TW201343673A

TW201343673A - 經ＦｃγＲＩＩＢ促進抗原消失之抗原結合分子

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Publication number: TW201343673A
Application number: TW102106149A
Authority: TW
Inventors: 井川智之; 前田敦彥; 岩柳有起; 原谷健太; 堅田仁; 門野正次郎; 味元風太
Original assignee: 中外製藥股份有限公司
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2013-11-01
Also published as: JPWO2013125667A1; MX370668B; BR112014020821B1; CA2865158A1; AU2013223087B2; EP3738980A1; AU2018202968B2; AU2018202643A1; RU2014138499A; JP6138108B2; SG10201805584YA; HK1201476A1; JP7012104B2; AU2018202968A1; TW202231872A; EP2818183A4; ES2795419T3; KR20140130707A; CN104244980A; CA2865158C

Abstract

本發明提供一種抗原結合分子，其係含有(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域；並提供一種該抗原之血漿中濃度比起投予該分子前降低之方法，包含投予該分子的步驟。

Description

經cγRIIB促進抗原消失之抗原結合分子

本發明提供用以使抗原從血漿中消失之抗原結合分子之用途、包含投予抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之方法、包含能使抗原從血漿中消失之抗原結合分子的醫藥組合物、及用以使抗原從血漿中消失之抗原結合分子之製造方法。

抗體於血漿中之安定性高、副作用也少，故作為醫藥品受重視。其中IgG型之抗體醫藥已有多數上市，現在也有許多抗體醫藥正在開發中(非專利文獻1及非專利文獻2)。另一方面，作為能應用在第二世代之抗體醫藥的技術已發展出各種技術，已有人類報告使效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性提高或使免疫原性風險減低的技術等(非專利文獻3)。抗體醫藥一般投予量非常高，所以據認為皮下投予製劑之製作困難、製造成本高等係其課題。就減少抗體醫藥投予量之方法而言，有人類考慮改善抗體之藥物動態之方法、及提高抗體與抗原之親和性(affinity)之方法。

作為改善抗體之藥物動態之方法，有人類報告不變區之人類為的胺基酸取代(非專利文獻4及5)。作為增強抗體對抗原之結合活性、及/或中和活性之技術，有人類報告親和性成熟技術(非專利文獻6)，可藉由對於可變區之CDR區等導入胺基酸變異以增強對抗原之結合活性。藉由抗原結合能力之增強，可增強於體外的生物活性、或減少投予量，而且也能提高於in vivo(活體內)的藥效(非專利文獻7)。

另一方面，抗體每一分子能中和之抗原量取決於親和性，為了能以少量抗體中和抗原，以各種方法加強抗體之親和性(非專利文獻6)。再者，若能對於抗原以共價鍵結合並能使親和性無限大，則能以一分子抗體中和一分子抗原(二價的情形為二分子抗原)。但如此的方法，以一分子抗體來中和一分子抗原(二價的情形為二分子抗原)的化學理論中和反應為極限，無法以抗原量以下的抗體量將抗原完全中和。亦即，藉由強化親和性將抗原中和的效果存在極限(非專利文獻8)。為中和抗體之情形，為了使其中和效果持續一定期間，必須在其期間在活體內投予產生之抗原量以上之抗體量，僅是上述抗體之藥物動態改善、或親和性成熟技術，對於減少必要抗體投予量存在極限。所以，為了持續目的期間以抗原量以下的抗體量達到中和抗原的效果，需要以一抗體中和多數抗原。就達成此目的之新方法，最近有人類報告對於抗原以金屬離子濃度依存性結合之抗原結合分子(專利文獻1及2)。能對於抗原於血漿中之pH中性條件及/或高鈣離子濃度之條件下強力結合且於內體(endosome)內之pH酸性條件及/或低鈣離子濃度之條件下從抗原解離之離子濃度依存性抗原結合分子，能於內體內從抗原解離。離子濃度依存性抗原結合分子，當從抗原解離後，該分子若由FcRn再循環於血漿中，可再度與抗原結合，故能以一個離子濃度依存性抗原結合分子反複結合於多數抗原。

又，抗原在血漿中之滯留性，比起結合於FcRn並再循環的抗體，係非常之短。但即便是抗原本身的血漿中滯留性短，若如此之血漿中滯留性長的通常的抗體與此抗原結合，抗體抗原複合體之血漿中滯留性會與抗體同樣增長。所以，通常若投予抗體，與該抗體結合之抗原會以抗體抗原複合體的形式存在，血漿中滯留性增長(不易從血漿中消失)、血漿中之抗原濃度上升。另一方面，離子濃度依存性抗原結合分子在內體內由於從抗原解離，可抑制血漿中抗原濃度上昇。但是於上述血漿中之抗原濃度之上昇之抑制，會影響與該抗原在活體內之產生量間的均衡性。所以，也有人類認為藉由投予如此之離子濃度依存性抗原結合分子，可能比起該分子投予前，會造成血漿中抗原濃度上昇(專利文獻3)。

最近，有人類製作在中性條件下對於FcRn有結合之抗原結合分子。有人類發現：藉由投予離子濃度依存地與抗原結合且於中性條件下對於FcRn有結合之抗原結合分子，相較於該分子投予前能降低血漿中抗原濃度(專利文獻3)。通常的抗體，藉由抗體投予會使血漿中之抗原濃度上昇，相對於此，於pH中性條件下對FcRn有結合活性之抗原結合分子、及以離子濃度依存的與抗原且於pH中性條件下對FcRn有結合活性之抗原結合分子，能藉由該分子之投予使血漿中之抗原濃度降低。如此的抗原結合分子，可經對於FcRn之結合之結果引起的胞吞作用(endocytosis)而將抗原積極地從血漿中除去，所以作為醫藥品極有用。

另一方面，作為IgG之受體，不僅存在FcRn，尚存在多數Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa)(非專利文獻9)。抗體對於活性型Fcγ受體之結合活性，對於抗體之細胞傷害活性發揮重要作用，故至今為止，已開發出藉由對活性型Fcγ受體之結合活性增強而增強細胞傷害活性之將膜型抗原作為標的之抗體(非專利文獻10、11)。同樣地，對抑制型Fcγ受體(FcγRIIb)之結合活性在免疫抑制活性(非專利文獻12、13、14)、致效劑活性(非專利文獻15、16)等發揮重要作用，因此以對抑制型Fcγ受體之結合活性增強之膜型抗原作為標的之抗體之研究正在進展(非專利文獻17、18)。

與可溶型抗原結合之抗體對於FcγR之結合之影響，主要於其副作用之觀點被探討。例如：已知投予對抗VEGF之抗體bevacizumab之患者群的血栓塞栓症的風險上昇(非專利文獻19)。又，於對於CD40配體之抗體之臨床開發試驗也同樣觀察到血栓塞栓症，且臨床試驗已中止(非專利文獻20)。血小板之細胞上係不是表現抑制型Fcγ受體FcγRIIb而是表現活性型Fcγ受體FcγRIIa(非專利文獻21)，但藉由使用動物模型等之後之研究，啟示投予的任一抗體均經對於血小板上之FcγRIIa之結合而造成血小板凝集，其結果形成血栓(非專利文獻22、非專利文獻23)。於係自體免疫疾病之一種的全身性紅斑狼瘡的患者中，會由於FcγRIIa依存的機制而活化血小板，據報告血小板之活化與重症度相關(非專利文獻24)。又，當將對於FcγRIIb之結合增強之抗體作為醫藥品使用的情形，能期待抗抗體產生之風險減低(非專利文獻25)、使與膜型抗原結合之抗體對於FcγRIIa之結合增強而得之抗體，據報告經樹狀細胞或巨噬細胞之抗體依存的吞噬活性(ADCP)會增強(非專利文獻26)。但是，藉由以可溶型抗原為標的之抗體對於活性型及/或抑制型Fcγ受體之結合活性，對於已投予該抗體之活體中之該抗體或該抗體所結合之抗原之血漿中動態的效果係為未知。

【先前技術文獻】【專利文獻】

【專利文獻1】WO2009/125825

【專利文獻2】WO2012/073992

【專利文獻3】WO2011/122011

【非專利文獻】

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【非專利文獻23】Robles-Carrillo L, Meyer T, Hatfield M, Desai H, Davila M, Langer F, Amaya M, Garber E, Francis JL, Hsu YM, Amirkhosravi A., Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583

【非專利文獻24】Duffau P, Seneschal J, Nicco C, Richez C, Lazaro E, Douchet I, Bordes C, Viallard JF, Goulvestre C, Pellegrin JL, Weil B, Moreau JF, Batteux F, Blanco P., Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus., Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63

【非專利文獻25】Desai DD, Harbers SO, Flores M, Colonna L, Downie MP, Bergtold A, Jung S, Clynes R., Fc gamma receptor IIB on dendritic cells enforces peripheral tolerance by inhibiting effector T cell responses., J. Immunol. (2007) 178 (10), 6217-6226

【非專利文獻26】Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells., Mol. Cancer Ther. (2008) 7 (8) 2517-2527

本發明係有鑑於如此的狀況而生。如前述，將可溶型抗原作為標的之抗體對於活性型及/或抑制型Fcγ受體之結合活性，對於已投予該抗體之活體中該抗體或該抗體所結合之抗原之血漿中動態的效果為未知。亦即，本發明之課題為：藉由投予在血漿中為可溶型且對於存在且成為病因之抗原有結合活性且對於活性型及/或抑制型Fcγ受體有所望結合活性之抗原結合分子，以抑制該分子所結合之抗原在血漿中濃度上昇。再者，本發明之課題為：藉由將於血漿中為可溶型且對抗存在成為病因之抗原之抗原結合分子其對於活性型及/或抑制型Fcγ受體之結合活性予以最適化，而將該分子所結合之抗原在血漿中濃度上昇之抑制予以最適化。

亦即，本發明，提供：一種降低抗原於血漿中濃度之方法，係藉由投予包含以下結合分域之抗原結合分子，使得比起該分子投予前，該抗原於血漿中濃度降低：(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域。又，本發明提供一種抗原之血漿中濃度之降低劑，係包含投予包含以下結合分域之抗原結合分子：(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域。再者，本發明提供一種醫藥組合物，其係包含含以下結合分域之抗原結合分子(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域。又，本發明提供一種使用分子使抗原於血漿中濃度降低之用途，該分子包含：(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域。此外，本發明提供該分子之製造方法及/或篩選方法。並不特別限於以下，作為一非限定態樣，具體而言提供以下者。

[1]一種抗原結合分子之使用，使該抗原結合分子對應之抗原從血漿中消失，其中該抗原結合分子包含：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238 位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。

[2]如[1]之使用，其中，該Fc區為更有選自於EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[3]如[2]之使用，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、 332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu中之任一者以上之Fc區。

[4]如[1]至[3]中任一項之使用，其中，該抗原結合分域係對於該抗原之結合活性會依鈣離子濃度之條件變化之抗原結合分域。

[5]如[4]之使用，其中，該抗原結合分域，係結合活性變化使得對該抗原於低鈣離子濃度之條件下之結合活性比起對該抗原於高鈣離子濃度之條件下的結合活性低的抗原結合分域。

[6]如[1]至[3]中任一項之使用，其中，該抗原結合分域係對該抗原之結合活性依pH之條件變化之抗原結合分域。

[7]如[6]之使用，其中，該抗原結合分域係結合活性變化使得對該抗原於pH酸性域條件下之結合活性低於在pH中性域條件下之結合活性的抗原結合分域。

[8]如[1]至[7]項中任一項之使用，其中，該抗原結合分域係抗體之可變區。

[9]如[1]至[8]中任一項之使用，其中，該Fc區係序列編號： 14、15、16或17中之任一者包含之Fc區中，EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。

[10]如[1]至[8]中任一項之使用，其中，該Fc區係於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性，比序列編號：14、15、16或17中之任一者所含之Fc區對FcRn之結合活性更增強之Fc區。

[11]如[10]之使用，其中，該增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17中之任一者所含之Fc區之胺基酸序列當中，選自EU編號表示之244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[12]如[11]之使用，其中，該增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17所含之Fc區之胺基酸序列當中，選自於EU編號表示之；244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、 249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、 308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或 Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys中之至少一個以上之胺基酸。

[13]如[1]至[12]中任一項之使用，其中，該抗原結合分子為抗體。

[14]一種醫藥組合物，其係包含抗原結合分子，該抗原結合分子包含：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。

[15]如[14]之醫藥組合物，其中，該Fc區為更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[16]如[15]之醫藥組合物，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、 274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、327位之胺基酸為Gly、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。

[17]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)至(e)之步驟；(a)獲得對抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之抗原結合分域、(b)獲得編碼為該步驟(a)選擇之抗原結合分域的基因、(c)將該步驟(b)獲得之基因、與編碼為EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區的基因以可作用地連結、(d)培養包含於該步驟(c)以可作用地連結之基因的寄主細胞、(e)從該步驟(d)獲得之培養液將抗原結合分子單離。

[18]如[17]之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區係更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[19]如[18]之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、 327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。

[20]一種包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，包含以下(a)至(e)之步驟；(a)獲得對抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之抗原結合分域、(b)獲得編碼為該步驟(a)選擇之抗原結合分域的基因、(c)將該步驟(b)獲得之基因、與編碼為EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區的基因以可作用地連結、(d)培養包含於該步驟(c)以可作用地連結之基因的寄主細胞、(e)從該步驟(d)獲得之培養液將抗原結合分子單離。

[21]如[20]之包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，其中，該Fc區係更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[22]如[21]之包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、 331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。

[23]一種使抗原從血漿中消失之方法，其係包含投予有效量的抗原結合分子的步驟，該抗原結合分子包含：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。

[24]如[23]之使抗原從血漿中消失之方法，其中，該Fc區係更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[25]如[24]之使抗原從血漿中消失之方法，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、 234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、 419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。

[26]如[23]至[25]中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述抗原結合分域係對前述抗原之結合活性依鈣離子濃度之條件變化之抗原結合分域。

[27]如[26]之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述抗原結合分域係結合活性變化使得對前述抗原於低鈣離子濃度條件下之結合活性低於對前述抗原於高鈣離子濃度條件下的結合活性之抗原結合分域。

[28]如[23]至[25]中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，結合活性變化之前述抗原結合分域，係對前述抗原之結合活性依pH之條件變化之抗原結合分域。

[29]如[28]之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述抗原結合分域係結合活性變化使得對前述抗原於pH酸性域條件下之結合活性低於在pH中性域條件下之結合活性之抗原結合分域。

[30]如[23]至[29]項中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述抗原結合分域為抗體之可變區。

[31]如[23]至[30]項中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述Fc區係序列編號：14、15、16或17中之任一者所含之Fc區中，EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。

[32]如[23]至[30]項中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述Fc區係於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性，比序列編號：14、15、16或17中之任一者所含之Fc區對FcRn之結合活性更增強之Fc區。

[33]如[32]項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述經增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17中之任一者所含之Fc區之胺基酸序列當中選自EU編號表示之244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。

[34]如[33]項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述經增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17所含之Fc區之胺基酸序列當中，選自於EU編號表示之；244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、 252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、 311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、之群組中之至少一個以上之胺基酸。

[35]如[23]至[34]項中任一項之使抗原從血漿中消失之方法，其中，前述抗原結合分子為抗體。

本發明中，「使用包含對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區的抗原結合分子於使該抗原從血漿中消失之用途」、「一種治療由該抗原引起之疾病之方法，包含投予含對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為GlyFc區之抗原結合分子」、及「一種醫藥組合物，包含含有以下區抗原結合分子：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區」、「一種醫藥組合物之製造方法，係使用如下之抗原結合分子，包含：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區」、及「一種製造醫藥組合物用之處理，包含使用如下之抗原結合分子之步驟：包含對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區」，彼此以同含意使用。

圖1顯示藉由投予比起既存之中和抗體，於中性pH對Fcγ受體之結合有增強之離子濃度依存地對抗原結合之抗體，以使可溶型抗原從血漿中消失之非限定之作用機轉。

圖2顯示將H54/L28-IgG1或對人類IL-6受體以pH依存性結合之Fv4-IgG1對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖3顯示將對人類IL-6受體以pH依存性結合之Fv4-IgG1、對小鼠FcγR之結合有缺損之Fv4-IgG1之改變體Fv4-IgG1-F760、對小鼠FcγR之結合有增強之Fv4-IgG1之改變體Fv4-IgG1-F1022、或Fv4-IgG1之低岩藻糖(fucose)IgG1-Fuc，對於FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖4顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022、及係Fv4-IgG1-F1022之改變體且包含於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1093作為重鏈之抗原結合分子，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖5顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022、及係Fv4-IgG1-F1022之改變體且包含於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1093作為重鏈的抗原結合分子，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之被投予之抗原結合分子之濃度變動。

圖6顯示將Fv4-IgG1、對小鼠FcγR之結合有增強之(尤其對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之)Fv4-IgG1之改變體Fv4-IgG1-F1087、及對小鼠FcγR之結合有增強之(尤其對小鼠FcγRI、小鼠FcγRIV之結合有增強之)Fv4-IgG1之改變體Fv4-IgG1-F1182，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖7顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087、及於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1087之改變體Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中被投予之抗原結合分子之濃度變動。

圖8顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182、及於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1182之改變體Fv4-IgG1-F1181，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中被投予之抗原結合分子之濃度變動。

圖9顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087、及於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1087之改變體Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖10顯示將Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182、及於pH酸性域對FcRn之結合有提高之Fv4-IgG1-F1182之改變體Fv4-IgG1-F1181，對人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖11顯示將Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF46，對正常小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖12顯示將Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF46，對FcγRIII缺損小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖13顯示將Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF46，對Fc受體γ鏈缺損小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖14顯示將Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-mF46，對FcγRIIb缺損小鼠投予時，該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。

圖15顯示使用具有FcγRIIa之多型(R/H)之捐出者來源之血小板之血小板凝集分析中，由於omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體所獲血小板凝集能力之評價結果。

圖16顯示使用具有FcγRIIa之多型(H/H)之捐出者來源之血小板之血小板凝集分析中，由於omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體所獲血小板凝集能力之評價結果。

圖17顯示評價洗滌血小板之膜表面之CD62p表現之結果。以黑色塗滿的圖線代表與PBS反應後加入ADP刺激的情形的結果，圖線中未塗滿者代表與免疫複合體反應後以ADP刺激之情形的結果。

圖18顯示評價洗滌血小板之膜表面之活性型細胞黏合素(integrin)表現之結果。以黑色塗滿的圖線代表與PBS反應後加入ADP刺激的情形的結果，圖線中未塗滿者代表與免疫複合體反應後以ADP刺激之情形的結果。

圖19中，橫軸代表各PD改變體對FcγRIIb之相對的結合活性的值，縱軸代表各PD改變體對FcγRIIa R型之相對的結合活性的值。將各PD改變體對各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體IL6R-F652/IL6R-L(IL6R-F652係包含序列編號：61規定之EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc的抗體重鏈)對各FcγR之結合量之值再乘100倍後的值，作為各PD改變體對各FcγR之相對的結合活性之值。圖中之F652的描點，代表IL6R-F652/IL6R-L之值。

圖20中，縱軸代表對於不具P238D改變之GpH7-B3(序列編號：63)/GpL16-k0導入了各改變之改變體對FcγRIIb之相對的結合活性的值，橫軸代表對於具有P238D改變之IL6R-F652(序列編號：61)/IL6R-L導入了各改變之改變體對FcγRIIb之相對的結合活性的值。又，各改變體對FcγRIIb之結合量的值除以改變導入前之抗體對FcγRIIb之結合量的值再乘100倍後之值，作為相對的結合活性的值。在此，導入於不具P238D之GpH7-B3/GpL16-k0的情形，與導入於具P238D之IL6R-F652/IL6R-L的情形同時發揮對FcγRIIb之結合增強效果之改變，包含於A區，而對不具P238D之GpH7-B3/GpL16-k0導入的情形，雖發揮對FcγRIIb之結合增強效果，但導入於具P238D之IL6R-F652/IL6R-L之情形，不發揮對FcγRIIb之結合增強效果之改變，係包含於B區。

圖21顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構。

圖22顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構，與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構，利用對FcγRIIb細胞外區域及Fc CH2分域A基於Cα原子間距離之最小平方法重疊而得之圖。

圖23顯示針對Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構，與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構，以Fc CH2分域A及Fc CH2分域B單獨彼此基於Cα原子間距離之最小平方法重疊，並將P238D附近之詳細結構比較之圖。

圖24顯示於Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構中，Fc CH2分域A之EU編號表示之237位之Gly之主鏈與FcγRIIb之160位之Tyr之間有氫鍵之圖。

圖25顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構中，Fc CH2分域B之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg之間有靜電交互作用之圖。

圖26中，橫軸代表各2B改變體對FcγRIIb之相對的結合活性的值、縱軸代表各2B改變體對FcγRIIa R型之相對的結合活性的值。各2B改變體對各FcγR之結合量的值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc)對各FcγR之結合量的值再乘100倍之值，當作各2B改變體對各FcγR之相對的結合活性的值。

圖27顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構中，Fc A鏈之EU編號表示之233位之Glu與FcγRIIb細胞外區域其周邊殘基。

圖28顯示在Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶結構中，Fc A鏈之EU編號表示之330位之Ala與FcγRIIb細胞外區域其周邊殘基。

圖29顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體及Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之結晶結構，對於Fc B鏈以基於Cα原子間距離之最小平方法重疊之Fc B鏈之EU編號表示之271位之Pro之結構。

圖30顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之圖。針對Fc部分CH2分域、CH3分域，以向左側為分域A、右側分域B。

圖31顯示由X射線結晶結構解析決定之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結構與Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體之結構(PDB code：3RY6)，於Fc部分CH2分域A利用基於Cα原子間距離之最小平方法重疊，並比較者。圖中粗線描繪者為Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體，細線描繪者為Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體之結構。又，Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體之結構中，僅畫出Fc部分CH2分域A。

圖32顯示於Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構中與FcγRIIb之160號Tyr在主鏈部分形成氫鍵之Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp附近之結構之細節。

圖33顯示於Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構中與FcγRIIb之160號之Tyr在主鏈部分形成氫鍵之Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp側鏈周圍之胺基酸殘基之結構。

圖34顯示實施例10顯示之Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構於Fc部分CH2分域B利用基於Cα原子間距離之最小平方法重疊，並於EU編號表示之266位至271位之環圈周邊比較之圖。該環圈中，Fc(P208)相較於Fc(P238D)，於EU編號表示之268位帶有H268D之改變，於EU編號表示之271位帶有P271G之改變。

圖35係於Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構中，Fc部分CH2分域B之Ser239周邊之結構和X射線結晶結構解析獲得之作為2Fo-Fc係數之電子密度一起顯示之圖。

圖36顯示利用X射線結晶結構解析決定之Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之立體結構與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之立體結構，利用基於Cα原子間距離之最小平方法重疊並比較之圖。

圖37係Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之X射線結晶結構與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構，和在Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp附近利用X射線結晶結構解析獲得之作為2Fo-Fc係數之電子密度一起比較之圖。

圖38係Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之X射線結晶結構與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶結構，和於Fc部分CH2分域B之EU編號表示之237位之Asp附近利用X射線結晶結構解析獲得之作為2Fo-Fc係數之電子密度一起比較之圖。

圖39顯示比較G1d與G4d之不變區之序列之圖。圖中，粗框包圍的胺基酸，代表G1d與G4d成為不同胺基酸殘基之部位。

圖40顯示正常小鼠之GA2-IgG1及GA2-F1087之血漿中抗體濃度變動。

圖41顯示已投予GA2-IgG1及GA2-F1087之正常小鼠中，血漿中hIgA濃度變動。

圖42顯示正常小鼠中，278-IgG1及278-F1087之血漿中抗體濃度變動。

圖43顯示已投予278-IgG1及278-F1087之C57BL/6J小鼠中，血漿中hIgE(Asp6)濃度變動。

圖44顯示將Fv4-mIgG1及對小鼠FcγRIIb之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-MB367對正常小鼠投予時，該小鼠之血漿中之抗人類IL-6受體小鼠抗體濃度變動。

圖45顯示將Fv4-mIgG1及對小鼠FcγRIIb之結合有增強之Fv4-mIgG1之改變體Fv4-mIgG1-MB367對正常小鼠投予時，該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度變動。

以下定義及詳細說明係為了容易理解本說明書說明之本發明而提供。

胺基酸

本說明書中，以例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示，將胺基酸以單字母碼或三字母碼、或其兩者表示記載。

胺基酸之改變

為了抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸之改變，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。依照該等公知方法可適當加以胺基酸附加、缺失、及/或取代。胺基酸殘基取代，係藉由取代為其他胺基酸殘基，而針對例如以下(a)~(c)之點改變為目的。

(a)板片構造、或螺旋構造之區中之多胜肽之背骨構造；(b)標的部位之電荷或疏水性、或(c)側鏈大小。

胺基酸殘基依其構造所含側鏈之特性分類為以下群：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈配向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族性：Trp、Tyr、Phe。

該等各群內之胺基酸殘基之取代稱為保守性取代，另外，在其他群間彼此的胺基酸殘基取代稱為非保守的取代。本發明之取代，可為保守的取代也可為非保守的取代，也可為保守的取代與非保守的取代的組合。又，取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸之改變方法，也可採用多數公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。

又，表示胺基酸改變之表達，可適當使用在表示特定位置之數字前後使用改變前與改變後之胺基酸之單字母碼之表達。例如，對抗體不變區所含之Fc區施以胺基酸取代時之稱為P238D改變，係表示EU編號表示之238位之Pro取代為Asp。亦即數字表示EU編號表示之胺基酸之位置，在其前記載之胺基酸單字母碼代表取代前之胺基酸，之後記載之胺基酸之單字母碼代表取代後之胺基酸。及/或本說明書中，「及/或」之用語之含意義，係「及/或」之前後之用語之組合，包括「及」與「或」適當組合的各種組合。具體而言，例如「326位、328位、及/或428位之胺基酸被取代」，代表以下胺基酸的改變的多樣性；(a)326位、(b)328位、(c)428位、(d)326位及328位、(e)326位及428位、(f)328位及428位、(g)326位及328位及428位。

抗原

本說明書中，「抗原」只要含有抗原結合分域所結合之抗原決定部位(epitope)即可，其構造不限於特定構造。就其他含意而言，抗原也可為無機物也可為有機物。抗原可列舉如下列分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、Addressin、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、alpha-1-antitrypsin、alpha-V/beta-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3細胞黏合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3Osteogenin(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、Bombesin、骨來源神經營養因子(Bone-derived neurotrophic factor)、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、calcitonin、cAMP、癌胎兒抗原(CEA)、癌關連抗原(carcinoma-associated antigen)、CathepsinA、CathepsinB、CathepsinC/DPPI、CathepsinD、CathepsinE、CathepsinH、CathepsinL、CathepsinO、CathepsinS、CathepsinV、CathepsinX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、Clostridium perfringens(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、 cytokeratin腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、Digoxin、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、endothelin受體、enkephalinase、eNOS、Eot、eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-selectin、ET-1、第IIa因子、第VII因子、第VIIIc因子、第IX因子、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、ferritin、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、fibrin、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激荷爾蒙、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長荷爾蒙釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外被糖蛋白、HCMV gH外被糖蛋白、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、heparanase、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨病毒(HCMV)、人類成長荷爾蒙(hGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-alpha、INF-beta、INF-gamma、inhibin、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素狀增殖因子1、細胞黏合素alpha2、細胞黏合素(integrin)alpha3、細胞黏合素alpha4、細胞黏合素alpha4/beta 1、細胞黏合素alpha4/beta 7、細胞黏合素alpha5(alphaV)、細胞黏合素alpha5/beta 1、細胞黏合素alpha5/beta 3、細胞黏合素alpha6、細胞黏合素beta 1、細胞黏合素beta 2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、kallikrein2、kallikrein5、kallikrein6、kallikrein11、kallikrein12、kallikrein14、kallikrein15、kallikreinL1、kallikreinL2、kallikreinL3、kallikreinL4、KC、KDR、角質化細胞增殖因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在型TGF-1、潛在型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-selectin、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體形成荷爾蒙、lympotoxin beta受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、 MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-alpha、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、mutin(Muc1)、MUC18、Muller管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cadherin、NCA 90、NCAM、NCAM、neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-beta、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-Cadherin、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素前體、prorelaxin、proteinC、PS、PSA、PSCA、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxinA鏈、relaxinB鏈、腎素(renin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體alpha/beta)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-beta RI(ALK-5)、TGF-beta RII、TGF-beta RIIb、TGF-beta RIII、TGF-beta 1、TGF-beta 2、TGF-beta 3、TGF-beta 4、TGF-beta 5、凝血酶(thrombin)、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-alpha、TNF-alpha beta、TNF-beta 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、 TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-aConectin(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD1S4、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、transferrin受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現Lewis Y關連碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR細胞黏合素、Von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL,PCSK9,prekallikrein,RON,TMEM16F、SOD1,Chromogranin A,Chromogranin B、tau, VAP1、高分子kininogen、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V、factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor XIa、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、thrombomodulin、TAPI、tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1、PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P及激素及成長因子用之受體。

上述抗原例示也有記載受體，但該等受體係於血漿中等活體液中以可溶型存在的情形，由於能與本發明之抗原結合分子形成複合體，故只要上述列舉之受體係以可溶型存在於血漿中等活體液中，則可作為本發明之抗原結合分子可結合並形成本發明複合體的抗原使用。如此之可溶型受體之一非限定態樣，例如：Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之可溶型IL-6R，即由序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列中之1至357號胺基酸構成的蛋白質。

上述抗原之例示也記載可溶型抗原，但對該抗原存在之溶液無限定，該可溶型抗原能存在活體液，亦即填滿活體內之脈管或組織‧細胞之間的所有液體。非限定之一態樣中，本發明之抗原結合分子結合之抗原，可存在於細胞外液。細胞外液，在脊椎動物係指血漿、組織間液、淋巴液、緻密的結締組織、腦脊髓液、髓液、穿刺液、或關節液等骨及軟骨中之成分、肺泡液(支氣管肺泡洗滌液)、腹水、胸水、心囊水、囊泡液、或眼房水(房水)等細胞透過液(細胞之主動輸送‧分泌活動之結果產生的各種腺腔內的液體、及消化管腔等體腔內液)的總稱。

抗原決定部位(epitope)

意指抗原中存在之抗原決定基之抗原決定部位，係指本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定部位可由其構造定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。

直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。

立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，可能包含對於直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時，形成立體構造抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。

結合活性

以下例示確認含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，但是確認含有對抗IL-6R以外之抗原的抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。

例如：含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用序列編號：2表示之IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之 ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。

又，含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識立體構造抗原決定部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子接觸IL-6R表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6R之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以IL-6R表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。

ELISA格式中，包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6R表現細胞之ELISA板添加待驗抗原結合分子，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記檢測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對於IL-6R表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合活性。

待驗抗原結合分子對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM (均為BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)

例如：包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(幾何平均)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之結合活性。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子與某抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。

具體而言，交叉阻斷試驗中，塗覆在微滴定板之井上的IL-6R蛋白質，於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下或非存在下，預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。井中之IL-6R蛋白質所結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則對於塗覆有待驗抗原結合分子之IL-6R蛋白質之井的結合活性愈低。

經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗原結合分子可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。

比起於不存在候選之彼此競爭抗原結合分子下實施之對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為彼此競爭之抗原結合分子。

包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定部位在鑑定構造時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原決定部位之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。

如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。

又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之細胞以及表現對於抗原決定部位導入有變異之IL-6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗IL-6R與對照IL-6R。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗IL-6R與對照IL-6R的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗IL-6R與對照IL-6R之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。

本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從多胜肽組合體存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。

△幾何平均值=幾何平均值(多胜肽組合體存在下)/幾何平均值(多胜肽組合體非存在下)

將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較值(變異IL-6R分子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。

待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定部位為相同。

抗原結合分域

本說明書中，「抗原結合分域」只要能結合於目的之抗原則可使用任意構造之分域。如此的分域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於生體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的 ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(WO2008/016854)為佳。本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等為較佳。

本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於相同的抗原決定部位。在此，相同之抗原決定部位可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於彼此不同的抗原決定部位。在此，不同的抗原決定部位，可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。

專一性

關於本發明提供之抗原結合分子對抗原之結合有「專一性」，係指專一性結合之分子的其中一分子對於其結合之一或多數之對手分子以外之分子為實質上不結合之狀態。在此，實質上不結合，係指如前述結合活性之項目所記載，對於該對手方之分子以外之分子之結合活性為對手方之分子之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下。又，抗原結合分域對某抗原中所含多數抗原決定部位當中之特定抗原決定部位為專一性的情形也可使用。又，抗原結合分域結合之抗原決定部位包括在多數不同的抗原中的情形，具該抗原結合分域之抗原結合分子能與含該抗原決定部位的各種抗原結合。

中和活性

本發明之一非限定態樣中，提供一種醫藥組合物，其係包含一抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含(i)對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、(ii)對FcγRIIb有選擇性結合活性之Fcγ結合分域、及(iii)於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域，且對該抗原具有中和活性。一般而言，中和活性係指抑制病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。抗原結合分子為抗體之情形，具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。某待驗物質之中和活性，係藉由將在配體之存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。

例如，作為IL-6R之主要配體考量者，以序列編號：3表示之IL-6為理想例。其胺基末端形成細胞外分域之I型膜蛋白質IL-6R，會與因IL-6而誘導二聚物化之gp130受體一起形成異四聚物(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由於該異四聚物之形成，組合於gp130受體之Jak活化。Jak進行自磷酸化及受體之磷酸化。受體及Jak之磷酸化部位，對於屬於如Stat3之有SH2之Stat家族之分子、或MAP激酶、PI3/Akt、其他具SH2之蛋白質或適應子(adaptor)，發揮結合部位之作用。其次，結合於gp130受體之Stat由於Jak而磷酸化。經磷酸化之Stat形成二聚物並移到核內，調整標的基因之轉錄。Jak或Stat經由其他類別之受體而涉及信號的串流。脫離控制的IL-6之信號串流，會觀察到自體免疫疾病之病態或發炎、多發性骨髓癌或前列腺癌等癌。能作為癌基因之Stat3，在許多癌中係持續地被活化。前列腺癌與多發性骨髓瘤中，來自IL-6R之信號串流與來自上皮成長因子受體(EGFR)家族成員之信號串流之間有串音(crosstalk)(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。

如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的標的細胞適當設定標的分子，不限定於上述因子。藉由測定活體內信號之活化，可評價中和活性。又，以對於存在活體內信號串流之下游的標的基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。標的基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在標的基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein) 或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。活體內信號活化之測定套組，也可適當使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。

再者，通常就測定作用於促進細胞增殖之方向之作用於信號串流的EGF受體家族等受體配體之中和活性之方法而言，可藉由測定標的細胞之增殖活性而評價中和抗體之中和活性。例如，就抗HB-EGF抗體基於中和活性對於例如HB-EGF等其增殖受EGF家族之成長因子而促進之細胞增殖之抑制效果予以評價或測定之方法而言，可理想地使用以下方法。在試管內評價或測定該細胞增殖抑制活性之方法，可使用測定培養基中添加之[³ H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指標的方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的formazan產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中同時加入配體及待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。活性測定時，作為對照抗體，將與抗HB-EGF 抗體有相同之構造同型之抗體且不具有該細胞增殖抑制活性之結合抗體與抗HB-EGF抗體同樣地使用，藉由抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體強的細胞增殖抑制活性，可判定活性。

用於評價活性之細胞，例如其增殖受HB-EGF促進之細胞，例如卵巢癌細胞RMG-1細胞株、經利用將以編碼為人類EGFR之細胞外分域與小鼠GCSF受體之細胞內分域於同一讀框融合而得之融合蛋白質hEGFR/mG-CSFR之基因表現之方式結合之載體轉形之小鼠Ba/F3細胞等可理想地使用。如此，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇用於評價活性之細胞而使用於測定前述細胞增殖活性。

抗體

本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG之不變區之後自然產生的改變體等也包括在內。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區，由於基因多型而致之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。尤其人類IgG1之序列，可為EU編號356-358號之胺基酸序列為 DEL，也可為EEM。又，就人類Igκ(Kappa)不變區與人類Igλ(Lambda)不變區而言，由於基因多型而致之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。

製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與IL-6結合之抗體(抗IL-6R抗體)之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。

抗IL-6R抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人類化抗體」或「嵌合抗體」。

單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL-6R蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL-6R抗體之融合瘤。

具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先，藉由表現在序列編號：2揭示其核苷酸序列之IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：1表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL-6R之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之IL-6R，例如可使Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代替表現以序列編號：1表示之IL-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。

對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL-6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL-6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL-6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：1之胺基酸序列當中相當於20-357號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。

又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之IL-6R之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。

以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。

依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。

又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。

-可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激

-無需精製免疫抗原

為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL-6R之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識IL-6R之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。

以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL-6R結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。

與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。

HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。

如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。

基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。

更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。

免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。

細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。

以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。

以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT 感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。

所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於IL-6R之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的IL-6R。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。

為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL-6R之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL-6R強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之IL-6R的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL-6R強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生IL-6R單株抗體之融合瘤。

或抗體對於經固定化之IL-6R表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL-6R表現細胞固定化在ELISA板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。

以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。

將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。

從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。

例如，可從產生抗IL-6R抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6R抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。

-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)

-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)

萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。

從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。

為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。

以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。

具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之不變區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。

利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於IL-6R之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6R之抗體時，抗體對於IL-6R之結合，更佳為專一性的。與IL-6R結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸IL-6R表現細胞之步驟、(2)檢測IL-6R表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與IL-6R表現細胞結合之抗體之步驟。

檢測抗體與IL-6R表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與IL-6R表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用IL-6R表現細胞之固定標本。

以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。

獲得編碼為目的抗IL-6R抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗IL-6R抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體不變區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於同一讀框融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指不變區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具不變區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體不變區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於同一讀框融合，可以構建嵌合抗體表現載體。

為了製造抗IL-6R單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：4)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗IL-6R抗體之DNA的重組細胞。

為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 1994/11523)。

用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。

(1)哺乳類細胞：CHO(中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cell line))、COS(猴腎細胞株(Monkey kidney cell line))、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼倉鼠腎細胞株(baby hamster kidney cell line))、Hela、Vero、HEK293(有受剪切之腺病毒的人類胚胎腎細胞株(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus)(Ad)5 DNA)、PER.C6細胞(經腺病毒型E1A及E1B基因轉形的人類胚胎網膜細胞株(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes))等(Current Protocols in Protein Science(May、2001、Unit 5.9、Table 5.9.1))

(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等

(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等

或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。

又，真菌細胞可以利用如下的細胞。

-酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬

-絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬

又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。

重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，將抗體基因藉由於同一讀框插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌羊體內。從接受胚胎的羊產生之基因轉殖羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。

本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人類為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。

本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的抗原結合分域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。

人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針對4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。

又，連結之鹼基序列可設計為彼此於同一讀框連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。

最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於同一讀框融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。

以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。

又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。

再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於同一讀框融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

又，就取得抗體基因之方法而言，除上述以外，也可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)製作用之表現載體構建之用途等)之方法。

EU編號及Kabat編號

依照本發明使用之方法，指定為抗體之CDR與FR之胺基酸位置係依照Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區之胺基酸係依照Kabat編號，不變區之胺基酸係依照Kabat之胺基酸位置的EU編號表示。

離子濃度之條件

金屬離子濃度之條件

本發明之一態樣中，離子濃度係指金屬離子濃度。「金屬離子」，係指屬於氫以外之鹼金屬及銅族等第I族、鹼土類金屬及鋅族等第II族、硼以外之第III族、碳與矽以外之第IV族、鐵族及鉑族等第VIII族、V、VI及VII族之各A亞族的元素、及銻、鉍、釙等金屬元素的離子。金屬原子具有釋出原子價電子而成為陽離子之性質，此稱為離子化傾向。離子化傾向大的金屬，富有化學活性。

本發明理想的金屬離子，例如鈣離子。鈣離子涉及許多生命現象的調節，涉及骨骼肌、平滑肌及心肌等肌肉的收縮、白血球的運動及吞噬等的活化、血小板的變形及分泌等之活化、淋巴球之活化、組織胺之分泌等的肥胖細胞的活化、經由兒茶酚胺α受體或乙醯膽鹼受體之細胞之回應、胞吐作用、由神經原末端釋出傳遞物質、神經原之軸策流(axonal flow)等。細胞內之鈣離子受體，已知有具多個鈣離子結合部位，且據認為在分子進化上來自共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，其結合模體(motif)已有多數已知。例如，Cadherin分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之Gla分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型lectin、LDL受體所含之A分域、annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域為人類所熟知。

本發明中，金屬離子為鈣離子之情形，鈣離子濃度之條件可列舉低鈣離子濃度之條件與高鈣離子濃度之條件。依據鈣離子濃度之條件而使結合活性改變，係指由於低鈣離子濃度與高鈣離子濃度之條件之不同而使抗原結合分子所含之抗原結合分域對於抗原之結合活性改變。例如，比起在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分域對於抗原之結合活性，在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分域對於抗原之結合活性較高之情形。又，例如比起在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分域對於抗原之結合活性，在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分域對於抗原之結合活性較高之情形。

本說明書中，高鈣離子濃度並非特別限於單值的數值，較佳可為從100μM至10mM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從200μM至5mM之間選擇之濃度。又，於不同態樣，可為從400μM至3mM之間選擇之濃度，另一態樣中，可為從200μM至2mM之間選擇之濃度。又，也可為從400μM至1mM之間選擇之濃度。尤其，接近在活體內之血漿中(血中)之鈣離子濃度的從500μM至2.5mM之間選擇之濃度為理想。

本說明書中，低鈣離子濃度並非特別限於單值的數值，較佳為可從0.1μM至30μM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從0.2μM至20μM之間選擇之濃度。又，於不同態樣中，也可為從0.5μM至10μM之間選擇之濃度，於另一態樣中，也可為從1μM至5μM之間選擇之濃度。再者，也可為從2μM至4μM之間選擇之濃度。尤其，宜為接近活體內之早期內體內之離子化鈣濃度之從1μM至5μM之間選擇之濃度。

本發明中，在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性比起在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低，係指本發明之抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在從0.1μM至30μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從100μM至10mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。較佳為，本發明之抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在從0.5μM至10μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從200μM至5mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，尤佳為在活體內之早期內體內的鈣離子濃度之抗原結合活性比起在活體內之血漿中之鈣離子濃度之抗原結合活性弱，具體而言，抗原結合分子在從1μM至5μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從500μM至2.5mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。

依金屬離子濃度之條件，抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子對於抗原之結合活性是否會變化，例如可依在前述結合活性之項目記載之公知測定方法而決定。例如，為了確認比起在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子對於抗原之結合活性，在高鈣離子濃度之條件下該分域或含分子對於抗原之結合活性變化為較高，係比較在低鈣離子濃度及高鈣離子濃度之條件下之該分域或該分子對於抗原之結合活性。

又，本發明中，「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」之表現方式，也可表達為抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」記載為「在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在低鈣離子濃度之條件之抗原結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」，記載為「使在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」。

測定對於抗原之結合活性時，鈣離子濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37℃的條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型抗原之情形，可藉由以抗原作為分析物流過固定有抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子之晶片以評價對於可溶型抗原之結合活性，當抗原為膜型抗原時，可藉由以抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片以評價對於膜型抗原之結合活性。

本發明之抗原結合分子中，只要在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性弱於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性即可，在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性與在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，但較佳對於抗原，在低鈣離子濃度之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與在高鈣離子濃度之條件之KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上，較佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為10以上，又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等各種值。

對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、流式細胞計數器等。

又，代表本發明之抗原結合分子在低鈣濃度之條件對於抗原之結合活性與在高鈣濃度之條件對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在低鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)與在高鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。

抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定不同鈣離子濃度時抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將鈣濃度以外之條件設為相同。

例如本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含WO2012/073992等(例如段落0200-0213)記載之方法篩選。

庫

依某一態樣，本發明之抗原結合分域或抗原結合分子，可由依據離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基係含於抗原結合分域之彼此序列互異之多數抗原結合分子為主而得之庫取得。離子濃度之例，可理想地列舉金屬離子濃度或氫離子濃度。

本說明書中，「庫」係指包含多數抗原結合分子或抗原結合分子之多數融合多胜肽、或編碼為該等序列之核酸、聚核苷酸。庫中所含之多數抗原結合分子或含有抗原結合分子之多數融合多胜肽之序列，並非單一序列，而是序列彼此互異之抗原結合分子或含有抗原結合分子之融合多胜肽。

本說明書中，序列彼此互異之多數抗原結合分子的記載中，用語「序列彼此互異」，係指庫中之各個抗原結合分子的序列彼此相異。亦即庫中彼此相異之序列之數目，反映出庫中之序列不同之獨立選殖體之數目，有時也稱為「庫大小」。通常的噬菌體提示庫為10⁶ 至10¹² ，可使用核糖體提示法(ribosome display)等公知技術，將庫大小擴大到10¹⁴ 。但，噬菌體庫之淘選選擇時使用之噬菌體粒子實際數目，通常比起庫大小大10至10,000倍。該過大倍數也稱為「庫當量數」，代表可能存在10至10,000個有相同胺基酸序列之各個選殖體。是以，本發明之「序列彼此互異」之用語，意指排除當量數之庫中之各個抗原結合分子之序列彼此不同，更具體而言，意指存在序列彼此互異之抗原結合分子10⁶ 至10¹⁴ 個分子，較佳為10⁷ 至10¹² 個分子，更佳為10⁸ 至10¹¹ 個分子，尤佳為10⁸ 至10¹⁰ 。

又，本發明記載之以多數抗原結合分子為主而成之庫中之用語「多數」，例如本發明之抗原結合分子、融合多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常為其物質之2個以上種類的集合。例如若為某2個以上之物質就特定形質互異，則代表該物質有存在2種以上。舉例來說，在胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的改變體胺基酸。例如，柔性殘基以外、或露出於表面之非常多樣的胺基酸位置的特定改變體胺基酸以外係實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上抗原結合分子時，本發明之抗原結合分子存在多個。其他實施例中，若編碼為柔性殘基之鹼基以外、或編碼為露出於表面之非常多樣之胺基酸位置之特定改變體胺基酸之鹼基以外為實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上之聚核苷酸分子，則本發明之聚核苷酸分子有多個存在。

再者，本發明之以多數抗原結合分子為主而成之庫中記載之用語「以其為主而成」，係反映庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件不同，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之數目。具體而言，宜在庫中至少存在顯示如此之結合活性之抗原結合分子10⁴ 個分子。又，更佳為，能從至少存在如此之顯示結合活性之抗原結合分子有10⁵ 個分子之庫取得本發明之抗原結合分域。又更佳為，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有10⁶ 個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。尤佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有10⁷ 個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。又，再更佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有10⁸ 個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。其他表達方式中，也可以庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之比例的形式理想地表現。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子在庫中之序列相異之獨立選殖體之數含有0.1%至80%，較佳為0.5%至60%，更佳為1%至40%，又更佳為2%至20%，尤佳為4%至10%之庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可以用分子數或在分子全體之比例表現。又，於病毒之情形，也與上述相同，可以用病毒個體之數或在個體全體比例表現。

依鈣離子濃度之條件，抗原結合分域對於抗原之結合活性會改變之胺基酸

依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗原結合分子可以用任意方式製備，例如當金屬離子為鈣離子濃度時，可使用預先存在之抗原結合分域或抗原結合分子、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或導入有非天然胺基酸變異而得之抗體或庫(可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。

如前述依離子濃度之條件，使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，例如，金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結合模體之胺基酸即可，其種類不限。鈣結合模體對於該技術領域中具有通常知識者為周知並已有詳細記載(例如Springer等人(Cell(2000)102,275-277)、Kawasaki及Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)、Moncrief等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)、Chauvaux等人(Biochem.J.(1990)265,261-265)、Bairoch及Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2,410-419)、Schaefer等人(Genomics(1995)25,638~643)、Economou等人(EMBO J.(1990)9,349-354)、Wurzburg等人(Structure.(2006)14,6,1049-1058))。亦即ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型外源凝集素(lectin)等任意公知之鈣結合模體，包括在本發明之抗原結合分子。如此之鈣結合模體之理想例，除了上述以外，也可列舉序列編號：5記載之抗原結合分域所含之鈣結合模體。

又，依照鈣離子濃度之條件，本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化之胺基酸，例如具有金屬螯合作用之胺基酸亦為理想。有金屬螯合作用之胺基酸，例如絲胺酸(Ser(S))、蘇胺酸(Thr(T))、天冬醯胺酸(Asn(N))、麩醯胺酸(Gln(Q))、天冬胺酸(Asp(D))及麩胺酸(Glu(E))等。

前述之胺基酸所含之抗原結合分域之位置不限定於特定位置，只要依鈣離子濃度之條件會使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變即可，可為形成抗原結合分域之重鏈可變區或輕鏈可變區中之任意位置。亦即，本發明之抗原結合分域，可從由依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在重鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成庫取得者。又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，係從該胺基酸係包含在重鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸包含在重鏈CDR3之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。

又，本發明之一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可能依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在輕鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。又，於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈CDR1之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈之CDR1以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。

又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈之CDR2之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，提供由該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR2之以Kabat編號表示之50位之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫。

又，於其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之以Kabat編號表示之92位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。

又，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在前述記載之輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3中選出的2個或3個CDR之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得作為本發明之不同態樣。再者，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在輕鏈之以Kabat編號表示之30位、31位、32位、50位及/或92位中之任一者以上的序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。

尤理想的實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列，以具有人類之生殖細胞系框架序列為理想。因此，於本發明之一態樣中，若框架序列完全為人類序列，且對於人類投予(例如疾病之治療)時，可認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不會引起免疫原性反應。由上述含意，本發明之「含有生殖細胞系列之序列」，係指本發明之框架序列的一部分與任一人類之生殖細胞系框架序列的一部分為相同。例如，當為本發明之抗原結合分子之重鏈FR2之序列與多數不同之人類之生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列組合而得之序列時，亦為本發明之「含有生殖細胞系列之序列」抗原結合分子。

框架，例如V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站包括的現在已知之完全人類型之框架區之序列為理想。該等框架區之序列可適當使用作為在本發明之抗原結合分子包含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列，也可依其類似性分類(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可從分類為7個次群之Vκ、分類為10個次群之Vλ、分類為7個次群之VH適當選擇理想的生殖細胞系列之序列。

完全人類型之VH序列不僅限定於下列，但可舉例如VH1次群(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2次群(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3次群(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4次群(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5次群(VH5-51)、VH6次群(VH6-1)、VH7次群(VH7-4、VH7-81)之VH序列等為理想例。該等在公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等也有記載，該技術領域中具有通常知識者可依據該等序列資訊適當設計本發明之抗原結合分子。該等以外之完全人類型之框架或框架之準區也可理想地使用。

完全人類型之Vκ序列，不僅限定於下列，例如可舉分類於Vk1次群之A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、分類於Vk2次群之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、分類於Vk3次群之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、分類於Vk4次群之B3、分類於Vk5次群之B2(本說明書中，也記載為Vk5-2))、分類於VK6次群之A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))。

完全人類型之Vλ序列不僅限定於下列，例如可舉分類於VL1次群之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、分類於VL1次群之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、分類於VL3次群之V3-2、V3-3、V3-4、分類於VL4次群之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、分類於VL5次群之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))為理想。

通常該等框架序列由於一個或更多胺基酸殘基的不同而彼此互異。該等框架序列可以與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用。與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架之例，不僅限定於此，其他也有比如KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如前述Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。

本發明不拘於特定理論，在使用生殖細胞系序列能期待排除幾乎於個人類的有害免疫反應之理由之一，據認為係如下所述。由於在通常之免疫反應中發生之親和性成熟步驟，會在免疫球蛋白之可變區頻繁地發生體細胞之突變。該等突變主要產生在其該序列為超可變的CDR的周邊，但也會影響到框架區的殘基。該等框架的突變在生殖細胞系之基因不存在，成為患者之免疫原性的可能性少。據推論此係通常之人類族群係已暴露於由生殖細胞系之基因表現的框架序列中的大多數，而有免疫寬容，結果該等生殖細胞系之框架在患者為低免疫原性或非免疫原性。為了使免疫寬容之可能性最大，可從普通存在之機能性生殖細胞系基因之集合選擇編碼為可變區之基因。

為了製作本發明之依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸包含於可變區序列之序列、重鏈可變區或輕鏈可變區之序列、或CDR序列或框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。

例如，可藉由將選擇預先含有依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少1個胺基酸殘基之作為框架序列之輕鏈可變區、及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區予以組合，而製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，離子濃度為鈣離子濃度時，例如可舉序列編號：5(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列為代表之輕鏈可變區序列與製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區組合而得之庫為理想。

又，在選擇預先含有前述依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基之作為框架序列之輕鏈可變區之序列中，也可設計使得含有多樣的胺基酸作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中，如此之殘基稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可包括一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：5(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。

【表1】

本說明書中，柔性殘基係指當比較公知之及/或天然抗體或抗原結合分域之胺基酸序列時，在該位置提示之幾個具有不同胺基酸之輕鏈及重鏈可變區上之胺基酸為非常多樣的位置所存在胺基酸殘基的變化(variation)。非常多樣的位置一般存在於CDR區。於一態樣中，當決定公知之及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)提供之資料係為有效。又，在網路上的許多資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)，提供收集的多數人類輕鏈及重鏈序列及其配置，該等序列及其配置的資訊在決定本發明中之非常多樣的位置時有用。依本發明，當胺基酸位在的位置較佳有約2至約20，更佳為約3至約19，較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個可能的不同胺基酸殘基的多樣性時，其位置可稱為非常多樣。在一些實施形態中，有些胺基酸位置，可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的相異胺基酸殘基的多樣性。

又，藉由組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也能製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：6(Vk1)、序列編號：7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等生殖細胞系列之特定殘基取代為依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列庫而製作之重鏈可變區而得之庫為理想例。該胺基酸殘基之非限定例，例如輕鏈之CDR1包含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之非限定之另一例，可舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。

如前述，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之30位、31位、及/或32位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR3所含胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之92位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要可形成鈣結合模體，及/或依照鈣離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有，也可組合該等胺基酸二個以上含有。又，已知有具多個鈣離子結合部位且據認為在分子進化上來自於共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，也可設計輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3使含有其結合模體。例如可以上述目的適當使用Cadherin分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之Gla分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型外源凝集素、LDL受體所含之A分域、annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域。

於組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區時，亦與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件變化即可，該柔性殘基之數及位置不限於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中可含有一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。

組合之重鏈可變區之例，可理想地舉隨機化可變區庫。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知之方法。本發明之一非限定態樣中，依據經特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因而構建的免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。

又，本發明之一非限定態樣中，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，係指可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或可與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如Insightll程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型的座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊實施。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人類電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。

又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人類之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變庫取得的胺基酸序列。

本發明之一態樣中，係從組合選擇預先含有「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列之重鏈可變區、及作為隨機化可變區序列庫製作之輕鏈可變區而含有本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫，獲得本發明之抗原結合分域。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：10(6RL#9-IgG1)或序列編號：11(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區而得之庫為理想例。又，可將製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區，替換為從具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區之中適當選擇而製作。例如組合序列編號：10(6RL#9-IgG1)或序列編號：11(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列以及具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區而得之庫為理想例。

又，也可設計使得選擇預先含有前述「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列的重鏈可變區之序列，含有柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要能依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含有一個或更多的柔性殘基。例如，當離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：10(6RL#9-IgG1)記載之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，比如重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位、96位及/或100a位以外之CDR3之胺基酸殘基。或導入於序列編號：11(6KC4-1#85-IgG1)之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位及/或101位以外之CDR3之胺基酸殘基。

又，藉由將前述導入有「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之重鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合，也能製作含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，於離子濃度為鈣離子濃度時，例如將重鏈可變區之特定殘基取代為依鈣依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區予以組合而得之庫。該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，就該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例可列舉重鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。該胺基酸殘基為重鏈之CDR3包含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉重鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之胺基酸。又，此等胺基酸殘基，只要能形成鈣結合模體，及/或鈣依照離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有，也可組合該等胺基酸二個以上並含有。

前述將導入有依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基之重鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合時，也與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該重鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要可依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。又，依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基以外之重鏈可變區之CDR1、CDR2及/或CDR3之胺基酸序列，也可使用隨機化可變區庫。輕鏈可變區使用生殖細胞系列之序列時，例如序列編號：6(Vk1)、7(Vk2)、序列編號：8(Vk3)、序列編號：9(Vk4)等生殖細胞系列之序列為非限定例。

前述，依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，只要能形成鈣結合模體即可，且任一胺基酸均能理想地使用，但如此之胺基酸具體而言可舉有電子提供性之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，可舉絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸或麩胺酸。

氫離子濃度之條件

又，本發明之一態樣中，離子濃度之條件係指氫離子濃度之條件或pH之條件。本發明中，質子亦即氫原子之原子核之濃度條件，可以與氫指數(pH)之條件同義處理。水溶液中之氫離子之活動量若以aH+表示，pH定義為-log10aH+。水溶液中之離子強度若(例如比10^-3 低)低，aH+大約等於氫離子強度。例如於25℃、1大氣壓，水之離子積為Kw=aH+aOH=10-14，所以純水中，aH+=aOH=10-7。此時之pH=7為中性，pH小於7的水溶液為酸性，pH大於7之水溶液為鹼性。

本發明中，離子濃度之條件使用pH的條件時，pH之條件可列舉高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件，與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件。依pH之條件，本發明之抗原結合分子所含之抗原結合分域對抗原之結合活性改變，係指由於高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)與低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件不同，抗原結合分子所含之抗原結合分域對於抗原之結合活性改變。例如，比起於pH酸性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，在pH中性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性較高的情形。又，也可列舉pH酸性域之條件時抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH中性域之條件時抗原結合分子對於抗原之結合活性的情形。

本說明書中，pH中性域並不特別限於單值的數值，理想者為從pH6.7至pH10.0之間選擇。又，其他態樣中，可從pH6.7至pH9.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH7.0至pH9.0之間選擇，其他態樣中，可從pH7.0至pH8.0之間選擇。尤其，在活體內之血漿中(血中)的pH附近的pH7.4為理想。

本說明書中，pH酸性域並非特別限於單值的數值，宜從pH4.0至pH6.5之間選擇。又，另一態樣中，可從pH4.5至pH6.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH5.0至pH6.5之間選擇，其他態樣中，可從pH5.5至pH6.5之間選擇。尤以接近活體內之早期內體內之離子化鈣濃度之pH5.8較理想。

本發明中，抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件對於抗原之結合活性，係指本發明之抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在從pH4.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7 至pH10.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性之意。較佳為，較佳為本發明之抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在從pH4.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7至pH9.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，更佳為抗原結合分子在從pH5.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH9.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。又，較佳為抗原結合分子在從pH5.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH8.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。尤佳為，在活體內之早期內體內之pH之抗原結合活性弱於在活體內之血漿中之pH之抗原結合活性，具體而言，抗原結合分子在pH5.8對於抗原之結合活性弱於在pH7.4對於抗原之結合活性。

抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子對於抗原之結合活性是否依pH之條件而改變，例如可使用在前述結合活性之項目記載之公知之測定方法決定。亦即，依該測定方法測定在不同pH之條件下之結合活性。例如，為了確認在pH中性域之條件下抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下前述分域或前述結合活性對於抗原之結合活性，比較在pH酸性域及pH中性域之條件下，前述分域或前述分子對於抗原之結合活性。

又本發明中，「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」之表達方式，也可表達為：抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性，高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」。

對於測定抗原之結合活性時之氫離子濃度或pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如，可於HEPES緩衝液、37℃之條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，當抗原為可溶型抗原的情形，可藉由將抗原作為分析物流過固定有抗原結合分域或該含分域之抗原結合分子之晶片，而評價對於可溶型抗原之結合活性，於抗原為膜型抗原之情形，可藉由將抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片，而評價對於膜型抗原之結合活性。

本發明之抗原結合分子，只要在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性即可，在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之KD之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上，更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為10以上，又更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值之上限不特別限定，只要是該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等任意值。

又，代表本發明之抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之kd(解離速度常數)與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。

抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定不同氫離子濃度亦即pH時抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將氫離子濃度亦即pH以外之條件設為相同。

例如本發明提供之一個態樣，即在氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗原結合分子之篩選取得。

(a)獲得在pH酸性域之條件下抗原結合分域或抗原結合分子之抗原結合活性；(b)獲得在pH中性域之條件下抗原結合分域或抗原結合分子之抗原結合活性；及(c)選擇在pH酸性域之條件之抗原結合活性低於在pH中性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子。

又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗原結合分子或此等之庫之篩選而取得。

(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗原結合分子或此等之庫接觸抗原；(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗原結合分子放置在pH酸性域之條件下；及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域或抗原結合分子單離。

又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域或抗原結合分子或此等之庫之篩選取得。

(a)於pH酸性域之條件下使抗原結合分域或抗原結合分子之庫接觸抗原；(b)選擇在前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域或抗原結合分子；(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域或抗原結合分子於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗原結合分子單離。

再者，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含以下步驟(a)~(c)之篩選方法取得。

(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗原結合分子之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)將在前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域或抗原結合分子於pH酸性域之條件從管柱溶出；及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域或抗原結合分子單離。

又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。

(a)於pH酸性域之條件使抗原結合分域或抗原結合分子之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域或抗原結合分子；(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域或抗原結合分子於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗原結合分子單離。

(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗原結合分子之庫接觸抗原；(b)取得在前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗原結合分子；(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域或抗原結合分子放置在pH酸性域之條件；及(d)將在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域或抗原結合分子單離。

又，前述步驟也可重複2次以上。因此，依本發明，可提供利用上述篩選方法中，更包含重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之篩選方法取得之在pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。

本發明之篩選方法中，高氫離子濃度條件或低pH亦即pH酸性域之抗原結合分域或抗原結合分子之抗原結合活性，只要是pH為4.0~6.5之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH例如pH為4.5~6.6之間之抗原結合活性。更佳的pH，例如pH為5.0~6.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為5.5~6.5之間之抗原結合活性。更佳之pH例如活體內之早期內體內之pH，具體而言例如於pH5.8之抗原結合活性。又，於低氫離子濃度條件或高pH亦即pH中性域之抗原結合分域或抗原結合分子之抗原結合活性，只要是pH為6.7~10之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH為例如pH為6.7~9.5之間之抗原結合活性。其他理想的pH可列舉pH為7.0~9.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為7.0~8.0之間之抗原結合活性。更佳的pH，可舉在活體內之血漿中之pH，具體而言可舉於pH為7.4之抗原結合活性。

抗原結合分域或抗原結合分子之抗原結合活性，可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，針對離子化鈣濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。此等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、FACS等。

本發明中，選擇在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子之步驟，係與選擇在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之抗原結合活性的抗原結合分域或抗原結合分子之步驟含意相同。

只要在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性即可，在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性與在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之差不特別限定，較佳為在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性為在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。

依氫離子濃度之條件使抗原結合分域對抗原之結合活性變化之胺基酸

依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗原結合分子可以用任意方式製備，例如可使用預先存在之抗原結合分子、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異而得之抗體或庫或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。

從對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗原結合分域或抗原結合分子，取得在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗原結合分子之方法，例如將如WO2009/125825記載之抗原結合分域或抗原結合分子中之胺基酸之至少一個取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或取代為非天然胺基酸變異或抗原結合分域或抗原結合分子中，插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之抗原結合分子或抗原結合分子為理想例。

側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異導入之位置不特別限定，只要比起取代或插入前，在pH酸性域之抗原結合活性比在pH中性域之抗原結合活性弱(KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)之值增大、或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值為增大)即可，可在任意部位。例如，於抗原結合分子為抗體之情形，抗體之可變區或CDR等為理想例。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之胺基酸之數目、或插入之胺基酸之數目可由該技術領域中具有通常知識者適當決定，可由側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之多數胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸。又，取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸以外，可同時進行其他胺基酸之缺失、附加、插入及/或取代等。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由該技術領域中具有通常知識者公知之丙胺酸掃描之丙胺酸取代為組胺酸等之組胺酸等掃描等的方法隨機進行，可從側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插入之變異經隨機導入之抗原結合分域或抗體之中，選擇比起變異前，KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值變大的抗原結合分子。

如前述，該側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異已進行且於pH酸性域之抗原結合活性低於在pH中性域之抗原結合活性之抗原結合分子之理想例，例如變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後在pH中性域之抗原結合活性，與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前在pH中性域之抗原結合活性為同等的抗原結合分子為理想例。本發明中，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之後之抗原結合分子，具有與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之抗原結合分子有同等抗原結合活性，係指變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合分子之抗原結合活性定為100%時，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後之抗原結合分子之抗原結合活性至少為10%以上，較佳為50%以上，更佳為80%以上，又較佳為90%以上。變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後，於pH7.4之抗原結合活性，也可高於變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之前在pH7.4之抗原結合活性。藉由取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸而使抗原結合分子之抗原結合活性減低時，可藉由將抗原結合分子中之1或多數胺基酸進行取代、缺失、附加及/或插入等，使得抗原結合活性與取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合活性為同等。本發明中，如此之側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插入後，藉由進行1或多數胺基酸之取代、缺失、附加及/或插入使得結合活性成為同等的抗原結合分子，也包括在內。

就本發明之一態樣而言，藉由組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分域或抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也可製作包含本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分域或抗原結合分子之庫。

該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例，也可列舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。

如前述，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之24位、27位、28位、31位、32位及/或34位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位及/或56位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93位、94位及/或95A位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要是依氫離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有也可組合2種以上該等胺基酸而含有。

前述組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區之情形，亦與前述同樣，可設定為使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分域或抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依氫離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。例如，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可列舉表3或表4記載之胺基酸殘基。又，依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基或柔性殘基以外之輕鏈可變區之胺基酸序列，就非限定例可理想地使用Vk1(序列編號：6)、Vk2(序列編號：7)、Vk3(序列編號：8)、Vk4(序列編號： 9)等等生殖細胞系列之序列。

前述依氫離子濃度之條件使抗原結合分域抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基，任一胺基酸殘基均可理想地使用，但如此之胺基酸殘基，具體而言可舉側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，除了組胺酸或麩胺酸等天然胺基酸以外，也可列舉組胺酸類似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)等非天然的胺基酸(Bioorg.Med. Chem.(2003)11(17),3761-2768。又，該胺基酸殘基之特佳例，可列舉側鏈之pKa為6.0-7.0之胺基酸。如此之有電子提供性之胺基酸，例如組胺酸。

組合之重鏈可變區之例，以隨機化可變區庫為理想例。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知方法。本發明之一非限定態樣中，依據以特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因構建之免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。

又，本發明之一非限定態樣中，與前述同樣，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型之座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊獲得。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人類電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。

又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人類之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。

FcRn

與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcγ受體不同，FcRn尤其是人類FcRn，在構造的上與主要組織不適合性複合體(MHC)第I類之多胜肽在構造相類似，且與第I類之MHC分子有22至29%之序列同一性(Ghetie等人，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn，係由與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRn之α鏈係由3個細胞外分域(α1、α2、α3)構成，且短的細胞質分域係將蛋白質留在細胞表面。α1及α2域會與抗體之Fc區中之FcRn結合分域交互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。

FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現，其涉及IgG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRn之囓齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有多數種類，在多數其他組織、及各種內皮細胞系表現。其在人類成人類血管內皮、肌肉血管系、及肝臓洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與IgG結合，並且再循環到血清，而據認為有維持IgG之血漿中濃度之作用。FcRn對於IgG分子之結合，通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7.0之pH酸性域。

以含序列編號：12表示之信號序列之多胜肽當做前驅體之人類FcRn，於活體內(序列編號：13記載包含信號序列之其多胜肽)會與人類β2-微球蛋白形成複合體。如後述參考實施例所示，與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以評價本發明之FcRn結合分域對於與如此的與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn的結合活性。本發明中，未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之FcRn結合分域結合之形態者，例如人類FcRn與人類β2-微球蛋白之複合體。

FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子對於FcRn尤其是人類FcRn之結合活性

本發明提供之抗原結合分子所含之FcRn結合分域對於FcRn尤其對於人類FcRn之結合活性，如前述結合活性之項目中所述，可依照該技術領域之人類士所公知之方法測定，針對pH以外之條件，可由該技術領域之人類士適當決定。抗原結合分域或含該分域之抗原結合分子之抗原結合活性與人類 FcRn結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度k_d (Dissociation rate：解離速度常數)、或視k_d (Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。該等可由該技術領域之人類士公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、流式細胞計數器等。

測定本發明FcRn結合分域含有該分域之抗原結合分子對於FcRn之結合活性時之pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可如WO2009/125825記載，於MES緩衝液、37℃之條件測定。又，本發明之之FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子對於FcRn之結合活性之測定，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。本發明之FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與FcRn之結合活性之測定，可藉由分別以FcRn或FcRn結合分域或含該分域之本發明之抗原結合分子作為分析物流過固定有FcRn結合分域或該分域之本發明之抗原結合分子或FcRn的晶片而評價。

作為本發明之抗原結合分子或該分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH酸性域，通常指pH4.0~pH6.5。較佳指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。作為本發明之抗原結合分子或該分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。pH中性域較佳為pH7.0 ~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接近活體內之血漿中(血中)之pH之pH7.4。由於在pH7.4時人類FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性低，當難評價其結合親和性時，可將pH7.4替換為使用pH7.0。就測定條件使用之溫度而言，FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與FcRn之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為與從20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃的任意溫度，也同樣用於決定人類FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與FcRn之結合親和性而可使用。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。

FcRn結合分域

本發明之抗原結合分子具有於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域。FcRn結合分域，只要是抗原結合分子在酸性pH域具有FcRn結合活性即不特別限定，又，也可為直接或間接對於FcRn具結合活性之分域。如此的分域，例如作為直接對於FcRn具結合活性之FcRn結合分域，例如IgG型免疫球蛋白之Fc區、白蛋白、白蛋白分域3、Christianson等人(mAbs(2012)4(2),208-216)等記載之抗FcRn抗體、WO2007/098420等記載之抗FcRn胜肽、抗FcRn Scaffold分子等、或間接對於人類FcRn具結合活性之與IgG 或白蛋白結合之分子等為理想。該分域只要是預先在pH酸性域具FcRn結合活性之分域，即可直接使用。該分域在pH酸性域沒有FcRn結合活性或弱時，可改變抗原結合分子中之形成FcRn結合分域之胺基酸而賦予FcRn結合活性。又，也可預先將在pH酸性域對FcRn有結合活性之分域中之胺基酸改變，而提高於pH酸性域對FcRn之結合活性。FcRn結合分域之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性域對FcRn之結合活性，而找出目的之改變。

Fc區

Fc區包含從抗體重鏈之不變區而來之胺基酸序列。Fc區，係EU編號表示之約216位之胺基酸中，自木瓜酶切斷部位之鉸鏈區之N末端起包含該鉸鏈、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。Fc區可從人類IgG1得到，但不限IgG之特定之次類別。如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區。

於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域

如前述，本發明之一非限定態樣中，作為於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域係使用人類IgG型免疫球蛋白之Fc區。作為該分域，若為預先於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之Fc區即可直接使用，如此之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。又，當Fc區於pH酸性域條件下對FcRn無結合活性或弱結合活性的情形，可藉由改變該Fc區中之胺基酸而取得所望之對FcRn有結合活性之Fc區。又，藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得於pH酸性域條件下對FcRn有所望結合活性或結合活性增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性而找出。例如：可依前述「FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子對於FcRn，尤其對於人類FcRn之結合活性」之項目記載之方法，找出如此的胺基酸改變。

如此之改變一非限定態樣可列舉於pH酸性域之條件下對FcRn之結合活性增強之Fc區之改變。為了改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區(初始Fc區)，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。初始Fc區之起源不限定，可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為，任意生物為從小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、長爪沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選出的生物為理想例。其他態樣中，初始Fc區也可從食蟹猴、狨猴、獼猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為，初始Fc區從人類IgG1取得，且不限定於IgG之特定類別。其意指人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區可理想地作為初始Fc區使用。同樣，本說明書中，前述來自任意生物之IgG之任意類別或次類別之Fc區較佳為可作為初始Fc區。天然存在之IgG之改變體或操作之型之例，記載於公知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009) 20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限於此等。

改變例如包括：一個以上之變異，例如，取代為與初始Fc區之胺基酸相異之胺基酸殘基之變異、或對於初始Fc區之胺基酸插入一個以上之胺基酸殘基或使初始Fc區之胺基酸有一個以上胺基酸缺失等。較佳為，改變後之Fc區之胺基酸序列中包括至少一部分非天然之Fc區之胺基酸序列。如此的變種必然與初始Fc區有少於100%之序列同一性或類似性。理想之實施形態中，變種與初始Fc區之胺基酸序列有約75%~少於100%之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為約80%~少於100%，又更佳為約85%~少於100%，再更佳為約90%~少於100%，最佳為約95%~少於100%之同一性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，初始Fc區及本發明之經改變之Fc區之間，有至少1個胺基酸之差異。初始Fc區與改變Fc區之胺基酸之不同，尤其以前述EU編號指定之胺基酸殘基之位置之經指定之胺基酸之差異也可理想地指定。

改變為其他胺基酸之改變，只要在pH酸性域條件下對FcRn有結合活性、或於酸性域條件下對於人類FcRn之結合活性提高即可，可將任意位置之胺基酸改變。本發明之抗原結合分子當含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域的情形，宜含有帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性為增強之效果之改變較佳。可如此改變之胺基酸，例如：國際公開WO1997/034631所記載之EU編號表示之252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位、及/或434位及與該等胺基酸組合之253位、310位、435位、及/或426位之胺基酸。如國際公開WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸較理想。同樣地，可如此改變之胺基酸，例如國際公開WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想。再者，可如此改變之胺基酸，如國際公開WO2004/092219所記載，可列舉EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。此外，作為可如此改變之胺基酸，也可理想地列舉例如國際公開WO2006/020114記載之238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位、及/或442位之胺基酸。又，作為可如此改變之胺基酸，例如也可理想地列舉國際公開WO2010/045193記載之EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸。藉由該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區於pH酸性域條件下對FcRn之結合增強。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從以下群組中選擇之至少一種以上之胺基酸之改變：EU編號表示之251位之胺基酸為Arg或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中之任一者、308位之胺基酸為Ile或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser中之任一者、312位之胺基酸為Ala或Asp中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者

433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者

。又，改變之胺基酸之數目不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可有二處以上之胺基酸改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之308位之胺基酸為Ile、309位之胺基酸為Pro、及/或311位之胺基酸為Glu之改變。又，該改變之其他一非限定態樣，可為包含308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Leu、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包含308位之胺基酸為Ile或Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala或Leu之改變。該改變之不同之一非限定態樣，可為包含308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ser、312位之胺基酸為Asp、及/或314位之胺基酸為Leu之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之251位之胺基酸為Leu、252位之胺基酸為Tyr、254位之胺基酸為Ser、或Thr、255位之胺基酸為Arg、及/或256位之胺基酸為Glu之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、及/或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包含428位之胺基酸為His或Met、及/或434位之胺基酸為His或Met之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之385位之胺基酸為Arg、386位之胺基酸為Thr、387位之胺基酸為Arg、及/或389位之胺基酸為 Pro之改變。又，該改變之其他非限定態樣，可為包含385位之胺基酸為Asp、386位之胺基酸為Pro及/或389位之胺基酸為Ser之改變。

再者，含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從以下之群組中選擇之至少一個以上之胺基酸之改變：EU編號表示之250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者。又，改變之胺基酸之數不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可有二處胺基酸改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之250位之胺基酸為Gln、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包含250位之胺基酸為Glu、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉以下群組中選擇之至少二個以上之胺基酸之改變： EU編號表示之251位之胺基酸為Asp或Glu中之任一者、252位之胺基酸為Tyr、307位之胺基酸為Gln、308位之胺基酸為Pro、378位之胺基酸為Val、380位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Leu、430位之胺基酸為Ala、或Lys中之任一者、434位之胺基酸為Ala、His、Ser、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Ile。

又，改變之胺基酸之數不特別限定，可僅有二處胺基酸改變，也可有三處以上之胺基酸改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者之改變。又，該改變其他一非限定態樣，可為包含308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包含252位之胺基酸為Tyr、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之一不同的非限定態樣，可為包含378位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之又另一不同的非限定態樣，可為包含428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為 Ala之改變。又，該改變之又另一其他不同的非限定態樣，可為包含434位之胺基酸為Ala、及436位之胺基酸為Ile之改變。再者，該改變之又另一非限定態樣，可為包含308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。再者，該改變之又另一非限定態樣，可為包含307位之胺基酸為Gln、及436位之胺基酸為Ile之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ser中之任一者之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包含307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包含252位之胺基酸為Tyr、308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。該改變之不同之一非限定態樣，可為包含251位之胺基酸為Asp、307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為His之改變。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可舉從以下之群組中選擇之至少二種以上之胺基酸之改變：EU編號表示之238位之胺基酸為Leu、244位之胺基酸為Leu、 245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、252位之胺基酸為Tyr、256位之胺基酸為Pro、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp中之任一者、312位之胺基酸為Pro、 316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、或Asn中之任一者、380位之胺基酸為Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、434位之胺基酸為Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中之任一者、 436位之胺基酸為Ile、Leu、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys。

含有人類IgG1之Fc區作為FcRn結合分域之情形，帶來於pH酸性域條件下對FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包含EU編號表示之257位之胺基酸為Ile、及311位之胺基酸為Ile之改變。又，該改變其他之一非限定態樣，可為包含257位之胺基酸為Ile、及434位之胺基酸為His之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包含376位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為His之改變。

Fcγ受體

Fcγ受體(FcγR)，係指能與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合的受體，實質上意指由Fcγ受體基因編碼之蛋白質之家族的任一成員。人類中，該家族包括含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，以及任意未曾發現的人類FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。FcγR，包括人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限定於此等，可為任意生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、及任意未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。如此的Fcγ受體之理想例，可舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：18(NM_000566.3)及19(NP_000557.1)，FcγRIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：20(BC020823.1)及21(AAH20823.1)、FcγRIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：22(BC146678.1)及23(AAI46679.1)，FcγRIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：24(BC033678.1)及25(AAH33678.1)，FcγRIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：26(BC128562.1)及27AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。Fcγ受體是否有與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合之活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及包括同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之 FcγRIII(CD16)，會與IgG之Fc部分結合之α鏈及在細胞內傳遞活化信號之有ITAM之共通γ鏈組合。另一方面，含有同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)本身的細胞質分域，包括ITAM。該等受體在巨噬細胞或肥大細胞(mast cell)、抗原提示細胞等許多免疫細胞表現。該等受體藉由與IgG之Fc部分結合而傳遞的活化信號，促進巨噬細胞之吞噬能力或發炎性細胞激素產生、肥大細胞之脫顆粒、抗原提示細胞之機能亢進。如上述，具有傳遞活化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為活性型Fcγ受體。

另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)本身的細胞質內分域包括傳遞抑制型信號之ITIM。B細胞中，由於FcγRIIb與B細胞受體(BCR)的交聯，抑制來自BCR之活化信號。結果使BCR之抗體產生受抑制。巨噬細胞中，由於FcγRIII與FcγRIIb之交聯使吞噬能力或發炎性細胞激素的產生能力受抑制。如上述有傳遞抑制化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為抑制型Fcγ受體。

對於Fcγ受體之結合活性

本發明之抗原結合分子所含之FcγR結合分域之FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者對於人類Fcγ受體之結合活性，可利用如上記載之FACS或ELISA格式確認，此外也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

ALPHA篩選，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。接近於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子以生物學交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。

例如。於提供者珠結合有包括經生物素標記之FcγR結合分域之抗原結合分子，於接受者珠結合有以麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的Fcγ受體。競爭的含改變FcγR結合分域之抗原結合分子不存在時，有野生型FcγR結合分域之抗原結合分子與Fcγ受體會交互作用並產生520-620nm的信號。含有未標籤化的改變FcγR結合分域之抗原結合分子，會與有野生型FcγR結合分域之抗原結合分子在與Fcγ受體間之交互作用競爭。將競爭結果表示之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將Fcγ受體以GST予以標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於同一讀框融合而得之融合基因連結於保持有可作用之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等的軟體以非線性回歸解析之一部位競合 (one-site competition)模型擬合(fitting)而理想地解析。

將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表面之溶劑之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感測圖)。從感測圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。本發明之抗原結合分子所含之FcγR結合分域之FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者對於人類Fcγ受體之結合活性，也可依由上述例使用Biacore系統計算出得到的對各人類Fcγ受體之KD值、結合量來判斷。在此，各種FcγR對多胜肽之結合量，也可由使為分析物之各種FcγR對於各多胜肽交互作用前後變化的感測圖中之RU值之差除以使感測晶片捕捉多胜肽前後變化之感測圖中之之RU值之差而得的值表達。

測定本發明之抗原結合分子所含之FcγR結合分域或該含分域之抗原結合分子與Fcγ受體之結合活性之pH 之條件，可適當使用pH酸性域或pH中性域之條件。作為測定本發明之FcγR結合分域或含該分域之抗原結合分子與Fcγ受體之結合活性之條件之pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。較佳為pH7.0~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接近活體內之血漿中(血中)之pH的pH7.4。本發明中，作為本發明之FcγR結合分域或含該分域之抗原結合分子與Fcγ受體有結合活性之條件的pH酸性域，通常為pH4.0~pH6.5。較佳為指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。測定條件使用之溫度，可於10℃~50℃之任意溫度評價FcγR結合分域或含該分域之抗原結合分子與人類Fcγ受體的結合親和性。較佳為，為了決定FcγR結合分域或含該分域之抗原結合分子與Fcγ受體之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一之20℃至35℃的任意溫度，也同樣可用在決定FcγR結合分域或含該分域之抗原結合分子與Fcγ受體之結合親和性。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。

FcγR結合分域

本發明之抗原結合分子，包含對抗原之結合活性會依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域(以下有時也稱為選擇性的FcγR結合分域)。FcγR結合分域，例如：IgG型免疫球蛋白之Fc區、 IgG型免疫球蛋白之FcγR結合分域、抗FcγR抗體、抗FcγR支架(Scaffold)分子等為理想例。該分域若為預先已對FcγR有結合活性之分域則可直接使用。該分域對FcγR無結合活性或弱時，可藉由改變抗原結合分子中之形成FcγR結合分域之胺基酸而賦予對FcγR之結合活性。又，也可將對預先對FcγR有結合活性之分域中之胺基酸改變而提高對FcγR之結合活性。FcγR結合分域之胺基酸之改變，也可比較胺基酸改變前與改變後對FcγR之結合活性而找出目的改變。如此之FcγR結合分域之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區所含之FcγR結合分域。例如：使用IgG型抗體之Fc區作為於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域的情形，可使用該Fc區所含之FcγR結合分域作為FcγR結合分域。

對於Fcγ受體有選擇性結合活性之FcγR結合分域

本發明之FcγR結合分域是否有選擇性結合活性，可將利用前述之對於Fcγ受體之結合活性之項目記載的方法所決定之對於各Fcγ受體之結合活性加以比較以確認。依本發明提供之抗原結合分子所含之選擇性的FcγR結合分域，可使用相對於對於活性型Fcγ受體，對於抑制型Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合分域。一非限定態樣中，由本發明提供之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域，可使用對於從包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、(包括副型V158 及F158)包括同型異構物FcγRIIIa及(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)FcγRIIIb之FcγRIII(CD16)、及包括(包括副型H131及R131)同型異構物FcγRIIa及FcγRIIc之FcγRII(CD32)中之任一者選出之活性型Fcγ受體，對於(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)FcγRIIb之結合活性高之FcγR結合分域。又，於本發明之一非限定態樣中，作為依本發明提供之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域，可使用比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高之FcγR結合分域。待驗對象之FcγR結合分域，是否為對於Fcγ受體有選擇性結合活性之FcγR結合分域，可藉由比較例如前述之對於Fcγ受體之結合活性之項目記載之方法決定之FcγR結合分域對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或對於FcγRIIc之KD值除以對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之KD值而得之值(比)。亦即式1表示之FcγR選擇性指數而進行判斷。

[式1]FcγR選擇性指數=對於活性型FcγR之KD值/對於抑制型FcγR之KD值

上式1中，活性型FcγR，係指FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，抑制型FcγR係指FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2，KD值測定使用之活性型FcγR及抑制型FcγR可從任一組合選擇，但一非限定態樣，可使用將對於包括副型H131之FcγRIIa之KD值除以對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之KD值而得之值(比)。

FcγR選擇性指數，例如：1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、2以上、3以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、35以上、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、100以上、110以上、120以上、130以上、140以上、150以上、160以上、170以上、180以上、190以上、200以上、210以上、220以上、230以上、240以上、250以上、260以上、270以上、280以上、290以上、300以上、310以上、320以上、330以上、340以上、350以上、360以上、370以上、380以上、390以上、400以上、410以上、420以上、430以上、440以上、450以上、460以上、470以上、480以上、490以上、500以上、520以上、540以上、560以上、580以上、600以上、620以上、640以上、660以上、680以上、700以上、720以上、740 以上、760以上、780以上、800以上、820以上、840以上、860以上、880以上、900以上、920以上、940以上、960以上、980以上、1000以上、1500以上、2000以上、2500以上、3000以上、3500以上、4000以上、4500以上、5000以上、5500以上、6000以上、6500以上、7000以上、7500以上、8000以上、8500以上、9000以上、9500以上、10000以上、100000以上。

本發明之抗原結合分子所含之選擇性的FcγR結合分域之一非限定態樣，例如構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區所含之FcγR結合分域經改變之Fc區。該改變Fc區之製作方法，可舉例前述胺基酸之改變之項目記載之方法。如此改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp之Fc區、或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區。人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp之Fc區、或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc之結合活性，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高。

本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR 結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區(以下總稱為野生型Fc區)及含該野生型Fc區之抗原結合分子，對於活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc)之結合活性維持或減少之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。

相較於野生型Fc區及含野生型Fc區之抗原結合分子，本發明之抗原結合分子所含之含選擇的FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子對於前述活性型FcγR之結合活性減少的程度，例如99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、95%以下、94%以下、93%以下、92%以下、91%以下、90%以下、88%以下、86%以下、84%以下、82%以下、80%以下、78%以下、76%以下、74%以下、72%以下、70%以下、68%以下、66%以下、64%以下、62%以下、60%以下、58%以下、56%以下、54%以下、52%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下、0.4%以下、0.3%以下、0.2%以下、0.1%以下、0.05%以下、0.01%以下、0.005%以下。

本發明之抗原結合分子所含之含選擇的FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型FcγR(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性增強之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。

相較於野生型Fc區及含野生型Fc區之抗原結合分子，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子對於前述抑制型FcγR之結合活性增強之程度，例如101%以上、102%以上、103%以上、104%以上、105%以上、106%以上、107%以上、108%以上、109%以上、110%以上、112%以上、114%以上、116%以上、118%以上、120%以上、122%以上、124%以上、126%以上、128%以上、130%以上、132%以上、134%以上、136%以上、138%以上、140%以上、142%以上、144%以上、146%以上、148%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、10000倍以上、100000倍以上。

又，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc)之結合活性維持或減少，及相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型FcγR(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性增強之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。

又，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性之增強程度比起對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之增強程度高之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。

本發明可為對於EU編號表示之238位之胺基酸為Asp之Fc區或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區，以前述胺基酸之改變之項目說明之態樣等，再施加其它至少一個對Fc區之改變。又，該等改變以外，可更含有附加性的改變。附加性的改變，例如可從胺基酸之取代、缺損、或修飾中之任一者、或此等之組合中選擇。例如可施加增強對FcγRIIb之結合活性，及施加使對FcγRIIa(H型)及FcγRIIa(R型)之結合活性維持或減低之改變。藉由施加如此的改變，能使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa。

其中，使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa(R型)之改變為佳，更佳為使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa(H型)之改變。如此改變之理想胺基酸取代，例如EU編號237位表示之Gly取代為Trp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Phe之改變、EU編號238位表示之Pro取代為Phe之改變、EU編號325位表示之Asn取代為Met之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ile之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Gln之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Met之改變、EU編號236位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Asn之改變、EU編號325位表示之Asn取代為Ser之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號266 位表示之Val取代為Met之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Phe之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Gly之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Glu之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Gly之改變、EU編號238位表示之Pro取代為Leu之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Leu之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Thr之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ser之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Met之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Trp之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Tyr之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Phe之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Asp之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Phe之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Leu之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Glu之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ala之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ile之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Gln之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Val之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Trp之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Arg之改變、EU編號268位表示之His取代為Gly之改變、EU編號268位表示之His取代為Asn之改變、EU編號324位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號266位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Gly之改變、EU編號332位表示之Ile取代為Phe之改變、EU編號324位表示之Ser取代為Ile 之改變、EU編號333位表示之Glu取代為Pro之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號337位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Gln之改變、EU編號335位表示之Thr取代為Asp之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asn之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ile之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Phe之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Val之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Tyr之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Pro之改變、EU編號326位表示之Lys取代為His之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Trp之改變、EU編號268位表示之His取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號266位表示之Val取代為Ile之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Glu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Val之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號334位表示之Lys取代為His之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Phe之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Pro之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Tyr之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ile之改變、EU編號295位表示之Gln取代為Leu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號268位表示之His取代為Ala之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ala之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Ala之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Glu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Leu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Met之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Tyr之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Lys之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Arg之改變、EU編號233位表示之Glu取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號323位表示之Val取代為Ile之改變、EU編號323位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號323位表示之Val取代為Met之改變、EU編號296位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Met之改變。

再者，該等改變之中較佳之胺基酸取代，例如EU編號237位表示之Gly取代為Trp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Phe之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Gln之改變、EU編號268位表示之His取代為Asn之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Gly之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ala之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Ala之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Glu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Leu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Met之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Tyr之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Lys之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Arg之改變、EU編號233位表示之Glu取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號323位表示之Val取代為Ile之改變、 EU編號323位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號323位表示之Val取代為Met之改變、EU編號296位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Met之改變。

上述改變可為一處，也可為二處以上之組合。如此之改變的理想例，可列舉表13~14、表16~23、表25~27記載之改變。

本發明之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域之另一非限定態樣，可舉人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區所含之FcγR結合分域經改變之Fc區。該改變Fc區之製作方法，可列舉前述胺基酸改變之項目記載之方法。如此改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區。人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高。

本發明中，可對於EU編號表示之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區，藉由前述胺基酸之改變之項目說明之態樣等，而更對於其他至少一個Fc區施加改變。又，除了該等改變以外，可更含有附加性改變。附加性改變，可從例如胺基酸之取代、缺損、或修飾中之任一者、或此等之組合選擇。例如，可施以維持或減低對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之改變。可施加增強對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性並且維持或減少對於FcγRIIa(H型)及FcγRIIa(R型)之結合活性之改變。又，也可施加使對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性之增強程度高於對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之增強程度高的改變。藉由施加如此的改變，可相較於對於FcγRIIa，更提高對於FcγRIIb之結合選擇性。

就含有選擇性FcγR結合分域之改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區之EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326 位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位中表示之群組中選擇之任一者以上之胺基酸經取代之改變Fc區為一非限定態樣之例。

又，含有選擇性的FcγR結合分域之改變Fc區之一非限定態樣，可舉人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區之EU編號表示之：233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為、Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、 332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上的改變Fc區。

前述含有更對於其他至少一個Fc區施加改變，再者含有附加性改變之Fc區之一非限定態樣，可列舉表5-1~表5-7記載之Fc區。

(表5-2為接續表5-1之表。)

(表5-3為接續表5-2之表。)

(表5-4為接續表5-3之表。)

(表5-5為接續表5-4之表。)

(表5-6為接續表5-5之表。)

(表5-7為接續表5-6之表。)

抗原結合分子

本發明中，抗原結合分子係以代表包含對抗原之結合活性因離子濃度之條件變化之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域(選擇的FcγR結合分域)之分子的最廣含意使用，具體而言，此等只要顯示對於抗原之結合活性即可，包括各種分子型。例如，對抗原之結合活性因離子濃度之條件變化之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域(選擇的FcγR結合分域)鍵結之分子，例如抗體。抗體包括單一單株抗體(包含致效劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體等。又，當作抗體之片段使用時，抗原結合分域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab')2、scFv及Fv)為理想例。將既有之安定的α/β筒狀蛋白質構造等立體構造作為支架(scaffold)，僅將其一部分構造用於建構抗原結合分域而庫化之支架分子，也包括在本發明之抗原結合分子。

本發明之抗原結合分子，可包含媒介對FcRn之結合及或補體受體之結合之Fc區之至少一部分。例如，於非限定之一態樣中，抗原結合分子可為抗體或Fc融合蛋白質。融合蛋白質，係指含有與在天然在具有其自然不連結之第二胺基酸序列之多胜肽連結之第一胺基酸序列之多胜肽的嵌合多胜肽。例如，融合蛋白質可包括編碼為Fc區之至少部分(例如賦予對FcRn之結合之Fc區之部分或賦予對Fcγ受體之結合之Fc區、賦予對補體之結合之Fc區之部分)之胺基酸序列、及編碼為例如受體之配體結合分域或配體之受體結合分域之胺基酸序列之非免疫球蛋白多胜肽。胺基酸序列也可存在於一起運到融合蛋白質之其他蛋白質，或此等通常存在於相同蛋白質但會重新再編入融合多胜肽中。融合蛋白質例如可依化學合成，或製作編碼為所望胜肽區之聚核苷酸並以表現其之基因重組的方法製作。

本發明之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域及對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域(選擇性的FcγR結合分域)等各分域可利用多胜肽鍵直接連結，並可經由連結子連結。連結子，可使用能依基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較理想。胜肽連結子之長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。

例如，胜肽連結子之情形，可理想地列舉： (序列編號：28)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：30)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：31)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：32)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：33)

Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：34)

Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：35)

(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：30))n

(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：31))n

[n為1以上之整數]等。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。

合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。

連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。

又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之雙硫鍵也可適當地利用。

為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。本發明中，用語「經連結」、「經融合」、「連結」或「融合」可相互交換的使用。該等用語，指利用包含上述化學結合手段或重組方法之所有方法將二個以上之多胜肽等的要素或成分形成為單一構造的方式進行連結。於同一讀框融合，當二以上之要素或成分為多胜肽時，係指以維持該多胜肽之正確讀取框之方式，為了形成連續的較長的讀取框之二個以上讀取框單位之連結。當二分子之Fab作為抗原結合分域使用時，該抗原結合分域與於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域及對Fcγ受體有選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域 (選擇性的FcγR結合分域)未經連結子而以胜肽鍵於同一讀框連結而得之本發明之抗原結合分子抗體，可作為本申請案之理想抗原結合分子使用。以下列舉包含抗體之結構之本發明之抗原結合分子之非限定之多數態樣。

(1)一抗體，包含：F(ab')2，含有對於抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之二個可變區；及Fc區，於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性且對Fcγ受體有選擇性的結合活性

(2)一抗體，包含：F(ab')2，在形成F(ab')2之可變區當中，其中一可變區係對於抗原之結合活性依離子濃度條件而變化之可變區，另一可變區係對Fcγ受體有選擇性的結合活性的可變區；及Fc區，於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性

(3)一抗體，包含：F(ab')2，在形成F(ab')2之可變區當中，其中一可變區係對於抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之可變區，另一可變區係於pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之可變區；及Fc區，對Fcγ受體有選擇性的結合活性

為含有上述(3)之結構之抗體之情形，作為pH酸性域條件下對FcRn有結合活性之可變區，也可理想地使用對FcRn之結合活性會依pH之條件變化之可變區。雖不拘於特定理論，但據認為當使用對FcRn之結合活性依pH之條件變化之可變區的情形，於酸性內體內結合於FcRn之抗體在輸送到細胞表面時，該可變區若為於pH中性域條件下對FcRn不具結合活性之可變區，會在細胞表面從FcRn游離並且容易使抗體再循環到血漿中。

雙專一性抗體及其製作方法

作為製備含有前述(2)、(3)之結構之抗體之方法之一態樣，可採用雙專一性抗體之製作方法。雙專一性抗體，係指包含對不同抗原決定部位專一性結合之二種可變區的抗體。IgG型之雙專一性抗體，可藉由從將2種產生IgG抗體之融合瘤融合而產生的混成融合瘤(hybrid hybridoma(quadroma)分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。

當使用前述抗體之項目記載之重組方法製造雙專一性抗體的情形，可採用將編碼為含目的之二種可變區之重鏈的基因導入細胞並使此等共同表現的方法。但是如此的共同表現方法中，僅考慮重鏈之組合，會成為如下的組合成為2：1：1之分子數之比例存在的混合物，即(i)含有與第一抗原決定部位結合之可變區的重鏈及含有與第二抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合、(ii)僅成為含有與第一抗原決定部位結合之可變區之重鏈成為一對之重鏈之組合、(iii)僅含有與第二抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合。從此等三種重鏈之組合之混合物難以將含目的之重鏈組合之抗原結合分子精製。

當使用如此的重組方法製造雙專一性抗體時，可藉由對於構成重鏈之CH3分域施以適當胺基酸取代之改變，而優先分泌含有異質組合之重鏈的雙專一性抗體。具體而言，將存在於其中一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob(「突起」之意))，並將存在於另一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole(「空隙」之意))，藉此使突起能配置於空隙內，而引起異種重鏈形成之促進及同種重鏈形成之妨害的方法(WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。

又，也已知將利用多胜肽之組合、或多胜肽構成之異種多聚物之組合之控制方法用在重鏈之組合而製作雙專一性抗體之技術。亦即，可採用藉由改變形成重鏈內界面之胺基酸殘基以控制使具相同序列之重鏈之組合受抑制且形成序列相異之二條重鏈的方法於雙專一性抗體之製作(WO2006/106905)。如此的方法也可採用於製造雙專一性抗體。

本發明之一非限定態樣中，作為抗原結合分子含有的Fc區，可適當使用上述雙專一性抗體作為起源之形成Fc區之二條多胜肽。更具體而言，宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之349之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Trp且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Ser、368之胺基酸為Ala、407之胺基酸為Val。

此外，在本發明之一非限定態樣中，作為Fc區可採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys。上述態樣中，也可理想地將409之胺基酸從Asp 換為Glu、399之胺基酸從Lys換為Arg。又，也可除了399之胺基酸之Lys以外，尚追加使360之胺基酸為Asp或392之胺基酸為Asp。

本發明之其他非限定態樣中，作為Fc區可理想地採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys。

本發明之又另一非限定態樣中，作為Fc區宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之439之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys。

本發明之另一非限定態樣中，作為Fc區，可適當採用此等組合之以下態樣中之任一者；(i)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為Asp，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為392之胺基酸之ASp)、(ii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之439之胺基酸之Glu也可換為360之胺基酸之Asp、EU編號表示之392之胺基酸之Asp或439之胺基酸之Asp)、(iii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys、或為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸也可不取代為Glu，而且370之胺基酸不取代為Glu的前提，可將439之胺基酸之Glu換為Asp或將439之胺基酸之Glu換為392之胺基酸之Asp)。

再者，本發明之另一非限定態樣中，可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。

再者，本發明之其他非限定態樣可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。

又，上述異種重鏈之組合技術以外，可以將作為將形成與第一抗原決定部位結合之可變區的輕鏈、及形成與第二抗原決定部位結合之可變區的輕鏈各和形成與第一抗原決定部位結合之可變區的重鏈、及形成與第二抗原決定部位結合之可變區的重鏈組合的已知異種輕鏈的組合技術即CrossMab技術(Scaefer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192))用在製作本發明提供之抗原結合分子。

藥物動態之改善

本發明中，「血漿中抗原消失能力」，係指抗原結合分子對活體內投予、或抗原結合分子在活體內分泌時，使血漿中存在之抗原從血漿中消失之能力。因此，本發明中，「增加抗原結合分子之血漿中抗原消失能力」，係指在投予抗原結合分子時，比起投予含有對抗原之結合活性不依離子濃度變化之抗原結合分域之抗原結合分子、含有於pH酸性域條件下對FcRn不具結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子、或含有對Fcγ受體不具選擇性的結合活性的Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，使抗原從血漿中消失之速度加快即可。抗原結合分子之血漿中抗原消失能力是否增加，例如可藉由測定將可溶型抗原與抗原結合分子對於活體內投予且投予後可溶型抗原在血漿中濃度來判斷。當投予含有對抗原之結合活性依離子濃度變化之抗原結合分域、含有於pH酸性域條件下對FcRn具結合活性之FcRn結合分域、及含有對Fcγ受體具選擇性的結合活性的Fcγ受體結合分域(選擇的FcγR結合分域)的抗原結合分子與可溶型抗原後之血漿中之可溶型抗原之濃度降低時，以使可溶型抗原及抗原結合分子投予後可溶型抗原在血漿中之濃度有下降的情形，可判斷抗原結合分子之血漿中抗原消失能力有增加。可溶型抗原可為在血漿中抗原結合分子結合之抗原、或抗原結合分子不結合之抗原，其濃度可各作為「血漿中抗原結合分子結合抗原濃度」及「血漿中抗原結合分子非結合抗原濃度」(後者與「血漿中游離抗原濃度」同義)。「血漿中總抗原濃度」，係指將抗原結合分子結合抗原與抗原結合分子非結合抗原合計之濃度、或抗原結合分子非結合抗原濃度「血漿中游離抗原濃度」，所以可溶型抗原濃度可作為「血漿中總抗原濃度」。測定「血漿中總抗原濃度」或「血漿中游離抗原濃度」之各種方法，在本說明書如以下記載，在該技術領域為周知。

本發明中，「藥物動態之提高」、「藥物動態之改善」、及「優異的藥物動態」，可代換為「血漿中(血中)滯留性之提高」、「血漿中(血中)滯留性之改善」、「優異的血漿中(血中)滯留性」、「增長血漿中(血中)滯留性」，該等語句以相同含意使用。

本發明中「藥物動態改善」係指：包括從抗原結合分子投予到人類、或小鼠、大鼠、猴、兔、犬等非人類動物到從血漿中消失為止(例如在細胞內受分解等而成為抗原結合分子不能再回到血漿中的狀態為止)的時間延長，且包括從抗原結合分子投予到經分解消失為止之期間可結合於抗原之狀態(例如抗原結合分子未結合於抗原之狀態)在血漿中滯留之時間延長。具有天然型Fc區之IgG，可結合於非人類動物來源之FcRn。例如，由於具有天然型Fc區之人類IgG，比起對人類FcRn之結合，更能強力結合於小鼠FcRn(Int.Immunol.(2001)13(12),1551-1559)，所以為了確認本發明之抗原結合分子之特性，較佳為使用小鼠投予。就其他例，小鼠原本之FcRn基因有缺損且有關於人類FcRn基因之轉殖基因(transgene)並表現之小鼠(Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)，為了確認以下記載之本發明之抗原結合分子之特性，可使用作為進行投予之對象。具體而言「藥物動態改善」，也包括未結合於抗原之抗原結合分子(抗原非結合型抗原結合分子)分解消失為止的時間延長。即使抗原結合分子存在血漿中，該抗原結合分子已有抗原結合的情形，該抗原結合分子不能重新與抗原結合。所以抗原結合分子未結合於抗原之時間若加長，能重新與抗原結合之時間延長(能重新與抗原之機會增多)、在活體內抗原未與抗原結合分子結合之時間可減少，抗原結合於抗原結合分子之時間可延長。若能利用抗原結合分子之投予加速抗原從血漿中消失，則抗原非結合型抗原結合分子之血漿中濃度增加，且抗原結合於抗原結合分子之時間延長。亦即，本發明中「抗原結合分子之藥物動態之改善」係包括：抗原非結合型抗原結合分子中之任一者之藥物動態參數之改善(血漿中半衰期之增加、平均血漿中滯留時間之增加、血漿中廓清率之下降中之任一者)、或抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間延長、或加速利用抗原結合分子使抗原從血漿中消失。可藉由測定抗原結合分子或抗原非結合型抗原結合分子之血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中廓清率等中之任一者之參數(藥理動力學(pharmacokinetics)利用演習來理解(南山堂))而判斷。例如，將抗原結合分子對於小鼠、大鼠、猴、兔、犬、人類等投予時，測定抗原結合分子或抗原非結合型抗原結合分子之血漿中濃度並計算各參數，於血漿中半衰期延長或平均血漿中滯留時間延長之情形等，可謂抗原結合分子之藥物動態有改善。該等之參數可利用對該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如，使用藥物動態解析軟體WinNonlin(Pharsight)，依附帶的實驗步驟書進行無房室(Noncompartmental)解析可適當評價。未結合於抗原之抗原結合分子之血漿中濃度之測定，可用該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施，例如使用在公知之方法(Clin.Pharmacol.(2008)48(4),406-417)測定之方法。

本發明中「藥物動態改善」也包括抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間延長。抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間是否有延長，可藉由測定游離抗原之血漿中濃度，由游離抗原之血漿中濃度、或游離抗原濃度相對於總抗原濃度之比例開始上升的時間判斷。

未與抗原結合分子結合之游離抗原之血漿中濃度、或游離抗原濃度相對於總抗原濃度之比例，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施，例如可使用於Pharm.Res.(2006)23(1),95-103測定之方法。又，當抗原在活體內顯示某些機能的情形，抗原是否與中和抗原機能之抗原結合分子(拮抗劑分子)結合，也可藉由評價該抗原之機能是否已被中和來判斷。抗原之機能是否已被中和，可藉由測定反映抗原機能之某些活體內標記來評價。抗原是否與活化抗原機能之抗原結合分子(致效劑分子)結合，可藉由測定反映抗原機能之某些活體內標記來評價。

游離抗原之血漿中濃度之測定、血漿中之游離抗原量相對於血漿中之總抗原量之比例之測定、活體內標記之測定等測定不特別限定，宜於抗原結合分子投予經過一定時間後實施較佳。本發明中抗原結合分子投予經過一定時間後，係不特別限定，可視投予之抗原結合分子之性質等由該技術領域中具有通常知識者適時決定，例如在抗原結合分子投予後經過1日後、抗原結合分子投予後經過3日後、抗原結合分子投予後經過7日後、抗原結合分子投予後經過14日後、抗原結合分子投予後經過28日後等。本發明中，「血漿中抗原濃度」係包括：為抗原結合分子結合抗原與抗原結合分子非結合抗原合計濃度之「血漿中總抗原濃度」、或抗原結合分子非結合抗原濃度即「血漿中游離抗原濃度」中之任一者的概念。

相較於投予含有對抗原之結合活性為離子濃度非依存的抗原結合分域的抗原結合分子、或含有對FcγR之結合活性受損之Fc區之抗原結合分子作為抗原結合分子、或未投予本發明之抗原結合分子之情形，藉由本發明之抗原結合分子之投予，血漿中總抗原濃度能減少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。

抗原/抗原結合分子莫耳比可以下列所示算出：A值=在各時點之抗原之莫耳濃度

B值=在各時點之抗原結合分子之莫耳濃度

C值=在各時點之抗原結合分子之單位莫耳濃度之抗原之莫耳濃度(抗原/抗原結合分子莫耳比)

C=A/B。

C值較小係指：每一抗原結合分子之抗原消失效率較高，C值較大係指：每一抗原結合分子之抗原消失效率較低。

抗原/抗原結合分子莫耳比可如上所述算出。

相較於投予含有對抗原之結合活性不依離子濃度變化之抗原結合分域的抗原結合分子、含有於pH酸性域條件下對FcRn不具結合活性之FcRn結合分域的抗原結合分子、或含有對Fcγ受體不具選擇性的結合活性的Fcγ受體結合分域的抗原結合分子作為抗原結合分子之情形，藉由本發明之抗原結合分子之投予，抗原/抗原結合分子莫耳比能減少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。

本發明中，作為與本發明之抗原結合分子比較之參考抗原結合分子，可使用包含對於抗原之結合活性不會依離子濃度變化之抗原結合分域之抗原結合分子、包含於pH酸性域之條件下對於FcRn無結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子、或含對於Fcγ受體無選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域之抗原結合分子。

於評價在pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域之影響的情形，血漿中總抗原濃度或抗原/ 抗體莫耳比之減少，於抗原結合分子與小鼠配對物抗原無交叉反應的情形，可使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32或系統276(Jackson Laboratories,Methods Mol Biol.2010；602：93-104)，以抗原抗體同時投予模型或不變狀態抗原注入模型中之任一者評價。抗原結合分子與小鼠配對物有交叉反應的情形，可藉由單將抗原結合分子對於人類FcRn基因轉殖小鼠系統32或系統276(Jackson Laboratories)投予以評價。同時投予模型中，係將抗原結合分子與抗原之混合物對於小鼠投予。不變狀態抗原注入模型中，為了達到一定的血漿中抗原濃度，係在小鼠埋入填充有抗原溶液之注入泵，然後將抗原結合分子對於小鼠投予。試驗抗原結合分子以相同用量投予。血漿中總抗原濃度、血漿中游離抗原濃度、及血漿中抗原結合分子濃度，使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法在適當時點測定。

評價對於Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域之影響之情形中，血漿中總抗原濃度或抗原/抗體莫耳比之減少，當抗原結合分子與小鼠配對物抗原無交叉反應的情形，也可使用通常使用之C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)，依抗原抗體同時注射模型或不變狀態抗原注入模型中之任一者評價。抗原結合分子與小鼠配對物有交叉反應的情形，也可單注射抗原結合分子到通常使用之C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)以評價。

同時投予模型中，係將抗原結合分子與抗原之混合物對於小鼠投予。不變狀態抗原注入模型中，為了達到一定的血漿中抗原濃度，係在小鼠埋入填充有抗原溶液之注入泵，然後將抗原結合分子對於小鼠投予。試驗抗原結合分子以相同用量投予。血漿中總抗原濃度、血漿中游離抗原濃度、及血漿中抗原結合分子濃度，使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法在適當時點測定。

投予2日後、4日後、7日後、14日後、28日後、56日後、或84日後，測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比，可評價本發明之長期效果。換言之，為了評價本發明之抗原結合分子之特性，可藉由測定抗原結合分子投予2日後、4日後、7日後、14日後、28日後、56日後、或84日後血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定長期間之血漿中抗原濃度。依本發明記載之抗原結合分子是否達成血漿中抗原濃度或抗原/抗原結合分子莫耳比之減少，可依先前記載之在任意之一或多數時點評價其減少以決定。

投予15分鐘後、1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、12小時後、或24小時後，測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比可評價本發明之短期效果。換言之，為了評價本發明之抗原結合分子之特性，可藉由抗原結合分子之投予15分鐘後、1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、12小時後、或24小時後測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定在短期間之血漿中抗原濃度。

本發明之抗原結合分子之投予路徑，可從皮內注射、靜脈內注射、玻璃體內注射、皮下注射、腹腔內注射、非經口注射、及肌肉內注射選擇。

本發明中，人類中之抗原結合分子之藥物動態改善較佳。難以測定在人類之血漿中滯留性的情形，可依據小鼠(例如，正常小鼠、人類抗原表現基因轉殖小鼠、人類FcRn表現基因轉殖小鼠、等)或猴(例如，食蟹猴等)之血漿中滯留性預測在人類之血漿中滯留性。

本發明中「抗原結合分子之藥物動態之改善、血漿中滯留性之提高」係包括：對活體投予抗原結合分子中之任一者之藥物動態參數之改善(血漿中半衰期之增加、平均血漿中滯留時間之增加、血漿中廓清率之下降、生體可得率中之任一者)、或投予後的適當時間抗原結合分子之血漿中濃度提高。可藉由測定抗原結合分子之血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中廓清率、生體可得率等中之任一者之參數(藥理動力學(pharmacokinetics)利用演習來理解(南山堂))而判斷。例如，將抗原結合分子對於小鼠(正常小鼠及人類FcRn基因轉殖小鼠)、大鼠、猴、兔、犬、人類等投予時，測定抗原結合分子之血漿中濃度並計算各參數，於血漿中半衰期延長或平均血漿中滯留時間延長之情形等，可謂抗原結合分子之藥物動態有改善。該等之參數可利用對該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如，使用藥物動態解析軟體WinNonlin(Pharsight)，依附帶的實驗步驟書進行無房室(Noncompartmental)解析可適當評價。

在小鼠中至今已發現FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、 FcγRIV的4種FcγR。在人類中，就對應於此等之FcγR，已發現FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb。該等FcγR之中，唯一認為是抑制型之FcγRIIb，在人類、小鼠均有保守性。其他FcγR，除了FcγRIIIb以外，都會經由Immunoreceptor tyriosine-based activating motif(ITAM)傳遞活化信號，FcγRIIb係經由細胞內具有的imunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)傳遞抑制信號(Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47)。

FcγRIIb之切斷改變體(splicing variant)據報告有FcγRIIb1及FcγRIIb2。人類及小鼠均為，FcγRIIb1比FcγRIIb2有較長的細胞內分域，且確認FcγRIIb1在B細胞表現，FcγRIIb2確認在巨噬細胞、肥胖細胞、樹狀細胞、嗜鹼性球、嗜中性球、嗜酸性球表現(J.Clin.Immunol.(2005)25(1),1-18)。

至今為止，人類中已報告FcγRIIb之機能不完整、表現低落與自體免疫疾病的發病有相關。例如，SLE患者中，位於FcγRIIb之表現起動子區的基因多型之影響會減弱轉錄活化因子之結合，而有FcγRIIb表現低落之例被報告(Hum.Genet.(2005)117,220-227、J.Immunol.(2004)172,7192-7199、J.Immunol.(2004)172,7186-7191)。又，SLE患者之中，據報告FcγRIIb之233號之胺基酸為Ile或Thr的二種基因多型。該部位存在於FcγRIIb之細胞膜貫穿區，比起233號之胺基酸為Thr的情形、Ile的情形，FcγRIIb不易存在於脂筏(lipid raft)，結果據報告FcγRIIb之信號傳遞機能低落(Nat.Med.(2005)11, 1056-1058、Hum.Mol.Genet.,(2005)14,2881-2892)。在小鼠亦為，C57BL/6小鼠之FcγRIIb基因經破壞之基因剔除小鼠，據報告會呈現自體抗體之產生或絲球體腎炎等SLE狀的症狀(Immunity 13(2000)277-285、J.Exp.Med.(2002)195,1167-1174)。又，至今為止考慮為SLE之自然發病模式的小鼠，亦據報告有FcγRIIb表現量下降等(Immunogenetics(2000)51,429-435、Int.Immunol.(1999)11,1685-1691、Curr.Biol.(2000)10,227-230、J.Immunol.(2002)169,4340-4346)。由此等，據認為在小鼠中亦與人類同樣，FcγRIIb係控制液性免疫。

具有本發明之Fc之抗體經由FcγRIIb使抗原消失時，據認為在FcγRIIb之機能中，FcγRIIb之內吞作用之機能有最重要的貢獻。如上述，FcγRIIb之切斷改變體存在有FcγRIIb1與FcγRIIb2，但是據報告後者主要涉及抗體與抗原之免疫複合體之內吞作用(J.Immunol.(1994),152574-585、Science(1992)256,1808-1812、Cell(1989)58,317-327)。至今為止，據報告小鼠之FcγRIIb2係被納入clathrin-coated pit並引起內吞作用(Cell(1989)58,317-327)。又，經由FcγRIIb2之內吞作用中據報告二白胺酸模體(dileucine motif)係為必要，人類及小鼠中均為dileucine motif係保守性的(EMBO J.(1994)13(13),2963-2969)。由此也可認為人類中也與小鼠同樣，FcγRIIb2有內吞作用能力。

另一方面，FcγRIIb1與FcγRIIb2不同，據報告不會引起內吞作用。FcγRIIb1存在有在FcγRIIb2未觀察到的細胞內分域中之插入序列。該序列會抑制FcγRIIb1納入於 clathrin-coated pit，其結果據認為會抑制內吞作用(J.Cell.Biol.(1992)116,875-888、J.Cell.Biol.(1989)109,3291-3302)。在人類中亦為，與小鼠同樣，在FcγRIIb1於FcγRIIb2同樣的部分存在有插入序列，所以以類似的機制預測FcγRIIb1與FcγRIIb2之內吞作用能力有差異。又，在人類中、小鼠中均為，據報告在20分鐘內細胞表面上之約40%之免疫複合體會攝入細胞內(Mol.Immunol.(2011)49,329-337、Science(1992)256,1808-1812)。由此可預測，在人類中，將FcγRIIb2與在小鼠以同樣速度將免疫複合體納入於細胞內。

FcγR家族當中，FcγRIIb在人類、小鼠均唯一細胞內具有ITIM且表現細胞之分布也相同，故免疫控制的機能也推測為相同。又，若考慮在人類、小鼠均以同樣速度將免疫複合體攝入細胞內之事實，藉由使用小鼠，可預測在人類經由FcγRIIb以抗體使抗原消失之效果。實際上在實施例5中，相較於對於正常小鼠投予具有以pH依存性地結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mIgG1，當對於正常小鼠投予具有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質且對於小鼠FcγRIIb及FcγRIII之親和性增強之抗原結合分子mF44及mF46時，比起投予mIgG1的情形，顯示抗原之廓清率增加。

又，在後述實施例6中，使用Fc受體γ鏈缺損小鼠實施同樣實驗。在小鼠的情形，FcγRIIb以外之FcγR據報告僅在gamma鏈共存下表現，所以於Fc受體γ鏈缺損小鼠僅會表現FcγRIIb。藉由對Fc受體γ鏈缺損小鼠投予有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mF44、mF46，可觀察到增強FcγRIIb選擇性結合時之加速抗原消失之效果。由實施例6之結果，顯示：對於Fc受體γ鏈缺損小鼠投予之有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mF44及mF46，比起對於同小鼠投予之有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mIgG1，抗原之廓清率有增加。又，從實施例6的結果，可知：mF44及mF46在投予到Fc受體γ鏈缺損小鼠的情形、投予到正常小鼠之情形，均以大致同程度使抗原消失。

於實施例6使用FcγRIII缺損小鼠實施同樣實驗。mIgG1及mF44、mF46，在mFcγR當中僅會與FcγRIIb及FcγRIII結合，所以藉由對於FcγRIII缺損小鼠投予此等抗體，可觀察到增強FcγRIIb選擇性結合時之加速抗原消失之效果。從實施例6之結果，對於FcγRIII缺損小鼠投予之mF44及mF46比起對於同小鼠投予之mIgG1，抗原之廓清率顯示增加。又，從實施例6之結果可知：mF44及mF46對於FcγRIII缺損小鼠投予之情形、對於正常小鼠之情形，及對於Fc受體γ鏈缺損小鼠投予之情形，以大致同程度使抗原消失。

由該等結果可知：未增強對於活性型FcγR之結合，僅增強對於FcγRIIb選擇的結合，可加速抗原消失。

除了先前考察到的至今為止的文獻報告以外，從使用上述小鼠之驗證結果，可認為：在人類之活體中亦與小鼠同樣，經由FcγRIIb將免疫複合體攝入細胞內，其結果具有增強對於人類FcγRIIb而增強選擇的結合之Fc的抗體，可加快該抗原消失。又，如先前所考察，在小鼠與人類中，經由FcγRIIb 之免疫複合體攝入細胞內係以同程度之速度發生，所以據認為：具有增強對小鼠FcγRIIb之親和性的Fc的抗體加速抗原消失之效果為同程度之效果，藉由使用將對人類FcγRIIb之親和性以同程度增強之Fc，也能於人類活體內達成。

如WO2009/125825之記載，將人類化抗IL-6受體抗體H54/L28-IgG1對於抗原之結合活性會依pH之條件變化，亦即於pH7.4與抗原結合，於pH5.8將抗原解離之改變賦予到可變區之Fv4-IgG1與為抗原之可溶型人類IL-6受體同時投予的小鼠中，可溶型人類IL-6受體之消失，比起將H54/L28-IgG1與該抗原同時投予之小鼠中的可溶型人類IL-6受體之消失，顯示有大幅加速。又，本說明書中，H54/L28-IgG1所含之重鏈H54-IgG1及輕鏈L28-CK，各以序列編號：36及序列編號：37表示，Fv4-IgG1所含之重鏈VH3-IgG1及輕鏈VL3-CK，各以序列編號：38及序列編號：39表示。

可溶型人類IL-6受體所結合之抗體H54/L28-IgG1結合之可溶型人類IL-6受體，係與抗體一起由FcRn而再循環於血漿中，相對於此，以pH依存性地與可溶型人類IL-6受體結合之抗體Fv4-IgG1，在內體內之酸性條件下會將與抗體結合之可溶型人類IL-6受體解離。經解離之可溶型人類IL-6受體由溶體分解，故可大幅加速可溶型人類IL-6受體之消失，且將以pH依存性地與可溶型人類IL-6受體結合之抗體Fv4-IgG1在內體內與FcRn結合後於血漿中再循環。經再循環之該抗體能再度與可溶型人類IL-6受體結合，因此會反複對於抗原(可溶型人類IL-6受體)結合及利用FcRn於血漿中再循環。其結果，據認為一個抗體分子能重複多次結合於可溶型人類IL-6受體(圖1)。

另一方面，如本發明揭示，發現：藉由投予包含依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、及含Foγ受體結合分域之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域對於FcγR之結合活性經增強之抗原結合分子，能使可溶型抗原在血漿中濃度大幅下降。

雖不拘於特定理論，但藉由投予包含對於FcγR之結合經增強之依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子所觀察到之預料外之血漿中可溶型抗原濃度之下降，也可如以下方式說明。

如前述，Fv4-IgG1等包含由於離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，據認為可重複多次與抗原結合，但於內體內將可溶型抗原解離並加快其從血漿中消失之效果，據認為係取決於抗原與抗原結合分子之複合體攝入內體內之速度。含有對於各種FcγR之結合活性經增強之依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，會藉由與細胞膜上表現之各種FcγR結合，而積極地攝入細胞內，於透過該分子中所含之pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域經由FcRn之結合之再循環，可再度於血漿中循環。亦即血漿中，會與可溶型抗原形成複合體之前述抗原結合分子，會經由在細胞膜上表現之FcγR而積極攝入細胞內，所以據認為加快血漿中之可溶型抗原消失之效果，會比起未增強對於各種之FcγR之結合活性的抗原結合分子更顯著。

與膜型抗原結合之抗體對於FcγR之結合活性，在該抗體之細胞傷害活性發揮重要作用。所以當作醫藥之抗體需要細胞傷害活性時，係使用對FcγR之結合活性高的人類IgG1的構造同型，且廣為使用藉由增強該抗體對於FcγR之結合活性而增強該抗體之細胞傷害活性之技術。另一方面，作為醫藥使用且與可溶型抗原結合之抗體對FcγR之結合活性發揮的作用，至今為止尚為未知，對FcγR之結合活性高的人類IgG1與對FcγR之結合活性低之人類IgG2或人類IgG4之對FcγR之結合活性之不同，對於投予該抗體之活體造成之生理上的效果的不同，至今為止尚未經充分探討。實際上，在本實施例如後述，確認投予對FcγR之結合活性有缺損之抗體之個體之血漿中，不影響可溶型抗原之濃度變化。另一方面，本發明中，發現：投予含有對FcγR之結合活性增強且依離子濃度之條件可溶型對於抗原之結合活性變化之抗原結合分域之抗原結合分子的個體，血漿中之可溶型抗原濃度大幅下降。亦即，可稱首度發現藉由將以可溶型抗原為標的之抗原結合分子所含之於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域以及依離子濃度之條件對可溶型抗原之結合會變化之抗原結合分域加以組合，能有增強對於FcγR之結合的優點。

使該抗原從血漿中消失之活體外(ex vivo)之方法

本發明提供之使該抗原從血漿中消失之方法中，抗原結合分子之用途一非限定態樣，也可列舉在用以使該抗原從血漿中消失之所謂活體外(ex vivo)之方法使用該抗原結合分子，係包含使從對象單離的血漿與本發明之抗原結合分子接觸形成的免疫複合體，去接觸表現FcRn及Fcγ受體的細胞。利用將抗原結合分子對活體內投予之方法換為/及組合，將包含抗原結合分子及與抗原結合分子結合之抗原的血漿先取出到活體外後，使與表現FcRn及Fcγ受體之細胞接觸並經過一定期間後使再循環到細胞外(也稱為再分泌或再循環)之使包含未結合抗原之抗原結合分子的血漿回到活體內的所謂活體外(ex vivo)的方法，也能促進血漿中之抗原之消失速度。

又，本發明提供之使該抗原從血漿中消失之方法中，抗原結合分子之用途一非限定態樣，也可列舉用以使該抗原從血漿中消失之所謂ex vivo之方法中之該抗原結合分子用途，包括將從已投予本發明之抗原結合分子之對象單離的血漿中存在的免疫複合體與表現FcRn及Fcγ受體之細胞接觸的步驟。

該抗原是否從血漿消失，可藉由評價對照前述血漿中之抗原之消失速度於本發明之抗原結合分子替換為含有對抗原之結合活性不依離子濃度變化之抗原結合分域的抗原結合分子、含有於pH酸性域條件下對FcRn無結合活性之FcRn結合分域的抗原結合分子、或含有對Fcγ受體無選擇性的結合活性的Fcγ受體結合分域的抗原結合分子並比較時是否受促進而確認。

抗原結合分子之製造方法

本發明尚提供一種製造具有血漿中存在之抗原消失之機能的抗原結合分子之製造方法，包含以下步驟(a)~(e)；(a)獲得對抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之抗原結合分域、(b)獲得編碼為前述步驟(a)選擇之抗原結合分域的基因、(c)以能作用的方式連結前述步驟(b)獲得之基因以及編碼為於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域的基因、(d)培養包含於前述步驟(c)以可作用地連結之基因的寄主細胞、(e)從前述步驟(d)獲得之培養液將抗原結合分子單離。

本發明之一非限定態樣中，在將編碼為依如前述選擇之條件下結合活性變化之抗原結合分域的聚核苷酸單離後，將該聚核苷酸插入到適當表現載體。例如：抗原結合分域為抗體之可變區的情形，獲得編碼為該可變區的cDNA後，利用認識插入該cDNA之兩末端的限制酶部位的限制酶消化該cDNA。理想的限制酶，係認識在構成抗原結合分子之基因的鹼基序列出現頻度低的鹼基序列並消化。又，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入附有附著末端的限制酶較佳。藉由將如上述消化之編碼為抗原結合分子之可變區的cDNA插入適當表現載體，能取得本發明之抗原結合分子之表現載體。

將如前述取得之編碼為抗原結合分域之聚核苷酸，與前述「於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域」及「對Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域」之項目分別記載之編碼為於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域及對Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域的基因以可作用的連結。連結時，可直接於同一讀框連結，也可將編碼為各分域之聚核苷酸經由連結子於同一讀框連結。又，上述各分域以外，與編碼為前述「FcγR結合分域」之項目記載之FcγR結合分域的基因以可作用地連結。

本發明之抗原結合分子係使用抗體的情形，可適當使用編碼為作為上述「於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域」之抗體之Fc區的聚核苷酸。也可使用將該聚核苷酸改變，使「pH酸性域條件下對FcRn之結合活性」及「對Fcγ受體之選擇的結合活性」適當改變的Fc區。如此改變之非限定態樣，分別列舉於前述「於pH酸性域之條件下對FcRn具有結合活性之FcRn結合分域」及「對Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域」之項目。

為了製造所望抗原結合分子，將編碼為抗原結合分子之聚核苷酸以可作用地連結於控制序列之態樣納入表現載體。控制序列，包括例如：增強子或起動子。又，為了使表現的抗原結合分子分泌到細胞外，可於胺基末端連結適當的信號序列。例如信號序列可使用具有胺基酸序列 MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：4)之胜肽，但此外也可連結適當的信號序列。將表現的多胜肽於上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽能以成熟多胜肽的形式分泌到細胞外。其次，以此表現載體對適當寄主細胞轉形，可取得表現編碼為所望抗原結合分子之聚核苷酸的重組細胞。從該重組細胞製造本發明之抗原結合分子之方法，可依前述抗體之項目記載之方法製造。

關於核酸「可作用地連結」，係指該核酸與其他核酸序列在機能方面有關係。例如，前驅序列(presequence)或分泌前導的DNA，當就某多胜肽之分泌以前驅體蛋白質的形式表現的情形，與該多胜肽之DNA以可作動地結合。起動子或增強子，在其影響某編碼序列之轉錄的情形，與其序列以可作用地連結。或核糖體結合部，在位於其容易轉譯的位置的情形，以可作用地與編碼序列連結。通常，「可作用地連結」，係指結合之DNA序列連續，且為分泌前導的情形，連續且位於讀取框內。但增強子不需連續。連結可藉由以適當的限制部位接合而達成。不存在如此之部位之情形，合成寡核苷酸適應子(adaptor)或連結子可依習知的慣用方式使用。又，依前述Overlap Extension PCR之方法也可製作連結的核酸。

作為本發明之一非限定態樣，將編碼為依如前述選擇之條件對抗原之結合活性會變化之抗原結合分子的聚核苷酸單離後，將該聚核苷酸之改變體插入適當表現載體。作為如此之改變體之一，可理想地列舉：無規化可變區庫係使用合成庫或非人類動物為起源的免疫庫所篩選之編碼為本發明之抗原結合分子之聚核苷酸序列經人類化的改變體。人類化之抗原結合分子之改變體之製作方法，可採用與前述人類化抗體之製作方法為同樣方法。

又，改變體之其他態樣，例如：將帶來使用合成庫或天然庫作為無規化可變區庫使用而篩選之本發明之抗原結合分子對抗原之結合親和性之增強(親和性成熟化)的改變對於經單離之聚核苷酸序列實施而得的改變體。如此的改變體，可依包括CDR之變異誘導(Yang等(J.Mol.Biol.(1995)254,392-403))、鏈曳步(shuffling)(Marks等(Bio/Technology(1992)10,779-783))、E.coli之變異誘發株之使用(Low等(J.Mol.Biol.(1996)250,359-368))、DNA曳步(shuffling)(Patten等人(Curr.Opin.Biotechnol.(1997)8,724-733))、噬菌體展示(Thompson等(J.Mol.Biol.(1996)256,77-88))及有性PCR(sexual PCR)(Clameri等(Nature(1998)391,288-291))的各種親和性成熟化之公知程序取得。

將編碼為已施加如前述胺基酸之變異的Fc區之改變體的聚核苷酸、編碼依如前述選擇之條件會使結合活性變化之抗原結合分域的聚核苷酸於同一讀框連結之編碼為具重鏈之抗原結合分子的聚核苷酸，可製作為本發明之改變體之一態樣。

依本發明，提供一種抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟：從將與編碼為Fc區之聚核苷酸於同一讀框連結之編碼為依離子濃度條件之結合活性會變化之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體已導入之細胞之培養液回收抗原結合分子。又，也提供一種抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟：從預先編碼為載體中以可作用地連結之Fc區的聚核苷酸、及編碼為依離子濃度之條件，結合活性會變化之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地載體被導入之細胞之培養液，回收抗原結合分子。

本發明之「抗原結合分子之製造方法」中，做為評價利用該抗原結合分子所致之該抗原從血漿中消失的方法，可採用公知方法。各對於適當月齡的小鼠等非人類動物的群組，投予本發明之抗原結合分子。投予方法，如後述「醫藥組合物」之項目所記載，作為注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組合物，例如可依靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、頭蓋內注射等進行全身或局部投予。

為了測定該濃度，可使用NMR(核磁共振)或質量分析(MS)等分光法；SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、1D凝膠系分析、2D凝膠系分析、液體層析(例如：高壓液體層析(HPLC)或低壓液體層析(LPLC))、薄層層析、及LC-MS系之技術等。若列舉適當的LCMS技術，例如ICAT(註冊商標)(Applied Biosystems)或iTRAQ(註冊商標)(Applied Biosystems)。又，也可適當採用檢測成為對象之抗原以適當酵素進一步消化之抗原的進一步的片段的方法。又，該抗原濃度之測定，可依直接或間接的檢測方法實施。亦即，該抗原可經由與酵素、鍵結、受體或輸送蛋白質、抗體、胜肽、適體(Aptamer)或寡核苷酸、或該能與抗原專一性結合之任意合成化學性的受體或化合物等、配體或配體類交互作用，而直接的或間接的檢測。該配體可經發光標記、螢光標記或放射性標記、及/或親和性標籤等可檢測之標記修飾。如此之例，可列舉免疫學的方法。

作為理想測定方法，例如使用與該抗原存在之抗原決定部位結合之抗體的免疫學的方法。該免疫學的方法，例如：酵素免疫測定法(ELISA、EIA)、螢光免疫測定法(FIA)、放射免疫測定法(RIA)、發光免疫測定法(LIA)、酵素抗體法、螢光抗體法、免疫層析法、免疫比濁法、乳膠比濁法、乳膠凝集反應測定法等。又，如此的免疫學方法中，測定可依手動操作實施，也可使用分析裝置等裝置實施。本發明之免疫學的方法，例如可依三明治法等公知方法實施。例如：將固定於擔體之第一抗體、與生物學的試樣及經標記物質修飾之第二抗體，同時或依序反應。依上述反應，會形成固定於擔體之第一抗體、該抗原及經標記物質修飾之第二抗體的複合體，藉由將此複合體含有的結合於第二抗體之標記物質定量，便能測定生物學的試樣中所含之該抗原之量(濃度)。

例如：為酵素免疫測定法之情形，宜使用包含固定有第一抗體之微板、以一系列稀釋之生物學的試樣、經HRP等酵素修飾之第二抗體、洗滌緩衝液、及依HRP等酵素受反應之基質的溶液。作為一非限定測定態樣中，可藉由使修飾第二抗體之酵素在其最佳條件下與基質反應，並以光學方法測定其酵素反應產物之量。又，螢光免疫測定法之情形，宜使用固定有第一抗體之光導波路、經一系列稀釋之生物學的試樣、利用螢光物質修飾之第二抗體、洗滌緩衝液。於一非限定測定態樣中，可藉由照射到修飾第二抗體之螢光物質的激發起光，並測定此螢光物質發出的螢光強度。

再者，於放射免疫測定法之情形，係測定放射性物質所得之放射線量。又，發光免疫測定法之情形，係測定發光反應系所得之發光量。又，為免疫比濁法、乳膠比濁法、乳膠凝集反應測定法等情形，係以終點法或以比例(rate)法測定穿透光或散射光。又，當以目視測定免疫層析法等的情形，係以目視測定在測試線上出現的標記物質的顏色。又，可將此目視的測定適當代換為使用分析裝置等設備。

醫藥組合物

本發明係關於本發明之抗原結合分子、依本發明之改變方法製作之抗原結合分子、或包含依本發明之製造方法製造之抗原結合分子之醫藥組合物。本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子，藉由投予，比起通常之抗原結合分子使血漿中之抗原濃度下降之作用高，且由於經投予之活體所為之免疫回應或該活體中之藥物動態等有改變，故作為醫藥組合物有用。本發明之醫藥組合物可含醫藥上可容許之擔體。

本發明中之醫藥組合物係通常指疾病之治療或預防、或檢查‧診斷用之藥劑。

本發明之醫藥組合物，能以該技術領域之人類士公知之方法製劑化。例如：能以與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如：藥理學上可容許之擔體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定為可獲得指示範圍之適當容量。

用於注射之無菌組合物，可使用如注射用蒸餾水之運載劑而依通常之製劑實務配方。注射用之水溶液，例如生理食鹽水、葡萄糖或含其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酸酯80(TM)、HCO-50等)。

油性液，例如麻油、黃豆油，溶解輔助劑可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如：磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如：鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如：苯甲醇及酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常充填在適當的安瓿。

本發明之醫藥組合物較佳為以非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組合物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等對於全身或局部投予。

投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含抗原結合分子之醫藥組合物之投予量，例如可設定為每次體重1kg為0.0001mg至1000mg之範圍。或，可定為例如每位患者為0.001~100000mg之投予量，但本發明不一定限於該等數值。投予量及投予方法，視患者之體重、年齡、症狀等而變動，但如為該技術領域之人類士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。

又，本發明提供在本發明之方法使用之套組，至少包含本發明之抗原結合分子。該套組，此外也可包裝有藥學上可容許擔體、介質、記載使用方法之指示書等。

又，本發明係關於使血漿中之含有二種以上之抗原結合單元及二以上之抗原結合分子之複合體消失的藥劑，係包含本發明之抗原結合分子或包含依本發明之製造方法製造之抗原結合分子作為有效成分。

又，本發明係關於一種疾病的治療方法，其包含以下步驟：將本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子對於對象(患者、受試者等)投予的步驟。疾病之非限定例，可列舉癌、或發炎性疾病。

又，本發明係關於包含本發明之抗原結合分子或包含依本發明之製造方法製造之抗原結合分子作為有效成分在使血漿中之含有二種以上之抗原結合單元及二以上之抗原結合分子之複合體消失的藥劑製造之用途。

又，本發明係關於本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子在使血漿中之含有二種以上之抗原結合單元及二以上之抗原結合分子之複合體消失的藥劑製造之用途。

又，本發明係關於在本發明之方法使用之本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子。

又，本發明記載之胺基酸序列所包含之胺基酸，有時會受到轉譯後修飾(例如：N末端之麩醯胺酸由於焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域之人類士熟知之修飾)，但如此的胺基酸為轉譯後修飾時，當然也包含在本發明記載之胺基酸序列。

又，本說明書引用之所有先前技術文獻，納入於本說明書作為參考。

以下將本發明以實施例更具體說明，但本發明不受該等實施例限制。

【實施例】

(實施例1)在pH中性域之條件下對小鼠FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子之製作

(1-1)關於pH依存性人類IL-6受體結合抗體

WO2009/125825記載之由H54-IgG1(序列編號：36)與L28-CK(序列編號：37)構成之H54/L28-IgG1為人類化抗IL-6受體抗體，且由VH3-IgG1(序列編號：38)與VL3-CK(序列編號：39)構成之Fv4-IgG1，係賦予了對於H54/L28-IgG1以pH依存性結合於可溶型人類IL-6受體之特性(在pH7.4結合，並在pH5.8解離)之人類化抗IL-6受體抗體。在WO2009/125825記載之小鼠之體內試驗中，相較於投予H54/L28-IgG1與為抗原之可溶型人類IL-6受體之混合物之群，投予Fv4-IgG1與為抗原之可溶型人類IL-6受體之混合物之群中，顯示可溶型人類IL-6受體從血漿中之消失大幅加快。

結合於可溶型人類IL-6受體之抗體亦即與H54/L28-IgG1結合之可溶型人類IL-6受體，會與抗體一起由FcRn而於血漿中再循環，相對於此，以pH依存性地結合於可溶型人類IL-6受體之抗體Fv4-IgG1，在內體內之酸性條件下會將與抗體結合之可溶型人類IL-6受體解離。已解離之可溶型人類IL-6受體會由溶體分解，所以可大幅加快可溶型人類IL-6受體之消失，且以pH依存性地結合於可溶型人類IL-6受體之抗體Fv4-IgG1，在內體內與FcRn結合之後會於血漿中再循環。經再循環之該抗體能再次與可溶型人類IL-6受體結合，所以可重複對於抗原(可溶型人類IL-6受體)之結合及以FcRn在血漿中再循環。其結果，據認為1個抗體分子能重複多次與可溶型人類IL-6受體結合(圖1)。

(1-2)對於小鼠FcγR之結合增強之抗人類IL-6受體抗體及對於小鼠FcγR不結合之抗人類IL-6受體抗體之製作

作為對於小鼠FcγR之結合增強之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp、EU編號表示之328位之Leu取代為Tyr之VH3-IgG1-F1022(序列編號：40)。使用參考實施例1之方法，製作包含VH3-IgG1-F1022作為重鏈，包含VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1022。

另一方面作為對於小鼠FcγR不結合之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之235位之Leu取代為Arg、239位之Ser取代為Lys之VH3-IgG1-F760(序列編號：41)。使用參考實施例1之方法，製作包含VH3-IgG1-F760作為重鏈、包含VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F760。

(1-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認

包含VH3-IgG1、VH3-IgG1-F1022及VH3-IgG1-F760作為重鏈、包含L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-IgG1、VH3/L(WT)-IgG1-F1022及VH3/L(WT)-IgG1-F760，係依參考實施例1之方法製作。如以下方式，將該等之抗體對於小鼠FcγR之結合以動力理論解析。

(1-4)對於小鼠FcγR之結合之動力理論解析

使用Biacore T100或T200(GE Healthcare)，將小鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV(參考實施例2中製備)(以下稱為小鼠FcγRs)與抗體之結合以動力理論解析。使以胺偶聯法在感測晶片CM4(GE Healthcare)上固定有適當量之protein L(ACTIGEN)捕捉目的抗體。其次注入小鼠FcγRs之稀釋液及為空白之運行緩衝液，使捕捉於感應晶片上之抗體與小鼠FcγRs交互作用。運行緩衝液可使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，小鼠FcγRs稀釋時也使用該緩衝液。感應晶片之再生係使用10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5。測定均在25℃實施。從測定得到的感測圖，計算為動力學參數之結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等之值，計算各抗體對於人類FcγR之K_D (M)。各參數之計算，係使用Biacore T100或T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)。

其結果，獲得表6所示之測定結果。VH3/L(WT)-IgG1-F1022，相較於VH3/L(WT)-IgG1，顯示對mFcγRI、mFcγRIIb及mFcγRIII之結合活性增強。另一方面， VH3/L(WT)-IgG1-F760對於各種小鼠FcγR未檢測到有結合，故顯示VH3/L(WT)-IgG1-F760對各種小鼠FcγR之結合活性缺損。又，表中，VH3/L(WT)-IgG1表示記載為IgG1、VH3/L(WT)-IgG1-F1022表示記載為F1022、VH3/L(WT)-IgG1-F760表示記載為F760。

(1-5)低岩藻糖型抗體之製作

使抗體對FcγR之結合活性增強之方法，已知有對於抗體之Fc區導入胺基酸改變之方法，此外已知有使與抗體連結之糖鏈成為低岩藻糖型糖鏈之方法(J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473)。依參考實施例1之方法，將岩藻糖轉運蛋白基因缺損之CHO細胞(WO2006067913)作為寄主細胞使用並表現Fv4-IgG1，製作低岩藻糖型Fv4-IgG1(以下記載為Fv4-IgG1-Fuc)。mFcγR(小鼠Fcγ受體)當中，據報告低岩藻糖型抗體對於FcγRIV之結合活性選擇性的提高(Science(2005)310(5753)1510-1512)。

[實施例2]對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子使抗原從血漿中消失之效果

(2-1)H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1使抗原從血漿中消失之效果

為抗人類IL-6受體抗體之H54/L28-IgG1、及有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之Fv4-IgG1，依參考實施例1之方法製作。使用製作之H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1之體內輸液試驗，依下列方法實施。

(2-1-1)使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗

在人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，以製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投予之抗人類IL-6受體抗體在投予後之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之中和抗體，將(以公知之方法取得)抗小鼠CD4單株抗體對於尾靜脈以20mg/kg單次投予。之後，在小鼠背部皮下埋入填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦。埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1mg/kg對於尾靜脈單次投予。投予抗人類IL-6受體抗體後經過15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日後從該小鼠採血。將採取的血液立刻於4℃以15,000rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。

(2-1-2)利用電化學發光法測定血漿中人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度

小鼠之血漿中hsIL-6R可溶型人類IL-6受體濃度，係以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL之hsIL-6R可溶型人類IL-6受體檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣，與SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)及tocilizumab混合，於37℃使反應1晚。製備成Tocilizumab之終濃度成為333μg/mL。之後，將反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於室溫使反應1小時並洗滌反應液後，分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。之後立即以SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。hsIL-6R可溶型人類IL-6受體濃度係由檢量線之回應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。

測定之人類IL-6受體濃度變動如圖2。相較於H54/L28-IgG1，對於人類IL-6受體以pH依存性地結合之Fv4-IgG1能降低人類IL-6受體濃度，但是人類IL-6受體濃度無法比抗體非投予時之基線低。亦即，對於抗原以pH依存性地結合之抗體，未能由於抗體投予使血漿中之抗原濃度低於抗體投予前。

(2-2)對FcγR之結合活性增強或下降之抗體使抗原從血漿中消失之效果

對於係pH依存性人類IL-6受體結合抗體的Fv4-IgG1，藉由使對FcγR之結合活性增強或下降，對於人類IL-6受體濃度變動造成之影響依下列之方法評價。使用實施例1製作之Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F760、Fv4-IgG1-F1022、Fv4-IgG1-Fuc之體內輸液試驗依下列之方法實施。

(2-2-1)使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗

在人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，以製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投予之人類免疫球蛋白製劑Sanglopor(CSL behring(股)公司)以及同時投予的抗人類IL-6受體抗體在投予後之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之中和抗體，將(以公知之方法取得)單株抗小鼠CD4 antibody對於尾靜脈以20mg/kg單次投予。之後，在小鼠背部皮下埋入填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦。埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1mg/kg、Sanglopor以1000mg/kg對於尾靜脈單次投予。投予抗人類IL-6受體抗體後經過15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日後從該小鼠採血。將採取的血液立刻於4℃以15,000rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。

(2-2-2)利用電化學發光法所為之血漿中可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度測定

與(2-1-2)記載之方法同樣，以電化學發光法測定小鼠血漿中hsIL-6R可溶型人類IL-6受體濃度。

結果如圖3。確認投予使Fv4-IgG1對於小鼠FcγR之結合缺損之Fv4-IgG1-F760之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動，與投予Fv4-IgG1之小鼠之血漿中之人類IL-6受體濃度為同等。由於對於膜型抗原之細胞傷害活性係依存於對於FcγR之結合，已知若對於FcγR之結合缺損，會變得無細胞傷害活性。另一方面，由於即使投予使對抗為可溶型抗原之人類IL-6受體之抗體之對於小鼠FcγR之結合缺損之抗體，投予後小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度之變動仍無影響，所以據認為針對投予對抗可溶型抗原之抗體之小鼠血漿中之抗原濃度之變動，抗體對於FcγR之結合無貢獻。

但意外地，投予對於小鼠FcγR結合增強之Fv4-IgG1-F1022之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度大幅下降，其下降程度確認比抗體非投予時之人類IL-6受體濃度基線更低。尤其，從Fv4-IgG1-F1022投予3日後之被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之情形之被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，下降成約100分之1。由此顯示，藉由投予以pH依存性地結合於人類IL-6受體且對於FcγR之結合增強之抗體，能使被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度大幅下降，且其下降程度可使血漿中之抗原濃度比起抗體投予前更低。

又，投予有低岩藻糖型之糖鏈且對於小鼠FcγR IV之結合活性增強之Fv4-IgG1-Fuc後小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，也比起投予Fv4-IgG1之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度有下降。尤其，Fv4-IgG1-Fuc投予7日後之被投予之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之情形之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，下降為約2分之1。由此顯示，藉由投予以pH依存性地結合於人類IL-6受體且對於FcγR之結合增強之pH依存性抗原結合分子，能降低被投予之小鼠血漿中之可溶型抗原之濃度，此時作為用以增強對於FcγR之結合之方法，不特別限定於導入胺基酸改變，例如使用結合於EU編號297位之糖鏈係低岩藻糖型糖鏈之人類IgG之Fc區也能達成。但抗原濃度下降之效果，相較於Fv4-F1022，Fv4-IgG1-Fuc明顯較小。由此結果可認為：多數存在之FcγR(小鼠中，FcγRI,II,III,IV)之中，Fv4-IgG1-Fuc之結合增強之mFcγIV，作為FcγR使抗原濃度下降之貢獻不大。

如上發現，藉由投予以pH依存性地結合於可溶型抗原之抗體對於FcγR之結合增強之抗體，能使被投予之個體中存在之可溶型抗原之血漿中濃度大幅下降。

雖不拘於特定理論，但藉由投予包含對於FcγR之結合增強之依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子可觀察到的預料外之血漿中可溶型抗原濃度之下降，也可說明如下。

非專一性的攝入到細胞內之IgG抗體，在內體內之酸性條件下結合於內體內之FcRn而回到細胞表面上，在血漿中之中性條件下從FcRn解離。在此，藉由對血漿中可溶型抗原維持一定濃度之小鼠投予藉由與可溶型抗原結合將其機能中和之抗體之情形，血漿中之可溶型抗原會與被投予的抗體形成複合體。在形成了該複合體之狀態攝入到細胞內之可溶型抗原，抗體之Fc區在內體內之酸性條件下結合於內體內之FcRn，故據認為會以結合於抗體之狀態與抗體一起再循環到血漿中。

另一方面對抗可溶型抗原之抗體係以pH依存性地結合於抗原之抗體(亦即在內體內之酸性條件將可溶型抗原解離之抗體)的情形，以與抗體形成複合體之狀態以非專一性的攝入到細胞內之可溶型抗原，在內體內會從抗體解離並於細胞內溶體內分解，不會再循環到血漿中。亦即，可認為：以與可溶型抗原形成複合體之狀態攝入到細胞內之Fv4-IgG1，在內體內將可溶型抗原解離，可加快其消失。

如前述，Fv4-IgG1等包含依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，據認為可重複數次與抗原結合，但是在內體內將可溶型抗原並加快其從血漿中消失之效果，據認為係取決於抗原與抗原結合分子之複合體攝入到內體內之速度。包含對於各種FcγR之結合活性增強、依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，會藉由與在細胞膜上表現之各種FcγR結合，而積極地被攝入細胞內，可藉由該分子中所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域及經由FcRn之結合之再循環，而再度在血漿中循環。亦即血漿中與可溶型抗原形成複合體之前述抗原結合分子，會經由在細胞膜上表現之FcγR而積極地被攝入細胞內，所以加快血漿中之可溶型抗原消失之效果，據認為比起對於各種FcγR之結合活性未增強之抗原結合分子更顯著。

結合於膜型抗原之抗體對FcγR之結合活性，在該抗體之細胞傷害活性發揮重要作用。所以當作醫藥使用之抗體需要細胞傷害活性之情形，係使用對FcγR之結合活性高的人類IgG1的構造同型，而且藉由增強該抗體對FcγR之結合活性，使該抗體之細胞傷害活性增強之技術已廣為使用。

另一方面，作為醫藥使用，結合於可溶型抗原之抗體對FcγR之結合活性發揮的作用至今為止尚未知，對FcγR之結合活性高之人類IgG1及對FcγR之結合活性低之人類IgG2或人類IgG4之對FcγR之結合活性之不同，賦予投予了該抗體之活體之效果差異，至今並未充分探討。實際上在本實施例中，已確認在投予了對FcγR之結合活性缺損之抗體的個體之血漿中，不影響可溶型抗原之濃度變動。另一方面，本發明發現：包含投予了對FcγR之結合活性增強且依離子濃度之條件可溶型對於抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗原結合分子之個體之血漿中，可溶型抗原之濃度大幅下降。亦即，可稱得上首次找出藉由將以可溶型抗原作為標的之抗原結合分子所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域及依離子濃度之條件對於可溶型抗原之結合會變化之抗原結合分域組合使對於FcγR之結合增強的優點。

(實施例3)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子使抗原從血漿中消失之效果

(3-1)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之製作

改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法，據報告有使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合提高之方法。對於IgG抗體之Fc區導入胺基酸取代並使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合提高，據認為從內體內往血漿中之再循環效率上升，其結果，該IgG抗體之血漿中滯留性改善。

使在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性提高以改善血漿中滯留性之胺基酸改變之一例，已有IgG抗體之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之方法(Nat.Biotechnol,,(2010)28：,157-159.)、434位之Asn取代為Ala之方法(Drug.Metab.Dispos.(2010)38(4),600-605)、252位之Met取代為Tyr、254位之Ser取代為Thr、256位之Thr取代為Glu之方法(J.Biol.Chem.(2006)281,23514-23524)、250位之Thr取代為Gln、428位之Met取代為Leu之方法(J.Immunol.(2006)176(1)346-356)、434位之Asn取代為His之方法(Clin.Pharm.& Ther.(2011)89(2)283-290.)、及WO2010/106180、WO2010/045193、WO2009/058492、WO2008/022152、WO2006/050166、WO2006/053301、WO2006/031370、WO2005/123780、 WO2005/047327、WO2005/037867、WO2004/035752、WO2002/060919等多數被報告。

實施例2中，為了使藉其之投予顯示可溶型抗原在血漿中濃度顯著下降之效果的Fv4-IgG1-F1022的藥物動態提升，製作VH3-IgG1-F1022之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之VH3-IgG1-F1093(序列編號：43)。使用參考實施例1之方法製作含有VH3-IgG1-F1093作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1093。

(3-2)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之效果

使用血漿中可溶型人類IL-6受體濃度維持不變狀態之人類FcRn基因轉殖小鼠，與實施例(2-1-1)之方法同樣地進行Fv4-IgG1-F1093之體內輸液試驗。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖4所示。

(3-2-1)利用ELISA法測定血漿中抗人類IL-6受體抗體濃度

小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度係以ELISA法測定。首先，將抗體的抗人類IgG(γ-鏈專一性)F(ab')2片段(SIGMA)分注到Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚，製作成抗人類IgG固相化板。製備含血漿中濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL之抗人類IL-6受體抗體之檢量線試樣以及稀釋 100倍以上之小鼠血漿測定試樣。將該等之檢量線試樣及在血漿測定試樣100μL加入有20ng/mL之可溶型人類IL-6受體200μL之混合液，於室溫靜置1小時。之後將該混合液分注於各井而得之抗人類IgG固相化板再於室溫靜置1小時。之後與Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)於室溫反應1小時，再與Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於室溫反應1小時進行反應液之發色反應，係以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質。藉由添加1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止之各井之反應液在450nm之吸光度，以微板讀取儀測定。小鼠血漿中之抗體濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算得。

其結果如圖5所示。

(3-3)利用在pH酸性域之條件下增強人類FcRn結合活性所得之藥物動態之改善

如圖5所示，投予了Fv4-IgG1在pH中性域之條件下對FcγR之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1022之群中，比起投予了Fv4-IgG1之群，確認已投予之抗體之血漿中滯留性下降。另一方面，投予了Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093之群中，比起投予了Fv4-IgG1-F1022之群，確認已投予之抗體之血漿中滯留性大幅改善。

又，如圖4所示，血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度，在Fv4-IgG1-F1022之投予群與Fv4-IgG1-F1093之投予群中均在直到抗體投予後第3日為止顯示同等的變動。投予後第3日，比起Fv4-IgG1之投予群，Fv4-IgG1-F1022及Fv4-IgG1-F1093任一投予群，均觀察到血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度之約100倍的顯著濃度下降。但抗體投予後第7日，Fv4-IgG1-F1022投予群之血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度比起投予後第3日觀察到上升的傾向，另一方面，Fv4-IgG1-F1093投予群中，未觀察到血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度上升，顯示本投予群中可溶型人類IL-6受體濃度下降之效果持續中。

亦即Fv4-IgG1-F1093之投予，已投予之個體之血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度比起Fv4-IgG1可降下到約100分之1，且其狀態能長期間維持，顯示為非常優異的抗原結合分子。雖不拘於特定理論，但在此觀察到的現象也可說明如下。Fv4-IgG1在pH中性域之條件下對FcγR之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1022，據認為主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞中有攝入多量。攝入並移到內體的抗體，在內體內藉由結合於FcRn而在血漿中再循環。在內體內之酸性pH之條件下，抗體對於FcRn之結合活性不足的情形，據認為攝入內體的抗體無法充分再循環。亦即作為Fv4-IgG1-F1022比Fv4-IgG1之血漿中滯留性低的理由，是因為攝入內體內之抗體經由對FcRn之結合而充分於血漿中再循環的程度，在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性不足，未再循環之抗體於溶體受分解的原故。

另一方面，Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093，與Fv4-IgG1-F1022同樣，據認為主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞有攝入多量。被攝入並移到內體之抗體，藉由在內體內結合於FcRn而與血漿中再循環，但由於Fv4-IgG1-F1093在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強，所以據認為在內體內對於FcRn有足夠結合活性。所以即使Fv4-IgG1-F1093攝入細胞內後，其許多仍會在血漿中再循環。所以比起Fv4-IgG1-F1022，據認為Fv4-IgG1-F1093會提高在已投予之個體之血漿中滯留性。

另一方面至今也已知藉由在pH酸性域之條件下提高對於FcRn之結合活性，通常之抗體之血漿中滯留性會提高。但若抗體之血漿中滯留性提高，結合於抗體之抗原之血漿中滯留性也提高，故據認為相應地抗原之血漿中濃度也提高。實際上，如WO2010/088444所記載之對於對抗IL-6之人類IgG1抗體Antibody18導入在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性提高之YTE改變之Antibody 18E，在食蟹猴中，抗體之血漿中滯留性提高，但同時抗原IL-6之血漿中濃度也提高。

但令人類意外地，對對於抗原以pH依存性地結合且對FcγR之結合活性增強之Fv4-F1022，投入已導入與YTE改變同樣之在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性提高之改變之Fv4-IgG1-F1093的情形，儘管在投予之個體中抗體之血漿中滯留性大幅提高，但該個體中，為抗原之可溶型人類IL-6受體濃度未提高，在抗體投予第7日，已投予 Fv4-IgG1-F1093之個體比起已投予Fv4-F1022之個體，可溶型人類IL-6受體濃度維持較低。

雖不受特定理論拘束，在此觀察到的現象也可如以下方式說明。將對於抗原未顯示pH依存性結合之抗體對活體投予後，該抗體非專一性的攝入到細胞內，維持結合於該抗體之抗原，與抗體以相同程度於血漿中再循環。另一方面，在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性增強之抗體，在被投予之活體之血漿中再循環的程度高於對於FcRn之結合活性增強之抗體，所以該維持結合於抗原之抗原在該活體之血漿中再循環的程度也提高。所以可認為：藉由提高被投予抗體所被投予之活體在血漿中滯留性，該抗體所結合之抗原在該活體之血漿中濃度也會上升。

另一方面，當將對於抗原以pH依存性地結合且對FcγR之結合活性增強之抗體對於活體投予時，該抗體會由於攝入主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞內而其在血漿中滯留性下降。另一方面，結合於該抗體之抗原也攝入該細胞內後，在內體內從該抗體解離後在溶體分解，藉此該活體之血漿中抗原濃度也下降。在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性有提高之情形，藉由增強對FcγR之結合活性而惡化之抗體之血漿中滯留性，可藉由提高經由FcRn之再循環率而改善。在此，對於抗原以pH依存性地結合之抗體所結合之抗原，在內體內從該抗體解離，且直接在溶體被分解，所以據認為抗原之血漿中濃度不上升。再者，由於被投予到活體之抗體之血漿中滯留性提高，據認為該抗體之抗原消失效果持續，能更久維持抗原濃度在低濃度。

由以上顯示：對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子，在投予了在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性有增強之抗體之活體中，被投予之抗體之血漿中滯留性提高。又，於該情形中顯示即使抗體之血漿中滯留性提高，抗原消失效果未減弱。

[實施例4]對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之效果之更進一步驗證

(4-1)對FcγR之結合活性增強之抗體之抗原之消失效果

實施例2中，在投予了對小鼠FcγR之結合增強之Fv4-IgG1-F1022之群中，顯示血漿中之抗原濃度大幅下降。又，實施例3中，Fv4-IgG1-F1022之投予群之血漿中滯留性之下降，顯示藉由增強Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性而有大幅改善。其次對於由於增強對小鼠FcγR之結合而得之血漿中可溶型抗原之消失效果、以及由於增強在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性而得到提高抗體之血漿中滯留性之效果，以如下方式進一步驗證。

(4-2)對於小鼠FcγR結合有增強之抗人類IL-6受體抗體之製作

作為對小鼠FcγR之結合有增強之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp之VH3-IgG1-F1087(序列編號：44)及VH3-IgG1之EU編號表示之239位之Ser取代為Asp、332位之Ile取代為Glu之VH3-IgG1-F1182(序列編號：45)。使用參考實施例1之方法，製作含有VH3-IgG1-F1087作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1087，及含有VH3-IgG1-F1182作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1182。

(4-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認

以參考實施例1之方法製作含有VH3-IgG1-F1087及VH3-IgG1-F1182作為重鏈、含有L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-IgG1-F1087及VH3/L(WT)-IgG1-F1182。以參考實施例2之方法評價該等之抗體及VH3/L(WT)-IgG1-F1022、VH3/L(WT)-IgG1對小鼠FcγR之結合活性。其結果如表7所示。又，各改變體對小鼠FcγR之結合活性比起施以改變前之IgG1增強了幾倍，如表8所示。又，表中，VH3/L(WT)-IgG1表示記載為IgG1、VH3/L(WT)-IgG1-F1022表示記載為F1022、VH3/L(WT)-IgG1-F1087表示記載為F1087、VH3/L(WT)-IgG1-F1182表示記載為F1182。

如表8所示，F1087及F1022對於小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性，比起IgG1增強，但對於小鼠FcγRIV之結合活性未增強。又，F1087對於小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII及小鼠FcγRIV之結合活性，若比起F1022對於此等之結合活性，其增強程度弱。另一方面，F1182對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性大幅增強，另一方面，其對FcγRIIb及FcγRIII之結合活性若比起F1022及F1087對於此等之結合活性，其增強之程度弱。如此，該等3種改變體均對於小鼠FcγR之結合顯示增強效果，但對哪一FcγR顯示選擇的結合活性增強、及其增強之程度，則依改變體而異。

(4-4)Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之使抗原從血漿中消失之效果

使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗與實施例2之方法同樣實施，並測定該小鼠血漿中之可溶型IL-6受體之濃度。其結果如圖6所示。

在活體內投予了對小鼠FcγR之結合活性比起Fv4-IgG1為增強之Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之群中，均比起投予了Fv4-IgG1之群，活體中之血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降。血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降之效果，特別在投予了對小鼠FcγRII及小鼠FcγRIII之結合為增強之Fv4-IgG1-F1087之群中為大。另一方面，在活體內投予了對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性大幅提高之(對小鼠FcγRII及小鼠FcγRIII之結合也有數倍增強)F1182之群中，由於F1182之投予所得之血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降之效果小。由該等結果可知：對藉由投予pH依存性抗原結合抗體之小鼠血漿中之抗原濃度有效率的下降的效果較有貢獻的小鼠FcγR，為小鼠FcγRII及/或小鼠FcγRIII。亦即藉由將對於小鼠FcγRII及/或小鼠FcγRIII之結合增強之pH依存性抗原結合抗體對於活體內投予，據認為能更有效率的降低活體內之抗原之血漿中濃度。

(4-5)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之製作

實施例3中，被投予對小鼠FcγR之結合活性有增強之Fv4-IgG1-F1022於pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093之人類FcRn基因轉殖小鼠中，比起被投予Fv4-IgG1-F1022之人類FcRn基因轉殖小鼠，被投予之抗體之血漿中滯留性大幅提高。該效果是否是在已投予Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之人類FcRn基因轉殖小鼠中也會顯示，以及是否在投予了施予與實施例3驗證之改變為相異之改變且在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強之改變體之小鼠也會顯示同樣效果，以如下方式驗證。

為了增強Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性，製作各重鏈VH3-IgG1-F1087及VH3-IgG1-F1182之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之VH3-IgG1-F1180(序列編號：46)及VH3-IgG1-F1181(序列編號：47)。又，為了增強Fv4-IgG1-F1087在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性，製作重鏈VH3-IgG1-F1087之EU編號表示之434位之Asn取代為Ala之VH3-IgG1-F1412(序列編號：48)。使用參考實施例1之方法，製作包含該等作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181及Fv4-IgG1-F1412。

(4-6)在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗體之藥物動態之改善

對人類FcRn基因轉殖小鼠各投予Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181及Fv4-IgG1-F1412之體內輸液試驗與實施例2之方法同樣地實施，並測定該小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度。投予了Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1之小鼠群之血漿中抗體濃度之結果如圖9，投予了Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1之小鼠血漿中抗體濃度之結果如圖10所示。又，該小鼠群之血漿中抗體濃度依實施例3之方法測定。該小鼠群中，Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1之血漿中可溶型IL-6受體濃度之結果如圖7，Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1之血漿中可溶型 IL-6受體濃度之結果如圖8所示。

在投予了Fv4-IgG1-F1182在pH酸性域對人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1181之小鼠群中，比起已投予Fv4-IgG1-F1182之小鼠群，抗體之血漿中滯留性確認有提高。另一方面，在投予了Fv4-IgG1-F1181之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體濃度，與投予了Fv4-IgG1-F1182之小鼠群之該等為同等，且比起投予了Fv4-IgG1之小鼠群，血漿中可溶型IL-6受體濃度均下降。

另一方面，投予了Fv4-IgG1-F1087在pH酸性域對人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1180及投予了Fv4-IgG1-F1412之小鼠群中，均比起投予了Fv4-IgG1-F1087之小鼠群，被投予之抗體之血漿中滯留性提高，令人類意外地，與投予了Fv4-IgG1之小鼠群之血漿中滯留性改善到同程度。又，伴隨抗體之血漿中滯留性之改善，被投予之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度之減少效果之持續性也改善。亦即從Fv4-IgG1-F1180及Fv4-IgG1-F1412之投予起14日後及21日後，接受該投予之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度，比起Fv4-IgG1-F1087之投予起14日後及21日後之該濃度顯著下降。

由以上顯示：藉由投予對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性增強之抗體，接受該投予之活體之血漿中滯留性可提高，係在投予了Fv4-IgG1-F1093、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1-F1180及Fv4-IgG1-F1412之4例之抗體的小鼠群中顯示。且投予了抗原結合分子之活體之血漿中滯留性即使提高，在該活體之抗原消失效果不減弱，換言之可顯示持續的抗原消失效果。

作為用以使在pH酸性域條件之人類FcRn結合活性增強之改變，除了將EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之方法，也可藉由將EU編號表示之434位之Asn取代為Ala之方法達成。由此，為了增強於pH酸性域條件下之人類FcRn結合活性使用之改變不特別限定，也可使用將IgG抗體之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之方法(Nat.Biotechnol.(2010)28,157-159)、434位之Asn取代為Ala之方法(Drug Metab.Dispos.(2010)38(4)600-605)、252位之Met取代為Tyr、254位之Ser取代為Thr、256位之Thr取代為Glu之方法(J.Biol.Chem.(2006)281,23514-23524)、250位之Thr取代為Gln、428位之Met取代為Leu之方法(J.Immunol.(2006)176(1),346-356)、434位之Asn取代為His之方法(Clin.Pharmcol.Ther.(2011)89(2)283-290)、及WO2010/106180、WO2010/045193、WO2009/058492、WO2008/022152、WO2006/050166、WO2006/053301、WO2006/031370、WO2005/123780、WO2005/047327、WO2005/037867、WO2004/035752、WO2002/060919等記載之改變。

(4-7)在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強且抑制對風溼病因子之結合之抗原結合分子之製作

為了使人類化抗CD4抗體在pH酸性域之條件下對於人類 FcRn之結合活性增強且提高血漿中滯留性，近年有人類報告將EU編號表示之434位之Asn取代為His之抗體分子對風溼病因子(Rheumatiod factor、RF)之結合(Clin.Pharmacol.Ther.(2011)89(2),283-290)。該抗體有人類IgG1之Fc區且位於對於FcRn之結合部位之EU編號表示之434位之Asn取代為His，顯示風溼病因子會結合於認識該經取代之處。

如實施例(4-6)所示，用於增強在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性之改變，已有各種者被報告，藉由將此等改變導入Fc區中之FcRn結合部位，能增強對認識該部位之風溼病因子之結合性。

但藉由將在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性不下降、僅對於風溼病因子之結合活性下降之改變導入於Fc區之該部位，能製作不具對風溼病因子之結合性，在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性有增強之抗原結合分子。

如此之使對風溼病因子之結合活性下降之改變，係使用EU編號表示之248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位之改變。較佳為使用EU編號表示之387、422、424、426、433、436、438、440位之改變。尤佳為使用EU編號表示之422位之Val取代為Glu或Ser之改變、424位之Ser取代為Arg之改變、433位之His取代為Asp之改變、436位之Tyr取代為Thr之改變、438位之Gln取代為Arg或Lys之改變、440位之Ser取代為Glu或Asp之改變。該等改變可以單獨使用，也可組合多處使用。

或為了降低對於風溼病因子之結合活性，也可導入N型糖鏈之附加序列。具體而言，N型糖鏈附加序列已知有Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx為Pro以外的任意胺基酸)，藉由將該序列導入Fc區，能附加N型糖鏈並利用N型糖鏈之立體障礙抑制與RF之結合。用於附加N型糖鏈之改變，較佳為使用EU編號表示之248位之Lys取代為Asn之改變、424位之Ser取代為Asn之改變、436位之Tyr取代為Asn且438位之Gln取代為Thr之改變、438位之Qln取代為Asn之改變。尤佳為使用EU編號表示之424位之Ser取代為Asn之改變。

[實施例5]投予對FcγR之結合活性高於天然型小鼠IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之效果

(5-1)投予了對FcγR之結合活性已增強之小鼠抗體之使抗原消失之效果

實施例1至4中，投予了具有人類抗體之Fc區且具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之抗原結合分子之對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗原結合分子的人類FcRn基因轉殖小鼠群中，確認該小鼠血漿中可溶型人類IL-6受體之消失加快。該效果在有小鼠FcRn之正常小鼠中、投予了具有小鼠抗體之Fc區且具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之抗原結合分子的具有小鼠FcRn之正常小鼠中是否也會顯示，係依以下所示驗證。

(5-2)對FcγR之結合活性增強之小鼠抗體之製作

使用參考實施例1之方法製作作為具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之小鼠IgG1抗體之重鏈的VH3-mIgG1(序列編號：49)、作為輕鏈之VL3-mk1(序列編號：50)。又，為了使VH3-mIgG1對小鼠FcγR之結合活性增強，製作EU編號表示之327位之Ala取代為Asp之VH3-mIgG1-mF44(序列編號：51)。同樣地，製作VH3-mIgG1之EU編號表示之239位之Ser取代為Asp、327位之Ala取代為Asp之VH3-mIgG1-mF46(序列編號：52)。使用參考實施例1之方法製作含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作為重鏈、含有VL3-mk1作為輕鏈之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46。

(5-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認

以參考實施例1之方法製作含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作為重鏈、含有L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-mIgG1、VH3/L(WT)-mIgG1-mF44或VH3/L(WT)-mIgG1-mF46。以參考實施例2之方法評價該等之抗體對小鼠FcγR之結合活性。結果如表9所示。又，各改變體對小鼠FcγR之結合活性比起施加改變之前之mIgG1增強幾倍，係如表10所示。又，表中，VH3/L(WT)-mIgG1表示記載為mIgG1、VH3/L(WT)-mIgG1-mF44表示記載為mF44、VH3/L(WT)-mIgG1-mF46表示記載為mF46。

【表9】

由具有天然型小鼠IgG1抗體之Fc區之VH3/L(WT)-mIgG1，對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV未顯示結合，僅對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII顯示結合之實施例4之探討結果，啟示對於使抗原濃度下降為重要的小鼠FcγR為小鼠FcγRII及或小鼠FcγRIII。又，導入了據認為會增強VH3/L(WT)-mIgG1對FcγR之結合活性之改變的VH3/L(WT)-mIgG-mF44及VH3/L(WT)-mIgG1-mF46，對於小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性均顯示有增強。

(5-4)正常小鼠中之血漿中可溶型IL-6受體濃度之減少效果之確認

以下列方式驗證投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之正常小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果。

藉由在正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦 (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投予了抗人類IL-6受體抗體後之可溶型人類IL-6受體之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之抗體，單株抗小鼠CD4抗體係在尾靜脈以20mg/kg單次投予。之後，將填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦埋入小鼠背部皮下。於埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1mg/kg對尾靜脈單次投予。抗人類IL-6受體抗體投予後經過15分鐘、7時間、1日、2日、4日、7日、14日(或15日)、21日(或22日)後從該小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以15,000rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。已分離之血漿直到實施測定為止保存於設定在-20℃以下之冷凍庫。

血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖11所示。

令人類意外地，投予了已導入mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性增強之改變的mF44及mF46的小鼠，比起投予了mIgG1之小鼠，均確認血漿中IL-6受體濃度之顯著下降。尤其，即使mF44之投予後第21日，mF44投予群之血漿中IL-6受體濃度比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度下降約6倍，相較於mIgG1投予群下降約10倍。另一方面mF46之投予後第7日，mF46投予群之血漿中IL-6受體濃度比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約30倍、比起mIgG1投予群顯著下降約50倍。

由以上顯示：與具有人類IgG1抗體之Fc區之抗原結合分子對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗體同樣，投予了具有小鼠IgG1抗體之Fc區之抗原結合分子對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗體的小鼠中，亦顯示血漿中可溶型IL-6受體之消失加速。雖不受特定理論拘束，在此觀察到的現象也可依如下方式說明。

若將以pH依存性地結合於可溶型抗原且對FcγR之結合活性增強之抗體對小鼠投予，會積極地被攝入主要在細胞膜上表現FcγR之細胞。被攝入之抗體在內體內之酸性pH之條件下將可溶型抗原解離後，會經由FcRn之媒介於血漿中再循環。所以，由如此之抗體帶來之使血漿中之可溶型抗原消失之效果之一要素，可列舉該抗體對FcγR之結合活性之強度。亦即，對FcγR之結合活性愈強，能更積極地被攝入FcγR表現細胞，據認為能加快血漿中之可溶型抗原消失。又，如此之效果在抗體所含之Fc區係來自人類IgG1、來自小鼠IgG1的情形，只要對FcγR之結合活性有增強，據認為均同樣可驗證。亦即，人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、大鼠IgG、猴IgG、兔IgG等任一動物種之Fc區，只要被投予之動物種對FcγR之結合活性有增強，據認為均能使用在驗證。

[實施例6]由於FcγRIIb選擇的結合有增強之抗體所得之抗原消失效果

(6-1)對FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之抗原消失效果

FcγRIII缺損小鼠(B6.129P2-FcgrFcγR3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories)是表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIV，但不表現小鼠FcγRIII之小鼠。另一方面，Fc受體γ鏈缺損小鼠(Fcerlg mouse,Taconic,Cell(1994)76,519-529)為僅表現小鼠FcγRIIb，且不表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV之小鼠。

實施例5中，相對於天然型小鼠IgG1，對FcγR之結合活性增強的mF44及mF46對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII顯示選擇的結合增強。利用該選擇的增強的抗體之結合活性，對於不表現小鼠FcγRIII之小鼠FcγRIII缺損小鼠或Fc受體γ鏈缺損小鼠投予mF44及mF46，據認為可模擬投予對小鼠FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體之狀況。

(6-2)使用FcγRIII缺損小鼠之投予了對小鼠FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗原消失效果之驗證

投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46之FcγRIII缺損小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣地驗證。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖12所示。

令人類意外地，投予了模擬mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之狀況之mF44及mF46之FcγRIII缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度，確認均比起投予了mIgG1之小鼠血漿中IL-6受體濃度有顯著下降。尤其，mF44之投予群之血漿中IL-6受體濃度比起mIgG1投予群之此濃度下降約3倍，抑制了由於抗體投予引起的抗原濃度之累積。另一方面，mF46之投予群之血漿中IL-6受體濃度在投予後第3日，比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約6倍，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約25倍。從該結果顯示：以pH依存性地結合於抗原之抗人類IL-6受體抗體對小鼠FcγRIIb之結合活性愈高，在投予其時之小鼠血漿中IL-6受體濃度會愈下降。

(6-3)使用Fc受體γ鏈缺損小鼠之投予了對小鼠FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗原消失效果之驗證

投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之Fc受體γ鏈缺損小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣地驗證。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖13所示。

與對FcγRIII缺損小鼠投予mF44及mF46時同樣，投予了模擬相對於mIgG1(天然型小鼠IgG1)僅對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之狀況之mF44及mF46之Fc受體γ鏈缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度，均比起投予了mIgG1之Fc受體γ鏈缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度確認有顯著下降。尤其mF44之投予群之血漿中IL-6受體濃度，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度下降約3倍，由於抗體投予引起之抗原濃度之累積受抑制。另一方面，mF46之投予群之血漿中IL-6受體濃度投予後第3日，比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約5倍，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約15倍。

從實施例(6-2)及(6-3)之結果，顯示：投予了以pH依存性地結合於可溶型抗原、對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之群之血漿中之可溶型抗原濃度可大幅下降。

[實施例7]由於對FcγRIII之結合有選擇的增強之抗體所獲得之抗原消失效果

(7-1)對FcγRIII之結合活性有選擇的增強之抗體之抗原消失效果

FcγRIIb缺損小鼠(FcgrFcγR2b(FcγRII)mouse,Taconic)(Nature(1996)379(6563),346-349)，係表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV但不表現小鼠FcγRIIb之小鼠。實施例5中，使天然型小鼠IgG1對FcγR之結合活性增強之mF44及mF46，顯示對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之選擇性結合有增強。利用該選擇性增強之抗體之結合活性，對於不表現小鼠FcγRIIb之小鼠FcγRIIb缺損小鼠投予mF44及mF46，據認為可模擬投予對小鼠FcγRIII之結合有選擇的增強之抗體之狀況。

實施例6中，模擬投予了對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之狀況的FcγRIII缺損小鼠血漿中之可溶型抗原濃度顯示下降。另一方面，模擬投予了對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇性增強之抗體的狀況的FcγRIIb缺損小鼠血漿中之可溶型抗原濃度是否下降，係利用以下試驗確認。

(7-2)使用FcγRIIb缺損小鼠之由小鼠FcγRIII選擇性的結合增強所獲得之抗原消失效果之驗證

對於FcγRIIb缺損小鼠投予作為抗人類IL-6受體抗體之 Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之FcγRIIb缺損小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣驗證。血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖14所示。

令人類意外地，模擬mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIII之結合活性選擇性增強之mF44及mF46之投予群中，血漿中IL-6受體濃度下降，但未確認有實施例6所示程度的下降。

雖不受特定理論拘束，從實施例5、6及7之結果也可以下列方式推察。投予了mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇的增強之mF44及mF46之表現小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII兩者之正常小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失，確認顯著加速。又，對於表現小鼠FcγRIIb但不表現小鼠FcγRIII之小鼠(FcγRIII缺損小鼠、及Fc受體γ鏈缺損小鼠)投予mF44及mF46之情形，也確認該小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失顯著加速。另一方面，對於表現小鼠FcγRIII但不表現小鼠FcγRIIb之小鼠(FcγRII缺損小鼠)投予mF44及mF46的情形，該小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失未顯著加速。

由以上可認為：mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇的增強之抗體mF44及mF46，主要藉由小鼠FcγRIIb之媒介攝入表現FcγR之細胞內，而造成結合於該抗體之血漿中之可溶型抗原消失。另一方面，經由FcγRIII媒介之抗體抗原複合體攝入FcγR表現細胞，據認為並未對於血漿中之可溶型抗原之消失有大助益。

又，如實施例4所示，特別是投予了對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性提高之Fv4-IgG1-F1087之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度顯著下降，另一方面，特別是投予了對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性提高之Fv4-IgG1-F1182之小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，比起Fv4-IgG1-F1087之此效果較小。

又，在實施例2中投予了由於具有低岩藻糖型糖鏈而使對小鼠FcγRIV之結合活性大幅增強之(Science(2005)310(5753)1510-1512)Fv4-IgG1-Fuc之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度，比起投予了Fv4-IgG1之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度雖下降，但其下降之效果為約2倍之小。所以，據認為經由小鼠FcγRIV之媒介之抗體攝入FcγR表現細胞，對於血漿中之可溶型抗原之消失未有大助益。

由該等結果發現：在小鼠中，抗體攝入FcγR表現細胞，在多數的小鼠FcγR之中，小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII，尤其小鼠FcγRIIb係發揮主要的作用。所以，雖不特別限定，但作為導入於小鼠FcγR結合分域之變異，可認為以增強對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII之結合，尤其增強對小鼠FcγRIIb之結合之變異較佳。

由本探討顯示：為了藉由投予以pH依存性地結合於可溶型抗原且對FcγR之結合活性增強之抗原結合分子使被投予之活體之血漿中之可溶型抗原之消失加快，在小鼠宜增強被投予之抗體對小鼠FcγRIIb之結合活性。亦即，當將以pH依存性地結合於可溶型抗原且對小鼠FcγRIIb之結合活性增強之抗原結合分子對活體內投予之情形，可加快血漿中之可溶型抗原之消失，並有效下降血漿中之可溶型抗原濃度，明顯有極有效的作用。

[實施例8]含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變的Fc區之抗體之血小板凝集能力之評價

(8-1)製作含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體

如實施例7所記載，藉由將對FcγRIIb之選擇性結合活性增強之抗體對活體投予，能從該活體之血漿中使抗原有效率的消失。又，投予含有對FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之Fc區之抗體，從對於被投予抗體之活體的安全性、副作用的觀點亦為理想。

但，mF44、mF46，對於小鼠FcγRIIb與小鼠FcγRIII兩者的結合增強，對小鼠FcγRIIb之選擇性結合未增強。此可認為原因在於小鼠FcγRIIb與小鼠FcγRIII之同源性(homology)高，故不易找到能識別兩者且增強對小鼠FcγRIIb之選擇性的結合的改變。又，至今為止尚無人類報告對小鼠FcγRIIb之選擇性的結合增強之Fc區。同樣，已知人類FcγRIIb與人類FcγRIIa(131Arg及131His之兩副型)之同源性亦高。又，至今為止也尚無人類報告能識別兩者且包含對人類FcγRIIb之選擇性的結合增強之改變之Fc區(Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)、Greenwood等人(Eur.J.Immunol.(1993)23(5), 1098-1104))。又，至今為止已有人類報告對FcγRIIa之結合係對由抗體所得血小板之凝集活性發揮重要作用(Meyer等人(J.Thromb.Haemost.(2009),7(1),171-181)、Robles-Carrillo等人(J.Immunol.(2010),185(3),1577-1583))。由該等之報告，被投予對FcγRIIa之結合增強之抗體的活體發生血栓症的風險有可能提高。而抗體對FcγRIIa之結合有增強之抗體之血小板凝集活性是否有增強，係依下列方式驗證。

(8-2)含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對人類FcγR之結合活性之評價

含有施加了對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對人類FcγRIa、FcγRIIa之R型及H型、FcγRIIb、FcγRIIIa之親和性，依下列方式解析。製作包含作為抗體H鏈可變區之揭示於WO2009/125825之對抗人類介白素6受體之抗體之可變區IL6R-H(序列編號：53)、作為抗體H鏈不變區之人類IgG1之C末端之Gly及Lys經除去之有G1d之IL6R-G1d(序列編號：54)的H鏈。其次製作IL6R-G1d之Fc區利用Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)記載之改變即EU編號267位表示之Ser取代為Glu、EU編號328位表示之Leu取代為Phe之改變的IL6R-G1d-v3(序列編號：55)。抗體L鏈共通使用對抗人類介白素6受體之抗體之L鏈IL6R-L(序列編號：56)，將各H鏈同時依參考實施例1之方法表現而得之抗體精製。含有IL6R-G1d、IL6R-G1d-v3作為重鏈之抗體，以下各稱為IgG1、IgG1-v3。

其次將該等之抗體與FcγR之交互作用使用 Biacore T100(GE Healthcare)進行動力理論解析。運行緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，於25℃的溫度測定該交互作用。使用以胺偶聯法將Protein A固定於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)之晶片。使捕捉於該晶片之目的抗體、以及經運行緩衝液稀釋之各FcγR交互作用，測定各FcγR對抗體之結合。測定後於10 mM glycine-HCl、pH1.5與晶片反應，將捕捉於晶片之抗體洗滌，並將經再生之晶片重複使用。測定結果獲得之感測圖利用Biacore Evaluation軟體以1：1 Langmuir binding model解析，從算出之結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)之值計算解離常數KD(mol/L)。IgG1、IgG1-v3對各FcγR之KD值如表11所示(各抗體對各FcγR之KD值)，IgG1對各FcγR之KD值除以IgG1-v3對各FcγR之KD值而得之IgG1-v3之相對KD值如表12所示。

由此結果可確認：包含IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之改變之Fc區(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)之抗體，比起含IgG1之Fc區之抗體，對FcγRIIb之親和性有408倍增強，且對FcγRIIa H型之親和性減弱為0.51倍，但對FcγRIIa之R型的親和性增強522倍。

(8-3)血小板凝集能力之評價

其次使用從FcγRIIa之H型、R型之提供者而來之血小板驗證：由於含有IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之Fc區之抗體對FcγRIIa之親和性之強弱，是否血小板凝集能力有所變化。使用參考實施例1之方法製作含有結合於IgE之hIgG1抗體(人類IgG1不變區)之重鏈可變區及G1d重鏈不變區之重鏈omalizumab_VH-G1d(序列編號：57)、作為輕鏈之omalizumab_VL-CK(序列編號：58)之抗體。又，製作omalizumab_VH-G1d之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之omalizumab_VH-G1d-v3(序列編號：59)。使用參考實施例1之方法，製作包含omalizumab_VH-G1d-v3作為重鏈、包含omalizumab_VL-CK作為輕鏈之omalizumab-G1d-v3。評價該抗體之血小板凝集能力。

血小板凝集係使用血小板凝集能力測定裝置HEMATRACER712(LMS(股)公司)測定。首先，將於含有0.5mL之3.8%檸檬酸鈉之4.5mL真空採血管逐一採取一定分量之約50mL之全血以200g進行15分鐘離心分離，將回收之上清當作Platelet Rich Plasma(PRP)。使用緩衝液A(137mM NaCl、 2.7mM KCl、12mM NaHCO3、0.42mM NaH₂ PO₄ 、2mM MgCl₂ 、5mM HEPES、5.55mM dextrose、1.5U/mL apyrase、0.35% BSA)洗滌過的PRP再替換為緩衝液B(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO₃ 、0.42mM NaH₂ PO₄ 、2mM MgCl₂ 、5mM HEPES、5.55mM dextrose、2mM CaCl₂ 、0.35% BSA)。其結果製備密度約300,000/μL之洗淨血小板。在設置於血小板凝集能力測定裝置、含攪拌棒之測定用比色管中分注156μL之洗淨血小板。在該裝置內維持在37.0℃之比色管內，將血小板利用攪拌棒以1000rpm攪拌。於其中加入製備為最終濃度各成為600μg/mL及686μg/mL之莫耳比1：1之omalizumab-G1d-v3與IgE之免疫複合體44μL，使血小板與該免疫複合體反應5分鐘。再將不會起二次凝集之濃度之腺苷二磷酸(ADP、SIGMA)加到反應液，確認是否凝集增強。

該試驗法獲得之FcγRIIa之各基因多型(H/H或R/H)之提供者之血小板凝集之結果，各如圖15及16所示。從圖15之結果，觀察到：在對於有FcγRIIa之多型(R/H)之提供者之血小板添加了免疫複合體之情形，有血小板凝集。另一方面，如圖16所示，對有FcγRIIa多型(H/H)之提供者之血小板添加免疫複合體的情形，未觀察到血小板凝集。

其次使用活化標記評價血小板之活化。血小板之活化，可利用CD62p(p-selectin)或活性型細胞黏合素此類活化標記在血小板膜表面之表現增加以測定。於依前述方法製備之洗淨血小板7.7μL之洗淨血小板添加免疫複合體2.3μL，於室溫反應5分鐘後，再添加ADP使最終濃度成為30μM，誘發活化，並確認是否由於免疫複合體增強ADP所致之活化。陰性對照係將免疫複合體替換為添加磷酸緩衝液(pH7.4)(Gibco)之樣本。對反應後之各樣本加入PE標記抗CD62抗體(BECTON DICKINSON)、PerCP標記抗CD61抗體、FITC標記PAC-1抗體(BD bioscience)以染色。各染色之螢光強度使用流式細胞計數器(FACS CantoII、BD bioscience)測定。

該試驗法獲得之CD62p表現之結果如圖17所示，活化細胞黏合素表現之結果如圖18所示。作為洗淨血小板，使用FcγRIIa之多型為R/H之一名健常人類獲得之洗淨血小板。利用ADP刺激在血小板膜表面誘導表現之CD62p及活性型細胞黏合素之表現量，在免疫複合體存在下均增加。

從該等結果可知：含有已施加IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體，比起表現FcγRIIa之基因多型當中131號之胺基酸為H之FcγRIIa之血小板，會較促進表現131號之胺基酸為R之FcγRIIa之血小板之凝集。亦即將含有已施加既有的對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對於在其中之一的對偶基因有FcγRIIa R型的人類投予的情形，啟示有由於血小板凝集所致血栓症發病的風險提高之危險性。含有對FcγRIIb更選擇性的結合增強之Fc區之本發明的抗原結合分子，不僅抗原之血漿中滯留性改善，且顯示克服上述問題之可能性，本發明之抗原結合分子之有用性係為明白。

[實施例9]除了導入P238D改變尚導入鉸鏈部分之改變的改變體對FcγRIIb之結合之全面解析

若相對於人類天然型IgG1，要使EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之Fc對FcγRIIb之結合更提高，而組合從天然型抗體之解析預測的其他改變，仍無法獲得期待的組合效果。所以嘗試藉由對於EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc導入全面性的改變，找尋對FcγRIIb之結合增強之改變體。製作作為抗體H鏈使用之導入有IL6R-G1d(序列編號：54)之EU編號表示之252位之Met取代為Tyr之改變、EU編號表示之434位之Asn取代為Tyr之改變的IL6R-F11(序列編號：60)。再製作對於IL6R-F11，導入有EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變之IL6R-F652(序列編號：61)。分別製備含有對於L6R-F652，EU編號表示之238位之殘基附近的區(EU編號表示之234位至237位、239位)分別取代為原本的胺基酸及半胱胺酸以外的18種胺基酸而得之抗體H鏈序列之表現質體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。該等之改變體係與參考實施例1以同樣方法表現、精製。該等Fc改變體稱為PD改變體。與參考實施例2依同樣方法，全面性的評價各PD改變體對FcγRIIa R型及FcγRIIb之交互作用。

依以下方法，製作表示與各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各PD改變體對於各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-F652/IL6R-L)對各FcγR之結合量之值再乘以100倍的值代表各PD改變體對各FcγR之相對的結合活性之值。橫軸表示各PD改變體對FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸表示各PD改變體對FcγRIIa R型之相對的結合活性之值(圖19)。

其結果發現：11種改變體對FcγRIIb之結合比起該各改變導入前之抗體有增強，且有維持或增強對FcγRIIa R型之結合之效果。該等之11種改變體對FcγRIIb及FcγRIIa R之結合活性的整理結果如表13所示。又，表中之序列編號表示待評價之改變體之H鏈之序列編號，改變係代表對IL6R-F11(序列編號：60)導入之改變。

對已導入P238D之改變體將前述11種改變進一步組合並導入之改變體之對FcγRIIb之相對的結合活性之值、及對不含P238D之Fc導入了該改變之改變體之對FcγRIIb之相對的結合活性之值，如圖20所示。若將該等11種之改變對P238D改變進一步導入，比起導入前對FcγRIIb之結合量增強。另一方面，將G237F、G237W、及S239D以外的8種改變對於不含 P238D之改變體導入之情形，顯示對FcγRIIb之結合有減少的效果(資料未顯示)。

從該結果，可知：要依據對天然型IgG1導入之改變之效果預測對含有P238D改變之改變體將相同改變組合並導入時之效果係為困難。又，換言之，本次找到的8種改變，係若未進行對於包含P238D改變之改變體將相同改變組合並導入之本探討則不可能找到的改變。

將表13所示改變體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV之KD值，以與參考實施例2同樣方法測定之結果如表14所示。又，表中之改變表示對IL6R-F11(序列編號：60)導入之改變。惟，針對製作IL6R-F11時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各改變體對於FcγRIIaR之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各改變體對於FcγRIIaH之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/改變體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。除此以外，各改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強之KD值，如表14所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-F11(序列編號：60)之改變體。又，表14中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2]KD=C˙R_max /R_eq -RI)-C

如表14所示，任一改變體比起IL6R-F11，對FcγRIIb之親和性均提高，其提高程度為1.9倍至5.0倍。各改變體對於FcγRIIaR之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比、及各改變體對於FcγRIIaH之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對值。亦即，該值係代表各改變體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-F11/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比均為0.7，故表14之任一改變體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之改變體中，該值為0.7至5.0，所以可說：本次獲得之改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為大約同等、或更減少。從該等之結果，可知：本次獲得之改變體比起親多胜肽，對FcγRIIaR型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一改變體比起IL6R-F11，親和性均下降。

[實施例10]含P238D之Fc與FcγRIIb細胞外區域之複合體之X射線結晶構造解析

如前面的實施例9所示，即使對含P238D之Fc導入與FcγRIIb之結合活性提高、或對FcγRIIb之選擇性提高及從天然型IgG1抗體之解析預測之改變，對FcγRIIb之結合活性仍會減弱，其原因據認為係Fc與FcγRIIb之交互作用界面之構造由於導入P238D而改變。而，為了追究該現象之原因，將帶有P238D之變異之IgG1之Fc(以下稱為Fc(P238D))與FcγRIIb細胞外區域之複合體之立體構造利用X射線結晶構造解析明確化，並比對天然型IgG1之Fc(以下稱為Fc(WT))與FcγRIIb細胞外區域之複合體之立體構造，以比較該等之結合樣式。又，關於Fc與FcγR細胞外區域之複合體之立體構造已有多數報告，已有人類解析Fc(WT)/FcγRIIIb細胞外區域複合體(Nature(2000)400,267-273、J.Biol.Chem.(2011)276,16469-16477)、Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108,12669-126674)、及Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體(J.Immunol.(2011)187,3208-3217)之立體構造。至今為止尚無人類解析Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之立體構造，但與Fc(WT)之複合體之立體構造為既知之FcγRIIa與FcγRIIb，在細胞外區域的胺基酸序列有93%一致，有非常高相同性，所以Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之立體構造，係從Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體之結晶構造以模型推定。

針對Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體，利用X射線結晶構造解析以解析能力2.6埃決定立體構造。該解析結果之構造如圖21所示。係在2個Fc CH2分域之間夾有FcγRIIb細胞外區域的方式結合，與至今為止所解析之Fc(WT)與FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa之各細胞外區域之複合體之立體構造類似。其次為了詳細比較，將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶構造以及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型構造，對於FcγRIIb細胞外區域及Fc CH2分域A以Cα原子間距離為準依最小平方法重合(圖22)。此時、Fc CH2分域B彼此之重疊程度並非良好，可知在該部分的立體構造有差異。再使用Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶構造及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型構造，比較抽出的FcγRIIb細胞外區域與Fc CH2分域B之間其距離為3.7埃以下之原子對，以比較FcγRIIb與Fc(WT)CH2分域B之間之原子間交互作用以及FcγRIIb與Fc(P238D)CH2分域B之間之原子間交互作用。如表15所示，Fc(P238D)與Fc(WT)中，Fc CH2分域B與FcγRIIb之間之原子間交互作用不一致。

再將Fc CH2分域A及Fc CH2分域B單獨彼此依照以Cα原子間距離為基準的最小平方法，進行Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶構造與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型構造之重合，來比較P238D附近之詳細構造。了解到為Fc(P238D)之變異導入位置之EU編號表示之238位之胺基酸殘基之位置隨著Fc(WT)改變，從鉸鏈區起接續之238位之胺基酸殘基的附近的環圈構造在Fc (P238D)與Fc(WT)會改變(圖23)。原本在Fc(WT)，EU編號表示之238位之Pro位於Fc之內側，與238位之周圍殘基形成疏水性核。但當EU編號表示之238位之Pro改變為帶電荷之非常親水的Asp之情形，變化的Asp殘基直接存在於疏水性核在脫溶劑和的觀點、能量觀點為不利。而，Fc(P238D)中，為了解除該能量上的不利，EU編號表示之238位之胺基酸殘基會改變為配向於溶劑側之形態，據認為對於238位之胺基酸殘基附近之環圈構造也會帶來變化。且該環圈由於距離以S-S鍵交聯的鉸鏈區不遠，所以該構造變化不限於局部變化，也會影響到Fc CH2分域A與分域B的相對配置，其結果據推測也會造成FcγRIIb與Fc CH2分域B之間之原子間交互作用的差異。所以，據認為即使對已有P238D改變之Fc組合在天然型IgG對FcγRIIb之選擇性、結合活性提高之改變，仍無法獲得預測的效果。

又，由於P238D導入造成構造變化之結果，在Fc CH2分域A中，相鄰於已導入變異之P238D的EU編號表示之237位之Gly之主鏈與FcγRIIb之160位之Tyr之間會產生氫鍵(圖24)。相當於Tyr160之殘基在FcγRIIa為Phe，在與FcγRIIa結合之情形，並未形成該氫鍵。160位之胺基酸，若一併考慮係在與Fc之交互作用界面，FcγRIIa與FcγRIIb之間之少數差異之一，可推測FcγRIIb特有之該氫鍵之有無，會成為Fc(P238D)之對FcγRIIb之結合活性之提高、對FcγRIIa之結合活性之減少、選擇性提高的原因。又，針對Fc CH2分域B，在EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131位之Arg之間可觀察到靜電的交互作用(圖25)。為FcγRIIa之一副型的FcγRIIa H型中，FcγRIIb之131位之Arg所對應之殘基為His，未能形成該靜電交互作用。由此可說明比起FcγRIIa R型，FcγRIIa H型對Fc(P238D)之結合活性減少之理由。從依據如此之X射線結晶構造解析之結果推測，可知：由於P238D導入所致其附近之環圈構造變化及伴隨的分域配置之相對變化，會形成在天然型IgG與FcγR之結合所未見的新的交互作用，可能與P238D改變體對於FcγRIIb之選擇性的結合輪廓相關。

[Fc(P238D)之表現精製]

包含P238D改變之Fc之製備依以下方式進行。首先將hIL6R-IgG1-v1(序列編號：62)之EU編號表示之220位之Cys取代為Ser且EU編號表示之236位之Glu起其C末端利用PCR選殖之基因序列Fc(P238D)，與參考實施例1記載之方法以同樣方法進行之表現載體之製作、表現、精製。又，EU編號表示之220位之Cys在通常之IgG1中，係與L鏈之Cys形成雙硫鍵，但僅製備Fc的情形，未使L鏈共表現，所以為了避免不必要的雙硫鍵形成，將該Cys殘基取代為Ser。

[FcγRIIb細胞外區域之表現精製]

FcγRIIb細胞外區域依參考實施例2之方法製備。

[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之精製]

對於在結晶化使用之獲得之FcγRIIb細胞外區域樣本2mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋白由大腸菌表現精製之Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)0.29mg，以0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件在室溫靜置3日，以將與FcγRIIb細胞外區域之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用5000MWCO之超過濾膜濃縮且經糖鏈切斷處理之FcγRIIb細胞外區域樣本，利用經以20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIb細胞外區域級分，將Fc(P238D)以莫耳比計算時FcγRIIb細胞外區域有若干過量的方式混合。將經10000MWCO之超過濾膜濃縮之前述混合液使用經20mM HEPS pH7.5、0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製，獲得Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之樣本。

[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶化]

使用經10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10mg/ml之前述Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之試樣，利用sitting-drop蒸氣擴散法將該複合體結晶化。結晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，對100mM Bis-Tris pH6.5、17% PEG3350、0.2M Ammonium acetate、及2.7%(w/v)D-Galactose之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.2μl：0.2μl混合，製成結晶化液滴。將密封的該結晶化液滴於20℃靜置，獲得薄板狀之結晶。

[來自Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶之X射線繞射資料之測定]

將獲得之Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之1個單結晶浸於100mM Bis-Tris pH6.5、20% PEG3350、Ammonium acetate、2.7%(w/v)D-Galactose、Ethylene glycol 22.5%(v/v)之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-1A，測定前述結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 270(ADSC)，使結晶每次旋轉0.8°，收集總共225張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.46埃之該結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P21，晶格常數a=48.85埃、b=76.01埃、c=115.09埃、α=90°、β=100.70°、γ=90°。

[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶構造解析]

利用使用程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法，決定Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。從為Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之結晶構造之PDB code：3SGJ之結構座標，取出之A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分當做另一座標，各設定為Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB code：3SGJ之結構座標取出之A鏈341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一個座標，設定為Fc CH3分域之探索用模型。最後，從為FcγRIIb細胞外區域之結晶構造之PDB code 2FCB之結構座標取出之A鏈6-178號之胺基酸殘基，設定為FcγRIIb細胞外區域之探索用模型。依照Fc CH3分域、FcγRIIb細胞外區域、Fc CH2分域之順序，從旋轉函數及並進函數決定各探索用模型於結晶格子內之走向與位置，而獲得Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶構造之初始結構模型。對於該初始結構模型，進行使2個Fc CH2分域、2個Fc CH3分域及FcγRIIb細胞外區域各域移動的剛體精密化，在該時點對於25-3.0埃之繞射強度資料，結晶學的可靠度因子R值為40.4%、Free R值為41.9%。又，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正。藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入模型，進行精密化，使用解析能力為25-2.6埃之24291個繞射強度資料，最終，對於含4846個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為23.7%、Free R值為27.6%。

[Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型構造製作]

依據為Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體之結晶構造之PDB code：3RY6之構造座標，使用程式Disovery Studio 3.1(Accelrys)之Build Mutants機能，以使與FcγRIIb之胺基酸序列一致之方式，對於構造座標中之FcγRIIa導入變異。此時，定Optimization Level為High、Cut Radius為4.5，使產生5個模型，採用其中能量分數最好者，設定為Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型構造。

[實施例11]依據結晶構造決定改變處之Fc改變體對於FcγR之結合之解析

依實施例10獲得之Fc(P238D)與FcγRIIb細胞外區域之複合體之X射線結晶構造解析之結果，構建對於EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc中，預測會影響與FcγRIIb之交互作用之部位(EU編號表示之233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位之殘基)導入全面性改變之改變體，以探討是否可獲得除了P238D改變還有增強FcγRIIb之結合之改變之組合。

製作對IL6R-G1d(序列編號：54)，EU編號表示之439位之Lys取代為Glu之IL6R-B3(序列編號：63)。其次，製作IL6R-B3之EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之IL6R-BF648。抗體L鏈共通使用IL6R-L(序列編號：56)。將依照與參考實施例1為同樣之方法表現之該等之抗體之改變體精製。依參考實施例2之方法，全面性的評價該等抗體改變體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)之結合。

依以下方法，製作表示對各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各改變體對各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-BF648/IL6R-L)對於各FcγR之結合量之值再乘以100倍的值代表各改變體對各FcγR之相對的結合活性之值。橫軸表示各改變體對FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸表示各改變體對FcγRIIa R型之相對的結合活性之值(圖26)。

其結果如圖26所示發現：所有改變中，24種改變體對比起改變導入前之抗體，維持或增強對FcγRIIb之結合。關於該等改變體對FcγR之結合如表16所示。又，表中之改變係代表對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。

表16所示改變體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、 FcγRIIb、FcγRIIIa V型之KD值依參考實施例2之方法測定之結果，整理如表13。表中之改變係代表對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各改變體對於FcγRIIaR之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各改變體對於FcγRIIaH之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/改變體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。除此以外，各改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值，如表17所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-B3(序列編號：63)之改變體。又，表17中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

從表17，任一改變體均比起IL6R-B3對FcγRIIb之親和性提高、其提高的幅度為2.1倍至9.7倍。各改變體對於FcγRIIaR之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比、及各改變體對於FcγRIIaH之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對值。亦即，該值係代表各改變體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-F11/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比各為0.3、0.2，故表17之任一改變體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之改變體中，該值為4.6至34.0，所以可說：本次獲得之改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為減少。從該等之結果，可知：本次獲得之改變體比起親多胜肽，對FcγRIIa R型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一改變體比起IL6R-B3，親和性均下降。

針對獲得之組合改變體之中有前景者從結晶構造推察其效果之要因。圖27顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶構造。其中，位在左側之H鏈為Fc A鏈、位在右側之H鏈為Fc鏈B。在此可知Fc A鏈之EU編號表示之233位之部位，位在FcγRIIb之113位之Lys之附近。惟，本結晶構造中，E233之側鏈其電子密度未能順利觀察，處於運動性相當高的狀態。因此EU編號表示之233位之Glu取代為Asp之改變，由於側鏈短了1個碳的分量造成側鏈之自由度減小，其結果在FcγRIIb之113位與Lys交互作用形成時之熵損失減少，結果據推測有助於結合自由能之提高。

圖28，顯示同樣Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之構造之中，EU編號表示之330位之部位附近之環境。從該圖可知Fc(P238D)之FcA鏈之EU編號表示之330位之部位周邊係由FcγRIIb之85位之Ser、86位之Glu、163位之Lys等構成的親水性的環境。因此推測EU編號表示之330位之Ala取代為Lys、或取代為Arg之改變，有助於強化與FcγRIIb之85位之Ser、86位之Glu之交互作用。

圖29係將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體及Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之結晶構造，以相對於Fc鏈B依Cα原子間距離之最小平方法重合之EU編號表示之271位之Pro之構造。該等二個構造良好地一致，但EU編號表示之271位之Pro之部位，成為相異之立體構造。又，若一併考慮Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶構造中，其周邊之電子密度弱，藉由使Fc(P238D)/FcγRIIb中，EU編號表示之271位為Pro，在構造上會有大負荷，啟示可能因而造成該環圈構造未能取得最適構造。因此EU編號表示之271位之Pro取代為Gly之改變，據推測藉由對該環圈構造賦予柔軟性、減少與FcγRIIb交互作用時採最適構造時之能量障礙，有助於結合增強。

[實施例12]藉由與P238D組合以增強對FcγRIIb之結合之改變之組合效果之驗證

驗證在實施例9及11獲得之改變之中，觀察到有增強對FcγRIIb之結合之效果或維持對FcγRIIb之結合，並抑制對其他FcγR之結合之效果之改變彼此組合獲得之效果。

與實施例11之方法同樣，將從表13及17選出之特別優異的改變對於抗體H鏈IL6R-BF648導入。抗體L鏈使用IL6R-L，依與參考實施例1同樣之方法精製表現的抗體。依照與參考實施例2同樣之方法，全面性的評價對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)之結合。

依以下方法，製作表示與各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各改變體對於各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-BF648/IL6R-L)對各FcγR之結合量之值再乘以100倍的值代表各改變體對各FcγR之相對的結合活性之值(表18)。又，表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。

表18-2係接續表18-1之表。

將表18所示改變體對FcγRIa、FcγRIIaR、 FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV之KD值，以與參考實施例2同樣方法測定之結果整理於表19-1及19-2。又，表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各改變體對於FcγRIIaR之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各改變體對於FcγRIIaH之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/改變體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。除此以外，各改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值，如表19-1及19-2所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-B3(序列編號：63)之改變體。又，表19-1及19-2中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2] KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

從表19-1及19-2，任一改變體比起IL6R-B3，對FcγRIIb之親和性均提高，其提高程度為3.0倍至99.0倍。各改變體對於FcγRIIaR之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比、及各改變體對於FcγRIIaH之KD值/各改變體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對FcγRIIaR及FcγRIIaH 之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對值。亦即，該值係代表各改變體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比各為0.3、0.2，故表19-1及19-2之任一改變體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之改變體中，該值為0.7至29.9，所以可說：本次獲得之改變體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為大約同等、或更減少。從該等之結果，可知：本次獲得之改變體比起親多胜肽，對FcγRIIa R型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一改變體比起IL6R-B3，親和性均下降。

表19-2係接續表19-1之表。

[實施例13]對FcγRIIb之結合有增強之改變體之製作

如實施例8所示，當對FcγRIIb之結合增強時，宜在儘可能限制其他活性型對於FcγR之結合的前提，增強對FcγRIIb之結合較佳。而製作將增強對FcγRIIb之結合、或有選擇性提高效果之改變彼此組合，以及對FcγRIIb之結合增強或選擇性提高之改變體。具體而言，以在對FcγRIIb之結合之增強、選擇性之提高顯示優異效果之P238D之改變作為基礎，與在實施例9、實施例11、實施例12之P238D之改變組合觀察到有效果之改變彼此更進一步組合。

製作組合於IL6R-G1d(序列編號：54)、IL6R-B3(序列編號：63)之Fc區，與在實施例9、實施例11、實施例12之P238D之改變組合認為有效果之改變即E233D、L234Y、G237D、S267Q、H268D、P271G、Y296D、K326D、K326A、A330R、A330K之改變體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)，依參考實施例1之方法，將重鏈含有該等改變體之抗體表現、精製。依參考實施例2之方法評價各改變體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合。

各改變體對各FcγR之KD如表20所示。改變表示對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作各改變體時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L，以*表示。又，表中之「KD(IIaR)/KD(IIb)」，該值愈大表示對FcγRIIb之選擇性愈高。「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)」，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγR IIaR之KD值除以各改變體對於FcγR IIaR之KD值而得之值。又，表20中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2] KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

令對於含有人類天然型IgG1之序列之IL6R-G1d/IL6R-L之H鏈導入了K439E之改變而得之 IL6R-B3/IL6R-L對各FcγR之結合為1之情形，IL6R-G1d/IL6R-L對FcγRIa之結合為1.3倍、對FcγRIIaR之結合為1.1倍、對FcγRIIaH之結合為1.1倍、對FcγRIIb之結合為1.2倍、對FcγRIIIaV之結合為0.9倍，IL6R-G1d/IL6R-L之IL6R-B3/IL6R-L之對於該等全部FcγR之結合為同等。因此，將各改變體對各FcγR之結合與該改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L比較，可認為與將各改變體對各FcγR之結合與含人類天然型IgG1之序列之IL6R-G1d/IL6R-L對各FcγR之結合比較為同等。而在之後的實施例，將各改變體對各FcγR之結合活性，與該改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L對各FcγR之結合活性比較。從表20，比起改變導入前之IL6R-B3，任一改變體對FcγRIIb之結合活性均提高，最低之IL6R-BF648/IL6R-L之結合活性提高2.6倍、最高之IL6R-BP230/IL6R-L之結合活性提高147.6倍。又，代表選擇性之KD(IIaR)/KD(IIb)之數值，最低的IL6R-BP234/IL6R-L為10.0、最高的IL6R-BP231/IL6R-L成為32.2，任一改變體之該數值均比改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之0.3的選擇性提高。又，任一改變體均為對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之此等結合活性低。

[實施例14]對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIb細胞外區域之複合體及與FcγRIIaR細胞外區域之複合體之X射線結晶構造解析

實施例13中，對FcγRIIb之結合最增強之改變體IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起改變導入前之 IL6R-B3/IL6R-L增強約150倍，對FcγRIIaR之結合也壓抑在約1.9倍之增強。因此，摸索製作係IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合、選擇性均優異的改變體，且在儘可能抑制對FcγRIIaR之結合之前提更增強對FcγRIIb之結合之更佳的改變體之可能性。

如實施例10之圖25所示，在含有P238D之改變之Fc區，CH2分域B之EU編號270位表示之Asp與FcγRIIb之131號之Arg之間形成強固的靜電交互作用，但該131號之胺基酸殘基在FcγRIIIa及FcγRIIaH為His，相對於此，在FcγRIIaR與FcγRIIb同樣為Arg。其結果，在FcγRIIaR與FcγRIIb之間，131號之胺基酸殘基與CH2分域B之EU編號270位表示之Asp的交互作用不會有差異。此據認為是Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合不易展現選擇性的要因。

另一方面，FcγRIIa與FcγRIIb細胞外區域之胺基酸序列，其93%為相同，有非常高相同性。若分析天然型IgG1之Fc區(以下Fc(WT))與FcγRIIaR之細胞外區域複合體之結晶構造(J.Imunol.(2011)187,3208-3217)，在兩者之交互作用之界面附近，FcγRIIaR與FcγRIIb之間僅找出3個胺基酸(Gln127、Leu132、Phe160)的差異，可預見改善Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性相當困難。

所以，為了達成Fc區對FcγRIIb之結合活性更增強，及提高Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性，不僅解析對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIb細胞外區域之複合體之立體構造，也一併解析對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIaR細胞外區域之複合體之立體構造，明瞭該Fc區與FcγRIIb之交互作用以及該Fc區與FcγRIIaR之交互作用的微妙差異，係為重要。而，解析成為在最早製作IL6R-BP230/IL6R-L之基礎的改變體且從實施例12製作之IL6R-BP208/IL6R-L之Fc區排除K439E之改變後之Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區域、或FcγRIIaR細胞外區域之複合體之X射線結晶構造。

(14-1)Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區域之複合體之X射線結晶構造解析

[Fc(P208)之表現精製]

Fc(P208)依如以下方式製備。首先製作IL6R-BP208之EU編號表示之439位之Glu取代為天然型人類IgG1之序列Lys之IL6R-P208。然後以編碼為EU編號表示之220位之Cys取代為Ser之改變體的DNA作為模板，選殖EU編號表示之216位之Glu開始其C末端利用PCR選殖之基因序列Fc(P208)。依參考實施例1記載之方法進行表現載體之製作、表現、精製。又，通常之IgG1之EU編號表示之220位之Cys，會與L鏈存在之Cys形成雙硫鍵，但僅製備Fc之情形，為了不共表現L鏈，為了避免不必要的雙硫鍵形成，將該220位之Cys取代為Ser。

[FcγRIIb細胞外區域之表現精製]

FcγRIIb細胞外區域依參考實施例2之方法製備。

[Fc(P208)FcγRIIb細胞外區域複合體之精製]

對於在結晶化使用之獲得之FcγRIIb細胞外區域樣本1.5mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋白由大腸菌表現之精製產物Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)0.15mg，以0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件在室溫靜置3日，以將與FcγRIIb細胞外區域樣本中之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用5000MWCO之超過濾膜濃縮且經前述糖鏈切斷處理之FcγRIIb細胞外區域樣本，利用經以20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIb細胞外區域之精製級分，將Fc(P208)以莫耳比計算時FcγRIIb細胞外區域有若干過量的方式加入，經10000MWCO之超過濾膜濃縮後，使用經20mM HEPS pH7.5、0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。如前述獲得之精製級分作為Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之樣本，供之後的探討使用。

[Fc(P208)/FcγRIIb複合體細胞外區域複合體之結晶化]

將利用10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10mg/ml之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之樣本，利用hanging drop蒸氣擴散法併用Seeding法結晶化。結晶化使用VDXm板(Hampton Research)，對0.1M Bis-Tris pH6.5、19%(w/v)PEG3350、0.2M Potassium Phosphate dibasic之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本=0.85μl：0.85μl混合製成之結晶化液滴，添加從以同樣條件獲得之同複合體之結晶使用Seed Bead(Hampton Research)粉碎之種結晶溶液製成之稀釋溶液0.15μl，密閉於裝有貯池之井，於20℃靜置以獲得板狀結晶。

[從Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶而來之X射線繞射資料之測定]

將獲得之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之1個單結晶浸於0.1M Bis-Tris pH6.5、24%(w/v)PEG3350、0.2M Potassium Phosphate dibasic、20%(v/v)Ethylene glycol之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍之該單結晶而來之X射線繞射資料，係以Spring-8之BL32XU測定。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器MX-225HE(RAYONIX)，使結晶每次旋轉0.6°，收集總共300張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至多2.81埃之該單結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群C2221，晶格常數a=156.69埃、b=260.17埃、c=56.85埃、α=90°、β=90°、γ=90°。

[Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X射線結晶構造解析]

Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之構造利用使用程式Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)之分子取代法決定。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之分子量，預測非對稱單元中之複合體數為一個。從為Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之結晶構造之PDB code：3SGJ之結構座標，取出之A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分當做另一座標，各設定為Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB code：3SGJ之結構座標取出之A鏈341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一個座標，設定為Fc CH3分域之探索用模型。最後，從為FcγRIIb細胞外區域之結晶構造之PDB code 2FCB之結構座標取出之A鏈6-178號之胺基酸殘基，設定為Fc(P208)之探索用模型。欲將Fc CH3分域、FcγRIIb細胞外區域、Fc CH2分域之各探索用模型於結晶格子內之走向與位置，依旋轉函數與並進函數決定，結果未能順利決定CH2分域之一之位置。而從基於其餘三個部分計算的位相計算之電子密度輿圖，參考Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之結晶構造來決定最後之CH2分域A之位置，獲得Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶構造之初始模型。對於該初始模型，進行使2個Fc CH2分域、2個Fc CH3分域及FcγRIIb細胞外區域各域移動的剛體精密化，在已進行了剛體精密化之該時點，使用25-3.0埃之繞射強度資料之構造模型之結晶學的信頼度因子R值為42.6%、Free R值為43.7%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之構造精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。再依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入構造模型，進行精密化，最終使用解析能力為25-2.81埃之27259個繞射強度資料，對於含4786個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為24.5%、Free R值為28.2%。

構造解析之結果，Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之立體構造以解析能力2.81埃決定。其解析之結果，取得之構造如圖30所示。係2個Fc區之CH2分域之間以夾入FcγRIIb之細胞外區域之方式結合，與至今為止所解析之天然型IgG之FcFc(WT)與FcγRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108,12669-126674)、FcγRIIIb(Nature(2000)400,267-273、J.Biol.Chem.(2011)276,16469-16477)、及FcγRIIa(J.Immunol.(2011)187(6),3208-3217)之各細胞外區域之複合體之立體構造與類似。

若觀察細部，Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域之複合體，由於G237D及P238D之改變導入之影響，比起Fc(WT)/FcγRIIaR細胞外區域之複合體，Fc區之CH2分域A之鉸鏈區起接續之EU編號表示之233位至239位之環圈構造已變化(圖31)。其結果，Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp主鏈與FcγRIIb之160號之Tyr側鏈之間認為會形成牢固的氫鍵(圖32)。該160號之胺基酸殘基，在FcγRIIaH及FcγRIIaR均為Phe，不可能形成氫鍵，因此本氫鍵據認為對於獲得Fc(P208)對FcγRIIb之結合活性之提高及對FcγRIIa之結合活性減少這些Fc(P208)對FcγRIIb之結合及對FcγRIIa之結合之選擇性有重要的貢獻。

另一方面，Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp之側鏈本身在與FcγRIIb結合時，未形成特別顯著的交互作用，未觀察到與Fc區內部其他殘基的交互作用。在該EU編號表示之237位之Asp之周圍，Fc區內之EU編號表示之332位之Ile、333位之Glu、334位之Lys位於附近(圖33)。若藉由將該等之部位之胺基酸殘基取代為親水性殘基，與Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp側鏈形成交互作用，能使環圈構造安定化，據認為該Fc區與FcγRIIb之160號之Tyr形成氫鍵，伴隨於此熵的能量損失輕減，結合自由能增加，也就是結合活性可能提高。

將實施例10所示之含P238D之改變之Fc(P238D)與FcγRIIb細胞外區域之複合體之X射線結晶構造、及Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區域之複合體之X射線結晶構造加以比較，Fc(P208)比起Fc(P238D)，多了新的5個變異，多是在側鏈層級的變化。惟，在Fc區之CH2分域B藉由將EU編號表示之271位之Pro改變為Gly，在主鏈層級觀察到位置變化，同時EU編號表示之266-270位之環圈之構造也會起變化(圖34)。如實施例11所示，Fc(P238D)之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成牢固的靜電交互作用時，該EU編號表示之271位之Pro部分啟示可能受有立體化學性的壓力。本次EU編號表示之271位之胺基酸改變為Gly所見到的構造變化，據認為係消除改變前之Pro累積的構造性應變的結果，其消除分量據推測與FcγRIIb之結合自由能之改善，亦即結合活性之提高有關。

再者，確認：起因於該EU編號表示之266-271位之環圈之構造變化，EU編號表示之292位之Arg會以二狀態起構造變化。此時，該EU編號表示之292位之Arg與Fc(P208)之一改變殘基即EU編號表示之268位之Asp所形成之靜電交互作用(圖34)，據認為有助於本環圈構造之安定化。本環圈中之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成之靜電交互作用，對於Fc(P208)與FcγRIIb之結合活性大有貢獻，所以藉由使該環圈構造結合時之構形安定化，能減輕伴隨結合之熵的能量損失，可能與本改變增加結合自由能，亦即結合活性之提高相關。

又，依據本構造解析結果，詳細調查目標為活性更高之改變之可能性，就作為改變導入部位之一候選者，找到EU編號表示之239位之Ser。如圖35所示，該CH2分域B之EU編號表示之239位之Ser位在FcγRIIb之117號之Lys從構造上觀察以最自然形態延伸之方向。但本次解析未觀察FcγRIIb之117號之Lys之電子密度，所以未採一定之構造，現狀也認為該Lys117涉及與Fc(P208)之交互作用係有限定的。該CH2分域B之EU編號表示之239位之Ser改變為有負電荷之Asp或Glu之情形，能期待與帶正電荷之FcγRIIb之117號之Lys之間之靜電交互作用，其結果可期待對FcγRIIb之結合活性提高。

另一方面，若觀察CH2分域A之EU編號表示之239位之Ser之構造，本胺基酸側鏈與EU編號表示之236位之Gly之主鏈形成氫鍵，使從鉸鏈區起接續之包含與FcγRIIb之160號之Tyr之側鏈形成氫鍵之以EU編號表示之237位之Asp之233位至239位之環圈構造安定化(圖32)。該環圈構造結合時之構形安定化係指伴隨結合之熵的能量損失減少，結果使結合自由能之增加，亦即結合活性提高。另一方面，CH2分域A之EU編號表示之239位之Ser改變為Asp或Glu之情形，喪失與EU編號表示之236位之Gly之主鏈間的氫鍵，環圈構造可能不安定化。且可能與鄰近存在之EU編號表示之265位之Asp發生靜電排斥，據認為使環圈構造更不安定化。該不安定化分量之能量，作用於FcγRIIb之結合自由能之減少，結果可能導致結合活性下降。

(14-2)Fc(P208)與FcγRIIaR細胞外區域之複合體之X射線結晶構造解析

[FcγRIIaR細胞外區域之表現精製]

FcγRIIaR細胞外區域，依參考實施例2之方法製備。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之精製]

對於在經精製之FcγRIIa R細胞外區域樣本1.5mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋白由大腸菌表現之Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)精製產物0.15mg、20μl之5U/ml濃度之Endo F2(QA-bio)及20μl之5U/ml濃度之Endo F3(QA-bio)，以0.1M Na Acetate pH4.5之緩衝條件在室溫靜置9日後，追加0.07mg之前述Endo F1、7.5μl之前述Endo F2及7.5μl之前述Endo F3後靜置3日，以將與 FcγRIIa R細胞外區域樣本中之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用10000MWCO之超過濾膜濃縮且經前述糖鏈切斷處理之FcγRIIaR細胞外區域樣本，利用經以25mM HEPES pH7、0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIaR細胞外區域之精製級分，將Fc(P208)以莫耳比計算時FcγRIIaR細胞外區域有若干過量的方式加入，經10000MWCO之超過濾膜濃縮後，使用經25mM HEPES pH7、0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。如前述獲得之精製級分作為Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之樣本，供之後的探討使用。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之結晶化]

使用經10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10mg/ml之前述Fc(P208)/FcγRIIa R型細胞外區域複合體之試樣，利用sitting-drop蒸氣擴散法結晶化。對0.1M Bis-Tris pH7.5、26%(w/v)PEG3350、0.2M Ammonium Sulfae之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.8μl：1.0μl混合，製成結晶化液滴以密封劑密閉並於20℃靜置，獲得板狀之結晶。

[來自Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體結晶之X射線繞射資料之測定]

將前述獲得之Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之1個單結晶浸於0.1M Bis-Tris pH7.5、27.5%(w/v)PEG3350、0.2M Ammonium Sulfate、20%(v/v)Glycerol之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍之來自該單結晶中之X射線繞射資料係使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-1A測定。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態，使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 315r(ADSC)，使該單結晶每次旋轉0.6°，收集總共225張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至多2.87埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群C222₁ ，晶格常數a=154.31埃、b=257.61埃、c=56.19埃、α=90°、β=90°、γ=90°。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之X射線結晶構造解析]

利用使用程式Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)之分子取代法，決定Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。使用實施例(14-1)獲得之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶構造作為探索用模型，從旋轉函數及並進函數決定Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體在結晶格子內之走向及位置。對於該獲得之初始構造模型，進行使2個Fc CH2分域、2個Fc區之CH3分域及 FcγRIIaR細胞外區域獨立移動的剛體精密化，在已結束剛體精密化之該時點，使用25-3.0埃之繞射強度資料之構造模型之結晶學的信頼度因子R值為38.4%、Free R值為30.0%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之構造精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。再依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入構造模型，進行精密化，最終使用解析能力為25-2.87埃之24838個繞射強度資料，對於含4758個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為26.3%、Free R值為38.0%。

構造解析之結果，Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區域複合體之立體構造以解析能力2.87埃決定。將Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之結晶構造，與實施例(14-1)所示Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶構造比較。結果兩Fcγ受體間反映非常高之胺基酸同一性，從全體構造掌握的層級幾乎未見到差異(圖36)。

但若詳細觀察在電子密度層級的構造，可找出可能改善Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性的差異。FcγRIIaR之160號之胺基酸殘基不是Tyr而是Phe，如圖37所示，包含P238D之改變之Fc區與FcγRIIb結合時存在之Fc區CH2分域A之EU編號表示之237位之胺基酸殘基之主鏈與FcγRIIb之160號Tyr之間之氫鍵，據認為在包含 P238D之改變之Fc區與FcγRIIb之結合未形成。該氫鍵不形成據認為係改善導入有P238D之改變之Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性之要因，進一步於電子密度層級比較時，可明確認認該Fc區與FcγRIIb之複合體中以EU編號表示之235位之Leu、及EU編號表示之234位之Leu之側鏈之電子密度，相對於此，在該Fc區與FcγRIIaR之複合體，該等側鏈之電儀密度不明確，以EU編號表示之237位附近之環圈，隨著與在其附近之FcγRIIaR交互作用之下降，而搖動。另一方面，比較該Fc區之CH2分域B之相同區之構造(圖38)時，該Fc區與FcγRIIb之複合體構造中，可確認直到EU編號表示之237位之Asp之電子密度，相對於此，該Fc區與FcγRIIaR之複合體中，比EU編號表示之237位之Asp前面的3個殘基，亦即直到EU編號表示之234位之Leu左右可確認電子密度，比起對FcγRIIb之結合，據認為使用較廣區域形成交互作用。從以上啟示：在該Fc區與FcγRIIb之結合，EU編號表示之234位至238位之區之Fc區之CH2分域A側之貢獻大，在該Fc區與FcγRIIaR之結合，EU編號表示之234位至238位之區之Fc區之CH2分域B側之貢獻大。

[實施例15]依據結晶構造決定改變處之Fc改變體

於在實施例14對FcγRIIb之結合為增強之改變體(P208)之分域B內，伴隨P271G改變之導入所致周圍之構造變化之結果，啟示EU編號表示之268位之Asp與EU編號表示之292位之Arg有靜電交互作用(圖34)。該交互作用形成係作用於EU編號表示之266位至271位之環圈構造之安定化，結果據認為可能有助於對FcγRIIb之結合增強。探討藉由將該改變體之EU編號表示之268位之Asp取代為Glu，是否能使前述靜電交互作用強化、該改變體之環圈構造更安定化，對FcγRIIb之結合增強。又，如圖33所示，FcγRIIb之EU編號表示之160位之Tyr，與P208之分域A之EU編號表示之237位之Asp之主鏈交互作用。另一方面，EU編號表示之237位之Asp之側鏈，位在分子內之EU編號表示之332位之Ile、333位之Glu、334位之Lys之附近，但未有特別突出的交互作用。一併驗證藉由將該等之部位取代為親水性胺基酸殘基，使與EU編號表示之237位之Asp之側鏈之交互作用增強、EU編號表示之266位至271位之環圈構造安定化，是否與FcγRIIb之160號之Tyr之交互作用會增強。

以對於實施例13製作之FcγRIIb顯示優異選擇性之IL6R-BP230/IL6R-L作為模板，製作分別導入從構造資訊找出的H268E、I332T、I332S、I332E、I332K、E333K、E333R、E333S、E333T、K334S、K334T、K334E之改變而得的改變體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。將依參考實施例1之方法表現之含有前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈的抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例2之方法評價。

各改變體對各FcγR之KD如表21所示。又，表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟，針對製作IL6R-BP230時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L，以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。

又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγR IIaR之KD值除以各改變體對FcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表21之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例2記載之式算得之數值。

[式2]KD=C˙R_max /R_eq -RI)-C

對IL6R-BP230/IL6R-L導入有H268E之改變之IL6R-BP264/IL6R-L、導入有E333K之改變之IL6R-BP465/IL6R-L、導入有E333R之改變之IL6R-BP466/IL6R-L、導入有E333T之改變之IL6R-BP470對 FcγRIIb之結合活性、及FcγRIIb之選擇性，比起IL6R-BP230/IL6R-L之這些性質均為提高。又，導入有I332T之改變之IL6R-BP391/IL6R-L之FcγRIIb之選擇性，比起IL6R-BP230/IL6R-L雖下降，但對FcγRIIb之結合活性提高。

[實施例16]對EU編號表示之271位之周邊之胺基酸殘基之改變的全面性導入

在Fc(P208)與FcγRIIb之構造與Fc(P238D)/FcγRIIb之構造之比較中，觀察到最大差異係Fc區之CH2分域B之EU編號表示之271位之附近之構造(圖33)。如實施例11所示，在Fc(P238D)，EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成牢固的靜電交互作用時，啟示對於EU編號表示之271位之Pro部分可能施加立體化學性的壓力。Fc(P208)/FcγRIIb之構造中，藉由將EU編號表示之271位之Pro取代為Gly，會在主鏈層級引起位置變化，使該構造的應變消除，其結果，據認為271位之附近之構造會起大變化。若能使該變化之271位之附近之構造更安定化，據認為伴隨與FcγRIIb之131號之Arg形成靜電交互作用之結合，能更減少熵的能量損失。而藉由將對EU編號表示之271位之周邊之胺基酸殘基之改變全面性的導入，探索顯示Fc區對FcγRIIb之結合之增強或選擇性提高之改變。

作為將改變全面性的導入的模板，製作對IL6R-B3(序列編號：63)導入了E233D、G237D、P238D、H268E、P271G之改變的IL6R-BP267。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。將依參考實施例1之方法表現之包含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例2之方法評價。將IL6R-BP267之EU編號表示之264位、265位、266位、267位、269位、272位之胺基酸，各取代為取代前之胺基酸與Cys以外的18種胺基酸。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。將依參考實施例1之方法表現之含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。依參考實施例2之方法精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV))之結合，依參考實施例2之方法評價。從獲得之改變體之中，比起導入改變前之IL6R-BP267/IL6R-L對FcγRIIb之結合或FcγIIb之選擇性，對FcγRIIb之結合為增強之改變體、或對FcγRIIb之選擇性提高之改變體，如表22所示。

各改變體對各FcγR之KD如表22所示。又，表中之改變係指：對作為模板之IL6R-BP267導入之改變。惟製作IL6R-B3時作為模板使用之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγR IIaR之KD值除以各改變體對FcγR IIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值為愈大，代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表23中以灰色塗滿的小格中之數值，FcγR對IgG之結合為微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

表22所示之改變體對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，均比IL6R-B3/IL6R-L之此等性質維持或減少。又，對IL6R-BP267/IL6R-L各施加S267A、V264I、E269D、S267E、V266F、S267G、V266M之改變之改變體對FcγRIIb之結合活性，比起施加改變前之IL6R-BP267/IL6R-L之此等性質有增強。又，對IL6R-BP267/IL6R-L各施加S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F之改變之改變體之KD(IIaR)/KD(IIb)之值，比起施加改變前之IL6R-BP267/IL6R-L之此等性質為增加，可知S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F之改變顯示對FcγRIIb之選擇性提高之效果。

[實施例17]由於對CH3區導入改變所得之對FcγRIIb之結合增強

據報告EU編號表示之396位之Pro取代為Leu之改變會增強對FcγRIIb之結合(Cancer Res.(2007)67,8882-8890)。EU編號表示之396位之胺基酸係與FcγR之交互作用無直接相關的部位，但藉由使抗體之構造變化，據認為會影響與FcγR之交互作用。而藉由對於Fc區之EU編號表示之396位之胺基酸導入全面性改變，驗證Fc領域對FcγRIIb之結合或選擇性是否提高。

作為將改變全面性的導入的模板，製作對IL6R-B3(序列編號：63)導入有E233D、G237D、P238D、S267A、H268E、P271G、A330R之改變之IL6R-BP423。製作IL6R-BP423之EU編號表示之396位之胺基酸取代為取代前之胺基酸與半胱胺酸以外的18種胺基酸的改變體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。依參考實施例1之方法，將表現之含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例2之方法評價。獲得之改變體對各FcγR之結合如表23所示。

又，表中之「對IL6R-BP423施加之改變」係指對於作為模板之IL6R-BP423導入之改變。惟，製作IL6R-BP423 時當作模板之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγR IIaR之KD值除以各改變體對FcγR IIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值為愈大，代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表23中以灰色塗滿的小格中之數值，FcγR對IgG之結合為微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例2記載之[式2]之式計算得之值。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

從表23之結果，對IL6R-BP423/IL6R-L導入有P396M之改變之IL6R-BP456/IL6R-L、導入有P396L之改變之IL6R-BP455/IL6R-L、導入有P396Y之改變之IL6R-BP464/IL6R-L、導入有P396F之改變之IL6R-BP450/IL6R-L、導入有P396D之改變之IL6R-BP448/IL6R-L、導入有P396Q之改變之IL6R-BP458/IL6R-L、導入有P396I之改變之IL6R-BP453/IL6R-L、導入有P396E之改變之IL6R-BP449/IL6R-L、導入有P396K之改變之IL6R-BP454/IL6R-L、導入有P396R之改變之 IL6R-BP459/IL6R-L對FcγRIIb之結合活性，均比導入改變前之IL6R-BP423/IL6R-L之此性質為提高。又，對IL6R-BP423/IL6R-L導入有P396M之改變之IL6R-BP456/IL6R-L之KD(IIaR)/KD(IIb)之值，比起改變導入前之IL6R-BP423/IL6R-L之此性質大，對FcγRIIb之選擇性提高。表23中製作之改變體，對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，均比親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L之該性質低。

[實施例18]利用次類別序列製作對FcγRIIb之結合為增強之改變體

依人類IgG存在之次類別，對FcγR之結合輪廓相異。驗證IgG1與IgG4對各FcγR之結合活性之差異，能否利用在對FcγRIIb之結合活性之增強、及/或選擇性之提高。首先，解析IgG1與IgG4對各FcγR之結合活性。作為抗體H鏈，製作包含人類IgG4之EU編號表示之228位之Ser取代為Pro、C末端之Gly及Lys經除去之Fc區G4d之IL6R-G4d(序列編號：64)作為抗體H鏈。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。將依參考實施例1之方法表現之含IL6R-L之輕鏈與IL6R-G1d/IL6R-L或IL6R-G4d/IL6R-L之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例2之方法評價。獲得之改變體對各FcγR之結合，整理於表24。

【表24】

IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質，強1.5倍，相對於此IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIIaR之結合，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質，顯示弱2.2倍。又，IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質弱。從以上之結果，可知：IL6R-G4d對FcγRIIb之結合活性、選擇性，都比IL6R-G1d有較好性質。

圖39係顯示G1d與G4d之CH1至C末端為止的序列(EU編號表示之118位至445位)的比較的排列。圖39中之粗框包圍的胺基酸顯示於G1d與G4d相異之胺基酸殘基。該等之相異之胺基酸之中，選擇幾個預測會涉及於FcγR之交互作用的部位，將從對FcγRIIb之結合活性、選擇性之觀點都提供理想性質之G4d之序列中之至少1個以上的胺基酸殘基移植到對FcγRIIb之結合有增強之改變體，驗證是否對FcγRIIb之結合更增強、及/或選擇性更提高。

具體而言製作為IL6R-BP230導入有A327G之改變之IL6R-BP473、導入有A330S之改變之IL6R-BP472、導入有P331S之改變之IL6R-BP471、導入有A330S及P331S之改變之IL6R-BP474、導入有A327G及A330S之改變之IL6R-BP475、導入有A327G、A330S、及P331S之改變之IL6R-BP476、導入有A327G及P331S之改變之IL6R-BP477。又，製作IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr為止之胺基酸取代為EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列之胺基酸的IL6R-BP478。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。依參考實施例1之方法，將含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例2之方法評價。

各改變體對各FcγR之KD如表25所示。又，表中之「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)」，指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。表中之「對IL6R-BP230施加之改變」，表示對IL6R-BP230導入之改變。惟，製作IL6R-BP230時當作模板之IL6R-B3/IL6R-L以*1表示。又，IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr取代為由EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列的IL6R-BP478，以*2表示。「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，指IL6R-B3/IL6R-L對FcγR IIaR之KD值除以該改變體對於FcγR IIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表25之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例2記載之式算得之數值。

[式2] KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

表25記載之改變體之中，導入有A327G之改變之IL6R-BP473/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起IL6R-BP230/IL6R-L之此性質，有1.2倍增強。又，IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr之胺基酸取代為由EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列之胺基酸之IL6R-BP478/IL6R-L對FcγRIIb及對FcγRIIaR之結合，比起IL6R-BP230/IL6R-L之此性質，皆有1.1倍增強。任一改變體對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，都比親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L之此性質低。

至此為止的探討，藉由對於改變體IL6R-BP230/IL6R-L之EU編號表示之327位之胺基酸導入取代人類IgG4之序列中之胺基酸之A327G之改變，顯示對FcγRIIb之結合活性增強。而，針對在IgG4與IgG1之序列為相異之部位且為EU編號表示之327位以外之胺基酸進一步探討。具體而言，製作對抗體H鏈之IL6R-BP230導入有K274Q之IL6R-BP541、導入有Y296F之IL6R-BP542、導入有H268Q之IL6R-BP543、導入有R355Q之IL6R-BP544、導入有D356E之IL6R-BP545、導入有L358M之IL6R-BP546、導入有K409R之IL6R-BP547、導入有Q419E之IL6R-BP548。抗體L鏈共通使用IL6R-L。依參考實施例1之方法，將含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。將經精製之抗體依參考實施例25之方法，對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例2之方法評價。

各改變體對各FcγR之KD如表26所示。又，表中之「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)」，指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值得到之值。表中之「對IL6R-BP230施加之改變」表示對IL6R-BP230導入之改變。惟，製作IL6R-BP230時之模板之IL6R-B3/IL6R-L以*1表示。「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，指IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以該改變體對FcγR IIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表26之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例2記載之式算得之數值。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

如表26所示，對IL6R-BP230/IL6R-L導入有K274Q之IL6R-BP541/IL6R-L、導入有R355Q之 IL6R-BP544/IL6R-L、導入有D356E之IL6R-BP545/IL6R-L、導入有L358M之IL6R-BP546/IL6R-L，比起改變導入前之IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合為增強。又，其中，對IL6R-BP230/IL6R-L導入有R355Q之IL6R-BP544/IL6R-L、導入有D356E之IL6R-BP545/IL6R-L、導入有L358M之IL6R-BP546/IL6R-L，比起改變導入前之IL6R-BP230/IL6R-L，KD(IIaR)/KD(IIb)之值為增加，為針對對FcγRIIb之選擇性也顯示提高之改變。

[實施例19]帶來對FcγRIIb之結合之增強、選擇性之提高之改變之組合之探討

在直到實施例18為止的實施例，係探討在對FcγRIIb之結合之增強或選擇性之提高方面觀察到有效果之改變的進一步組合。具體而言，對IL6R-B3(序列編號：63)導入至今為止之探討中帶來對FcγRIIb之結合之增強、及/或選擇性之提高之改變之組合。又，作為比較對照，製作既存對FcγRIIb之結合增強之改變(Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933))、S267E、及L328F之改變導入於IL6R-B3之IL6R-BP253。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：56)。將依參考實施例1之方法表現之含前述重鏈之改變體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例2之方法評價。

各改變體對各FcγR之KD如表27所示。又，表中之改變係代表對IL6R-B3(序列編號：63)導入之改變。惟製作各改變體時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各改變體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係將IL6R-B3/IL6R-L對FcγR IIaR之KD值除以該改變體對FcγR IIaR之KD而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaR之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大，代表比FcγRIIaR對FcγRIIb之選擇性愈高。又，KD(IIaH)/KD(IIb)係指：各改變體對於FcγRIIaH之KD除以該改變體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表比起FcγRIIaH，對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表27之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例2記載之式算得之數值。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

表27記載之改變體之中，施加增強對FcγRIIb之結合之既有的改變的IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIIb及 FcγRIIaR之結合活性，比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之此性質，各有277倍、及529倍增強。又，IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIa之結合活性也比起IL6R-B3/IL6R-L之此性質增強。另一方面IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIIaH及對FcγRIIIaV之結合，比IL6R-B3/IL6R-L之此性質減弱。其他改變體之中，IL6R-BP436/IL6R-L與IL6R-BP438/IL6R-L對FcγRIa之結合，比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之此性質，稍有增強，但其他改變體對FcγRIa之結合均減弱。又，任一改變體對FcγRIIaH、及對FcγRIIIaV之結合，比起IL6R-B3/IL6R-L之此性質均減弱。

IL6R-BP489/IL6R-L、IL6R-BP487/IL6R-L、IL6R-BP499/IL6R-L、IL6R-BP498/IL6R-L、IL6R-BP503/IL6R-L、IL6R-BP488/IL6R-L、IL6R-BP490/IL6R-L、IL6R-BP445/IL6R-L、IL6R-BP552/IL6R-L、IL6R-BP507/IL6R-L、IL6R-BP536/IL6R-L、IL6R-BP534/IL6R-L、IL6R-491/IL6R-L、IL6R-BP553/IL6R-L、IL6R-BP532/IL6R-L、IL6R-BP506/IL6R-L、IL6R-BP511/IL6R-L、IL6R-BP502/IL6R-L、IL6R-BP531/IL6R-L、IL6R-BP510/IL6R-L、IL6R-BP535/IL6R-L、IL6R-BP497/IL6R-L、IL6R-BP533/IL6R-L、IL6R-BP555/IL6R-L、IL6R-BP554/IL6R-L、IL6R-BP436/IL6R-L、IL6R-BP423/IL6R-L、IL6R-BP440/IL6R-L、IL6R-BP538/IL6R-L、 IL6R-BP429/IL6R-L、IL6R-BP438/IL6R-L、IL6R-BP565/IL6R-L、IL6R-BP540/IL6R-L、IL6R-BP426/IL6R-L、IL6R-BP437/IL6R-L、IL6R-BP439/IL6R-L、IL6R-BP551/IL6R-L、IL6R-BP494/IL6R-L、IL6R-BP537/IL6R-L、IL6R-BP550/IL6R-L、IL6R-BP556/IL6R-L、IL6R-BP539/IL6R-L、IL6R-BP558/IL6R-L、IL6R-BP425/IL6R-L、IL6R-BP495/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起已施以增強對FcγRIIb之結合之既有改變的IL6R-BP253/IL6R-L之此性質為高。該等之中，對FcγRIIb之結合最低的IL6R-BP495/IL6R-L到最高之IL6R-BP489/IL6R-L的增強範圍，當以IL6R-B3/IL6R-L之結合作為1時，為321倍至3100倍。

若比較本探討製作之改變體、既存對FcγRIIb之結合增強之改變體IL6R-BP253/IL6R-L，KD(IIaH)/KD(IIb)之值，在最低之IL6R-BP479/IL6R-L為16.1、最高之IL6R-BP567/IL6R-L為64.4，任一改變體均比IL6R-BP253/IL6R-L之0.2高。又，KD(IIaR)/KD(IIb)之值，在最低之IL6R-BP480/IL6R-L為107.7、最高之IL6R-BP426/IL6R-L為8362，任一改變體均比IL6R-BP253/IL6R-L之107.1高。從該等之結果顯示：表27所示之改變體對於FcγRIIb之選擇性，比起施加了既存對FcγRIIb之結合增強之改變之改變體對於FcγRIIb之選擇性，對FcγRIIb之選擇性均提高。尤其IL6R-BP559/IL6R-L、 IL6R-BP493/IL6R-L、IL6R-BP557/IL6R-L、IL6R-BP492/IL6R-L、IL6R-BP500/IL6R-L對FcγRIIaR之結合，比起IL6R-B3/IL6R-L均維持1.5倍以下，另一方面，對FcγRIIb之結合活性增強100倍以上，故可期待避免藉由增強對FcγRIIaR之結合可能產生之副作用，且同時顯示對FcγRIIb之結合增強之效果。因此，該等之改變體，可說是在對FcγRIIb之結合活性增強之程度、及選擇性的兩個方面，比起習知技術更優異的改變體。

又，雖不拘於特定理論，但比起含Y296D之改變體IL6R-BP567/IL6R-L及IL6R-BP493/IL6R-L，具有高Treg誘導能力的Tregitope序列(De Groot等(Blood(2008)112,3303-3311))係為保守，也有可能被認為帶有高Treg誘導活性之改變體IL6R-BP568/IL6R-L及IL6R-BP492/IL6R-L為更有效的改變體。若針對該等改變體對FcγRIIb之結合活性及選擇性來看，IL6R-BP568/IL6R-L相教於天然型，對FcγRIIaR之結合為1.6倍、對FcγRIIb之結合為211倍，又，IL6R-BP492/IL6R-L對FcγRIIaR之結合為1.2倍、對FcγRIIb之結合為131倍，該等改變體對FcγRIIb有高結合活性及選擇性。

[實施例20]鈣依存性的與人類IgA結合之抗體之製備

(20-1)人類IgA(hIgA)之製備

實施例2至4顯示對於小鼠FcγR結合為增強之以pH依存性地結合於抗原即人類IL-6受體之分子，能使血漿中之抗原濃度大幅下降。其次，為了針對投予了對於人類IL-6受體以外之抗原以pH依存性地結合且對小鼠FcγR之結合有增強之抗體之活體之血漿中之可溶型抗原消失效果是否也能被同樣觀察到加以驗證，重新實施使用人類IgA作為抗原之使用抗體之試驗。抗原人類IgA(以下也稱hIgA)(可變區為抗人類IL6R抗體)使用如以下之重組技術製備。將藉由培養含有含H(WT)-IgA1(序列編號：65)與L(WT)(序列編號：42)之重組載體的寄主細胞而表現的hIgA依該技術領域之人類士公知之方法使用離子交換層析及凝膠過濾層析精製。

(20-2)與hIgA結合之抗體之表現與精製

GA2-IgG1(重鏈序列編號：66、輕鏈序列編號：67)，係與hIgA結合之抗體。將編碼為GA2-IgG1(重鏈序列編號：66、輕鏈序列編號：67)之DNA序列以該技術領域之人類士公知之方法納入動物表現用質體。抗體之表現及精製使用以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)而得之細胞懸浮液，以1.33 x 10⁶ 個/mL之細胞密度對於6井盤的各井各接種3mL。其次將以脂轉染法製備之質體導入細胞。將該細胞於CO₂ 培養箱(37℃、8%CO₂ ,90rpm)培養4日，從單離之培養上清使用rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)以該技術領域之人類士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液之吸光度(波長：280nm)使用分光光度計測定。從獲得之測定值使用依PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。

(20-3)取得之抗體對於hIgA之鈣依存性結合能力評價

使用Biacore T200(GE Healthcare)評價在實施例(20-2)單離之抗體之hIgA結合活性(解離常數KD(M))。運行緩衝液使用含3μM或1.2mM CaCl₂ 之0.05% tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl(pH7.4或pH5.8)，測定該結合活性。於感測晶片CM5(GE Healthcare)上以胺基偶聯法將重組型PROTEIN A/G(Thermo Scientific)適量固定化後，使抗體結合。其次注入當做分析物之適當濃度的hIgA(記載於(A1-1))，使與感應晶片上之抗體交互作用。測定於37℃進行。測定後，注入10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，使感應晶片再生。測定結果使用Biacore T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)，利用曲線適擬之解析及平衡值解析，從測定結果計算解離常數KD(M)。其結果如表28。可知：GA2-IgG1在Ca²⁺ 濃度為1.2 mM之條件下會與hIgA強力結合，但在Ca²⁺ 濃度為3μM之條件下與hIgA顯示弱結合。又，GA2-IgG1在Ca²⁺ 濃度為1.2mM之條件下，於pH7.4與人類IgA強力結合，但在pH5.8與人類IgA為弱結合。亦即GA2-IgG1對人類IgA，以pH依存性、及鈣依存性的結合。

[實施例21]以鈣依存性的結合於hIgA之抗體之改變體之製備

其次，為了使抗原(hIgA)從血漿中之消失更增大，製作對於以鈣依存性的結合於hIgA之GA2-IgG1對於小鼠FcγR之結合增強，GA2-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp之GA2-F1087(重鏈序列編號：68)。使用將編碼為GA2-F1087(重鏈序列編號：67、輕鏈序列編號：68)之DNA序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法納入之動物表現用質體，在精製後測定以上述方法表現之該等之抗體改變體之濃度。含有該改變之抗體，如實施例(4-3)所示，對於小鼠FcγR結合大幅增強。

[實施例22]投予了Ca依存性hIgA結合抗體之正常小鼠中，對抗原之血漿中滯留性之影響之評價

(22-1)使用正常小鼠之體內試驗

對正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)單獨投予hIgA(人類IgA：於實施例(20-1)製作)、或同時投予hIgA及抗hIgA抗體後之hIgA及抗hIgA抗體之體內動態進行評價。將hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA與抗hIgA抗體之混合溶液，對尾靜脈以10mL/kg之用量單次投予。抗hIgA抗體使用上述GA2-IgG1及GA2-F1087。

混合溶液中之hIgA濃度皆為80μg/mL，抗hIgA抗體濃度為2.69mg/mL。此時，相對於hIgA，抗hIgA抗體以以足量過量存在，所以據認為hIgA大部分與抗體結合。在投予GA-IgG1之群中，於投予後5分鐘、7小時、1日、2日、3日、7日從小鼠採血。又，在投予GA-F1087之群中，在投予後5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、1日、3日、7日從小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以12,000 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。經分離之血漿在直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。

(22-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度

小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度以ELISA法測定。首先，將Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)的各井，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgG固相化板。製備血漿中濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.07813μg/mL之抗hIgA抗體之檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到Anti-Human IgG固相化板，將該板於25℃溫育1小時。之後，使Goat Anti-Human IgG(γ chain specific)Biotin(BIOT)Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)分注於該板之各井後，將該板於25℃反應1小時，再將Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注於該板之各井後，將該板於25℃反應1小時，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定各井之反應液於450nm之吸光度。小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中的GA2-IgG1及GA2-F1087之血漿中抗體濃度變動如圖40所示。其結果，確認與hIgA有強pH依存性性結合活性之選殖體GA2-IgG1即使FcγR之結合有增強，其血漿中抗體濃度不大幅下降。

(22-3)利用ELISA法測定血漿中hIgA濃度

小鼠之血漿中hIgA濃度，以ELISA法測定。首先，將Goat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)的各井，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgA固相化板。製備血漿中濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL之hIgA檢量線試樣，作為血漿中濃度之標準液。對該等檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣各100μL添加500ng/mL之hsIL-6R200μL並混合，於室溫靜置1小時。之後分注混合溶液100μL於Anti-Human IgA固相化板，再於室溫靜置1小時。之後，使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)分注於前述板之各井，將該板於室溫反應1小時，再使Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注於前述板之各井，將該平於室溫反應1小時，以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定各井之反應液在450nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中之血漿中hIgA濃度變化如圖41。

結果，相對於hIgA單獨之消失，同時投予hIgA與有100倍以上之Ca依存性結合之GA2-IgG1的小鼠，hIgA之消失比起hIgA單獨時大幅加速。且投予hIgA與對FcγR之結合為增強之GA2-F1087之小鼠血漿中，在投予一日後比起測定範圍(0.006μg/mL以上)，hIgA之濃度下降，比投予GA-IgG1之小鼠血漿中hIgA之消失更大幅地加速。由以上，實施例2至實施例7中，投予IL6R與抗IL6R抗體之小鼠中，對於FcγR之結合有增強之抗體所得之抗原除去效果顯示增強，但在投予抗原為hIgA與抗hIgA抗體之小鼠也顯示同樣效果。從至今為止的實施例獲得之結果，可認為此情形之抗原除去也主要經由FcγRIIb。

[實施例23]pH依存性抗IgE抗體之取得

(23-1)抗人類IgE抗體之取得

為了取得pH依存性抗人類IgE抗體，將抗原人類IgE(重鏈序列編號：69、輕鏈序列編號：70)(可變區由抗人類Glypican3抗體構成)使用FreeStyle293(Life Technologies)表現。將表現的人類IgE依該技術領域中具有通常知識者公知之一般的管柱層析法精製並製備。從取得之多數抗體之中，篩選對於人類IgE以pH依存性地結合之抗體。使用將篩選之抗人類IgE抗體之重鏈及輕鏈之可變區納入有與人類IgG1重鏈不變區、及人類輕鏈不變區融合之抗體基因的載體，精製表現的重組抗人類IgE抗體。製作的抗體命名為選殖體278(以下記載為278-IgG1，重鏈序列編號：71、輕鏈序列編號：72)。

(23-2)抗人類IgE抗體對人類IgE之結合活性及pH依存性結合活性之評價

能於內體內將抗原解離之抗體，也能藉由結合於以不僅能對於抗原以pH依存性地結合也能以Ca依存性的結合的抗原以創製。而，評價278-IgG1及成為對照之不具pH/Ca依存性IgE結合能力人類IgG1抗體Xolair(omalizumab,Novartis)對人類IgE(hIgE)之pH依存性結合能力及pH/Ca依存性結合能力。亦即使用Biacore T200(GE Healthcare)評價278-IgG1及Xolair對hIgE之結合活性(解離常數KD(M))。運行緩衝液使用以下3種，進行測定。

‧1.2mmol/l CaCl₂ /0.05% tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH7.4

‧1.2mmol/l CaCl₂ /0.05% tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH5.8

‧3μmol/l CaCl₂ /0.05% tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH5.8

將對於適量的化學合成的人類Glypican3蛋白質來源序列(序列編號：73)之C末端存在的Lys附加生物素而得之胜肽(以下記載為「生物素化GPC3胜肽」)添加到感測晶片SA(GE Healthcare)上，利用鏈黴親合素與生物素的親和性固定在該感測晶片SA上。注入適當濃度之人類IgE，由生物素化GPC3胜肽捕捉而將人類IgE固定於晶片上。注入作為分析物之適當濃度之278-IgG1，使與感應晶片上之人類IgE交互作用。之後，注入10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，使感應晶片再生。交互作用均於37℃測定。利用使用Biacore T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)之曲線擬合所為之測定結果之解析，計算結合速度常數ka(1/Ms)及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。並且計算在pH5.8,1.2mM Ca條件與pH7.4,1.2mM Ca條件下之各抗體之KD比以評價pH依存性結合，計算於pH5.8,3μM Ca條件與pH7.4,1.2mM Ca條件之下之各抗體之KD比以評價pH/Ca依存性結合。其結果如表29所示。

[實施例24]以pH依存性地人類結合於IgE之抗體之改變體之製備

其次，為了使從血漿中之抗原(人類IgE)之消失更增大，為了使相對於以pH依存性地人類結合於IgE之278-IgG1，對於小鼠FcγR結合增強，將編碼為278-IgG1之EU編號表示之328位之Leu取代為Tyr之278-F1087(重鏈序列編號：74、輕鏈序列編號：72)之DNA序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法納入動物表現用質體。使用導入有該質體之動物細胞，精製後測定以上述方法表現之該等之抗體改變體之濃度。

[實施例25]278-IgG1之體內評價

(25-1)體內評價用之人類IgE(hIgE(Asp6))之製備

由重鏈(序列編號：75)及輕鏈(序列編號：70)構成之體內評價用之人類IgEhIgE(Asp6)(可變區為抗人類Glypican3抗體)依與實施例(23-1)同樣之方法製備。hIgE(Asp6)，係以為了使人類IgE之N型糖鏈之不均勻性不受抗原人類IgE之血漿中濃度變動之影響之方式，將人類IgE之6處N型糖鏈結合部位的天冬醯胺酸改變為天冬胺酸之分子。

(25-2)投予了選殖體278之正常小鼠血漿中之人類IgE之消失加速效果之驗證

於實施例2至4及22，投予了以pH依存性地結合於為抗原之人類IL-6受體及人類IgA並且對於小鼠FcγR之結合有增強之分子之小鼠血漿中之抗原濃度顯示大幅下降。對小鼠FcγR之結合增強之情形，為了進一步驗證投予了人類IL-6受體、及人類IgA以外之對於抗原以pH依存性地結合且對小鼠FcγR之結合有增強之抗體之活體之血漿中之可溶型抗原之消失效果是否也可同樣觀察到，重新實施以人類IgE作為抗原之抗體之試驗。

評價對於C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)單獨投予hIgE(Asp6)、或同時投予hIgE(Asp6)及抗hIgE抗體(278-IgG1與278-F1087)後之hIgE(Asp6)及抗人類IgE抗體之體內動態。將hIgE(Asp6)(20μg/mL)或hIgE(Asp6)及抗人類IgE抗體之混合溶液(濃度如表30記載，任一抗體均製備為成為同濃度)從尾靜脈以10mL/kg單次投予。此時，由於各抗體相對於IgE(Asp6)均以足量過量存在，所以據認為IgE(Asp6)大約全部結合在抗體。於投予了選殖體278(278-IgG1)之群中，在投予後5分鐘、2小時、7小時、1日、2日、4日、5日、7日、 14日、21日從該小鼠採血。在投予了278-F1087之群中，於5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、1日、3日、7日、14日、21日從該小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以15,000進行5分鐘離心分離，獲得血漿。經分離之血漿在直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。

(25-3)正常小鼠血漿中之抗人類IgE抗體濃度之測定

小鼠血漿中之抗hIgE抗體濃度以ELISA法測定。製備血漿中濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL之檢量線試樣。為了使hIgE(Asp6)與抗hIgE抗體之免疫複合體均勻，於檢量線及小鼠血漿測定試樣添加1μg/mLhIgE(Asp6)，將278-hIgG1投予群及對應之檢量線試樣於室溫靜置30分鐘。又，將278-F1087投予群及對應之檢量線試樣於37℃攪拌一晚。將靜置或攪拌後之檢量線及小鼠血漿測定試樣分注到固定了Anti-Human Kappa Light A鏈ntibody(Bethyl Laboratories)之免疫板(Nunc-Immune Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International))，於室溫靜置攪拌2小時(278-F1087投予群之試樣及278-F1087之檢量線試樣)或於4℃靜置一晚(278-hIgG1投予群之試樣及278-hIgG1之檢量線試樣)。之後依序使Rabbit anti-Human IgG(Fc)Secondary antibody,Biotin conjugate(Pierce Biotechnology)及Streptavidin-Poly HRP80(Stereospecific Detection Technologies)反應1小時。將使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質之發色反應以1 N-硫酸(Showa Chemical)停止反應後，將該發色以微板讀取儀測定450nm之吸光度之方法來測定小鼠血漿中濃度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測得之靜脈內投予後之血漿中抗體濃度變動如圖42所示。其結果，投予了對於人類IgE有強pH依存性結合活性之278-IgG1對FcγR之結合為增強之改變體的小鼠中，該小鼠血漿中之抗體濃度比起278-IgG1之該濃度確認未大幅下降。

(25-4)正常小鼠血漿中之hIgE(Asp6)濃度之測定

小鼠血漿中之hIgE(Asp6)濃度以ELISA法測定。製備血漿中濃度為192、96、48、24、12、6、3ng/mL之檢量線試樣。為了使hIgE(Asp6)與抗hIgE抗體之免疫複合體均勻，於檢量線及小鼠血漿測定試樣添加Xolair(Novartis)，使在投予278-hIgG1之群中成為10μg/mL，於室溫靜置30分鐘。使投予278-F1087之群中成為20μg/mL之方式，添加278-F1022(重鏈序列編號：76、輕鏈序列編號：72，與實施例24同樣地製備)或278-F760(重鏈序列編號：77、輕鏈序列編號：72，與實施例A5同樣地製備)，於37℃攪拌60小時。將小鼠血漿測定試樣分注到固定了anti-human IgE之免疫板(MABTECH)或固定了anti-human IgE(clone 107、MABTECH)之免疫板(Nunc F96 MicroWell Plate(Nalge nunc International))，於室溫靜置或攪拌2小時或於4℃靜置一晚。之後依序使human GPC3 core protein(序列編號：78)、經NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)生物素化之抗GPC3抗體(社內製備)、Sterptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)反應1小時。將使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質之發色反應以1 N-硫酸(Showa Chemical)停止反應後，將該發色以微板讀取儀測定450nm之吸光度之方法，或以SuperSignal(r)ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)作為基質進行發光反應，以微板讀取儀測定發光強度之方法來測定小鼠血漿中濃度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度或發光強度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測得之靜脈內投予後之血漿中hIgE(Asp6)濃度變動如圖43所示。

其結果，相對於人類IgE單獨之消失，同時投予了有強pH依存性結合活性之278-IgG1及人類IgE之小鼠中，人類IgE之消失比起人類IgE單獨為加速。且，投予了相對於278-IgG1之FcγR之結合為增強之278-F1087與人類IgE之小鼠中，人類IgE之消失確認比起單獨投予人類IgE及投予278-IgG1與人類IgE之小鼠有大幅加速。亦即不僅至今為止所述之FcγR之結合有增強之抗IL6R抗體或抗IgA抗體，投予了FcγR之結合有增強之抗IgE抗體之小鼠，抗原之消失也顯示加速。從至此為止的實施例獲的結果可認為：此情形之抗原之除去也主要經由FcγRIIb。

[實施例26]投予對FcγRIIb之結合活性高於天然型小鼠IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子使抗原從血漿中消失之效果

(26-1)投予了對FcγRIIb之結合活性已增強之小鼠抗體之使抗原從血漿中消失之效果

實施例5至7中，從投予了具有人類抗體之Fc區且具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之抗原結合分子之正常小鼠群及模擬投予對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇性增強之抗體的FcγRIII缺損小鼠及Fc受體γ鏈缺損小鼠群的探討結果等，確認以pH依存性的與可溶型抗原結合且FcγRIIb之選擇性結合活性有增強之抗原結合分子，當對於活體內投予時，能使血漿中之可溶型抗原有效率的消失。該效果在投予了具有對小鼠FcγRIIb之選擇性結合活性有增強之小鼠Fc區且具有pH依存性的與人類IL-6受體結合之性質之抗原結合分子的正常小鼠是否也會顯示，係依以下所示驗證。

(26-2)對FcγRIIb之結合活性增強之小鼠抗體之製作

使用參考實施例1之方法製作作為具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之小鼠IgG1抗體之重鏈的VH3-mIgG1(序列編號：49)、作為輕鏈之VL3-mk1(序列編號：50)。又，為了使VH3-mIgG1對小鼠FcγRIIb之結合活性增強，製作EU編號表示之EU編號表示之230位之Thr取代為Glu、231位之Val取代為Ala、232位之Pro取代為Asn、238位之 Ser取代為Glu、239位之Ser取代為Asp之VH3-mIgG1-MB367(序列編號：79)。使用參考實施例1之方法製作含有VH3-mIgG1或VH3-mIgG1-MB367作為重鏈、含有VL3-mk1作為輕鏈之Fv4-mIgG1或Fv4-mIgG1-MB367。

(26-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認

以參考實施例1之方法表現、精製含有VH3-mIgG1或VH3-mIgG1-MB367作為重鏈、含有L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-mIgG1或VH3/L(WT)-mIgG1-MB367。以參考實施例2之方法評價該等之抗體對小鼠FcγR之結合活性。結果如表31所示。又，各改變體對小鼠FcγR之結合活性比起施加改變之前之mIgG1增強幾倍，係如表32所示。

由表32的結果，對於VH3/L(WT)-mIgG1導入上述5個改變而得的VH3/L(WT)-mIgG1-MB367，比起導入前，對小鼠FcγRIIb之結合活性有約160倍增強，相對於此，對小鼠FcγRIII之結合活性有6.2倍增強。亦即，VH3/L(WT)-mIgG1-MB367顯示選擇性的且增強的對小鼠FcγRIIb的結合活性。

(26-4)正常小鼠中之血漿中可溶型IL-6受體濃度之減少效果之確認

投予Fv4-mIgG1或Fv4-mIgG1-MB367作為抗人類IL-6受體抗體之正常小鼠中的血漿中可溶型人類IL-6受體之消失效果，依以下方式驗證。

(26-4-1)使用正常小鼠之體內試驗

評價同時對正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)投予可溶型人類IL-6受體及抗人類IL-6受體小鼠抗體後之可溶型人類IL-6受體及抗人類IL-6受體小鼠抗體之體內動態。將可溶型人類IL-6受體與抗人類IL-6受體小鼠抗體之混合溶液對尾靜脈以10mL/kg單次投予。此時，可溶型人類IL-6受體係以50μg/kg、抗人類IL-6受體小鼠抗體係以1mg/kg的用量投予。抗人類IL-6受體小鼠抗體係使用上述Fv4-mIgG1及Fv4-mIgG1-MB367。抗人類IL-6受體小鼠抗體投予後經過5分鐘、7小時、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日後從該小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以15,000rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。已分離之血漿直到實施測定為止保存於設定在-20℃以下之冷凍庫。

(26-4-2)利用ELISA法測定血漿中抗人類IL-6受體小鼠抗體濃度

小鼠血漿中之抗人類IL-6受體小鼠抗體濃度以ELISA法測定。首先，將可溶型人類IL-6受體分注到Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚，製成可溶型人類IL-6受體固相化板。作為血漿中濃度，製備含2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mL之抗人類IL-6受體小鼠抗體的檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣。將該等檢量線試樣及血漿測定試樣100μL對各井分注而得的可溶型人類IL-6受體固相化板於室溫進行2小時攪拌。之後，使Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody(SIGMA)於室溫反應2小時而得之反應液之發色反應，係以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質進行。藉由添加1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)使反應停止，各井之反應液之450nm之吸光度以微平板讀取儀測定。小鼠血漿中之抗體濃度，係從檢量線的吸光度，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。其結果如圖44。

(26-4-3)利用電化學發光法測定血漿中可溶型人類IL-6受體濃度

小鼠之血漿中hsIL-6R濃度以電化學發光法測定。製備作為血漿中濃度之調整為12.5,6.25,3.13,1.56,0.781,0.391,0.195ng/mL之hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣，混合經以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)及tocilizumab溶液(中外製藥)，於37℃反應1晚。之後，分注到使用含0.5%BSA(w/v)之PBS-Tween溶液於5℃阻斷1晚之Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)。再於室溫反應2小時並洗滌後，分注Read Buffer T(×2)(Meso Scale Discovery)，立刻以SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)測定。hSIL-6R濃度係由檢量線的回應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。其結果如圖45。

如圖44所示，已投予對小鼠FcγRIIb之結合活性選擇性增強的Fv4-mIgG1-MB367的群，與已投予Fv4-mIgG1之群顯示同等血漿中抗體濃度變動，另一方面，未觀察到由於對小鼠FcγRIIb之結合活性之增強導致血漿中抗體滯留性降低。另一方面，由圖45所示，已投予對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇性增強之Fv4-mIgG1-MB367的群，比起已投予Fv4-mIgG1之群，血漿中之可溶型IL-6受體濃度顯著降低。

由以上，在正常小鼠也呈現以pH依存的與可溶型抗原結合且對FcγRIIb之選擇性的結合活性有增強之抗原結合分子，當對於活體內投予時，能有效率地使血漿中之可溶型抗原消失。雖不拘於特定理論，但在此觀察到的現象也可說明如以下。

若將以pH依存的與可溶型抗原且對FcγRIIb之結合活性有增強之抗體投予到小鼠，主要會積極被攝入在細胞膜上表現FcγRIIb的細胞中。被攝入的抗體於內體內之酸性pH條件下將可溶型抗原解離後，會經FcRn而再循環到血漿中。所以，帶來使如此之抗體造成血漿中之可溶型抗原消失之效果的一要素，可列舉該抗體對FcγRIIb之結合活性之強度。亦即，可認為對FcγRIIb之結合活性越強，能更積極被攝入FcγRIIb表現細胞，能快速使血漿中之可溶型抗原消失。又，如此的效果，在抗體所含之Fc區之來源為人類之IgG1、小鼠IgG1均為，只要對FcγRIIb之結合活性增強，均可認為能同樣驗證。亦即，人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、大鼠IgG、猴IgG、兔IgG等各種動物種之Fc區，只要對於所投予動物種之FcγRIIb的結合活性增強，據認為均可用來驗證。

[參考實施例1]抗體之表現載體之製作及抗體之表現與精製

使用Assemble PCR等依該技術領域中具有通常知識者公知之方法製作編碼為抗體之可變區之H鏈及L鏈之鹼基序列的全長基因的合成。胺基酸取代之導入係使用PCR等依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行。將獲得之質體片段插入到動物細胞表現載體，製作H鏈表現載體及L鏈表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。將製作的質體對於人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen公司)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen社)過渡性導入，並進行抗體之表現。回收得到的培養上清後，通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)、或0.45μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)，獲得培養上清。從獲得之培養上清使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE healthcare)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE healthcare)，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法精製抗體。精製抗體濃度使用分光光度計測定於280nm之吸光度，使用從獲得之值以PACE等方法計算的吸光係數，計算出抗體濃度(Protein Science(1995)；4,2411-2423)。

[參考實施例2]FcγR之製備方法及改變抗體與FcγR之交互作用解析方法

FcγR之細胞外分域依以下方法製備。首先，以該技術領域中具有通常知識者公知的方法合成FcγR之細胞外分域的基因。此時，各FcγR之序列係依登錄於NCBI的資訊製作。具體而言，針對FcγRI依據NCBI之存取編號NM_000566(版本編號NM_000566.3)之序列製作、針對FcγRIIa依據NCBI之存取編號NM_001136219(版本編號NM_001136219.1)之序列製作、針對FcγRIIb依據NCBI之存取編號NM_004001(版本編號NM_004001.3)之序列製作、針對FcγRIIIa依據NCBI之存取編號NM_001127593(版本編號NM_001127593.1)之序列製作、針對FcγRIIIb依據NCBI之存取編號NM_000570(版本編號NM_000570.3)之序列製作，並於C末端附加His標籤。又，FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb已知存在多型，FcγRIIa之多型部位參考Warmerdam等人(J.Exp.Med.(1990)172,19-25)、FcγRIIIa之多型部位參考Wu等人(J.Clin.Invest.(1997)100(5),1059-1070)、FcγRIIIb之多型部位參考Ory等人(J.Clin.Invest.(1989)84,1688-1691)製作。

將獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體，製作表現載體。將製作之表現載體對於來自人類胎腎癌細胞之 FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)過渡性導入，表現目的蛋白質。又，結晶構造解析用使用之FcγRIIb，係藉由於終濃度10μg/mL之Kifunesine存在下使目的蛋白質表現，而成為對FcγRIIb附加之糖鏈為高甘露聚糖型。將從上述過渡性導入之細胞之培養液獲得之培養上清通過0.22μm濾器而得之製備液，原則依其次4步驟精製。第1步驟為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾精製。惟，當FcγRI精製時，第1步驟係用使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析。經精製之蛋白質於280nm之吸光度使用分光光度計測定，使用從獲得之測定值以PACE等方法計算之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

各改變抗體與上述中製備之Fcγ受體間之交互作用，使用Biacore T100(GEhealthcare)、Biacore T200(GEhealthcare)、Biacore A100、Biacore 4000解析。運行緩衝液中，使用HBS-EP+(GEhealthcare)之測定之溫度設為25℃。使用在Series S Sensor Chip CM5(GEhealthcare)或Series S sensor Chip CM4(GEhealthcare)以胺偶聯法固定有抗原胜肽、ProteinA(Thermo Scientific)、Protein A/G(Thermo Scientific)、Protein L(ACTIGEN或BioVision)之晶片、或使預先生物素化之抗原胜肽與Series S Sensor Chip SA(certified)(GEhealthcare)交互作用並固定該胜肽之晶片。

使該等之感應晶片捕捉目的抗體，使與以運行緩衝液稀釋之Fcγ受體交互作用，測定對抗體之結合量，並將該測定值在抗體間比較。惟，Fcγ受體之結合量依存於捕捉之抗體之量，故比較Fcγ受體之結合量除以各抗體之捕捉量之校正值。又，使10mM glycine-HCl、pH1.5反應，將捕捉到感應晶片之抗體洗滌，將感應晶片再生並反複使用。

又，為了算出各改變抗體對FcγR之KD值的速度論的解析，依以下方法實施。首先，使上述感應晶片捕捉目的抗體，與經過運行緩衝液稀釋的受體交互作用，對於獲得之感應圖，以Biacore Evaluation Software將測定結果以1：1 Langmuir binding model進行全面擬合(global fitting)，計算出結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)，從此值算得解離常數KD(mol/L)。

又，當各改變抗體與FcγR之交互作用微弱，判斷無法正確解析以上述速度論的解析的情形，針對其相互作用，利用Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE記載之以下之1：1結合模型式，計算KD。

於1：1 binding model交互作用之分子在Biacore上之行對能以下式3表達。

[式3]R_eq =C˙R_max /(KD+C)+RI

上(式3)中之各項目之含意如下；Req：對於分析物濃度為不變狀態結合層級(Steady state binding levels)

C：濃度

RI：試樣中之容積折射率貢獻(Bulk refractive index contribution in the sample)

Rmax：分析物之表面結合能力(Analyte binding capacity of the surface)

若將此式變形，KD可如以下式2表達。

[式2]KD=C˙R_max /(R_eq -RI)-C

藉由於此式代入Rmax、RI、C之值，可算出KD。針對RI、C，可從測定結果之感應圖、測定條件求出值。針對Rmax之計算，依照以下方法。針對在此測定次同時評價之比較對象的交互作用充分強的抗體，將以上述1：1 Langmuir binding model進行全面擬合(global fitting)時獲得之Rmax之值，除以成為比較對象之抗體對於感應晶片的捕捉量再乘以欲評價之改變抗體之捕捉量而得的值，作為Rmax。

SEQUENCE LISTING

<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)

<120> 經Fcγ RIIb促進抗原消失之抗原結合分子(An antigen-binding molecule that promotes loss of antigens in the blood plasma through contact with Fc gamma RIIb)

<130> C102Y1PY1P

<150> PCT/JP2012/054624

<151> 2012-02-24

<150> JP 2012-185866

<151> 2012-08-24

<150> PCT/JP2012/075092

<151> 2012-09-28

<160> 81

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 6

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 8

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 9

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 10

<210> 11

<211> 126

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 11

<210> 12

<211> 365

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 12

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 13

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 14

<210> 15

<211> 326

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 15

<210> 16

<211> 377

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 16

<210> 17

<211> 327

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 17

<210> 18

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 18

<210> 19

<211> 374

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 19

<210> 20

<211> 951

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 20

<210> 21

<211> 316

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 21

<210> 22

<211> 876

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 22

<210> 23

<211> 291

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 23

<210> 24

<211> 765

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 24

<210> 25

<211> 254

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 25

<210> 26

<211> 702

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 26

<210> 27

<211> 233

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 27

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 28

<210> 29

<211> 4

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 29

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 30

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 31

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 32

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 33

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 34

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 35

<210> 36

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 36

<210> 37

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 37

<210> 38

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 38

<210> 39

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 39

<210> 40

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 40

<210> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 41

<210> 42

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 42

<210> 43

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 43

<210> 44

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 44

<210> 45

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 45

<210> 46

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 46

<210> 47

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 47

<210> 48

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 48

<210> 49

<211> 443

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 49

<210> 50

<211> 214

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 50

<210> 51

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 51

<210> 52

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 52

<210> 53

<211> 119

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 53

<210> 54

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 54

<210> 55

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 55

<210> 56

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 56

<210> 57

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 57

<210> 58

<211> 218

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 58

<210> 59

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 59

<210> 60

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 60

<210> 61

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 61

<210> 62

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 62

<210> 63

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 63

<210> 64

<211> 444

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 64

<210> 65

<211> 464

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 65

<210> 66

<211> 451

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 66

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 67

<210> 68

<211> 451

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 68

<210> 69

<211> 543

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 69

<210> 70

<211> 219

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 70

<210> 71

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 71

<210> 72

<211> 217

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 72

<210> 73

<211> 32

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 73

<210> 74

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 74

<210> 75

<211> 543

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 75

<210> 76

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 76

<210> 77

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 77

<210> 78

<211> 545

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 78

<210> 79

<211> 433

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 79

<210> 80

<211> 328

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 80

<210> 81

<211> 325

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 81

【序列表】

SEQUENCE LISTING

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> An antigen-binding molecule that promotes loss of antigens in the blood plasma through contact with Fc gamma RIIb

<130> C102Y1PY1P

<150> PCT/JP2012/054624

<151> 2012-02-24

<150> JP 2012-185866

<151> 2012-08-24

<150> PCT/JP2012/075092

<151> 2012-09-28

<160> 81

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 6

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 8

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 9

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 10

<210> 11

<211> 126

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 11

<210> 12

<211> 365

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 12

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 13

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 14

<210> 15

<211> 326

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 15

<210> 16

<211> 377

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 16

<210> 17

<211> 327

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 17

<210> 18

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 18

<210> 19

<211> 374

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 19

<210> 20

<211> 951

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 20

<210> 21

<211> 316

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 21

<210> 22

<211> 876

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 22

<210> 23

<211> 291

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 23

<210> 24

<211> 765

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 24

<210> 25

<211> 254

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 25

<210> 26

<211> 702

<212> DNA

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 26

<210> 27

<211> 233

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 27

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 28

<210> 29

<211> 4

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 29

<210> 30

<211> 5

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 30

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 31

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 32

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 33

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 34

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 35

<210> 36

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 36

<210> 37

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 37

<210> 38

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 38

<210> 39

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 39

<210> 40

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 40

<210> 41

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 41

<210> 42

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 42

<210> 43

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 43

<210> 44

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 44

<210> 45

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 45

<210> 46

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 46

<210> 47

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 47

<210> 48

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 48

<210> 49

<211> 443

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 49

<210> 50

<211> 214

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 50

<210> 51

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 51

<210> 52

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 52

<210> 53

<211> 119

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 53

<210> 54

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 54

<210> 55

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 55

<210> 56

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 56

<210> 57

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 57

<210> 58

<211> 218

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 58

<210> 59

<211> 449

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 59

<210> 60

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 60

<210> 61

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 61

<210> 62

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 62

<210> 63

<211> 447

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 63

<210> 64

<211> 444

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 64

<210> 65

<211> 464

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 65

<210> 66

<211> 451

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 66

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 67

<210> 68

<211> 451

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 68

<210> 69

<211> 543

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 69

<210> 70

<211> 219

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 70

<210> 71

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 71

<210> 72

<211> 217

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 72

<210> 73

<211> 32

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 73

<210> 74

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 74

<210> 75

<211> 543

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 75

<210> 76

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 76

<210> 77

<211> 443

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 77

<210> 78

<211> 545

<212> PRT

<213> 人類(Homo sapiens)

<400> 78

<210> 79

<211> 433

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 79

<210> 80

<211> 328

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 80

<210> 81

<211> 325

<212> PRT

<213> 人類造序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人類工合成的序列(An artificially synthesized sequence)

<400> 81

Claims

一種抗原結合分子之使用，使該抗原結合分子對應之抗原從血漿中消失，其中該抗原結合分子包含：對該抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及具有EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。
如申請專利範圍第1項之抗原結合分子之使用，其中，該Fc區為更有選自於EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。
如申請專利範圍第2項之抗原結合分子之使用，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln、 274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu中之任一者以上之Fc區。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分域係對於該抗原之結合活性依鈣離子濃度之條件變化之抗原結合分域。
如申請專利範圍第4項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分域，係結合活性變化使得對該抗原於低鈣離子濃度之條件下之結合活性比起對該抗原於高鈣離子濃度之條件下的結合活性低的抗原結合分域。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分域係對該抗原之結合活性依pH之條件變化之抗原結合分域。
如申請專利範圍第6項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分域係結合活性變化使得對該抗原於pH酸性域條件下之結合活性低於在pH中性域條件下之結合活性的抗原結合分域。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分域係抗體之可變區。
如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該Fc區係序列編號：14、15、16或17中之任一者包含之Fc區中，EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。
如申請專利範圍第1至8項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該Fc區係於pH酸性域條件下對FcRn之結合活性，比序列編號：14、15、16或17中之任一者所含之Fc區對FcRn之結合活性更增強之Fc區。
如申請專利範圍第10項之抗原結合分子之使用，其中，該增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17中之任一者所含之Fc區之胺基酸序列當中，選自EU編號表示之244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339 位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。
如申請專利範圍第11之抗原結合分子之使用，其中，該增強之Fc區，係序列編號：14、15、16、或17所含之Fc區之胺基酸序列當中，選自於EU編號表示之：244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或251位之胺基酸為Arg、Asp、Glu、或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro、或Thr中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、 270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、Gln、或Met中之任一者、308位之胺基酸為Ile、Pro、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val、或Trp中之任一者、312位之胺基酸為Ala、Asp、或Pro中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、 341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、Asn、或Val中之任一者、380位之胺基酸為Ala、Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、 431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、中之至少一個以上之胺基酸。
如申請專利範圍第1至12項中任一項之抗原結合分子之使用，其中，該抗原結合分子為抗體。
一種醫藥組合物，其係包含抗原結合分子，該抗原結合分子包含：對抗原之結合活性依離子濃度之條件變化之抗原結合分域、及EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區。
如申請專利範圍第14項之醫藥組合物，其中，該Fc區為更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。
如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、327位之胺基酸為Gly、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、 396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。
一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)至(e)之步驟；(a)獲得對抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之抗原結合分域、(b)獲得編碼為該步驟(a)選擇之抗原結合分域的基因、(c)將該步驟(b)獲得之基因、與編碼為EU編號表示之28位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區的基因以可作用地連結、(d)培養包含於該步驟(c)以可作用地連結之基因的寄主細胞、(e)從該步驟(d)獲得之培養液將抗原結合分子單離。
如申請專利範圍第17項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區係更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。
如申請專利範圍第18項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、 234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、 419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。
一種包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，包含以下(a)至(e)之步驟；(a)獲得對抗原之結合活性依離子濃度之條件而變化之抗原結合分域、(b)獲得編碼為該步驟(a)選擇之抗原結合分域的基因、(c)將該步驟(b)獲得之基因、與編碼為EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及271位之胺基酸為Gly之Fc區的基因以可作用地連結、(d)培養包含於該步驟(c)以可作用地連結之基因的寄主細胞、(e)從該步驟(d)獲得之培養液將抗原結合分子單離。
如申請專利範圍第20項之包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，其中，該Fc區係更有選自EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、274位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、355位、356位、358位、396位、409位、及419位之群組中之至少一個以上之胺基酸經取代之Fc區。
如申請專利範圍第21項之包含抗原結合分子之醫藥組合物之製造方法，其中，該Fc區係EU編號表示之；233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、 237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro、或Gln中之任一者、274位之胺基酸為Gln、296位之胺基酸為Asp、或Phe中之任一者、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、355位之胺基酸為Gln、356位之胺基酸為Glu、358位之胺基酸為Met、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、409位之胺基酸為Arg、419位之胺基酸為Glu、中之任一者以上之Fc區。