TW201416081A - 富芸香素之萃取物及其製備方法 - Google Patents

Abstract

一種從植物獲得富芸香素萃取物的方法及如此獲得之橢圓葉鈎藤(Uncaria elliptica)的富芸香素萃取物。

Description

富芸香素之萃取物及其製備方法

一種從植物獲得富芸香素萃取物的方法及如此獲得之橢圓葉鈎藤(Uncaria elliptica)的富芸香素萃取物。

芸香素係一種天然類黃酮，其使用作為曲克蘆丁(Troxerutin)的起始物質，其中曲克蘆丁可增加微血管的耐力及降低靜脈血管壁的通透性。臨床研究顯示出以芸香素衍生物(維腦路通(venoruton))治療患者導致改善血栓後症候群。參見Panminerva Medicine，53，第13頁，2011。另一個研究發現芸香素係最有效的抗血栓劑之一。參見The Journal of Clinical Investigation，122，No 6，2012。芸香素作為醫藥品的起始物質漸漸變得更重要。

為了從多種植物來源(例如，槐樹(Sophora Japonica)(亞洲)、Fava d’anta(巴西)及橢圓葉鈎藤(巴西))萃取及純化出芸香素，典型使用水及甲醇溶劑。但是，實際上來自此等植物來源的富芸香素萃取物具有明顯的缺點，諸如濃棕色及包含較高的鐵含量(與來自其它來源的富芸香素萃取物比較)。此棕色歸因於植物中的色素。

非常難以藉由習知的萃取及/或純化方法消除此棕色及減少鐵含量，因為鐵顯示出係緊緊地併入該色素中。已經嘗試克服這些缺點。但是，這些嘗試難以減少已併入色素中的鐵同時維持好的芸香素產率。

對合適於大規模生產具有高芸香素含量、低鐵含量及減低呈色之富芸香素萃取物的應用之經濟程序有需求。

本發明係以可使用特別的醇與酸之組合來從植物獲得低鐵含量及呈色的富芸香素萃取物之出乎意料的發現為基礎。

此外，於本文中描述出一種從植物獲得一富芸香素萃取物的方法。該方法包括將一含芸香素植物萃取物溶解在甲醇或乙醇中以獲得一粗芸香素萃取物溶液，其中該含固體芸香素植物萃取物包含90%至95重量%的芸香素及100至300 ppm的鐵；減少該粗芸香素萃取物溶液的體積以獲得一濃縮物；藉由將一酸(1-15%，以該含芸香素植物萃取物的重量計)、及選擇性C1-C4醇、水或二者加入至該濃縮物獲得一混合物，其中該含芸香素植物萃取物構成該混合物的8%至30%(w/v)及該酸係選自於由抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、沒食子酸及蘋果酸所組成之群；讓該混合物靜置以形成沉澱；及分離出該沉澱物，因此獲得一包含少於20 ppm的鐵之富芸香素萃取物。

該含芸香素植物萃取物可從以水、醇或醇水溶液萃取橢圓葉鈎藤、槐樹或Fava d’anta獲得，如為粗沉澱物。

在某些具體實例中，該酸係以1-10%(以該含芸香素植物萃取物的重量計)加入，例如，1-5%或2-4%。在加入水與C1-C4醇的情況中，該水對C1-C4醇之比率可係1：1 至5：1，例如，1：1至3：1。水與C1-C4醇可分別、同時或以C1-C4醇水溶液之形式加入。

同樣地，本文的特色為一種橢圓葉鈎藤的富芸香素萃取物，該萃取物包含97%至99%芸香素(如藉由HPLC測量)及少於20 ppm的鐵，該萃取物在550奈米處的吸收度係低於0.2。該萃取物亦可包含5%至10重量%的水。其可藉由上述方法製備。

在下列說明中提出本發明的一或多個具體實例之細節。將從該說明及從申請專利範圍明瞭本發明的其它特徵、目標及優點。

於本文中描述出一種使用新穎的醇與酸之組合，從植物來源獲得富芸香素萃取物的方法。如與藉由習知方法製備的萃取物比較，藉由本方法獲得之富芸香素萃取物已明顯減低呈色及鐵含量。

該含固體芸香素萃取物可使用在技藝中已知的習知方法，從多種植物來源製備，例如，槐樹(亞洲)、Fava d’anta(巴西)及橢圓葉鈎藤(巴西)。此方法包括(但不限於)在多種溶劑中浸泡、加熱、搖晃、攪拌或注入植物材料(例如，莖及葉)。所使用的植物材料可呈整株乾燥植物、壓碎的植物或粉末形式。該溶劑包括水、醇(例如，甲醇)或醇水溶液。在萃取後，該萃取物溶液可藉由篩選、過濾、加壓或其它合適的技術與固體分離。該濾出液可經濃縮及冷卻以允許 形成沉澱，因此獲得一含固體芸香素萃取物。多種萃取方法之說明參見例如，Chinese Patent 1013579；US 2006/0099690；及Dighe等人，International Journal of Pharma and Bio Sciences，2(1)：750-757(2011)。

典型來說，藉由這些方法製備之含固體芸香素萃取物具有高鐵含量(例如，100-300ppm)及濃密地著色(例如，黃色或棕色)，特別是在源自橢圓葉鈎藤的萃取物中。芸香素可構成這些含固體芸香素萃取物的85%至90重量%。

可將從而製備的含固體芸香素萃取物溶解在醇溶劑(較佳為甲醇或乙醇)中，以獲得一粗芸香素萃取物溶液。例如，每1毫升溶劑可溶解0.05-0.13克的固體萃取物。該粗萃取物溶液可例如在大氣壓下進一步濃縮，以減少其體積例如4至10倍。可根據描述在下列的混合物之想要的體積及成分來預定該粗萃取物溶液的最後體積。

將酸及選擇性C1-C4醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇)加入至上述粗芸香素萃取物溶液以獲得一混合物。水亦可包含在該混合物中。

所使用的酸係選自於抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、沒食子酸及蘋果酸。其以約1-15%(例如，1-10%，或1-5%，以上述使用來製備該粗芸香素萃取物溶液的含固體芸香素萃取物之重量計)加入至該粗芸香素萃取物溶液。

該混合物必需包含至少一種C1-C4醇。例如，如上所述，可使用甲醇或乙醇(即C1-C4醇)從該含固體芸香素萃取物製得該粗芸香素萃取物溶液。可不需要對該粗芸香素 萃取物溶液加入額外C1-C4醇。在某些情況中，為了獲得包含8%至30%(w/v)含固體芸香素萃取物的混合物，可例如以該含固體芸香素萃取物的2-12倍(v/w)加入C1-C4醇、C1-C4醇水溶液或C1-C4醇與水。所加入的額外C1-C4醇可與用來製得該粗芸香素萃取物溶液之醇相同或不同。

芸香素以不同水合物存在，諸如單水合物、二水合物及三水合物。已知無水物及單水合物不穩定。因此，以在純化製程期間藉由與水水合來製備相對穩定的二水合物或三水合物為較佳。此外，可將水加入至該粗芸香素萃取物溶液。其可分別地加入。其亦可以C1-4醇水溶液之形式加入。該水對C1-C4醇的比率可係1：1至5：1，例如，1：1至3：1。如上述提到，最後混合物較佳包含8%至30%(w/v)的含固體芸香素萃取物。

然後，讓該包含粗芸香素萃取物溶液、C1-C4醇、酸及選擇性水之混合物靜置沉澱，例如，以形成結晶。例如，該混合物可經進一步濃縮，及攪拌該經濃縮的混合物及讓其冷卻以形成沉澱。可藉由任何合適的技術收集沉澱物，例如，過濾、以醇及/或水沖洗、及乾燥。

該沉澱物(即，富芸香素萃取物)可包含97%至99%的芸香素(如藉由HPLC測量)及少於20的ppm鐵(即，少於10 ppm)。其亦具有低呈色，例如，該萃取物在550奈米處的吸收度低於0.2。其亦可包含5%至10重量%的水。該富芸香素萃取物可具有任何顆粒尺寸，例如，5微米或較小。例如，其可具有奈米尺寸顆粒。

藉由上述方法製備的富芸香素萃取物對多種應用有用。其可配製成醫藥組合物，例如，藥物。其亦可使用作為營養補充品或食物添加劑。

下列特定實施例欲解釋為僅闡明用，及無論如何不以任何方法限制本揭示的剩餘部分。沒有進一步詳細闡述，咸信熟習該項技術者可根據於此之說明將本發明使用至其最大程度。於本文中所引用的全部公告其全文藉此以參考方式併入本文。

藉由下列程序獲得描述在下列實施例1-4中之鐵含量、純度及吸收度值：

(1)鐵含量

準確地獲得1.0克樣品及硫酸化。將2毫升鹽酸加入至殘餘物。然後乾燥樣品，及在加入10毫升水與一滴鹽酸後於沸水中加熱。在冷卻後，將體積準確地調整至10.0毫升，然後過濾過0.45微米過濾器。藉由ICP分析測量在該樣品溶液中的鐵濃度。

(2)可見光吸收度

將1.0克樣品溶解在15毫升二甲基甲醯胺(DMF)中。在以DMF將體積調整至20.0毫升後，讓該溶液過濾過0.45微米過濾器。在550奈米下，使用1.0公分的路徑長度來測量該經過濾的樣品之吸收度。

(3)HPLC分析

根據EP專題著作芸香苷三水合物、相關物質之液相層析法進行HPLC分析。簡單地說，使用在下列提出的試劑及條件：測試溶液：將0.10克欲檢驗的物質溶解在20毫升甲醇中及以動相B稀釋至100.0毫升。

參考溶液(a)：將10.0毫克芸香苷三水合物CRS溶解在10.0毫升甲醇中。

參考溶液(b)：以動相B將1.0毫升參考溶液(a)稀釋至50.0毫升。

管柱(LiChrospher 100 RP-8，C8，4.0x250毫米，Agilent)：

- 尺寸：1=0.25公尺，i.d.=4.0毫米，

- 靜相：色層分析用之辛基矽烷基矽凝膠(5微米)

- 溫度：30℃

動相：

- 動相A：混合5體積的四氫呋喃與95體積15.6克/升的磷酸二氫鈉溶液，以磷酸調整至pH 3.0。

- 動相B：混合40體積的四氫呋喃與60體積15.6克/升溶液的磷酸二氫鈉，以磷酸調整至pH 3.0。

梯度時間表

流速：1毫升/分鐘。

偵測：分光光度計在280奈米下。

注射：20微升。

在下列實施例1-4中所使用的酸及醇係從Wako Pure Chemical Industries,Ltd.(Osaka)獲得：抗壞血酸(最少99.5% 1級)；檸檬酸(最少98.0%特級)；蘋果酸(最少99.0%特級)；沒食子酸(98.0-103.0% 1級)；酒石酸(最少99.0% 1級)；甲醇(最少99.5% 1級)；乙醇(最少99.5%特級)；正丙醇(最少99.7%特級)；正丁醇(最少99.0%特級)。

實施例1：粗芸香素萃取物溶液之製備

使用習知的程序，以水及/或醇萃取橢圓葉鈎藤的莖及葉以獲得含固體芸香素萃取物。將三組含固體芸香素萃取物(每組50克)溶解在600毫升甲醇中及在30-35℃下攪拌二小時。過濾每種溶液及在大氣壓下濃縮，以產生300毫升的粗芸香素萃取物溶液。

從而製備的含固體芸香素萃取物包含85-90%(w/w)的芸香素及100-200 ppm的鐵。其當溶解在有機溶劑中時發展出暗棕色及在DMF中於550奈米處之平均吸收度係0.8-1.3。資料總整理在下列表1中。

實施例2：抗壞血酸在與多種溶劑組合中之影響 (1)甲醇

在大氣壓下濃縮三組粗芸香素萃取物溶液(每組皆從將50克含固體芸香素萃取物溶解在600毫升甲醇(MeOH)中獲得)，以提供300毫升體積。讓每種濃縮物接收0、1.0或5.0克的抗壞血酸及每種經進一步濃縮以提供150毫升的體積。在藉由冷卻結晶後，藉由過濾接著以甲醇沖洗收集經純化的芸香素結晶。在60℃下乾燥該經純化的芸香素5小時，及如上所述般分析。結果總整理在下列表2中。在結晶程序期間加入抗壞血酸會以劑量相依方式減少殘餘鐵及減低在550奈米處的吸收度。

(2)乙醇

將二組500毫升粗芸香素萃取物溶液(其係將25克含固體芸香素萃取物溶解在乙醇(EtOH)中獲得)每組在大氣壓下濃縮，以提供100毫升的體積。讓每組濃縮物接收25毫升包含0或0.5克抗壞血酸的水。在藉由攪拌及冷卻結晶後，藉由過濾，接著以15毫升95%乙醇沖洗收集經純化的芸香素結晶。在60℃下乾燥該經純化的芸香素5小時及如上所述般分析。結果總整理在下列表3中。抗壞血酸的效應明顯不如當在結晶過程中使用甲醇的情況般(參見上述)。

(3)丙醇

藉由將25克含固體芸香素萃取物溶解在300毫升MeOH中製備二組粗芸香素萃取物溶液。每組萃取物在大氣壓下濃縮以提供43毫升的體積。讓每組濃縮物接收包含0或0.5克抗壞血酸的丙醇水溶液(正丙醇：水=1：1；總共200毫升)。在藉由攪拌及冷卻結晶後，藉由過濾收集經純化的芸香素結晶。以25毫升正丙醇接著水沖洗芸香素結晶。在80℃下乾燥該經純化的芸香素6小時及分析。分析結果總整理在下列表4中。抗壞血酸減少殘餘鐵及減低該經純化的芸香素在550奈米處之吸收度。

(4)丁醇

藉由將25克含固體芸香素萃取物溶解在300毫升MeOH中製備四種粗芸香素萃取物溶液每種。每種萃取物溶液在大氣壓下濃縮以提供43毫升的體積。讓每種濃縮物接收包含0、0.25、0.5或2.5克抗壞血酸的正丁醇水溶液(水：正丁醇=133：67毫升)。在藉由攪拌及冷卻結晶後，藉由過濾收集經純化的芸香素結晶，然後以25毫升正丁醇接著以100毫升水沖洗。在80℃下乾燥該經純化的芸香素6小時及如上所述般分析。分析結果總整理在表5中。抗壞血酸減少殘餘鐵及減低該經純化的芸香素在550奈米處之吸收度。

實施例3：多種酸在與丁醇水溶液之組合中的影響

藉由將25克如在實施例1中描述般獲得之含固體芸香素萃取物溶解於300毫升MeOH中來製備七種粗芸香素萃取物溶液每種。在大氣壓下濃縮該萃取物以提供每種的體積43毫升。讓每種濃縮物接收包含酒石酸、檸檬酸、蘋果酸或沒食子酸(其量顯示在下列表6中)的丁醇水溶液(水：正丁醇=133：67毫升)。

在藉由攪拌及冷卻該濃縮物而結晶後，藉由過濾收集該經純化的芸香素結晶。以25毫升正丁醇接著以100毫升水沖洗該經純化的芸香素。在80℃下乾燥經純化的芸香素6小時及如上所述般分析。結果顯示在表6中。除了沒食子酸外，全部其它酸皆減少殘餘鐵及減低該經純化的芸香素在550奈米處之吸收度。

描述在實施例2及3中的結果指示出丁醇與抗壞血酸 之組合係最有效減低鐵含量及在550奈米處顯示出吸收度的黃色顏色二者。

實施例4：溶劑的影響

使用多種沒有任何酸的溶劑獲得經純化的芸香素。已觀察到丁醇水溶液及乙醇水溶液提供較好的芸香素產率(如與其它溶劑比較)。參見下列表7。

其它具體實例

在本專利說明書中所揭示的全部特徵可以任何組合結合。在本專利說明書中所揭示的每種特徵可藉由另一種提供相同、同等或類似目的的特徵置換。因此，除非其它方面有明確地描述，否則所揭示的每種特徵僅係同等或類似特徵的通用系列之實施例。

熟習該項技術者可從上述容易地查明本發明的基本特徵，及可沒有離開其精神及範圍製得本發明的多種改變及修改以讓其適應多種用途及條件。因此，其它具體實例亦在本申請專利範圍內。

Claims (21)

1. 一種從植物獲得富芸香素萃取物的方法，該方法包括：將一含芸香素植物萃取物溶解在甲醇或乙醇中以獲得一粗芸香素萃取物溶液，該含芸香素植物萃取物包含90%至95重量%的芸香素及100至300 ppm的鐵；減少該粗芸香素萃取物溶液的體積以獲得一濃縮物；藉由對該濃縮物加入一酸(1-15%，以該含芸香素植物萃取物的重量計)及選擇性C1-C4醇、水或二者獲得一混合物，其中該含芸香素植物萃取物構成該混合物的8%至30%(w/v)及該酸係選自於由抗壞血酸、檸檬酸、酒石酸、沒食子酸及蘋果酸所組成之群；讓該混合物靜置以形成沉澱；及分離該沉澱物，因此獲得一包含少於20ppm鐵的富芸香素萃取物。
2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該含芸香素植物萃取物係以水、醇或醇水溶液從橢圓葉鈎藤、槐樹或Fava d’anta萃取獲得，如為粗沉澱物。
3. 如申請專利範圍第1項的方法，其中加入C1-C4醇及水。
4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該酸係以該含 芸香素植物萃取物的1-10重量%加入。
5. 如申請專利範圍第4項的方法，其中該酸係以該含芸香素植物萃取物的1-5重量%加入。
6. 如申請專利範圍第5項的方法，其中該酸係以該含芸香素植物萃取物的2-4%加入。
7. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該C1-C4醇及水係以包含5-80體積%水的C1-C4醇水溶液形式加入。
8. 如申請專利範圍第3項的方法，其中該水對C1-C4醇的比率係1：1至5：1，以體積計。
9. 如申請專利範圍第8項的方法，其中該水對C1-C4醇的比率係1：1至3：1，以體積計。
10. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該C1-C4醇係甲醇及該酸係抗壞血酸。
11. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該C1-C4醇係正丁醇或丙醇。
12. 如申請專利範圍第11項的方法，其中該酸係抗壞 血酸。
13. 如申請專利範圍第12項的方法，其中該C1-C4醇係正丁醇。
14. 如申請專利範圍第13項的方法，其中該酸係以該含芸香素植物萃取物的1-10重量%加入。
15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該酸係以該含芸香素植物萃取物的1-5重量%加入。
16. 如申請專利範圍第15項的方法，其中該酸係以該含芸香素植物萃取物的2-4重量%加入。
17. 如申請專利範圍第13項的方法，其中該水對C1-C4醇的比率係1：1至5：1，以體積計。
18. 如申請專利範圍第13項的方法，其中於水對C1-C4醇的比率係1：1至3：1，以體積計。
19. 一種橢圓葉鈎藤的富芸香素萃取物，該萃取物包含97%至99%的芸香素(如藉由HPLC測量)及少於20 ppm的鐵，該萃取物在550奈米處的吸收度係低於0.2。
20. 如申請專利範圍第19項之富芸香素萃取物，其中該萃取物包含至少98%的芸香素(如藉由HPLC測量)及少於10 ppm的鐵，其在550奈米處的吸收度係低於0.1。
21. 如申請專利範圍第19項之富芸香素萃取物，其中該萃取物包含5%至10重量%的水。