SU1316550A3 - Способ получени анорексогенного средства из сыворотки крови,обладающего эндогенным эффектом насыщени дл регулировани потреблени пищи через центральную нервную систему - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине , а именно к препаративной биохимии , предназначено дл  получени  средства, обладающего эндогенным эффектом насыщени  дл  центрального регулировани  потреблени  пищи, из сыворотки крови человека. Цель изобретени  - вьщеление из сьшоротки крови человека вещества гликопедтидной природы - сатиетина, обладающего избирательным воздействием на сигнал насыщени  и ингибирующим потребление пищи в опытах на крысах, не потребл ющих пищи 96 ч. Дп  этого провод т ультрафильтрацию сыворотки человека через мембранный фильтр под давлением 3 атм с размерами пор, пропускающими вещество мол.м. 10000- 50000 дальтон. В результате сыворотка раздел етс  на 2 фракции: низкомолекул рных и высокомолекул рных веществ. Сатиетин - во фракции низкомолекул рных веществ. Затем провод т лиофилизацию, гель хр9матографию через гель с объемом пор, пропускающим вещество мол.м. 15000-50000 дальтон. далее элюцию ведут 0,1-0,9%-ным водным раствором NaCl, лиофилизируют, хроматографирутот через гель с объемом пор, пропускающим вещество мол.м. 2000-50000 дальтон, снова лиофилизируют . Получают вещество белого цвета , анализ показывает, что оно  вл етс  гликопептидом. В результате его кислотного гидролиза получают аминокислоты и углеводы. § О) 00 о: сд СП о СП

Description

1

Изобретение относитс  к медицине а именно к препаративной биохимии и касаетс  способа- получени  средства обладающего эндогенным эффектом насыщени  дл  центрального регулировани  потреблени  пищи из сыворотки крови человека.

Целью изобретени   вл етс  вьще- ление из сыворотки крови человека вещества гликопептидной природы - сатиетина,,- обладающего избирательны воздействием на сигнал насыщени  и ингибирующим потреблени  пищи в опытах на крысаз, которые не потребл ли пищи в течение 96 ч.

Указанна  цепь достигаетс  путем ультрафильтрации сьшоротки человека через мембранньш фильтр с размерами пор, пропускающими вещество с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили зации, гель-хроматографии через гел с объемом пор, пропускающими вещества 1500-50000 дальтон, элюации 0,1-0,9%-ным водным раствором хлористого натри , лиофилизации, гель- хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000 и лиофилизации.

Способ осуществл етс  следующим образом.

Сыворотку крови человека подвергают ультрафильтрации через мембранные фильтры, пропускающие вещества мол.м. ниже 50000 дальтон, ультрафильтрацию провод т под давлением 3 атм.с посто нным перемешиванием. В результате такой процедуры сыворока раздел етс  на две фракции: низкомолекул рных и высокомолекул рных веществ. Сатиетин находитс  во фракции низкомолекул рных веществ. Несмотр  на мол. м. 60000-100000 даль тон фильтрат высушивают и подвергают гель-хроматографии через гель сефадекса или биогел  с объемом пор 1500-50000, активный продукт выходи в свободном объеме колонки, при элю ции раствором хлористого натри  при нейтральных значени х рН, фракции, содержащие активное вещество, собирают и лиофилизируют, а затем очищают на колонке с биогелем р 2-р 3 элюируют дистиллированной водой, фракции, обладающие активностью, собирают и лиофилизируют.

.Пример 1. 100 л сьшоротки подвергают ультрафильтрации через мембрану Amicon ИМ-10, 700 мл уль- трафильтрата лиофилизируют и затем расo

5

0

5

0

5

0

5

0

твор ют в зоне дистиллированной воды и подвергают гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-15 (диаметр колонки 5 см, высота 90 см), элюируют 0,9%-ным раствором хлористого натри  при нейтральных значени х рН, собирают фракции по 10 мл. Фракции между полимерами 50 и 60 (между 500 и 600 мл элюирующего раствора) были .найдены биологически активными. Биологически активные фракции собирают, лиофилизируют и раствор ют в 10 мл дистиллированной воды, затем нанос т на колонку с биогелем Р-30, размер колонки 2,5x90 см и элюируют дистиллированной водой, собирают фракции по 10 мл, фракции между 10 и 15 были биологически активными, их объедин ют и лиофилизируют.

В зависимости от качества исходной сьшоротки получают 200-240 мг сухого продукта, который был снежно- белым сходным по структуре с хлопком и гомогенным веществом.

Пример 2. 900 мл сыворотки подвергают ультрафильтрации через мембрану ХМ-50 Amicon, 700 мл фильтрата лиофилизируют и раствор ют в дистиллированной воде, затем нанос т на колонку с сефадексом G-50 (5x90 см), элюируют 0,9%-ным раствором хлористого натри  и собирают фракции по 10 мл. Биологически активные фракции от 500 до 600 мл объедин ют, лиофилизируют, раствор ют в 10 мл дистиллированной воды и очищают на колонке с биогелем Р2 (2,5x90 см) с применением в качестве элюэнта дистиллированной воды, с колонки собирают фракции по 10 мл, биологически активной фракции между номерами 11 и 15 собирают и лиофилизируют . Получают 20-30 мг сухого продукта которьй был снежно-белым чистым веществом.

Пример 3. Провод т процесс аналогично примеру 1, но вместо сефа- декс G-15 используют крупнозернистьй сефадекс G-25, а элюцию провод т 0,2%-ным водным раствором хлористого натри .

Пример 4. Провод т процесс аналогично примеру 1, но-вместо сефадекса G-45 используют тонкодисперс- ньш сефадекс G-25 и элюирутот 0,1%-ным водным раствором хлористого натри . Гели с меньшими размерами пор, чем сефадекс G-10 не примен ютс , а при использовании гелей с большими размерами пор, сатиетин нельз  выделить, так как активное вещество проникает в гель и распредел етс  по всему объему гел ,

В результате предложенного спо- соба получено вещество белогр цвета, сходное по виду с хлопком, химический анализ показывает, что оно-  вл етс  гликопептидом и после его кислотного гидролиза могут быть полу- чены аминокислоты и углеводы: общее содержание аминокислот в продукте составл ет 60,6%, редицирукнцих веществ - 13%, углеводов - 10,7%, содержание воды в продукте составл ет ;10%, фактически в виде св занной воды . При электрофорезе в полиакрил- амидном геле в присутствии додецил- сульфата натри  обнаружен компонент с мол.м. около 68000 дальтон, но существует компонент с мол.м. 18000 и два компонента с одинаковой мол.м. 28000, хорошо раздел емые.

Спектр поглощени  в ультрафиолетовой области не показывает максиму- мов поглощени , но по вл етс  плато примерно в области 275-280 нм, которое может быть характеристикой пептида белка.

Биологическа  активность продукта 30 ющего эндогенным эффектом насыщени 

на потребление пищи была исследована на самках крыс CFf весом 200- 240 г. Животные были лишены пищи, но воду давали неограниченно. В св зи с агрессивностью вызванной голоданием , животньк индивидуально помещали в различные клетки. Каждому животному вводили внутривенно дозу 10 мг/кг сатиетина внутривенно, расдл  регулировани  потреблени  пищи через центральную нервную систему путем ультрафильтрацйи сыворотки крб- ви человека через мембранный фильтр 35 с пределами пропускани  веществ с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили- зации фильтрата, растворени  его в воде, гель-хроматографии ч.ерез гель с объемом пор 1500-50000 дальтон.

творенного в 0,5 мп физиологического 40 элюции 0,1-0,9%-ным водным раствором

раствора. Животным контрольной группы вводили только 0,5 мл физиологического раствора. Через 1 ч животным давали корм: обычные пищевые таблетки, содержащие альбумин, жир, углевод и 45

хлористого натри , лнофилиэации целевого продукта и повторной гель-хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000, элюции водой и лиофили- зации.

Редактор Г. Волкова

Составитель С. Мельникова

Техред В.Кадар Корректор В. Бут га

Заказ 2374/58Тираж 595Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

витамины, в неограниченном количестве . Потребление йищи определ ли через 1,5 и 24 ч после предоставлени  корма. Животные с введением сатие- тина снижают потребление пищи при- мерно от 2 до 8 раз в различные сроки по сравнению с контролем и более высокой активностью по сравнению с амфетамином через 24 ч после воздействи .

Дл  проверки специфического и избирательного действи  было проведено испытание препарата на тест подпрыгивани  по сравнению с веществом, обладающим сходным воздействием, химическим продуктом амфетамином (d,I амфетамин гидрохлорид, хиноин, даже большие дозы сатиетина не оказывают никакого вли ни  на повышение или снижение подвижности, также не оказывают вли ни  и на продольные мьшцы в изолированном состо нии по сравнению с холецистокинином).

Claims (1)

1. Формула изобре.тени 

   Способ получени  анорексогенного средства из сьшоротки крови, облададл  регулировани  потреблени  пищи через центральную нервную систему путем ультрафильтрацйи сыворотки крб- ви человека через мембранный фильтр с пределами пропускани  веществ с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили- зации фильтрата, растворени  его в воде, гель-хроматографии ч.ерез гель с объемом пор 1500-50000 дальтон.

   хлористого натри , лнофилиэации целевого продукта и повторной гель-хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000, элюции водой и лиофили- зации.