TW201321513A

TW201321513A - 用於體外大量擴增毛囊幹細胞的培養方法

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Publication number: TW201321513A
Application number: TW100143433A
Authority: TW
Inventors: Jin-Yu Liu; Yu-Lin Li
Original assignee: Univ Jilin
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2013-06-01

Abstract

一種用於體外大量擴增毛囊幹細胞的培養方法，屬細胞培養技術領域。本發明有關一種以微球作為細胞培養的載體、旋轉瓶作為細胞增殖的發酵罐，進行體外大量擴增毛囊幹細的方法。該方法操作簡單，經濟實用，避免反復繼代細胞而導致的細胞增殖能力減弱、分化潛能降低等與傳統擴增細胞方法相關的副作用，同時可節省培養液用量。利用該方法擴增之毛囊幹細胞仍保持原來的增殖能力和分化潛能，可用於：（1）建立毛囊幹細胞銀行，為成體幹細胞相關研究提供優質的種子細胞；（2）移植修復病變的組織器官；（3）構建組織工程化器官，用作自體器官的代替物，用於移植修復病變或缺失的器官；（4）作為基因治療的靶細胞，用於治療相應的疾病。

Description

用於體外大量擴增毛囊幹細胞的培養方法

本發明係關於細胞培養技術領域，具體涉及一種體外大量快速擴增貼壁生長的細胞培養方法，特別是利用微球作為細胞培養的載體，旋轉瓶作為發酵罐，體外大量擴增毛囊幹細胞的生物反應器技術。

疾病對人類的健康和生存構成重大威脅、是世界各國普遍面臨的最重要的社會問題。幹細胞移植技術的問世和進展，為傳統治療手段認為是“不治之症”的患者帶來了新的生機和希望。但幹細胞的來源、移植治療的安全性和有效性一直是幹細胞再生醫學研究中需要解決的重大科學問題。

毛囊是皮膚的附屬器之一，起源於胚胎發育時期表皮和間充質(mesenchymal)間的相互作用。毛囊中除了含有表皮幹細胞、黑色素幹細胞外，還含有間充質樣幹細胞(mesenchymal stem cells,MSC)。這種毛囊間充質樣幹細胞不僅能夠自我更新，還能夠分化成骨、軟骨、脂肪和血管平滑肌等多種組織特異性細胞。毛囊幹細胞的自我更新和多向分化，為包括毛囊在內的多種組織器官的再生醫學研究和應用奠定了細胞學基礎。毛囊來源豐富、獲取方便，而且收穫毛囊基本不會對機體產生任何損害作用。因此毛囊幹細胞是目前已知的成體幹細胞中最具有臨床應用潛能的種子細胞。但收穫毛囊，分離幹細胞，開展再生醫學研究，需要大量的、未分化的種子細胞。傳統細胞培養上，大量收穫諸如毛囊幹細胞等貼壁生長的細胞，通常是通過反復繼代而實現的。然而細胞經過反復繼代後，不僅增殖能力迅速下降，而且還失去向多種組織特異性細胞分化的潛能，甚至移植後有可能誘發腫瘤的形成。已知貼壁生長細胞的收穫量和培養面積成正比，即：培養面積越大，收穫的細胞量就越多。微載體含有很高的面積/體積比。1克直徑為100-300微米的微載體，如：Cultisphere-G所擁有的表面積大約是1平方米。如此利用微載體作為細胞培養的介質，在少量的培養基中，就能夠生產出大量的、貼壁生長的細胞，這樣既滿足開展幹細胞再生醫學研究所必須的細胞的數量，也避免因反復繼代而可能導致的細胞增殖能力、多向分化潛能的下降以及移植後誘發腫瘤形成的風險，還降低了生產成本。因此利用微載體作為細胞培養的介質，來大量培養貼壁增長的細胞，已被廣泛地應用於細胞生物學研究和臨床應用中，取得了令人滿意的結果。

本發明的目的在於提供一種可作為種子細胞，用於開展細胞療法，治療和修復病變組織器官的體外大量快速擴增毛囊幹細胞的培養方法。

本發明所稱的“細胞培養旋轉瓶”是指用於細胞培養的容器，如：但不僅限於，垂直旋轉瓶和水平旋轉瓶，容量為10~10000ml，培養時設定轉速為1~500轉/分鐘。

本發明所稱的“微載體”是指由一種或多種生物可降解材料構成，或由非生物降解材料構成，或由生物可降解與非生物降解材料構成的用於細胞培養的介質，其形態如：但不僅限於，顆粒、薄膜和塊狀物。本發明微載體較佳為球形或橢圓球形顆粒，其平均粒徑通常為10~1000 μm，較佳為20~800μm，更佳為100~300μm、301~500μm和501~800μm，如：但不僅限於，100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm和800μm。

本發明所稱的“生物可降解材料”是指通過生物體自身的生物或生物化學過程，實現降解或分解的高分子材料，如：但不僅限於，膠原蛋白、血液纖溶蛋白、明膠、透明質酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚亞胺酯和殼聚糖。

本發明所稱的“非生物降解材料”是指玻璃、矽膠、金屬和塑膠。

本發明所稱的“細胞”是指來源於人類、野生動物和家畜(Livestock)。野生動物為自然狀態下未經人工馴化的動物。家畜是為了提供食物來源而人工飼養的動物，如：但不僅限於，狗、鼠、倉鼠、豬、馬、兔、乳牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、鵝和雞等體內或通過各種方法進行體外分離獲得的毛囊幹細胞。所選用的“細胞”較好來源於哺乳動物，尤其是人體毛囊幹細胞。

本發明所稱的“培養液”是指以DMEM(Dulbecco`s Modified Eagle Medium，杜貝克氏改質鷹氏培養基)、DMEM-F12、EGM(Endothelial Growth Medium，內皮細胞生長培養基)、KGM(Keratinocyte Growth Medium，角質形成細胞生長培養基)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，艾氏改質杜貝克氏培養基)、MEM(Minimum Essential Medium，最小必須培養基)和EBM(Eagle's Basal Medium，鷹氏基礎培養基)中的一種為基本培養液，並含有一種或多種生物因子的混合物。

本發明所稱的“生物因子”為胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)、鹼性成纖維生長因子(basic Fibroblast Growth Factors，bFGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、血管表皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、磷酸鹽維生素C、地塞米松、胰島素、轉鐵蛋白、動物腦垂體提取物、青-鏈黴素、兩性黴素，以及人或動物的血清。所述生物因子應適量使用，以有利於促使細胞的增值，上述各種細胞因子其適量的範圍獨立地取自於0.1-500ng/ml之範圍，較好選擇自0.5-100ng/ml，更佳選擇自1~20ng/ml、21~40ng/ml、41~80ng/ml和81~100ng/ml，如：但不僅限於，1~100的正整數濃度(ng/ml)取值範圍。

本發明所稱的“動物血清”是指來源於牛血清、羊血清、豬血清和其它哺乳動物血清的一種或多種。所稱的“動物血清”作為生物因子添加時，應適量使用，以有利於促使細胞的增殖，其適量的範圍為總培養液體積的0.1~30%(v/v)，較佳選擇自1~25%(v/v)，更佳選擇自1~5%、6~10%、11~15%和16~20%(v/v)，如：但不僅限於，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%和20%(v/v)。

本發明提供的毛囊幹細胞培養方法，包括下述步驟：

(a)利用蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊的方式而獲得的細胞，以1×10³~1×10⁸細胞/克微載體的密度，接種於微載體上，並懸浮於培養液中。細胞接種密度較佳選擇為2.5×10⁶~2×10⁷細胞/克微載體，尤其是2.5×10⁶~1×10⁷細胞/克微載體，如：但不僅限於，2.5×10⁶細胞/克微載體、3×10⁶細胞/克微載體、4×10⁶細胞/克微載體、5×10⁶細胞/克微載體、6×10⁶細胞/克微載體、7×10⁶細胞/克微載體、8×10⁶細胞/克微載體、9×10⁶細胞/克微載體和1×10⁷細胞/克微載體。

(b)將微載體連同接種於其上的細胞一起轉移到細胞培養旋轉瓶中。

(c)依據細胞培養旋轉瓶的容積，添加培養液至細胞培養旋轉瓶中達培養瓶容積的1/10~1/3。

(d)將細胞培養旋轉瓶置於細胞培養箱內培養，培養條件為：37℃，5v/v%CO₂，細胞培養旋轉瓶每小時轉動1~5分鐘，轉速10~300轉/分鐘。

(e)待細胞在微載體上貼附生長接近單層時，使用0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v)EDTA溶液，將細胞從微載體上消化下來後，先經血清滅活胰蛋白酶，再用磷酸鹽緩衝液沖洗掉其中的血清和抗生素後，即得擴增的毛囊幹細胞。

本發明之利用蛋白酶消化毛囊獲取毛囊幹細胞之培養方式應理解為利用蛋白酶對毛囊進行消化以獲取單個毛囊幹細胞之方式，如：磷酸鹽緩衝溶液(PBS)沖洗毛囊或毛囊組織塊，再使用0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v)EDTA溶液37℃消化3-30分鐘後，以胎牛血清終止，並接種至孔板中。本領域技術人員可以理解，任何以蛋白酶對毛囊進行消化以獲取單個細胞的方式都應適用於本發明。本發明採用組織塊培養法獲取毛囊幹細胞的方式應理解係通過培養，使毛囊幹細胞從毛囊中移行出來。將毛囊培養在為本發明以上所涉及的獲取細胞的具體步驟、所用試劑和採用的條件是基於本發明充分公開的需要而進行的列舉，且不得限制本發明。

本發明提供之以微球作為細胞培養的載體、旋轉瓶作為細胞增殖的發酵罐，體外大量擴增毛囊幹細胞的方法，該方法操作簡單，經濟實用，避免反復繼代細胞而導致的細胞增殖能力減弱、分化潛能降低等與傳統擴增細胞方法相關的副作用，同時可減少培養液的用量；利用該方法擴增出來的毛囊幹細胞仍保持原來增殖能力和分化潛能，可用於：(1)建立毛囊幹細胞銀行，為成體幹細胞相關研究提供優質的種子細胞；(2)移植修復病變的組織器官；(3)構建組織工程化器官，用作自體器官的替代物，用於移植修復病變或缺失的器官；(4)作為基因治療的靶細胞，用於治療相應的疾病。

經由本發明方法獲得的毛囊幹細胞，經蛋白酶消化後，從微載體上釋放下來，可作為種子細胞，用於開展細胞療法，治療病變的組織器官，或用於構建組織工程化器官，用以移植治療病變或缺失的器官，也可以用作基因治療的標靶細胞，用於移植治療代謝性或先天遺傳性疾病。還可以將可生物降解微載體，連同在其上貼附生長的毛囊幹細胞一起，直接移植到病變的部位，用於治療相應的組織器官的病變，或改善相應病變器官的狀態，提高其功能，從而達到修復組織器官的目的。

以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非用以限制本發明範圍，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，但本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者均等替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的申請專利範圍中。

本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自於西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。

實施例1

(A)設備和材料的準備：

(i)細胞培養旋轉瓶：CELLSPIN(購自IBS)，容量為500ml，轉速為20轉/分鐘；

(ii)載體：明膠製成的平均粒徑為200μm的微球；

(iii)培養液：以DMEM(購自於Invitrogen)為基礎培養液，其中添加適量的表皮生長因子(EGF)；

毛囊幹細胞的培養與擴增：

(a)利用蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊的培養法而獲得的人毛囊幹細胞，具體為：以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)沖洗毛囊或毛囊組織塊，再使用0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v) EDTA溶液於37℃消化10分鐘後，以胎牛血清終止，隨後接種至孔板中；然後以1×10³~1×10⁷細胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮於培養液中。

(c)據細胞培養旋轉瓶的容積，添加培養液至旋轉瓶容積的1/5。

(d)將細胞培養旋轉瓶置於細胞培養箱內培養，培養條件為：37℃、5v/v%CO₂，細胞培養旋轉瓶每小時轉動1-5分鐘，轉速10-300轉/分鐘。

(e)待細胞在微載體上貼附生長接近單層時，使用0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v) EDTA溶液，將細胞從微載體上消化下來，經血清滅活胰蛋白酶，以磷酸鹽緩衝液沖洗掉其中的血清和抗生素後，即得擴增的毛囊幹細胞。

將數量為“50萬個”、“250萬個”和“500萬個”的毛囊幹細胞分別接種在0.5克如上所述的明膠微載體上。細胞的生長曲線如圖1所示：接種細胞後2~14天，細胞進入指數生長期，數量得到快速大量擴增。其中“500萬個細胞/克微載體”為較佳的接種細胞的起始數量。

實施例2

設備和材料的準備：

(ii)載體：明膠製成的平均粒徑為200μm的微球；

(iii)培養液：以DMEM(購自於Invitrogen)為基礎培養液，其中添加5ng/ml的EGF；

毛囊幹細胞的培養與擴增：

(a)利用蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊的培養法而獲得的人毛囊幹細胞，具體為：以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)沖洗毛囊或毛囊組織塊，再使用0.25wt.%胰蛋白酶-0.02wt.%EDTA溶液於37℃消化10分鐘後，以胎牛血清終止，隨後接種至孔板中；然後以5×10⁶細胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮於培養液中。

將擴增獲得的毛囊幹細胞通過習知成脂細胞體外誘導分化處理(Tissue Eng. 2001,7,211-28)，並進行油紅O染色。實驗證明，擴增獲得的毛囊幹細胞已成功分化為成脂細胞(圖2)，具有分化潛能。

實施例3

設備和材料的準備：

(i)胞培養旋轉瓶：CELLSPIN(購自IBS)，容量為500ml，轉速為20轉/分鐘；

(ii)載體：明膠製成的平均粒徑為200μm的微球；

(iii)培養液：以DMEM(購自於Invitrogen)為基礎培養液，其中添加10ng/ml的bFGF和5ng/ml的EGF；

毛囊幹細胞的培養與擴增：

(a)利用蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊的培養法而獲得的人毛囊幹細胞，具體為：以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)沖洗毛囊或毛囊組織塊，再使用0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v) EDTA溶液於37℃消化10分鐘後，以胎牛血清終止，接種至孔板中；然後以1×10⁷細胞/克微載體的密度，接種在微載體上，懸浮於培養液中。

(c)依據細胞培養旋轉瓶的容積，添加培養液至旋轉瓶容積的1/5。

將擴增獲得的毛囊幹細胞通過習知成骨細胞體外誘導分化處理(Tissue Eng. 2001,7,211-28)，並進行茜素紅染色。實驗證明，擴增獲得的毛囊幹細胞已成功分化為成骨細胞(圖3)，具有分化潛能。

實施例4

設備和材料的準備：

(ii)載體：明膠製成的平均粒徑為200μm的微球；

(iii)培養液：以DMEM(購自於Invitrogen)為基礎培養液，其中添加10ng/ml的bFGF、10%(v/v)的胎牛血清和10ng/ml的EGF；

毛囊幹細胞的培養與擴增：

將擴增獲得的毛囊幹細胞通過習知成骨細胞體外誘導分化處理(Tissue Eng. 2001,7,211-28)，並進行阿利新蘭染色。實驗證明，擴增獲得的毛囊幹細胞已成功分化為成軟骨細胞(圖4)，具有分化潛能。

圖1為載體中細胞的生長曲線；其中，圖例“500萬”、“250萬”和“50萬”表示接種在0.5克微載體上細胞的起始數量；

圖2為採用本發明實施例2提供的擴增方法獲得的毛囊幹細胞，先經習知成脂細胞體外誘導分化處理，再進行油紅O染色所得的結果，被油紅O染色的成脂細胞如圖中箭頭所示；

圖3為採用本發明實施例3提供的擴增方法獲得的毛囊幹細胞，先經習知成骨細胞體外誘導分化處理，再進行茜素紅染色所得的結果，被茜素紅染色的成骨細胞如圖中箭頭所示；

圖4為採用本發明實施例4提供的擴增方法獲得的毛囊幹細胞，先經習知成軟骨細胞體外誘導分化處理，再進行阿利新蘭染色所得的結果，被阿利新蘭染色的成軟骨細胞如圖中箭頭所示。

Claims

一種用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其特徵在於包括下列步驟：(a)將利用蛋白酶消化毛囊或毛囊組織塊培養的方式而獲得的細胞，以1×10³~1×10⁹細胞/克微載體的密度，接種於微載體上，並懸浮於培養液中；(b)將微載體連同接種於其上的細胞一起轉移到細胞培養旋轉瓶中；(c)依據細胞培養旋轉瓶的容積，添加所述培養液至所述細胞培養旋轉瓶達其容積的1/10~1/3；(d)將細胞培養旋轉瓶置於細胞培養箱內培養，培養條件為：37℃，5v/v%CO₂，細胞培養旋轉瓶每小時轉動1~5分鐘，轉速10~300轉/分鐘；(e)待細胞在微載體上貼附生長接近單層時，利用消化液將細胞從微載體上消化下來，經血清滅活胰蛋白酶，以磷酸鹽緩衝液沖洗掉其中的血清和抗生素後，獲得經擴增的毛囊幹細胞。
如申請專利範圍第1項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該消化液為0.25%(v/v)胰蛋白酶-0.02%(v/v)EDTA溶液。
如申請專利範圍第1項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該培養液係以選自DMEM、DMM-F12、EGM、KGM、IMDM、MEM及EBM所成組群之一種為基本培養液，並含有一種或多種生物因子。
如申請專利範圍第3項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該生物因子選自IGF、bFGF、EGF、VEGF、磷酸鹽維生素C、地塞米松、胰島素、轉鐵蛋白、動物腦垂體提取物、青-鏈黴素、兩性黴素、人或動物的血清所成組群之一或多種。
如申請專利範圍第4項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該動物血清選自於牛血清、羊血清、豬血清和其它哺乳動物血清的一種或多種。
如申請專利範圍第1項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該微載體係由一種或多種生物可降解材料構成，或由非生物降解材料構成，或由生物可降解與非生物降解材料構成的用於細胞培養的介質。
如申請專利範圍第6項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該生物可降解材料選自於膠原蛋白、血液纖溶蛋白、明膠、透明質酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚亞胺酯或殼聚糖。
如申請專利範圍第6項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該非生物降解材料係選自於玻璃、矽膠、金屬和塑膠所成之組群。
如申請專利範圍第1項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該微載體為球形或橢圓球形顆粒，其平均粒徑為10-1000μm。
如申請專利範圍第1項之用於體外大量擴增毛囊幹細胞之培養方法，其中該微載體為球形或橢圓球形顆粒，其平均粒徑為100-800μm。