SK47399A3 - Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase - Google Patents
Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase Download PDFInfo
- Publication number
- SK47399A3 SK47399A3 SK473-99A SK47399A SK47399A3 SK 47399 A3 SK47399 A3 SK 47399A3 SK 47399 A SK47399 A SK 47399A SK 47399 A3 SK47399 A3 SK 47399A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- paf
- activity
- rph
- fragment
- column
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01047—1-Alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase (3.1.1.47), i.e. platelet-activating factor acetylhydrolase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Skrátená PAF acetylhydroláza^Truncated PAF acetyl hydrolase
-aktivujúceho faktora^-activating factor ^
Oblasť technikyTechnical field
Predkladaný vynález sa týkaThe present invention relates to
CAH) Chydrolázy hydrolyzujúcej faktor aktivujúci doštičky) a špecifickejšie novo purifikovaných a izolovaných polynukleotidov kódujúcich ľudskú plazmovú PAF acetylhydrolázu a.produktov PAF-AH kódovaných polynukleotidini. Ďalej materiálov a metód produkcie produktov rekombinantnej PAF-AH a protilátok proti PAF-AH.CAH) Platelet Activating Factor hydrolyzing hydrolyzes) and more specifically the newly purified and isolated polynucleotides encoding human plasma PAF acetyl hydrolase and PAF-AH products encoded by polynucleotides. Further materials and methods of producing recombinant PAF-AH products and antibodies against PAF-AH.
Dotera iší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
PAF je biologicky aktívny fosfolipid syntetizovaný rôznymi typmi buniek. In vivo a pri normálnych koncentráciách 10“10 až 10-9 M PAF aktivuje cieľové bunky (ako napríklad krvné doštičky a neutrofily) väzbou ria špecifické povrchové receptory spojené s G proĽeírimi CVenable et al., J. Lipid Res., 34: 691-701 C1993)).PAF is a biologically active phospholipid synthesized by various cell types. In vivo, and at normal concentrations of 10 -10 to 10 -9 M PAF, activates target cells (such as platelets and neutrophils) by binding to specific surface receptors associated with G proteins CVenable et al., J. Lipid Res., 34: 691- 701 (C1993)).
PAF má štruktúru l-Cl-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-fosfocholin. Aby bola biologická aktivita optimálna, musí byť na sri-1 pozícii chrbtice PAF naviazaný éterovou väzbou mastný alkohol a na sn-3 pozícii musí byt fosfocholíriová vedúca skupina.PAF has the structure 1-Cl-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine. For optimal biological activity, a fatty alcohol must be attached at the s-1 position of the PAF backbone and a s-3 position must have a phosphocholoryl leader group.
PAF pracuje pri normálnych fyziologických procesoch Cnapr. zápaloch, zástave krvácania a pôrode) a jeho úloha je predpokladaná v prípade patologických zápalových procesov Cnapr. astmy, anafylaxle. septického šoku a artritídy) CVeriable et al., pozri predchádzajúce citácie, Lindsberg et al., Ann. Neurol., 30: 117-129 C1991). Pravdepodobnosť úlohy PAF v patologických odpovediach viedla k pokusom modulovať aktivitu PAF. Najviac týchto pokusov bolo zameraných na vývoj antagonlstov aktivity PAF, ktoré by interferovali s väzbou PAF na bunkové povrchové receptory. Pozri napr. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy. 22: 980-983 C1992).PAF works in the normal physiological processes of Cnapr. inflammation, haemostasis and delivery) and its role is assumed in the case of pathological inflammatory processes Cnapr. asthma, anaphylaxis. septic shock and arthritis) CVeriable et al., supra, Lindsberg et al., Ann. Neurol., 30: 117-129 (1998). The probability of the role of PAF in pathological responses has led to attempts to modulate PAF activity. Most of these experiments have focused on the development of PAF activity antagonists that would interfere with the binding of PAF to cell surface receptors. See e.g. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy. 22: 980-983 (1992).
Syntéza a sekrécla PAF, jeho degradácia a vyčistenie sú zrejme vysoko kontrolované a to do takej miery, že patologické pôsobenie PAF- môže byť výsledkom zrútenia regulačných mechanizmov PAF. To vedie k jeho nadmernej produkcii, nepatričnej produkcii alebo neschopnosti degradácie. Alternatívny zdroj modulácie aktivity PAF by zahrnovalo napodobovanie alebo zväčšovanie prírodných procesov, ktorými dochádza k rozlíšeniu zápalu. Makrofágy (Stafforini et al.. J. Biol. Chem.. 265 (17)« 9682-9687 (1990). hepatocyty a ľudské hepatúmové bunkové línie HepG2 (Saton et al., J. Clin. Invest., 87« 476-481 (1991) a Tarbet et al., J. Biol. Chem.. 266(25)= 16667-16673 (1991.) popísali uvoľňovanie enzymatlckej aktivity, PAF acetylhydroláza (PAF-AH), ktorá iriaktivuje PAF. Okrem toho, že inaktivuje PAF, PAF-AH tiež inaktivuje oxidatívne fragmentované fosfolipidy, ako sú napr. produkty arachidóriovej kaskády, ktoré prenášajú zápal (pozri Streinler et al.. J. Biol. Chem., 266(17)« 11095-11103 (1991). ľnaktivácia PAF PAF-AH je spôsobená predovšetkým hydrolýzou PAF na sn-2 acetylovariej skupine a PAF-AH metabolizuje oxidatívne fragmentované fosfolipidy tak, že odníma sn-2 acylskuplnu. Dva typy PAF-AH boli identifikované! cytoplazmatická forma nájdená v rôznych typoch buniek a tkanív ako sú endotelové a erytrocyty a extracelulárna forma nájdená v plazme a sére. Plazmová PAF-AH nehydrolyzuje intaktrié fosfolipidy s výnimkou PAF a táto substrátová špecificita dovoľuje enzýmu cirkulovať in vivo c plne aktívnom stave bez nepriaznivých vplyvov. Plazmová PAF-AH sa zdá byt zodpovedná za všetky degradácie PAF v ľudskej krvi ex vivo (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 162(9)« 4223-430 (1987)).Synthesis and secretion of PAF, its degradation and purification are apparently highly controlled, to the extent that the pathological action of PAF- may result from the breakdown of PAF regulatory mechanisms. This leads to its overproduction, inappropriate production or inability to degrade. An alternative source of modulating PAF activity would include mimicking or augmenting the natural processes that distinguish inflammation. Macrophages (Stafforini et al., J. Biol. Chem. 265 (17), 9682-9687 (1990). Hepatocytes and HepG2 Human Hepatum Cell Lines (Saton et al., J. Clin. Invest., 87, 476-). 481 (1991) and Tarbet et al., J. Biol. Chem. 266 (25) = 16667-16673 (1991) described the release of the enzymatic activity, PAF acetyl hydrolase (PAF-AH), which inactivates PAF. inactivates PAF, PAF-AH also inactivates oxidatively fragmented phospholipids such as the arachidory cascade products that transmit inflammation (see Streinler et al., J. Biol. Chem., 266 (17) < 11095-11103 (1991)). PAF PAF-AH is mainly due to the hydrolysis of PAF to the sn-2 acetylation group and PAF-AH metabolizes oxidatively fragmented phospholipids by removing the sn-2 acyl scapil Two types of PAF-AH have been identified cytoplasmic form found in different cell and tissue types as are endothelial and erythrocytes and extracellular form found in plasma and serum. hydrolyzes intact phospholipids with the exception of PAF, and this substrate specificity allows the enzyme to circulate in vivo in a fully active state without adversely affecting it. Plasma PAF-AH appears to be responsible for all degradations of PAF in human blood ex vivo (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 162 (9), 4223-430 (1987)).
Zdá sa. že zatiaľ čo cytoplazmatická a plazmová forma PAF-AH majú Identickú substrátovú špecificitu, má plazmová PAF-AH biochemické vlastnosti. ktoré jú odlišujú od cytoplazmatickej PAF-AH a od iných llpáz. Konkrétne je plazmová PAF-AH asociovaná s lipoproteínovými časticami, je lnhlbovaná disopropyl fluórfosfátom. nie je ovplyvnená vápenatými iónmi, je relatívne insenzitívna voči proteolýze a má molekulovú hmotnosť 43000 Da (pozri Stafforini et al.. (1987), pozri vyššie). Rovnaký Stafforiniho článok popisuje postup čiastočnej purifikácie PAF-AH z ľudskej plazmy a ďalej aminokyselinové zloženie materiálu získaného použitím tohoto postupu. Cytoplazmatlcká PAF-AH bola purifikovaná z erytrocytov (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268(6)t 3857-3865 (1993)) a desať aminokyselinových zvyškov z amino-konca cytoplazmatickej PAF-AH bolo v článku popísaných tiež. Hattori et al., J. Biol. Chem.. 268(25)s 18748-18753 popísal purlfikáciu cytoplazmatického PAF-AH z hovädzieho mozgu. Po tom, ako bol k tomu dokumentu podaný patentový návrh, bola publikovaná nukleotidová sekvencia cytoplazmatického PAF-AH z hovädzieho mozgu v článku Hattori et al., J. Biol. Chem., 269(237)s 23150-23155 (1994). 5. januára 1995, tri mesiace po podaní patentového návrhu k tomuto dokumentu bola publikovaná nukleotidová sekvencia lipoproteín asociovanej fosfolipázy As, (Lp-PLA-a) s Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PTC) International Publication No. U095/00469. Nukleotidová sekvencia Lp-PLAa so odlišuje v jednej pozícii v porovnaní s nukleotidovou sekvenciou PAF-AH predchádzajúceho vynálezu. Rozdiel v nukleotlde (zodpovedajúc.! pozícii 1297 SEQ ID NO s 7) viedol k rozdielu v aminokyseline medzi enzýmami, ktoré boli týmito polynukleotidmi kódované. Aminokyselina v pozícii 379 SEQ ID NO: 8 je valíri, zatiaľ čo aminokyselina na príslušnej pozícii. Lp-PLAa je alaníri. Okrem toho zahrnuje nukleotidová sekvencia PAF-AH predkladaného vynálezu 124 báz na 5’ konci a 20 báz na 3' konci nie je prítomných v sekvencii Lp-PLA-.. Po troch mesiacoch 10. apríla 1995 bola do GenBank pod Accesslon No. U24577 uložená sekvencia Lp-PLAa, ktorá sa odlišuje 11 pozíciami v porovnaní s nukleotidovou sekvenciou PAF-AH predkladaného vynálezu. Rozdiely v nukleotldoch (zodpovedajúce pozíciám 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122. 904. 905. 911. 983 a 1327 SEQ ID NOs 7) viedli k rozdielom v štyroch aminokyselinách v prípade enzýmov kódovaných týmito polynukleotidmi. Aminokyseliny na pozíciách 249, 250, 274 a 369 SEQ 10 NQ: 8 sú lyžín, kyselina asparágová, fenylalanín a leucín, zatiaľ čo príslušné aminokyseliny na príslušných pozíciách v génovej' banke (GenBank) sú izoleucín, arginín. leucín a serín.It appears. whereas, while the cytoplasmic and plasma forms of PAF-AH have identical substrate specificity, plasma PAF-AH has biochemical properties. which differ from cytoplasmic PAF-AH and other 11pases. In particular, plasma PAF-AH is associated with lipoprotein particles, is digested with disopropyl fluorophosphate. it is relatively insensitive to proteolysis and has a molecular weight of 43,000 Da (see Stafforini et al. (1987), supra). The same Stafforini paper describes a process for partial purification of PAF-AH from human plasma and the amino acid composition of the material obtained using this process. Cytoplasmic PAF-AH was purified from erythrocytes (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268 (6) t 3857-3865 (1993)) and ten amino acid residues from the amino-terminus of cytoplasmic PAF-AH were also described in the article . Hattori et al., J. Biol. Chem. 268 (25) with 18748-18753 described purification of cytoplasmic PAF-AH from bovine brain. Following a patent application, the nucleotide sequence of bovine brain cytoplasmic PAF-AH was published in Hattori et al., J. Biol. Chem., 269 (237) with 23150-23155 (1994). On January 5, 1995, three months after filing a patent proposal for this document, the nucleotide sequence of the lipoprotein-associated phospholipase As (Lp-PLA-a) with the Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PTC) was published. U095 / 00,469th The nucleotide sequence of Lp-PLA α is different in one position compared to the nucleotide sequence of PAF-AH of the present invention. The nucleotide difference (corresponding to position 1297 of SEQ ID NO: 7) resulted in an amino acid difference between the enzymes encoded by these polynucleotides. The amino acid at position 379 of SEQ ID NO: 8 is valier, while the amino acid at the corresponding position. Lp-PLAa is alanine. In addition, the nucleotide sequence of the PAF-AH of the present invention comprises 124 bases at the 5 'end and 20 bases at the 3' end not present in the Lp-PLA- sequence. U24577 deposited Lp-PLA α sequence, which differs by 11 positions compared to the nucleotide sequence of PAF-AH of the present invention. Nucleotide differences (corresponding to positions 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 and 1327 of SEQ ID NOs 7) resulted in four amino acid differences for the enzymes encoded by these polynucleotides. The amino acids at positions 249, 250, 274 and 369 of SEQ ID NO: 8 are lysine, aspartic acid, phenylalanine, and leucine, while the corresponding amino acids at the appropriate positions in the GenBank are isoleucine, arginine. leucine and serine.
Rekombinantná produkcia PAF-AH by umožnila použitie exogénneho PAF-AH na napodobenie či rozšírenie normálnych procesov rozoznanla zápalu in vivo. Podávanie PAF-AH by poskytlo Fyziologickú výhodu pred podávaní antagonistov receptora PAF, pretože PAF-AH je látka normálne sa vyskytujúca v plazme. Antagonisti receptora PAF, ktoré sú Štruktúrne príbuzné PAF tiež inhibujú natívnu aktivitu PAF-AH. Podávanie PAF-AH by tak chránilo žiadúci metabolizmus PAF a metabolizmus oxidatívne fragmentovaných fosfolipidov. Inhibícia aktivity PAF-AH pomocou antagonistov receptora PAF-AH tak vlastne marí kompetitívnu blokádu receptora PAF antagonistami Cpozri Stremler et al., pozri vyššie). Okrem toho v mieste akútneho zápalu sa napríklad uvoľňujú oxidanby, ktoré vedú k inaktlvácli natívneho enzýmu PAF-AH a to ústi následne do zvýšenej lokálnej hladiny PAF a lábok príbuzných PAF (PAF-like). Tieto látky môžu ďalej súťažiť s ktorýmkoľvek exogénne podaným antagonistom PAF receptora o väzbu na PAF receptor. Oproti tomu by ošetrenie rekombinantným PAF-AH zvýšilo endogénnu aktivitu PAF-AH, čím by sa kompenzovala akákoľvek lnaktlvácia endogénneho enzýmu. Existuje teda v tomto odbore potreba identifikácie a izolácie polynukleotidovej sekvencie kódujúcej ľudský plazmový PAF-AH a ďalej potreba vyvinúť materiál a mebódy použiteľné na rekombiriantnú produkciu PAF-AH a výrobu látok na detekciu PAF-AH v plazme.Recombinant production of PAF-AH would allow the use of exogenous PAF-AH to mimic or augment normal processes to recognize inflammation in vivo. Administration of PAF-AH would provide a physiological advantage over the administration of PAF receptor antagonists, since PAF-AH is a substance normally found in plasma. PAF receptor antagonists that are structurally related to PAF also inhibit native PAF-AH activity. Thus, administration of PAF-AH would protect the desired metabolism of PAF and the metabolism of oxidatively fragmented phospholipids. In fact, inhibition of PAF-AH activity by PAF-AH receptor antagonists obstructs competitive blockade of PAF receptor by antagonists (Cpozri Stremler et al., Supra). In addition, at the site of acute inflammation, for example, oxidans are released which lead to inactivation of the native PAF-AH enzyme, resulting in increased local levels of PAF and PAF-like wells (PAF-like). These agents may further compete with any exogenously administered PAF receptor antagonist for binding to the PAF receptor. In contrast, treatment with recombinant PAF-AH would increase the endogenous activity of PAF-AH, thereby compensating for any inactivation of the endogenous enzyme. Thus, there is a need in the art for the identification and isolation of a polynucleotide sequence encoding human plasma PAF-AH, and for the development of material and mebodes useful for recombinant production of PAF-AH and production of substances for detecting PAF-AH in plasma.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Predkladaný vynález poskytuje novo purifikované a izolované polynukleotidy (napr. DNA a RNA - obidve vlákna) kódujúce ľudskú plazmovú PAF-AH alebo jej enzymaticky aktívne fragmenty. Preferované sekvencie DNA vynálezu zahrnujú genómové a cDNA sekvencie a tiež čiastočne alebo celkovo chemicky syntetizované sekvencie DNA. Vo vynáleze sú uvažované sekvencie DNA kódujúce PAF-AH, ktoré sú popísané v SEQ ID NO:7 a sekvencie DNA, ktoré hybridizujú pri stringentných podmienkach s nakódujúcim vláknom tejto sekvencie alebo, ktoré by pre redundanciu genetického kódu hybridizovali. Vo vynáleze sú tiež uvažované biologické repliky (napr. kópie izolovaných sekvencii DNA vytvorených in vivo alebo in vitro') sekvencii DNA vynálezu. Zaistené sú tiež autonómne sa replikujúce rekomblnantné konštrukty. ako sú plazmldové a vírusové vektory s inkorporovanými sekvenciami PAF-AH a predovšetkým potom vektory, kde je DNA kódujúca PAF-AH operatívne zviazaná s endogénnymi alebo exogénnymi expresnými kontrolnými DNA sekvenciami a transkripčriými terminátormi.The present invention provides novelly purified and isolated polynucleotides (e.g., DNA and RNA - both strands) encoding human plasma PAF-AH or enzymatically active fragments thereof. Preferred DNA sequences of the invention include genomic and cDNA sequences, as well as partially or totally chemically synthesized DNA sequences. The present invention contemplates DNA sequences encoding PAF-AH that are described in SEQ ID NO: 7 and DNA sequences that hybridize under stringent conditions to the coding strand of the sequence or that would hybridize for redundancy of the genetic code. Also contemplated by the invention are biological replicas (e.g., copies of isolated DNA sequences generated in vivo or in vitro) of the DNA sequences of the invention. Autonomously replicating recombinant constructs are also provided. such as plasmid and viral vectors incorporating PAF-AH sequences, and in particular vectors wherein the DNA encoding PAF-AH is operably linked to endogenous or exogenous expression control DNA sequences and transcriptional terminators.
Podľa ďalšej stránky vynálezu sú prokaryotické a eukaryotické hostiteľské bunky stabilne transformované sekvenciami DNA vynálezu spôsobom dovoľujúcim požadovanú expresiu PAF-AH vnútri týchto buniek. Hostiteľské bunky exprimujúce PAF-AH produkty môžu slúžiť na rozličné užitočné ciele. Takéto bunky vytvárajú hodnotný zdroj imunogénov pre vývoj protilátkových substancií špecificky imurioreagujúci s PAF-AH. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú jasne použiteľné pri metódach produkcie PAF-AH vo veľkých objemoch, pri ktorých sú bunky pestované vo vhodných kultivačných médiách a požadované polypeptidové produkty sú izolované z týchto buniek alebo z média. v ktorom boli bunky pestované, napríklad imunoafinitnou purifikáciou.According to another aspect of the invention, prokaryotic and eukaryotic host cells are stably transformed with DNA sequences of the invention in a manner allowing the desired expression of PAF-AH within these cells. Host cells expressing PAF-AH products can serve a variety of useful targets. Such cells create a valuable source of immunogens for the development of antibody substances specifically immunoreacting with PAF-AH. The host cells of the invention are clearly useful in large-scale PAF-AH production methods, wherein the cells are grown in suitable culture media and the desired polypeptide products are isolated from these cells or from the medium. in which the cells were grown, for example by immunoaffinity purification.
Neimunologické metódy uvažované vynálezom purifikácie PAF-Ah z plazmy zahrnujú tieto kroky s a) izoláciu nizkohustotriých lipoproteínových častíc; b) solubilizáciu vyššie uvedených nízkohustotných lipoproteínových častíc v pufri obsahujúcom lOmM CHAPS. takto je vytvorený prvý roztok PAF-AH enzýmu; c) nanesenie vyššie uvedeného prvého roztoku enzýmu PAF-AH na DFAF an1.ón-1 nnexovú kolónu; d) premytie vyššie uvedenej DEAE anión-ionexovej kolóny pufrom s pH približne 7,5 obsahujúcim 3mľl CHAPS e) elúciu enzýmu PAF-AH z. vyššie uvedenej DEAE anión-1 nnexnvej kolóny dn frakcií pufrom s pH približne 7,5 obsahujúcim gradi.ent NaCI 0 až 0,51*1; f) spojenie frakcií majúcich enzymatickú aktivitu PAF-AH eluovaných z vyššie uvedenej DFAF anión-1nnexnvej kolóny; g) prevedenie vyššie uvedených spojených aktívnych frakcií z vyššie uvedenej DEAE anión-innexnvej knlóny dn 10ml*l CHAPS. tak bol vytvorený druhý rnztok PAF-AH enzýmu; h) nanesenie vyššie uvedeného druhého roztoku enzýmu na afi.nitnú kolónu s blue dye llgandom; 1) elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej afi.ni tne j kolóny s bl ue dye ligandoin pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a chaotropické soli; j) nanesenie eluátu z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom na afinitnú kolónu s Cu llgandom; k) elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s Cu ligandom pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a Imidazol; 1)nanesenie eluátu z vyššie uvedenej aflnltnej kolóny s Cu llgandom na SDS-PAGE a m) izoláciu približne 44kDa enzýmu PAF-AH z SDS polyalkrylamidového gélu. Prednostne je pufer v kroku b) 25ml*l Tris-HCl, ΙΟιηΜ CHAPS, pH 7,5; pufer v kroku d) je 25mM Tris-HCl, lmM CHAPS; kolóna kroku h) je kolóna s Blue Sepharose Fast Flou; pufer v kroku i) je 25mM Tris-HCl, 10ml*l CHAPS, 0, 5 KSCN, pH 7,5; kolóna v kroku j) je Cu Chelating Sepharose kolóna a pufer kroku k) je 25ml*I Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,51*1 NaCl. 50ml*I imidazol pri pH v rozmedzí okolo 7,5-8,0.The non-immunological methods contemplated by the invention for plasma PAF-Ah purification include the steps of a) isolating low density lipoprotein particles; b) solubilizing the above low density lipoprotein particles in a buffer containing 10 mM CHAPS. thus forming a first solution of the PAF-AH enzyme; c) loading the aforementioned first PAF-AH enzyme solution onto a DFAF anion-1 n-nex column; d) washing the above DEAE anion-exchange column with a pH of about 7.5 containing 3 ml of CHAPS; e) eluting the PAF-AH enzyme. the aforementioned DEAE anion-1 non-exchanging column of dn fractions with a pH buffer of about 7.5 containing a NaCl gradient of 0 to 0.51 * 1; f) pooling fractions having PAF-AH enzymatic activity eluted from the above-mentioned DFAF anion-1-exchanger column; g) transferring the aforementioned pooled active fractions from the aforementioned DEAE anion-innex clone dn 10ml * 1 CHAPS. thus, a second solution of the PAF-AH enzyme was generated; h) loading the aforementioned second enzyme solution onto a blue dye Igg affinity column; 1) eluting the PAF-AH enzyme from the above affinity column with blue dye ligandoin buffer containing 10 mM CHAPS and chaotropic salts; j) loading the eluate from the above blue dye ligand affinity column onto a Cu 11gand affinity column; k) eluting the enzyme PAF-AH from the above affinity column with a Cu ligand buffer containing 10 mM CHAPS and Imidazole; 1) loading the eluate from the above affinity Cu11gand column on SDS-PAGE; and m) isolating the approximately 44 kDa PAF-AH enzyme from the SDS polyalkrylamide gel. Preferably, the buffer in step b) is 25 ml * 1 Tris-HCl, pH CHAPS, pH 7.5; the buffer in step d) is 25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS; the column of step h) is a Blue Sepharose Fast Flu column; the buffer in step i) is 25 mM Tris-HCl, 10 ml * 1 CHAPS, 0.5 KSCN, pH 7.5; the column in step j) is a Cu Chelating Sepharose column and the buffer of step k) is 25ml * 1 Tris-HCl, 10mM CHAPS, 0.51 * 1 NaCl. 50ml * I imidazole at a pH in the range of about 7.5-8.0.
Metóda uvažovaná vo vynáleze na purifikáciu enzymaticky aktívneho PAF-AH z f. coli produkujúcej PAF-AH zahrnuje tieto kroky» b) nanesenie vyššie uvedeného centrifugaCného supernatantu na afinitnú kolónu s blue dye llgandom; c> elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom pufrom obsahujúci lOmM CHAPS a chaotropické soli; d) nanesenie eluátu z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom na afinitnú kolónu s Cu ligandom; e) elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s Cu ligandom pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a imidazol. Prednostne je kolóna kroku b) kolóna s Blue Sepharose Fast Floui; pufer kroku c) je 25ml*l Tris-HCl, 10mM CHAPS, 0, 5M KSCN. pH 7.5; kolóna v kroku d) je Cu Chelating Sepharose kolóna a pufer kroku e) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl. 50mM Imidazol, pH 7,5.The method contemplated by the invention for purifying enzymatically active PAF-AH from f. a PAF-AH producing coli comprising the steps of: b) loading the above centrifugation supernatant onto a blue dye 11gandom affinity column; c) eluting the PAF-AH enzyme from the above-described blue dye ligand affinity column containing 10 mM CHAPS and chaotropic salts; d) loading the eluate from the above blue dye ligand affinity column onto a Cu ligand affinity column; e) eluting the enzyme PAF-AH from the above affinity column with a Cu ligand buffer containing 10 mM CHAPS and imidazole. Preferably, the column of step b) is a Blue Sepharose Fast Floui column; the buffer of step c) is 25 ml * 1 Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0.5 M KSCN. pH 7.5; the column in step d) is a Cu Chelating Sepharose column and the buffer of step e) is 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0.5 M NaCl. 50mM Imidazole, pH 7.5.
Vo vynáleze je uvažovaná ešte iná metóda puriflkácie enzymaticky aktívneho PAF-AH z E. coli produkujúcej PAF-AH. Táto metóda zahrnuje tieto kroky; a) príprava centrifugaCného supernatantu z lyzovanej E. coli produkujúcej enzým PAF-AH'; b) zriedenie vyššie uvedeného centrifugaCného supernatantu v pufri s nízkym pH obsahujúcim lOmM CHAPS; c) nanesenie vyššie uvedeného zriedeného centrifugaCného supernatantu na katlón-ionexovú kolónu ekvllibrovanú na pH okolo 7,5; d) elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej katión-ionexovej kolóny IM soľou; e) zvýšenie pH vyššie uvedeného eluátu z vyššie uvedenej katiún-ionexovej kolóny a upravenie koncentrácie soli vyššie uvedeného eluátu na koncentráciu soli okolo 0.51*1; f) nanesenie vyššie uvedeného eluátu z vyššie uvedenej katión-ionexovej kolóny na afinitnú kolónu s blue dye llgandom; g) elúciu enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandoin pufrom obsahujúcim soli s koncentráciou okolo 2ľl až 31*1; h) dialýzu vyššie uvedeného eluátu z vyššie uvedenej afinitnej kolóny s blue dye llgandom použitím pufra obsahujúceho asi 0. IX Tween. Prednostne je pufer v kroku b) 25ml*I MES. lOmM CHAPS. lml*l EDTA. pH 4.9; kolóna v kroku c) je S Sepharose kolóna ekvilibrovaná v 25inl*l MES, 10ml*l CHAPS, lmM EDTA, 50ml*l NaCl. pH 5,5; PAF-AH je v kroku d) eluovaná lml*l NaCl; pH eluátu v kroku e) je upravená na pH 7.5 použitím 21*1 Tris-bázy; kolóna v kroku f) je kolóna sepharosy; pufer v kroku g) je 25ml*l Tris. 10ml*l CHAPS. 31*1 NaCl. lml*l EDTA. pH 7.5 a pufer v kroku h) je 25ml*l Tris, 0, 5 ľl NaCl, 0, IX Tween 8D, pH 7,5.Another method of purifying the enzymatically active PAF-AH from E. coli producing PAF-AH is contemplated in the invention. This method includes the following steps; a) preparing a centrifugation supernatant from lysed E. coli producing PAF-AH 'enzyme; b) diluting the above centrifugation supernatant in a low pH buffer containing 10 mM CHAPS; c) loading the above diluted centrifugation supernatant onto a cation exchange column equilibrated to a pH of about 7.5; d) eluting the PAF-AH enzyme from the above cation-exchange IM column with salt; e) raising the pH of said eluate from said cation exchange column and adjusting the salt concentration of said eluate to a salt concentration of about 0.51 * 1; f) loading the above eluate from the above cation-exchange column onto a blue dye 11gandom affinity column; g) eluting the enzyme PAF-AH from the above affinity column with a blue dye ligandoin buffer containing salts at a concentration of about 2 µl to 31 µl; h) dialyzing the above eluate from the above blue dye 11gandom affinity column using a buffer containing about 0. 1X Tween. Preferably, the buffer in step b) is 25ml * 1 MES. 10mM CHAPS. lml * l EDTA. pH 4.9; the column in step c) is a S Sepharose column equilibrated in 25 µl * 1 MES, 10 ml * 1 CHAPS, 1 mM EDTA, 50 ml * 1 NaCl. pH 5.5; PAF-AH is eluted in step d) with 1 ml * 1 NaCl; The pH of the eluate in step e) is adjusted to pH 7.5 using 21 * 1 Tris-base; the column in step f) is a sepharose column; the buffer in step g) is 25 ml * 1 Tris. 10ml * 1 CHAPS. 31 * 1 NaCl. lml * l EDTA. pH 7.5 and the buffer in step h) is 25 ml * 1 Tris, 0.5 µl NaCl, 0.1X Tween 8D, pH 7.5.
Vo vynáleze je uvažovaná ešte jedna metóda purifikácie enzymaticky aktívneho PAF-AH z E. coli. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky s a) prípravu extraktu E. coli, ktorá vedie po lýze v pufri obsahujúcom CHAPS k supernatantu obsahujúcemu solubilizovariý PAF-AH; b) riedenie vyššie uvedeného supernatantu a jeho aplikáciu na anión-ionexovú kolónu ekvilibrovaného na pH okolo 8,0; c) elúciu enzýmu PAF-Ah z vyššie uvedenej anión-ionexovej kolóny; d) nanesenie vyššie uvedeného adjustovaného eluátu z vyššie uvedenej anión-ionexovej kolóny nä afinitnú kolónu obsahujúcu blue dye ligand: d) elúciu vyššie uvedenej kolóny obsahujúcej blue dye ligand pufrom obsahujúcim 3, Dl*l sol; f) zriedenie eluátu z kolóny obsahujúcej blue dye ligand do pufra vhodného pre realizáciu hydroxylapatitovej chromátografie; g) realizáciu hydroxylapatitovej chromatografie, kde je premytie a elúcia uskutoónená pomocou pufrov Cs obsahom Ci bez obsahu CHAPS); h) neriedenie hydroxylapatltového eluátu na katión-ionexovú; i) nanesenie hydroxylapatltového eluátu na vyššie uvedeného soli vhodnú pre vyššie uvedeného nariedéného katión-ionexovú kolónu pri pH koncentráciu pohybujúcom sa v rozmedzí približne 6. D až 7,0; j) elúciu PAF-AH z vyššie uvedenej katión-ionexovej kolóny vhodným pufrom s vhodným zložením; k) realizáciu katión-ionexovej chromatografie pri chlade; a 1) zloženie kvapalnej alebo zmrazenej formy PAF-AH v neprítomnosti CHAPS.Another method of purifying enzymatically active PAF-AH from E. coli is contemplated in the invention. This method comprises the following steps of a) preparing an E. coli extract which, after lysis in a buffer containing CHAPS, results in a supernatant containing solubilizable PAF-AH; b) diluting the above supernatant and applying it to an anion exchange column equilibrated to a pH of about 8.0; c) eluting the PAF-Ah enzyme from the above anion-exchange column; d) applying said adjusted eluate from said anion-exchange column to a blue dye ligand containing affinity column: d) eluting said blue dye ligand column with a buffer containing 3, D1 * 1 salt; f) diluting the eluate from the column containing the blue dye ligand to a buffer suitable for performing hydroxylapatite chromatography; g) performing hydroxylapatite chromatography, wherein the washing and elution is carried out using Cs buffers containing Ci without CHAPS); h) not diluting the hydroxylapatta eluate to a cation exchange resin; i) applying a hydroxylapatta eluate to the aforementioned salts suitable for the aforementioned diluted cation-ion exchange column at a pH in the range of about 6. D to 7.0; j) eluting PAF-AH from the above cation-exchange column with a suitable buffer of a suitable composition; k) performing cation-exchange chromatography in the cold; and 1) the composition of a liquid or frozen form of PAF-AH in the absence of CHAPS.
Najlepšie je vo vyššie uvedenom kroku: a) lyzovaci pufer iná zloženie. 25ml*l Tris. lOOmľl NaCl. lml*l EDTA. 20inľl CHAPS. pH 8,0; v kroku b) riedenie supernatantu pre anión-ionexovú chromatografiu je 3-4 krát do 25mľl Tris. Imľl EDTA, 10ml*l CHAPS. pH 8. Q a kolóna je O-Sepharosová kolóna ekvilibrovaná 25niM Tris. Imľl EDTA, 50mľl NaCl. lOmľl CHAPS, pH 8.0; v kroku c) je aniún-ionexová kolóna vymývaná s použitím 25mľl Tris. Imľl EDTA, 350mľl NaCl, lOmľl CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikovaný priamo na afiriitnú kolónu s blue dye llgandom; v kroku e) je kolóna eluovaná pufrom obsahujúcim 3ľl NaCl. lOmľl CHAPS, 25mľl Tris. pH 8.0; v kroku f) je eluát z Blue dye zriedený pre hydroxylapatitovú chromatograf iu. Eluát je zriedený lOmľl fosforečnanom sodným, lOQmľl NaCl. lOmľl CHAPS, pH 6.2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografia sprevádzaná použitím hydroxylapatitovej kolóny ekvilibrovanej lOmľl fosforečnanom sodným, lOOmľl NaCl, lOmľl CHAPS. Elúcla je uskutočňovaná s použitím 50mľl fosforečnanu sodného. lOOmľl NaCl C s Ci bez lOmľl CHAPS), pH 7.5; v kroku h) je uskutočňované neriedenie vyššie uvedeného hydroxylapa bitového eluátu pre katióri-ionexovou chromatografiou pomocou pufra s pH v rozmedzí približne 6, 0 ažPreferably, in the above step: a) the lysis buffer is a different composition. 25ml * l Tris. 100mL NaCl. lml * l EDTA. 20inch CHAPS. pH 8.0; in step b), the dilution of the supernatant for anion-exchange chromatography is 3-4 times to 25 ml of Tris. 1µl EDTA, 10ml * 1 CHAPS. pH 8. Q and column is O-Sepharose column equilibrated with 25 µM Tris. 1 µl EDTA, 50 µl NaCl. 10mL CHAPS, pH 8.0; in step c), the anion exchange column is eluted using 25 ml Tris. 1 µL EDTA, 350 µL NaCl, 10 µL CHAPS, pH 8.0; in step d), the eluate of step c) is applied directly to the blue dye 11gandom affinity column; in step e) the column is eluted with a buffer containing 3 µl of NaCl. 10ml CHAPS, 25ml Tris. pH 8.0; in step f), the blue dye eluate is diluted for hydroxylapatite chromatography. The eluate is diluted with 10 ml sodium phosphate, 10 ml ml NaCl. 10mL CHAPS, pH 6.2; in step g), hydroxylapatite chromatography is performed using a hydroxylapatite column equilibrated with 10mL sodium phosphate, 100mL NaCl, 10mL CHAPS. Elution is performed using 50 ml of sodium phosphate. 100mL NaCl C with Ci without 10mL CHAPS), pH 7.5; in step h) the dilution of the above hydroxylap bit eluate for cation-exchange chromatography is carried out with a buffer having a pH in the range of about 6.0 to
7. 0 a obsahujúcim fosforečnan sodný Cs Ci bez CHAPS); v kroku i) je kolóna s S-Sepharosou ekvllibrovanou SOmľl fosforečnanom sodným (s Ci bez lOmľl CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je elúcla uskutočnená pufrom vhodného zloženia ako napríklad SOmľl fosforečnan draselný. 12, 5mľl kys.7. 0 and containing sodium phosphate Cs (without CHAPS); in step i) the S-Sepharose column is equilibrated with SOmil 1 sodium phosphate (with Ci without 10mil CHAPS), pH 6.8; in step j), the elution is carried out with a buffer of a suitable composition, such as, for example, SO1, potassium phosphate. 12, 5ml acid.
a obsahujúceho 0,012 Tween 80;and containing 0.012 Tween 80;
katión-ionexová chromatografia pri 2-8 eC. Príkladom pre vhodné zloženie pufra použiteľného v kroku 1), ktorý stabilizuje PAF-AH je SOmľl fosforečnan draselný, 12. 5mľl kys. asparágová, 125mľl NaCl, pH približne 7.4 Cs Ci bez prídavku Tween 80 a/alebo Plurlnicu F68) alebo 25mľl fosfátový C K*) pufer obsahujúci C prinajmenšom) 125'mľl NaCl. 25mľl arglnín a 0. 012 Tween-80 C s Ci bez Pluronlcku asparágová, 125mľl NaCl. pH 7,5 v kroku k) je uskutočnenácation-ion exchange chromatography at 2-8 e C. An example for a suitable composition of the buffer usable in step 1) that stabilizes PAF-AH is SO1 / ml potassium phosphate, 12.5. aspartic, 125mL NaCl, pH about 7.4 Cs Ci without the addition of Tween 80 and / or Plurlnic F68) or 25mL phosphate buffer (C *) containing C at least 125'mL NaCl. 25 ml of arglin and 0. 012 Tween-80 C with Ci without Pluronlck aspartic, 125 ml of NaCl. The pH of 7.5 in step k) is carried out
F68 w koncentrácii približne 0. 1 a 0, 5%).F68 w at a concentration of approximately 0.1 and 0.5%).
uvedenej HIC#1 znížením koncentrácie detergentov; HIC#1 na pH okolo 6,4; g)said HIC # 1 by reducing the concentration of detergents; HIC # 1 to a pH of about 6.4; g)
Ešte jedna metóda purifikácie enzymaticky aktívneho rPAF-AH produktu £. coli je uvažovaná vo vynáleze. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky* a) prípravu extraktu E. coli, ktorá po lýze v pufri obsahujúcom Triton X-100 vedie k solubllizovanému supernatantu produktu rPAF-AH; b) nariedenie vyššie uvedeného superriatantu a jeho nanesenie na afiriitnú exchange kolónu s imobillzovaným kovom ekvilibrovanú na pH okolo 8,0; c) elúciu produktu rPAF-AH z vyššie uvedenej afinitnej exchange kolóny s imobillzovaným kovom pufrom obsahujúcim imidazol; d) úpravu koncentrácie solí a nanesenie vyššie uvedeného eluátu z afinitnej exchange kolóny s imobillzovaným kovom na hydrofóbnu kolónu Chydrophobic interaction column CHICttl); e) elúciu vyššie koncentrácie solí a/alebo zvýšením f) titráciu vyššie uvedeného eluátu z nanesenie vyššie uvedeného upraveného eluátu z HlCttl na katióri-ionexovú kolónu CCEXttl) ekvilibrovanú na pH cca 8,4; h) elúciu vyššie uvedenej CEXttl s použitím koncentrácie chloridu sodného; 1) úpravu vyššie uvedeného eluátu z CEX#1 pomocou chloridu sodného na koncentráciu okolo 2,01*1; j) nanesenie vyššie uvedeného eluátu z CEXttl na hydrofóbnu kolónu Chydrophobic iriteractiori column CHIC#2) ekvilibrovanú na pH okolo 8, 0 a koncentráciu chloridu sodného okolo 2,01*1; k) elúciu vyššie uvedenej HIC#2 znížením koncentrácie solí a/alebo zvýšením koncentrácie detergentov; 1) nariedenie vyššie uvedeného eluátu z HIC#2 a úpravu pH na hodnotu okolo 6,0; m) nanesenie vyššie uvedeného upraveného eluátu z HIC82 na katión-ionexovú kolónu CCEX#2) ekvilibrovanC na pH okolo 6,0; n) elúciu produktu rPAF-AH z vyššie uvedenej CEX#2 pufrom s vhodným zložením.Yet another method of purifying the enzymatically active rPAF-AH product δ. coli is contemplated in the invention. The method comprises the following steps * a) preparing an E. coli extract which, after lysis in a buffer containing Triton X-100, results in a solublized supernatant of the rPAF-AH product; b) diluting the above superriatant and loading it onto an immobilized metal affinity exchange column equilibrated to a pH of about 8.0; c) eluting the rPAF-AH product from the above affinity exchange column with an immobilized metal buffer containing imidazole; d) adjusting the salt concentration and loading the above eluate from the immobilized metal affinity exchange column onto a hydrophobic column (Chydrophobic interaction column (CHICtt1)); e) eluting a higher salt concentration and / or increasing f) titrating the aforesaid eluate from loading the aforesaid conditioned eluate from HCl (CCl 1) onto a cation-ion exchange column (equilibrated to a pH of about 8.4; h) eluting the above CEXtt1 using sodium chloride concentration; 1) adjusting the above eluate from CEX # 1 with sodium chloride to a concentration of about 2.01 * 1; j) loading the above eluate from CEXtt1 onto a hydrophobic column (Chydrophobic iriteractiori column CHIC # 2) equilibrated to a pH of about 8.0 and a sodium chloride concentration of about 2.01 * 1; k) eluting the above HIC # 2 by reducing the salt concentration and / or increasing the detergent concentration; 1) diluting the above eluate from HIC # 2 and adjusting the pH to about 6.0; m) loading the above treated eluate from HIC82 onto a cation-ion exchange column (CCEX # 2) equilibrated to about pH 6.0; n) eluting the rPAF-AH product from the above CEX # 2 buffer with a suitable composition.
Najlepšie je použiť vo vyššie uvedenom kroku a) lyzovací pufer 90ml*I TRIS, 0,125X Triton X-100. 0, 61*1 NaCl, pH 8. 0. Lýza je uskutočnená vo vysokotlakovom homogerilzátore; v kroku b) je supernatant nariedený ekvilibračným pufrom C 20ml*l TRIS. 0, 51*1 NaCl. 0, IX Triton X-100. pH 8,0). zinková chelátová kolóna COhelatlng Sepharose Fast Flou, Pharmacia. Uppsala. Švédsko) je nabitá a ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom. Na kolónu je nanesený neriedený supernatant a kolóna je premytá pufrom so zložením 20mľl TRIS. 0. 51*1 NaCl. 41*1 močovina, 0. IX Triton X-100. pH 8. 0 a ďalej premytý 20ml*l TRIS. 0,51*1 NaCl, 0.02% Triton X-100. pH 8.0; v kroku c) je elúcia dokonalá pomocou roztoku so zložením 20mľT Tris, 50ml*l Imidazol, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; o kroku d) je eluát upravený na lml*l EDTA a 21*1 NaCl, kolóna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow C Pharmacia) je ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom C 2. 01*1 NaCl, 25ml*l Tris, 0.02% Triton X-100, pH 8, 0) a je na ňu nanesený eluát z kroku c) pri izbovej teplote. Kolóna je premytá ekvilibračným pufrom a ďalej je premytá roztokom so zložením 25ml*l NaPO4, 0.20% Triton X-100, pH 6,5 rýchlosťou 30 cm/hod. ; v krokuIt is best to use lysis buffer 90ml * I TRIS, 0.125X Triton X-100 in step a) above. 0. 61 * 1 NaCl, pH 8. 0. The lysis is carried out in a high-pressure homogenizer; in step b), the supernatant is diluted with 20 ml * 1 TRIS equilibration buffer. 0.51 * 1 NaCl. 0, 1X Triton X-100. pH 8.0). zinc chelate column COhelatlng Sepharose Fast Flou, Pharmacia. Uppsala. Sweden) is charged and equilibrated with equilibration buffer. The undiluted supernatant is applied to the column and the column is washed with 20 ml of TRIS buffer. 0. 51 * 1 NaCl. 41 * 1 urea, 0. IX Triton X-100. pH 8.0 and further washed with 20ml * 1 TRIS. 0.51 * 1 NaCl, 0.02% Triton X-100. pH 8.0; in step c) elution is accomplished with a 20mL Tris solution, 50ml * 1 Imidazole, 0.02% Triton X-100, pH 8.0; in step d) the eluate is adjusted to 1 ml * 1 EDTA and 21 * 1 NaCl, a Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) column is equilibrated with Equilibration Buffer C 2. 01 * 1 NaCl, 25 ml * 1 Tris, 0.02% Triton X-100 pH 8.0) and the eluate of step c) is applied at room temperature. The column is washed with equilibration buffer and further washed with 25 ml * 1 NaPO 4 , 0.20% Triton X-100, pH 6.5 at a rate of 30 cm / hr. ; in step
e) je elúcia dokonalá pomocou roztoku 25ml*l NaPCLi. 3% Triton X-100, pH 6, 5; v kroku g) je kolóna ľlacro-prep High S Column (Bio-Rad Labs, Richmond. CA, USA) ekvilibrovaná ekvilibračriým pufrom (20ml*l NaPCLi, 0,02% Triton X-100, pH 6,4). Upravený eluát z kroku f) je nanesený na kolónu, premytý ekvilibračným pufrom a ďalej premytý pufrom so zložením 25ml*l NaPCL», 0,02% Triton X-100, pH 8.0; v kroku h) je elúcia dokonalá pomocou roztoku so zložením 25ml*l NaP04. 0,02% Triton X-100, 1,31*1 NaCl, pH 8,0; v kroku j) je Bakerbond Wide Póre Hi-Propyl C3 (Baker, Philipsburg, NJ) ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom (0, 02% Triton X-100, 21*1 NaCl, 25ml*l Tris, pH 8, 0) . Upravený eluát z kroku i) je nanesený pri izbovej teplote na túto kolónu, kolóna je premytá ekvilibračným pufrom a ďalej je premytá roztokom so zložením 0, 20% Triton X-100, 25mľl Tris, pH 8,0 rýchlosťou 30 cm/hod.; v kroku k) je elúcia dokonalá pri použití roztoku so zložením 10ml*l Tris, 3,0% Triton X-100. pH 8,0; v kroku 1) je neriedenie do ekvilibračného pufra (20mI*I sukcinát, 0.1% PLURONIC F68 pH 6,0); v kroku m) je kolóna SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom kroku 1) a na ňu ďalej nanesený eluát z kroku 1) kolóna je premytá ekvilibračným pufrom; a v kroku n) je elúcia dokonalá s pomocou roztoku so zložením 50ml*l NaPCl*. 0, 71*1 NaCl. 0,1% PLURONIC F68. 0.02% TUEEN 80, pH 7.5.e) elution is accomplished with 25 ml * 1 NaPCLi solution. 3% Triton X-100, pH 6.5; in step g), the illo-prep High S Column (Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA) is equilibrated with equilibration buffer (20ml * 1 NaPCLi, 0.02% Triton X-100, pH 6.4). The conditioned eluate from step f) is applied to the column, washed with equilibration buffer and further washed with a buffer of 25 ml * 1 NaPCL2, 0.02% Triton X-100, pH 8.0; in step h) elution is accomplished with a 25ml * 1 NaPO 4 solution . 0.02% Triton X-100, 1.31 * 1 NaCl, pH 8.0; in step j), Bakerbond Wide Pore Hi-Propyl C 3 (Baker, Philipsburg, NJ) is equilibrated with equilibration buffer (0.02% Triton X-100, 21 * 1 NaCl, 25ml * 1 Tris, pH 8.0). The treated eluate of step i) is applied to this column at room temperature, the column is washed with equilibration buffer and further washed with a solution of 0.20% Triton X-100, 25 ml Tris, pH 8.0 at a rate of 30 cm / h; in step k), elution was accomplished using a 10ml * 1 Tris, 3.0% Triton X-100 solution. pH 8.0; in step 1) is not diluted in equilibration buffer (20mL * succinate, 0.1% PLURONIC F68 pH 6.0); in step m) the SP Sepharose Fast Flow column (Pharmacia) is equilibrated with the equilibration buffer of step 1) and the eluate from step 1) further loaded onto it is washed with equilibration buffer; and in step n) elution is accomplished with a 50ml * 1 NaPCl * solution. 0. 71 * 1 NaCl. 0.1% PLURONIC F68. 0.02% TUEEN 80, pH 7.5.
PAF-AH produkty môžu byť získané ako izoláty z prírodných bunkových zdrojov alebo môžu byť chemicky syntetizované.PAF-AH products may be obtained as isolates from natural cell sources or may be chemically synthesized.
Prednostne sií ale produkované rekombinantnými postupmi zahrnujúcimi hostiteľské eukaryotlcké a prokaryotické bunky tohoto vynálezu. PAF-AH produkty, ktoré majú Časť alebo celú aminokyselinovú sekvenciu popísanú v SEQ ID NO t 8 sú uvažované v tomto vynáleze. Predovšetkým sú uvažované fragmenty, ktorým chýba až prvých dvanásť N-koncových aminokyselín ľudských aminokyselinových sekvencii PAF-AH, ktoré sú popísané v SEO ID NO:8. Prednostne tie, ktoré majú ako IniciaCnú N-koncovú aminokyselinu l*let4&> Ala47 alebo Ala4a SEO ID NO: 8. Uvažované sú tiež fragmenty tohoto, ktorým chýba až tridsať C-koncových aminokyselín aminokyselinovej sekvencie SEO ID NO: 8, predovšetkým tie, ktoré majú a Leu431 ako C-koncový zvyšok. Uvažované sú ďalej obmeny PAF-AH alebo PAF-AH alebo tie, ktoré majú v sekvencii SEO ID NO: 8 nahradenú aminoskupinu a ktoré sú vybrané zo skupiny zloženej z S 108 A, S 273 A. D 286 A,Preferably, however, they are produced by recombinant procedures involving the host eukaryotic and prokaryotic cells of the invention. PAF-AH products having part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 are contemplated in the present invention. In particular, fragments that lack up to the first twelve N-terminal amino acids of the human PAF-AH amino acid sequences described in SEO ID NO: 8 are contemplated. Preferably, those having the Initial N-terminal amino acid 1 * let 4 > Ala 47 or Ala 4a SEO ID NO: 8. Also contemplated are fragments of this lacking up to thirty C-terminal amino acids of the amino acid sequence of SEO ID NO: 8, particularly those having a Leu 431 as the C-terminal residue. Also contemplated are variants of PAF-AH or PAF-AH, or those having an amino group replaced in the sequence of SEO ID NO: 8 and selected from the group consisting of S108A, S273A.
D 286 N. D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A. H 399 A. C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S. C 407 S, D 286 A, D 286 N a D 304 A. Ako je poznamenané vyššie, sú polynukleotidy (vrátane DNA) kódujúce takéto fragmenty alebo obmeny fragmentov zaistené vynálezom. Vynálezom sú zaistené tiež spôsoby rekombinantnej produkcie týchto fragmentov alebo obmien pestovaním hostiteľských buniek obsahujúcich takéto DNA. SúCasne uprednostňované PAF-AH produkty zahrnujú prokaryotické polypeptldové expresné produkty DNA kódujúce amiriokyselinové zvyšky l*let4á až Asn44t SEO ID NO: 8 oznaCované ako rPH.2 a prokaryotické polypeptldové expresné produkty DNA kódujúce aminokysellnové zvyšky l*let4<*, až Ile429 SEO ID NO: 8 oznaCované ako rPH.9. Obidva produkty rPH.2 a rPH.9) vykazujú nižšiu aminokoncovú heterogénnosť ako. napríklad, zodpovedajúce prokaryotické polypeptldové expresné produkty DNA kódujúce celú sekvenciu PAF-AH s predchádzajúcich translačným iniciaCným kodónom. Okrem toho rPH.9 vykazuje vyššiu karboxykoncovú homogenitu (konzistenciu). Použitie cicavčích hostiteľských buniek je predpokladané, aby boli zaistené také posttranslaCné modifikácie (napr. myrlstolácla. glykozylácla, skrátenie, llpldácla a tyrozín-. serín- a treoninfosforylácia), ktoré môžu byť potrebné pre udelenie optimálnej biologickej aktivity rekomblnantných expresných produktov vynálezu. PAF-AH produkty popísané vo vynáleze môžu mať plnú dĺžku, mOžu tô byť fragmenty alebo obmeny. Obmeny mOžu obsahovať PAF-AH analúgy, kde je jedna alebo viac špecifikovaných Criapr. prirodzene kódovaných) aminokyselín vybraných alebo nahradených alebo kde je jedna alebo viac nešpecifikovaných aminokyselín pridaných 1) bez straty jednej alebo viacerých enzymatických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre PAF-AH alebo 2) so špecifickou neschopnosťou konkrétnej biologickej aktivity PAF-AH. Proteíny alebo ďalšie molekuly, ktoré sa viažu na PAF-AH, môžu byť použité na moduláciu jej aktivity.D 286 N. D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A. H 399 A. C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S. C 407 S, D 286 A, D 286 N and D 304 A. As noted above, polynucleotides (including DNA) encoding such fragments or fragment variations are provided by the invention. Also provided by the invention are methods of recombinantly producing these fragments or variations by growing host cells containing such DNA. At the same time preferred PAF-AH products include the prokaryotic polypeptldové expression products of DNA encoding residues amiriokyselinové L * 4 a to let Asn 44 tons SEQ ID NO: 8, and rPH.2 called polypeptldové prokaryotic expression products of DNA encoding of amino acid residues L * 4 years <*, and Ile 42 9 SEO ID NO: 8 RPH.9. Both rPH.2 and rPH.9) exhibit lower amino terminal heterogeneity than. for example, the corresponding prokaryotic polypeptide expression products of DNA encoding the entire sequence of PAF-AH with the preceding translational initiation codon. In addition, rPH.9 exhibits higher carboxy-terminal homogeneity (consistency). The use of mammalian host cells is contemplated to provide for such posttranslational modifications (e.g., myristal, glycosylation, truncation, human and tyrosine-, serine- and threonine phosphorylation) that may be required to confer optimal biological activity of the recombinant expression products of the invention. The PAF-AH products described herein may be full length, may be fragments or variations. Variants may include PAF-AH analogues where one or more Criapr is specified. naturally encoded) amino acids selected or replaced or wherein one or more unspecified amino acids are added 1) without losing one or more PAF-AH-specific enzymatic activities or immunological characteristics, or 2) with a specific inability to a particular PAF-AH biological activity. Proteins or other molecules that bind to PAF-AH can be used to modulate its activity.
V predkladanom vynáleze sú tiež uvažované protilátkové substancie (napr. monoklonálne a polyklonálne protilátky, jedrioreťazcové protilátky, chimerické protilátky, CDR vrúbľované protilátky a pod.) a ďalšie väzbové proteíny špecifické pre PAF-AH. Konkrétne demonštratívne väzbové proteíny vynálezu sú monoklonálne protilátky produkované hybridómami 90G11D a 90F2D, ktoré bolí uložené v American Type Culture Collection CATCC), 12301. Parklawn Drive, Rockville, l*ID 20852, 30 septembra 1994 a boli im pridelené Accession Nos. HB 11724 a HB 11725. Ďalší demonštratívny väzbový proteín vynálezu je monoklonálna protilátka produkovaná hybridórnoin 143A, ktorý bol uložený v ATCCAlso contemplated by the present invention are antibody substances (e.g., monoclonal and polyclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies, CDR grafted antibodies, and the like) and other PAF-AH-specific binding proteins. In particular, the demonstrative binding proteins of the invention are monoclonal antibodies produced by the hybridomas 90G11D and 90F2D, which have been deposited in the American Type Culture Collection (CCCC), 12301. Parklawn Drive, Rockville, IN ID 20852, Sep. 30, 1994 and assigned Accession Nos. HB 11724 and HB 11725. Another demonstrative binding protein of the invention is a monoclonal antibody produced by hybridoma 143A, which has been deposited in the ATCC
1. júna 1995 a jemu pridelené Accession No. je HB 11900. Proteíny alebo iné molekuly Cnapr. lipidy alebo malé molekuly), ktoré sa špecificky viažu na PAF-AH mOžu byť identifikované použitím PAF-AH izolovanej z plazmy, rekombinaritného PAF-AH, obmien PAF-AH alebo buniek expriinujúcich takéto produkty. Väzbové proteiny sú použiteľné následne v zmesiach pre imunlzáciu a tiež pre purifikáciu PAF-AH. Sú tiež použiteľné ria detekciu alebo kvantifikáciu PAF-AH v tekutinách a tkanivových vzorkách pomocou známych imunologických postupov. Uvažované sú tiež antlidlotypické protilátky špecifické pre PAF-AH špecifické protilátkové substancie.1 June 1995 and assigned to him by Accession No. is HB 11900. Proteins or other molecules of Cnapr. lipids or small molecules) that specifically bind to PAF-AH can be identified using plasma-isolated PAF-AH, recombinant PAF-AH, variants of PAF-AH, or cells expressing such products. The binding proteins are subsequently useful in compositions for immunization as well as for purification of PAF-AH. They are also useful for detecting or quantifying PAF-AH in fluids and tissue samples using known immunological techniques. Antlidlotypic antibodies specific for PAF-AH specific antibody substances are also contemplated.
Vedecká hodnota Informácií poskytnutých cez odhalenie DNA a amlnokyselinové sekvencie predkladaným vynálezom je zrejmá. Jedna zo série príkladovt znalosť sekvencie cDNA pre PAF-AH umožňuje pri použití hybridizácií DNA/DNA izoláciu genómových DNA sekvencii kódujúcich PAF-AH a špecifikáciu PAF-AH expresných kontrolných regulačných sekvencii, ako sú promótory, operátory a pod. Postupy DNA/DNA hybridizácií uskutočňovaných so sekvenciami DNA vynálezu pri štandardných podmienkach stringencie takisto zrejme dovolia Izoláciu DNA kódujúcich alelické varienty PAF-AH, ďalších štruktúrne príbuzných proteínov. ktoré majú spoločné jednu alebo viac biochemických a/alebo imunologických vlastností PAF-AH a tiež proteínových homológov PAF-AH z iných (ako ľudských) zdrojov. DNA sekvenčné informácie predkladaným vynálezom dovoľujú tiež pomocou alebo knockout stratégií (pozri napr. Kapecchi,The scientific value of the information provided through the disclosure of the DNA and amino acid sequence of the present invention is apparent. One of a series of examples of knowledge of the cDNA sequence for PAF-AH allows the use of DNA / DNA hybridizations to isolate genomic DNA sequences encoding PAF-AH and to specify PAF-AH expression control regulatory sequences such as promoters, operators, and the like. DNA / DNA hybridization procedures performed with the DNA sequences of the invention under standard stringency conditions also seem to permit isolation of DNA encoding allelic variants of PAF-AH, other structurally related proteins. which share one or more of the biochemical and / or immunological properties of PAF-AH as well as protein homologues of PAF-AH from non-human sources. The DNA sequence information of the present invention also permits using or knockout strategies (see, e.g., Kapecchi,
1288-1292 (1989)), vývoj hlodavcov, ktoré nevedia exprimovať funkčný enzým PAF-AH alebo exprimovať obmenu PAF-AH enzýmu. Vhodne označené polyriukleotidy popísané vo vynáleze sú použiteľné pri hybridizačných testoch na detekciu kapacity buniek syntetizovať PAF-AH. Polynukleotidy popísané vo vynáleze môžu byť tiež základom diagnostických metód užitočných pri identifikácii a genetických úpravách v PAF-AH centre, ktoré vyzdvihuje stav alebo stavy choroby. Dostupné robí vynález tiež antisence polynukleotidy, významné pri regulácii expresie PAF-AH tými bunkami, ktoré zvyčajne epxrlmujú to isté.1288-1292 (1989)), the development of rodents that are unable to express a functional PAF-AH enzyme or express a variant of the PAF-AH enzyme. The suitably labeled polyriucleotides described herein are useful in hybridization assays to detect the capacity of cells to synthesize PAF-AH. The polynucleotides described in the invention may also form the basis of diagnostic methods useful in the identification and genetic engineering of a PAF-AH center that highlights a disease state or conditions. The invention also makes available antisense polynucleotides important in regulating the expression of PAF-AH by those cells that usually epxrlmme the same.
poskytované homológnych rekombiriácií Science. 244provided by homologous recombinations Science. 244
Je uvažované podávanie preparátov PAF-AH vynálezu cicavčím subjektom, predovšetkým ľuďom s cieľom ameliorácie patologických zápalových stavov. Na základe dOkazov o zapojení PAF v patologických zápalových stavoch je podávanie PAF-AH indikované napr. pri ošetrení astmy (ľliwa et al.. J. Clin Invest.. 82« 1983-1991 (1988)s Hsieh et al., J. Allergy Clin. ľmmunol.. 91« 650-657 (1993)s a Yamashída et al.. Allergy. 49« 60-63 (1994)), anafylaxie (Venable et al., pozri vyššie), šoku (Venable et al.. pozri vyššie), reperfúzneho poranenia a ischémie centrálneho nervového systému (Lindsberg et al. (1991), pozri vyššie), antigénmi vyvolanej artritídy (Zarco et al.. Clin. Exp. ľmmunol.. 88« 318-323 (1992)). aterogenézy (Handley et al., Drug Dev. Res.. 7« 361-375 (1986)) Crohňovéj choroby (Denlzot et al.. Dlgestive Diseases and Sciences, 37(3)« 432-437 (1982)). ischemickej nekrózy čreva/nekrotizujúcej enterokolitídy (Denizot et al., pozri vyššie a Caplan et al.. Acta Paediatr., Suppl. 396, 11-17 (1994)), ulceróznej kolltídy (Denizot et al., pozri vyššie), ischemickej mozgovej príhody (Satori et al., Stroke 23: 1090-1092 (1992)), ischemického poranenia mozgu (Llndsberg et al., Stroke, 21« 1452-1457 (1990) a Llndsberg et al., (1991), pozri vyššie), systémového lupus erythematosus (Matsizaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139-144 (1992)), akútnej parikreatitidy (Kald et al., Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)), otravy krvi (Kald et al., pozri vyššie), akútnej poststreptokokovej gloinerulonefritídy (Mezzario et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993), pľúcneho otoku ako rekcie na liečenie IL-2 (Rablriovici et al., J. Clin. InvesL., 89« 1669-1673 (1992)). alergického zápalu (Watanabe et al.. Br. J. Pharmacol., 111: 123-130 (1994)), ischemického zlyhania obličiek (Grino ela., Annals of Interná! ľleddclrie , 121(5): 345-347 (1994)), predčasného pôrodu (Hoffman et. al.. AM. J. Obstet. Gynecol.. 162(2): 525-528 (1990) a Makl. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 728-732 (1988)), syndrómu respiračnéj nedostatočnosti dospelých (Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74(4): 1791-1802 (1993). Matsuinoto et al.. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19: 509-515 (1992) a Rodriguez-Roisin et al.. J. Clin Invest., 93: 188-194 (1994). Použitie PAF-AH prípravkov na ošetrenie HIV infekcie centrálneho nervového systému je tiež vo vynáleze uvažované. Ošetrenie, ako je tu používané, zahrnuje ako profylaktické tak aj terapeutické ošetrenie.Administration of the PAF-AH preparations of the invention to mammalian subjects, particularly humans, for the purpose of ameliorating pathological inflammatory conditions is contemplated. Based on evidence of PAF involvement in pathological inflammatory conditions, administration of PAF-AH is indicated e.g. in the treatment of asthma (Liwa et al., J. Clin Invest. 82, 1983-1991 (1988) with Hsieh et al., J. Allergy Clin., Immunol., 91, 650-657 (1993), Yamashida et al. Allergy., 49, 60-63 (1994)), anaphylaxis (Venable et al., Supra), shock (Venable et al. Supra), reperfusion injury and central nervous system ischemia (Lindsberg et al. (1991) , supra), antigen-induced arthritis (Zarco et al., Clin. Exp. Immunol. 88: 318-323 (1992)). atherogenesis (Handley et al., Drug Dev. Res. 7: 361-375 (1986)) Crohn's Disease (Denlzot et al., Dgestive Diseases and Sciences, 37 (3), 432-437 (1982)). ischemic intestinal necrosis / necrotizing enterocolitis (Denizot et al., supra and Caplan et al., Acta Paediatr., Suppl. 396, 11-17 (1994)), ulcerative colitis (Denizot et al., supra), ischemic cerebral episodes (Satori et al., Stroke 23: 1090-1092 (1992)), ischemic brain injury (Llndsberg et al., Stroke, 21, 1452-1457 (1990) and Llndsberg et al. (1991), supra) systemic lupus erythematosus (Matsizaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139-144 (1992)), acute paricreatitis (Kald et al., Pancreas, 8 (4): 440-442 (1993)), blood poisoning ( Kald et al., Supra), acute post-streptococcal gloinerulonephritis (Mezzario et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993)), pulmonary edema in response to IL-2 treatment (Rablriovici et al. , J. Clin. InvesL., 89 (1669-1673 (1992)), allergic inflammation (Watanabe et al., Br. J. Pharmacol., 111: 123-130 (1994)), ischemic renal failure (Grino ela. , Annals of Internal! Leddclrie, 121 ( 5): 345-347 (1994)), premature labor (Hoffman et. al .. AM. J. Obstet. Gynecol. 162 (2): 525-528 (1990) and Makl. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 728-732 (1988)), adult respiratory insufficiency syndrome (Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74 (4): 1791-1802 (1993). Matsuinoto et al. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19: 509-515 (1992) and Rodriguez-Roisin et al., J. Clin Invest., 93: 188-194 (1994) .The use of PAF-AH formulations for the treatment of HIV central nervous system infection is also The treatment as used herein includes both prophylactic and therapeutic treatments.
Pre mnohé z predtým uvedených patologických stavov bol popísaný pokusný zvierací model. Napríklad myšací model pre astmu a rinitídu je popísaný v príklade 16 tohoto dokumentu; králičí model pre artritídu je popísaný v Zarco et al., pozri vyššie; potkanie modely pre ischemickú nekrózu Čriev/nekrotizujúcu enterokolltldu sú popísané v Furukaua et al., Ped. Res., 34(2): 237-241 (1993) a Caplan et al., pozri vyššie; králičí model pre mŕtvicu je popísaný v Llndsberg et al., (1990), pozri vyššie; myšací model pre lupus je popísaný v Matsuzakí et al., pozri vyššie; potkaní model pre akútnu pankreatitídu je popísaný v Kald et al.. pozri vyššie; potkan! model pre opuch pľúc ako výsledok terapie IL-2 je popísaný v Rabinovici eL al., pozri vyššie; potkan! model alergického zápalu je popísaný v Uatanable et al.. pozri vyššie; psí model pre obličkový alolmplantát je popísaný vo Uatson et al.. Transplantatiori, 56(4)« 1047-1049 (1993) a potkanie a morčacie modely syndrómu respiračnej nedostatočnosti dospelých sú samostatne popísané v Rabinovici et al., pozri vyššie a Lellouch-Tubiana, Am. Rev. Respir. Dis.. 137« 948-954 C1988).For many of the aforementioned pathological conditions, an experimental animal model has been described. For example, a mouse model for asthma and rhinitis is described in Example 16 of this document; a rabbit model for arthritis is described in Zarco et al., supra; rat models for intestinal ischemic necrosis / necrotizing enterocollosis are described in Furukaua et al., Ped. Res., 34 (2): 237-241 (1993) and Caplan et al., Supra; the rabbit stroke model is described in Lndsberg et al., (1990), supra; the mouse model for lupus is described in Matsuzaki et al., supra; the rat model for acute pancreatitis is described in Kald et al., supra; rat! the model for pulmonary edema as a result of IL-2 therapy is described in Rabinovici et al., supra; rat! the allergic inflammatory model is described in Uatanable et al., supra; a canine model for kidney allograft is described in Uatson et al. Transplantatiori, 56 (4) «1047-1049 (1993) and rat and guinea pig models of adult respiratory distress syndrome are separately described in Rabinovici et al., supra and Lellouch-Tubiana. , Am. Rev. Respir. Dis. 137 (948-954, C1988).
Mimoriadne uvažované sú vo vynáleze zmesi PAF-AH použiteľné pri metóde ošetrenia cicavcov ľahko podliehajúcich alebo trpiacich patologickými stavmi spôsobenými PAF. Takéto ošetrenie zahrnuje podávanie PAF-AH cicavcom v množstvách dostatočných pre doplnenie endogénnej aktivity PAF-AH a pre inaktlváciu patologických množstiev PAF u týchto cicavcov.Particularly contemplated in the invention are PAF-AH compositions useful in a method of treating a mammal which is readily subject to or suffering from a pathological condition caused by PAF. Such treatment comprises administering PAF-AH to the mammal in amounts sufficient to complement the endogenous activity of PAF-AH and to inactivate pathological levels of PAF in the mammal.
Terapeuticko-farmakologická zmes uvažovaná vo vynáleze zahrnuje PAF-AH produkty a fyziologicky akceptovateľné riedidlá alebo nosiče. l*IQže tiež zahrnovať ďalšie látky majúce protizápalové účinky. Indikované množstvo dávky by bolo dostatočné pre doplnenie endogénnej aktivity PAF-AH a inaktlváciu patologických množstiev PAF. Na všeobecnú úvahu o dávkach pozri Remmingtori's Pharmaceutical Sciences, 18tH Editlon. Plack Publishing Co.. Easton, PA (1990). Dávky sa budú pohybovať medzi 0.1 až asi 100 ug PAF-AH/kg telesnej hmotnosti. Terapeutické zmesi vynálezu môžu byť podávané rôznymi cestami v závislosti od patologických stavov, ktoré majú byť liečené. Podávanie môže byť napríklad intravenózne, subkutánne, orálne. vo forme čaplkov a/alebo pľúcnymi cestami.The therapeutic-pharmacological composition contemplated by the invention includes PAF-AH products and physiologically acceptable diluents or carriers. It may also include other substances having anti-inflammatory effects. The indicated dose amount would be sufficient to complement the endogenous activity of PAF-AH and to inactivate pathological amounts of PAF. For general consideration of dosages, see Remmingtori's Pharmaceutical Sciences, 18 tH Editlon. Plack Publishing Co., Easton, PA (1990). Dosages will range between 0.1 to about 100 µg PAF-AH / kg body weight. The therapeutic compositions of the invention may be administered by various routes depending on the pathological conditions to be treated. Administration can be, for example, intravenously, subcutaneously, orally. in the form of suppositories and / or pulmonary pathways.
V prípade patologických stavov pľúc. je podávanie PAF-AH pľúcnymi cestami prednostne Indikované. Pri pulmonálnom podávaní je zvažované široké spektrum doručovaclch zariadení bežné pre tieto ciele. napr. nebulizéry, inhalátory s meraním a práškové Inhalátory. Doručenie rôznych proteínov do pľúc a obehového systému Inhaláciou aerosólových zmesi bolo popísané v Adjel et al., Pharm. Res.. 7(6)s 565-569 (1990) (leuprolide acetat); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13(Supp.5)< s. 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicíne. ΙΓΓ(3). 206-212 (1989) (cŕl-antitrypsin) s Smith et al., J. Clin Invest., 84s 1145-1146 (1989) («ŕ-l-proteinase Inhibltor); Debs et al., J. Immunol., 140« 3482-3488 (1993) (rekombinanntý gamainterferún a tumorový nekrotický faktor alfa); Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publication No. UO 94/20069 publikovaný 15. septembra 1994 (rekombinant pegylated granulocyte colony stimulating factor).In the case of pathological lung conditions. administration of PAF-AH by the pulmonary route is preferably indicated. For pulmonary administration, a wide variety of delivery devices are contemplated for these purposes. e.g. nebulizers, measuring inhalers and powder inhalers. Delivery of Various Proteins to the Lung and Circulatory System Inhalation of aerosol mixtures has been described in Adjel et al., Pharm. Res. 7 (6): 565-569 (1990) (leuprolide acetate); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13 (Supp.5) <p. 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine. ΙΓΓ (3). 206-212 (1989) (? -Antitrypsin) with Smith et al., J. Clin Invest., 84s 1145-1146 (1989) (? -1-proteinase Inhibitor); Debs et al., J. Immunol., 140, pp. 3482-3488 (1993) (recombinant gamain-terferin and tumor necrosis factor alpha); Patent Cooperation Treaty (PCT) US 94/20069 published September 15, 1994 (recombinant pegylated granulocyte colony stimulating factor).
Popíš obrázkov na výkresochDescribe the figures in the drawings
Množstvo ďalších stránok a výhod predkladaného vynálezu bude zrejmé po zvážení nasledujúcich detailných vysvetlení, v ktorých bude odkazované na obrázky, kde je sA number of other aspects and advantages of the present invention will be apparent from the following detailed explanations in which reference will be made to the drawings in which:
Obr. ls Fotografia PVDF membrány obsahujúcej PAF-AH purifikovariý z ľudskej plazmy.Fig. 1s A photograph of a PVDF membrane containing PAF-AH purified from human plasma.
Obr. 2s Graf ukazujúci erizymatlckú aktivitu rekombinantnej ľudskej plazmovej PAF-AH.Fig. 2s Graph showing the erizymatic activity of recombinant human plasma PAF-AH.
Obr. 3s Schematický nákres znázorňujúci rekombinantná fragmenty PAF-AH a ich katalytické aktivity.Fig. 3s Schematic drawing showing recombinant fragments of PAF-AH and their catalytic activities.
Obr. 4« Hmotriostná spektroskopia rPH.2 produktu PAF-AH.Fig. 4 - Mass spectroscopy of rPH.2 of PAF-AH.
Obr. 5« Hinotnostná spektroskopia rPH.9 produktu PAF-AH.Fig. 5 ' RPH.9 spectroscopy of PAF-AH.
rek ombinantného rekombinantnéhorecombinant ombinant recombinant
Obr. 6: Stĺpcový graf ilustrujúci blokádu edému nohy potkana vyvolaného PAF lokálne podaným rekombinantným PAF-AH tohoto vynálezu.Fig. 6: Bar graph illustrating blockade of PAF-induced rat foot edema by locally administered recombinant PAF-AH of the invention.
Obr. 7« Stĺpcový graf ilustrujúci blokádu edému nohy potkana vyvolaného PAF intravenózne podaným rekombinantným PAF-AH.Fig. 7 Bar graph illustrating blockade of PAF-induced rat foot edema by intravenously administered recombinant PAF-AH.
Obr. 8s Stĺpcový graf znázorňujúci, že PAF-AH blokuje edém vyvolaný PAF, ale nie edém vyvolaný zymosanom A.Fig. 8s Bar graph showing that PAF-AH blocks PAF-induced edema, but not zymosan A-induced edema.
Obr. 9A a 9Bs Aritizápalová aktivita PAF-AH v prípade edému nohy potkana - závisiasĽ od veľkosti dávky.Fig. 9A and 9Bs Dose-dependent arithi-inflammatory activity of PAF-AH in rat foot edema.
Obr. 10A a 10B: Časová závislosť In vivo účinnosti jednej dávky PAF-AH.Fig. 10A and 10B: In vivo Time Dependence of Single Dose PAF-AH.
Obr. 11: Čiarový graf znázorňujúci farmakokinetiky PAF-AH v krvnom obehu potkana.Fig. 11: Line graph showing the pharmacokinetics of PAF-AH in rat bloodstream.
Obr. 12: Stĺpcový graf znázorňujúci problzápalové účinky PAF-AH v porovnaní s nižším účinkom antagonlstov PAF v prípade edému nohy potkana.Fig. 12: Bar graph showing the inflammatory effects of PAF-AH compared to the lower effect of PAF antagonists in rat foot edema.
Obr. 13: Znázornenie výsledkov indikujúcich, že PAF-AH neutralizuje apoptické účinky média z HIV-1 infikovaných a aktivovaných monocytov.Fig. 13: Representation of results indicating that PAF-AH neutralizes the apoptotic effects of medium from HIV-1 infected and activated monocytes.
Príklady realizácie vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Nasledujúce uvedené príklady slúžia na ilustráciu vynálezu.The following examples serve to illustrate the invention.
Príklad 1 uvádza novú metódu purifikácie PAF-AH z ľudskej plazmy. Príklad 2 popisuje mikrosekvencovanie amlnokyselinových zvyškov PAF-AH purifikovaného z ľudskej plazmy. V Príklade 3 je popísané klonovanie cDNA celého génu Cfull lenth cDNA) kódujúceho ľudský plazmatický PAF-AH. V Príklade 4 sú popísané rOzne varianty zloženia génu kódujúceho ľudský plazmatický PAF-AH. Klonovanie génových sekvencli kódujúcich ľudský plazmatický PAF-AH je popísané v Príklade 5. Príklad 6 popisuje klonovanie homológov cDNA pre ľudský plazmatický PAF-AH pre psie. myšacie, hovädzie, kuracie, hlodavčle cDNA a cDNA z makaka. V Príklade 7 sú popísané výsledky testu dokazujúceho enzymatíckú aktivitu rekomblnantnéhoExample 1 discloses a new method for purifying PAF-AH from human plasma. Example 2 describes the microsquencing of amino acid residues of PAF-AH purified from human plasma. Example 3 describes the cloning of the cDNA of the entire Cfull lenth gene (cDNA) encoding human plasma PAF-AH. In Example 4, various variants of the composition of the gene encoding human plasma PAF-AH are described. Cloning of gene sequences encoding human plasma PAF-AH is described in Example 5. Example 6 describes cloning of cDNA homologs for human plasma PAF-AH for canine. mouse, bovine, chicken, rodent and cynomolgus cDNAs. Example 7 describes the results of a test demonstrating recombinant enzyme activity
PAF-AH transientne exprimovaného w bunkách COS 7. Príklad 8 popisuje expreslu DNA reprezentujúcu kloň s plnou dĺžkou DNA, skrátenú DNA a a chinierické DNA pre ľudský PAF-AH v E. coli, S. cerevisiae a cicavčích bunkách. Príklad 9 uvádza protokol purifikácie rekombínantného PAF-AH z E. coli a testy potvrdzujúce Jeho enzymatlckú aktivitu. Príklad 10 popisuje rôzne rekombinantné produkty pre PAF-AH vrátane analógov vzniknutých substitúciou aminokyselinových zvySkov a produktov vzniknutých amino a karboxykoneoch. Ďalej je tu popísaný pokus že natívny PAF-AH izolovaný z plazmy je Výsledky analýz uskutočnených pomocou Northern skrátením na dokazujúci, glykozylovaný.PAF-AH transiently expressed in COS 7 cells. Example 8 describes the expression of DNA representing a full-length DNA strand, truncated DNA, and and chimeric DNA for human PAF-AH in E. coli, S. cerevisiae, and mammalian cells. Example 9 sets forth a protocol for the purification of recombinant PAF-AH from E. coli and assays confirming its enzymatic activity. Example 10 describes various recombinant products for PAF-AH including amino acid residue analogues and amino and carboxykone-derived products. Further, there is described an experiment that native PAF-AH isolated from plasma is the result of Northern truncation analyzes to prove glycosylated.
blotu na dôkaz expresie ľudskej plazmatickej PAF-AH RNA v rôznych tkanivách a bunkových líniách sú prezentované v Príklade 11. zatiaľ čo výsledky hybridizácie in situ sú uvedené v Príklade 12. Príklad 13 popisuje vývoj monoklonálnych a polyklonálnych protilátok Špecifických pre ľudský plazmatický PAF-AH. Príkladyblots to demonstrate the expression of human plasma PAF-AH RNA in various tissues and cell lines are presented in Example 11. whereas the results of in situ hybridization are presented in Example 12. Example 13 describes the development of monoclonal and polyclonal antibodies specific for human plasma PAF-AH. Examples
14. 15, 16, 17. 18 a 19 popisujú ria zvieracích modeloch in vivo terapeutické vplyvy podávania rekombinaritných produktov PAF-AH podľa vynálezu na akútne zápaly; zápal pohrudnice, astmu, nekrotizujúcu enterokolitídu (črevný katarj, syndróm dychovej nedostatočnosti dospelých a parikreatitídu. Príklad 20 popisuje in vitro vplyv rekombínantného produktu PAF-AH na neurotoxlcitu spojenú s infekciou HIV. Príklad 21 ukazuje výsledky imunologického vySetrenia séra ľudských pacientov vykazujúcich deficiericiu v aktivite PAF-AH a popisuje identifikáciu genetických porúch u pacientov, ktoré sú zrejmé zodpovedné za túto nedostatočnosť.14, 15, 16, 17, 18 and 19 describe in vivo animal models the therapeutic effects of administration of recombinant PAF-AH products of the invention on acute inflammation; pleural inflammation, asthma, necrotizing enterocolitis (intestinal catarrh, adult respiratory distress syndrome, and paricreatitis. Example 20 describes the in vitro effect of recombinant PAF-AH product on HIV-associated neurotoxicity. Example 21 shows the results of immunoassay examinations in human sera deficiency patients -AH and describes the identification of genetic disorders in patients that are obviously responsible for this deficiency.
Príklad 1Example 1
S cieľom získania materiálu pre aminokyselinovú sekvenáciu ľudského plazmatického PAF-AH bola uskutočnená purlfikácla.Purification was performed to obtain material for the amino acid sequence of human plasma PAF-AH.
A. Optimalizácia purlflkačných podmienokA. Optimization of Purification Conditions
Najprv sa z plazmy odstránili lipoproteínové častice s nízkou hustotou (lou denslty llpoprotein - LDL5 a to pomocou precipltácle fosovolfrámanom z plazmy a následnou solublllzáclou v 0, IX Tween 20. Ďalej nasledovala chromatografla na stĺpci DEAE CPharmacia, Uppsala, Sueden) postupom popísaným Stafforinim a ďalšími C1987), pozri vyššie, ale nekonzistentná elúcia aktivity PAF-AH zo stĺpca DEAE si vyžiadala prehodnotenie solubilizácie a následných podmienok purifikácie.First, low-density lipoprotein particles (LDL5 lipoprotein-LDL5) were removed from the plasma by preciprocating plasma phosphovate, followed by solubilization in 0, 1X Tween 20, followed by DEAE CPharmacia column chromatography, Upforala, Suffen, Sueden and others. C1987), see above, but inconsistent elution of PAF-AH activity from the DEAE column required re-evaluation of solubilization and subsequent purification conditions.
Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) a oktylglukozid boli hodnotené v použitých centrifugačných metódach a gélovej filtračnej chromatografii na svoju schopnosť solubllizovať častice LDL. CHAPS vykázal o 25X väčšiu návratnosť aktivity v rozpustnej frakcii ako Tween 20 a o 300 X väčší výťažok aktivity ako oktylglukozid. Precipltát LDL solubilizovaný lOmM CHAPS sa potom delil na stĺpci DEAE Sepharosy Fast Flcw (je to stĺpec aniónového meniča; Pharmacia) pomocou pufra obsahujúceho linľlTween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) and octyl glucoside were evaluated in centrifugation methods and gel filtration chromatography used for their ability to solublize LDL particles. CHAPS showed a 25X greater activity recovery in the soluble fraction than Tween 20 and a 300X greater activity yield than octylglucoside. The LDL precipate solubilized with 10 mM CHAPS was then separated on a DEAE Sepharose Fast Flcw column (an anion exchange column; Pharmacia) using a buffer containing linol.
CHAPS. Tak sa získalo veľké PAF-AH CDEAE pool). ktoré stĺpcov.CHAPS. This gave a large PAF-AH CDEAE pool). which columns.
množstvo čiastočne nečisteného slúžilo na hodnotenie ďalšíchthe amount of partially uncleaned was used to evaluate others
DEAE pool bol použitý ako štartovný materiál na testovanie ďalších rôznych chromatografických stĺpcov, ktoré boli použité pre ďalšie čistenie aktivity PAF-AH. Medzi testovanými stĺpcami boli x Blue Sepharose Fast Flou CPharmacia), stĺpec pre afinitnú chromatografiu s farebným llgandom; S-Sepharose Fast Flou (Pharmacia), katlónový menič; Cu Chelatiríg Sepharose (Pharmacia), stĺpec pre afinitnú chromatografiu využívajúci kovové Ugandy; Fractogel S (EM Separations, Gibbstoun. NJ), katlónový menič a Sephaacryl -200 (Pharmacia), stĺpec pre gélovú filtráciu. Všetky tieto chromatografické postupy však priniesli len nízky stupeň riačlstenla, ak sa použil chromatografia na Sephacryle lmM CHAPS. Následná gélováThe DEAE pool was used as a starting material to test other different chromatographic columns that were used to further purify the PAF-AH activity. Among the columns tested were x Blue Sepharose Fast Flou (coloring), an affinity chromatography column with color 11gand; S-Sepharose Fast Flou (Pharmacia); Cu Chelatirig Sepharose (Pharmacia), affinity chromatography column using metal Uganda; Fractogel S (EM Separations, Gibbstoun. NJ), a cation exchanger and Sephaacryl -200 (Pharmacia), gel filtration column. However, all these chromatographic procedures yielded only a low degree of dilution when Sephacryle 1mM CHAPS chromatography was used. Subsequent gel
S-200 v lmM CHAPS poskytla enzymatlcky aktívnu frakciu, ktorá sa však vymývala zo stĺpca vo väčšom rozsahu veľkostí, ako bola predpokladaná veľkosť zodpovedajúca približne 44 kDa. Z tohoto zistenia vyplýva záver, že LDL proteíny sú v roztoku agregované.S-200 in 1mM CHAPS gave an enzymatically active fraction, but eluted from the column over a larger size range than predicted size of approximately 44 kDa. This finding suggests that LDL proteins are aggregated in solution.
Rôzne vzorky LDL sa preto hodnotili pomocou analytickej gélovej filtrácie, kedy sa hodnotil stupeň agregácie a jeo vplyv na aktivitu PAF-AH. Vzorky z DEAE poolu a Čerstvo rozpustené LDL precipitáty sa analyzovali na stĺpci Superose 12 (Pharmacia) ekvilibrovanom pufrom s lmľl CHAPS. Obidve vzorky sa eluovall zo stĺpca v Širokom rozmedzí molekulových hmotnosti. naJvySSia aktivita bola zistená vo frakcii s molekulovou hmotnosťou vySSou ako 150 kDa. Ak sa vzorky analyzovali na stĺpci Superose 12 ekvilibrovanom lOmľl CHAPS. naJväCSie množstvo aktivity sa nachádzalo vo frakcii s molekulovou hmotnosťou približne 44 kDa, Co je oblasť, kde bola aktivita predpokladaná. Vzorky, ktoré obsahovali aktivitu vo frakciách s vySSou molekulovou hmotnosťou, zodpovedali agregátom.Different LDL samples were therefore evaluated by analytical gel filtration, where the degree of aggregation and the effect on PAF-AH activity were evaluated. Samples from the DEAE pool and Freshly Dissolved LDL Precipitates were analyzed on a Superose 12 (Pharmacia) column equilibrated with 1 ml of CHAPS. Both samples were eluted from the column over a wide molecular weight range. The high activity was found in a fraction with a molecular weight of 150 kDa. When samples were analyzed on a Superose 12 column equilibrated with 10 ml CHAPS. The greatest amount of activity was found in a fraction with a molecular weight of approximately 44 kDa, which is the region where activity was predicted. Samples that contained activity in the high molecular weight fractions corresponded to the aggregates.
Aktivita ostatných vzoriek sa po nasledujúcom testovaní pomocou gélovej filtrácie nachádzal výhradne v rozsahu molekulovej hmotnosti zodpovedajúcej 44 kDa. Tieto vzorky boli precipitáty LDL rozpustené v 10ml*l CHAPS v prítomnosti 0, 5 1*1 NaCl a ďalej vzorky z DEAE poolu, ktoré boli upravené po elúcii zo stĺpca pomocou 10 ml*l CHAPS. Získané výsledky potvrdzujú, že aby sa zamedzilo agregácii vzoriek PAF-AH, je nutné použiť minimálne 10 ml*l CHAPS. Zvýšenie koncentrácie CHAPS z 1 ml*l na 10 ml*l po chromátografii na stĺpci DEAE celulózy, ale pred ďalšími krokmi purifikaCného postupu, navodilo dramatické zmeny v .purifikaCnom postupe. Napríklad, stupeň riaCistenia PAF-AH ria stĺpciThe activity of the other samples, after subsequent gel filtration testing, was found exclusively in the molecular weight range corresponding to 44 kDa. These samples were LDL precipitates dissolved in 10 ml * 1 CHAPS in the presence of 0.5 L * 1 NaCl and further samples from DEAE pool, which were treated after column elution with 10 ml * 1 CHAPS. The results obtained confirm that at least 10 ml * 1 CHAPS should be used to prevent aggregation of PAF-AH samples. Increasing the CHAPS concentration from 1 ml * l to 10 ml * l after chromatography on a DEAE cellulose column, but prior to the next steps of the purification process, caused dramatic changes in the purification process. For example, the degree of purification of PAF-AH is determined in the column
S-Sepharosy FAST Flou sa zvýšilo z dvojnásobku na desaťnásobok. Aktivita PAF-AH sa viaže v 1 mň CHAPS na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flou ireverzibilné, ale ak sa použije s 10 ml*l CHAPS, vymyje sa zo stĺpca veľmi vysoká hladina aktivity. Chromátografia na stĺpci DEAE sa však pridaním 10 mň CHAPS oproti predchádzajúcim chromatografiám nezlepšila.S-Sepharose FAST Flou was increased from two to ten times. PAF-AH activity binds in 1 m CHAPS to a Blue Sepharose Fast Flou column irreversible, but when used with 10 ml * 1 CHAPS, a very high level of activity is eluted from the column. However, the chromatography on the DEAE column did not improve with the addition of 10 mM CHAPS over previous chromatographies.
Chromatografia na stĺpci Cu nasledovala po chromatografii na zvýšilo aktivitu PAF-AH pätnásťkrát. Tiež sa zistilo, že aktivita PAF-AH sa môže obnoviť po elektroforéze na redukujúcom SDS-polyakrylamidovom géle. vzorka sa však pred elektroforézou nesmie variť. Aktivita materiálu získaného elúclou zo stĺpca CuCu column chromatography followed chromatography to increase PAF-AH activity by 15-fold. It has also been found that PAF-AH activity can be restored after electrophoresis on a reducing SDS-polyacrylamide gel. however, the sample must not be cooked before electrophoresis. Activity of material obtained by elution from Cu column
Chelating Sepharosy. ktorá Blue Sepharose Fast Flou,Chelating Sepharosy. which Blue Sepharose Fast Flou,
Chelating Sepharose, sa po elektroforéze na SDS polyakrylamldovom géle a následnom farbení striebrom, vyskytovala v hlavnom prúžku proteínu.Chelating Sepharose, after electrophoresis on an SDS polyacrylamide gel and subsequent silver staining, occurred in the main band of the protein.
B. Protokol pre purifikáciu PAF-AHB. Protocol for Purification of PAF-AH
Nový protokol pre purifikáciu PAF-AH pre ciele aminokyselinového sekvencovania obsahuje nasledujúce kroky, ktoré sú uskutoCMované pri 4 °C. Ľudská plazma sa rozdelila po 900 ml alikvotoch do 1-lltrových fliaš firmy Nalgene a upravila sa hodnota pH na 8, G. LDL Častice sa potom precipitovali pridaním 90 inl 3, 85% fosfovolfrámanu sodného a potom následným pridaním 21*1 MgCls... Plazma sa potom centrifugovala 15 minút pri 3800 g. Pele ta bola resuspendovaná v 800 ml 0, 2% citrátu sodného. LOL Častice sa opäť vyzrážali pomocou pridania 10 g NaCl a 24 ml 2N PlgCl2. LDL Častice získané z 5 1 ľudskej plazmy sa rozpustili v 5 1 pufri A C25ml*l Tris-HCl, 10ml*1 CHAPS, pH 7,5) a nechali sa miešať cez noc. Rozpustené LOL častice sa centrifugovall pri 3800 g počas 1, 5 hodiny. Supernatant sa schraŕioval, potom sa preťiltroval cez filtračný papier Uhatman 113. čím sa odstránili zvyšné pevné častice. Solubilizované LOL častice sa nasadili na stĺpec DEAE Sepharosy Fast Flou (11 x 10 cm; objem živice 1 1; 80 ml/min), ktorý bol ekvilibrovaný pufrom B C25mPI Tris-HCl, lml*l CHAPS. pH 7, 5) . Stĺpec sa premýval 8 1 gradientu 0-0, 5 PI NaCl a zozbierali sa 480 ml frakcie. Tento krok bol nevyhnutný pre naviazanie látk na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flou tak, ako je to popísané ďalej. Frakcie boli testované na aktivitu acetylhydrolázy a to metódou, ktorá je popísaná v Príklade 4.The new protocol for purifying PAF-AH for amino acid sequencing targets comprises the following steps, which are carried out at 4 ° C. Human plasma was dispensed in 900 ml aliquots into 1-liter Nalgene bottles and the pH was adjusted to 8, G. LDL The particles were then precipitated by the addition of 90 inl 3, 85% sodium phosphovate, followed by 21 * 1 MgCl 2 ... The plasma was then centrifuged for 15 minutes at 3800 g. The pellet was resuspended in 800 ml of 0.2% sodium citrate. LOL The particles were reprecipitated by the addition of 10 g NaCl and 24 ml 2N PlgCl 2 . LDL Particles obtained from 5 L of human plasma were dissolved in 5 L of buffer A (25 ml * 1 Tris-HCl, 10 ml * 1 CHAPS, pH 7.5) and allowed to stir overnight. The dissolved LOL particles were centrifuged at 3800 g for 1.5 hours. The supernatant was collected, then filtered through Uhatman 113 filter paper to remove any remaining solids. Solubilized LOL particles were loaded onto a DEAE Sepharose Fast Flou column (11 x 10 cm; resin volume 1 L; 80 mL / min) that was equilibrated with C25mPI Tris-HCl buffer, 1 mL * 1 CHAPS. pH 7.5). The column was washed with 8 L of a 0-0.5 µl NaCl gradient and 480 mL fractions were collected. This step was necessary to bind the compounds to the Blue Sepharose Fast Flou column as described below. Fractions were assayed for acetyl hydrolase activity by the method described in Example 4.
Frakcie vykazujúce aktivitu sa zliali a pridalo sa také množstvo CHAPS, aby v celom objeme frakcií koncentrácia dosiahla 10ml*l. Všetky frakcie získané po chromatografil na DEAE sa nanášali cez noc rýchlosťou 4 ml/min. na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flou (5 cm x 10 cm, mŕtvy objem 200 ml) ekvilibrovaný pufrom obsahujúcim 0, 5 1*1 NaCl. Stĺpec sa premýval ekvillbračným pufrom rýchlosťou 18 ml/mlnútu a to až do tej doby, než sa absorbancla vrátila na hodnotu pre absorbancie namerané pred aplikáciou vzorky. Aktivita PAF-AH sa vymývala zo stĺpca pomocou krokovej elúcle pufrom A obsahujúcim 0,5 M KSCN Cchaotropná soľ) a tn rýchlosťou 16 ml/miri. Zbierali sa 50 ml frakcie. Tento krok viedol k viac ako tisícnásobnému načisteniu enzýmového preparátu. Zbierali sa aktívne frakcie, potom sa v celom ich nazbieranom objeme upravilo pH na hodnotu 8,0 a tn pomocou 11*1 Tris-HCl, pH 8,0. Aktívna frakcie získané .po chromatografii na stĺpci Blue Sepharosy Fast Flou sa naniesla na stĺpec Cu Chelatin Sepharosy C2, 5 x 2 cm, mŕtvy objem 10 ml; prietoková rýchlosť 4 ml/min.), ktorý hol. ekvilibrovaný pufrom C C25ml*I Tris-HCl, 10ml*l CHAPS. O, 5 1*1 NaCl, pH R, 0, Je možné použiť aj pufer s pH 7,5) . Stĺpec bol vymývaný objemom 50 ml pufra C. Aktivita PAF-AH sa vymývala zo stĺpca 100 m). 50inl*l imidazolu v pufri C a zozbierali sa 10-ml frakcie. Eluent s aktívnym PAF-AH sa zhromaždil a nechal sa dl.alyzovať proti pufru A. Okrem toho, že sa týmto krokom 15-krát zvýšila aktivita danéhn enzýmového preparátu PAF-AH. chromátografia na stĺpci Cu Chelating Sepharose dala len veľmi malé načistenie. Aktívny eluent zo stĺpca Cu Chelating Sepharose bol redukovaný v 50mľI DTT počas 15 minút pri 37 °C a potom bol nanesený na 0,75 mm 7, 5X pnlyakrylamldový gél.. Gélové platne boli nakrájané na prúžky s šírkou 0. 5 cm a vložené do centrifugačnej mikrokyvety na jedno použitie obsahujúcej 20 nl. 25ml*l Tris-HCl, 10ml*I CHAPS, 150ml*l NaCl. Prúžky holi potom rozotrené a ponechané inkubrivaĽ v kyvete cez noc pri 4 °C. Supernatant vzniknutý centrifugáciou týchto rozdrvených gélových prúžkov sa potom testoval, na aktivitu PAF-AH, tým sa určilo, ktorý prúžok na géle SDS-PAGE obsahuje PAF-AH. Aktivita PAF-AH bola nájdená v prúžku, ktorý zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 44 kDa. Proteíny z duplicitného gélu boli prenesené elektricky na PVDF membránu CTmmnbilon-P. Millipore) a ofarbené Comassie Blue. Fotografia PVDF membrány je na obrázku 1.The fractions showing activity were pooled and CHAPS was added to give a concentration of 10ml * l over the entire fraction. All fractions obtained after chromatography on DEAE were loaded overnight at 4 ml / min. to a Blue Sepharose Fast Flou column (5 cm x 10 cm, 200 ml dead volume) equilibrated with 0.5 L * 1 NaCl buffer. The column was washed with equilibration buffer at a rate of 18 ml / ml until the absorbance was returned to the absorbance measured before sample application. PAF-AH activity was eluted from the column with step elution buffer A containing 0.5 M KSCN (Caotropic salt) and tn at a rate of 16 ml / ml. 50 ml fractions were collected. This step resulted in more than a thousand fold purification of the enzyme preparation. Active fractions were collected, then adjusted to pH 8.0 and tn with 11 * 1 Tris-HCl, pH 8.0 throughout their collected volume. The active fractions obtained after Blue Sepharose Fast Flou column chromatography were loaded onto a Cu Chelatin Sepharose C2 column, 5 x 2 cm, dead volume 10 ml; flow rate 4 ml / min), which hol. equilibrated with C buffer C25ml * 1 Tris-HCl, 10ml * 1 CHAPS. 0.5L * NaCl, pH R, 0. A buffer of pH 7.5) may also be used. The column was eluted with a volume of 50 ml of buffer C. PAF-AH activity was eluted from the 100 m column. 50 µl of imidazole in buffer C and 10-ml fractions were collected. The eluent with active PAF-AH was collected and allowed to analyze against buffer A. In addition, the activity of the enzyme preparation PAF-AH was increased 15-fold by this step. Chromatography on a Cu Chelating Sepharose column gave very little purification. The active eluent from the Cu Chelating Sepharose column was reduced in 50mL of DTT for 15 minutes at 37 ° C and then loaded onto a 0.75mm 7.5X acrylic amide gel. The gel plates were cut into strips with a width of 0.5cm and placed in single-use centrifuge micro-cells containing 20 µl. 25ml * 1 Tris-HCl, 10ml * 1 CHAPS, 150ml * 1 NaCl. The rod strips were then ground and left to incubate in the cuvette overnight at 4 ° C. The supernatant produced by centrifugation of these crushed gel bands was then tested for PAF-AH activity to determine which band on the SDS-PAGE gel contained PAF-AH. PAF-AH activity was found in a band that corresponds to a molecular weight of approximately 44 kDa. Duplicate gel proteins were electrically transferred to the CTmmnbilon-P PVDF membrane. Millipore) and stained with Comassie Blue. A photograph of the PVDF membrane is shown in Figure 1.
Tak, ako je ukázané v Tabuľke č. 1 ďalej v texte. z 5 1 ľudskej plazmy sa získalo približne 200 ug PAF-AH nečisteného 2 x 10Ä. Na porovnanie. Stafforini. a ďalší C1987). pozri vySSie. popísal vo svojom postupe načistenie aktivity 3 x 10*.As shown in Table no. 1 below. 5 1 of human plasma was obtained about 200 .mu.g PAF-AH impure 2 x 10 Å. For comparison. Stafforini. and others (C1987). see above. described in his procedure the purification of 3 x 10 * activity.
Tabuľka 3Table 3
10=5 10 = 5
Súhrnne môžeme konštatovať, že pre úspešnú purifikáciu PAF-AH 7. plazmy s cieľom mikrosekvencovania sú unikátne a kritická nasledujúce kroky* Cl) rozpustenia a chromatografia na v 10 ml*l CHAPS, C 2) afinitná chromatografia na stĺpci s modrým llgandom, ako je Blue Sepharose Fast Flou, C3) chromatografia na Cu ligandovom afinitnom noslCi, ako je Cu Chelating Sepharose a C4) elúcla PAF-AH z gélu po SDS-PAGE.In summary, the following steps are unique and critical for successful purification of PAF-AH 7 plasma for microsquencing: * 1) dissolution and chromatography on 10 ml * 1 CHAPS, (2) affinity chromatography on a blue 11gandom column, such as Blue Sepharose Fast Flou, C3) chromatography on Cu ligand affinity carrier, such as Cu Chelating Sepharose and C4) eluting PAF-AH from gel after SDS-PAGE.
Príklad 2Example 2
Prúžok s proteínmi s veľkosťou PVDF membrány obsahujúcej PAF-AH sekvencia prítomných bielkovín proteínového sekvenátora Applied asi 44 kDa bol vystrihnutý z Cpopísané v Príklade 1).A PVDF membrane size band containing the PAF-AH sequence of proteins present in the Applied protein sequencer of about 44 kDa was excised from the Cp described in Example 1).
bola stanovená pomocouhas been determined by
Biosystems 473A. Analýza sekvencii. N-koncovej oblasti proteínov migrujúcich v oblasti asi 44 kDa, ktorá vykazuje PAF-AH aktivitu, naznačila prítomnosť dvnch majoritných a dvoch minoritných sekvencii. Pomer ohidvoch majoritných sekvencii bol 1:1, preto bolo obtiažne interpretovať, sekvenčné dáta.Biosystems 473A. Sequence analysis. The N-terminal region of proteins migrating in the region of about 44 kDa, which exhibits PAF-AH activity, indicated the presence of two major and two minor sequences. The ratio of the two major sequences was 1: 1, so it was difficult to interpret the sequence data.
Aby bolo možné odlíšiť, sekvencie obidvoch majoritných proteínov rozdelených na SDS géle, bol duplikát PVDF membrány s prúžkom okolo 44 kDa rozpolený a horná aj dolná časť bola sekvencovaná nddelerie.In order to differentiate, the sequences of the two major proteins separated on an SDS gel, a duplicate of a PVDF membrane with a band of about 44 kDa was split and the upper and lower portions were sequenced in sequence.
Sekvenčia N-knnca získaná z dolnej polovice membrány je takáto:The N-knn sequence obtained from the lower half of the membrane is as follows:
SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1
FKDLGEEAFKALVLIAFFKDLGEEAFKALVLIAF
Po prehľadaní databáz proteínov bola táto sekvencia stotožnená n fragmentom ľudského sérumalbumí.nu. N-knncová sekvericla stanovená v prípade materiálu z hornej polovice tej istej PVDF membrány je takáto:After searching the protein databases, this sequence was identified by the n fragment of human serum albumin. The N-knock-down sectors determined for the material of the upper half of the same PVDF membrane are as follows:
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2
IQVLMAAASFGQTKIPIQVLMAAASFGQTKIP
Táto sekvencia nemala náprotivok v žiadnom proteíne zo skúmaných databáz a líšila sa od N-koncovej sekvencie aminokyselín:This sequence had no counterpart in any protein from the databases examined and differed from the N-terminal amino acid sequence:
SEQ ID NO: 3 MKPLVVFVLGG popísanej v prípade erytrocytového cytoplazmatlckého PAF-AH v Stafforini et al . (1993), pozri vyššie. Nová sek venci a (SEO Tf) NO: 2) bola využitá pri klonovaní r.DNA ľudskej plazmatickejSEQ ID NO: 3 MKPLVVFVLGG described for erythrocyte cytoplasmic PAF-AH in Stafforini et al. (1993), supra. The new sequence (SEO Tf) NO: 2) was used in cloning r.DNA of human plasma.
PAF-AH, ako je to popísané ďalej v Príklade 3.PAF-AH as described in Example 3 below.
Príklad 3Example 3
Kloň kódujúci úplnú ľudskú plazmatickú PAF-AH bol Izolovaný z makrofágovej cDNA knižnice.A clone encoding full human plasma PAF-AH was isolated from a macrophage cDNA library.
A. Konštrukcia makrofágovej cDNA knižniceA. Construction of a macrophage cDNA library
7. makrofágov periférnej krvi odvodených od monocytov bola izolované poly A+ RNA. Dvojreťazcová, tupo zakončená cDNA bola získaná pomocou súpravy Invitrogen Copy Kit CSan Diego, CA), k nej boli ligáciou pripojené adaptory BstXI a potom bola vložená do cicavčieho expresného vektora pRcCCMV CInvitrogen). Vzniknutý plazmid bol vnesený elektroporáciou do E. coli XL-1 Blue. Transformované baktérie boli vysiate na 978 platní v hustote asi 3000 kolónií na platnú. Plazmldová DNA pripravená oddelene z každej platne bola uložená v jednotlivých súboroch, bola tiež spojená do väčších súborov, reprezeritujúcich 300 000 klanov.7. Poly A + RNA was isolated from peripheral blood macrophages derived from monocytes. Double stranded, blunt-ended cDNA was obtained using Invitrogen Copy Kit (Diego Diego, CA), ligated with BstXI adapters, and then inserted into a mammalian expression vector (pRcCCMV (Invitrogen)). The resulting plasmid was introduced by electroporation into E. coli XL-1 Blue. Transformed bacteria were seeded on 978 plates at a density of about 3000 colonies per plate. Plasmid DNA prepared separately from each plate was stored in individual pools, and was also pooled into larger pools, reprezeritizing 300,000 clans.
B. Testovanie knižnice pomocou PCRB. Library Testing by PCR
Makrofágová knižnica bola testovaná pomocou polymérázovej reťazovej reakcie s využitím degenerovaných antisense primárov navrhnutých na základe novej N-koncovej aminokyselinovej sekvencle popísanej v Príklade 2. Sekvencla priméru je uvedená v súlade s nomenklatúrou IUPAC, I“ znamená inozín.The macrophage library was tested by a polymerase chain reaction using degenerate antisense primers designed based on the new N-terminal amino acid sequence described in Example 2. The primer sequence is given in accordance with the IUPAC nomenclature, I 'means inosine.
SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4
5' ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3'5 'ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3'
Nuc. Acids Res., 19S: nukleotldov na tretej Na testovanie súborovNuc. Acids Res., 19S: Nucleotides on Third For Testing Files
Tabuľka výberu kodónov (klada et al.,Codon selection table (for example, et al.,
1981-1986 C1991)) bola použitá na určenie pozícii každého kodónu tohoto priméru.1981-1986 (1991) was used to determine the position of each codon of this primer.
makrofágovej knižnice s 300 000 klonml bol použitý tento primér v kombinácii s primérom špecifickým pre buď SP6 alebo T7 promótorovú sekvenciu, nachádzajúcu sa po obidvoch stranách klonovacleho miesta vektora pRc/CI*IV. Každá PCR reakčná zmes bola zložená zo 3.00 ng templátovej cDNA. lug každého z dvoch primárov, 0, 125 ml*I každého zo štyroch dNTP, 1Π ml*l Tris-HCl pH 8, 4, 50 ml*I MgCla a 2, 5 jednotky Taq polymerázy. Začiatočný denaturačriý krok trvajúci 4 minúty pri 94 °C ho], nasledovaný 30 cyklami amplifl kácie zloženými, z 1. minúty pri 94 °C, 1 minúty pri 6Π °C a 2 minút pri 72 eC. Výsledný PCR produkt, hol nakloriovaný do vektora pBluescript SK- CStratagene, La Jolla, CA) a jeho nukl.eotidová sekvend.a stanovená pomocou dídenxymetódy. Tento PCR produkt obsahoval sekvenciu odvodíteľnú nd novej peptidovej sekvencl.e a zodpovedajúcu nukleotldom 3. až 331. CSFC1 ID Nfls 7).This primer was used in combination with a primer specific for either the SP6 or T7 promoter sequence located on both sides of the cloning site of the pRc / CI * IV vector. Each PCR reaction mixture was composed of 3.00 ng template cDNA. 1 µl of each of the two primers, 0, 125 ml * 1 of each of the four dNTPs, 1Π ml * 1 of Tris-HCl pH 8.4, 50 ml * 1 of MgCl 2 and 2.5 units of Taq polymerase. The initial step of at denaturačriý 4 minutes at 94 ° C it], followed by 30 cycles amplifl cation composed of 1 min at 94, 1 min at 6Π ° C and 2 minutes at 72 e C. The resulting PCR product, the alcohol nakloriovaný the vector pBluescript (Ctratagene, La Jolla, CA) and its nucleation sequence determined by the dinidene method. This PCR product contained a sequence deductible nd to the new peptide sequence corresponding to nucleotides 3 to 331. (CSFC1 ID Nfls 7).
Ďalej sú uvedené PCR priméry, špecifické pre vyššie popísaný klonovariý PCR fragment, a určené na nájdenie klanu s úplnou dĺžkou.The following are PCR primers specific for the above-described clonovirus PCR fragment and designed to find a full-length clan.
Sense primér CSFO 10 ΝΠ» R)Sense primer CSFO 10 RΠ »R)
5' TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3'5 'TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3'
Antisense primér CSEC3 TO ΝΠ« 6)Antisense primer CSEC3 TO ΝΠ «6)
5' CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3'5 'CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3'
PCR reakcie s využitím týchto primárov holi uskutočnené ako to bolo popísané vyššie a poslúžili na prvé testovanie súborov cDNA s 300 0ΟΠ klenmi a potom na testovanie príslušných menších súhnrov s 3000 klonml. Tri súbory s 3000 kIónmi, ktoré dávali PCR produkt s očakávanou veľkostnú hnil použi.té na transformáciu baktérií.PCR reactions using these primers were performed as described above and served for the first testing of cDNA sets with 300 0ΟΠ spans, and then for testing the corresponding smaller sets with 3000 clonml. Three sets of 3000 ions that gave the PCR product with the expected size rot used to transform the bacteria.
C. Testovanie knižnice pomocou hybridizácieC. Testing the library by hybridization
DNA z týchto baktérií bola testovaná pomocou hyhridizácle s využitím pňvodnéhn nakl.onovaného PCR fragmentu ako sondy. Kolónie holi. prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 502 formam1.de, 0,75M chloride sodnom, 0, Π75ΓΙ citráte sodnom, 0, Π5Μ fosfáte sodnom, pH 6.5. 12 polyvinylpyrn] idóne, 12 fikole, 12 hovädzom sérumaltiumíne a 50 ng/ml sonikovanej ONA z lososieho ml.iečia. Hybridizačná sonda bola značená postupom raridoin priming s hexamérmi. Hybridizácia bola uskutočnená pri. 42 °C cez noc, membrány boli intenzívne obmyté 0,031*1 chloridom sodným, 3niľl citrátom sodný, 0,12 SOS pri 42 OC. Bola stanovená sekvenčia nukleotidov v prípade 10 klonov dávajúcich pozitívny signál. Jeden z týchto klonov. sAH 406-3, obsahoval sekvenclu odvoditeľnú na základe pôvodnej peptidovej sekvericie proteínu s PAF-AH aktivitou purlfikovaného z ľudskej plazmy. Sekvencie DNA a aminokyselinová sekvericia z nej odvodená sú uvedené v SEO ID NO: 7 (DNA) a SEO ID NO: 8 (aminokyseliny).The DNA from these bacteria was tested by hybridization using the original cloned PCR fragment as a probe. Colony holi. transferred to nitrocellulose, prehybridized and hybridized in 502 formam1.de, 0.75M sodium chloride, 0, Π75ΓΙ sodium citrate, 0, Π5Μ sodium phosphate, pH 6.5. 12 polyvinylpyrrolidine, 12 ficolls, 12 bovine serumaltium and 50 ng / ml sonicated salmon ONA. The hybridization probe was labeled with a raridoin priming procedure with hexamers. Hybridization was performed at. 42 ° C overnight. Filters were washed by 0.031 1 * with sodium chloride, sodium citrate 3niľl, 0.12 SOS at 42 o C. The nucleotide sequence was determined for the 10 hybridizing clones signal. One of these clones. sAH 406-3, contained a sequence deducible based on the original peptide sequencing of the protein with PAF-AH activity purified from human plasma. The DNA sequences and amino acid sequence derived therefrom are shown in SEO ID NO: 7 (DNA) and SEO ID NO: 8 (amino acids).
Kloň sAH 406-3 obsahuje 1,52 kb dlhý inzert s otvoreným čítacím rámcom, ktorý kóduje predpokladaný proteíri zložený z 441 aminokyselín. Na N-konci sa nachádza relatívne hydrofóbny úsek s dĺžkou 41 aminokyselín pred N-koricovou aminokyselinou stanovenou mlkrosekvenáclou proteínu Clzoleucín v pozícií 42 v SEQ ID NO: 8). Kódovaný proteín môže mať buď dlhú signálnu sekvenclu alebo signálnu sekvenclu plus ďalší peptid, ktorý je odštiepený pri vzniku zrelého funkčného enzýmu. Prítomnosť signálnej sekvencie je jedným zo znakov sektretovaných proteínov. Okrem toho sa nachádza v proteíne kódovanom klonoin sAH 406-3 konsensus motív GxSxG (aminokyseliny 271-275 v SEO ID NO: 8), o ktorom sa predpokladá, že obsahuje seríri aktívneho miesta v prípade všetkých známych cicavčích a mikrobiálnych lipáz a seríriproteáz, pozri Chapus et al., Bloahimie. 701 1223-1224 (1988) a Brenner, Náture, 334: 528-530 (1988).The sAH 406-3 clone contains an 1.52 kb insert with an open reading frame that encodes a putative protein of 441 amino acids. At the N-terminus, there is a relatively hydrophobic region of 41 amino acids in front of the N-amino acid determined by the sequence of the Clzoleucine protein at position 42 in SEQ ID NO: 8). The encoded protein may have either a long signal sequence or a signal sequence plus an additional peptide that is cleaved to yield a mature functional enzyme. The presence of a signal sequence is one of the traits of secreted proteins. In addition, in the protein encoded by the clone sAH 406-3 there is a consensus motif GxSxG (amino acids 271-275 in SEO ID NO: 8), which is believed to contain a series of active site for all known mammalian and microbial lipases and seroproteases, see Chapus et al., Bloahimie. 701 1223-1224 (1988) and Brenner, Nature, 334: 528-530 (1988).
Tabuľka 2, nižšie, predkladá porovnanie amiriokyselinového zloženia ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorá je predmetom tohoto patentu, založeného na sekvenčil SEO ID NO:8 s aminokysellnovým zložením purlfikovaného materiálu popísaným Stafforiniom et al. (1987), pozri vyššie.Table 2, below, compares the amino acid composition of human plasma PAF-AH that is the subject of this patent, based on the Sequence ID NO: 8 with the amino acid composition of the purified material described by Stafforini et al. (1987), supra.
Tabuľka 2Table 2
Amiriokysellnové zloženie zrelej formy ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorá je predmetom tohoto patentu, a amiriokysellnové zloženie predtým purifikovaného materiálu, ktorý bol označený ako ľudská plazmatická PAF-AH, je zreteľné odlišné.The amirio-acid composition of the mature form of human plasma PAF-AH which is the subject of this patent, and the amirio-acid composition of the previously purified material, which has been designated human plasma PAF-AH, is distinctly different.
Porovnanie nukleotidovej a odvodenej aminokyselinovej sekvencie hovädzej mozgovej cytoplazmatickej PAF-AH (Hattori et al.. pozri vyššie) s nukleotidovou sekvenclou ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorý je predmetom tohoto patentu, neodhalilo žiadnu významnú štruktúrnu podobnosť týchto sekvencii.Comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequence of bovine brain cytoplasmic PAF-AH (Hattori et al., Supra) with the human plasma PAF-AH nucleotide sequence of the present invention revealed no significant structural similarity to these sequences.
Príklad 4Example 4
PCR uskutočnená s cDNA z makrofágov a stimulovaných PBMC s využitím primérov hybridizujúcich s 5’ neprekladanou oblasťou (nukleotidy 31 až 52 v SEQ ID N0< 7) a oblastí obsahujúcich translačný terminačriý kodóri na 3'konci PAF-AH cDNA (nukleotidy 1465 až 1487 v SEQ ID N0« 7) našla predpokladaný strihový variant (splice variant) ľudského PAF-AH génu. Výsledkom tejto PCR reakcie boli dva prúžky na géle. jeden z nich zodpovedal očakávanej veľkosti PAF-AH cDNA z Príkladu 3 a druhý kratší asi o 100 bp. Väčší prúžok bol identifikovaný na základe sekvencovania s PAF-AH cDNA z Príkladu 3. zatiaľ čo kratšiemu prúžku chýbal exún 2 (pozri Príklad 5 nižšie) PAF-AH sekvencie, ktorý kóduje predpokladaný signálnu a propeptldovú sekvenciu plazmatického PAF-AH.PCR performed with cDNA from macrophages and stimulated PBMC using primers hybridizing to the 5 'untranslated region (nucleotides 31 to 52 in SEQ ID NO <7) and regions containing translational termination coders at the 3' end of the PAF-AH cDNA (nucleotides 1465 to 1487 in SEQ ID NO: 7) found the putative splice variant of the human PAF-AH gene. This PCR reaction resulted in two bands on the gel. one corresponding to the expected size of the PAF-AH cDNA of Example 3 and the other shorter by about 100 bp. The larger band was identified by sequencing with the PAF-AH cDNA of Example 3. while the shorter band was absent from the exune 2 (see Example 5 below) of the PAF-AH sequence, which encodes the putative signal and propeptide sequence of plasma PAF-AH.
V kratšom klone je prítomná predpokladaná katalytická trláda a všetky cystelnové zvyšky. preto je biochemická aktivita proteínu kódovaného týmto kloriom pravdepodobne zhodná s aktivitou plazmatického enzýmu.In the shorter clone, the putative catalyst residue and all cystelin residues are present. therefore, the biochemical activity of the protein encoded by this clorium is likely to be identical to that of the plasma enzyme.
Aby sa stanovil biologický význam tohoto strihového variantu PAF-AH, o ktorom sa predpokladá, že kóduje cytoplazmatický aktívny enzým, skúmalo sa relatívne množstvo obidvoch foriem v krvných inakrofágoch odvodených od inonocytov pomocou metódy RNase protection. Ani jedna z obidvoch mRNA nebola prítomná v čerstvo Izolovaných monocytoch, avšak obidve mRNA bolí nájdené deň 2. počas in vitro diferenciácie moriocytov do makrofágov a pretrvávali počas 6 dni kultivácie. Množstvo obdivoch mRNA bolo približne rovnaké počas celého obdobia diferenciácie. Naopak podobná analýza nervového tkaniva detegovala len expresiu mRNA s úplnou dĺžkou kódujúcej extracelulárnu úplnú formu PAF-AH.To determine the biological significance of this splicing variant of PAF-AH, which is believed to encode a cytoplasmic active enzyme, the relative amount of both forms in inocyte-derived blood inacrophages was examined by the RNase protection method. Neither of the two mRNAs was present in the freshly isolated monocytes, but both mRNAs were found on day 2 during in vitro differentiation of moriocytes into macrophages and persisted for 6 days of culture. The number of mRNA admissions was approximately the same throughout the differentiation period. In contrast, a similar analysis of nerve tissue detected only full-length mRNA expression encoding the extracellular full-length form of PAF-AH.
Príklad 5Example 5
Takisto boli izolované genómové sekvencie ľudskej plazmatickej PAF-AH. Štruktúra PAF-AH génu bola stanovená izoláciou fágových klonov lambda a 1, obsahujúcich ľudskú genómovú DNA. pomocou stringencie. Fragmenty a sekvencované pomocouHuman plasma PAF-AH genomic sequences were also isolated. The structure of the PAF-AH gene was determined by isolating lambda α 1 phage clones containing human genomic DNA. using stringency. Fragments and sequenced by
DNA hybridizácie v podmienkach vysokej fágových klonov boli ďalej kloriované primárov prísadajúcich v pravidelných intervaloch k cDNA klonu sAH 406-3. Navyše boli pripravené nové sekvenačné priméry homológne k oblastiam intrónov hraničiacim s exórimi a využité na protísmerové sekvencovanie cez hranice exón-intrón s cieľom potvrdenia sekvencie. Hranice exón/íntrón boli definované ako body, kde sa genómová sekvencia a cDNA začínajú odlišovať. Táto analýza zistila zloženie ľudskéhoDNA hybridizations under high phage clone conditions were further cloned with primers associated at regular intervals with the cDNA clone of sAH 406-3. In addition, new sequencing primers were prepared homologous to the exon-bordering intron regions and used for upstream sequencing across the exon-intron boundaries to confirm the sequence. The exon / intron boundaries were defined as points where the genomic sequence and cDNA begin to differ. This analysis revealed the composition of the human
PAF-AH génu z 12 exónov.PAF-AH gene from 12 exons.
Exúny 1, 2, 3, 4, 5, 6 a časť exónu 7 boli izolované z mužskej fetálnej placentárnej knižnice konštruovanej v lambda FIX (Stratagene). Fágové plaky boli prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 50% f ormamide, 0, 75ľl chloride sodnom, 75ml*l citráte sodnom, 50ml*l fosfáte sodnom (pH 6,5). 1% polyvinylpyrolidóne. 1% fikole, 1% hovädzom serérumalbumine a 50 ng/ml sonikovanej DNA z lososieho mliečla. Úplný cDNA kloň sAH 406-3 bol použitý ako hybridizačná sonda na identifikáciu fágových klonov obsahujúcich exóny 2-6 a časĽ exónu 7. Kloň obsahujúci exóri 1 bol identifikovaný pomocou fragmentu odvodeného z 5'konca tohoto cDNA klonu (nukleotidy 1 až 312 v SED ID NO: 7). Obidve sondy boli značené pomocou 3Sp metódou random priming s hexamérmi. Hybridizácia bola uskutočňovaná pri 42 °C cez noc, membrány boli intenzívne obmyté 30ml*l chloridom sodným, 3ml*l citrátom sodným, 0, 1% SDS pri 42 eC. DNA sekvencie exónov 1, 2,Exons 1, 2, 3, 4, 5, 6 and part of exon 7 were isolated from a male fetal placental library constructed in lambda FIX (Stratagene). The phage plaques were transferred to nitrocellulose, prehybridized and hybridized in 50% formamide, 0.75 µl sodium chloride, 75 ml * 1 sodium citrate, 50 ml * 1 sodium phosphate (pH 6.5). 1% polyvinylpyrrolidone. 1% ficola, 1% bovine serumalbumine and 50 ng / ml sonicated salmon milk DNA. The complete cDNA clone of sAH 406-3 was used as a hybridization probe to identify phage clones containing exons 2-6 and part of exon 7. The clone containing exor 1 was identified by a fragment derived from the 5 'end of this cDNA clone (nucleotides 1 to 312 in SED ID). NO: 7). Both probes were labeled with 3S p by random priming with hexamers. Hybridization was performed at 42 ° C overnight, membranes were extensively washed with 30 ml * 1 sodium chloride, 3 ml * 1 sodium citrate, 0.1% SDS at 42 e C. DNA sequences of exons 1,2,
3. 4, 5 a 6 spolu s čiastočnými sekvenclami susediacich Intrónov sú uvedené v SEO ID NO: 9. 10, 11. 12, 13 a 14.3, 4, 5 and 6 together with partial sequences of adjacent Introns are given in SEO ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 and 14.
Zvyšok exónu 7 a exóny 8, 9, 10, 11 a 12 boli naklonované z PI klonu izolovaného z ľudskej PI genómovej knižnice. Plaky PI fágov boli prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 0. 751*1 chloride sodnom, 50ml*l fosfáte sodnom (pH 7,4), 5mľ1 EDTA, 1% polyvinylpyrolidúne, 1% fikole, 1% hovädzom sérumalbumine. 0,5% SDS a 0, 1 mg/ml celkovej ľudskej DNA. 2?6 kbThe remainder of exon 7 and exons 8, 9, 10, 11 and 12 were cloned from a PI clone isolated from a human PI genomic library. PI phage plaques were transferred to nitrocellulose, prehybridized and hybridized in 0. 751 * 1 sodium chloride, 50ml * 1 sodium phosphate (pH 7.4), 5mL EDTA, 1% polyvinylpyrrolidone, 1% ficola, 1% bovine serum albumin. 0.5% SDS and 0.1 mg / ml total human DNA. 2? 6 kb
EcoRI fragment genómovej DNA odvodený od 3'konca klonu lambda izolovaného predtým bol použitý ako sonda a označený pomocou 32P metódou random priming s hexamérml. Tento fragment obsahoval exón 6 a Časť exónu 7. prítomného vo fágovom klone. Po hybridizácii cez noc pri 65 °C boli membrány obmyté ako to bolo popísané vyššie. DNA sekvencie exónov 7, 8, 9, 10. 11 a 12 spolu s čiastočnými sekvenciami susediacich intróriov sú uvedené v SEQ ID NO: 15. 16. 17. 18, 19 a 20.An EcoRI fragment of genomic DNA derived from the 3 'end of the lambda clone isolated previously was used as a probe and labeled with 32 P by random priming with hexamer. This fragment contained exon 6 and part of exon 7 present in the phage clone. After overnight hybridization at 65 ° C, the membranes were washed as described above. The DNA sequences of exons 7, 8, 9, 10, 11 and 12, together with partial sequences of adjacent introns, are set forth in SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19 and 20.
Príklad 6Example 6
Úplné klony cDNA plazmatickej PAF-AH boli Izolované z cDNA knižnice z myšacej, psej, hovädzej a slepačej sleziny, neúplný hlodavčí kloň bol izolovaný z cDNA knižnice z potkanieho týmusu. Tieto klony boli identifikované pomocou hybridizácie s nízkou stririgenciou s ľudskou cDNA (hybridizačné podmienky boli rovnaké, ako to bolo popísané vyššie v prípade exónov 1 až 6 v Príklade 5. len namiesto 50x1 formamidu bol použitý formainid 20X1). Ako sonda bol použitý 1 kb Hind III fragment ľudského PAF-AH cDNA klonu sAH 406-3 (nukleotidy 309 až 1322 v SEQ ID NO: 7). Okrem toho bol izolovaný neúplný opičí kloň z cDNA z mozgu inak ak a pomocou PCR a primérov navrhnutých podľa sekvencie nukleotidov 285 až 303 a 851 až 867 zo SEQ ID NO: 7. Nukleotidové a odvodené amiriokyseliriové sekvencie cDNA kloriov z myši, psa, kravy, slepice, potkana a makaka sú uvedené v tomto poradí v SEQ ID NO: 21. 22, 23. 24. 25 a 26.Complete plasma PAF-AH cDNA clones were isolated from mouse, canine, bovine and chicken spleen cDNA libraries, the incomplete rodent clone was isolated from rat thymus cDNA library. These clones were identified by low-stringency hybridization with human cDNA (the hybridization conditions were as described above for exons 1 to 6 in Example 5. only formainide 20X1 was used instead of 50x1 formamide). A 1 kb Hind III fragment of the human PAF-AH cDNA clone sAH 406-3 (nucleotides 309-1322 in SEQ ID NO: 7) was used as a probe. In addition, an incomplete monkey clone was isolated from the brain cDNA otherwise if and by PCR and primers designed according to nucleotides 285 to 303 and 851 to 867 of SEQ ID NO: 7. Nucleotide and derived amino acid sequences of the mouse, cows, cows, hens, rats and cynomolgus monkeys are shown in SEQ ID NOs: 21, 22, 23, 24, 25 and 26, respectively.
Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencii cDNA kloriov s ľudským cDNA kloriom poskytlo údaje o podiele identických aminokyselín v percentách, ktoré sú uvedené v tab. 3 nižšie.Comparison of the deduced amino acid sequences of the cDNA clones with the human cDNA clorium gave data on the percentage of identical amino acids as shown in Table 1. 3 below.
Tabuľka 3Table 3
Asi 38Z amlnokyselinovýcl·! zvyškov je kompletne konzervovaných vo všetkých sekvenclách. Najpremenlivejšie oblasti sa nachádzajú na N-koncl (obsahujú signálnu sekvenciu) a na C-koncl a nie sú významné pre enzýmovú aktivitu, ako je ukázané v Príklade 10. Motív Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (SEQ ID NOs 27) nájdený v neutrálnych lipázach a iných esterázach je konzervovaný v hovädzej. psej, myšacej, potkanej a slepačej PAF-AH. Serín. nachádzajúci sa uprostred tohoto motívu, slúži týmto enzýmom ako aktívne nukleofllné miesto. Predpokladané aspartámové a histldíriové zložky aktívneho miesta (Príklad 10A) sú takisto konzervované. Ľudská plazmatická PAF-AH. ktorá je predmetom tohoto patentu. teda pravdepodobne využíva katalytickú triádu a môže zabrať □ □ ... hydrolázovú konformáciu typickú pre neutrálne llpázy, aj keď inak nevykazuje sekvenčnú homolégiu s lipázaml.About 38Z amino acid! residues are completely conserved in all sequences. The most variable regions are located on the N-konc1 (containing the signal sequence) and the C-konc1 and are not significant for the enzyme activity as shown in Example 10. The Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly motif (SEQ ID NOs 27) found in neutral lipases and other esterases is preserved in beef. canine, murine, rat and chicken PAF-AH. Serine. located in the middle of this motif serves as an active nucleophilic site by these enzymes. The putative aspartame and histldirium components of the active site (Example 10A) are also conserved. Human Plasma PAF-AH. which is the subject of this patent. thus, it is likely to utilize a catalytic triad and may occupy a hydrol □ ... hydrolase conformation typical of neutral lipases, although it otherwise does not exhibit sequence homology with lipases.
Ľudská plazmatická PAF-AH by mala obsahovať oblasť, ktorá špecificky interaguje s lipoproteínovými časticami (lou density a high density) v plazme. N-koncová časť molekuly s obsahom dlhých úsekov vysoko medzldruhovo konzervovaných aminokyselín, ale nie katalytických triád enzýmu, by mohla sprostredkovať tieto interakcie.Human plasma PAF-AH should contain a region that specifically interacts with plasma lipoprotein particles (lou density and high density). The N-terminal portion of the molecule containing long stretches of highly interspecific conserved amino acids but not catalytic triads of the enzyme could mediate these interactions.
Príklad 7Example 7
Expresný konštrukt pRC/CMV bol krátkodobo exprimovaný v bunkách COS 7 s cieľom stanovenia PAF-AH aktivity proteínu, kódovaného sAH 406-3 klonoin cONA ľudského plazmatického PAF-AH (Príklad 3). PAF-AH aktivita v médiu z COS buniek bola zisťovaná tri dni po transfekcii týchto buniek pomocou DEAE dextránu.The pRC / CMV expression construct was briefly expressed in COS 7 cells to determine the PAF-AH activity of the protein encoded by the sAH 406-3 clonoin cONA of human plasma PAF-AH (Example 3). PAF-AH activity in medium from COS cells was detected three days after transfection of these cells with DEAE dextran.
Bunky boli zaočkované v hustote 300 000 buniek na jednu kultivačnú misku s priemerom 60 mm. Nasledujúci deň boli bunky inkubované 2 hodiny v DMEM obsahujúcom 0, 5 mg/ml OEAE extráne, 0, linM chloroquine a 5-10 ug plazmatickej DNA. Potom boli bunky opracované 102 DMSO v PBS počas 1 minúty. obmyté médiom a inkubované v DMEM obsahujúcom 10X fetálne teľacie sérum, v ktorom bola predtým lnaktivovaná endogénna PAF-AH aktivita pomocou diizopropylfluorofosfátu (DFP). Po troch dňoch Inkubácie bola v médiách z transformovaných buniek zisťovaná PAF-AH aktivita. Meranie tejto aktivity boli uskutočňované v prítomnosti a neprítomnosti buď lOmM EDTA alebo lmM DFP, aby sa zistilo, či rekombinantný enzým vyžaduje vápnik a či. je inhibovaný DFP, ktorý je inhibítorom seríriesteráz, ako to bolo popísané v prípade PAF-AH Staffoririíoni et al., (1987), pozri vyššie. Negatívne kontroly zahrnovali bunky transformované pRc/CMV bez inzertu alebo s ínzertom sAH 406-3 v opačnej orientácii.Cells were seeded at a density of 300,000 cells per 60 mm diameter culture dish. The following day, the cells were incubated for 2 hours in DMEM containing 0.5 mg / ml OEAE extran, 0, linM chloroquine and 5-10 µg of plasma DNA. The cells were then treated with 10 6 DMSO in PBS for 1 minute. washed with medium and incubated in DMEM containing 10X fetal calf serum in which endogenous PAF-AH activity was previously inactivated with diisopropyl fluorophosphate (DFP). After three days of incubation, PAF-AH activity was detected in transformed cell media. Measurements of this activity were performed in the presence and absence of either 10 mM EDTA or 1 mM DFP to determine whether the recombinant enzyme required calcium and whether. is inhibited by DFP, which is an inhibitor of seriresterases as described for PAF-AH Stafforirioni et al., (1987), supra. Negative controls included pRc / CMV transformed cells with no insert or with a sAH 406-3 insert in the opposite orientation.
PAF-AH aktivita v superriatantoch z transformovaných buniek bola zisťovaná metódou Stafforiniho et al., (1990), pozri vyššie, s nasledujúcimi modifikáciami. Stručne zhrnuté, PAF-AH aktivita bola stanovená meraním hydrolýzy 3H acetátu z Eacetyl-3H1 PAF (New England Nuclear, Boston, MA). Voľný 3H acetát vo vodnej fáze bol oddelený od značeného substrátu pomocou chromatografle v reverznej fáze na oktadecylsllikagéle (Baker Research Products. Phlllpsburg, PA). Stanovenia boli uskutočňovaná s 10 ul supernatantu z transformovaných 7.2. v reakčnom objeme 50 ul.PAF-AH activity in transformed cell superriatants was determined by the method of Stafforini et al., (1990), supra, with the following modifications. Briefly, PAF-AH activity was determined by measuring the hydrolysis of 3 H acetate from Eacetyl- 3 H 1 PAF (New England Nuclear, Boston, MA). The free 3 H acetate in the aqueous phase was separated from the labeled substrate by reverse-phase chromatography on octadecyl gel (Baker Research Products, Illinois, PA). Assays were performed with 10 µl of supernatant from transformed 7.2. in a reaction volume of 50 µl.
buniek v 0.IM Hepes pufri, pH V jednej reakcii bolo použité celkovo 50 pmol substrátu s pomerom značený>neznačený PAF 1:5. Reakčné zmesi boli inkubované 30 minút pri 37 °C a zastavené pridaním 40 ul 10M kyseliny octovej. Roztok bol potom premytý na kolóne s oktadecylsilikagélom, prepláchnutej potom 0. IM acetátom sodný. Eluát každej vzorky bol odobraný a meraný na scintilačnom počítači počas jednej minúty.cells in 0.IM Hepes buffer, pH A total of 50 pmol substrate was used in one reaction with a ratio of labeled> unlabeled PAF of 1: 5. The reaction mixtures were incubated for 30 minutes at 37 ° C and stopped by adding 40 µL of 10 M acetic acid. The solution was then washed on a column of octadecyl silicagel, then rinsed with 0.1M sodium acetate. The eluate of each sample was collected and measured on a scintillation counter for one minute.
Ako je ukázané na obr. 2, média z buniek, transformovaných s sAH 406-3, obsahovali PAF-AH aktivitu s hodnotami štyrikrát vyššími ako pozadie. Táto aktivita nebola ovplyvnená prítomnosťou EDTA, avšak bola inhibovaná lml*l DFP. Tieto pozorovania dokazujú, že kloň sAH 406-3 kúduje enzým, ktoré aktivita je v súlade s ľudským plazmatickým enzýmom PAF-AH.As shown in FIG. 2, media from cells transformed with sAH 406-3 contained PAF-AH activity with values four times higher than background. This activity was not affected by the presence of EDTA, but was inhibited by 1 ml * 1 DFP. These observations demonstrate that the sAH 406-3 clone drives an enzyme which activity is consistent with the human plasma enzyme PAF-AH.
Príklad 8Example 8
DNA kódujúca ľudskú plazmatickú PAF-AH v úplnej dĺžke, jej rôzne skrátené formy a ďalej chimerickú myšaclu-ľudskú PAF-AH bola pomocou rekombinaritných metód exprlmovariá v E. coli a kvasinkách a trvalé exprlmovariá v cicavčích bunkách.DNA encoding full-length human plasma PAF-AH, its various truncated forms, and chimeric mouse-human PAF-AH were, by recombinant methods, expression in E. coli and yeast, and permanent expression in mammalian cells.
A. Expresia v E. coliA. Expression in E. coli
Pomocou PCR bol vytvorený proteíri kódujúci fragment cDNA klonu sAH 406-3 pre ľudskú plazmatickú PAF-AH, vhodný pre okamžité ďalšie kloriovanie v expresnom vektore v E. coli. Tento segment začína na 5'korici ľudského génu kodónom pre Ile^s (SEQ ID NO: 8), N-koricový aminokysellnový zvyšok enzýmu purifikovariého z ľudskej plazmy. V konštrukte bol zahrnutý zvyšok génu vrátane pôvodného terininačného kodóriu. Bol použitý nasledujúci 5' sense primér:By PCR, a protein encoding a cDNA fragment of the sAH 406-3 clone for human plasma PAF-AH was generated, suitable for immediate further cloning in an expression vector in E. coli. This segment begins at the 5 'of the human gene with the codon for Ile I s (SEQ ID NO: 8), an N-amino acid amino acid residue of an enzyme purified from human plasma. The remainder of the gene was included in the construct, including the original terinination codor. The following 5 'sense primer was used:
SEQ ID NO: 28SEQ ID NO: 28
5' TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3', ktorý obsahoval XbaT klonovacie miesto translačný iniciačný kodón (podčiarknutý). Bol použitý nasledujúci 3' antiserise primér:5 'TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3' that contained the XbaT cloning site translation initiation codon (underlined). The following 3 'antiserise primer was used:
SEQ ID NO: 29SEQ ID NO: 29
5'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATľCCTG 35'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTAT1CCTG 3
Tento primér zahrnoval terminačný kodón sAH 406-3 a obsahoval EcoRV kloriovacie miesto. PCR reakcie boli uskutočnené tak, ako to bolo popísané v Príklade 3. Výsledný PCR produkt bol štiepený enzýmami Xbal a EcoRV a ďalej klonovaný να vektore pBR322 obsahujúcom promótor Trp (deBoer et al., PfMS, 80121-25 (1983)) tesne pred klonovaclin miestom. Kmeň E. coli XL-1 Blue bol transformovaný expresným konštruktom a kultivovaný v L pOde obsahujúcej karbenicilin v koncentrácii 100 ug/ml. Transformarity rástli cez noc, boli centrifugované a resuspendované v lytickom pufri zloženom z 50mľl Tris-HCl pH 7, 5, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, lml*l EDTA, 100 ug/ml lyzozómu a 0,05 trypsín inhibujúcich jednotiek (TIU)/ml Aprotinínu. Po jednohodiriove j inkubácii na ľade a dvojminútovej sonikácii bola v lyzátoch stanovená aktivita PAF-AH metódou popísanou v Príklade 4. E. coli transformovaná expresným konštruktom (označeným trp AH) vytvárala proteín s PAF-AH aktivitou. Pozri tab. 6 v Príklade 9.This primer included a termination codon of sAH 406-3 and contained an EcoRV cleavage site. PCR reactions were performed as described in Example 3. The resulting PCR product was digested with XbaI and EcoRV and further cloned into the pBR322 vector containing the Trp promoter (deBoer et al., PfMS, 80121-25 (1983)) just prior to cloning. place. The E. coli XL-1 Blue strain was transformed with an expression construct and cultured in L soil containing carbenicillin at a concentration of 100 µg / ml. Transformarities were grown overnight, centrifuged and resuspended in lysis buffer composed of 50mL Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl, 10mM CHAPS, 1mL * 1 EDTA, 100µg / ml lysosome and 0.05 trypsin inhibiting units (TIU) / ml of Aprotinin. After one hour incubation on ice and two minutes sonication, PAF-AH activity was determined in the lysates by the method described in Example 4. E. coli transformed with an expression construct (termed trp AH) produced a protein with PAF-AH activity. See tab. 6 in Example 9.
Bolí použité aj konštrukty obsahujúce iné promótory, riadiace expresiu ľudského PAF-AH v E. coli - tacll promótor (deBoer, pozri vyššie), arabiriózový (ara B) promótor zo Salmonella typhimurium ĽHoruitz et al., Gene, 14.-309-319 (1981)3 a promótor bakteriofága T7. Konštrukty obsahujúce Trp promótor (pUC trp AH), tacll promótor (pUC tac AH) a araB promótor (pUC ara AID boli zostrojené na základe plazmidu pUC19 (neu Engalrid Blolabs. l*IA), zatiaľ čo konštrukt s T7 promótorom utvorený z plazmidu pET15B (Novagen. Madison, WI) hybridným promótorom (pHAB/PH), tvorený araB (pET AH) bol Konštrukt s pripojeným kConstructs containing other promoters were also used to control expression of human PAF-AH in the E. coli tacII promoter (deBoer, supra), the arabiriose (ara B) promoter from Salmonella typhimurium L. Horitz et al., Gene, 14-309-319. (1981) 3 and the bacteriophage T7 promoter. Constructs containing the Trp promoter (pUC trp AH), the tacII promoter (pUC tac AH), and the araB promoter (pUC ara AID) were constructed based on plasmid pUC19 (neu Engalrid Blolabs. 1 * IA), whereas the T7 promoter construct was constructed from plasmid pET15B. (Novagen. Madison, WI) a hybrid promoter (pHAB / PH), consisting of araB (pET AH), was a construct with
T7 promótorovej oblasti bol PET15B. Všetky konštrukty ribozúmovému väzbovému miestu z takisto vytvorený z plazmidu produkovali v E. coli proteíny s PAF-AH aktivitou v rozsahu 20 až 50 U/ml/0DÄOo· Táto aktivita zodpovedá celkovému množstvu rekombiriantného proteínu >1% všetkých bunkových proteínov.The T7 promoter region was PET15B. All constructs of the ribosome binding site z also generated from the plasmid produced proteins in E. coli with PAF-AH activity in the range of 20-50 U / ml / 0D o0 o. This activity corresponds to a total recombinant protein> 1% of all cellular proteins.
Bolo takisto zhodnotených niekoľko expresných korištruktav. ktoré produkujú v E. coli PAF-AH s predĺženými N-koncami. N-koniec prírodnej ľudskej PAF-AH bol na základe sekvencovanla aminokyselín stanovený ako ľle42 (Príklad 2). Avšak sekvenčia hezprnstredne pred Tle-is·Several expression constructs were also evaluated. which produce PAF-AH in E. coli with extended N-termini. The N-terminus of natural human PAF-AH was determined to be β 42 based on amino acid sequencing (Example 2). However, the sequence is right in front of Tle-is ·
3R nezodpovedá and nokysel i nám tvorí ard m3R does not match and no acid also makes us ard m
Cieľové míest.O pre odštiepenie signál nehn pp.pf.1dn Γ t n znamená pravidlo -A-1 nie je splnené, keďže v pozícii -1 nie .je prítomný lyží n, (pnzri vnn Heljne, Nim. Arrfrte Rfí.tt,, 14 s 4RR3-4RRI.1 (1ARR11, .Tr mnžné, že je sekrečným systémom bunky rozpoznávaná k.lasi cke- jš1 a signálna sekvenria fl*lj-A17 alebo l*l.-P=1) a potnm nasleduje ďalšie endnprnte.nl y ti oké štiepenie (Príklad 2). Celá PAF-AH kódujúca sekvenria, začínajúca metioninom (nuklentidy 1 R? až 1 4R7 zn sekvencie RFC! ΤΠ NO: 7) hni a upravená pre expresiu v F, rnli pomocnú ŕ.r~p prnmrttnra . Tentn knnštrnkt tvoril aktívny PAF—AH. avšak akri je tn uvedené u tab. 4, jehn expresia dosahovala asi jedni i päťdesiatimi úrovne expresi.e pôvodného knnštri ik tu, začínajúceho Tlena, Tietn výsledky naznačujú, že predĺženie prnteínii na jehn N—knnci nie je kritické ani nutné pre aktivitu reknmhl nanf néhn PAF—AH v F, cr>11 .Destination point.O for cleaving the nehn signal pp.pf.1dn Γ tn means rule -A-1 is not met, since in position -1 not there is ski n present, (eg in vnn Heljne, Nim. Arrfrte Rfí.tt ,, 14 with 4RR3-4RRI.1 (1ARR11, .Tr may be that the cell secretion system is recognized by clasic and signal sequence fl * lj-A 17 or l * l-P = 1 ) and then followed by another end The entire PAF-AH coding sequence starting with methionine (nuclides 1R? to 14R7 n of sequence RFC1? P NO: 7) is digested and engineered for expression in F, helper helper. ~ p prnmrttnra. Tentn knnštrnkt, the active PAF-AH. however, the acridinium t n is referred to in the Table. 4, lamb expression was around fifty both, the level of the original expresi.e knnštri also here, the starting Tlc, Tietn results indicate that the extension of the prnteínii N-knot is not critical or necessary for the activity of recombinant PAF-AH in F, cr> 11.
Tabuľka 4Table 4
Aktivita PAF-AH (Ι.Ι/Π1_Ί/0ηώΟΟ)PAF-AH activity (Ι.Ι / Π1_Ί / 0η ώΟΟ )
V F, colí môžu byť takisto priprave.né skrátené reknmhi nantné formy Ti.idsksj PAF—AH pninncnu pl azm1 du s malým počtom kópií na hlinku a promótora, ktorý je indukovaný pridaním arabinózy dn kul tivačriého média, Jednm.i z takýchto foriem PAF-AH, skrátených na N-knnci, je produkt reknmhi.na.ntnsj expresie DNA kódujúci amínnkyselinnvé zvyšky Met^x, až Asn4ni poľlypeptidu kódovaného úpl.nou PAF—AH cDNA (SFli ID NO: A), Je označený akn rPH,2. Pre produkciu rPH,2 v hakteriá.l.nych bunkách hni použitý plazmi d pRAR2/PH,2 ndvndený nd pRR322, ktorý obsahuje (I) nukleotidy 2A7 až 1487 zo sekvencie SEQ ID N0« 7, ktorá kóduje ľudský PAF-AH začínajúci kodónom pre metionín v pozícii 46, (2) araB-C promótory a araC gén z arablnózového operónu Salmonella typhimurium, (3) transkripčne terminančnú sekvenciu z bakteriofága T7 a (4) replikačný začiatok fága fl.Also, shortened recombinant forms of TiHuman PAF-AH foamy plasmid with a low copy number on clay and a promoter that is induced by the addition of arabinose in culture medium can also be prepared in such forms of PAF-AH. truncated on the N-knot is the product of recombinant DNA expression encoding the amino acid residues Met? x to Asn ? 4 of the polypeptide encoded by the complete PAF-AH cDNA (SFI ID NO: A). For the production of rPH, 2 in bacterial cells, the plasmid d pRAR2 / PH, 2 nd nR pRR322, which contains (I) nucleotides 2A7 to 1487 of SEQ ID NO: 7, which encodes human PAF-AH starting with a codon, is now used. for the methionine at position 46, (2) the araB-C promoters and the araC gene from the arabnose operon Salmonella typhimurium, (3) the transcription termination sequence from bacteriophage T7, and (4) the phage fl1 origin of replication.
Konkrétne zahrnuje pBAR/PH.2 nasledujúce úseky DNA: (1) oblasť od zrušeného Aatľľ miesta v pozícii 1994 k EcoRI miestu v pozícii 6274, to znamená sekvencia vektora s obsahom replikačného začiatku a gény zodpovedané za rezistenciu k apmicilínu alebo tetracyklínu odvodené od bakteriálneho plazmidu pBR322: (2) oblasť od EcoRI miesta v pozícii 6274 k Xbal miestu v pozícii. 131, to znamená DNA arablnózového operónu zo Salmonella typhimurium (Genbank Accession nuinber: 1*111045, M11046, 1*111047, J01797); (3) oblasť od Xbal miesta v pozícií 131 k Ncoľ miestu v pozícii 170, to znamená DNA obsahujúcu väzbové miesto pre rlbozóm z pET-21b (Novagen, Madison, UI); (4) oblasť od Ncoľ miesta v pozícii 17D k Xliol miestu v pozícii 1363, to znamená sekvencia ľudskej PAF-AH cDNA a (5) oblasť od Xhol miesta v pozícii 1363 k zrušenému Aatľľ miestu v pozícii 1993. to znamená DNA fragment z pET-21b (Novagen), s obsahom transkripčne terminačnej sekvencie bakteriofága T7 a replikačného začiatku bakteriofága fl.Specifically, pBAR / PH.2 comprises the following DNA regions: (1) a region from the deleted AAT1 site at position 1994 to the EcoRI site at position 6274, that is, a vector sequence containing a replication origin and genes responsible for resistance to apmicillin or tetracycline derived from a bacterial plasmid pBR322: (2) a region from the EcoRI site at position 6274 to the XbaI site at position. 131, i.e. Salmonella typhimurium arabnose operon DNA (Genbank Accession nuinber: 1 * 111045, M11046, 1 * 111047, J01797); (3) a region from an XbaI site at position 131 to an NcoI site at position 170, that is, a DNA containing a rlbosome binding site from pET-21b (Novagen, Madison, UI); (4) a region from the NcoI site at position 17D to the Xliol site at position 1363, that is, the sequence of the human PAF-AH cDNA, and (5) a region from the XhoI site at position 1363 to the deleted AATI site at position 1993. -21b (Novagen), containing the transcription termination sequence of bacteriophage T7 and the bacteriophage fl1 origin of replication.
Iná forma PAF-AH, označená ako rPF.9, je produktom rekombinantnej expresie DNA kódujúcej amiriokyselinové zvyšky Met^A až Ilen4a£ polypeptidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEl'3 ID NO: 8). DNA kódujúca rPH.9 bola vložená do toho istého vektora, ktorý bol použitý pre produkciu rPH.2 v bakteriálnych bunkách,. Tento plazmid bol nazvaný PBAR2/PH.9, je zložený z nasledujúcich úsekov DNA: (1) oblasť od zrušeného Aatľľ miesta v pozícii 1958 k EcoRI miestu v pozícii 6239, to znamená sekvencia vektora obsahujúca replikačný začiatok a gény zodpovedné za rezistenciu k ampicilínu alebo tetracyklínu odvodené od bakteriálneho plazmidu pBR322; (2) oblasť od EcoRI miesta v pozícii 6239 k Xbal miestu v pozícií 131, to znamená DNA arablnózového operónu zo Salmonella typhimurium (Genbank accession number. M11045. M11046. M11047, J01797); (3) oblasť odAnother form of PAF-AH, designated as rPF.9, is the product of recombinant expression of DNA encoding the amino acid residues of Met? A to Ilen 4 and? A polypeptide encoded by the complete PAF-AH cDNA (SE13 ID NO: 8). The DNA encoding rPH.9 was inserted into the same vector that was used to produce rPH.2 in bacterial cells. This plasmid was named PBAR2 / PH.9, consisting of the following DNA regions: (1) a region from the deleted AAT1 site at position 1958 to the EcoRI site at position 6239, i.e., a vector sequence containing an origin of replication and genes responsible for ampicillin resistance; tetracycline derived from the bacterial plasmid pBR322; (2) a region from the EcoRI site at position 6239 to the XbaI site at position 131, that is, the arabnose operon DNA from Salmonella typhimurium (Genbank accession number. M11045, M11046, M11047, J01797); (3) Area from
Xbal miesta v pozícii 131 k Ncol miestu v pozícii 170, to znamená DNA obsahujúcu väzbové miesto pre ribozóm z pET-21b CNovagen, Madison, UI) ; (4) oblasť od Ncol miesta v pozícii 170 k Xhol miestu v pozícii 1363, to znamená sekvencia ľudskej PAF-AH cONA a C 5) oblasť od Xhol miesta v pozícii 1328 k zrušenému AatlI miestu v pozícii 1958, to znamená DNA fragment z pET-21b CNovagen), s obsahom transkripčne termiriačriej sekvencie bakteriofága T7 a replikačného začiatku bakterlofága fl.XbaI sites at position 131 to the NcoI site at position 170, i.e. DNA containing the ribosome binding site of pET-21b (CNagen, Madison, UI); (4) a region from the NcoI site at position 170 to the XhoI site at position 1363, that is, the sequence of human PAF-AH cONA, and C) a region from the XhoI site at position 1328 to the deleted AatII site at position 1958, i.e. the DNA fragment from pET -21b CNovagen), containing the transcriptional thermirectional sequence of bacteriophage T7 and the replication origin of bacteriophage fl.
Expresie PAF-AH proteínov v pBAR/PH.2 a v pBAR/PH.9 je riadená promótorom araB, ktorý je v prítomnosti glukózy a neprítomnosti arabinózy dokonale reprimovaný, ale funguje ako do média s vyčerpanou je dosiahnutá pridanímThe expression of PAF-AH proteins in pBAR / PH.2 and pBAR / PH.9 is under the control of the araB promoter, which is perfectly repressed in the presence of glucose and in the absence of arabinose, but functions as a depleted medium by addition
Cminimálne médium M9 hydrolyzátom kazeínu).(M9 medium casein hydrolyzate).
silný promótor po pridaní L-arabinózy glukózou. Selekcia buniek s plazmidom ampicllínu Calebo príbuzného antibiotika) alebo tetracyklínu do média. Pre expresiu rekomblnantného PAF-AH môže byť použitých mnoho kmeňov E. coli vrátane C ale ne výhradne) kmeňov prototrofných v metabolizme arabinózy ako napr. U3110. DH5‘D , BL21. C600, JM101 a ich derivátov, kmeňov nesúcich mutácie znižujúce proteolýzu ako napr. CAG829, KY1429 a kmeňov neschopných rozkladať arabinózu ako napr. SB7219 a MC1051. Výhoda použitia kmeňa, ktorý nedokáže rozkladať arabinózu. spočíva v tom, že induktor Carabinóza) expresie PAF-AH nie je odčerpávaný z média počas indukčnej periódy, čo vedie k vyšším hladinám PAF-AH v porovnaní s hladinami dosiahnutými v prípade kmeňov schopných metabollzovať arabinózu. Aktívne PAF-AH formy sú exprimované v rôznych kmeňoch E. coli v akomkoľvek vhodnom médiu a pri akýchkoľvek vhodných podmienkach. Bohaté médiá LB, E0M295 doplnené kvasnlčnýin extraktom a kyslým rovnako ako definované médiá CA675, to znamená minimálne médium A nastavené na pH 5,75, s glycerolom ako zdrojom uhlíka, doplnené stopovými prvkami a vitamínmi) dovoľujú značnú produkciu rPAF-AH foriem. Do médií je pridávaný tetracyklín, ktorý zaisťuje vďaka selekčnému tlaku prítomnosť plazmldu v kultúre.strong promoter after addition of L-arabinose with glucose. Selection of cells with the plasmid ampicillin (or related antibiotic) or tetracycline into the medium. Many E. coli strains including C but not exclusively) strains prototrophic in arabinose metabolism such as e.g. U3110. DH5‘D, BL21. C600, JM101 and derivatives thereof, strains harboring proteolysis-reducing mutations such as e.g. CAG829, KY1429 and strains unable to degrade arabinose such as e.g. SB7219 and MC1051. The advantage of using a strain that cannot decompose arabinose. consists in that the inducer (Carabinosis) of PAF-AH expression is not pumped out of the medium during the induction period, resulting in higher levels of PAF-AH compared to those achieved with strains capable of metabolizing arabinose. The active PAF-AH forms are expressed in various strains of E. coli in any suitable medium and under any suitable conditions. Rich LB media, E0M295 supplemented with yeast extract and acidic as well as defined CA675 media, i.e. at least medium A adjusted to pH 5.75, with glycerol as a carbon source, supplemented with trace elements and vitamins) allow considerable production of rPAF-AH forms. Tetracycline is added to the media to ensure the presence of plasmid in the culture due to selection pressure.
Kmeň E. coli MC1061 CATCC 53338). nesúci deléciu arabinózového operónu a teda neschopný metabolizovať arabinózu, bol transformovaný plazmidom pBAR2/PH.2. Kmeň ľlC1061 je auxotrofný ria leucín, bol kultivovaný pri stálom doplňovaní médií obsahujúcimi, kazeínový extrakt a komplemeritujúcimi tak leucínovú mutáciu. Bunky E. coli transformované pBAR/PH.2 boli pestované pri 30 °C v rastových médiách obsahujúcich 2g/L glukózy. Glukóza má dvojitý význam - slúži ako zdroj uhlíka pre rast buniek a ako represor arabinózového promótora. Keď poklesla hladina glukózy na <50 mg/L, zaCalo doplňovanie živín pomocou koncentrátu Cglukóza v koncentrácii 300g/L). Doplňovanie glukózy sa počas 16 hodín lineárne zvyšovalo rýchlosťou, ktorá obmedzovala tvorbu kyslých vedľajších produktov. V tomto okamihu bolo doplňovanie glukózy nahradené pridávaním glycerolu. SúCasne bola pridávaná L-arabirióza (500g/L) do výslednej koncentrácie 5 g/L. Doplňovanie glycerolu bolo udržiavané na stálej výške počas 22 hodín. Bunky boli zozbierané pomocou filtrácie na dutých vláknach, pritom sa suspenzia buniek asi lD-krát zahustila. Bunkový sediment bo.l uložený pri -70 *C. Celková bunková hmota dosahovala asi 80g/L (ODúoo = 50-60) s PAF-AH aktivitou 65-70 jednotiek/OD/ml, Co predstavuje asi 10X všetkých bunkových proteínov. Bakteriálna kultúra s koneCným objemom asi 75 litrov obsahovala 50-60g PAF-AH.E. coli strain MC1061 (CATCC 53338). carrying arabinose operon deletion and thus unable to metabolize arabinose was transformed with plasmid pBAR2 / PH.2. Strain 1C1061 is an auxotrophic ria leucine, was cultured by constant replenishment of media containing casein extract and complemerating the leucine mutation. PBAR / PH.2 transformed E. coli cells were grown at 30 ° C in growth media containing 2g / L glucose. Glucose has a double meaning - it serves as a carbon source for cell growth and as a repressor for the arabinose promoter. When the glucose level dropped to <50 mg / L, nutrient replenishment with glucose concentrate (300 g / L) started. Glucose replenishment increased linearly over 16 hours at a rate that limited the formation of acidic by-products. At this point, glucose replenishment was replaced by the addition of glycerol. L-arabirosis (500g / L) was added simultaneously to a final concentration of 5g / L. Glycerol replenishment was maintained at a constant height for 22 hours. Cells were harvested by hollow fiber filtration, whereby the cell suspension was concentrated approximately 1-fold. Cell sediment bo.l stored at -70 ° C. Total cell mass reached about 80g / L (OD 600 = 50-60) with a PAF-AH activity of 65-70 units / OD / ml, which represents about 10X of all cellular proteins. A bacterial culture with a final volume of about 75 liters contained 50-60g PAF-AH.
Vysoká úroveň produkcie rPAF-AH foriem môže byť docielená expresiou PBAR2/PH.2 alebo PH.9 v kmeňoch SB7219 a MC1061. Iné kmene neschopné odbúravať arabinózu sú takisto vhodné pre dosiahnutie vysokej hustoty bakteriálnej kultúry. DoporuCujú sa nasledujúcu podmienky kultivácie baktérií. FermentaCné tanky obsahujúce kultivačné médiu s 2g/L glukózy sú zaočkované exponenciálne rastúcimi kmeňmi SB7219;pBAR2/PH* 2 a SB7219spBAR2/PH.9. Po spotrebovaní glukózy sú fermentaCné tanky zásobované roztokom glycerolu obsahujúcim stopové prvky, vitamíny, horčík a amónne soli tak. aby bol udržaný zdravý exponenciálny rast. Teplota fermentora je udržiavaná na 30 °C, tanky sú prevzdušňované a pretrepávané tak. že je hladina rozpusteného kyslíka nad 15% saturácie. Keď je hustota bakteriálnej kultúry vyššia ako llDg/L (mokrá váha), sú živiny doplňované konštantnou rýchlosťou, ku kultúre je pridané L-arabirióza C konečná koncentrácia asi 0, 5%). Tvorba produktu Je sledovaná počas 16-22 hodín. Výťažok dosahuje zvyčajne hodnoty 40-50 g/L Csuchá váha buniek). Bunky sú zozbierané ceritrifugáciou, uložené pri -70 °C a rPAF-AH je vyčistený pre ďalšie analýzy. Špecifické výťažky vySSie ako 150 jednotiek/nil/OD^oo sú dosahované bežne.High levels of production of rPAF-AH forms can be achieved by expression of PBAR2 / PH.2 or PH.9 in strains SB7219 and MC1061. Other strains unable to degrade arabinose are also suitable for achieving a high density of bacterial culture. The following bacterial culture conditions are recommended. Fermentation tanks containing 2g / L glucose culture medium are inoculated with exponentially growing strains SB7219; pBAR2 / PH * 2 and SB7219spBAR2 / PH.9. After glucose has been consumed, the fermentation tanks are supplied with a glycerol solution containing trace elements, vitamins, magnesium and ammonium salts so. to maintain healthy exponential growth. The fermentor temperature is maintained at 30 ° C, the tanks are aerated and shaken. the dissolved oxygen level is above 15% saturation. When the density of the bacterial culture is higher than 11Dg / L (wet weight), the nutrients are replenished at a constant rate, L-arabiriose C (final concentration of about 0.5%) is added to the culture). Product formation is followed for 16-22 hours. The yield is usually 40-50 g / L (dry cell weight). Cells are harvested by ceritrifugation, stored at -70 ° C and rPAF-AH is purified for further analysis. Specific yields higher than 150 units / µl / OD 40 are commonly achieved.
B. Expresia v kvasinkáchB. Yeast expression
Ľudská rekombinantná PAF-AH bola takisto exprimovaná v Saccharomyces cerevísíae. Na riadenie expresie rPAF-AH bol použitý kvasriičný promótor ADH2, produkcie dosiahla hodnoty 7 jednatiek/ml/OD.i.oo CTab.5).Human recombinant PAF-AH was also expressed in Saccharomyces cerevisiae. The yeast ADH2 promoter was used to control the expression of rPAF-AH, production reached 7 units / ml (OD.i.oo CTab.5).
Tabuľka 5Table 5
C. Expresia PAF-AH v cicavčích bunkáchC. Expression of PAF-AH in Mammalian Cells
1. Expresia ľudského PAF-AH cDNA konStruktu1. Expression of a human PAF-AH cDNA construct
Plazmldy konštruované pre expresiu PAF-AH využívajú s výnimkou pSNF/PAFAH.l silný vírusový promótor pôvodom z cytomagalovlrusu. polyadenylaCné miesto z génu pre kravský rastový hormón a replikačný začiatok vírusu SV40 na zaistenie vysokého počtu kópií plazmidu v COS bunkách. Plazmidy boli. vnesené do buniek pomocou elektroporácie. Najprv bola pripravená súprava plazmldov. v ktorých boli buď 5'hraničná sekvencia (pDCl/PAFAH.l). alebo ako 5' tak aj 3'hraničná sekvencia ľudskej PAF-AH cDNA (PDC1/PAFAH.2), nahradené hraničnými oblasťami iných génov, ktoré sa vyznačujú vysokou úrovňou expresie v cicavčích bunkách. Trarisfekcla týchto plazmldov do COS, CHO či 293 buniek viedla k produkcii PAF-AH v rovnakej výške (0,01 jednotiek/ml teda 2-4-krát vyššie ako úroveň pozadia). aká bola dosiahnutá s klanom sAH-406 po transientnej expresii COS buniek (Príklad 7). Bol konštruovaný ďalší plazmld obsahujúci promóto Friendovho slezinného vírusu namiesto promótora cytomegalovírusu. cDNA pre ľudskú PAF-AH bola vložená do plazmidu ρπιΗ-neo (Hahn et al., Gene 127s 267 (1993)) pod kontrolou promótora Friendovho slezinného vírusu. Po transfekcii buniek myelómovej linie NSO plazmidom pSFN/PAFAH.l a otestovaní niekoľkých sto klonov boli zistené dve: transfektanty (4B11 a 1C11), ktoré dávali 0,15-0,5 jednotiek/ml aktivity PAF-AH. Produktivita týchto dvoch NSO transfektantov zodpovedá asi 0, 1 mg/liter. ak predpokladáme špecifickú aktivitu asi 5000 jednobiek/mg.Plasmids engineered to express PAF-AH utilize, with the exception of pSNF / PAFAH.1, a strong viral promoter derived from cytomagalovirus. a polyadenylation site from the cow's growth hormone gene and the SV40 virus replication origin to provide a high copy number plasmid in COS cells. The plasmids were. introduced into the cells by electroporation. First, a set of plasmids was prepared. in which there were either 5 'border sequences (pDCl / PAFAH.1). or both the 5 'and 3' flanking sequences of human PAF-AH cDNA (PDC1 / PAFAH.2), replaced by flanking regions of other genes that exhibit high levels of expression in mammalian cells. Trisection of these plasmids into COS, CHO, or 293 cells resulted in the production of PAF-AH at the same level (0.01 units / ml, thus 2-4 times higher than the background level). as achieved with the sAH-406 clan after transient expression of COS cells (Example 7). Another plasmid containing the Friend's spleen virus promoter instead of the cytomegalovirus promoter was constructed. The human PAF-AH cDNA was inserted into the plasmid ρπιΗ-neo (Hahn et al., Gene 127s 267 (1993)) under the control of the Friend's spleen virus promoter. After transfection of NSSO myeloma line cells with plasmid pSFN / PAFAH.1 and testing several hundred clones, two were found: transfectants (4B11 and 1C11), which gave 0.15-0.5 units / ml PAF-AH activity. The productivity of the two NSO transfectants corresponds to about 0.1 mg / liter. assuming a specific activity of about 5000 units / mg.
2. Expresla PAF-AH chimerických konštruktov tvorených myšacím a ľudským génom2. Expression of PAF-AH chimeric constructs produced by the mouse and human gene
Konštrukt pRC/ľlS9 obsahujúci. cDNA pre myšaciu PAF-AH v cicavčom expresnom vektore oRc/CMV viedol po transfekcii do COS buniek k produkcii sekretovanej formy PAF-AH vo výške 5-10 jednotiek/ml (1000-krát vyššie nad úrovňou pozadia). Ak predpokladáme, že je špecifická aktivita myšacej PAF-AH približne rovnaká ako v prípade ľudského enzýmu, je myšacia cDNA exprimovaná asi 500-krát až 1000-krát viac ako ľudská cDNA pre PAF-AH.PRC / 1S9 construct containing. The mouse PAF-AH cDNA in the mammalian oRc / CMV expression vector resulted in the production of a secreted form of PAF-AH at a rate of 5-10 units / ml (1000-fold above background level) after transfection into COS cells. Assuming that the specific activity of murine PAF-AH is approximately the same as that of the human enzyme, murine cDNA is expressed about 500 to 1000-fold more than human cDNA for PAF-AH.
Aby mohol byť preskúmaný rozdiel medzi úrovňou expresie ľudskej a myšacej PAF-AH v COS bunkách, boli zostrojené dva chimerické ľudské-mySacie gény a sledované z hľadiska expresie v COS hunkách. Prvý korištrukt, pRc/PH. HI*IC1, obsahuje kódujúcu sekvenclu pre 97 N-koncových polypeptidu (SEO ID NO x 21) aminokyselinám ľudskej PAF-AH aminokyselín myšacieho PAF-AH pripojených k 343 C-koncovým v expresnom vektore pRc/CI*IV (Invitrogen, San Diego, CA) . Druhý chimerický gén pRc/PH. I*IHC2 obsahuje kódujúcu sekvenclu pre 40 N-koncových aminokyselín myšacieho PAF-AH polypeptidu pripojených k 400 C-koncovým zvyškom ľudskej PAF-AH v pRc/CI*lV. Po transfekcií COS buniek plazmidoin pRc/PH. ľlHCl došlo k akumulácii 1-2 jednotiek/ml PAF-AH aktivity v médiu. V kondiciovaných médiách z bunkovej kultúry trarisf ormovarie j plazmidoin pRc/PH. ľlCH2 bola zistená len 0,01 Jednotky/ml PAF-AH aktivity. Z týchto pokusov vyplýva, že rozdiel v úrovni expresie myšacieho a ľudského PAF-AH génu je aspoň čiastočne spôsobený vlastnosťami polypeptidového segmentu vymedzeného aininokyselinovými zvyškami 40 až 97, alebo príslušným úsekom RNA ši DNA, kódujúcim túto oblast PA-AH proteínu.To investigate the difference between the level of expression of human and mouse PAF-AH in COS cells, two chimeric human-mouse genes were constructed and screened for expression in COS hunks. The first structure, pRc / PH. HI * IC1, contains the coding sequence for 97 N-terminal polypeptides (SEO ID NO x 21) of the human PAF-AH amino acids of murine PAF-AH linked to the 343 C-terminal in the pRc / CI * IV expression vector (Invitrogen, San Diego, CA). Second chimeric pRc / PH gene. I * IHC2 contains the coding sequence for the 40 N-terminal amino acids of the murine PAF-AH polypeptide linked to the 400 C-terminal residues of human PAF-AH in pRc / CI * IV. After transfection of COS cells with plasmidoin pRc / PH. 1 HCl accumulated 1-2 units / ml PAF-AH activity in the medium. Plasmidido pRc / PH is used in conditioned media from trarisforum cell culture. 1 CH 2 was found only 0.01 Units / ml PAF-AH activity. These experiments show that the difference in expression level of the murine and human PAF-AH gene is at least in part due to the properties of the polypeptide segment delimited by the amino acid residues 40-97, or the corresponding region of RNA and DNA encoding this region of PA-AH protein.
3. Prekódovanie prvých 290 bp sekvencie PAF-AH3. Recoding the first 290 bp sequence of PAF-AH
Jedna z hypotéz vysvetľujúcich nízku úroveň syntézy ľudskej PAF-AH v trarisf orinovaných cicavčích bunkách predpokladá, že použitie kodóriov v prirodzenom géne nie je optimálne pre účinnú expreslu. Nezdá sa však pravdepodobné, že by typ použitých kodóriov mohol byť zodpovedný za 500-1000-násobný rozdiel v úrovní expresie medzi ľudským a myšacím génom, pretože optimalizácia kodónov vedie len k 10-násobnému zvýšeniu expresie. Druhá hypotéza vysvetľuje rozdielnu úroveň expresie myšacieho a ľudského PAF-AH génu v prítomnosti sekundárnej štruktúry v 5' kódujúcej oblasti ľudskej PAF-AH mRNA. ktorá vedie k relatívne rýchlej degradácii mRNA, alebo spôsobuje neúčinnú iniciáciu či elongáclu trarislácie.One of the hypotheses explaining the low level of synthesis of human PAF-AH in tris-treated mammalian cells suggests that the use of codors in the natural gene is not optimal for efficient expression. However, it does not appear likely that the type of coders used could be responsible for the 500-1000 fold difference in expression levels between the human and mouse genes, since codon optimization only results in a 10 fold increase in expression. The second hypothesis explains the different levels of expression of the mouse and human PAF-AH gene in the presence of a secondary structure in the 5 'coding region of human PAF-AH mRNA. which leads to relatively rapid degradation of mRNA, or causes ineffective initiation or elongation of trarislation.
S cieľom overenia týchto hypotéz bo zostrojený syntetický fragment kódujúci pôvodný ľudský PAF-AH proteín od N-konca až k amlnokysellnovému zvyšku 96, v ktorom bola väčšina kodónov nahradená (prekódovaná) kodónml pre tú istú aminokyselinu, avšak majúcimi odlišnú sekvenclu. Zmena z GTA v druhom kodóne viedla k vytvoreniu Asp718 miesta. ktoré je na jednom konci syntetického fragmentu a ktoré je takisto prítomné v myšacej cDNA. Druhý koniec fragmentu obsahoval BamHI miesto vyskytujúce sa v kodóne 97 ľudského génu. Asp718/BamHI fragment dlhý asi 290 bp bol odvodený od PCR fragmentu pripraveného pomocou duálnej asymetrickej PCRs postupu na konštrukciu syntetických génov popísaného v Saridhu et al., BioTec/miques, 12 s 14-16 C1992) . Syntetický Asp718/BamHI fragment bol ligovaný s DNA fragmentmi, kódujúcimi zvyšok molekuly ľudskej PAF-AH, začínajúcimi nukleotldom 463 zo SEC) ID NO. 7. Potom bola sekvencia kódujúca pôvodný ľudský PAF-AH enzým vložená do cicavčieho expresného vektora pRc/CPIV (Invitrogen, Sari Diego), čím bol vytvorený plazmid pRc/HPH.4. Úplná sekvencia prekódovaného génu je uvedená v SEC) ID NO* 30. Oblasť v pRc/HPH.4 priliehajúca k 5' koncu sekvencie kódujúcej ľudskú PAF-AH pochádza z myšacej cDNA pre PAF-AH v pRo/l*IC9 (nukleotidy 1 až 116 zo SEC) ID NO. 21).To verify these hypotheses, a synthetic fragment encoding the original human PAF-AH protein was constructed from the N-terminus to the amino acid residue 96 in which most codons were replaced (recoded) with the same amino acid codon but having a different sequence. A change from GTA in the second codon resulted in the creation of an Asp718 site. which is at one end of the synthetic fragment and which is also present in the mouse cDNA. The other end of the fragment contained a BamHI site found in codon 97 of the human gene. The Asp718 / BamHI fragment of about 290 bp was derived from a PCR fragment prepared by the dual asymmetric PCRs procedure for the construction of the synthetic genes described in Saridh et al., BioTec / miques, 12 s 14-16 (1992). The synthetic Asp718 / BamHI fragment was ligated with DNA fragments encoding the remainder of the human PAF-AH molecule, starting at nucleotide 463 of SECID ID NO. Then, the sequence encoding the native human PAF-AH enzyme was inserted into a mammalian expression vector pRc / CPIV (Invitrogen, Sari Diego) to create the plasmid pRc / HPH.4. The complete sequence of the recoded gene is shown in SEC) ID NO * 30. The region in pRc / HPH.4 adjacent to the 5 'end of the sequence encoding human PAF-AH originates from the murine PAF-AH cDNA at pRo / 1 * IC9 (nucleotides 1 to 116 of SEC) ID NO. 21).
transformácie COS pRc/HPH.4 bude obsahujúceho géntransformation of COS pRc / HPH.4 will contain the gene
COS bunky boli tranzientrie transformované plazmldml pRc/HPH. 4 (prekódovaný ľudský gén). pRc/l*IS9 (myšací PAF-AH) a pRc/PH.I*IHC1 (hybridná sekvencia myš-človek č.l) s cieľom stanovenia expresie ľudskej PAF-AH z pRc/HPH.4. V kondiciovaných médiách z transformovaných bunkových kultúr bola zisťovaná PAF-AH aktivita, ktorá nadobúdala hodnoty 5, 7 jednotky/ml (myšací gén), 0.9 jednotky/ml (hybridná sekvencia myš-človek č.l) a 2.6 jednotky/ml (prekódovaný ľudský gén). Prekódovanie prvých 290 bp kódujúcej sekvencie pre ľudskú PAF-AH sa ukázalo byť ako úspešná stratégia a zdvihlo hladinu expresie ľudskej PAF-AH z niekoľkých nanogramov/ml na asi 0, 5 mikrogramu/ml počas tranzieritne j buniek. Prekódovaný gén pre PAF-AH z plazmidu vložený do cicavčieho expresného vektora pre dihydrofolátreduktázu (DHFR) a týmto vektorom bude transformovaná DHFR negatívna bunková línia ovária čínskeho chrčka. Transformované bunky budú podrobené selekcii metotrexátom. tak budú získané kleny, ktoré tvoria veľké množstvo ľudskej PAF-AH vďaka génovej ampliflkácli.COS cells were transiently transformed with plasmid ml pRc / HPH. 4 (recoded human gene). pRc / 1 * IS9 (murine PAF-AH) and pRc / PH.1 / IHC1 (mouse-human hybrid sequence # 1) to determine expression of human PAF-AH from pRc / HPH.4. In conditioned media from transformed cell cultures, PAF-AH activity was determined to have values of 5.7 units / ml (mouse gene), 0.9 units / ml (mouse-human hybrid sequence # 1) and 2.6 units / ml (recoded human gene). Recoding the first 290 bp coding sequence for human PAF-AH proved to be a successful strategy and raised the level of expression of human PAF-AH from several nanograms / ml to about 0.5 micrograms / ml during transient cells. The recoded PAF-AH gene from the plasmid was inserted into a mammalian dihydrofolate reductase (DHFR) mammalian expression vector and transformed with the DHFR negative Chinese hamster ovary cell line. Transformed cells will be subjected to methotrexate selection. thus, gems will be obtained which make up a large amount of human PAF-AH through gene amplification.
Príklad 9Example 9
Ľudská rekombiriantná plazmatická PAF-AH (začínajúca Ile43) exprimovaná v E. coli, bola prečistená na úroveň Coomassie modrou ofarbeného prúžku ria SDS-PAGE pomocou rôznych metód. Takisto boli stanovované aktivity vykazované natívnym enzýmom PAF-AH.Human recombinant plasma PAF-AH (beginning with Ile 43 ) expressed in E. coli was purified to the Coomassie level of blue stained ria SDS-PAGE by various methods. The activities exhibited by the native enzyme PAF-AH were also determined.
A. Purifikácia rekoinbinantnej PAF-AHA. Purification of recoinbinant PAF-AH
Prvý použitý puriflkačný postup je podobný tomu, ktorý bol popísaný v Príklade 1 pre natívnu PAF-AH. Nasledujúce kroky boli uskutočňované pri 4 °C. Peleta z 50ml kultúry E. coli. ktoré produkujú PAF-AH C transformované expresným konštruktom trp AH) bol lyzovaný tak, ako je to popísané v Príklade 8. Pevné čiastočky boli odstránené centrifugáciou pri 10 DOOg počas 20 minút. Supernatant bol nanesený rýchlosťou 0,8 ml/min na kolónu Blue sepharose Fast Flou (2,5 cm x 4 cm; objem náplne 20 ml)), ktorá bola ekvilibrovaná pufrom D (25inl*l Tris-HCl, 10ml*l CHAPS, D, 51*1 NaCl. pH 7, 5) . Kolóna bola premytá 10D ml pufra D a eluovaná rýchlosťou 3,2 ml/min 100 ml pufra A obsahujúceho 0,51*1 KSCN. 15 ml aktívnej frakcie bolo nanesených ria lml kolónu Cu chelating Sepharose, ekvilibrovanú pufrom D. Táto kolóna bola premytá 5 ml pufra D, ďalej nasledovala elúcia 5 ml pufra D obsahujúceho 100ml*l imidazol gravitačným tokom. Frakcie s PAF-AH aktivitou boli analyzované pomocou SDS-PAGE.The first purification procedure used is similar to that described in Example 1 for native PAF-AH. The following steps were performed at 4 ° C. Pellet from 50 ml E. coli culture. which produce PAF-AH (transformed with the trp AH expression construct) was lysed as described in Example 8. Solid particles were removed by centrifugation at 10,000g for 20 minutes. The supernatant was loaded at 0.8 ml / min onto a Blue sepharose Fast Flou column (2.5 cm x 4 cm; 20 ml fill volume)) which was equilibrated with buffer D (25 µl * 1 Tris-HCl, 10 ml * 1 CHAPS, D, 51 * 1 NaCl, pH 7.5). The column was washed with 10D ml of buffer D and eluted at a rate of 3.2 ml / min with 100 ml of buffer A containing 0.51 * 1 KSCN. 15 ml of the active fraction was loaded on a 1 ml Cu chelating Sepharose column equilibrated with buffer D. This column was washed with 5 ml of buffer D, followed by elution of 5 ml of buffer D containing 100 ml * 1 imidazole by gravity flow. Fractions with PAF-AH activity were analyzed by SDS-PAGE.
Výsledky purifikácie sú znázornené v Tab. 6, v ktorej sa jednotka rovná hydrolýze umol PAF za hodinu. Produkt purifikácie získaný pri 4 °C sa objavil na SDS-PAGE ako jediný intenzívne zafarbený prúžok pod polohou markera 43 kDa, s náznakom difúzneho zafarbenia tesne pod a nad sebou. Rekombinantný materiál je výrazne čistšl a vykazuje vyššiu špecifickú aktivitu v porovnaní s PAF-AH preparátom z plazmy, popísaným v Príklade 1.The purification results are shown in Tab. 6, in which the unit equals hydrolysis umol PAF per hour. The purification product obtained at 4 ° C appeared on SDS-PAGE as the only intensely stained band below the 43 kDa marker position, suggesting diffuse staining just below and above each other. The recombinant material is significantly purer and exhibits a higher specific activity compared to the PAF-AH preparation from plasma described in Example 1.
Tabuľka 6Table 6
ka/mgka / mg
Keď bola totožná purifikačný procedúra uskutočnená pri laboratórnej teplote, objavila sa okrem prúžku pod markerom 43 kDa skupina prúžkov migrujúcich pod polohou markera 29 kDa. ktorá kolerovala s PAF-AH aktivitou zmeranou v plátkoch gélu. Tieto prúžky s nižšou molekulovou hmotnosťou môžu byť proteolytické fragmenty PAF-AH. ktoré si uchovali enzymatickú aktivitu.When the same purification procedure was performed at room temperature, in addition to the 43 kDa marker band, a group of strips migrating below the 29 kDa marker position appeared. which coincided with PAF-AH activity measured in gel slices. These lower molecular weight bands may be proteolytic fragments of PAF-AH. that retained enzymatic activity.
Pri laboratórnej teplote bol použitý tiež rfalši purifikačný postup. Peleta (100 g) E. coli produkujúcich PAF-AH C transformovaných expresným konštruktom pUC trp AH) bo], resuspendovaný v 200 ml lyzovacieho puf r a (25ml*l Tris, 20mm CHAPS, 50ml*l NaCl. lml*l EDTA, 50 ug/ml benzamidu. pH 7,5) a lyzovaný trojnásobným pretlačením cez mikrofluidizér pri 15000 psi. Pevné častice boli odstránené centrifugáciou pri 14300 x g počas jednej hodiny. Supernatant bol lOx zriedený v zrleďovacom pufri (25mľl l*IES (kyselina 2-CN-morfolinoletánsulfónová), 10ml*l CHAPS, lml*l EDTA, pH 4. 9) a nanesený rýchlosťou 25ml za minútu na kolónu S Sepharosy Fast Flou (200ml) (katión-ionexovú kolóna), ktorá je ekvilibrovaná v pufri E (25ml*l l*IES. 10ml*l CHAPS. lmň EDTA. 50ml*l NaCl. pH 5. 5). Kolóna bola premytá jedným litrom pufra E a eluovaná 11*1 NaCl. Eluát bol zozbieraný do 50ml frakcií a pH bolo upravené ria 7.5 pomocou 0. 5ml 21*1 Tris-u C bázy). Frakcie obsahujúce aktivitu PAF-AH boli spojené a upravené tak. aby obsahovali 0.51*1 NaCl. Takto spojené frakcie boli nanesené rýchlosťou 1 ml/min na kolónu Blue Sepharase Fast Flou <2,5 cm x 4 cm; 20 ml) ekvilibrovanú v pufri F <25ml*l Tris, 10ml*l CHAPS, 0,51*1 NaCl, lml*l EDTA, pH 7, 5) . Kolóna bola premytá 100 ml puf r a F a eluovariá pufrom F obsahujúcim 31*1 NaCl rýchlosťou 4 ml/min. Tento Blue Sepharosový Fast Flou chromatografická krok bol opakovaný s cieľom zníženia hladiny endotoxínov vo vzorke. Frakcie obsahujúce aktivitu PAF-AH boli spojené a dialyzované proti pufru G <25ml*l Tris. pH 7.5. 0.51*1 NaCl. 0.1* Tueen 80. lml*l EDTA).A falsified purification procedure was also used at room temperature. A pellet (100 g) of E. coli producing PAF-AH C transformed with the expression construct pUC trp AH) was resuspended in 200 ml lysis buffer (25 ml * 1 Tris, 20 mm CHAPS, 50 ml * 1 NaCl, 1 ml * 1 EDTA, 50 ml). µg / ml benzamide (pH 7.5) and lysed three times by passing through a microfluidizer at 15,000 psi. The solids were removed by centrifugation at 14300 x g for one hour. The supernatant was diluted 10-fold in dilution buffer (25 ml 1 * IES (2-CN-morpholinolethanesulfonic acid), 10 ml * 1 CHAPS, 1 ml * 1 EDTA, pH 4.9) and loaded at 25 ml per minute onto a Sepharose Fast Flou column (200 ml). (cation-ion exchange column), which is equilibrated in buffer E (25ml * 11 * IES, 10ml * 1 CHAPS, 1m EDTA, 50ml * 1 NaCl, pH 5.5). The column was washed with 1 liter of buffer E and eluted with 11 * 1 NaCl. The eluate was collected into 50 ml fractions and the pH was adjusted to 7.5 with 0.5 ml of 21 * 1 Tris C base). Fractions containing PAF-AH activity were pooled and conditioned. to contain 0.51 * 1 NaCl. The fractions so combined were loaded at a rate of 1 ml / min onto a Blue Sepharase Fast Flou column <2.5 cm x 4 cm; 20 ml) equilibrated in buffer F <25 ml * 1 Tris, 10 ml * 1 CHAPS, 0.51 * 1 NaCl, 1 ml * 1 EDTA, pH 7.5). The column was washed with 100 ml of buffer r and F and eluted with buffer F containing 31 * 1 NaCl at a rate of 4 ml / min. This Blue Sepharose Fast Flou chromatography step was repeated to reduce the level of endotoxins in the sample. Fractions containing PAF-AH activity were pooled and dialyzed against buffer G <25ml * 1 Tris. pH 7.5. 0.51 * 1 NaCl. 0.1 * Tueen 80. lml * l EDTA).
Výsledky purifikácie sú ukázané v tabuľke 7, v ktorej sa jednota rovná umol hydrolýzy PAF za hodinu.The results of the purification are shown in Table 7, in which the unity is equal to µmol of PAF hydrolysis per hour.
Tabulka 7Table 7
Získaný produkt purifikácie vyzeral na SDS-PAGE ako jediný intenzívny prúžok pod značkou 43 kDa s trochou difúzneho zafarbenia priamo pod a nad prúžkom. Rekombinantný materiál je podstatne čistší a vykazuje väčšiu špecifickú aktivitu v porovnaní s príp47 ravou PAF-AH z plazmy, ako je popísaná v Príklade 1.The obtained purification product appeared on SDS-PAGE as a single intense band under the 43 kDa label with some diffuse staining directly below and above the band. The recombinant material is substantially cleaner and exhibits greater specific activity compared to plasma PAF-AH treatment as described in Example 1.
V tomto predkladanom vynáleze sa uvažuje ešte o jednom purifikačriom protokole. Ten zahrnuje lýzu buniek, prečistenie a prvý kolónový krok. Bunky boli zriedené 1*1 v lyzovacom pufri (25m Tris pH 7.5. 150mI*l NaCl, IX Tueen 80. 2ml*l EDTA). Lýza bola uskutočnená v chladenom inikrofluidizéri pri 15000-20000 psi. Bolo použité trojnásobné pretlačenie materiálu cez mikrofluidizér s cieľom dosiahnuť >992 rozbitie buniek. Lyzát bol zriedený 1·20 v riediacom pufri (25ml*l Tris, pH 8,5, lml*l EDTA) a aplikovaný na kolónu naplnenú chromatografickým médiom Q-Sepharosa Big Bead (Pharmacia). Kolóna bola ekvilibrovaná v roztoku 25mm Tris pHAnother purification protocol is contemplated in the present invention. This includes cell lysis, purification and the first column step. Cells were diluted 1 * 1 in lysis buffer (25m Tris pH 7.5. 150mL * 1 NaCl, 1X Tueen 80. 2ml * 1 EDTA). Lysis was performed in a cooled microfluidizer at 15,000-20000 psi. A triple extrusion of the material through a microfluidizer was used to achieve> 992 cell breakage. The lysate was diluted 1 · 20 in dilution buffer (25ml * 1 Tris, pH 8.5, 1ml * 1 EDTA) and applied to a column packed with Q-Sepharosa Big Bead chromatography medium (Pharmacia). The column was equilibrated in 25mm Tris pH
8,5, lml*l EDTA, 0,0152 Tueeri SO. Eluát bol zriedený lslO v 25ml*l ľlES pH 5.5, 1,21*1 síran amónny, lml*l EDTA a nanesený na chromátografické médium Butyl Sepharose (Pharmacia) ekvilibrované rovnakým pufrom. Aktivita PAF-AH bola eluovaná roztokom 25ml*l l*IES pH 5. 5, 0. 12 Tueen BO, lml*l EDTA.8.5, lml * l EDTA, 0.0152 Tueeri SO. The eluate was diluted with ls10 in 25 ml * 1 µES pH 5.5, 1.21 * 1 ammonium sulfate, 1 ml * 1 EDTA and loaded onto Butyl Sepharose (Pharmacia) chromatography medium equilibrated with the same buffer. PAF-AH activity was eluted with 25ml * 11 * IES pH5.5, 0. 12 Tueen BO, 1ml * 1 EDTA.
V tomto predkladanom vynáleze sa uvažuje ešte o ďalej metóde purifikácie purifikácie enzyinaticky aktívneho PAF-AH. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky· a) príprava extraktu E. coli, ktorá vedie po lýze v pufri obsahujúcom CHAPS k supernatantu obsahujúcemu solubllizovariý PAF-AH; b) riedenie vyššie uvedeného supernatantu a jeho aplikácia na anióri-ionexovú kolónu ekvilibrovariú na pH približne 8, 0; c) elúcia enzýmu PAF-AH z vyššie uvedenej anión-ionexovej kolóny; d) nanesenie vyššie uvedeného adjustovaného eluátu z vyššie uvedenej anlóri-ionexovej kolóny na aflriitnú kolónu obsahujúcu blue dye ligand; e) elúci.u vyššie uvedenej kolóny obsahujúcej blue dye ligand pufrom obsahujúcim 3,01*1 soľ; f) zriedenie eluátu z kolóny obsahujúcej blue dye ligand do pufra vhodného pre realizáciu hydroxylapatitovej chromatografie; g) uskutočnenie hydroxylapatitovej chromatografie, kde je premytie a elúcia uskutočnené s pomocou pufrov (s obsahom či bez obsahu CHAPS); h) narledenie vyššie uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentráciu solí vhodnú pre katión-ionexovú kolónu; i) nanesenie vyššie uvedeného narledeného hydroxylapatitového eluátu na katión-ionexovú kolónu pri pH pohybujúcom sa v rozmedzí približne 6,0 až 7,0; j) elúcia PAF-AH z vyššie uvedenej katión-ionexovej kolóny vhodným pufrom s vhodným zložením; k) uskutočnenie katión-ionexovej chromatografie pri chlade; a 1) zloženie kvapalnej alebo zmrazenej formy PAF-AH v neprítomnosti CHAPS.In the present invention, a method for purifying the purification of an enzymatically active PAF-AH is further contemplated. This method comprises the following steps: a) preparing an E. coli extract which, after lysis in a buffer containing CHAPS, results in a supernatant containing solubllizarial PAF-AH; b) diluting the above supernatant and applying it to an anion-exchange column by equilibrating to a pH of about 8.0; c) eluting the enzyme PAF-AH from the above anion-exchange column; d) loading said adjusted eluate from said anion exchange resin column onto a blue dye ligand containing affinity column; e) eluting the above-mentioned blue dye ligand column with a buffer containing 3.01 * 1 salt; f) diluting the eluate from the column containing the blue dye ligand to a buffer suitable for performing hydroxylapatite chromatography; g) performing hydroxylapatite chromatography, wherein the washing and elution is carried out with buffers (with or without CHAPS); h) brightening the above hydroxylapatite eluate to a salt concentration suitable for a cation exchange column; i) applying the above-mentioned hydroxylapatite eluate to a cation-exchange column at a pH ranging from about 6.0 to 7.0; j) eluting PAF-AH from the above cation-exchange column with a suitable buffer of a suitable composition; k) performing cation-exchange chromatography in the cold; and 1) the composition of a liquid or frozen form of PAF-AH in the absence of CHAPS.
Najlepšie je vo vyššie uvedenom kroku použiť totos v krokuIt is best to use totos in the step above
a) lyzovací pufer má zloženie: 25ml*l Tris, 100ml*l EDTA, 20ml*l CHAPS, pH 8,0; v kroku b) riedenie supernatantu pre anióri-ionexovú chromatografiu je 3-4 krát od 25ml*l Tris, lml*l EDTA, 10ml*l CHAPS, pH 8, 0 a kolóna je (3-Sepharosová kolóna ekvilibrovaná 25ml*l Tris, lmľl EDTA, 50mľl NaCl. 10ml*l CHAPS, pH 8.0; v kroku c) je ariión-ioriexavá kolóna vymývaná použitím 25ml*l Tris, lmľl EDTA, 350ml*l NaCl, lOmľl CHAPS. pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikovaný priamo na afinltnú kolónu s blue dye ligandom; v kroku e) je kolóna eluovaná pufrom obsahujúcim 31*1 NaCl, lOmľl CHAPS, 25ml*l Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zriedený pre hydroxylapatitovú chromatografíu. Eluát je zriedený lOinľl fosforečnanom sodným, lOOmľl NaCl, 10inl*l CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografia sprevádzaná použitím hydroxylapatitove j kolóny ekvilihrovanej 10ml*l fosforečnanom sodným, lOOmľl NaCl, 10ml*l CHAPS. Elúcia je uskutočňovaná použitím 50mľl fosforečnanu sodného, lOOmľl NaCl (s či bez 10ml*l CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je uskutočňované neriedenie vyššie uvedeného hydroxylapatitového eluátu pre katión-ionexovú chromatografiu pomocou pufra s pH v rozmedzí približne 6, 0 až 7, 0 a obsahujúcom fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolóna sa) the lysis buffer has the following composition: 25ml * 1 Tris, 100ml * 1 EDTA, 20ml * 1 CHAPS, pH 8.0; in step b) the dilution of the anion-exchange chromatography supernatant is 3-4 times from 25ml * 1 Tris, 1ml * 1 EDTA, 10ml * 1 CHAPS, pH 8.0 and the column is (3-Sepharose column equilibrated with 25ml * 1 Tris, 1 ml of EDTA, 50 ml of NaCl, 10 ml * 1 of CHAPS, pH 8.0, in step c) the anionic-ionic column is eluted using 25 ml * 1 of Tris, 1 ml of EDTA, 350 ml of 1 NaCl, 10 ml of CHAPS. pH 8.0; in step d), the eluate of step c) is applied directly to the affinity column with a blue dye ligand; in step e) the column is eluted with a buffer containing 31 * 1 NaCl, 10 ml CHAPS, 25 ml * 1 Tris, pH 8.0; in step f) the Blue dye eluate is diluted for hydroxylapatite chromatography. The eluate is diluted with 10µl sodium phosphate, 100µl NaCl, 10µl * 1 CHAPS, pH 6.2; in step g), hydroxylapatite chromatography is performed using a hydroxylapatite j column equilibrated with 10ml * 1 sodium phosphate, 100ml NaCl, 10ml * 1 CHAPS. Elution is performed using 50mL sodium phosphate, 100mL NaCl (with or without 10mL * 1 CHAPS), pH 7.5; in step h) the dilution of the above-mentioned hydroxylapatite eluate for cation-exchange chromatography is performed with a buffer having a pH in the range of about 6.0 to 7.0 and containing sodium phosphate (with or without CHAPS); in step i) the column is s
S-Sepharosou ekvilibrovaná 50mi*l fosforečnanom sodným (s či bez 10ml*l CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je elúcia uskutočnená pufrom s vhodným zložením, ako napríklad 50ml*l fosforečnan draselný, 12. 5ml*I kys. asparágová, 125ml*l NaCl, pH 7,5 a obsahujúcim 0,01% Tueen 80; v kroku k) je uskutočnená katión-ionexová chromatografia pri 2-8 °C. Príkladom pre vhodné zloženie pufra použiteľného v kroku 1). ktorý stabilizuje PAF-AH je 50ml*l fosforečnan draselný, 12.5ml*l kys. asparágová, 125ml*i NaCl, pH približne 7,4 (s či bez prídavku Tueen 80 a/alebo Plurinicu F68) alebo 25ml*l fosfátový C K*) pufer obsahujúci (prinajmenšom) 125ml*l NaCl, 25mľl arginín a 0,01% TueenS-Sepharose equilibrated with 50 mM sodium phosphate (with or without 10 ml * 1 CHAPS), pH 6.8; in step j), the elution is carried out with a buffer of a suitable composition, such as 50 ml * 1 potassium phosphate, 12.5 ml * 1 acid. aspartic, 125ml * 1 NaCl, pH 7.5 and containing 0.01% Tueen 80; in step k), cation-exchange chromatography is performed at 2-8 ° C. An example for a suitable buffer composition useful in step 1). which stabilizes PAF-AH is 50ml * l potassium phosphate, 12.5ml * l acid. aspartic, 125ml * i NaCl, pH about 7.4 (with or without Tueen 80 and / or Plurinic F68) or 25ml * l phosphate CK *) buffer containing (at least) 125ml * l NaCl, 25ml arginine and 0.01% Tween
C s Ci bez Plurinicku F68 v koncentrácii približne 0,1 až 0. 530 .C with Ci without Plurinick F68 at a concentration of about 0.1 to 0. 530.
Aktivita rekombinantného PAF-AHRecombinant PAF-AH activity
Najvýraznejšou vlastnosťou PAF acetylhydrolázy je výrazná Specificita pre substráty s krátkymi zvyškami na sn-2 pozícii substrátu. Táto prísna Specificita odlišuje PAF acetylhydrolázu od ostatných foriem PLAa. Aby sa zistilo, Ci rekombinantný PAF-AH degraduje fosfolipidy s dlhým reťazcom mastných kyselín na sn-2 pozícii, bola teda testovaná hydrolýza l-palmitoyl-2-arachidonyl-.sn-glycerol-3-fosfocholínu C arachidoriylPC) . Táto látka je totiž uprednostňovaným substrátom dobre charakterizovanej formy PLAa. Ako predpovedali už predchádzajúce štúdie s natívnym PAF-AH, tento fosfolipíd nebol v prípade, že bol lnkubovaný s rekoinbinantným PAF-AH hydrolyzovaný. V ďalších experimentoch bol do roztoku štandardného hydrolyzaCného testu pridaný arachidoriylPC v koncentrácii 0 až 125ul*l. Cielom tohoto bolo zistenie, Ci toto pridanie inhlbuje hydrolýzu PAF rekombinantnýin PAF-AH. Dokonca ani pri najvyššej koncentrácii PAF-AH CCo bola koncentrácia 5x vyššia ako koncentrácia PAF) nebola zistená inhibícia hydrolýzy PAF. Rekombinantný PAF-AH teda vykazuje rovnakú substrátovú špeeificitu ako natívny enzým - substráty s dlhými reťazcami nie sú rozpoznávané. Okrem toho rekombinantný enzým PAF-AH rýchlo degraduje oxidovaný fosfolipíd CgluraroylPC), ktorý prešiel oxidatívnym štiepením sn-2 mastných kyselín. Natívna plazmová PAF-AH má niekoľko ďalších vlastnosti, ktoré ju odlišujú od ostatných fosfolipáz. vrátane od vápenatých iónov nezávislých fosfolipáz a fosfolipáz odolných voCi látkam, ktoré modifikujú SH skupiny alebo štiepia disulfidy.The most prominent feature of PAF acetyl hydrolase is its distinct specificity for substrates with short residues at the sn-2 position of the substrate. This strict specificity distinguishes PAF acetyl hydrolase from other forms of PLA and . Thus, in order to determine that the C1 recombinant PAF-AH degrades long chain fatty acid phospholipids at the sn-2 position, hydrolysis of 1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (arachidoriylPC) was tested. This substance is the preferred substrate for a well characterized form of PLA and . As predicted by previous studies with native PAF-AH, this phospholipid was not hydrolyzed when incubated with recoinbinant PAF-AH. In other experiments, arachidoriylPC was added to the standard hydrolysis assay solution at a concentration of 0 to 125 µL *. The aim of this was to find out that this addition inhibits the hydrolysis of PAF by recombinant PAF-AH. Even at the highest concentration of PAF-AH (CCo), the concentration was 5-fold higher than that of PAF), and no inhibition of PAF hydrolysis was observed. Thus, recombinant PAF-AH exhibits the same substrate specificity as the native enzyme - long chain substrates are not recognized. In addition, the recombinant enzyme PAF-AH rapidly degrades the oxidized phospholipid (CgluraroylPC), which has undergone oxidative cleavage of sn-2 fatty acids. Native plasma PAF-AH has several other properties that distinguish it from other phospholipases. including calcium ion-independent phospholipases and phospholipases resistant to substances that modify SH groups or cleave disulfides.
Natívne a rekombinantné plazmové enzýmy PAF-AH sú senzitívne voCi DFP, Co naznaCuje, že serín tvorí Časť ich aktívneho séra. Neobvyklou vlastnosťou natívnej plazmovej PAF acetylhydrolázy je jej tesná asociácia s lipoproteínmi v krvnom obehu a skutoCnosť, že jej katalytická efektivita je ovplyvnená lipoproteinovým prostredím. Ak je rekombiriantná PAF-AH, ako je popísaná vo vynáleze, inkubovaná s ľudskom plazmou Ca predtým ošetrená DFP s cieľom odstránenia endogénnej enzymatickej aktivity), asociuje sa s nízko- a vysokohustotnýml llpoprotelrimi rovnakým spôsobom ako natívna aktivita. Tento výsledok je dôležitý, pretože existujú solídne dôkazy o tom, že modifikácia nízkohustotných lipoproteínov je nevyhnutná pre ukladanie cholesterolu pozorovanému pri ateróme a že oxidácia lipidov je iniciačným faktorom v tomto procese. PAF-AH chráni nlzkohustotné llpoproteíny pred modifikáciou pri oxidačných podmienkach in vitro a môžu hrať túto úlohu aj in vivo. Podávanie PAF-AH je preto doporučovarié pre zníženie oxidácie lipoproteínov v prípade aterosklerotických plakov a rovnako tak aj pri liečbe zápalov. Všetky tieto výsledky potvrdzujú, že kloň cDNA sAH 406-3 kóduje proteín s aktivitami ľudskej plazmovej PAF acetylhydrolázy.Native and recombinant plasma PAF-AH enzymes are sensitive to DFP, suggesting that serine forms part of their active serum. An unusual property of native plasma PAF acetyl hydrolase is its close association with lipoproteins in the bloodstream and the fact that its catalytic efficiency is influenced by the lipoprotein environment. When recombinant PAF-AH, as described herein, is incubated with human plasma Ca previously treated with DFP to remove endogenous enzymatic activity), it is associated with low- and high-density 11β-propellants in the same manner as native activity. This result is important because there is solid evidence that modification of low-density lipoproteins is necessary for the cholesterol deposition observed at atheroma and that lipid oxidation is an initiating factor in this process. PAF-AH protects low density II proteins from modification under oxidative conditions in vitro and may play this role in vivo. Administration of PAF-AH is therefore recommended to reduce lipoprotein oxidation in atherosclerotic plaques as well as in the treatment of inflammation. All these results confirm that the sAH 406-3 cDNA clone encodes a protein with human plasma PAF acetyl hydrolase activities.
Príklad 10Example 10
V E. coli boli exprimované aj ďalšie rekombinantné PAF-AH produkty. Tieto produkty zahrnovali arialógy PAF-AH majúce mutáciu v jednej aminokyseline a fragmenty PAF-AH.Other recombinant PAF-AH products were also expressed in E. coli. These products included arialogs of PAF-AH having a single amino acid mutation and fragments of PAF-AH.
A. PAF-AH produkty vzniknuté substitúciou aminokyselínA. PAF-AH products resulting from amino acid substitution
PAF-AH je lipáza. pretože hydrolyzuje fosfolipid PAF. Aj keď neexistuje žiadna všeobecná podobnosť medzi PAF-AH a ostatnými charak terizovanýini lipázaml, v porovnaní so štruktúrne charakterizovanými lipázaml boli nájdené konzervované zvyšky. V aktívnom centre bol identifikovaný seríri. Serín spoločne so zvyškom aspartámu a hlstidlnu tvorí katalytickú trojicu, ktorá reprezentuje aktívne miesto lípáz. Tieto tri zvyšky spolu nesusedia v primárnej aminokyselinovej sekvencii, ale zo štruktúrnych štúdii vieme. že spolu tieto tri susedia v trojrozmernom priestore. Z porovnávaní Štruktúr cicavčích llpáz vieme, že aspartámový zvyšok je obvykle 24 aminokyselinovým zvyškom od C konca, smerom k aktívnemu miestu so serlnom.PAF-AH is a lipase. because it hydrolyzes the phospholipid PAF. Although there is no general similarity between PAF-AH and the other lipase-specific characteristics, conserved residues were found compared to the structurally characterized lipases. A serie has been identified in the active center. Serine, together with the remainder of aspartame and glidant, forms a catalytic triad that represents the active site of the lipases. These three residues are not contiguous in the primary amino acid sequence, but we know from the structural studies. that these three neighbors in three-dimensional space. Comparing the structures of mammalian IIpases, we know that the aspartame residue is usually a 24 amino acid residue from the C terminus, towards the active site with serine.
Pomocou miestne cielenej mutagenézy a PCR boli modifikované jednotlivé kodóny ľudskej PAF-AH, ktoré kódovali sekvencie pre alanínový zvyšok. Tieto mutanty boli exprimované v E. coli. Tak, ako je ukázané v tabuľke 8, kde napríklad skratka S108A znamená, že šerí nový zvyšok v pozícii 108 bol zamenený za alaniri,Individual codons of human PAF-AH that encoded sequences for an alanine residue were modified by site-directed mutagenesis and PCR. These mutants were expressed in E. coli. As shown in Table 8, where, for example, the abbreviation S108A means that the sparing new residue at position 108 has been replaced by alaniri,
Hís3Si kompletne zničili medzí jednotlivými centre sú pre PAF-AH a bodové mutácie Ser273, AspS9<& alebo PAF-AH aktivitu. Vzdialenosti aminokyselinovýini zvyškami v aktívnom ostatné llpázy podobné (od Ser k Asp je to 23 aminokyselín; od Ser k His je to 78 aminokyselín). Tieto pokusy tiež ukázali, že Serffi73. Asp29(i, alebo His3Si sú zvyšky kľúčové pre aktivitu a preto tiež sú kandidátmi pre triádu katalytických zvyškov. Cysteíriové zvyšky sú svojou vlastnosťou možnosti tvorby disulťidových mostíkov veľmi často kritické pre zachovanie funkčnej integrity proteínu. Plazmatický PAF-AH enzým obsahuje päť cysteínových zvyškov. Na určenie, ktorý z cysteinových zvyškov je kritický pre udržanie enzýmovej aktivity, boli cysteíny jednotlivo nahradené mutáciou za serín a výsledné mutanty sa exprimovali v E. coli. Predbežné výsledky merania aktivity s čiastočne nečistenými preparátmi týchto rekombínantných mutantných foriem enzýmu sú ukázané v druhom stĺpci tabuľky čislo 8, zatiaľ čo výsledky získané s viacerými načistenými enzýmovýml preparátmi sú zhrnuté v treťom stĺpci tabuľky 8. Dáta ukazujú, že všetky mutantné formy vykazovali skoro rovnaké aktivitu, z toho usudzujeme že pre aktivitu PAH-AH nie je nutný žiadny cysteinový zvyšok. Ďalšie mutanty mali tiež malý alebo žiadny vplyv na katalytickú aktivitu PAF-AH. V tabuľke 8, ++++ reprezentujú aktivitu prirodzene sa vyskytujúceho typuHiss 3S i completely destroyed between the individual centers are for PAF-AH and point mutations Ser 27 3, Asp S9 & or PAF-AH activity. The amino acid distances are similar to those in the other 11pase active (from Ser to Asp is 23 amino acids; from Ser to His is 78 amino acids). These experiments have also shown that Ser ffi 73. Asp 29 (i , or His 3S i are residues critical for activity and therefore also candidates for the triad of catalytic residues. Cysteir residues, by their ability to form disulphide bridges, are often critical for maintaining functional integrity Plasma PAF-AH enzyme contains five cysteine residues In order to determine which of the cysteine residues is critical for maintaining enzyme activity, cysteines were individually replaced by serine mutation and the resulting mutants were expressed in E. coli. preparations of these recombinant mutant forms of the enzyme are shown in the second column of Table 8, while the results obtained with multiple purified enzyme preparations are summarized in the third column of Table 8. The data show that all mutant forms showed almost the same activity, therefore We conclude that no cysteine residue is required for PAH-AH activity, and other mutants also had little or no effect on the catalytic activity of PAF-AH. In Table 8, ++++ represent the activity of the naturally occurring type
PAF-AH rovnajúcu sa 40 až 60 U/ml/CX)Aoo. +++ reprezentujú aktivitu okolo 20 až 40 U/ml/OD^ao, ++ 10 až 20 U/ml/ODôoo. + 1 až 10 U/ml/QDaoo a znamienko - indikuje aktivitu menšiu ako 1 U/ml/ODtf.oo.PAF-AH equal to 40 to 60 U / ml / CX) and oo. +++ represent an activity of about 20 to 40 U / ml / OD 600, and 10 to 20 U / ml / OD 600. + 1 to 10 U / ml / QDaoo and the - sign indicate activity less than 1 U / ml / ODtf.oo.
Tabulka 8Table 8
B. Fragmentálne PAF-AH produktyB. Fragmental PAF-AH products
Pomocou štiepenia exonuklázou III na 3' konci PAF-AH kódujúcej sekvencie rôzne dlhý čas boli pripravené delécie na C konci. Tieto skrátené kódujúce sekvencie boli potom ligované do plazmldovej DNA kódujúcej stop kodóny vo všetkých troch častiach rámca. Pomocou DNA sekvenčnej analýzy, expresie proteínu a merania aktivity PAF-AH bolo charakterizovaných desať DNA delečných konštruktov. Odstránenie 21 až 30 amlnokysellnových zvyškov z C konca silne redukovalo katalytickú aktivitu a odstránenie 52 amlnokysellnových zvyškové viedlo k kompletnému zničeniu aktivity. To je znázornené na obrázku 3.Deletions at the C terminus were prepared by digestion with exonuclease III at the 3 'end of the PAF-AH coding sequence for various long periods of time. These truncated coding sequences were then ligated into plasmid DNA encoding stop codons in all three parts of the frame. Ten DNA deletion constructs were characterized using DNA sequence analysis, protein expression, and measurement of PAF-AH activity. Removal of the 21-30 amino acid residues from the C terminus strongly reduced catalytic activity, and removal of the 52 amino acid residues resulted in complete destruction of activity. This is shown in Figure 3.
Podobné delécie boli uskutočnené na aminokoncl PAF-AH. V E. coli boli pripravené fúzne proteiny PAF-AH s tioredoxínom na N-konci. Tým sa docielila konzistentná vysoká hladina expresie aktivity PAF-AH (LaVallíe a ďalší, Oiotechnolay, 111 str. 187 až 193, 1993). Odstránenie devätnástich aminokyselinových zvyškov z prirodzene sa vyskytujúceho N-konca proteínu (Ile42) redukovalo aktivitu až o 99 X. Zatiaľ čo odstránenie 26 aminokyselinových zvyškov kompletne zničilo enzymatickú aktivitu fúzneho proteínu (pozri obrázok 3). Delécia 12 aminokyselinových zvyškov zvýšila enzýmovú aktivitu štyri razy.Similar deletions were performed on the amino terminus of PAF-AH. PAF-AH fusion proteins with thioredoxin at the N-terminus were prepared in E. coli. This resulted in a consistently high level of expression of PAF-AH activity (LaVallie et al., Oiotechnolay, 1993, 111: 187-193). Removal of the nineteen amino acid residues from the naturally occurring N-terminus of the protein (Ile 42 ) reduced activity by up to 99%. While removal of the 26 amino acid residues completely destroyed the enzymatic activity of the fusion protein (see Figure 3). The deletion of the 12 amino acid residues increased enzyme activity four times.
V nasledujúcich purifikačných procesoch pre PAF-AH vychádzajúcich z čerstvej ľudskej plazmy pomocou metód podobných tým, ktoré boli popísané v Príklade 1 (na skoncentrovanie eluátu z Blue Sepharosy bol použitý namiesto Cu stĺpca filter ľlicrocon 30 Firmy Amicon), boli identifikované ďalšie dve N-koncové aminokyseliny popri Ile4a a to Ser3s a Lys5S. Heterogenita môže mat prirodzený pôvod v stave enzýmu v plazme, či môže byt výsledkom purifikačného postupu.In the following purification processes for PAF-AH starting from fresh human plasma using methods similar to those described in Example 1 (two concentrations of the N-terminal N-terminal were identified to concentrate the Blue Sepharose eluate instead of the Cu column of Amicon llicrocon 30). amino acids alongside Ile 4a namely Ser 3s and Lys 5S . Heterogeneity may have a natural origin in the state of the enzyme in the plasma, whether it may result from a purification procedure.
Purifikovaný materiál popísaný vyššie bol tiež podrobený analýze na glykozylácii. Purifikovaný natívny PAF-AH sa inkuboval v prítomnosti alebo neprítomnosti N-glykanázy, čo je enzým odstraňujúci karbohydráty viazané ria N-koniec glykoproteínov. Takto ošetrené vzorky PAF-AH boli potom podrobené elektroforéze v 12 X SDS polyarkylamldovom géle a potom označené pomocou králičieho polyklonálneho antlséra vo Western blotte. Bielkovina, ktorá nebola inkubovaná s N-glykanázou, putovala v géle ako difúzny prúžok s molekulovou hmotnosťou 45 až 50 kDa, zatiaľ čo proteín ošetrený glykanázou putoval ako ostro ohraničený pruh zodpovedajúci molekulovej hmotnosti 44 kDa. Tým je demonštrovaná skutočnosť, že natívny PAF-AH je glykozylovaný.The purified material described above was also subjected to glycosylation analysis. Purified native PAF-AH was incubated in the presence or absence of N-glycanase, a carbohydrate-removing enzyme bound to the N-terminus of glycoproteins. The PAF-AH treated samples were then subjected to electrophoresis in a 12X SDS polyarkylamide gel and then labeled with rabbit polyclonal antler in a Western blot. The protein that was not incubated with N-glycanase traveled in the gel as a diffusion band with a molecular weight of 45-50 kDa, while the glycanase-treated protein traveled as a sharply defined band corresponding to a molecular weight of 44 kDa. This demonstrates that native PAF-AH is glycosylated.
Heterogenita na N-konci bola tiež pozorovaná v puriFikovaných preparátoch rekomblnantnéha PAF-AH (Ile42 N-terminal heterogeneity was also observed in purified preparations of recombinant PAF-AH (Ile 42).
N-koniec). Tieto enzýmové preparáty boli zmesou polypeptidu s N-koncaml začínajúci Ala^x, lle4s· alebo umelým iniciačným zvyškom ľlet_i susediacim s Ile«.N-terminus). These enzyme preparations were a mixture of polypeptides with N-koncaml beginning with Ala ^ x, Ile 4 · s or an artificial initiating radical ľlet_i adjacent to Ile ".
1. Predbežné porovnanie fragmentov PAF-AH s PAF-AHPreliminary comparison of PAF-AH fragments with PAF-AH
Z dôvodu pozorovanej heterogenity rekombinantne pripravených PAF-AH boli pripravené ďalšie rekomblnantné produkty, ktoré boli tiež testované na pozorovanú heterogenitu po expresii a následnej purifikácii. Zloženie rekombínantných exprimovaných produktov PBAR2/PH.2 a pBAR2/PH.2 v kmeni MC1061 E. coli bolo analyzované v rôznych časových intervaloch počas produkčnej fázy bunkového cyklu. Čiastočne načistené vzorky rekombinantného PH.2 a PH.9 odobrané v rôznych časových Intervaloch medzi 5 až 22 hodinami po indukcii expresie proteínu boli analyzované pomocou laserovej desorpčriej ionizačnej hmotnostnej spektrometrie C l*IALDI-l*IS) .Because of the observed heterogeneity of recombinantly prepared PAF-AH, other recombinant products were prepared, which were also tested for observed heterogeneity after expression and subsequent purification. The composition of recombinant expressed PBAR2 / PH.2 and pBAR2 / PH.2 products in E. coli strain MC1061 was analyzed at various time intervals during the production phase of the cell cycle. Partially purified samples of recombinant PH.2 and PH.9 taken at different time intervals between 5 and 22 hours after induction of protein expression were analyzed by laser desorption ionization mass spectrometry (1 * IALDI-1 * IS).
Ak bol použitý PH.2 expresný vektor, boli pozorované dva piky v spektre čiastočne purifikovaného proteinu, ktoré zodpovedali hmotnostnej hodnote predpokladanej pre rPAF-AH protein. tieto dva piky boli pozorované vo všetkých časových intervaloch, väčšia heterogenita bola pozorovaná len v časovom intervale zodpovedajúcom stresovému pôsobeniu spôsobenému nahromadením acetátu alebo vyčerpaním kyslíka v médiu počas fermentácie buniek. Presnosť merania MALDI-MS techniky leží približne v rozsahu ± 0, 3 % hmotnosti jednej aminokyseliny. Pozorovaný produkt s vyššou hmotnosťou zodpovedá svojim hmotnostným zložením očakávanému celému produktu translácie vektora PH.2 mínus hmotnosť metioninu. ako iniciátora translácie. o ktorom sa predpokladá, že bol posttranslačne odstránený. Pík s nižšou hmotnosťou mal približne o 1200 atómových hmotnostných jednotiek menej.When a PH.2 expression vector was used, two peaks were observed in the spectrum of the partially purified protein, which corresponded to the mass value predicted for the rPAF-AH protein. these two peaks were observed at all time intervals, greater heterogeneity was observed only at the time interval corresponding to the stress action caused by acetate accumulation or depletion of oxygen in the medium during fermentation of the cells. The measurement accuracy of the MALDI-MS technique lies within approximately ± 0.3% by weight of one amino acid. The higher-weighted product observed, by its weight composition, corresponds to the expected total translation product of the PH.2 vector minus the weight of methionine. as the initiator of translation. which is believed to have been post-translationally removed. The lower mass peak had approximately 1200 atomic mass units less.
Ak bol použitý expresný vektor PH.9, bol získaný v spektre čiastočne purifikovaného proteinu prednostne protein, ktorý zodpovedal svojou očakávanou hmotnosťou proteínu rPAF-AH. Tento jediný pík bol pozorovaný vo všetkých časových okamihoch, v čase sa nezvyšovala ani heterogenita proteínu. Pozorovaná hmotnosť tohoto proteinu bola v súlade s prítomnosťou očakávaného translačného produktu pre vektor PH.9 s plnou dĺžkou, opäť mínus iniciačný metionín.When the expression vector PH.9 was used, preferably a protein that corresponded to its expected mass of rPAF-AH protein was obtained in the partially purified protein spectrum. This single peak was observed at all times, nor did the protein heterogeneity increase over time. The observed mass of this protein was consistent with the presence of the expected translation product for the full-length PH.9 vector, again minus the initiating methionine.
2. Purifikácia fragmentov PAF-AH2. Purification of PAF-AH fragments
Rekombinantne exprimované produkty rPH.2 (expresný produkt DNA kódujúci ľletA& až Asn44X) a rPH.9 (expresný produkt DNA kódujúci ľlet4á až Ile439) boli purif ikované pre ďalšie porovnávacie štúdie s produktom rPAF-AH (expresný produkt DNA kódujúci Ile43 až Asn441). RPH.9 bol produkovaný pomocou kmeňa E. coli SB7219 a purifikovaný väčšinou pomocou chelátového purifikačného procesu využívajúceho Zri. tak. ako to bolo popísané vyššie. rPH.2 bol produkovaný v kmeni ľlClOSl v E. coli, tak, ako to bolo popísané v predchádzajúcom texte a bol purifikovaný tak, ako je to popísané ďalej. Transformované bunky boli lyzované riariedenim buniek lyzačným pufrom (IDOmľl sukcinát. lOQmm NaCl. 20mľl CHAPS, pH 6. Oô. Vzniknutá hmota sa mixovala a lyžovala sa popraskaním buniek vysokým tlakom. Lýzované bunky sa stočili a supernatant obsahujúci rPH.2 sa ponechal pre ďalšie spracovanie. Vyčerený supernatant sa nariedil 5-krát 25mľl fosfátovým pufrom obsahujúcim lml*l EDTA. lOmľl CHAPS, pH 7,0. Nariedený supernatant sa potom aplikoval na stĺpec Sepharosy Q. Stĺpec sa premyl najprv trojnásobkom objemu stĺpca 25ml*l Na-fosfátovým pufrom obsahujúcim linľl EDTA, 50mM NaCl, lDmľl CHAPS, pH 7,0 (Premytie 1), potom nasledovalo premytie desaťnásobným objemom stĺpca 25ml*l Tris pufrom obsahujúcim lmľl EDTA, lOmľl CHAPS, pH 8,0 (Premytie 2) a následne desiatimi objemami stĺpca 25mľl Tris pufrom obsahujúcim lmľl EDTA. IDOmľl NaCl, lOmľl CHAPS. pH 8,0 (Premytie 3). Elúcia bola zakončená pomocou 25mľl Tris pufra obsahujúceho lmľl EDTA, 350mľl NaCl, lOmľl CHAPS. pH 8, 0. Eluát zo stĺpca Q Sepharosy sa potom nariedil trojnásobkom svojho objemu 25mľl Tris. obsahujúcim lml*l EDTA. lOmľl CHAPS, pH 8, 0 a bol navrstvený na stĺpec Blue Sepharosy. Stĺpec bol premytý najprv desiatimi objemami stĺpca 25inľl Trlsom. obsahujúcim lmľl EDTA, lOmľl CHAPS, pH 8,0. Potom nasledovalo premytie troma objemami stĺpca 25mľl Tisom obsahujúcim 0, 5ľl NaCl, lOmľl CHAPS, pH 8,0. Elúcia bola zakončená pomocou premytia 25ml*l Trisom obsahujúcim 3,01*1 NaCl, 10ml*l CHAPS, pH 8,0. Eluát zo stĺpca Blue Sepharosy bol nariedený päťnásobkom lOmľl Na-fosfátového pufra obsahujúceho 10ml*l CHAPS, pH 6, 2 a bol potom aplikovaný na chromatografický stĺpec. Stĺpec bol premytý desaťnásobkom objemu stĺpca 10mI*l Na-fosfátovým pufrom obsahujúcim ΙΟΟπιΓΙ NaCl, 0. 1 X Pluronic F68, pH 6, 2. rPH. 2 sa eluoval zo stĺpca 120 ml*l Na-fosf átovým pufrom obsahujúcim 100inl*l NaCl a 0,1 X Pluronic F-68m, pH 7,5. V prípade neriedeného eluátu zo stĺpca hydroxylapatitu bolo upravené pH na pH 6. 8 pomocou 0,5 N-sukcinylovej kyseliny. Potom nasledovala chromatografia na stĺpci Sepharosy SP. Stĺpec SP Sepharosy bol premytý desaťnásobkom svojho objemu 50ml*l fosfátom sodným obsahujúcim 125ml*l NaCl, 0,1 X Pluronic F68, pH 6,8. Elúcla sa uskutočňovala 50ml*I fosfátom sodným so 125ml*l NaCl a 0,1 X Pluronic F68, pH 7, 5. Eluovariý rPH.2 sa napokon upravil riedením na koneCnú koncentráciu 4 mg/ml pomocou 50ml*l fosfátu sodného obsahujúceho 1251*1 NaCl, 0.15X Pluronic F68, pH 7,5. Ďalej bol pridaný Tueen 80 do koneCnej koncentrácie 0,02 X. Vytvorený produkt sa prefiltroval cez 0,2 mn membránu a uschoval pre ďalšie využitie.Recombinantly expressed rPH.2 (the expression product of DNA encoding LLET A and 44X to Asn) and rPH.9 (the expression product of DNA encoding LLET 4A-Ile 439) was purified active for further comparative studies with the product of PAF-AH (expression product of DNA encoding Ile 43 to Asn 441 ). RPH.9 was produced using an E. coli strain SB7219 and purified mostly by a chelated purification process using Zri. so. as described above. rPH.2 was produced in the ClClOS1 strain in E. coli, as described above, and was purified as described below. The transformed cells were lysed by diluting the cells with lysis buffer (ID01ml succinate, 10mm NaCl. 20ml CHAPS, pH 6. The resulting mass was mixed and lysed by cracking the cells under high pressure. The lysed cells were centrifuged and the supernatant containing rPH.2 was left for further processing. The clarified supernatant was diluted 5-fold with 25 ml of phosphate buffer containing 1 ml * 1 EDTA, 10 ml of CHAPS, pH 7.0, and the diluted supernatant was then applied to a Sepharose Q column. 1µl EDTA, 50mM NaCl, 1µml CHAPS, pH 7.0 (Wash 1), followed by a 10-fold column volume wash of 25ml * 1 Tris buffer containing 1mLl EDTA, 10mL CHAPS, pH 8.0 (Wash 2) followed by ten column volumes of 25mL. Tris buffer containing 1mL EDTA, IDOmL NaCl, 10mL CHAPS, pH 8.0 (Wash 3) Elution was terminated with 25mL Tris buffer containing 1mL EDTA, 350 The pH of the eluate from the Q Sepharose column was then diluted three times with its volume of 25 ml Tris. containing 1ml * 1 EDTA. 10 ml of CHAPS, pH 8.0, and was stacked on a Blue Sepharose column. The column was washed first with ten column volumes of 25 µl Trls. containing 10 ml EDTA, 10 ml CHAPS, pH 8.0. This was followed by washing with three column volumes of 25 ml of Tis, containing 0.5 µl of NaCl, 10 ml of CHAPS, pH 8.0. The elution was terminated by washing with 25 ml * 1 Tris containing 3.01 * 1 NaCl, 10 ml * 1 CHAPS, pH 8.0. The Blue Sepharose column eluate was diluted five times with 10 ml Na-phosphate buffer containing 10 ml * 1 CHAPS, pH 6.2, and then applied to the chromatography column. The column was washed with ten times the column volume with 10mL * 1 Na-phosphate buffer containing NaCl, 0.1X Pluronic F68, pH 6, 2. rPH. 2 was eluted from the column with 120 ml * 1 Na-phosphate buffer containing 100 µl * 1 NaCl and 0.1 X Pluronic F-68m, pH 7.5. In the case of the undiluted hydroxylapatite eluate, the pH was adjusted to pH 6.8 with 0.5 N-succinyl acid. This was followed by Sepharose SP column chromatography. The SP Sepharose column was washed ten times its volume with 50 ml * 1 sodium phosphate containing 125 ml * 1 NaCl, 0.1 X Pluronic F68, pH 6.8. Elution was performed with 50ml * 1 sodium phosphate with 125ml * 1 NaCl and 0.1X Pluronic F68, pH7.5. The elution of rPH.2 was finally adjusted by dilution to a final concentration of 4mg / ml with 50ml * 1 sodium phosphate containing 1251 * 1 NaCl, 0.15X Pluronic F68, pH 7.5. Next, Tueen 80 was added to a final concentration of 0.02X. The product formed was filtered through a 0.2 mn membrane and stored for further use.
3. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH pomocou sekveriácie3. Comparison of PAF-AH fragments with PAF-AH by sequencing
Purifikované preparáty rPH.2 a rPH, 9 boli porovnané s purifikovanými zlúCeniami rPAF-AH pomocou N.terminálneho sekvencovania použitím sekvenátora Applied Biosystems Model 473 Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) a pomocou pomocou prístroja Protein Sequencer. s rPAF-AH menšiuPurified preparations rPH.2 and rPH, 9 were compared to purified rPAF-AH compounds by N. terminal sequencing using an Applied Biosystems Model 473 Protein Sequencer sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) and using a Protein Sequencer. with rPAF-AH less
C koncového sekvencovania uskutočneného Heulett-Packard Model G1009A C-terminal Pripravený rPH.2 vykazoval v porovnaní heterogenitu N-konca. N-koncová analýza pripraveného rPH.9 bola velmi podobná tiež analýze v prípade rPH.2, ale v porovnaní s rPH.2 bola pozorovaná v prípade rPH.9 nižšia heterogenita na C-konci.C-terminal sequencing performed by Heulett-Packard Model G1009A C-terminal The prepared rPH.2 showed N-terminal heterogeneity in comparison. The N-terminal analysis of the prepared rPH.9 was also very similar to that of rPH.2, but compared to rPH.2, lower C-terminal heterogeneity was observed for rPH.9.
Purifíkovaný protein rPH.2 vykazoval väCšinu sekvenci! obsahujúcich N-koncový Ala47> (približne 86 až 89 X) a menší podiel sekvenci! majúcich na N-konci Ala4B (približne 11 až 14The purified rPH.2 protein showed most of the sequence. containing an N-terminal Ala 47 (approximately 86-89%) and a smaller fraction of the sequences. having N-terminal Ala 4B (approximately 11-14)
*). Tento pomer bol celkom stabilný aj pri rôznych podmienkach fermentácie buniek. Purifikovaný proteín rPH.9 tiež obsahoval vo väčšine sekvencii N-koncový Ala47- (medzi 83 až 90 *) a menší podiel s N-koncovou aminokyselinou Ala<*s C približne 10 až 17 %) . Oproti tomu. snahy o prípravu polypeptldu v baktériách začínajúceho lle42 (rPAF-AH) vyústili v zmes rôznych polypeptidov s N-koncovými aminokyselinami začínajúcimi Ala47 (20 až 53 %), Ile42 (8 až 10 3)3) a umelo dodaným iniciátorom metlonínom ľlet-1 <37 až 72 30 v susedstve lle.q.2. V prípade rPH.2 a rPH.9 bol iniciačný inetionín účinne odstránený pomocou amlnoterminalpeptldázy po bakteriálnej syntéze peptidu, kedy zostal Ala v pozícii 47 (alebo alanin v pozícii 48) ako koncový zvyšok.*). This ratio was quite stable even under various cell fermentation conditions. Purified rPH.9 protein also contained in most sequences the N-terminal Ala 47 - (between 83 to 90%) and a minor proportion with the N-terminal amino acid Ala <* with a C of about 10 to 17%). In contrast. efforts to prepare polypeptides in bacteria starting with lle 42 (rPAF-AH) resulted in a mixture of different polypeptides with N-terminal amino acids starting with Ala 47 (20-53%), Ile 42 (8-103) 3, and an artificially delivered initiator by metlonin fly -1 <37 to 72 30 in the vicinity of lle.q. 2 . In the case of rPH.2 and rPH.9, the initiating inethionin was effectively removed by amnotherminal peptidase after bacterial peptide synthesis, leaving Ala at position 47 (or alanine at position 48) as the terminal residue.
Sekvencovaníe C-konca sa uskutočňovalo veľmi často na rPH.2, kde na C-koncl bola objavená ako hlavná vyskytujúca sa sekvencia HOOC-Asn-tyr (približne 80 30, čo je v dobrej zhode s predpokladanou sekvenciou C-konca translačného produktu, ktorá je HOOC-ASn^^,-Tyr^o. zatiaľ čo sekvencia HOOC-Leu sa objavila len v 20 %. Po frakcionizácii rPH.2 na SDS-PAGE sa uskutočnilo ďalšie sekvencuvanie primárneho a sekundárneho prúžku. Sekvencovaníe určilo ako C-terminálnu sekvenciu HOOC-Leu-ľlet z nižšieho sekundárneho prúžku (AHL popísané ďalej k sekcii B.5). ktorý zodpovedá translačnému produktu skrátenému o 10 amlnokyselinových zvyškov. Tento produkt vykazuje tiež nízku hladinu HOOC-His. Ďalšie mapovanie peptidov ukázalo, že v prípade niektorých produktov rPH.2 sa vyskytujú ešte ďalšie C-koricové sekvencie. Priamym sekvencovanim bol C-koniec v prípade rPH.9 primárne určený ako HOOC-Ile-His (približne 78 až 91 X. čo záleží od šarže). Tento výsledok je v dobrej zhode s predpokladaným C koncom translačného produktu HOOC-lle429-Hls42e· Zdá sa však, že táto technika má určité pozadie (šum), čím by neboli podchytené nízke hladiny koncentrácií iných sekvencii.C-terminal sequencing was performed very frequently on rPH.2, where C-terminal was detected as the main occurring sequence of HOOC-Asn-tyr (approximately 80 30, which is in good agreement with the predicted C-terminal sequence of the translation product, which the sequence of HOOC-Leu appeared only in 20% After further fractionation of rPH.2 on SDS-PAGE, further sequencing of the primary and secondary bands was performed, sequencing was determined as the C-terminal sequence. HOOC-Leu-fly from the lower secondary band (AHL described below to section B.5), which corresponds to a translation product truncated by 10 amino acid residues, which also shows a low HOOC-His level. Direct C-terminal sequencing was primarily determined as HOOC-Ile-His (approximately 78-91%, depending on batch) by r-sequencing of rPH.9. This result is in good agreement with the predicted C end of the translation product HOOC-lle 429 -Hls 42e. However, this technique appears to have some background (noise), thus avoiding low levels of concentrations of other sequences.
4. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH metódou ľlALDI-l*IS4. Comparison of PAF-AH fragments with PAF-AH by the ľALDI-1 * IS method
MALDI-ľlS metóda bola aplikovaná na purifikované produkty rPH.2 a rPH.9. Spektrum namerané pre rPH.2 vykázalo dva piky.The MALDI-1S method was applied to purified rPH.2 and rPH.9 products. The spectrum measured for rPH.2 showed two peaks.
ktoré svojou hmotnosťou zodpovedali hodnote očakávanej pre rPH.AH produkty (pozri obrázok 4). Toto spektrum je podobné spektru získanému do čiastočne purifikovaného proteínu popísanému v sekcii B.l vyššie v texte. Druhý pík, zodpovedajúci nižšej molekulovej hmotnosti, bol vo väčšine meraní prítomný asi v 20 až 30% zastúpení. Spektrum rPH.9 ukázalo, že dominantný pík zodpovedá predpokladanej hmotnosti pre úplný translačný produkt vektora PH.9, od ktorého sa odčíta hmotnosť iniciačného metionínu (pozri obrázok 5). V prípade rPH.9 bol tiež pozorovaný vedľajší pík zodpovedajúci nižšej molekulovej hmotnosti. Bol zastúpený asi v prípade 5 % celkového množstva vzoriek.which by their weight corresponded to the value expected for rPH.AH products (see Figure 4). This spectrum is similar to that obtained in the partially purified protein described in section B..1 above. The second peak, corresponding to the lower molecular weight, was present in about 20 to 30% of the majority of measurements. The spectrum of rPH.9 showed that the dominant peak corresponds to the predicted mass for the complete translation product of the vector PH.9, from which the mass of the initiating methionine is subtracted (see Figure 5). For rPH.9, a lower molecular weight minor peak was also observed. It was represented in about 5% of the total number of samples.
5. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH pomocou SDS-PAGE5. Comparison of PAF-AH fragments with PAF-AH by SDS-PAGE
Elektroforéza v polyalkrylamldovom géle v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) bola aplikovaná na purifikované šarže rPAF-AH. rPH.2 a rPH.9. V prípade rPH.2 bol získaný na elektroforeogrme veľmi zložitý obraz prúžkov, rozmiestených okolo miesta zodpovedajúceho migračnému rozsahu očakávanému pre rPAF-AH produkt. Toto miesto bolo určené pomocou zodpovedajúcich molekulových štandardov. Na jednom, či niekoľkých, géle boli pozorované dva dominantné prúžky, ktoré mali v tesnom susedstve každý svoje dva sekundárne prúžky, ktoré boli umiestené nad a pod primárnym prúžkom. Tieto horné sekundárne prúžky, stredné primárne a spodné sekundárne prúžky boli označené ako AHU, ΑΗΙΊ a AHL. Všetky tieto prúžky reagovali s monoklonáInou protilátkou pripravenou proti rPAF-AH vo Western blote a tak boli identifikované ako produkty príbuzné rPAF-AH. Vrchný sekundárny prúžok AHU zvyšoval svoju intenzitu v závislosti od doby skladovania proteínu a pravdepodobne reprezentoval modifikovanú formu produktu rPAF-AH. Výsledky získané z SDS-PAGE pre rPAF-AH produkty sú podobné výsledkom získaným tou istou metódou pre rPH.2. Sú tu dva väčšie pruhy. ktoré migrujú v blízkosti predpokladanej molekulovej hmotnosti pre rPAF-AH, ďalej dva minoritné pruhy nad a tieň pod majoritnými pruhmi. Na rozdiel od týchto, rPH.9 poskytuje na SDS-PAGE jeden dominantný pruh bez zjavného štiepenia. Ďalej boli tiež pozorované slabo poznateľné prúžky zodpovedajúce nižšej molekulovej hmotnosti a ďalší prúžok v pozícii zodpovedajúcej hmotnosti diméru. Nebol zrejmý však žiadny prúžok zodpovedajúci AHU pozícii.Polyalkrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) was applied to purified batches of rPAF-AH. rPH.2 and rPH.9. In the case of rPH.2, a very complex image of strips was obtained on the electropherogram, distributed around a site corresponding to the migration range expected for the rPAF-AH product. This site was determined using the appropriate molecular standards. Two or more dominant strips were observed on one or more of the gels, each having its two secondary strips in close proximity which were placed above and below the primary stripe. These upper secondary bands, middle primary bands and lower secondary bands were designated as AHU, ΑΗΙΊ, and AHL. All of these strips reacted with a monoclonal antibody prepared against rPAF-AH in a Western blot and were thus identified as rPAF-AH-related products. The upper secondary band of AHU increased its intensity as a function of protein storage time and probably represented a modified form of the rPAF-AH product. The results obtained from SDS-PAGE for rPAF-AH products are similar to those obtained by the same method for rPH.2. There are two larger stripes. which migrate near the predicted molecular weight for rPAF-AH, two minor bands above and the shadow below the major bands. In contrast, rPH.9 provides one dominant band on SDS-PAGE without apparent cleavage. Furthermore, poorly recognizable bands corresponding to a lower molecular weight and another band at a position corresponding to the weight of the dimer were also observed. However, no band corresponding to the AHU position was apparent.
Zloženie purifikovaných preparátov rPH.2 a rPH.9 bolo ďalej analyzované pomocou 2D gélov a izoelektrickej fokusácle (IEF) v močovine, ktorá nasledovala za SDS-PAGE v druhom rozmere. Pre rPH.9 je na dvojrozmernej elektroforéze päť hlavných škvŕn rozdelených v smere IEF. Heterogenita v počte nábojov sa v rámci jednotlivých šarží rPH.9 javila ako konzistentná. Na rozdiel od vyššie uvedených výsledkov 2D gél pre rPH.2 sa javil ďaleko komplikovanejší, pretože obsahoval asi 15 škvŕn rozdelených v IEF a SDS-PAGE.The composition of the purified preparations of rPH.2 and rPH.9 was further analyzed by 2D gels and isoelectric focusing (IEF) in urea following SDS-PAGE in the second dimension. For rPH.9, five major spots distributed in the IEF direction are on two-dimensional electrophoresis. Heterogeneity in the number of charges appeared consistent across batches of rPH.9. In contrast to the above results, the 2D gel for rPH.2 appeared far more complicated as it contained about 15 spots distributed in IEF and SDS-PAGE.
6. Porovnanie aktivity PAF-AH s aktivitou fragmentov PAF-AH6. Comparison of PAF-AH activity with that of PAF-AH fragments
Puriflkované produkty rPH.2 a rPH.9 vykazovali obidva enzymatickú aktivitu, ktorá bola rovnaká ako v prípade endogénneho PAF-AH purifikovaného zo séra, obidva produkty tiež viažu lipoproteíri rovnakým spôsobom ako purifikovaný endogénny PAF-AH.Purified rPH.2 and rPH.9 products showed both enzymatic activity that was the same as for serum purified endogenous PAF-AH, both products also bind lipoprotein in the same manner as purified endogenous PAF-AH.
Príklad 11Example 11
Predbežná analýza expresie ľudských plazmatických mRNA pre PAF-AH bola vo vzorcoch ľudských pletív stanovovaná pomocou hybridizácie v Northern blote.Preliminary analysis of human plasma mRNA expression for PAF-AH was determined by Northern blot hybridization in human tissue samples.
jeden až tri elektroforézy vone to three electrophoresis in
RNA boli pripravené zo vzoriek ľudskej mozgovej kôry, srdca, obličiek, placenty, týmusu a mandlí pomocou RNA Stat 60 Ctel-Test B, Friendswood, TX), Ďalej bola RNA pripravená tiež z buniek podobných prekurzorom ľudských hematopoetických buniek línie THP-1 (ATCC TIB 202), v prípade ktorej bola vyvolaná difereciácia do fenotypu podobného makrofágu a to použitím phorbolesteru phorbolinyristylacetátu (PI*1A). RNA získaná z pletív a RNA pripravená z premylocytickej bunkovej línie THF-1 pred a dni po indukcii. boli rozdelené pomocou 1,2X agarúzovom forinaldehydovom géll a potom prenesené na nitrocelulózovú membránu. Kloň s úplnou dĺžkou PAF-AH cDNA, SAH406-3, pripravený z ľudskej plazmy, bol oznaCený metódou náhodného párovania primérov (random priming) a bol hybridizovaný na membránu, pri podmienkach identických podmienkam popísaným v príklade 3 pre prehliadanie knižnice. Získané výsledky indikovali, že sonda PAF-AH hybridlzuje s pruhom zodpovedajúcim 1.8 kb vo vzorcoch z týmusu, mandlí a v malom rozsahu tiež s placentárnou RNA.RNAs were prepared from human cortex, heart, kidney, placenta, thymus and tonsils using RNA Stat 60 Ctel-Test B, Friendswood, TX. RNA was also prepared from cells similar to the THP-1 human hematopoietic cell precursor (ATCC) TIB 202), in which differentiation into a macrophage-like phenotype was induced using phorbol ester of phorbolinyristyl acetate (PI * 1A). Tissue-derived RNA and RNA prepared from the THF-1 premylocyte cell line before and days after induction. were separated using a 1.2X agarous forinaldehyde gel and then transferred to a nitrocellulose membrane. A full-length PAF-AH cDNA clone, SAH406-3, prepared from human plasma, was labeled by random priming and hybridized to a membrane under conditions identical to those described in Example 3 for library browsing. The results obtained indicated that the PAF-AH probe hybridized to a band corresponding to 1.8 kb in thymus, tonsil, and, to a small extent, placental RNA samples.
PAF sa syntetizuje v mozgu ako pri normálnych, tak aj patofyziologických podmienkach. Vzhľadom na známe, zápal vyvolávajúce a potenciálne neurotoxické vlastnosti tejto molekuly, sa predpokladá ako kritický pre udržanie zdravia nervového pletiva mechanizmus lokalizácie PAF syntézy alebo jeho rýchly katabolizmus. Prítomnosť PAF acetylhydrolázy v nervových tkanivách ukazuje na jej ochrannú úlohu v týchto pletivách. Je zaujímavé. že obidva PAF-AH, to znamená bovinná (hovädzia) heterotrimérna intracelulárna PAF-AH (jej klonovanie je popísané v práci Hattori a ďalší, J. Biol. Chem., 2G9C37) i strana 23150 až 23155 (1994) aj PAF-AH podľa predkladaného vynálezu, boli nájdené v mozgu.PAF is synthesized in the brain under both normal and pathophysiological conditions. In view of the known inflammatory-inducing and potential neurotoxic properties of this molecule, it is believed that the mechanism of localization of PAF synthesis or its rapid catabolism is critical to maintaining the health of nerve tissue. The presence of PAF acetyl hydrolase in neural tissues indicates its protective role in these tissues. Is interesting. that both PAF-AH, i.e. bovine (bovine) heterotrimeric intracellular PAF-AH (its cloning is described in Hattori et al., J. Biol. Chem., 2G9C37) and pages 23150 to 23155 (1994) and PAF-AH according to of the present invention have been found in the brain.
S cieľom určenia, či obidva enzýmy exprimované v rovnakých alebo iných častiach mozgu, bol riaklonovaný ľudský homológ bovinnej cDNA pre intracelulárnu PAF-AH a pomocou Northern blotu boli porovnané vzorky tejto v mozgu expriinovariej mRNA f i exprimovanou mRNA pre PAF-AH podľa vynálezu rovnakou metódou, ako bola popísaná v predchádzajúcich paragraf och. V mozgu boli. metódou Northern blotu preskúmané nasledujúce oblasti« malý mozog, dreň, miecha, bazálne jadro mozgu, amygdala, podvesok mozgový, talamus a tylový pól, čelný lalok a spánkový lalok mozgovej kOry. Stopa prítomnosti obidvoch enzýmov bola detegovaná v každom z uvedených pletív. Vo vyššom množstve bola však skôr detegovaná heterotrimérna Intracelulárna forma enzýmu, než forma sekretovaná. Analýza uskutočnená pomocou Northern blotu potvrdila aj pre ďalšie pletivá a bunky, že heterotrimérna forma intracelulárneho enzýmu sa vyskytovala v týchto pletivách veľmi hojne. Pletivá, kde bol enzým detegovaný sú nasledujúce: týmus, prostata, semenníky, vaječníky. tenké črevo, tračnlk, periférne krvný leukocyty, makrofágy, mozog, pečeň, kostrové svaly, obličky, slinivka a žľazy nadobllčlek. Táto všadeprítomná expresia tejto formy enzýmu napovedá, že heterotrimérna intracelulárna PAF-AH má v bunkách všeobecnú udržiavaciu funkciu.In order to determine whether both enzymes expressed in the same or other parts of the brain, a human bovine cDNA homologue for intracellular PAF-AH was raclonated and samples of this brain expressing in the brain mRNA expressing PAF-AH mRNA according to the invention were compared using the same method, as described in the previous paragraph och. They were in the brain. Northern blot examined the following areas: small brain, medulla, spinal cord, basal nucleus, amygdala, pituitary, thalamus and tulle pole, frontal lobe and temporal lobe of the cerebral cortex. Traces of both enzymes were detected in each tissue. However, a heterotrimeric intracellular form of the enzyme was detected in a higher amount than the secreted form. Northern blot analysis also confirmed for other tissues and cells that the heterotrimeric form of the intracellular enzyme was very abundant in these tissues. The tissues where the enzyme was detected are as follows: thymus, prostate, testes, ovaries. small intestine, colon, peripheral blood leukocytes, macrophages, brain, liver, skeletal muscles, kidneys, pancreas and adrenal glands. This ubiquitous expression of this form of enzyme suggests that heterotrimeric intracellular PAF-AH has a general maintenance function in cells.
Ďalej bola v kultúre skúmaná expresia RNA pre PAF-AH v monocytoch izolovaných z ľudskej krvi a počas ich spontánnej diferenciácie ria makrofágy. V čerstvých monocytoch bolo detegované len malé, alebo vôbec žiadne množstvo RNA, ale expresia bola indukovaná a zosilnila sa počas diferenciácie na makrofágy. Sprievodným javom bolo aj zvýšenie aktivity PAF-AH v médiu kultúry diferencujúcich sa buniek. Expresia transkriptu ľudskej plazmatickej RNA pre PAF-AH bola tiež pozorovaná v bunkách THP-1 a to prvý deň. ale už nie tretí deň nasledujúci po indukcii. Bunky THP-1 v bazálnom štádiu neexprimovali mRNA pre PAF-AH.Furthermore, expression of RNA for PAF-AH in monocytes isolated from human blood and during their spontaneous differentiation of macrophages was investigated in culture. Little or no RNA was detected in fresh monocytes, but expression was induced and amplified during differentiation into macrophages. An accompanying phenomenon was also an increase in PAF-AH activity in the culture medium of differentiating cells. Expression of the human plasma RNA transcript for PAF-AH was also observed in THP-1 cells on the first day. but no longer on the third day following the induction. Baseline stage THP-1 cells did not express PAF-AH mRNA.
Príklad 12Example 12
Expresia PAF-AH v ľudských a myšacích pletivách bola skúmaná pomocou hybridizácie in situ.PAF-AH expression in human and mouse tissues was examined by in situ hybridization.
Ľudské pletivá boli získané National Disease Research Interchange and Cooperative Humari Tissue Netuork. Normálny myšací mozog a miecha, ďalej EAE miecha boli získané z S/JLJ myší. Normálnejšie myšacieho embryá boli získaná od jedenástich do osemnástich dni po oplodnení.Human tissues were obtained by National Disease Research Interchange and Cooperative Humari Tissue Netuork. Normal mouse brain and spinal cord, EAE spinal cord were obtained from S / JLJ mice. More normal mouse embryos were obtained from eleven to eighteen days after fertilization.
Časti pletív boli umiestené do Tissue Tek II kryoformy (ňiles Laboratories, Inc., Naperville. IL) s malým možstvom OCT zlúčeniny (ňlles, Inc. Elkhart, IN). Vo forme boli vzorky vycentrovarié. forma naplnená OCT zlúčeninou, potom umiestená do nádoby s 2-metylbutánom (C2H5CH(CH3)2, ALdrlch Chemical Company, ľne., ňlluaukee. Ul) a nádobka bola umiestená do kvapalného dusíka. Hneď ako pletivo a OCT zlúčenina v kryoforme zmrznú, sú uchovávané v -80 °C až do rozrezania bločka. Bločky s pletivami boli rozdelené na rezy s hrúbkou 6 um a pripevnené k Vectabondom CVector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) potiahnutým sklíčkam a skladované pri -70 °C a potom umiestené do teploty 50 °C na dobu približne 5 minút s cieľom odstránenia kondenzácie a potom sú vzorky fixované v 4% paraformaldehyde počas 20 minút pri 4 “C, dehydrované C 70%. 95%, 100% etanol) počas jednej minúty pre každý stupeň, napokon sú ponechané na vzduchu schnúť počas 30 minút pri izbovej teplote. Pletivá sú hybridizované in situ s rádioaktívne značenou jednovláknovou mRNA generovanou z DNA odvodenej z interného 1 Kb HindlII fragmentu génu pre PAF-AH Cnukleotldy 308 až 1323 zo Sekvencie ID číslo» 7) pomocou in vítro RNA transkripcie inkorporáciou 3SS-UTP CAmersham) alebo z DNA odvodenej od heterotrimérnej intracelulárnej cDNA pre PAF-AH identifikovanej Hattorim a ďalšími. Sondy sa používali v rflznych dĺžkach od 250 do 500bp. Hybridizácia sa uskutočňovala cez noc C12 až 16 hodín) pri. 50 °C; 3SS- značená sonda C6xlOs cpm/rez), tRNA CO, 5 ug/rez), ďalej bola pridaná dietylpyrokarbonátom ošetrená voda C depe) do hybridizačného pufra, čím sa upravili koncentrácie jeho zložiek na 50% forinamidu. 0,31*1 NaCl, 20ml*l Tris ph 7. 5. 10% sir anom dextránu. Ix Denhardtov roztok, lOOmM ditintreitol CDTT) a 5ml*l EDTA. Po hybridizácii sa rezy premývali 1 hodinu pri izbovej teplote v 4x SSC/10ml*l DTT, potom 40 minút pri 60 °C v 50% formamide/lxSSC/lOmM DTT, 30 minút pri izbovej teplote v 2 x SSC, 30 minút pri izbovej teplote v 0,1 x SSC. Rezy sa potom dehydrovali, sušili 2 hodiny na vzduchu a potom boli vyvolané C po skladovaní pri 4 °C v úplnej tme) a ofarbené kontrastným farbivom hematoxylín/eozín.Parts of the tissues were placed in a Tissue Tek II cryoform (ils Laboratories, Inc., Naperville, IL) with a small amount of OCT compound (ils, Inc. Elkhart, IN). The samples were centered in the mold. the form filled with the OCT compound, then placed in a 2-methylbutane (C 2 H 5 CH (CH 3 ) 2 , ALdrich Chemical Company, Inc.) mixture and placed in liquid nitrogen. Once the tissue and the OCT compound are frozen in the cryoform, they are stored at -80 ° C until the block is cut. The tissue blocks were divided into sections of 6 µm thickness and attached to Vectabonds (CVector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) coated slides and stored at -70 ° C and then placed at 50 ° C for approximately 5 minutes to remove condensation and then the samples are fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes at 4 ° C, dehydrated with 70% C. 95%, 100% ethanol) for one minute for each step, and finally allowed to air dry for 30 minutes at room temperature. The filaments are hybridized in situ with radiolabeled single stranded mRNA generated from DNA derived from the internal 1 Kb HindIII fragment of the PAF-AH gene (308-1332 of SEQ ID NO: 7) by in vitro RNA transcription by incorporation of 3S S-UTP (CAmersham) or from DNA derived from heterotrimeric intracellular PAF-AH cDNA identified by Hattori et al. Probes were used in different lengths from 250 to 500bp. Hybridization was performed overnight (C12 to 16 hours) at. 50 [deg.] C .; 3S S-labeled C6x10 probe with cpm / inc), tRNA CO, 5 µg / inc), diethylpyrocarbonate-treated water (dep) was added to the hybridization buffer to adjust the concentrations of its components to 50% forinamide. 0.31 * 1 NaCl, 20ml * l Tris ph 7. 5. 10% dextran siren. 1x Denhardt's solution, 100mM ditintreitol CDTT) and 5ml * 1 EDTA. After hybridization, sections were washed for 1 hour at room temperature in 4x SSC / 10ml * 1 DTT, then 40 minutes at 60 ° C in 50% formamide / 1xSSC / 10mM DTT, 30 minutes at room temperature in 2 x SSC, 30 minutes at room temperature. temperature at 0.1 x SSC. The sections were then dehydrated, air-dried for 2 hours and then induced (after storage at 4 ° C in complete darkness) and stained with the hematoxyline / eosin contrast dye.
A. Mozog flozočekA. Brain floss
Ako v ľudskom, tak aj myšacom mozgu bol pozorovaný silný signál vo vrstve Purkyňových buniek malého mozgu. ďalej v košíčkových bunkách a v stredných častiach jednotlivých neurónov v nucleus dentate C jedno zo štyroch jadier v malom mozgu). V týchto bunkách bola ďalej pozorovaná aj heterotrimérna formaIn both human and mouse brain, a strong signal was observed in the small brain Purkinje cell layer. then in the basket cells and in the central parts of individual neurons in nucleus dentate C one of the four nuclei in the cerebellum). Furthermore, a heterotrimeric form was also observed in these cells
PAF-AH. Ďalej bol nájdený signál aj pre plazmatickú PAF-AH v granulárnych a molekulových vrstvách sivej mozgovej hmoty.PAF-AH. Furthermore, a signal was also found for plasma PAF-AH in granular and molecular layers of gray brain matter.
HippocapmusHippocapmus
Silný signál bol zaznamenaný v hippocampe. hlavne v jednotlivých bunkách, ktoré sa javila ako bunky neurónové. Tieto bunky boli identifikované ako polymorfné časti strednej časti neurónov a granulárnych buniek. Tiež v hippocampe bol nájdený signál pre heterotrimérnu iritracelulárnu formu PAF-AH.A strong signal was recorded in the hippocampus. especially in individual cells, which appeared to be neuronal cells. These cells were identified as polymorphic portions of the middle portion of neurons and granular cells. Also in the hippocampus a signal was found for the heterotrimeric iritracellular form of PAF-AH.
/7ozgroi/ý kmeň/ 7ozgroi / ý strain
Ako v ľudskom, taj ak myšacom mozgovom kmeni bol v jednotlivých bunkách sivej hmoty zaznamenaný silný signál.As in human, taj and mouse brainstem, a strong signal was recorded in individual cells of gray matter.
Kôracrust
V častiach ľudskej mozgovej kôry, ktorá bola získaná z hlavnej mozgovej, tylovej spánkovej kôry a tiež v celých častiach myšacích mozgov bol pozorovaný v prípade jednotlivých buniek silný signál. Tieto bunky boli identifikované ako pyramidálne, hviezdicovité a polymorfné bunky. Neboli pozorované žiadne rozdiely vo výsledkoch získaných z rôznych vrstiev kôry. Výsledky získané metódou hybridizácie in situ sa líšili od výsledkov získaných skúmaním mozgovej kôry metódou Northern blotu. Rozdiely pravdepodobnosti vyplývajú z vyššej citlivosti metódy hybridizácie in situ v porovnaní s metódou Northern blotu. Ako v malom mozgu, tak aj v hipokampe boli získané podobné výsledky potvrdzujúce expresiu heterotrimérnej formy intracelulárneho PAF-AH.In the parts of the human cerebral cortex that were obtained from the main cerebral, tulle temporal cortex as well as in whole parts of the mouse brain, a strong signal was observed for individual cells. These cells were identified as pyramidal, star, and polymorphic cells. No differences were observed in the results obtained from the different layers of bark. The results obtained by the in situ hybridization method were different from those obtained by examining the cerebral cortex by Northern blotting. Probability differences result from higher sensitivity of the in situ hybridization method compared to the Northern blot method. In both the cerebellum and hippocampus, similar results were obtained confirming the expression of the heterotrimeric form of intracellular PAF-AH.
Hypofýzahypophysis
O niečo slabší signál bol zaznamenaný na jednotlivých roztrúsených bunkách distálnej časti týchto ľudských pletív.A slightly weaker signal was recorded on individual scattered cells of the distal portion of these human tissues.
B. Ľudský tračníkB. Human colon
Ako v prípade normálnych, tak aj v prípade tračníkov pacientov s Crohnovou chorobou, sa objavil signál u lymfatických agregátov prítomných v častí sliznice, signál bol slabo vyšší u pacientov s Crohnovou chorobou. Vzorky z tračníka pacientov s Crohnovou chorobou vykazovali tiež silný signál v lamlna propria. Podobne, vyššia hladina signálu bola pozorovaná vo vzorcoch z chorého slepého čreva, aj keď zdravé črevo vykazovalo nízky, ale stále ešte detegovateľný signál. Vzorky od pacientov trpiacich ulceróznou kolitídou nevykazovali žiadny signál a to ani v lymfatických agregátoch, ani v črevnej sliznici.Both in normal and in the colon of patients with Crohn's disease, a signal appeared in the lymphatic aggregates present in the mucosal parts, the signal was slightly higher in patients with Crohn's disease. The samples from the colon of patients with Crohn's disease also showed a strong signal in the lamina propria. Similarly, a higher signal level was observed in diseased caecum samples, although a healthy intestine showed a low but still detectable signal. Samples from patients suffering from ulcerative colitis showed no signal, either in lymphatic aggregates or in the intestinal mucosa.
C. Ľudské mandle a týmusC. Human almonds and thymus
Bol zaznamenaný signál signál v prípade roztrúsených buniek v zárodočných centrách mandlí a týmusu.A signal signal was recorded for scattered cells in the almond and thymus germinal centers.
D. Ľudské lymfatické uzlinyD. Human lymph nodes
V prípade vzoriek pochádzajúcich z lymfatických uzlín normálneho darcu bol pozorovaný silný signál, zatiaľ čo vo vzorkách odobraných z lymfatických uzlín pacienta v septickom šoku bol zaznamenaný signál veľmi slabý.For normal donor lymph node specimens, a strong signal was observed, whereas in the sample taken from the patient's lymph node in septic shock, the signal was very weak.
E. Ľudské tenké črevoE. Human small intestine
Ako vzorky tenkého čreva od zdravého darcu, tak aj vzorky čreva od pacientov trpiacich Crohnovou chorobou poskytovali len slabý signál v Peyerových plakoch a črevnej sliznici. Signál bol bo vzorkách chorých darcov trocha vyšší.Both the small intestine specimens from a healthy donor and the intestinal specimens from Crohn's disease patients gave only a weak signal in Peyer's plaques and intestinal mucosa. The signal was somewhat higher in the samples of the sick donors.
F. Ľudská slezina a pľúcaF. Human spleen and lungs
Ako vo vzorkách pochádzajúcich zo zdravej sleziny a pľúc, tak aj vo vzorkách zo slezín pacientov trpiacich abscesom sleziny a pľúc pacientov s rozdutím pľúc nebo nájdený žiadny signál.No signal was found in both spleen and lung spleen specimens and spleen specimens of patients suffering from spleen abscess and lung patients.
G. Myšacia miechaG. Mouse spinal cord
V prípade obidvoch typov miechy, to znamená normálne a AEE štádium 3 miechy, bol zaznamenaný silný signál v sivej hmote miechy. Expresia bola v mieche v EAE štádiu 3 slabo vyššia. V prípade miechy pochádzajúcej z EAE štádia 3 boli bunky v bielej hmote mozgovej a v perivaskulárnom spojive pravdepodobne infiltrované makrofágmi alebo leukocytmi a vykazovali signál, ktorý nebol zrejmý v normálnej mieche.For both types of spinal cord, i.e. normal and AEE stage 3 spinal cord, a strong signal was recorded in the gray spinal cord mass. Expression was slightly higher in the EAE Stage 3 spinal cord. In the EAE Stage 3 spinal cord, cells in the white matter of the brain and perivascular connective tissue were likely to be infiltrated by macrophages or leukocytes and showed a signal that was not apparent in the normal spinal cord.
H. Myšacie embryáH. Mouse embryos
V jedenásťdennom embryu je signál zreteľný v centrálnom nerovom systéme v štvrtej srdcovej komore, ktorá zostáva konštantná počas vývoja malého mozgu a mozgového kmeňa embrya. Počas dozrievania embrya sa signál stáva zreteľným v centrálnom nervovom systéme v mieche C12 deň), primárnej kôry a Gasseriho uzline C14 deň) a v hypofýze 16 deň). V periférnom nervovom systéme sa signál stáva zreteľným (začínajúc dňom 14 a 15) v nervoch odbočujúcich z miechy a 17 deň sa objavuje silný signál v okolí základov čuchových orgánov embrya. Expresia je tiež zrejmú od 14 dňa a pečeni a pľúcach, v čreve od 15 a v posteriálnej časti úst/hrdla odo dňa 16. Od 18 dňa je možné signál určiť, diferencovane ako signál v kôre. zadnom mozgu (malom mozgu a mozgovom kmeni), v nervoch odbočujúcich z bedrovej oblasti miechy, ako signál v zadnej časti úst/hrdla, pečeni, obličkách, ďalej ako možný slabý signál v pľúcach a čreve.In the eleven-day embryo, the signal is evident in the central neural system in the fourth ventricle, which remains constant during the development of the cerebellum and embryonic brainstem. During embryo maturation, the signal becomes apparent in the central nervous system (spinal cord (day 12), primary cortex and Gasseri lymph node (day 14) and in the pituitary (day 16). In the peripheral nervous system, the signal becomes clear (beginning on days 14 and 15) in the nerves branching out of the spinal cord, and on day 17 a strong signal appears around the bases of the embryonic olfactory organs. Expression is also evident from day 14 and liver and lung, in the intestine from day 15 and in the posterior part of the mouth / throat from day 16. From day 18, the signal can be determined differentially as the signal in the cortex. hind brain (small brain and brainstem), in nerves branching from the lumbar region of the spinal cord, as a signal at the back of the mouth / throat, liver, kidney, as well as a possible weak signal in the lungs and intestine.
Súhrnsum
Expresia mRNA pre PAF-AH v mandliach, týmuse, lymfatických uzlinách, Peyerových pľúcach, slepom čreve a v lymfatických agregátoch tračnika je v dobrom súlade so závermi. že pravdepodobný prevládajúci zdroj PAF-AH in vivo je v makrofágu, pretože vo všetkých týchto uvedených pletivách sú makrofágy silne zastúpené, slúžia tu ako fagocytózrie a antigén prezentujúce bunkyPAF-AH mRNA expression in almonds, thymus, lymph nodes, Peyer's lungs, appendix and colon lymphatic aggregates is in good agreement with the conclusions. that the likely predominant source of PAF-AH in vivo is in the macrophage, since in all these tissues macrophages are strongly represented, serving as phagocytosis and antigen-presenting cells
Expresia PAF-AH v zápalových pletivách sa dá vysvetliť hypotézou, že hlavnú úlohu v zápalových procesoch hrajú monocyty odvodené od makrofágov. Predpokladá sa, že PAF-AH lnaktivuje PAF a fosfolipidy podporujúce zápal a tým reguluje smerom dole kaskádu zápalových procesov iniciovaných pomocou týchto mediátorov.The expression of PAF-AH in inflammatory tissues can be explained by the hypothesis that macrophage-derived monocytes play a major role in inflammatory processes. PAF-AH is believed to inactivate PAF and inflammatory-promoting phospholipids and thereby down-regulate the cascade of inflammatory processes initiated by these mediators.
PAF je u potkanov detegovaný vo všetkých tkanivách a je sekretovaný v kultúre granulárnych buniek malého mozgu. In vitro a in vivo pokusy ukázali, že sa PAF viaže na špecifické receptory v nervových tkanivách a indukuje funkčné a fenotyplcké zmeny, ako je mobilizácia kalcia. regulácia transkripcie, ktorá aktivuje gény a diferenciácia nerových bunkových linií prekurzora, PC12. Tieto pozorovania objasňujú úlohu PAF v mozgu a v súlade s tým sa uskutočnili pokusy využívajúce kultúry tkanív hyppocampu a analógov PAF a jeho antagonistov, ktoré využívajú PAF ako dôležitý spätný inesendžer pre dlhotrvajúce hypokampálne zosilnenie. Preto okrem patologickej úlohy PAF v zápalových procesoch sa zdá, že sa PAF zúčastňuje aj na rutinnom nervovom signálnom procese. Expresia extracelulárnej PAF-AH v mozgu môže teda slúžiť na reguláciu trvania a veľkosti signalizácie sprostredkovanej PAF.PAF is detected in rats in all tissues and is secreted in the culture of small brain granular cells. In vitro and in vivo experiments have shown that PAF binds to specific receptors in nerve tissues and induces functional and phenotopic changes such as calcium mobilization. regulation of transcription that activates genes and differentiation of neural precursor cell lines, PC12. These observations clarify the role of PAF in the brain, and accordingly, experiments have been utilized using tissue culture cultures of the hyppocampus and analogs of PAF and its antagonists, which utilize PAF as an important backbone for long-term hypocampal enhancement. Therefore, in addition to the pathological role of PAF in inflammatory processes, PAF also appears to be involved in the routine neural signaling process. Thus, expression of extracellular PAF-AH in the brain can serve to regulate the duration and magnitude of PAF-mediated signaling.
Príklad 13Example 13
Pri použití PAF-AH ako antigénu produkovaného v E. coli boli pripravené monoklonálne protilátky špecifické pre ľudský špecifický plazmatický PAF-AH.Using PAF-AH as the antigen produced in E. coli, monoclonal antibodies specific for human specific plasma PAF-AH were prepared.
Myš línie 1342 bol a imunlzovaná 0, 19 a 40 deň rekombinantnýin PAF-AH. Ako dávka tesne pred fúziou použitá na lmunlzáclu myši dávka imuriogériu v PBS. 0 štyri dni ďalej bola myš usmrtená a sterilné vybraná jej slezina. Tá bola potom vložená do misky s 10 ml bezsérového média RPMI 1640. Suspenzia buniek bola pripravená trením slezín medzi dvoma koncami zmrazených mikroskopických sklíčok ponorenýchThe 1342 mouse was immunized on days 0, 19, and 40 with recombinant PAF-AH. As a dose just prior to the fusion, a dose of immunotherapy in PBS was used on immunized mice. Four days later, the mouse was sacrificed and its spleen sterile removed. This was then placed in a 10 ml serum-free RPMI 1640 medium dish. The cell suspension was prepared by rubbing the spleens between the two ends of frozen microscope slides immersed.
1640 s dodaným 2mM L-glutamínom, jednotiek/ml penicilínu a 100ug/ml streptomycínu (RPMI) (GIBCO. Canada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilný bunkový filter (70-mesh Nltex) (Becton Dicklnson, Parsippany, Neu Jersey) a potom boli bunky dvakrát premyté centrifugáciou pri 200 g počas do bezsérového média RPMI lmM pyruvátom sodným, 100 piatich minút a pelety boli opäť resuspendované v 20 ml bezsérového média RPľlI. Slezinné bunky z troch natívnych Balb/c myší boli pripravené podobným spôsobom. NS-1 myelúmové bunky boli udržiavané v logaritmickej fáze v RPľlI s 11 2 fetálneho bovinného séra (FBS) (Hyclorie Laboratories, Inc., Logan, Utah) počas troch dni pred fúziou, boli centrifugované pri 200 g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá rovnakým spôsobom, ako je to popísané vyššie.1640 with delivered 2 mM L-glutamine, units / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin (RPMI) (GIBCO. Canada). The cell suspension was filtered through a sterile 70-mesh Nltex cell filter (Becton Dicklnson, Parsippany, Neu Jersey), and then the cells were washed twice by centrifugation at 200 g for 20 min in serum free RPMI 1 mM sodium pyruvate medium, and pellets were resuspended again. in 20 ml of serum-free RPIII medium. Spleen cells from three native Balb / c mice were prepared in a similar manner. NS-1 myeloma cells were maintained in logarithmic phase in RP µl with 11 2 fetal bovine serum (FBS) (Hyclorie Laboratories, Inc., Logan, Utah) for three days prior to fusion, centrifuged at 200 g for 5 minutes and pellet twice washed in the same manner as described above.
Jedenkrát 10θ slezinných buniek bolo kombinovaných s 2. 0 x 107 NS-1 buniek. centrifugovaných a supernatant bol odsatý. Sediment v kyvete bol poklepkávaním dva kyvety rozdelený a potom bol pridávaný počas jednej minúty 1 ml 37 °C teplého PEG-u 1500 (502 v 75mľl Hepes. pH 8,0) (Boehringer ľlanheim) pri stálom miešaní, nasledovalo pridanie 7 ml bezsérového média počas 7 minút. Nasledovalo pridanie 8 ml RPľlI a bunky sa centrlfugovall pri 200 g počas 10 minút. Po odstránení supernatantu bola peleta resuspendovaná v 200 inl RPľlI obsahujúcom 15 2 FBS, lOOuľl hypoxantíriu sodného, 0, 4uľl aminopterínu, 16uľl tymidínu (HAT) (Gitico). 25 jednotiek/ml IL-6 (Boehringer ľlarinheim) a 1, 5 x 10Ä tymocytov/inl a bunky boli vysiate na desať dosiek Corning s plochým dnom s 96 jamkami (Corning, Corning New York).Once 10 θ spleen cells were combined with 2.0 x 10 7 NS-1 cells. centrifuged and the supernatant was aspirated. The sediment in the cuvette was split by tapping two cuvettes and then 1 ml of 37 ° C warm PEG 1500 (502 in 75 ml Hepes. PH 8.0) (Boehringer Llanheim) was added over one minute with stirring, followed by 7 ml of serum-free medium. for 7 minutes. This was followed by the addition of 8 ml RPIII and the cells were centrifuged at 200 g for 10 minutes. After discarding the supernatant, the pellet was resuspended in 200 µl RPµl containing 15 2 FBS, 100 µl sodium hypoxanthria, 0.4 µl aminopterin, 16 µl thymidine (HAT) (Gitico). 25 units / ml IL-6 (Boehringer ľlarinheim) and 1 x 10 5 thymocytes R / inl and the cells were plated on ten plates Corning flat-bottom 96-well plates (Corning, Corning New York).
Druhý, štvrtý a šiesty deň nasledujúci po fúzii bolo vymenených 100 ul v jamke za čerstvé. Ôsmy deň bola fúzia testovaná pomocou ELISA. testovala sa na prítomnosť myšacieho IgG vlažúceho rekombinantný PAF-AH. ľlikrotitračné dosky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, ľlA) bolí potiahnuté rekombinaritným PAF-AH v koncentrácii lOOng/dosku nariedeným v 25mľl TRIS, pH 7,5.On the second, fourth and sixth day following the fusion, 100 µl per well was exchanged for fresh. On day 8, the fusion was tested by ELISA. it was tested for the presence of mouse IgG fluttering with recombinant PAF-AH. Immulon 4 aliquot plates (Dynatech, Cambridge, IL) were coated with recombinant PAF-AH at a concentration of 100ng / plate diluted in 25 ml of TRIS, pH 7.5.
Inkubácia sa konala pri 37 °C počas dvoch hodín. Potom bol poťahovací roztok odsatý a do jamiek bolo nakvapkaných 200 ul blokovacleho roztoku (0,52 želatíny z rybacej kože (Sigma) zriedenej pomocou CľlF-PBS) a tento blokovací roztok sa lnkuboval 30 minút pri 37 °C. Potom boli dosky trikrát premyté PBS obsahujúcim 0,052 Tween 20 (PBST) a do každej jamky bolo pridaných 50 ul supernatantu z kultúry. Po ďalšej 30-minútovej inkubácii pri 37 eC a následnom trojnásobnom premytí bol do jamiek na doske pridaný konjugát kozích antímyšacích IgG <fc) s chrenovou peroxidázou CJackson ImmunoResearch. West Grove, Pensylvania) nariedený v PBS 1» 3500. Dosky sa lnkubovall rovnakým spôsobom, ako to bolo popísané vyššie, štyrikrát boli premyté PBST a potom nasledovala inkubácia so substrátom pre peroxidázu C100 ul/jamka) rozpusteným v substrátovom pufri. Roztok mal toto zloženie» lmg/ml o-feriyléndlamín C Sigma) a 0,1 ul/ml 30% Ha0a v lOOmľl citrátu pH 4, 5. Po piatich minútach bola farebná reakcia zastavená pridaním 50 ul 15% HeSCU. Na fotometri odčítajúcom hodnoty absorbancíe v roztoku CDynatech reader) sa odCítala absorbaricia pri vlnovej dĺžke 490 nm - A^9O.Incubation was performed at 37 ° C for two hours. Then, the coating solution was aspirated and 200 µL of blocking solution (0.52 fish skin gelatin (Sigma) diluted with C 11 F-PBS) was added dropwise and the blocking solution was incubated for 30 minutes at 37 ° C. Plates were then washed three times with PBS containing 0.052 Tween 20 (PBST) and 50 µl of culture supernatant was added to each well. After a further 30 minute incubation at 37 e C and subsequently washing three times was added to wells of a goat anti-mouse conjugate added IgG <fc) horseradish peroxidase CJackson ImmunoResearch. West Grove, Pennsylvania) diluted in PBS 1 3500. The plates were incubated as described above, washed four times with PBST followed by incubation with peroxidase substrate (100 µl / well) dissolved in substrate buffer. The solution had this composition (1 mg / ml o-feriylenedlamine (Sigma) and 0.1 µl / ml 30% H and 0 and in 100 ml citrate pH 4.5). After five minutes, the color reaction was stopped by adding 50 µl of 15% HeSCU. On a photometer reading the absorbance values in a CDynatech reader solution, the absorbbaricity was read at 490 nm - A ^ 90 .
Vybrané jamky z fúzie boli dvakrát prekloriované metódou limitného riedenia do 96-jamkovéj doštiCky. Po piatich dňoch inkubácie sa vizuálne hodnotil poCet kolónií v jamke. Hybridómy. ktoré sa klonovali, boli nasledujúce» 9001E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) a 90F2D CATCC HB 11725).Selected wells from the fusion were double-purified by limiting dilution to a 96-well plate. After five days of incubation, the number of colonies per well was visually assessed. Hybridomas. which were cloned were the following: 9001E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) and 90F2D CATCC HB 11725).
Izotypy inonoklonálnych protilátok. produkovaných hybridómami, bolí urCené pomocou systému Isostrip CBoehringer ňannhelm. Iridianapolis, IN) . Výsledky ukázali, že morioklonálne protilátky produkované hybridómami fúzie 90 boli typu IgGt.Isotypes of inonoclonal antibodies. produced by hybridomas were determined using the Isostrip CBoehringerannhelm system. Iridianapolis, IN). The results showed that the morioclonal antibodies produced by fusion 90 hybridomas were of the IgG t type.
Všetky monokloriálne protilátky produkované hybridómami z fúzie 90 bolo možné použiť v ELISA testoch, ale neviazali sa na PAF-AH vo Western blotoch. Na prípravu protilátok, ktoré by mohli rozpoznávať PAF-AH vo Western blote, sa myši imunlzovall rekoinbinantným enzýmom. Hybridómy boli pripravené metódou popísanou pre fúziu 90. ale testovanie prebiehalo pomocou Western blotu a nie pomocou ELISA. Tak boli vybrané klony, ktoré bolo možné použiť na detekciu pomocou tejto metódy.All monoclorial antibodies produced by hybridomas from fusion 90 could be used in ELISA assays but did not bind to PAF-AH in Western blots. To prepare antibodies that could recognize PAF-AH in a Western blot, mice were immunized with a recombinant enzyme. Hybridomas were prepared by the method described for fusion 90. but testing was by Western blot and not by ELISA. Thus, clones were selected that could be used for detection by this method.
Pre Western analýzy sa rekombinantný PAF-AH miešal s rovnakým objemom vzorkového pufra obsahujúceho 125ml*l Tris, pH 6, 8. 4% SDS. 100ml*l ditiotreitol a 0, 05% brofenolovú modrú. Pred nanesením na elektroforézu sa vzorka varila poCas 5 minút. Bo), používaný 12% SDS polyakrylamldový gél CNovex). Elektroforéza sa uskutočňovala pri 40inA, potom nasledoval elektrotransfer bielkoviny na polyvinylidénfluoridovú membránu (Pierce). Transfer trval 1 hodinu pri 124 V v roztoku 192mľl glycínu, 25mM Tris bázy, 20% metanolu a 0, 01% SDS. Membrána sa nechal inkubovať cez noc v roztoku 20mM Tris. lOOmM NaCI (TBS) obsahujúcom 5% hovädzie sérum albumín (BSA, Sigma). Blot sa ďalej Inkuboval 1 hodinu pri izbovej teplote s králičím polyklonálnym antisérom neriedeným 1:8000 pomocou TBS pufra obsahujúceho 5% BSA, potom nasledovalo premytie v TBS a inkubácia s konjugátom kozích antí myšacích IgG konjugovaných s alkalickou fosfatázou rozpusteným v TBS počas 1 hodiny pri Izbovej teplote. Blot bol a nasledovala Inkubácia so substrátom pre alkalickú fosfatázu, to znamená 5-bróm-4-chlér-3-indolyl fosfátom v koncentrácii 0, 02% a 0, 03% tetrazoliovou modrou v Tris-HCl, pHFor Western analysis, recombinant PAF-AH was mixed with an equal volume of sample buffer containing 125 ml * 1 Tris, pH 6, 8.4% SDS. 100 ml * 1 dithiothreitol and 0.05% brofenol blue. The sample was boiled for 5 minutes prior to electrophoresis. Bo), using a 12% SDS polyacrylamide gel (CNovex). Electrophoresis was performed at 40inA, followed by electrotransfer of the protein onto a polyvinylidene fluoride membrane (Pierce). The transfer took 1 hour at 124 V in a solution of 192mL glycine, 25mM Tris base, 20% methanol and 0.01% SDS. The membrane was allowed to incubate overnight in 20 mM Tris. 100mM NaCl (TBS) containing 5% bovine serum albumin (BSA, Sigma). The blot was further incubated for 1 hour at room temperature with rabbit polyclonal antiserum undiluted 1: 8000 with TBS buffer containing 5% BSA, followed by washing in TBS and incubation with alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG conjugated in TBS for 1 hour at room temperature. temperature. The blot was followed by incubation with a substrate for alkaline phosphatase, i.e. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate at concentrations of 0.02% and 0.03% tetrazolium blue in Tris-HCl, pH
9,5, lOOmM NaCI a 5mM MgCla. Reakcia bola zastavená pomocou opakovaného premývania vodou.9.5, 5 mM NaCl and lOOmM and MgCl. The reaction was stopped by repeated washing with water.
obsahujúcom 5% BSA opäť premytý TBScontaining 5% BSA washed again with TBS
Vybrané jamky fúzie, ktorých supernatanty boli pozitívne vo Westernovej analýze, boli spracované tak, ako to bolo popísané vyššie. Hybridóin 143A reagujúci s PAF-AH vo Western blotoch bol klonovaný (ATCC HB 11900).Selected fusion wells whose supernatants were positive in Western analysis were processed as described above. Hybridone 143A reactive with PAF-AH in Western blots was cloned (ATCC HB 11900).
Polyklonálrie antlséra špecifické pre ľudský plazmatický PAF-AH boli pripravené počas trojmesačnej lmunizácie králikov 1011 ug purifikovaného rekombinantného enzýmu vo Freundovom adjuvans.Polyclonal anti-serum specific for human plasma PAF-AH were prepared during 3-month immunization of rabbits with 1011 µg of purified recombinant enzyme in Freund's adjuvant.
Príklad 14Example 14
Na hodnotenie in vivo terapeutického vplyvu rekombinantného PAF-AH pripraveného podľa vynálezu boli uskutočnené experimentálne štúdie na modeli akútneho zápalu v prípade opuchu potkanieho chodidla (Henriues a ďalší. Br. J. Pharmacol.. 106·. 579-589 (1992). Výsledky týchto štúdií ukázali, že rPAF-AH blokuje vznik PAF-indukovaného edému. Ďalej boli uskutočnené paralelné štúdie slúžiace na porovnanie účinnosti PAF-AH s dvoma komerčne dostupnými PAF antagonlstamí.To assess the in vivo therapeutic effect of recombinant PAF-AH prepared according to the invention, experimental studies were conducted in an acute inflammatory model in the case of rat swelling (Henriues et al. Br. J. Pharmacol. 106: 579-589 (1992). Results of these Studies have shown that rPAF-AH blocks PAF-induced edema, and parallel studies have been conducted to compare the efficacy of PAF-AH with two commercially available PAF antagonists.
A. Príprava PAF-AHA. Preparation of PAF-AH
E. coli transformované PAF-AH expresným vektorom puc trp AH boli lýzované v mikrofluidizéri. pevné časti boli centrifugované a bunkové supernatanty boli nanesené na stĺpec S-Sepharosy (Pharmacia). Stĺpec bol extenzívne premývaný pufram obsahujúcim 50ml*l NaCl. 10ml*l CHAPS, 25ml*l I»1ES a lml*l EDTA. pH 5.5. PAF-AH bol vymytý stúpajúcou koncentráciou NaCl, až do hodnoty 11*1. Ako ďalší krok purifikačného procesu bola použitá afinitná chromátografia na stĺpci Blue Sepharosy (Pharmacia). Pred nanesením PAF-AH na stĺpec Blue Sepharosy bola vzorka nariedená 1«2, tým došlo k zníženiu koncentrácie soli na 0.51*1 a upravilo sa pH na 7.5. Po extenzívnom premývaní stĺpca Blue Sepharosy pufrom obsahujúcim 0. 51*1 NaCl. 25ml*l Tris. lOmľl CHAPS a lml*l EDTA. pH 7. 5. PAF-AH bol zo stĺpca vymývaný zvyšujúcou sa koncentráciou NaCl až na 3, 01*1.E. coli transformed with the PAF-AH expression vector puc trp AH were lysed in a microfluidizer. the solids were centrifuged and the cell supernatants were loaded onto a S-Sepharose column (Pharmacia). The column was washed extensively with a buffer containing 50 ml * 1 NaCl. 10ml * 1 CHAPS, 25ml * 1 * 1ES and 1ml * 1 EDTA. pH 5.5. PAF-AH was eluted with increasing NaCl, up to 11 * 1. Affinity chromatography on a Blue Sepharose column (Pharmacia) was used as the next step of the purification process. Before application of PAF-AH to the Blue Sepharose column, the sample was diluted 1 - 2, thereby reducing the salt concentration to 0.51 * 1 and adjusting the pH to 7.5. After extensive washing of the Blue Sepharose column with a buffer containing 0. 51 * 1 NaCl. 25ml * l Tris. 10ml CHAPS and 1ml * 1 EDTA. pH 7. 5. PAF-AH was eluted from the column with increasing NaCl concentration up to 3.01 * 1.
rozsahu 5000 uskutočnené s eridotoxínu arange 5000 performed with eridotoxin and
Čistota týmto spOsobom izolovaného PAF-AH bola obvykle 95%. tak. ako to bolo určené pomocou SDS-PAGE s aktivitou v až 1000 U/ml. Ďalšie kvantitatívne kontroly PAF-AH preparátmi zahrnovali určenie hladiny hemolytickej aktivity s čerstvo pripravenými potkaními erytrocytmi. Ako pufer slúžiaci súčasne na uchovanie aj ako nosič pre administráciu preparátu bol použitý pufer obsahujúci 25ml*l Tris, 10ml*l CHAPS. 0,51*1 NaCl, pH 7,5. Dávkovanie použité v pokusoch bolo založené ria určení enzýmovej aktivity v testoch priamo predchádzajúcich pokusom.The purity of PAF-AH isolated by this method was usually 95%. so. as determined by SDS-PAGE with activity at up to 1000 U / ml. Additional quantitative controls of PAF-AH preparations included determination of hemolytic activity levels with freshly prepared rat erythrocytes. A buffer containing 25 ml * 1 Tris, 10 ml * 1 CHAPS was used as both the preservation buffer and the carrier for administration of the preparation. 0.51 * 1 NaCl, pH 7.5. The dosages used in the experiments were based on the determination of enzyme activity in assays directly prior to the experiments.
B. Indukcia opuchu (edému)B. Edema induction (edema)
Vo všetkých pokusoch boli použité potkanie samice Long Evans (Charles River, Uilmlngtori, l*IA) staré medzi 6 až 8 týždňami, ktoré vážili medzi 1B0 až 200 g. Pred uskutočnením pokusu boli zvieratá podrobené anestézii zmesou anestetlckých prípravkov Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (l*llles. Shaunee Mlsslon. KS) a AcePromazln (Aveco. Fort Dodge, IA). Všetky anestetiká boli podané podkožné v dávkach približne 2. 5 mgLong Evans rats (Charles River, Uilmlngtori, 1 * IA) between 6 and 8 weeks of age, weighing between 1 and 200 g, were used in all experiments. Prior to the experiment, the animals were anesthetized with a mixture of Ketaset anesthetic preparations (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (11 * Shlesunee Mlsslon, KS) and AcePromazine (Aveco, Fort Dodge, IA). All anesthetics were administered subcutaneously at doses of approximately 2.5 mg
Ktasetu. 1,6 mg Rompunu. 0,2 mg AcePromazlnu na jednu dávku podanú jednému zvieraťu. Opuchy boli indukované v chodidlách podaním buď PAF alebo zymozanu tak, ako je popísané ďalej. PAF pre realizáciu každého uchovávaného v zmesiKtasetu. 1.6 mg Rompun. 0.2 mg of AcePromasin per dose given to one animal. Swelling was induced in the feet by administration of either PAF or zymosan as described below. PAF for the realization of each stored in the mixture
Požadované objemy boli čerstvý pre každý pokus a Zvieratám bolo aplikovaných (Sigma -1402) bol čerstvo pripravený pokusu zo zásobného roztoku 19, lml*l chloroform/metanol (9«1) pri -20 ‘’C.The required volumes were fresh for each experiment and the animals (Sigma -1402) were freshly prepared from the 19, 1 ml * 1 chloroform / methanol (9 1 1) stock solution at -20 C. C.
vysušené pod dusíkovou atmosférou, neriedené 1*1000 v pufri obsahujúcom 150ml*l NaCl, lOmM Tris. pH 7,5 a 0.25% BSA a sord.kované počas piatich minút. Zvieratám bolo aplikovaných podkožné medzi brušká ria zadnom chodidle 50 ul PAF (konečná dávka 0. 95 nmol). Opuch sa objavil za hodinu, v niektorých prípadoch po dvoch hodinách. Zymozan A (Sigma A-8800) sa pripravoval to ako suspenzia 10 mg/ml v PS. podkožné medzi brušká na zadnom chodidle 50 ul zymozanu (konečná dávka 500 ug) a opuch sa objavil po dvoch hodinách.dried under nitrogen, undiluted with 1 * 1000 in buffer containing 150 ml * 1 NaCl, 10 mM Tris. pH 7.5 and 0.25% BSA and sordated for five minutes. The animals were injected subcutaneously between the abdominal thigh with 50 µl of PAF (final dose 0. 95 nmol). Swelling occurred in an hour, in some cases after two hours. Zymozan A (Sigma A-8800) was prepared as a 10 mg / ml suspension in PS. subcutaneously between the tummy on the hind foot of 50 µl zymosan (final dose 500 µg) and swelling appeared after two hours.
Opuch sa kvantifikoval pomocou merania objemu chodidla bezprostredne pred administráciou PAF alebo zymozanu a potom v uvedenom čase po podaní PAF a zymozanu. Opuch sa kvantifikoval zvýšením objemu chodidla v mililitroch. Meranie objemu bolo uskutočňované na plethysmometri (UGO Basile, model 7150), ktorým sa dá zmerať. objem vody vytlačenej ponoreným chodidlom. Z dôvodu, aby bola porovnateľná veľkosť ponorenej častí chodidla v obdivoch vymedzených časových intervaloch, zadná časť nohy bola označená nezmývateľným atramentom v mieste, kde končí osrstenie na päte. Opakované merania rovnakého chodidla použitím tejto techniky indikovali presnosť merania s chybou do 5 %.Swelling was quantified by measuring the volume of the foot immediately before administration of PAF or zymosan and then at that time after administration of PAF and zymosan. Swelling was quantified by increasing the foot volume in milliliters. Volume measurement was performed on a plethysmometer (UGO Basile, model 7150), which can be measured. the volume of water displaced by the immersed foot. In order to be comparable in size to the submerged parts of the foot at admiration of time intervals, the back of the foot was marked with irreversible ink where the heeling ends. Repeated measurements of the same foot using this technique indicated measurement accuracy with an error of up to 5%.
C. Spôsoby podávania a dávkovania PAF-AHC. Methods of Administration and Dosage of PAF-AH
PAF-AH bol podávaný injekčné lokálne medzi brušká na chodidle, alebo systémovo pomocou intravenóznej injekcie do chvostovej žily. Pri lokálnom podávaní dostali potkany 100 ul PAF-AH (4000-6000 U/ml) podkožné medzi brušká pravej zadnej nody Ľavá noha slúžila ako kontrola, bola do nej lnjikovaná dávka 100 ul nosiča (pufrovaný fyziologický roztok). Pri systémovom podávaní PAF-AH bolo potkanom podávané uvedené množstvo jednotiek PAF-AH v 300 ul nosiča injekciou do chvostovej žily. Kontrolné zvieratá dostali intravenózne do chvostovej žily rovnaký objem nosiča.PAF-AH was injected locally between the tummy on the foot or systemically by intravenous injection into the tail vein. When administered locally, the rats received 100 µl of PAF-AH (4000-6000 U / ml) subcutaneously between the right hind abdomen. The left leg served as a control, injected with a 100 µl dose of vehicle (buffered saline). For systemic administration of PAF-AH, rats were given the indicated amount of PAF-AH units in 300 µl of carrier by tail vein injection. Control animals received the same volume of vehicle intravenously into the tail vein.
D. Lokálne podávanie PAF-AHD. Topical Administration of PAF-AH
Potkanom (N=s4) bola podaná subkutánne medzi brušká na pravom chodidle injekčná dávka 100 ul PAF-AH (4000-6000 U/ml). Do ľavého chodidla bol injekčné vpravený len nosič (100 ul pufrovaného fyziologického roztoku). Štyrom ďalším potkanom bola podaná len dávka nosiča. Všetky potkany boli ihneď podrobené podaniu PAF cestou subkutánnych injekcii a jednu hodinu po podaní bol meraný objem. Obrázok 6, kde je veľkosť opuchu vyjadrená zvýšením objemu chodidla (ml) ±SEM pre každú sledovanú skupinu, ukazuje, že vznik opuchu indukovaného pomocou PAF je blokovaný lokálnym podaním PAF-AH. V prípade skupiny zvierat, ktorým bol podaný PAF-AH pred podaním PAF, sa prejavilil v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat zmenšenie opuchu. V skupine myši ošetrených PAF-AH bolo pozorované zvýšenie objemu chodidla len o 0,08 ml±0. 008 (SEM). Zvýšenie objemu chodidla bolo spôsobené injekciou PAF do chodidla. Toto zvýšenie objemu nebolo pozorované v chodidlách, do ktorých bol injekčrie aplikovaný len nosič.Rats (N = s 4) were injected subcutaneously between the tummy of the right foot with a 100 µl injection of PAF-AH (4000-6000 U / ml). Only the vehicle (100 µl of buffered saline) was injected into the left foot. Four other rats received only the dose of vehicle. All rats were immediately subjected to PAF by subcutaneous injection and the volume was measured one hour after administration. Figure 6, where swelling size is expressed by the increase in foot volume (ml) ± SEM for each treatment group, shows that PAF-induced swelling is blocked by local administration of PAF-AH. In the group of animals treated with PAF-AH prior to PAF administration, there was a decrease in swelling compared to the control group of animals. In the PAF-AH treated mice, an increase in foot volume of only 0.08 ml ± 0 was observed. 008 (SEM). The increase in foot volume was due to injection of PAF into the foot. This increase in volume was not observed in soles injected solely with the vehicle.
E. Intravenózne podávanie PAF-AHE. Intravenous administration of PAF-AH
Potkany (N=4 v skupine) boli ošetrené intravenóznou injekciou PAF-AH (2000 U v 300 ul nosiča) 15 minút pred podaním PAF. Opuch sa objavil 1 až 2 hodiny po podaní PAF. Obrázok 7, na ktorom je veľkosť opuchu vyjadrená nárastom objemu v (ml)±SEM pre každú skúmanú skupinu, ukazuje, že intravenózna aplikácia PAF-AH blokuje vznik opuchu zapríčinený podaním PAF a to jednu až dve hodiny po jeho podaní. Skupina, ktorá bola ošetrená 20Q0U PAF-AH itnravenóznou cestou, vykázala počas dvoch hodín zníženie zápalu. Priemerné zvýšenie hodnoty objemu kvapaliny liečenej PAF-AH bolo 0, 10±0,08 (SEM), oproti zvýšeniu 0.56 ml±0, 11 nameranému v prípade kontrolnej skupiny ošetrenej len nosičom.Rats (N = 4 per group) were treated by intravenous injection of PAF-AH (2000 U in 300 µl vehicle) 15 minutes before PAF administration. Swelling occurred 1-2 hours after PAF administration. Figure 7, in which the swelling size is expressed in volume increase in (ml) ± SEM for each study group, shows that intravenous application of PAF-AH blocks the development of swelling due to PAF administration one to two hours after administration. The group that was treated with 20QUU PAF-AH by the intravenous route showed a decrease in inflammation within two hours. The mean increase in the volume of liquid treated with PAF-AH was 0.10 ± 0.08 (SEM), compared to an increase of 0.56 ml ± 0.1 in the vehicle-treated control group.
F. Porovnanie účinku PAF-AH v zabránení vzniku opuchu indukovaného PAF alebo ZymozanomF. Comparison of PAF-AH Effect in Preventing PAF or Zymozan-induced Swelling
Potkany (N=4 v skupine) boli ošetrené intravenóznou injekciou PAF-AH (2QQ0U v 300 ul nosiča) alebo nosičom samotným. 15 minút pred touto injekciou dostali zvieratá PAF alebo zymozan A a po jednej alebo dvoch hodinách bol zmeraný objem chodidiel. Na obrázku 8 je znázornená velkost opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podanie PAF-AH (2000 U) bolo účinné v redukcii opuchu chodidla vyvolaného PAF, avšak je neuúčinné v blokovaní vzniku opuchu v prípade podávania zymozanu. Priemerné zvýšenie hodnoty objemu v prípade skupiny PAF-AH bolo 0, 08±0. 02 (SEI*I), oproti zvýšeniu 0, 49±0, 03 nameranému v prípade kontrolnej skupiny.Rats (N = 4 per group) were treated by intravenous injection of PAF-AH (2QQ0U in 300 µl vehicle) or vehicle alone. 15 minutes prior to this injection, the animals received PAF or zymozan A and the foot volume was measured after one or two hours. Figure 8 shows the swelling size as the mean volume increase in (ml) ± SEM for all treatment groups. It can be seen from the figure that the administration of PAF-AH (2000 U) was effective in reducing PAF-induced foot edema, but is ineffective in blocking edema formation with zymosan administration. The mean volume increase for the PAF-AH group was 0.08 ± 0. 02 (SEI * I), versus an increase of 0.49 ± 0.03 measured for the control group.
G. Podávanie účinnej dávky určené titráciou PAF-AH. ktorá vyvoláva ochranuG. Administration of an effective dose determined by titration of PAF-AH. that gives protection
V dvoch samostatných pokusoch bol potkanom (N=3 až 4 v skupine) podávaný intravenózne PAF-AH v sérii riedení alebo len nosič v 300 ul objemoch a to 15 minút pred podaním dávky PAF. Obidve chodidlá zvierat boli ošetrené PAF rovnakým spôsobom, ako je popísaný vyššie, opuch sa hodnotil po jednej hodine. Na obrázku 9 je znázornená velkost opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podávanie stúpajúcich dávok PAF-AH zabraňuje tiež so stúpajúcou tendenciou tvorbe opuchu vyvolaného injekciou PAF potkanom. V pokuse bola zistená I0so pre PAF-AH podávaný Injekčnou cestou medzi 40 až 80 U na potkana.In two separate experiments, rats (N = 3 to 4 per group) were administered intravenously with PAF-AH in a series of dilutions or vehicle only in 300 µl volumes 15 minutes prior to dosing with PAF. Both feet of the animals were treated with PAF in the same manner as described above, the swelling was evaluated after one hour. Figure 9 shows the swelling size as the mean volume increase in (ml) ± SEM for all treatment groups. It can be seen from the figure that administration of increasing doses of PAF-AH also prevents an increasing tendency to produce swelling induced by PAF injection in the rat. The experiment was found I0 of PAF-AH given by injection between 40 and 80 U per rat.
H. Účinnosť PAF-AH in vivo ako funkcia času po podaníH. Efficacy of PAF-AH in vivo as a function of time after administration
V dvoch samostatných pokusoch bol potkanom (N=3 až 4 v skupine) podávaný intravenózne PAF-AH (200 U v 300 ul nosiča) alebo len nosič. Po podaní PAF-AH dostali potkany dávku PAF a to v časových intervaloch začínajúcich 15 minút po podaní PAF-AH až po 47 hodín po podaní PAF-AH. Opuch bol potom hodnotený jednu hodinu po podaní PAF. Na obrázku 10 je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEI*l a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podanie 200U PAF-Ah ochráni potkany pred vznikom opuchu Indukovaného PAF počas najmenej 24 hodín.In two separate experiments, rats (N = 3 to 4 per group) were administered intravenously with PAF-AH (200 U in 300 µl vehicle) or vehicle only. After administration of PAF-AH, rats received a dose of PAF at time intervals beginning 15 minutes after PAF-AH administration up to 47 hours after PAF-AH administration. The swelling was then assessed one hour after PAF administration. Figure 10 shows swelling size as the mean volume increase in (ml) ± SEI * 1 for all treatment groups. From the figure, it is evident that administration of 200U PAF-Ah will protect rats from induced PAF swelling for at least 24 hours.
I. Farmakokinetiká PAF-AHI. Pharmacokinetics of PAF-AH
Štyri potkany dostali dávku 2000 PAF-AH intravenóznou injekciou v 300 ul objeme. V rôznych časových bodoch bola odobraná plazma a uchovaná pri 4 °C. Koncentrácia PAF-AH v plazme sa určovala pomocou ELISA, používal sa typ testu využívajúci dvojité väzby pomocou mAb. V skratke sa dá tento postup popísať takto: monoklonálna protilátka 90G11D (Príklad 13) sa nariedi v 50mľl uhličitanovom puf r i pH 9, 0 na koncentráciu 100 ng/ml a nechá sa naviazať na mikrotitračnú dosku Immulon 4 cez noc pri +4 °C. Po extenzívnom premytí pomocou PBS obsahujúceho 0, 05% Tueen 20, sa dosky blokovali 1 hodinu pri izbovej teplote 0, 5% rybacou kožnou želatínou (Sigma) riedenou v PBS. Vzorky séra riedené v PBS obsahujúceho 15mľl CHAPS boli na premytú dosku nanesené v duplikátoch a inkubovali sa počas 1 hodiny v izbovej teplote. Po premyti bol pridaný do každej jamky konjugát monoklonálriej protilátky 90F2D s biotírioín (Príklad 13) v koncentrácii 5 ug/ml Konjugát sa nechal inkubovať jednu hodinu pri Po premytí sa pridalo do každej jamky 50 ulFour rats received a dose of 2000 PAF-AH by intravenous injection in 300 µl volume. Plasma was collected at various time points and stored at 4 ° C. Plasma concentration of PAF-AH was determined by ELISA, using a type of double-binding mAb assay. Briefly, the 90G11D monoclonal antibody (Example 13) was diluted in 50 ml of carbonate buffer pH 9.0 to a concentration of 100 ng / ml and allowed to bind to the Immulon 4 microtiter plate overnight at +4 ° C. After extensive washing with PBS containing 0.05% Tueen 20, the plates were blocked for 1 hour at room temperature with 0.5% fish skin gelatin (Sigma) diluted in PBS. Serum samples diluted in PBS containing 15mL of CHAPS were plated in duplicate on the washed plate and incubated for 1 hour at room temperature. After washing, the 90F2D monoclonal antibody conjugate with biotirioin (Example 13) was added to each well at a concentration of 5 µg / ml. Conjugate was allowed to incubate for one hour. After washing, 50 µl was added to each well.
Extra avldínu (Sigma) v riedení 1:1000. Avidin sa inkuboval jednu hodinu pri izbovej teplote. Po premytí sa pridal substrát OPD a nechalo sa vyvinúť zafarbenie, ktoré sa zmeralo na fotometri. Z kalibračnej krivky sa potom podlá nameraných hodnôt odčítala aktivita enzýmu. Z obrázku 11, kde body reprezentujú priemer±SEI*l je zrejmé, že v plazme odobranej hodinu pred podaním hladiny koncentrácie PAF-AH dosahujú predpokladanú koncentráciu vo vzorkách s objemom plazmy 5 až 6 ml u potkanov vážiacich 180 až 200 gramov, priemerne 374 U/ml±58,2. Po jednej hodine hladiny koncentrácie stabilne klesajú, až dosiahnu po 24 hodinách priemernú hodnotu 19,3 U/ml±3,4, ktorá je však stále znateľne nariedený v PBS. izbovej teplote.Extra avldine (Sigma) at 1: 1000 dilution. Avidin was incubated for one hour at room temperature. After washing, the OPD substrate was added and allowed to develop staining, which was measured on a photometer. The enzyme activity was then read from the calibration curve according to the measured values. From Figure 11, where the dots represent mean ± SEI * 1, it is evident that in plasma collected an hour prior to administration of PAF-AH levels, they predict concentrations in plasma samples of 5-6 ml in rats weighing 180-200 grams, average 374 U / ml ± 58.2. After one hour, the concentration levels steadily decrease until they reach an average value of 19.3 U / ml ± 3.4 after 24 hours, which is still appreciably diluted in PBS. room temperature.
vyššia ako koncentrácia endogénnej PAF-AH, ktorá dosahovala v enzyinatických testoch približné hodnoty okolo 4 U/ml.higher than the concentration of endogenous PAF-AH, which reached approximately 4 U / ml in enzymatic assays.
J. Účinnosť PAF-AH v porovnaní s antagonistami PAFJ. Efficacy of PAF-AH compared to PAF antagonists
Potkany (N=4 v skupine) bolí ošetrené jedným z troch potenciálnych prípravkov zamedzujúcich zápal: antagonistom PAF CV3988 (Biomol L-103) podávaný IP (2mg v 200 ul EtOH). antagonistom PAF Alpazolom (Sigma A - 8800) podávaným IP (2 mg v 200 ul EtOH) alebo PAF-AH (2000 U) podávaným IV. Kontrolná skupina potkanov dostala 300 ul nosiča IV. Antagonisti PAF boli administrované IP, pretože sú rozpustné v etanole. Potkanom ošetreným buď CV3988 alebo Alprazolom bol podaný PAF po 30 minútach po podaní týchto antaganistov, to preto, aby sa antagonisti PAF dostali do obehu, zatiaľ čo PAF-AH a potkanom ošetreným nosičom bolo podávanie uskutočnené po 15 minútach po administrácii enzýmu. Potkany ošetrené PAF-AH vykazovali redukciu v opuchoch indukovaných PAF, až za nimi sa umiestili ďalší antagonisti CV3988 a Aprazolain. To je znázornené ria obrázku 12, kde je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (inl)±SEI*l a to pre všetky skúmané skupiny.Rats (N = 4 per group) were treated with one of three potential anti-inflammatory agents: PAF antagonist CV3988 (Biomol L-103) administered IP (2mg in 200µl EtOH). PAF antagonist Alpazol (Sigma A-8800) administered IP (2 mg in 200 µl EtOH) or PAF-AH (2000 U) administered IV. A control group of rats received 300 µl of carrier IV. PAF antagonists have been administered IP because they are soluble in ethanol. Rats treated with either CV3988 or Alprazole were given PAF 30 minutes after the administration of these antagonists, to allow PAF antagonists to circulate, while PAF-AH and rat treated carriers were administered 15 minutes after administration of the enzyme. PAF-AH-treated rats showed a reduction in PAF-induced swelling until additional CV3988 and Aprazolain antagonists were placed behind them. This is shown in Figure 12, where swelling is shown as the mean volume increase in (inl) ± SEI * 1 for all groups studied.
Ak zhrnieme dosiahnuté výsledky, je zrejmé, že rPAF-AH účinne blokuje opuchy vyvolané in vivo PAF. Podávanie produktov PAF-AH sa môže diať buď lokálne alebo systémovo pomocou IV injekcií. V štúdiách dávkovania sa pohybovali dávky IV injekcií v rozsahu 160-2000 U/potkana. Tieto dávky dramaticky znížili zápal vyvolaný PAF, zatiaľ čo dávka 01So sa pohybovala v rozmedzí 40 až 80 ϋ/potkana. Výpočty založené na objeme plazmy pre potkana vážiaceho 180 až 200 gramov dávajú dobrý predpoklad pre to, že koncentrácie v plazme rovnajúce sa 25 až 40 U/ml účinne bránia vzniku opuchu vyvolanému PAF. Tieto predpoklady boli podporené predbežnými farmakoklnetlckými štúdiami. Zistilo sa, že dávka 2000U PAF-AH je účinná pri blokovaní edému vyvolaného PAF počas najmenej 24 hodín. Po 24 hodinách po podávaní boli v plazme zistené koncentrácie PAF-AH približne 25 U/ml. PAF-AH blokoval vznik opuchu vyvolaného PAF oveľq účinnejšie ako obidvaja testovaní uvedený ďalší antagonisti PAF. Súhrnne je možné povedať, že tieto výsledky potvrdzujú, že PAF-AH úClnne blokuje zápaly indukované PAF a mohol by mať terapeuticky význam pri liečení chorôb, kde je PAF primárny mediátor.Summarizing the results obtained, it is clear that rPAF-AH effectively blocks in vivo PAF-induced edema. Administration of PAF-AH products can be either local or systemic by IV injection. In dosing studies, doses of IV injections ranged from 160-2000 U / rat. These benefits dramatically reduce PAF mediated inflammation, while a dose of 01 S was between 40 and 80 ϋ / rat. Calculations based on plasma volume for a rat weighing 180-200 grams provide a good assumption that plasma concentrations of 25-40 U / ml effectively prevented PAF-induced edema. These assumptions were supported by preliminary pharmacokinetic studies. A dose of 2000U of PAF-AH was found to be effective in blocking PAF-induced edema for at least 24 hours. Plasma PAF-AH concentrations of approximately 25 U / ml were detected 24 hours after administration. PAF-AH blocked PAF-induced swelling much more efficiently than both testing of said other PAF antagonists. Taken together, these results confirm that PAF-AH effectively blocks PAF-induced inflammation and could be of therapeutic importance in the treatment of diseases where PAF is the primary mediator.
Príklad 15Example 15
Rekoinbinantý PAF-AH podľa vynálezu bol testovaný in vivo na druhom modeli, zápale pohrudnice (pleuritíde) vyvolanom PAF. Ako bolo ukázané už predtým, ak je aplikovaný do pohrudnlčného priestoru, indukuje vaskulárne presakovanie. (Hebriques a ďalší, pozri vyššie). Samice potkanov (Charles River, 180-200 g) boli injikované do chvostovej žily 200 ul 1% Evansovou modrou rozpustenou v 300 ul rekomblnantného PAF-AH (1500 ul/ml/hodina, pripraveného tak, ako je to popísané v Príklade 14) alebo len rovnakým objemom kontrolného pufra. Po pätnástich minútach dostali potkany lOOul injekciu PAF (2nmol) do pohrudnlčného priestoru. Po jednej hodine pôsobenia PAF boli. potkany zabité a odsatá kvapalina, ktorá vznikla premývaním pohrudničnej dutiny 3 ml heparinizovaného PBS. Presakovanie ciev bolo merané množstvom Evarisovej modrej v pohrudničnom priestore premeraním absorbancie pri 620 nm. V prípade potkanov, ktorým bol najprv podaný PAF-AH, bolo presakovanie ciev oveľa menšie, ako v prípade kontrolnej skupiny zvierat (reprezentovalo to viac ako 80% redukciu zápalu).The recombinant PAF-AH of the invention was tested in vivo in a second model, pleural inflammation (pleuritis) induced by PAF. As previously shown, when applied to the pleural space, it induces vascular leakage. (Hebriques et al., Supra). Female rats (Charles River, 180-200 g) were injected into the tail vein with 200 µl of 1% Evans Blue dissolved in 300 µl of recombinant PAF-AH (1500 µl / ml / hour, prepared as described in Example 14), or with just the same volume of control buffer. After 15 minutes, 100µl rats were injected with PAF (2nmol) into the pleural space. After one hour of PAF treatment they were. rats are killed and aspirated by washing the pleural cavity with 3 ml of heparinized PBS. Vessel leakage was measured by the amount of Evaris blue in the pleural space by measuring absorbance at 620 nm. In the rats initially given PAF-AH, the leakage of the vessels was much less than that of the control group of animals (representing more than 80% reduction in inflammation).
Predchádzajúce výsledky podporujú možnosť využitia rekomblnantného PAF-AH podľa vynálezu ako lieku pri zápale pohrudnice.Previous results support the possibility of using recombinant PAF-AH of the invention as a medicament for pleural inflammation.
Príklad 16Example 16
Účinnosť rekomblnantného enzýmu PAF-AH podľa vynálezu bola tiež testovaná na modeli antigénom Indukovanej tvorby eozinofilov. Akumulácia eozinofilov v dýchacích cestách je charakteristickou vlastnosťou neskorej fázy imunitnej odpovede, ktorá sa vyskytuje pri astme. rlnitíde a ekzémoch, ľlyšl BALB/c (Charles River) boli zcitlivené dvoma intraperitoneálnymi injekciami obsahujúcimi 1 ug ovalbumínu (OVA) v 4 mg hydroxidu hlinitého (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) podanými v dvojtýždennom intervale. Štrnásty deň nasledujúci druhou lmunlzáclou boli zcitlivené myši podrobené imunologickému testu s aerosolizovaným OVA alebo fyziologickým roztokom ako kontrolou.The efficacy of the recombinant PAF-AH enzyme of the invention was also tested in a model of antigen-induced eosinophil formation. The accumulation of eosinophils in the airways is a characteristic feature of the late phase of the immune response that occurs in asthma. rnititis and eczema, unlike BALB / c (Charles River), were sensitized by two intraperitoneal injections containing 1 µg ovalbumin (OVA) in 4 mg aluminum hydroxide (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) given at two week intervals. On the fourteenth day following the second immunoglobulin, the sensitized mice were subjected to an immunoassay with aerosolized OVA or saline as a control.
Pred samotným testom boli myši náhodne rozdelené do štyroch skupín po štyroch myšiach. Plyši v skupine 1. a 3 boli ošetrené 140 ul kontrolného pufra obsahujúceho 25ml*l Tris, 0,51*1 NaCl, lml*l EDTA a 0.1Z Tueen 80 podaného intravenóznou injekciou. Plyši v skupine 2a 4 boli ošetrené 750 jednotkami PAF-AH (aktivita 5500U/ml podanými v 140 ul PAF-AH pufra). Tridsať minúť po podaní PAF-AH alebo pufra boli myši v skupine 1 a 2 vystavené aerosollzovanému PBS. ako je to popísané ďalej, zatiaľ čo myši v skupine 3 a 4 boli vystavené aerosollzovanému OVA. 24 hodín potom boli myši. opäť ošetrené druhý raz buď 140 ul pufra (skupina 1 a 3) alebo 750 jednotkami PAF-AH v 140 ul pufra (skupina 2 a 4). Látky boli podané intravenózne injekciou.Prior to the test, mice were randomly divided into four groups of four mice. Plushes in Groups 1 and 3 were treated with 140 µl of control buffer containing 25ml * 1 Tris, 0.51 * 1 NaCl, 1ml * 1 EDTA and 0.1Z Tueen 80 administered by intravenous injection. Plushes in Group 2a 4 were treated with 750 units of PAF-AH (5500U / ml activity administered in 140 µl of PAF-AH buffer). Thirty minutes after PAF-AH or buffer administration, mice in Groups 1 and 2 were exposed to aerosolized PBS. as described below, while mice in groups 3 and 4 were exposed to aerosolized OVA. 24 hours later, the mice were. re-treated a second time with either 140 µl of buffer (groups 1 and 3) or 750 units of PAF-AH in 140 µl of buffer (groups 2 and 4). The compounds were injected intravenously.
Eozifilová infiltrácia trachei bola indukovaná u zcitlivených myší vystavením zvierat aerolizovanému OVA. Zcitlivené myši boli umiestené do 50inl kónických centrifugačných skúmaviek (Cormimg) a nútené dýchať aerolizovaný OVA (50 mg/ml) rozpustený v 0, 9% fyziologickom roztoku počas 20 minút s použitím rozprašovača (Model 646, DeVilblss Corp., Somerset, PA). Kontrolné myši boli ošetrené rovnakým spôsobom s tou výnimkou, že bol v rozprašovači použitý len 0, 9% fyziologický roztok. 48 hodín po expozícií aerolizovaným OVA alebo fyziologickým roztokom boli myši usmrtené a trachey boli vybrané. Trachey z každej skupiny boli pevne zachytené v OCT a skladované pri -70 °C do doby narezania preparátov.Trachea eosifile infiltration was induced in sensitized mice by exposure of animals to aerolized OVA. Sensitized mice were placed in 50 µl conical centrifuge tubes (Cormimg) and forced to breathe aerolized OVA (50 mg / ml) dissolved in 0.9% saline for 20 minutes using a nebulizer (Model 646, DeVilblss Corp., Somerset, PA). Control mice were treated in the same manner except that only 0.9% saline was used in the nebulizer. 48 hours after exposure to aerolized OVA or saline, mice were sacrificed and trachea removed. Tracheas from each group were firmly captured in OCT and stored at -70 ° C until the slides were cut.
Na vyhodnotenie eozinofilovej infiltrácie trachey boli tkanivové rezy zo štyroch skupín myší ofarbené buď roztokom Luna a hematoxylín-eozínovým roztokom alebo peroxldázou. Dvanásť šesťmikrometrových rezov bolo narezaných z každej skupiny a podľa toho očíslovaných. Rezy očíslované nepárnymi číslami boli ofarbené farbou Luna podľa nasledujúceho postupu. Rezy boli fixované 5 minút pri laboratórnej teplote, opláchnuté tečúcou vodou trikrát počas 2 minút pri laboratórnej teplote a potom opláchnuté v dvoch výmenách destilovanej vody (dH2O) počas jednej minúty pri laboratórnej teplote. Tkanivové rezy boli farbené farbou Luna 5 minút pri laboratórnej teplote (farba Luna je zložená z 90 ml Ueigertovho železného hematoxylínu (Ueigert's Irori heinatoxylin) a 10 ml 12 Bierbrich Scarlet) . Ofarbené rezy boli ponorené do 12 kyslého alkoholu 6x, opláchnuté v tečúcej vode počas 1 minúty pri laboratórnej teplote, ponorené do 0, 52 roztoku uhličitanu lltneho, päťkrát opláchnuté tečúcou vodou počas 2 min pri izbovej teplote. Rezy boli dehydrované etanolom s koncentráciami 70 2 - 95 2 - 100 2, v každej koncentrácii boli ponechané 1 minútu pri izbovej teplote, ďalej boli prečistené dvakrát xylénom počas 1 minúty pri izbovej teplote a pripevnené do Cytoseal 60.To evaluate eosinophil trachea infiltration, tissue sections from four groups of mice were stained with either Luna solution and haematoxylin-eosin solution or peroxidase. Twelve six-micron sections were cut from each group and numbered accordingly. Sections numbered odd were stained with Luna according to the following procedure. The sections were fixed for 5 minutes at room temperature, rinsed with running water three times for 2 minutes at room temperature and then rinsed in two changes of distilled water (dH 2 O) for one minute at room temperature. Tissue sections were stained with Luna for 5 minutes at room temperature (Luna is composed of 90 ml Ueigert's iron hematoxylin (Ueigert's Irori heinatoxylin) and 10 ml 12 Bierbrich Scarlet). The stained sections were immersed in 12 acidic alcohol 6 times, rinsed in running water for 1 minute at room temperature, immersed in 0.52 of lithium carbonate solution, rinsed five times with running water for 2 min at room temperature. Sections were dehydrated with ethanol at concentrations of 70 - 95 - 2 - 100 2, left for 1 minute at room temperature, further cleaned twice with xylene for 1 minute at room temperature and attached to Cytoseal 60.
Pre farbenie peroxidáz boli segmenty fixované acetónom s teplotou 4 °C počas 10 minút a usušené na vzduchu. Ku každej časti bolo pridaných 200 ul roztoku DAB a ponechaných 5 min pri izbovej teplote. Rezy boli 5 min oplachované vodovodnou vodou pri izbovej teplote a ďalej boli na každý segment aplikovaný 2 kvapky 12 kyseliny osmičelej počas 3-5 s. Rezy boli opláchnuté vodovodnou vodou počas 5 min pri izbovej teplote a kontrastne ofarbené Mayerovým hematoxylínom pri 25 °C pri izbovej teplote. Potom boli rezy 5 min oplachované tečúcou vodou a dehydrované etanolovým radom 70 2 - 95 2 - 100 2. 1 minútu v každej koncentrácii, pri izbovej teplote. Rezy boli ďalej prečistené dvakrát xylénom počas 1 minúty pri izbovej teplote a upevnené v Cybosealu 60.For peroxidase staining, segments were fixed with acetone at 4 ° C for 10 minutes and air dried. 200 µl of DAB solution was added to each portion and left at room temperature for 5 min. Sections were rinsed with tap water at room temperature for 5 min and 2 drops of 12 osmium acid were added to each segment for 3-5 s. Sections were rinsed with tap water for 5 min at room temperature and counterstained with Mayer's hematoxylin at 25 ° C at room temperature. Then, the sections were rinsed with running water for 5 min and dehydrated with an ethanol series 70 of 2 - 95 2 - 100 for 1 minute at each concentration, at room temperature. Sections were further cleaned twice with xylene for 1 minute at room temperature and mounted in Cyboseal 60.
Bol hodnotený počet eozinofilov v submukozálnom tracheálnom tkanive. Trachea myšacej prvej a druhej skupiny obsahovala veľmi málo samotných eozinofilov v submukozálnom tkanive. Podľa predpokladu boli trachey myši tretej skupiny, ktoré boli dopredu ošetrené pufrom a vystavené poprašku OVA, veľký počet eozinofilov v subniukozálnom tkanive. Oproti tomu trachey myší. štvrtej skupiny, ktoré boli predbežne ošetrené PAF-AH a vystavené poprášenie OVA, obsahovali len niekoľko eozinofilov v submukozálnom tkanive v porovnaní s kontrolnou skupinou a skupinami 1 a 2.The number of eosinophils in submucosal tracheal tissue was evaluated. The trachea of the mouse first and second groups contained very few eosinophils alone in submucosal tissue. Supposedly, the tracheas of the third group of mice pre-treated with buffer and exposed to OVA dust were a large number of eosinophils in subniucosal tissue. In contrast, trachea mice. The fourth group, which had been pre-treated with PAF-AH and exposed to OVA dusting, contained only a few eosinophils in submucosal tissue compared to the control group and groups 1 and 2.
Terapeutické ošetrenie PAF-AH preto môže byť indikované v prípadoch neskorej imunitnej odpovede, pri ktorej dochádza k akumulácii eozinofilov, tak, ako je to v prípade astmy a rinitidy.Therefore, therapeutic treatment of PAF-AH may be indicated in cases of a late immune response in which eosinophils accumulate, as in the case of asthma and rhinitis.
Príklad 17Example 17
PAF-AH produkt, ktorý je predmetom patentu, bol testovaný pre dva odlišné potkanie modely pri ošetrení nekrotických enterokolitíd (NEC), akútnych hemoragických nekróz čreva, ku ktorým dochádza u plodov s nízkou pôrodnou váhou a spôsobuje významnú chorobnosť a mortalitu. V predchádzajúcich experimentoch sa ukázalo, že ošetrenie glukokortikoidmi znížilo výskyt NEC u zvierat a nedonosených detí a predpokladá sa, že k aktivite glukokortikoidov dochádza prostredníctvom zvýšenej teploty PAF-AH v plazme.The patented PAF-AH product has been tested for two different rat models in the treatment of necrotic enterocolitis (NEC), acute haemorrhagic intestinal necrosis that occurs in fetuses of low birth weight and causes significant morbidity and mortality. Previous experiments have shown that glucocorticoid treatment reduced the incidence of NEC in animals and premature infants and glucocorticoid activity is believed to occur through elevated plasma PAF-AH temperature.
A. Aktivita u potkanov s NÍJEC indukovaným pôsobením PAFA. Activity in PAF-induced NIJEC rats
1. Prevencia1. Prevention
Rekomblnantriý PAF-AH produkt, rPH.2 (25.000 jednotiek v 0, 3 ml, skupiny 2 a 4) alebo samotný pufer (25ml*l Tris, 0,51*1 NaCl, lml*l EDTA a 0, IX Tueen 80) (skupiny 1 a 3), boli podané do chvostovej žily samičích potkanov Uistar (n=3) s hmotnosťou 180-200 g. 15 minút po aplikácií rPH.2 alebo samotného pufra bol zvieratám lnjlkovaný, tak ako to popísal Furukaua, et al. (J. Pediatr. Res. 34* 237-241 (1993)), do abdominálnej aorty na úrovni superíornej mezenterickej artérie buď samotný BSA (0,25 X) - fyziologický roztok (skupiny 1 a 2) alebo PAF (0,2 ug/100 mg) suspendovaný vo fyziologickom roztoku obsahujúcom BSA (skupina 3a 4). Tenké črevo bolo po dvoch hodinách odstránené od slepého čreva prerušením Trietzovho väzu, dôkladne opláchnuté chladným fyziologickým roztokom a hodnotené. Pre mikroskopické pozorovanie boli získané vzorky z hornej, strednej a dolnej časti tenkého čreva. Tkanivá boli fixované v pufrovanom formalíne a vzorky pripravené pre mikroskopické hodnotenie ofarbením hematoxilínom a eozínom. Experiment bol trikrát opakovaný.Recombine-tan PAF-AH product, rPH.2 (25,000 units in 0, 3 ml, groups 2 and 4) or buffer alone (25ml * 1 Tris, 0.51 * 1 NaCl, 1ml * 1 EDTA and 0, IX Tueen 80) (groups 1 and 3) were administered to the tail vein of female Uistar rats (n = 3) weighing 180-200 g. 15 minutes after administration of rPH.2 or buffer alone, the animals were injected as described by Furukau, et al. (J. Pediatr. Res. 34 * 237-241 (1993)), into the abdominal aorta at the level of the superorous mesenteric artery, either BSA alone (0.25 X) - saline (Groups 1 and 2) or PAF (0.2 µg) (100 mg) suspended in saline containing BSA (groups 3 and 4). The small intestine was removed from the caecum after two hours by severing the Trietz ligament, thoroughly rinsed with cold saline, and evaluated. For microscopic observation, upper, middle and lower small intestine samples were obtained. The tissues were fixed in buffered formalin and samples prepared for microscopic evaluation by hematoxiline and eosin staining. The experiment was repeated three times.
Pri zbežnej prehliadke čriev bol zistený normálny nález v skupinách ošetrených BSA vo fyziologickom roztoku. Podobne tiež injikovaný rPH.2 v neprítomnosti PAF nemal žiadny efekt na nález v črevách Cgross findings). Naopak, injekcia PAF do descendujúcej aorty mala za následok rýchle a ťažké diskolorácle a hemoragiu serúzneho povrchu čriev. Podobná hemoragia bola zaznamenaná, ak boli segmenty tenkého čreva sledované na strane sliznice a tenké črevo bolo úplne nekrotické. Ak bol rPH.2 injikovaný do chvostovej žily 15 min pred podaním PAF do aorty, bol nález na črevách normálny.A cursory examination of the intestines revealed normal findings in BSA-treated saline groups. Similarly, injected rPH.2 in the absence of PAF had no effect on the findings in the intestines (Cgross findings). In contrast, injection of PAF into the descending aorta resulted in rapid and severe discolouration and haemorrhage of the serous intestinal surface. A similar haemorrhage was observed when the small intestine segments were observed on the mucosal side and the small intestine was completely necrotic. When rPH.2 was injected into the tail vein 15 min before PAF was administered to the aorta, the findings were normal.
Pri mikroskopickom pozorovaní čriev v skupinách 1, 2 a 4 bola zistená normálna vilúzna architektúra a normálna populácia buniek v lamina proprla. Naopak v prípade skupiny ošetrenej samotným PAF boli zistené silné riek r úzy a hemoragie v celej sliznici. Aktivity PAF-AH v plazme boli stanovené v prípade rovnakých potkanov ako v predchádzajúcom experimente. Aktivita PAF-AH bola stanovená tak, ako je to popísané nižšie. Pred injekciou do chvostovej žily boli najprv odobrané vzorky krvi. Ďalej boli vzorky odobrané z vena cava bezprostredne pred injekciou PAF a v dobe usmrtenia. Krv bola zozbieraná v množstve asi 50 ul do heparinizovaných kapilárnych trubičiek. Plazma bola získaná centrifugáciou C980x g počas 5 minút). Enzým bol stanovený podľa Yasuda a Johnston. Endocrinology, 1301 708-716 C1992).The microscopic observation of the intestines in groups 1, 2 and 4 revealed a normal villus architecture and a normal population of cells in the lamina proprla. In contrast, in the group treated with PAF alone, strong mucosa rheumatism and haemorrhage were found throughout the mucosa. Plasma PAF-AH activities were determined in the same rats as in the previous experiment. PAF-AH activity was determined as described below. Blood samples were taken before injection into the tail vein. In addition, samples were taken from the vena cava immediately prior to PAF injection and at the time of sacrifice. Blood was collected at about 50 µl into heparinized capillary tubes. Plasma was obtained by centrifugation (C980xg for 5 minutes). The enzyme was determined by Yasuda and Johnston. Endocrinology, 1301 708-716 (C1992).
Aktivita PAF-AH v plazme bola v prípade všetkých potkanov pred injekciou 75 ± 2.5 jednotky Cl jednotka sa rovná 1 nmol x min-1 x ml-1 plazmy). Aktivity PAF-AH namerané v plazme boli po minútach po injekcii samotného pufra 75, 2 ± 2, 6 jednotky v skupine 1 a 76, 7 ± 3, 5 jednotiek v skupine 3. Po 15 minútach bola zistená aktivita PAF-AH v plazme zvierat. ktorým bolo injikovaných 25 000 jednotiek rPH.2, 2249 ± 341 jednotiek v skupine 2 a 2494 ± 623 jednotiek v skupine 4. Aktivita v skupinách 2 a 4 zostala zvýšená (1855 ± 257 jednotiek) až do doby usmrtenia (2 1/4 hodiny po injekcii rPH.2) (skupina 2 = 1771 ± 308; skupina 4 = 1939 ± 478). Z týchto výsledkov vyplýva, že aktivita PAF-Ah v plazme potkanov, ktorým bola injikovaná samotná prenosná látka (skupiny la 3). sa nemenila počas experimentu. V prípade zvierat, ktorým bol injikovaný PAF. sa vyvinul NEC, zatiaľ čo všetky potkany, ktorým bol podaný rPH.2 a potom injekcia PAF. boli úplne ochránené.Plasma PAF-AH activity in all rats before injection was 75 ± 2.5 units (unit 1 equals 1 nmol x min -1 x ml -1 plasma). PAF-AH activities measured in plasma were minutes after injection of buffer alone 75, 2 ± 2.6 units in Group 1 and 76.7 ± 3.5 units in Group 3. After 15 minutes, PAF-AH activity was detected in animal plasma . injected 25,000 rPH.2 units, 2249 ± 341 units in Group 2, and 2494 ± 623 units in Group 4. Activity in Groups 2 and 4 remained elevated (1855 ± 257 units) until sacrifice (2 1/4 hours). after injection (rPH.2) (group 2 = 1771 ± 308; group 4 = 1939 ± 478). These results indicate that PAF-Ah activity in the plasma of injected rats (Groups Ia and 3a). did not change during the experiment. For animals injected with PAF. developed NEC, while all rats given rPH.2 and then injected with PAF. were completely protected.
2. Závislosť prevencie NEC od dávkovania2. Dosage-dependent NEC prevention
Aby bolo možné zistiť u potkanov závislosť ochrannej aktivity proti NEC od dávkovania. boli zvieratá ošetrené zvyšujúcimi sa dávkami rPH.2 15 min pred podaním PAF. Dávky rPH.2 sa pohybovali v rozmedzí 25, 5 až 25. 500 jednotiek, ktoré boli. podané do chvostovej žily potkanov. Potom bol injikovaný PAF (0, Ί ug v 0.2 fyziologického roztoku s BSA) 15 min po podaní rPH.2 do abdominálnej aorty. 2 hodiny po podaní PAF bolo tenké črevo odstránené a bol hodnotený vznik NEC. Aktivita PAF-AH v plazme bola stanovená pred exogénnym podaním enzýmu a 15 minút a 2 1/4 hodiny po podaní rPH.2. Výsledky sú priemernou hodnotou z 2-5 zvierat v každej skupine. V prípade všetkých potkanov, ktoré dostávali menej ako 2 000 jednotiek enzýmu, sa rozvinul NEC. Aktivita PAF-AH v plazme zvierat, ktorým boli podávané najnižšie ochranné dávky enzýmu (2040 jednotiek), dosahovala po 15 minútach 363 jednotiek na ml plazmy, čo predstavovalo päťnásobné zvýšenie oproti východiskovej hodnote. Ak bol rPH.2 podaný v dávke nižšej ako 1 020 celkových jednotiek, bola priemerná aktivita enzýmu v plazme okolo 160 a nižšia a v prípade všetkých zvierat zistený vznik NEC.In order to determine the dose-dependency of NEC protective activity in rats. animals were treated with increasing doses of rPH.2 15 min before PAF administration. The rPH.2 doses ranged from 25, 5 to 25,500 units that were. administered into the tail vein of rats. PAF (0.1 µg in 0.2 saline with BSA) was then injected 15 min after rPH.2 administration into the abdominal aorta. 2 hours after PAF administration, the small intestine was removed and NEC was evaluated. Plasma PAF-AH activity was determined before exogenous enzyme administration and 15 minutes and 2 1/4 hours after rPH.2 administration. Results are the mean of 2-5 animals in each group. All rats that received less than 2,000 enzyme units developed an NEC. PAF-AH activity in the plasma of animals receiving the lowest protective doses of enzyme (2040 units) reached 363 units per ml of plasma after 15 minutes, a 5-fold increase from baseline. When rPH.2 was administered at a dose of less than 1020 total units, the mean plasma enzyme activity was about 160 and lower, and NECs were found in all animals.
3. Trvanie ochrany proti NEC3. Duration of protection against NEC
S cieľom stanovenia dĺžky exogénneho pôsobenia produktu PAF-AH potrebného na ochranu proti vzniku NEC, bolo potkanom do chvostovej žily jednorázovo injikované fixné množstvo enzýmu a následne aplikovaný PAF v rôznych časových intervaloch. rPH.2 (8 500 jednotiek v 0. 3 ml) alebo samotný roztok bez účinnej látky bol potkanom podaný od chvostovej žily a PAF (0,36 ng v 0. 2 ml BSA vo fyziologickom roztoku) injlkovaný do abdomlnálnej aorty v rôznych časových intervaloch po podaní enzýmu. Tenké črevá boli vybrané 2 hodiny po injekcii PAF a podrobené vyšetreniu a histologickému pozorovaniu vzniku NEC. Aktivita PAF-AH v plazme bola stanovená v rôznych intervaloch po podaní enzýmu a dve hodiny po aplikácii PAF. V každej skupine boli stanovené priemerné hodnoty enzymatickej aktivity ± štandardná odchýlka.In order to determine the length of the exogenous action of the PAF-AH product required to protect against NEC, rats were injected once with a fixed amount of enzyme and subsequently administered PAF at various time intervals. rPH.2 (8,500 units in 0.3 ml) or drug-free solution alone was administered to the rat from the tail vein and PAF (0.36 ng in 0.2 ml BSA in saline) injected into the abdominal aorta at various time intervals after administration of the enzyme. Small intestines were removed 2 hours after PAF injection and examined and histologically observed for NEC. Plasma PAF-AH activity was determined at various intervals after enzyme administration and two hours after PAF administration. Mean values of enzyme activity ± standard deviation were determined in each group.
Z výsledkov vyplýva, že u žiadneho potkana nedošlo k vzniku NEC počas prvých 8 hodin po injekcii rPH.2, zatiaľ čo v prípade 100 X zvierat, ktorým bol následne aplikovaný PAF 24 a 48 hodín po injekcii enzýmu, došlo k rozvoji NEC.The results showed that no rat developed NEC within the first 8 hours after rPH.2 injection, whereas 100 X animals that were subsequently treated with PAF 24 and 48 hours after enzyme injection developed NEC.
4. Zvrat NEC4. Reversal of NEC
Aby bolo možné stanoviť, či môže podávanie PAF-AH zvrátiť rozvoj NEC vyvolaný injekciou PAF, bolo zvieratám injikovaných 25 000 jednotiek enzýmu do vena cava dve minúty po podaril PAF (0, 4 ug). V prípade žiadneho zvieraťa sa NEC nevytvoril. Avšak ak bol rPH.2 podaný týmto spôsobom 15 minút po injekcii PAF, v prípade všetkých zvierat sa NEC vytvoril. čo zodpovedá rýchlemu priebehu počas rozvoja NEC Indukovanému podaním PAF, ako už bolo popísané predtým Furukavom et el. (pozri vyššie). Zo súhrnu týchto výsledkov vyplýva, že relatívne malé zvýšenie aktivity (päťnásobné) PAF-AH v plazme je schopné zabrániť vzniku NEC. Tieto pozorovania spolu s predchádzajúcimi správami o tom, že aktivita PAF-AH v plazme králičích plodov Cľlaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 728-732 (1988)] a neošetrených detíTo determine whether PAF-AH administration could reverse the development of NEC induced by PAF injection, 25,000 units of enzyme were injected into the vena cava two minutes after successful PAF (0.4 µg). NEC was not formed in any animal. However, when rPH.2 was administered in this manner 15 minutes after PAF injection, NEC was formed in all animals. which corresponds to the rapid course of development of NEC induced by PAF administration, as described previously by Furukav et al. (see above). Taken together, these results indicate that a relatively small increase (5-fold) in plasma PAF-AH activity is able to prevent NEC. These observations, together with previous reports that PAF-AH activity in rabbit fetal plasma Clakki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 728-732 (1988)] and untreated children
CCaplan et al.. J. Pediatr. 116: 908-964 (1990)] bola relatívne nízka, svedčí o tom, že profylaktické podanie prípravkov obsahujúcich ľudský rekombinantný PAF-AH produkt deťom s nízkou pflrodriou váhou môže byť použité pri ošetrení NEC.CCaplan et al., J. Pediatr. 116: 908-964 (1990)] was relatively low, suggesting that the prophylactic administration of formulations containing the human recombinant PAF-AH product to children of low birth weight can be used in the treatment of NEC.
B. Aktivita v neonatálnom modeli NECB. Activity in neonatal NEC model
Účinnosť produktu PAF-AH. rPH.2. bola hodnotená v prípade NEC modelu pre novo narodené stresované potkany ďalej popísaným postupom a to podaním kŕmnej zmesi a asfyxiou. čo sú dva rizikové faktory pre vznik choroby u ľudí. V tomto modelovom systéme došlo v prípade 70-80 % zvierat do tretieho dňa života k zjavnému a mikroskopickému poškodeniu čreva podobne ako v prípade neonatálneho NEC. Potkaní novorodenci boli získaní z brezivých potkanov Sprague-Dauley CHarlari Sprague-Dauley. Indianapolis. IN), pri anestézii C02 a porodené abdominálnou lncíziou. Novorodené zvieratá bola zhromaždené. osušené a celú dobu experimentu umiestené v irikubátori pre novorodencov.Efficacy of PAF-AH. rPH.2. was evaluated in the NEC model for newly born stressed rats by the following procedure by administration of compound feed and asphyxia. which are two risk factors for human disease. In this model system, 70-80% of the animals had evident and microscopic bowel damage by day 3 of life, similar to neonatal NEC. Rat neonates were obtained from breeding Sprague-Dauley breeding CHarlari Sprague-Dauley rats. Indianapolis. IN), under CO 2 anesthesia and born with abdominal infections. Newborn animals were collected. dried and placed in the newborn infant incubator throughout the experiment.
Najprv boli v jednotlivých skupinách stanovené dávkovanie a absorpčné charakteristiky rPH.2. Normálnym novorodeným potkaním mláďatám bola v čase 0. podaná enterálne alebo Intraperitoneálne jedna z troch dávok rPH.2 C31ambda, lSlambda alebo 751ambda) a potom bola odobraná krv pre stanovenie aktivity PAF-AH v plazme po lh. 6h a 24h. Aktivita PAF-AH bola meraná metódou inkubácie so substrátom CCray et al.. Náture, 374« 549 ¢1995)] a ELISA použitím anti-ľudských rPAF-AH monoklonálnych protilátok pre každú vzorku C90F2D a 90G11D, ako je to popísané v Príklade 13). Imunohistologický rozbor bol uskutočnený Štandardnými technikami pomocou protilátok l«100 a inkubovaných cez noc.First, the dosage and absorption characteristics of rPH.2 were determined in each group. Normal neonatal rats were administered enteral or intraperitoneally at one time with three doses of rPH.2 (31 µgda, 1Slambda, or 75 µgda) and blood was then collected for determination of PAF-AH activity in plasma after 1 h. 6h and 24h. PAF-AH activity was measured by incubation with substrate CCray et al. Nature, 374 (549 «1995)] and ELISA using anti-human rPAF-AH monoclonal antibodies for each sample (C90F2D and 90G11D, as described in Example 13). . Immunohistological assays were performed using standard techniques using antibodies 1-100 and incubated overnight.
V prípade normálne narodených mláďat potkanov nebola po aplikácii rPH.2 do čriev zistená zvýšená aktivita PAF-AH v plazme žiadnu dobu experimentu, ako pomocou metódy inkubácie so substrátom, tak aj metódy ELISA. Pri intraperitoneálnej aplikácii rPH.2 bola do jednej hodiny po aplikácii merateľná cirkulujúca aktivita PAF-AH obidvoma metódami a táto aktivita vrcholila 6h po podaní látky. Vyššie dávky rPH.2 Cod 3 do 751ambda, 10 až 250 U) vyvolali vyššiu aktivitu PAF-AH v plazme. Po enterálnom podaní bola pri imunohistochemíckej analýze zistená prítomnosť rPAF-AH produktu v epitelových bunkách Črevnej sliznice. Aktivita bola sústredená prevažne v črevných viloch s minimálnu prítomnosťou farbiva v kryptických bunkách. Intenzívnejšie bolo ofarbené ileum ako jejunum a určité množstvo rPAF—AH produktu bolo imunochemicky detegované v častiach tračníka. Žiadne pozorovateľné farbenie nebolo zistené v prípade kontrolných vzoriek a vzoriek získaných zo zvierat, ktorým bola látka podaná intraperitoneálrie. Enterálria aplikácia produktu rPAF-AH mala teda za následok lokálnu akumuláciu v epiteli sliznice. zatiaľ podanie produktu rPAF-AH zvýšilo hladinu ale nie jeho lokálnu akumuláciu v sliznici.In normal-born rat pups, no increase in plasma PAF-AH activity was observed after either rPH.2 intestinal administration with either substrate incubation method or ELISA. For intraperitoneal administration of rPH.2, circulating PAF-AH activity was measurable within one hour after dosing by both methods and peaked 6h after dosing. Higher doses of rPH.2 (Cod 3 to 75 µm, 10 to 250 U) elicited higher PAF-AH activity in plasma. Following enteral administration, immunohistochemical analysis revealed the presence of rPAF-AH product in intestinal mucosal epithelial cells. Activity was concentrated mainly in intestinal villas with minimal dye presence in cryptic cells. The ileum was stained more intensively than the jejunum, and some rPAF-AH product was detected immunochemically in the colon sections. No observable staining was found for the control samples and the samples obtained from animals treated with intraperitoneally. Thus, enteral administration of rPAF-AH resulted in local accumulation in the mucosal epithelium. meanwhile, administration of rPAF-AH increased levels but not local accumulation in the mucosa.
čo intraperitoneálne cirkulujúceho enzýmu,what intraperitoneally circulating enzyme,
V prípade NEC modelu bol u novorodených potkanov indukovaný NEC podľa Caplan et al.. Pediatr. Pathol.. 14: 1017-1028 (1994). Pri tomto postupe boli zvieratá každé tri hodiny kŕmené trubičkou rozpustnou kŕmnou zmesou pre mláďatá (Esbiliac, Borden Inc.).In the NEC model, NEC according to Caplan et al. Was induced in neonatal rats. Pathol. 14: 1017-1028 (1994). In this procedure, the animals were fed every three hours with a tube of a soluble infant feed mix (Esbiliac, Borden Inc.).
kŕmna dávka 0,1 ml/kŕinenie bola neskôr podľa zvýšená na 0,4 ml/kŕmeriie až do štvrtého dňa. V zvierat bola dvakrát denne vyvolaná asfyxia % dusíka počas 50 sekúnd v uzatvorenejthe feed dose of 0.1 ml / feed was later increased to 0.4 ml / feed until day four. In animals, asphyxia% nitrogen was induced twice a day for 50 seconds at sealed
Začiatočná tolerancie prípade všetkých vdychovaním 100 plastikovej komore a zvieratá potom boli vystavené chladu (4 °C) počas 10 min. Funkcia čriev a močového mechúra bola stimulovaná jemnou manipuláciou po každom kŕmení. Zvieratá boli vyživované počas 96 hodín alebo dokiaľ nevykazovali znaky úzkosti. Chorobné zvieratá inall abdominálnu dlstenzlu. krvavú stolicu, dýchacie ťažkosti, cyanózu, letariu a boli usmrtené dekapltáciou. Po usmrtení boli črevá všetkých potkanov hodnotené na prítomnosť nekrúz a fixované vo formaline pre neskoršiu histologickú analýzu. Vzorky boli uchytené v parafíne, narezané mikrotómom. ofarbené hematoxylínom a eozinom a hodnotené dvoma nezávislými pozorovateľmi. Poškodenie čriev bolo označené ako 1+ pri odchlipnutých alebo oddelených epitelových bunkách, 2+ pri odlupujúcich sa epitelových bunkách do strednej vilúznej vrstvy, 3+ pre nekrózu celého vilusu a 4+ pre transmurálnu nekrózu.Initial tolerance of the case all by inhalation of the 100 plastic chamber and the animals were then exposed to cold (4 ° C) for 10 min. Intestinal and bladder function was stimulated by gentle manipulation after each feeding. The animals were fed for 96 hours or until they showed signs of anxiety. Diseased animals inall abdominal dlstenzlu. bloody stools, breathing difficulties, cyanosis, letharia and were killed by decapitation. After sacrifice, the intestines of all rats were evaluated for the presence of necrosis and fixed in formalin for later histological analysis. The samples were embedded in paraffin, cut with a microtome. stained with hematoxylin and eosin and evaluated by two independent observers. Intestinal damage was designated as 1+ for detached or detached epithelial cells, 2+ for peeling epithelial cells into the middle villus layer, 3+ for whole villain necrosis and 4+ for transmural necrosis.
S cieľom stanovenia účinnosti rPH.2 bola trom skupinám potkanov podaná látka enterálrie, intraperitoneálne alebo obidvoma spôsobmi. Preparát rPH.2 obsahoval 0, 8 mg/ml proteínu a približne 4000 jednotiek/mg PAF-AH s pomerom endotoxin/protein <0,5 EU/mg. Pri enterálnom použití rPH.2 bolo zvieratám podaných 251ambda C80U) látky zriedenej v kŕmnej dávke orogastrickou trubicou (každé tri hodiny). Pri intraperitoneálnom použití bolo zvieratám podaných 751ambda intraperitoneálnou injekciou dvakrát denne. Kontrolným zvieratám bol aplikovaný (20mM NaPCU. pH 7,4) bez rPH.2 a každou experimentálnou skupinou. Mortalita a príznaky NEC v každej skupine ošetrenia a rozdiely boli analyzované pomocou Físcherovho exaktného testu. Za významné boli považované hodnoty pri p <0.05. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9.To determine the efficacy of rPH.2, three groups of rats were administered enteral, intraperitoneally, or both. RPH.2 contained 0.8 mg / ml protein and about 4000 units / mg PAF-AH with an endotoxin / protein ratio <0.5 EU / mg. For enteral use of rPH.2, animals were given 251 µg (C80U) of the compound diluted in the ration by the orogastric tube (every three hours). For intraperitoneal use, animals were injected 75 µg by intraperitoneal injection twice daily. Control animals (20 mM NaPCU, pH 7.4) were administered without rPH.2 and each experimental group. Mortality and symptoms of NEC in each treatment group and differences were analyzed by Fischer's exact test. Values at p <0.05 were considered significant. The results are shown in Table 9.
zodpovedajúci objem pufra boli sledované súčasne sthe corresponding buffer volume was monitored simultaneously with
Tabuľka 9Table 9
U enterálne po 3h)U enteral after 3h)
Údaje reprezentujú súhrnné výsledky štyroch nezávislých experimentov pri i. p, aplikácii, štyroch experimentov pri enterálnom podaní a troch experimentov pri i.p. + enterálnom podaní.The data represent the cumulative results of four independent experiments at i. p, administration, four enteral administration experiments and three i.p. + enteral administration.
Enterálria aplikácia rPH.2 v porovnaní s kontrolou významne znižovala ako výskyt NEC, tak aj úhyn zvierat. Výsledky štyroch rôznych experimentov ukázali, že predchádzajúce ošetrenie zvierat rPH.2 znížilo NEC z 19/26 (kontrola) na 6/26 (p<0,001).Enteral administration of rPH.2 significantly reduced both NEC and animal mortality compared to controls. The results of four different experiments showed that pretreatment of rPH.2 animals reduced NEC from 19/26 (control) to 6/26 (p <0.001).
Iritestinálne poškodenie ošetrených a kontrolných zvierat bolo rôzne, ale vo väčšine prípadov šlo o midvillous nekrózy v prípade niekoľkých segmentov, úplné nekrózy vilusu v iných častiach, prípadne tie isté miesta s transmutálriymi nekrózaml, zvyšné časti mali normálny histologický nález. Najťažší stupeň NEC v prípade ošetrených aj kontrolných zvierat s intestinálnym poškodením bol podobný (stredná hodnota 2, 8 v prípade kontrôl a 2, 4 v prípade dopredu ošetrených rPH.2. p>0, 05).Iritestinal damage to treated and control animals was varied, but in most cases it was midvillous necrosis in several segments, complete villus necrosis in other parts, or the same sites with transmutral necrosis, the remaining parts had normal histological findings. The highest NEC grade for both treated and control animals with intestinal impairment was similar (median 2, 8 for controls and 2, 4 for pre-treated rPH.2. P> 0.05).
Intraperitoneálne podanie rPH.2 nemalo, v tomto modelovom systéme, na tvorbu NEC a úhyn zvierat významný vplyv. Nástup symptómov v tejto skupine a kontroly bol podobný (40 ± 5 hodín v prípade kontroly. 36 ±7 hodín v skupine potkanov ošetrených rPH.2) a stupeň NEC bol v obidvoch skupinách tiež podobný (stredná hodnota 2, 6 v prípade kontroly a 2, 5 v skupine potkanov ošetrených rPH.2).Intraperitoneal administration of rPH.2 had no significant effect on NEC production and animal mortality in this model system. The onset of symptoms in this group and the control was similar (40 ± 5 hours for the control. 36 ± 7 hours in the rPH.2-treated group) and the degree of NEC was also similar in both groups (mean 2, 6 in the control and 2 groups). 5 in the group of rats treated with rPH.2).
Boli uskutočnené ďalšie experimenty, pri ktorých bol potkanom podaný rPH.2 ako enterálne, tak aj intraperitoneálne a to v rovnakých dávkach ako pri aplikácii jedným z týchto spôsobov (251ambda rPH.2 pri každom kŕmení po troch hodinách a 751ambda intraperitoneálnou injekciou dvakrát denne). Výsledky ukazuje tabuľka 9. Napriek tomu, že nebol medzi ošetrenou a kontrolnou skupinou zistený významný rozdiel v počte uhynutých zvierat, ošetrenie rPH.2 významne znižovalo výskyt NEC (10/17 v prípade kontroly a 3/14 v prípade potkanov ošetrených rPH.2, p = 0,04). V prípade šiestich zo siedmich uhynutých zvierat zo skupiny ošetrenej rPH.2 bol zistený pozitívny nález E. coli v krvi tesne pred smrťou.Additional experiments were performed in which rats were administered rPH.2 both enterally and intraperitoneally at the same dosages as when administered by either route (251 µgda rPH.2 at each 3 hour feed and 75 µg intraperitoneal injection twice daily). The results are shown in Table 9. Although there was no significant difference in the number of animals killed between treatment and control, treatment with rPH.2 significantly reduced the incidence of NEC (10/17 for control and 3/14 for rPH.2-treated rats, p = 0.04). Six out of seven dead animals from the rPH.2-treated group were found to have a positive E. coli blood count just prior to death.
Tieto výsledky potvrdzujú úlohu PAF-AH produktov v neonatálnom modeli NEC, ktorý nie je indukovaný PAF. Enterálne ošetrenie rPAF-AH produktom bránilo vzniku NEC, zatiaľ čo intraperitoneálne ošetrenie v týchto dávkach nemalo žiadny zrejmý účinok. Tieto výsledky svedčia o tom. že PAF-AH produkt doplnený do zmesi pre umelú výživu novorodencov ohrozených vznikom NEC by mohol znížiť výskyt tejto choroby.These results confirm the role of PAF-AH products in the neonatal model of NEC that is not induced by PAF. Enteral treatment of the rPAF-AH product prevented NEC, while intraperitoneal treatment at these doses had no apparent effect. These results suggest. that a PAF-AH product added to an infant formula for newborns at risk of developing NEC could reduce the incidence of this disease.
Príklad 18Example 18
Účinnosť PAF-AH produktu pri syndróme akútnej respiračnej nedostatočnosti (ARDS - acute respiratoty distress syndróme) bola sledovaná u morčiat.The efficacy of PAF-AH product in acute respiratory distress syndrome (ARDS) was studied in guinea pigs.
Intravenózne irijikovaný PAF vyvolal u morčiat ťažký zápal pľúc pripomínajúci začiatočný ARDS u ľudí. Počas niekoľkých minút po intravenóznej aplikácii PAF bol parenchým pľúc zaplnený zúženými bronchami a bronchiolami (Lellouch-Tubiana et al., pozri vyššie). Krvné doštičky a polymorfonukleárne neutrofily začali marginalizovať a bunkové agregáty boli ľahko detegovateľné pozdĺž pľúcnych arteriol ĽLellouch-Tubiana Br. J. Exp Path., 66: 345-355 (1985)3. Infúzie PAF tiež poškodzovali bronchiálne epitelové bunky, ktoré sa odlučovali zo stien a akumulovali v dýchacícl·· cestách. Takéto poškodenie epltelových buniek v dýchacích dráhach je v zhode s tvorbou hyalínových membrán, ku ktorému dochádza u ľudí počas ARDS. ľlarginalizácia neutrofilov a doštičiek je rýchlo nasledovaná diapedézou týchto buniek do alveolárnych sept a alveolárnych priestorov pľúc. Bunkové infiltráty vyvolané PAF sú sprevádzané významným vaskulárnym presakovaním a vznikom edému v dýchacích cestách EKirsch. Exp. Lung Res., 18: 447-459 (1992)3. Vznik edému bol tiež potvrdený pri in vitro štúdiách, kedy PAF indukoval extravazáciu fibrinogériu značeného iasI u závislosti od podanej dávky (10-1000 ng/ml) v prípade premytých pľúc morčiat EBasran, Br. J. Pharmacol.. 77: 437 (1982)3.Intravenously irrigated PAF induced severe lung inflammation in guinea pigs resembling initial ARDS in humans. Within minutes after intravenous administration of PAF, the lung parenchyma was filled with constricted bronchi and bronchioles (Lellouch-Tubiana et al., Supra). Platelets and polymorphonuclear neutrophils began to marginalize and cell aggregates were readily detectable along the pulmonary arterioles of Lellouch-Tubiana Br. J. Exp. Path., 66: 345-355 (1985) 3. PAF infusions also damaged bronchial epithelial cells, which separated from the walls and accumulated in the airways. Such damage to the epithelial cells in the airway is consistent with the formation of hyaline membranes that occur in humans during ARDS. The ilginalization of neutrophils and platelets is rapidly followed by diapedesis of these cells into the alveolar septum and alveolar lung space. PAF-induced cellular infiltrates are accompanied by significant vascular leakage and the development of EKirsch airway edema. Exp. Lung Res., 18: 447-459 (1992). The edema was also confirmed by in vitro studies where PAF induced extravasation fibrinogériu IAS labeled I in a dose-dependent (10-1000 ng / ml) for the washed guinea pig lung EBasran, Br. J. Pharmacol. 77: 437 (1982) 3.
Na základe vyššie uvedených pozorovaní bol vytvorený ARDS model u morčiat. Kanyla je pod anestéziou umiestená do krčnej žily morčiat Hartly samčieho pohlavia (približne 300-400 g) a PAF zriedený v transportnej látke, ktorou bolo 500 ug PBS s 0.25 % hovädzieho sérumalbumínu (PBS-BSA), aplikovaný infúziou počas 15 minút v celkovej dávke 100-400 ng/kg. V rOznych intervaloch po infúzii PAF boli zvieratá usmrtené a bolo im odobrané pľúcne tkanivo. V prípade morčiat, ktorým bo infúziou podaný PAF, bolo už počas 15 minút jasne zrejmé časovo závislé poškodenie pľúc a zápal, ktorý trval až 60 minút. V alveolárnych priestoroch morčiat, ktorým bol podaný PAF, sú prítomné neutrofily a červené krvinky, zatiaľ čo v prípade kontrolných zvierat ich prítomnosť nebola zistená. Bolo tiež dokázané poškodenie epitelových buniek pripomínajúce tvorbu hyalínových membrán u ľudských pacientov s ARDS. Vo vzorkách bronchoalveolárnej laváže (BAL) odobraných z morčiat, ktorým bol infúzne podaný PAF, bola zistená silná akumulácia proteínov v zapálených pľúcach a dokázané vaskulárne presakovanie.Based on the above observations, an ARDS model was developed in guinea pigs. The cannula is placed under anesthesia in the cervical vein of male Hartly guinea pigs (approximately 300-400 g) and PAF diluted in a 500 µg PBS with 0.25% bovine serum albumin (PBS-BSA) infused over 15 minutes in a total dose 100-400 ng / kg. At various intervals after PAF infusion, the animals were sacrificed and lung tissue was removed. In the case of guinea pigs infused with PAF, time-dependent lung damage and inflammation, which lasted up to 60 minutes, were clearly evident within 15 minutes. Neutrophils and red blood cells are present in the guinea pig alveolar compartments given PAF, whereas their presence was not detected in control animals. Epithelial cell damage resembling hyaline membrane formation in human ARDS patients has also been demonstrated. In bronchoalveolar lavage (BAL) samples taken from guinea pigs that were infused with PAF, a strong accumulation of proteins in the inflamed lungs and vascular leakage was detected.
V tomto modelovom systéme ARDS u morčiat bolo zistené, že rPH.2 úplne zabránil poškodeniu pľúc vyvolanému PAF. Skupiny morčiat boli dopredu ošetrené buď rPH.2 (2000 jednotiek v 500 ul) alebo len samotným PAF-AH pufrom (500 ul). Po 15 minútach bol morčatám podaný infúzne PAF (400 ng/kg v 500 ul) a aplikovaná počas 15 minút. Kontrolnej skupine morčiat bolo infúzne podaných 500 ul PBS-BSA. Po ukončení infúzie PAF boli zvieratá usmrtené a odobraná im BAL tekutina lavážou pľúc X s 10 ml fyziologického roztoku obsahujúceho 2 u/ml heparíriu, aby sa predišlo zrážaniu. S cieľom stanovenia obsahu proteínov v BAL boli vzorky zriedené l«10 fyziologických roztokom a bola stanovená OD 280. V BAL tekutine morčiat, ktorým bol aplikovaný samotný pufer, bola zistená koncentrácia proteínov 2,10 ± 1.3 mg/ml. Oproti tomu BAL tekutina zo zvierat, ktorým bol infúzne podaný PAF, obsahovalaIn this guinea pig model of ARDS, rPH.2 was found to completely prevent PAF-induced lung damage. Groups of guinea pigs were pretreated with either rPH.2 (2000 units in 500 µl) or only PAF-AH buffer alone (500 µl). After 15 minutes, guinea pigs were infused with PAF (400 ng / kg in 500 µl) and administered for 15 minutes. The guinea pig control group was infused with 500 µl PBS-BSA. After completion of the PAF infusion, animals were sacrificed and BAL fluid was collected by lavage lung X with 10 ml saline containing 2 µ / ml heparin to prevent clotting. In order to determine the protein content of the BAL, samples were diluted 1 - 10 with saline and OD 280 was determined. A protein concentration of 2.10 ± 1.3 mg / ml was found in the BAL of guinea pigs treated with buffer alone. In contrast, BAL fluid from animals infused with PAF contained
12,55 ± 1,65 mg/ml proteínov. V prípade morčiat dopredu ošetrených rPH.2 bol v BAL tekutine zistený obsah proteínov 1,13 ± 0,25 mg/ml, čo je porovnateľné s kontrolou a dokazuje to, že PAF-AH produkt úplne bráni vzniku pľúcneho edému indukovaného PAF.12.55 ± 1.65 mg / ml proteins. In guinea pigs pre-treated with rPH.2, a protein content of 1.13 ± 0.25 mg / ml was found in the BAL fluid, which is comparable to the control and demonstrates that the PAF-AH product completely prevents PAF-induced pulmonary edema.
Príklad 19Example 19
Účinnosť produktu PAF-AH, rPH.2, bola hodnotená pre dva modelové systémy akútnej pankreatitídy.The efficacy of PAF-AH, rPH.2, was evaluated for two model systems of acute pancreatitis.
A. Aktivita v prípade modelu pankreatitídy u potkanovA. Activity in the rat pancreatitis model
Samci potkana Uistar ¢200-250 g) boli zakúpené od Charles River Laboratories < Ullmlngton, ľlA) . Potkany boli chované v miestností s riadenou klímou 23 ±2 °C, 12 hodinovým cyklom svetlo/tma a kŕmené štandardným laboratórnym krmivom a vodou ad libitum. Zvieratá boli náhodne rozdelené do kontrolnej a experimentálnej skupiny. Potkany boli anestetlzované 50 mg/kg pentobarbltalom sodným aplikovaným lntraperltoneálne a potom im bol zavedený polyvinylový katéter (veľkosť V3, Biolab Products. Lake Havasu. AZ) do krčnej žily. Katéter bol tiahnutý subkutánne a ústil v dorzálnej cervikálriej oblasti. Zvieratá bolí ponechané, aby sa prebrali s anestézie. Potkany mali voľný prístup k vode, ale boli cez noc ponechané bez potravy. Experimenty boli uskutočnené nasledujúci deň na zvieratách, ktoré boli uč pri vedomí. Do začatia experimentu bol katéter plnený konštantnou infúziou fyziologického roztoku (0.2 ml/h). Ten deň. kedy sa uskutočnil experiment, bol zvieratám intravenózne injikovariý rPH.2 alebo samotná prenosná kontrolná látka a následne podaná infúzia buď (1) 5 ug/kg caeruleínu po hodine počas 3.5 hodiny, alebo (2) 10 ug/kg caeruleínu po hodine počas 5 hodín, (Research Plus, Bayonne, NJ). Hneď po ukončení infúzie boli zvieratá anestetlzované pentobarbltalom sodný. boli im otvorené brušné dutiny a bolo im odsatých 5 ml krvi z vnútornej veny cavy pre ďalšie stanovenie. Zvieratá boli potom usmrtené vykrvácaním. Boli merané sérum amyláza sérum lipáza a sérum bilirubin a odobraný pankreas. Časti pankreasu boli buď fixované v 42 roztoku fosfátového formaldehydového purfa pre histologické aktivity alebo ihneď zmrazené na -80 °C pre merania myeloperoxldázovej aktivity. Ďalšie časti pankreasu boli použité na stanovenie obsahu vody v pankrease, pankreasovej amylázy a trypsínu, ako je popísané nižšie. Myeloperoxidasová aktivita, ktorá ukazuje mieru zafarbenia neutrofilov bola stanovená v pankrease a pľúcach, ako je ďalej opísané. Dáta bolí štatisticky hodnotené pomocou nepárového Študentovho t-testu. priemer + S. E. 1*1. prinajmenšomMale Uistar rats (200-250 g) were purchased from Charles River Laboratories (Ullmlngton, 11A). The rats were housed in a controlled climate room of 23 ± 2 ° C, a 12 hour light / dark cycle, and fed standard laboratory feed and water ad libitum. Animals were randomized into control and experimental groups. The rats were anesthetized with 50 mg / kg sodium pentobarbltal administered intraperitoneally and then a polyvinyl catheter (V3 size, Biolab Products. Lake Havasu, AZ) was inserted into the jugular vein. The catheter was pulled subcutaneously and opened in the dorsal cervical region. The animals were allowed to wake up with anesthesia. The rats had free access to water but were left without food overnight. The experiments were carried out the following day on conscious animals. Until the beginning of the experiment, the catheter was filled with a constant infusion of saline (0.2 ml / h). That day. when the experiment was performed, the animals were injected intravenously with rPH.2 or the portable control alone and subsequently infused either (1) 5 µg / kg caerulein for an hour over 3.5 hours, or (2) 10 µg / kg caerulein for an hour over 5 hours , (Research Plus, Bayonne, N.J.). Immediately after the end of the infusion, the animals were anesthetized with sodium pentobarbltal. the abdominal cavities were opened, and 5 ml of blood was aspirated from the inner vein of the cava for further determination. The animals were then sacrificed by bleeding. Serum amylase serum lipase and serum bilirubin and pancreas collected were measured. Portions of the pancreas were either fixed in 42 phosphate formaldehyde buffer solution for histological activities or immediately frozen at -80 ° C to measure myeloperoxidase activity. Other portions of the pancreas were used to determine the water content of the pancreas, pancreas amylase and trypsin, as described below. Myeloperoxidase activity, which shows the degree of neutrophil staining, was determined in the pancreas and lungs as described below. Data were statistically evaluated using an unpaired Student's t-test. mean + S.E. 1 * 1. least
Uvedené hodnoty predstavujú troch rôznych experimentov. Za významné sú považované výsledky pri p < 0. 05.The values shown represent three different experiments. Results at p <0.05 are considered significant.
1. Obsah vody v pankrease1. Water content in the pancreas
Segmenty pankreasu boli osušené a zvážené (Čerstvá váha) a potom sušené 34 hodín pri 120 °C a opäť zvážené (suchá váha) . Voda pankreasu bola vypoCitaná ako rozdiel medzi Čerstvou a suchou váhou a vyjadrená ako percento Čerstvej váhy. Zvýšený obsah vody v pankrease indikoval vznik edému.The pancreas segments were dried and weighed (fresh weight) and then dried for 34 hours at 120 ° C and reweighed (dry weight). Pancreas water was calculated as the difference between Fresh and Dry weight and expressed as a percentage of Fresh Weight. Increased water content in the pancreas indicated edema.
2. Sérum a pankreatická amyláza2. Serum and pancreatic amylase
Aktivita amylázy v séru bola meraná pomocou substrátuSerum amylase activity was measured by substrate
4,6-ethylin (G7)-p-nitrofenyl (Gi)-oŕiD-maltoplastid (ET-G^PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, ľlO) podľa Pierre et al.. Clin. Chem., 22>1219 (1976). Aktivita amylázy v tkanivách pankreasu bola meraná rovnakou metódou po homogenizácií tkanív v 10 mľl fosfátového pufru, pH 7.4.4,6-ethylidene (G 7) -p-nitrophenyl (G) -oŕiD-maltoplastid (ET-G ^ PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, LLO) by Pierre et al .. Clin. Chem., 22, 1219 (1976). Amylase activity in pancreatic tissues was measured by the same method after tissue homogenization in 10 ml of phosphate buffer, pH 7.4.
3. Pankreatický trypsín3. Pancreatic trypsin
Aktivita trypsinu bola meraná fluorímetricky pomocou substrátu Boc-Gin-Ala-Arg-ľlCA. V kyvete bolo zmiešané 200 ul vzorku a 2, 7ml 50mľl Tris purfa (pH 8,0) obsahujúceho 150 mľl NaCl, 1 mľl CaCl2 a 0.1 * hovädzie sérum albumín. K vzorku bolo pridané 100 ul substrátu a po 20 sekundách preinkubácle bola zahájená reakcia. Fluorescencia bola meraná pri excitácii 380 nm a emisii 440 nm a vyjadrená smernicou priamky. Aby bolo možné vyhodnotiť spoloCne rňzne experimenty, bola aktivita trypsinu vo frakciách vyjadrená ako percento celkovej aktivity trypsinu.Trypsin activity was measured fluorimetrically using the substrate Boc-Gln-Ala-Arg-11CA. In a cuvette, 200 µl of sample and 2.7 ml of 50 ml Tris Purge (pH 8.0) containing 150 ml of NaCl, 1 ml of CaCl 2 and 0.1 * bovine serum albumin were mixed. 100 µl of substrate was added to the sample and after 20 seconds preincubation the reaction was initiated. Fluorescence was measured at 380 nm excitation and 440 nm emission and expressed by the slope of the line. In order to evaluate the various experiments together, trypsin activity in fractions was expressed as a percentage of total trypsin activity.
4. Histológa a morfometria4. Histology and morphometry
Pre svetelnú inikroskopiu boli náhodne vybrané rezy z prednej, strednej a zadnej Časti pankreasu a fixované v 10 * neutrálnom fosfátovom formalínovom pufri. V parafíne uchytené segmenty s veľkosťou 5 um bolí ofarbené hematoxylínom-eozínom (H & E) a hodnotené skúšaným morfológom. Poškodenie alebo nekrózy aclnárnych buniek boli stanovené buď ako (a) prítomnosť neostrostl v prípade aclnárnych buniek alebo (b) vakuolizácla a opuch acinárnych buniek a deštrukcia histo-architektúry celého acínu alebo len časti, obidva javy museli súvisieť so zápalovou reakciou. Množstvo poranených alebo riekrotických buniek a celková plocha tvorená acinárnymi bunkami bolo kvantifikované inorfometricky pomocou videa a počítačovej planimetríckej analýzy obrazu (model CCD-72. Dage-MTl, Michigan city, IN) vybaveným softvérom pre analýzu obrazu NIH-1200. Pre každú vzorku bolo hodnotených desať náhodne zvolených polí mikroskopu. Rozsah poškodených alebo nekrotlckých buniek bol stanovený ako percento celkovej plochy acinárnych buniek s oblasťami spĺňajúcimi kritériá pre poškodenie alebo nekrózu.For light microscopy, sections from the anterior, middle and posterior pancreas were randomly selected and fixed in 10% neutral phosphate formalin buffer. Paraffin-attached segments of 5 µm were stained with hematoxylin-eosin (H&E) and evaluated by the morphologist tested. Damage or necrosis of acellular cells was determined by either (a) the presence of no acres in the case of acellular cells or (b) the vacuolization and swelling of the acinar cells and destruction of the whole or only part of the histo-architecture, both events must be related to the inflammatory response. The number of wounded or rhecotic cells and the total area formed by the acinar cells was quantified inorfometrically using video and computerized planimetric image analysis (CCD-72 model. Dage-MT1, Michigan city, IN) equipped with NIH-1200 image analysis software. Ten randomly selected microscope fields were evaluated for each sample. The extent of damaged or necrotic cells was determined as a percentage of the total area of acinar cells with areas meeting the criteria for damage or necrosis.
5. Meranie myeloperoxidázovej aktivity (MPO) v pankrease a plúcach5. Measurement of myeloperoxidase activity (MPO) in pancreas and lungs
Zafarbenie neutrofilov v pankrease a pľúcach bolo stanovené na základe myeloperoxidázovej aktivity v tkanivách. Vzorky boli odobrané v dobe usmrtenia uložené pri -70 °C až do doby analýzy. Vzorky (50 mg) boli rozmrazené a homogenizované v 1 ml 20inM fosfátového puf r a (pH 7.4) a ceritrifugované (10.000 x g, 10 miri, 4 °C). Získaná peleta bola resuspendovaná v 50mM fosfátovom pufri (pH 6,0) obsahujúcom 0,52 hexadecyltrimetylamónlumbromid (Sigma, St. Louis, MO) a štyrikrát za sebou zmrazená a rozmrazená. Suspenzie boli potom rozrušené sonikáciou počas 40 sekúnd a centrifugované (101000 x g. 5 min, 4 °C). Reakčná zmes obsahujúca extrahovaný enzým, 1,6mM tetrametylbenzidín (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80mM fosfátový pufer (pH 5,4) a 0.3mM peroxid vodíka, bola inkubovaná pri 37 °C 110 sekúnd a meraná absorbancla pri 655 nm automatickým analyzátorom CobasBlo. Táto absorbancla potom bola prepočítaná podľa obsahu sušiny vo vzorke tkaniva.Neutrophil staining in the pancreas and lung was determined based on tissue myeloperoxidase activity. Samples were taken at the time of sacrifice stored at -70 ° C until analysis. Samples (50 mg) were thawed and homogenized in 1 ml of 20 µM phosphate buffer a (pH 7.4) and ceritrifuged (10,000 x g, 10 µL, 4 ° C). The obtained pellet was resuspended in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.52 hexadecyltrimethylammonium bromide (Sigma, St. Louis, MO) and frozen and thawed four times in succession. The suspensions were then disrupted by sonication for 40 seconds and centrifuged (101,000 x g. 5 min, 4 ° C). The reaction mixture containing the extracted enzyme, 1.6 mM tetramethylbenzidine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80 mM phosphate buffer (pH 5.4) and 0.3 mM hydrogen peroxide, was incubated at 37 ° C for 110 seconds and the absorbance measured at 655 nm with CobasBlo automatic analyzer. This absorbance was then recalculated according to the dry matter content of the tissue sample.
6. Meranie pulmonálnej vaskulárnej permeability6. Measurement of pulmonary vascular permeability
Upchanle spoločného blliopankreatlckého kanála má obvykle za následok ťažkú pankreatltídu súvisiacu s poškodením pľúc, ktoré je možné kvantifikovať podľa vaskulárnej permeability pľúc a histologickým hodnotením.Upchanle of the common blliopancreatic canal usually results in severe pancreatltis associated with lung damage, which can be quantified by vascular permeability of the lungs and histological evaluation.
hodiny pred fluoresceínhours before fluorescein
Zvieratám bolo dve aplikovaných 5 mg/kg CFITC-albumín. Sigma Chemical Co., St. mikrovaskulárna permeabílita bola presakovania FITC-albuminu z bronchoalveolárnych priestorov.Animals received two 5 mg / kg CFITC-albumin. Sigma Chemical Co. microvascular permeability was leakage of FITC-albumin from bronchoalveolar spaces.
usmrtením intravenózne lzotiokyanát albumínu Louis, 1*10) . Pulmonálna hodnotená na základe vaskulárnych kompartmentov do Stručný popis metódy* hneď po usmrtení bol pravý bronchus blokovaný svorkou a trachea otvorená. Potom boli pravé pľúca vybrané pomocou kanyly vložené do trachey. Tri laváže fyziologickým roztokom (60 ml na laváž) boli spojené a bola merané fluorescencia FITC v sére a laváži pri excitácii 494 nm a emisii 520 nm. Vypočítaný pomer fluorescencie laváže ku krvi potom vyjadroval mieru mikrovaskulárnej permeability pľúc. Pľúca boli tiež ofarbené pomocou H & E a histologický hodnotené.by sacrificing intravenous isothiocyanate albumin Louis, 1 * 10). Pulmonary Assessment Based on Vascular Compartments by Brief Description of the Method * Right after sacrifice, right bronchus was clamped and the trachea opened. Then the right lungs selected by cannula were inserted into the trachea. Three saline lavages (60 ml per lavage) were pooled and serum FITC fluorescence and lavage was measured at 494 nm excitation and 520 nm emission. The calculated ratio of lavage to blood fluorescence then expressed a measure of the lung microvascular permeability. The lungs were also stained with H&E and histologically evaluated.
7. Účinok padania Caeruleinu a rPH.27. Effect of Caerulein falling and rPH.2
Infúzia samotného caeruleinu 5 ug/kg/h počas 3,5 hodiny vyvolala u potkanov typickú miernu indukovanú pankreatitídu. charakterizovanú hyperamyláziou, pankreatickým edémom meraným podľa obsahu vody v pankrease a histologickými zmenami zahrnujúcimi výraznú vakuolizáciou a pankreatický edém. Infúzia fyziologického roztoku nevyvolávala u kontrolných zvierat žiadne z týchto biochemických ani histologických zmien. Intravenózne podanie rPH.2 v dávkach 5, 10 alebo 20 mg/kg 30 min pred začatím infúzie caeruleinu neovplyvnila významne závažnosť zmien pankreatického edému (obsah vody) a histologický nález indukovaný infúziou samotného caeruleinu. Podanie rPH.2 neovplyvnilo tiež caeruleínoin indukovanú aktlváclu pankreatického trypsinogénu alebo obsah amylázy.Infusion of caerulein alone at 5 µg / kg / h for 3.5 hours induced typical mild induced pancreatitis. characterized by hyperamylase, pancreatic edema measured by pancreatic water content, and histological changes including marked vacuolization and pancreatic edema. Saline infusion did not induce any of these biochemical or histological changes in control animals. Intravenous administration of rPH.2 at 5, 10, or 20 mg / kg 30 minutes prior to the start of caerulein infusion did not significantly affect the severity of changes in pancreatic edema (water content) and the histological finding induced by infusion of caerulein alone. Also, administration of rPH.2 did not affect caerulinoin-induced pancreatic trypsinogen activity or amylase content.
Infúzia vyšších dávok caeruleinu. 10 ug/kg/h počas 5 hodin, vyvolala u potkanov ťažšiu pankreatitídu a charakteristickým výrazným zvýšením amylázovej aktivity v sére, vznikom pankreatického edému, silným zvýšením pankreatickej aktivity ΙΊΡΟ a významným zvýšením aktivácie trypsinogénu a amylázovej aktivity pankreasu. Histológia pankreasu odhalila nielen edém pankreasu a vakuolizáclu alcinárnych buniek, ale tiež niekoľko nekrotických škvŕn a niekoľko infiltrovaných buniek.Infusion of higher doses of caerulein. 10 µg / kg / h for 5 hours, induced severe pancreatitis in rats and characterized by a marked increase in serum amylase activity, pancreatic edema development, a strong increase in pancreatic activity ΙΊΡΟ, and a significant increase in trypsinogen activation and pancreatic amylase activity. Histology of the pancreas revealed not only pancreatic edema and vacuolization of the alcanic cells, but also several necrotic spots and several infiltrated cells.
Ošetrenie rPH.2 v dávke 5 následok zníženie výskytu caeruleínom meraného podľaTreatment with rPH.2 at dose 5 resulted in a reduction in the incidence of caerulein measured according to
Podanie rPH.2 (5 alebo 10 mg/kg intravenózne) 30 min pred začiatkom infúzie caeruleínu (10 ug/kg/h) zlepšilo väčšinu pankreatických zmien, ktoré vyvolala samotná infúzia caeruleínu. Výsledky prezentuje Tabuľka 10. pozri ďalej. Ošetrenie rPH.2 v dávke 5 mg/kg malo za následok pokles aktivity sérumamylázy (z 1098±1412 na 6763+1256). Vyššie dávky 10 mg/kg rPH.2 už nevyvolali zlepšenie hyperamylázie.Administration of rPH.2 (5 or 10 mg / kg intravenously) 30 min before the start of caerulein infusion (10 µg / kg / h) improved most of the pancreatic changes induced by caerulein infusion alone. The results are presented in Table 10. see below. Treatment with rPH.2 at 5 mg / kg resulted in a decrease in serum amylase activity (from 1098 ± 1412 to 6763 + 1256). Higher doses of 10 mg / kg rPH.2 no longer induced an improvement in hyperamylasia.
alebo 10 mg/kg malo tiež za pankreatického edému indukovaného obsahu vody (90.61 ± 0, 27 pri samotnom caeruleínu a 88,21 ± □, 61 pre caeruleín s 5 mg/kg rPH.2). rPH.2 v dávke 5 mg/kg vyvolal silné zlepšenie pankreatickej aktivity NPO (2,92 + 0,32-krát pri samotnom caeruleíne a 1,19 + 0, 21 pri caeruleínu spolu s rPH.2, p < 0,05). Vyššie dávky rPH.2 nevyvolávali už ďalšie zlepšenie l*IPO aktivity. Dávka rPH.2 tiež nemenila významne rozsah aktlvácie trypsinogénu alebo obsah amylázy v pankrease. Po predbežnom ošetrení rPH.2 bolo pri histologickej analýze zistené zlepšenie v prípade mikroskopických nekróz pankreasu a infiltrácie.or 10 mg / kg also had a water content induced pancreatic edema (90.61 ± 0.27 for caerulein alone and 88.21 ± 0.61 for caerulein with 5 mg / kg rPH.2). rPH.2 at 5 mg / kg caused a strong improvement in pancreatic NPO activity (2.92 ± 0.32-fold for caerulein alone and 1.19 ± 0.21 for caerulein together with rPH.2, p <0.05) . Higher doses of rPH.2 did not elicit any further improvement in I * IPO activity. Also, the dose of rPH.2 did not significantly alter the extent of trypsinogen activation or amylase content in the pancreas. After rPH.2 pretreatment, histological analysis revealed an improvement in microscopic pancreatic necrosis and infiltration.
Poškodenie pľúc súvisiace s pankreatitídou bolo pozorované ako klinicky, tak aj v prípade niekoľkých modelov pankraetitídy. Infúzia caeruleínu v dávke 5 ug/kg/h počas 3,5 h, ktorá vyvoláva miernu formu pankreatitídy, nemala za následok významné zasiahnutie pľúc. Avšak infúzia caeruleínu v dávke 10 ug/kg/h počas 5 h, ktorá vyvolávala ťažšiu pankreatitidu, spôsobila poškodenie pľúc kvantifikovateľné zvýšenou vaskulárnou permeabllltou pľúc (0,31 ± 0.04 až 0,79 ± 0.09), aktivitou ľlPO v pľúcach (zodpovedajúcou zafarbeniu neutrofilov) a infiltráciou neutrofílov.Lung damage associated with pancreatitis has been observed both clinically and in several pancraetitis models. Infusion of caerulein at a dose of 5 µg / kg / h for 3.5 h, which induces a mild form of pancreatitis, did not result in significant lung involvement. However, infusion of caerulein at a dose of 10 µg / kg / h for 5 h, which induced more severe pancreatitis, caused lung damage quantitatively by increased vascular lung permeability (0.31 ± 0.04 to 0.79 ± 0.09), IL-10 activity in the lungs (corresponding to neutrophil staining) ) and neutrophil infiltration.
Podanie rPH.2 v dávke 5 mg/kg 30 min pred infúziou caeruleínu významne zlepšovala rast MPO aktivity v pľúcach, indukovaný infúziou samotného caeruleínu (3.55 ± 0.93 v prípade samotného caeruleínu a 1,51 ± 0,26 v prípade caeruleínu s rPH.2). Ošetrenie rPH.2 významne znížilo závažnosť mikroskopických zmien pozorovaných v pľúcnom tkanive po infúzii caeruleínu. Zvýšená vaskulárna permeablllta vyvolaná infúziou caeruleínu bola podaním rPH.2 znížená, ale rozdiel nebol štatisticky významný. Vyššia dávka rPH.2 (10 mg/kg) neznižovala viac poškodenie pľúc vyvolané caeruleínom než nižšie dávky.Administration of rPH.2 at 5 mg / kg 30 min before caerulein infusion significantly improved lung MPO activity induced by infusion of caerulein alone (3.55 ± 0.93 for caerulein alone and 1.51 ± 0.26 for caerulein with rPH.2 ). Treatment with rPH.2 significantly reduced the severity of microscopic changes observed in lung tissue after caerulein infusion. The increased vascular permeability caused by caerulein infusion was reduced by rPH.2, but the difference was not statistically significant. A higher dose of rPH.2 (10 mg / kg) did not reduce caerulein-induced lung damage more than the lower doses.
Tabulka 10Table 10
Tabuľka 10 - pokračovanieTable 10 - continued
B. Aktivita v pripade modelu pankreatitídy u vačiceB. Opossum pancreatitis model activity
Zdravé, náhodne odchytené americké vačice (.Didelphis i/irginiana) obidvoch pohlaví (2,0 kg až 4,0 kg) bolí získané zo Scott-Haas a chované v miestnostiach s riadenou atmosférou 23±2 °C, 12 hodinovým cyklom svetlo/tma a kŕmené štandardným laboratórnym krmivom a vodou ad líbitum. Po nočnom pôste boli zvieratá anestetizované 50 mg/kg fenobarbitalu sodného i.p. (Veterinary Laboratories Inc., Leriexa, KS). Cellotómia bola uskutočňovaná prostredníctvom stredovej incízie pri sterilných podmienkach a kanál spoločný pre žlč a pankreas bol podviazaný s cieľom vyvolania nekrotickej pankreatitídy. Navyše bol cystický tak, aby žlčník nemohol fungovať ako zásobáreň boli náhodne rozdelené do kontrolných a skupín. Začínajúc druhým dňom po podviazaní pankreatického kanálu, bolo experimentálnej skupine podané rPH.2 v dávke 5 mg/kg telesnej hmotnosti a deň (aplikované 4 mg/ml roztoku) intravenózne do chvostovej žily. zatiaľ čo kontrolnej skupine bolo intravenózne podané placebo v rovnakom objeme. Po 1 a 2 dňoch ošetrenia (3. a 4. deň po llgácli pankreatického kanál podviazaný žlče. Zvieratá experimentálnych kanálu) boli zvieratá usmrtené predávkovaním fenobarbitalu sodného. Boli odobrané vzorky krvi zo srdca pre stanovenie obsahu sérum amylázy, sérum llpázy a sérum billrubinu a bol odobraný pankreas. Časti pankreasu boli jednak fixované v 4 % fosfátovom forinaldehydovorn pufri pre histologické pozorovania alebo okamžite zmrazené na -80 °C pre stanovenie myeloperoxidázovej aktivity. Ďalšie časti pankreasu slúžili pre stanovenie obsahu vody a obsahu pankreatickej amylázy, tak. ako to bolo popísané vyššie v sekcii A tohoto príkladu, ľlyeloperoxidázová aktivita, mierka zafarbenia neutrofilov, bola stanovená v pankrease tak. ako to je popísané vyššie. Pulmonálria vaskulárna permeabllita bola tiež stanovená vyššie uvedenou metódou.Healthy, randomly captured American Opossums (.Didelphis i / irginiana) of both sexes (2.0 kg to 4.0 kg) were obtained from Scott-Haas and kept in controlled atmosphere rooms of 23 ± 2 ° C, 12 hour light / dark and fed standard laboratory food and water ad libitum. Following overnight fasting, the animals were anesthetized with 50 mg / kg sodium phenobarbital i.p. (Veterinary Laboratories Inc., Leriexa, KS). Cellotomy was performed by means of a central incision under sterile conditions and a channel common to the bile and pancreas was ligated to induce necrotic pancreatitis. In addition, it was cystic so that the gallbladder could not function as a reservoir, randomly divided into control and groups. Beginning on the second day after ligation of the pancreatic canal, the experimental group was administered rPH.2 at a dose of 5 mg / kg body weight per day (administered with a 4 mg / ml solution) intravenously into the tail vein. whereas the control group received intravenous placebo in the same volume. After 1 and 2 days of treatment (days 3 and 4 after ligation of pancreatic bile-ligated bile. Experimental channel animals), the animals were sacrificed by an overdose of sodium phenobarbital. Blood samples were collected from the heart for the determination of serum amylase, serum llpase and serum billrubin and pancreas were collected. Portions of the pancreas were either fixed in 4% phosphate forinaldehyde buffer for histological observation or immediately frozen at -80 ° C to determine myeloperoxidase activity. Other parts of the pancreas served to determine the water content and pancreatic amylase content, respectively. as described above in section A of this example, llyeloperoxidase activity, a measure of neutrophil staining, was determined in the pancreas so. as described above. Pulmonary vascular permeability was also determined by the above method.
Uvedené výsledky predstavujú priemer ± stredná chyba priemeru CSEľl) získaný z troch a viacerých experimentov. Významnosť zmien bola hodnotená Študentovým t-testom. pokial išlo o dáta usporiadané v dvoch skupinách a analýzou variaricie (ANOVA), ak boli porovnávané tri skupiny a viac. Ak ANOVA indikovala významný rozdiel, boli dáta analyzované metódou Turkey ako post hoc test rozdielov medzi skupinami. Rozdiel bol považovaný za významný, ak hodnota p<0,05.The results presented represent the mean ± mean error of the mean (CSE1) obtained from three or more experiments. The significance of the changes was evaluated by the Student's t-test. for data organized in two groups and variance analysis (ANOVA) when three groups or more were compared. If ANOVA indicated a significant difference, the data were analyzed by Turkey as a post hoc test for group differences. The difference was considered significant if p <0.05.
Výsledky sú uvedené v Tabuľke 11. Upchanie spoločného biliopankreatického kanállka malo za následok ťažkú nekrotickú pankreatitidu, charakterizovanú hyperamyláziou, hyperlípázémiami a rozsiahlymi nekrózami pankreasu. Navyše malo upchanie spoločného biolopankratického kanállka za následok silné zvýšenie hodnôt billrubinu v sére. Intravenózne podanie rPH.2 (5 mg/kg/deň) začínajúc druhým dňom po ligácll pankreatického kanállka, zlepšilo väčšinu pankreatických zmien indukovaných upchaním kanállka a v porovnaní so zvieratami, ktorým bolo podané placebo. Jednodenné ošetrenie rPH.2 znížilo hladinu sérumamylázy v porovnaní s kontrolnými zvieratami, napriek tomu. že rozdiel nebol štatisticky významný a dvojdenná aplikácia rPH.2 (4. deň po ligácll pankreatického kanállka) významne znížil hladiny amylázy v porovnaní s placeboskuplnou. Jednodenné a dvojdenné ošetrenie rPH.2 znížilo hladinu sérumlipázy na úroveň kontroly.The results are shown in Table 11. Congestion of the common biliopancreatic duct resulted in severe necrotic pancreatitis, characterized by hyperamylase, hyperlipaseemia, and extensive pancreatic necrosis. In addition, clogging of the common biolopancratic duct resulted in a strong increase in serum billrubin values. Intravenous administration of rPH.2 (5 mg / kg / day) beginning the second day after pancreatic duct ligation improved most of the pancreatic duct-induced pancreatic changes and compared to placebo-treated animals. One day treatment with rPH.2 reduced serum amylase levels compared to control animals, however. that the difference was not statistically significant and the two-day application of rPH.2 (day 4 after pancreatic duct ligation) significantly reduced amylase levels compared to placebo. One-day and two-day rPH.2 treatment reduced serum lipase levels to control levels.
avšak rozdiel nebol štatisticky významný. Dvojdenná aplikácia rPH.2 znížila obsah pankreatickej amylázy na úroveň kontrôl, avšak pri jednodennej aplikácii došlo k zvýšeniu pankreatickej amylázy. Ošetrenie rPH.2 neovplyvnilo hladinu bilirubínu v sére, pankreatickú myeloperoxldázovú aktivitu ani obsah vody v pankrease.however, the difference was not statistically significant. A two-day application of rPH.2 reduced pancreatic amylase content to control levels, but a one-day administration increased pancreatic amylase. Treatment with rPH.2 did not affect serum bilirubin levels, pancreatic myeloperoxidase activity or pancreatic water content.
K hlavným charakteristickým zmenám indukovaným obštrukciou bíliopankreatíckého kanállka patrili nekrózy, infiltrácia zapálených buniek, vakuollzácla acinárnych buniek a výrazné roztiahnutie acinárnych luménov. Morfometrieké sledovanie poškodených acinárnych buniek pankreasu ukázalo silný ochranný účinok rPH.2 pri ošetrení deň alebo dva dopredu. Pri ošetrení rPH.2 deň dopredu bolo poškodenie acinárnych buniek znížené na 23 2 celkového acinárneho tkaniva, v porovnaní so 48 2 poškodeného tkaniva zvierat, ktorým bolo podané placebo. Tento pokles poranených buniek bol ešte viac rPH.2. kedy došlo k zníženiu zrejmý po dvojdennej aplikácii poškodených buniek na 35 2 v porovnaní so 60 2 u zvierat, ktorým bolo podané placebo.The main characteristic changes induced by obstruction of the bile-pancreatic duct included necrosis, inflamed cell infiltration, acinar cell vacuum, and a pronounced expansion of the acinar lumens. Morphometric observation of damaged pancreatic acinar cells showed a strong protective effect of rPH.2 on a day or two advance treatment. At rPH.2 day treatment, acinic cell damage was reduced to 23 2 of total acinar tissue, compared to 48 2 of placebo-injured animal tissue. This decrease in the injured cells was even more rPH.2. when there was a reduction in apparent after two days of injured cell application to 35 2 compared to 60 2 in placebo-treated animals.
Vaskulárna permeabilita pľúc, kvantifikovaná injekciou FITC, v skupine, ktorej bol aplikovaný rPH.2, sa výrazne odlišovala od placebo skupiny pri jednodennej a dvojdennej aplikácii. Histologické pozorovania ukázali ťažké poškodenie pľúc vo všetkých skupinách ošetrených placebom. Poškodenie pľúc bolo charakterizované rozsiahlou zápalovou reakciou s intersticiálnou a intraalveolárnou infiltráciou predovšetkým makrofágmi, lymfocytmi a neutrofilmi a nepravidelným ale výrazným intersticiálnym edémom a zosilnením alveolárnych membrán. Podanie rPH.2 výrazne znížilo infiltráciu zapálených buniek a zmenšilo intersticiálny edém pri obidvoch dĺžkach aplikácie.Vascular permeability of the lungs, quantified by injection of FITC, in the rPH.2 treated group, was significantly different from the placebo group at one and two days. Histological observations showed severe lung injury in all placebo-treated groups. Lung damage was characterized by a widespread inflammatory response with interstitial and intraalveolar infiltration mainly by macrophages, lymphocytes and neutrophils and irregular but marked interstitial edema and thickening of alveolar membranes. Administration of rPH.2 significantly reduced inflammatory cell infiltration and reduced interstitial edema at both application times.
Súhrn týchto výsledkov jasne ukazuje, že intravenózne podanie rPH.2 v dávke 5 mg/kg/deň začínajúc 48 hodín po llgácll pankreatického kanállka malo za následok významné zníženie zvýšených hladín amylázy a llpázy a poškodenie acinárnych buniek kvantifikovaná morfometrickou analýzou sekcií ofarbených H & E n a došlo k významnému poklesu závažnosti pankreatltídou indukovanému poškodeniu pľúc. Na tomto, z klinického hľadiska vhodnom modeli pankreatitidy, ukázal rPAF-AH produkt prínosný vplyv na zníženie závažnosti pankreatitidy.The summary of these results clearly shows that intravenous administration of rPH.2 at 5 mg / kg / day starting 48 hours after pancreatic duct IgG1 resulted in a significant reduction in elevated levels of amylase and llpase and acinar cell damage quantified by morphometric analysis of H & E stained sections there was a significant decrease in the severity of pancreatltid-induced lung injury. In this clinically appropriate model of pancreatitis, rPAF-AH product showed a beneficial effect in reducing the severity of pancreatitis.
Tabuľka 11Table 11
Tabuľka 11 - pokračovanieTable 11 - continued
Po jednodennom ošetrení Po dvojdennom ošetrení (usmrtenie 3. deň) (usmrtenie 4. deň) placebo rPH.2 mg/kg placebo rPH.2 mg/kg poškodené 48 23 acinárne bunky (% z celkového acinárneho tkaniva)After one day treatment After two days treatment (day 3 sacrifice) (day 4 sacrifice) placebo rPH.2 mg / kg placebo rPH.2 mg / kg damaged 48 23 acinar cells (% of total acinar tissue)
35 * p = 0, 02 versus placebo MW p < 0,001 versus placebo35 * p = 0.02 versus placebo MW p <0.001 versus placebo
Príklad 20Example 20
Bola uskutočnená štúdia hodnotiaca účinok PAF-AH produktu, rPH.2, na neurotoxicitu spojenú s infekciou HIV. Infekcia centrálneho nervového systému HIV-1 (human immunodeficiency irus, typ 1) spOsobuje neuronálne straty apoptózou. Ak sú monocyty infikované HIV-1 aktivované rôznymi antigénnymi stimulmi vrátane kontaktu s nervovými bunkami, vylučujú vysoké hladiny neurotoxických cytokinov, vrátane PAF, vyvolávajúcich zápal.A study was conducted to evaluate the effect of PAF-AH product, rPH.2, on neurotoxicity associated with HIV infection. Infection of the central nervous system HIV-1 (human immunodeficiency irus, type 1) causes neuronal loss by apoptosis. When monocytes infected with HIV-1 are activated by various antigenic stimuli, including contact with nerve cells, they secrete high levels of neurotoxic cytokines, including PAF, inducing inflammation.
Bol študovaný vplyv rPH.2 na neurotoxicitu upraveného média z monocytov infikovaných HIV.The effect of rPH.2 on the neurotoxicity of conditioned media from HIV infected monocytes was studied.
Monocyty boli infikované HIV a aktivované tak, ako je to popísané ďalej. Monocyty bolí získané z periférnych buniek kostnej drene (peripheral bone marrou cells - PBMC) HIV a hepatltis B seronegativnych darcov po leukoforéze a puriflkované 098%) centrifugačným vyčistením (Countercurrent centrifugal eluriatiori) tak. ako to popísali Genis et al.. J. Exp. Med.. 176: 1703-1718 (1992). Bunky boli kultivované (lx 10* bunlek/ml v kultivačných fľašiach T-75) v DMEM/Sigma, St. Louls, MO) s ľudským rekombinantným faktorom stimulujúcim kolónie makrofágovMonocytes were infected with HIV and activated as described below. Monocytes were obtained from peripheral bone marrou cells (PBMCs) of HIV and hepatitis B seronegative donors after leukophoresis and purified by 098%) by centrifugation (Countercurrent centrifugal eluriatiori) so. as described by Genis et al., J. Exp. Med., 176: 1703-1718 (1992). Cells were cultured (1x 10 * cells / ml in T-75 flasks) in DMEM / Sigma, St. Petersburg. Louls, MO) with human recombinant macrophage colony stimulating factor
100100
CMSCF - rekombinant human macrophage colony stimulátory factor) CGenetic Inštitúte, Inc. Cambridge, MA). Pri týchto podmienkach sa monocyty diferencovali na makrofágy. Po 7-10 dňoch kultivácie boli makrofágy vystavené HIV-lftDft C pod číslom 1*160472) v prebytku infekčného agens Cmultlpllclty of infectiori - 1*101) 0,01 infekčných viriónov/cielovú bunku. Pri týchto podmienkach bolo 20-50 % monocytov infikovaných 7 dní po inokuláclí HIV-1, čo bolo potvrdené imunofluorescenčnýml metódami a hybridizáciou ln situ [Kalter et al., J. Immunol., 146» 298-306 C1991)]. Kultúram bolo doplňované čerstvé živné médium každý 2 až 3 deň. Päť až sedem dni po infekcii HIV, v čase kulminácie aktivity reverznej transkriptázy CIO7 cpm/ml) stanovenej podlá Kalter et al.r pozri vyššie, boli kultúry monocytov, a to ako infikovaných HIV-1, tak aj paralelné kultúry neinfikovaných monocytov, stimulované LPS CIO ng/ml) alebo samotnou prenosovou látkou počas 30 miri, pri 37 °C a potom rýchlo zmrazené na -80 °C a uchované až do doby testovania neurotoxicity.CMSCF (Recombinant Human Macrophage Colony Stimulators Factor) CGenetic Institute, Inc. Cambridge, MA). Under these conditions, monocytes differentiated into macrophages. After 7-10 days of culture, macrophages were exposed to HIV-1 ftDft C under number 1 * 160472) in excess of infectious agent (1 * 1014) of 0.01 infectious virions / target cell. Under these conditions, 20-50% of the monocytes were infected 7 days after inoculation with HIV-1, as confirmed by immunofluorescence methods and 1n situ hybridization (Kalter et al., J. Immunol., 146 »298-306 C1991)]. The cultures were supplemented with fresh nutrient medium every 2-3 days. Five to seven days after infection with HIV, the culmination time of the reverse transcriptase activity CIO 7 cpm / ml) determined in Kalter et al. r see above, monocyte cultures, both HIV-1 infected and uninfected monocyte parallel cultures, stimulated with LPS (10 ng / ml) or transfer agent alone for 30 miri, at 37 ° C and then rapidly frozen to -80 ° C and maintained until neurotoxicity testing.
Kultúry ľudských cerebrálnych kortikálnych neurónových buniek boli odvodené podľa nasledujúceho postupu. Ľudské fetálrie mozgové tkanivo bolo získané z telencefalónu v druhom trimestri. C13-16 týždňov tehotenstva) modifikovaným postupom podľa Bankera a Couana, Braln Res., 1361 397-425 C1977). Stručný popis metódy» mozgové tkanivo bolo odobrané, obmyté 30 ml chladného Hankovho média BSS C obsahujúceho Ca3'1' a Mga* + 25ml*l HEPES a 5X gentainicínu), separované od adherent meninges a krvi a narezané na kúsky s veľkosťou 2 mm3. Tkanivo bolo pretlačené cez 230ul*l vrecko Nitex a 10-15-krát jemne pretiahnuté cez Pasteurovu pipetu opálenú nad plameňom. Ďalej bolo tkanivo centrifugované pri 550 rpm. 5 min. 4 °C a peleta bola resuspendovaná v 5-10 ml l*IEI*l-hipp CD-glukóza, 5 g/1; L-glutamiri, 2ml*ls HEPES. 10ml*l; AN pyruvát, lmM; KC1, 20mň) s obsahom N1 komponent C inzulín. 5 mg/ml; transferín, 5 mg/ml; selenlt. 5 ug/1. progesterón, 20nl*l; putrescin, lOOuM), rovnako ako 10% fetálne sérum CFCS), PSN zmes antibiotík C penicilín, 50 mg/1; streptomycín 50 mg/1; neomycín 100 mg/1) a fungizon <2,5 g/1). Počet buniek a ich životnosť boli určené pomocou nariedenia Hanksovým BSS obsahujúcim 0. 4 % tryptofánovúCultures of human cerebral cortical neuronal cells were derived according to the following procedure. Human fetal brain tissue was obtained from telencephalon in the second trimester. C13-16 weeks of pregnancy) by the modified procedure of Banker and Couan, Braln Res., 1361 397-425 (C1977). Brief description of the method »brain tissue was collected, washed with 30 ml of cold Hank's BSS C medium containing Ca 3 ' 1 ' and Mg and * + 25ml * 1 HEPES and 5X gentainicin), separated from adherent meninges and blood and cut into 2 pieces. mm 3 . The tissue was passed through a 230 µL Nitex bag and gently passed through a flame-burnt Pasteur pipette 10-15 times. Next, the tissue was centrifuged at 550 rpm. 5 min. 4 ° C and the pellet was resuspended in 5-10 ml of 1 * IEI * 1-hipp CD-glucose, 5 g / L; L-glutamiri, 2ml * 1 with HEPES. 10 ml * l; AN pyruvate, 1mM; KCl, 20 min) containing N1 components C insulin. 5 mg / ml; transferrin, 5 mg / ml; selenlt. 5 µg / L. progesterone, 20 µl * 1; putrescine, 100 µM), as well as 10% fetal serum (CFCS), PSN antibiotic C penicillin, 50 mg / L; streptomycin 50 mg / L; neomycin 100 mg / l) and fungizone <2.5 g / l). Cell number and cell viability were determined by dilution with Hanks BSS containing 0.4% tryptophan
101101
X modrú (1«1 v/v) a bunky boli počítané pomocou hemocytometra. Bunky boli päťkrát premyté 10 ml plpetou a vysiate v riedení zodpovedajúcom hustote 105 buníek/12 mm krycie sklíčko, ktorá bola dopredu potiahnutá poly-L-lyzínom (70K-150K ľlW, Sigma, St. louis, MO) a po nanesení buniek umiestená do 24-jamkových kultivačných dosiek. Do každej kultivačnej jamky bol potom pridaný 1 ml média. Bunky sa inkubovall a kultivovali počas 10 až 28 dní pri 370 °C v inkubátore s vlhkou atmosférou zloženou z 5 % C0a/95 % vzduchu. Médium sa menilo každé tri dní. Pri týchto podmienkach boli kultúry > z 60-70 % homogénne pre neuróny, ďalej kultúra obsahovala 20-30 % hviezdicových buniek, < 1% míkroglii a približne 10 % makrofágov a farbitelných mikroglií. Po 14 až 28 dňoch kultivácie kultúra neurónov exprimovala dostatočné množstvo N-metyl-D-aspartátu (NMDA) alebo nori-NMDA receptory boli usmrtené po podaní excitotoxických dávok NMDA alebo alfaamino-3-hydroxy-5-metyl-4-izoxazol propiónovej kyseliny (AMPA).X blue (1 → 1 v / v) and cells were counted using a hemocytometer. The cells were washed five times with a 10 ml flask and seeded at a dilution equivalent to a density of 105 cells / 12 mm coverslip that had been pre-coated with poly-L-lysine (70K-150K lW, Sigma, St. Louis, MO) and placed in the cells. 24-well culture plates. 1 ml of medium was then added to each culture well. Cells were incubated and cultured for 10-28 days at 370 ° C in a humidified incubator composed of 5% CO 2 and / 95% air. Medium was changed every three days. Under these conditions, the cultures were> 60-70% homogeneous for neurons, further the culture contained 20-30% star cells, <1% microglia and approximately 10% macrophages and stained microglia. After 14 to 28 days of culture, the neuronal culture expressed a sufficient amount of N-methyl-D-aspartate (NMDA) or nori-NMDA receptors were killed after administration of excitotoxic doses of NMDA or alphaamino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid ( AMPA).
Test na rieurotoxicitu bol uskutočňovaný nasledujúcim spôsobom. Testované vzorky, medzi ktoré patrili (a) kondiciované média z LPS-stimulovariých HIV-1 infikovaných moriocytov. (b) kontrolné médiá, (c) kondiciované médium s pridaným rPH.2 v koncentrácii 51 ug/ml alebo (d) kondiciované médium s pridaným nosičom pre rPH.2, boli aplikované na bunky kultúry neurónov v koncentrácií lslO v/v na dobu 24 hodín. Neurotoxicita sa merala pomocou identifikácie apoptických jadier in situ na neurónoch rastúcich na krycích sklíčkach, ktoré boli fixované 4% formaldehydom. Pre tento test bol používaný komerčný kít (Apop Tag; ONCOR. Gaithersburg, MD), ktorý používal terminálnu deoxynukleotidyltransferázu (TdT) pre väzbu digoxigenin-dUPT k 3’-OH konci novo štiepenej DNA (TUNEL farbenia). Digitálne spracovanie obrazov neurónov farbených TUNEL technikou vo viac ako 15 náhodne vybraných mikroskopických poliach sa analyzovalo na počet technikou TUNEL farbených jadier/celkovému počtu neurónov zistených na 50 mikroskopických poliach pomocou počítačovej morfometrie (MCID, Imaglng Research. St. Catherine. Ontario, Kanada).The rheotoxicity test was carried out as follows. Test samples, including conditioned media from LPS-stimulating HIV-1 infected moriocytes. (b) control media, (c) conditioned media with added rPH.2 at a concentration of 51 µg / ml, or (d) conditioned media with added carrier for rPH.2, were applied to neuronal culture cells at a concentration of ls10 v / v for a period of time 24 hours. Neurotoxicity was measured by identifying apoptotic nuclei in situ on neurons growing on coverslips that were fixed with 4% formaldehyde. A commercial kit (Apop Tag; ONCOR, Gaithersburg, MD) was used for this assay, using terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) to bind digoxigenin-dUPT to the 3'-OH end of the newly digested DNA (TUNEL staining). Digital processing of TUNEL stained neuron images in more than 15 randomly selected microscopic fields was analyzed for the number of TUNEL stained nuclei / total number of neurons detected in 50 microscopic fields by computer morphometry (MCID, Imaglng Research, St. Catherine, Ontario, Canada).
102102
Dáta boli vyjadrené farbení TUNEL + SEI*I a štatistickej dOkaznosti redukovať neurónov.Data were expressed by TUNEL + SEI * I staining and statistical evidence to reduce neurons.
v % jadier neurónov pozitívnych vo sú ukázané na obrázku 13. Testy medzi kontrolou a experimentálnym liečením boli uskutočnené metódou ANOVA alebo párovými t-testmi, s dôkaznosťou p<0.05. Kvantifikácia týchto kultúr potvrdila, že kondlciované médium z HlV-infikovaných a aktivovaných monocytov indukovalo smrť buniek neurónov v rozsahu 25% z celkovej populácie cerebrálnych kôrových neurónov. rPH.2 bol schopný túto toxicitu na menej ako 5 % z celkového počtu rPH.2 sám o sebe nebol neurotoxický, pretože v koncentrácii 50 ug/ml rPH.2 nemal v porovnaní s kultúrou ošetrenou pomocou kontrolného média žiadny vplyv na smrť neurónových buniek. Tieto výsledky jasne dokázali, že hlavnou zložkou vyvolávajúcou neurotoxicítu pri aplikácii kondiciovaného média z buniek HIV-1 infikovaných aktivovaných monocytov, musi byť PAF, pretože neurotoxlcita môže byť takmer úplne potlačená spoločnou inkubáciou s produktom PAF-AH, čo je enzým zodpovedný za metabolizmus PAF v centrálnom nervovom systéme. Tieto zistenia načŕtajú možné terapeutické použitie pri liečení neurologických chorôb CNS, ktoré sú spojené s infekciou HIV-1.The% between the nuclei of the positive neurons are shown in Figure 13. Tests between control and experimental treatment were performed by ANOVA or paired t-tests, with a p <0.05 probability. Quantification of these cultures confirmed that conditioned medium from HIV-infected and activated monocytes induced neuronal cell death in the range of 25% of the total cerebral cortex neuron population. rPH.2 was capable of this toxicity to less than 5% of the total number of rPH.2 itself was not neurotoxic, since at 50 µg / ml rPH.2 had no effect on neuronal cell death compared to culture treated with control medium. These results clearly demonstrated that PAF must be the major neurotoxicity-inducing component in the administration of conditioned media from HIV-1 cells infected with activated monocytes, since neurotoxicity can be almost completely suppressed by co-incubation with PAF-AH, the enzyme responsible for PAF metabolism in central nervous system. These findings outline possible therapeutic uses in the treatment of CNS neurological diseases associated with HIV-1 infection.
Príklad 21Example 21
Takmer 4 percentá japonskej populácie má nízku či až nedetegovateľnú hladinu aktivity PAF-AH v plazme. Táto deŕiciencia je v korelácii s ťažkými respiračnými symptómami u deti trpiacich astmou. Fliua a rfalši (J. Clin. Invest., 82s 1983-1991 (1988)), poukázali na to, že tieto stavy môžu byť spôsobené deficlenclou dedenou autozomálnym recesívnym spôsobom.Almost 4 percent of the Japanese population has low or even undetectable levels of PAF-AH activity in plasma. This distinction is correlated with severe respiratory symptoms in children suffering from asthma. Fliua et al. (J. Clin. Invest., 82s 1983-1991 (1988)) have pointed out that these conditions may be caused by a deficient member inherited in an autosomal recessive manner.
Na určenie skutočnosti, či táto deficlencla pochádza z inaktlvneho. ale prítomného enzýmu, či je spôsobená nemožnosťou syntézy PAF-AH, bola zhromažďovaná plazma od mnohých pacientov deficientných na aktivitu PAF-AH (pomocou metódy popísanej v Príklade 10 pre transfektanty) a ďalej bola testovaná prítomnosť PAF-AH pomocou monoklonálnych protilátok 90G11D (Príklad 13) pomocou EL1SA metódy popísanej ďalej* ľllkrotitračné doskyTo determine whether this deficlencla comes from inactivated. but the enzyme present, whether it is due to the impossibility of PAF-AH synthesis, plasma was collected from many patients deficient in PAF-AH activity (using the method described in Example 10 for transfectants) and further tested for PAF-AH using monoclonal antibodies 90G11D (Example 13). ) using the EL1SA method described below
103103
Immunolon 4 s plochým dnom (Dynatech, Chantilly, VA) boli potiahnuté monoklonáInou protilátkou 90G11D v koncentrácii 100 ng/jamku a ponechané inkubovať sa do rána. Potom boli jamky blokované 1 hodinu pri izbovej teplote 0, 5% želatínou z rybacej kože (Sigma) nariederiej v CMF-PBS. Ďalej boli jamky štyrikrát premyté. Plazma získaná od pacientov bola nariedená v PBS obsahujúcom 15ml*l CHAPS a bola pridaná do každej jamky na doštičke (50 ul/jamka). Doštičky sa Inkubovali 1 hodinu pri Izbovej teplote a potom boli štyri razy premyté. Nasledovalo pridanie 5 ul monoklonálnej protilátky 90F2D v koncentrácii 5 ug/ml, ktorá bola biotinylovaná štandardnou metódou a nariedená v PBST do každej jamky. Doska sa inkubovala 1 hodinu pri izbovej teplote a potom bola trikrát premytá. Nasledovalo pridanie 50 ul Extra Avidínu (Sigma) neriedeného 1 s 1000 v CľlT-PBST do každej jamky a doska sa opäť nechala Inkubovať 1 hodinu pri Izbovej teplote. Potom nasledovalo vyvolanie aktivity.Flat-bottom Immunolon 4 (Dynatech, Chantilly, VA) was coated with monoclonal antibody 90G11D at 100 ng / well and allowed to incubate until morning. The wells were then blocked for 1 hour at room temperature with 0.5% fish skin gelatin (Sigma) diluted in CMF-PBS. Next, the wells were washed four times. Patient plasma was diluted in PBS containing 15ml * 1 CHAPS and added to each well of the plate (50 µl / well). Plates were incubated for 1 hour at room temperature and then washed four times. This was followed by the addition of 5 µl of monoclonal antibody 90F2D at a concentration of 5 µg / ml, which was biotinylated by a standard method and diluted in PBST to each well. The plate was incubated for 1 hour at room temperature and then washed three times. This was followed by the addition of 50 µl of Extra Avidin (Sigma) undiluted 1 with 1000 in C 1 H-PBST to each well and the plate was again incubated for 1 hour at room temperature. This was followed by induction of activity.
Boli nájdené priame korelácie medzi PAF-AH aktivitou a koncentráciou enzýmu. Ak nebola v sére pacienta nameraná aktivita, bolo to vždy sprevádzané nemožnosťou detegovať prítomnosť enzýmu. Podobne, vzorky plazmy vykazujúce polovičnú hodnotu normálnej aktivity, obsahovali polovicu normálnej hladiny PAF-AH. Tieto zistenia potvrdzujú. Že deficiencia aktivity PAF-AH je spôsobená nemožnosťou syntetizovať enzým alebo je spôsobená tým, že monoklonálne protilátky nerozpoznávajú inaktívnu formu enzýmu.Direct correlations were found between PAF-AH activity and enzyme concentration. If no activity was measured in the patient's serum, this was always accompanied by the inability to detect the presence of the enzyme. Similarly, plasma samples showing half the normal activity value contained half of the normal level of PAF-AH. These findings confirm. That the deficiency of PAF-AH activity is due to the inability to synthesize the enzyme or is due to the fact that the monoclonal antibodies do not recognize an inactive form of the enzyme.
Boli navrhnuté ďalšie pokusy, ktoré mali umožniť rozhodnutie, či deficiencia je spôsobená genetickou poruchou v géne pre ľudský plazmatický PAF-AH. Bola Izolovaná genómová DNA z PAF-AH deficientných jedincov a použitá ako templát pre PCR reakcie s primérmi špecifickými pre PAF-AH gén. Každá z kódujúcich sekvencii exónov bola najprv amplifikovaná a sekvericovaná z jedného jedinca. V exóne 9 bola zistená zámena jedného riukleotidu (a to G za T v pozícii 996 podľa Sekvencie id. č.i 7). Nukleotidová zámena vyústila do amlnokyselinovej substitúcie fenylalaníriu za valín v pozícii 279 sekvencie PAF-AH (V279F). Exón 9 bol amplifikovaný z genómovej DNA ešte ďalších 11Further attempts have been made to determine whether the deficiency is due to a genetic disorder in the human plasma PAF-AH gene. Genomic DNA from PAF-AH deficient individuals was isolated and used as a template for PCR reactions with primers specific for the PAF-AH gene. Each of the exon coding sequences was first amplified and sequenced from one individual. Exon 9 revealed a single nucleotide replacement (G to T at position 996 of SEQ ID NO: 7). Nucleotide replacement resulted in an amino acid substitution of phenylalania for valine at position 279 of the sequence PAF-AH (V279F). Exon 9 was amplified from genomic DNA for a further 11
104104
PAF-AH deficientných pacientov, u ktorých bola zistená rovnaká bodová mutácia.PAF-AH deficient patients in whom the same point mutation was found.
K určeniu, či táto mutácia pozmení enzým, bol v E.coli exprimovaný konštrukt s touto mutáciou nevykazujúci žiadnu PAF-AH aktivitu, zatiaľ čo kontrolný konštrukt, ktorý neobsahoval mutáciu. bol plne aktívny. Zámena tejto aminokyseliny vedie pravdepodobne k štrukturálnej modifikácii, ktorá spOsobuje pozorovanú deficíenciu aktivity a tiež neschopnosť imunoreaktivity s PAF-AH protilátkami generovanými podľa vynálezu.To determine whether this mutation altered the enzyme, a construct with this mutation showing no PAF-AH activity was expressed in E. coli, whereas a control construct that did not contain the mutation. was fully active. Replacement of this amino acid is likely to result in a structural modification that causes an observed deficiency in activity as well as an inability to immunoreactivity with PAF-AH antibodies generated according to the invention.
PAF-AH špecifické protilátky podľa vynálezu tak môžu byť použité v diagnostických metódach k detekcii abnormálnych hladín PAF-AH v séru (normálne koncentrácie sú medzi 1 až 5 U/ml) a k sledovaniu patologických podmienok spojených s PAF-AH. Čo viac. určenie genetického poškodenia v PAF-AH génu umožňuje genetický výskum zaoberajúci sa deficienciou PAF-AH u japonských pacientov. Mutácia spOsobuje zisk reštrikčného endonukleázového miesta (MAEII) a tak umožňuje aplikácie jednoduché metódy, analýzy Restrition Fragment Lenght Polymorphlsm (RFLP), ktorá je schopná rozlíšiť medzi normálnymi a mutantnýini alelainl. (informáciu o tejto aplikácii možno získať s Leuln, strana 136 až 141 v GeriesThus, the PAF-AH specific antibodies of the invention can be used in diagnostic methods to detect abnormal serum levels of PAF-AH (normal concentrations are between 1 and 5 U / ml) and to monitor the pathological conditions associated with PAF-AH. What more. the determination of genetic damage in the PAF-AH gene allows genetic research into PAF-AH deficiency in Japanese patients. The mutation causes a restriction endonuclease site (MAEII) to be obtained, thus allowing the application of a simple method, Restrition Fragment Lenght Polymorphlsm (RFLP), which is able to distinguish between normal and mutant allelines. (information on this application can be obtained with Leuln, pages 136-141 in Geries
V. Oxford IJniversity Press, New York (1994)).V. Oxford International Press, New York (1994)).
Pomocou metódy štiepenia DNA erizýmomMae II, bol uskutočnený výskum genómovej DNA od 12 pacientov deficientných v PAF-AH, nasledoval Southern blot a hybridizácia so sondou komplementárnou s exónom 9 (nukleotidy 1 až 396, podľa Sekvencie id. č.« 17). U všetkých pacientov bolo zistené, že majú RFLP zhodné s mutantnými alelami.Using the DNA II erase enzyme digestion method, genomic DNA was investigated from 12 patients deficient in PAF-AH, followed by Southern blotting and hybridization with a probe complementary to exon 9 (nucleotides 1 to 396, according to SEQ ID NO: 17). All patients were found to have RFLPs consistent with mutant alleles.
Aj keď je vynález popísaný pomocou termínov špecifických pr danú realizáciu, samozrejme sa však rozumie, že sa mOžu vyskytnúť rôzne varianty a modifikácie, ktoré sú jasné odborníkom v danom odbore. Preto teda, na vynález mOžu byť pokladané len také obmedzenia, ktoré sa objavujú v pripojených patentových nárokoch.While the invention is described by terms specific to an embodiment, it will be understood that variations and modifications may be apparent to those skilled in the art. Therefore, only the limitations that appear in the appended claims can be considered to be within the scope of the invention.
105105
Zoznam sekvencii (1) Všeobecné Informácie;Sequence Listing (1) General Information;
Cl) Žiadateľ: ICOS CORPORATION(Cl) Applicant: ICOS CORPORATION
C11) Názov vynálezu: Platelet-Actlvating Factor AcetylhyďrolaseC11) Title of the invention: Platelet-Actlvating Factor Acetylhyrolase
C111) Počet sekvencii: 30 (iv) Korešpondenčná adresa:C111) Number of Sequences: 30 (iv) Mailing Address:
(A) Adresa: Marshall, O'Toole. Gerstein. Murray &(A) Address: Marshall, O'Toole. Gerstein. Murray &
Borun (B) Ulica: 6300 Sears Tower. 233 South Uacker Drive (C) ľlesto: Chicago (D) Štát: Illinois (E) Krajina: United States of America (F) PSČ CZIP): 60606-6402 (v) Forma vhodná pre počítačové spracovanie:Borun (B) Street: 6300 Sears Tower. 233 South Uacker Drive (C) Location: Chicago (D) Country: Illinois (E) Country: United States of America (F) Postcode CZIP): 60606-6402 (v) Form Compatible:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0. Version #1.25 (vl) Súčasné údaje o žiadosti:(A) Media Type: Floppy Disk (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operating System: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: PatentIn Release # 1.0. Version # 1.25 (vl) Current application data:
(A) Čislo žiadosti:(A) Application number:
(B) Dátum registrácie:(B) Registration date:
(C) Klasifikácia:(C) Classification:
(viii) Informácie o právnom zástupcovl/agentovl:(viii) Attorney / Agent Information:
(A) Meno: Rin-Laures. Li-Hsien (B) Registračné číslo: 33,547 (C) Referencie/počet súdnych prípadov: 27866/34026 (ix) Telekomunikačné informácie:(A) Name: Rin-Laures. Li-Hsien (B) Registration number: 33,547 (C) Reference / number of court cases: 27866/34026 (ix) Telecommunication information:
(A) Telefón: (312) 474-6300 (B) Fax: (312) 474-0448 (C) Telefax: 25-3658 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:(A) Telephone: (312) 474-6300 (B) Fax: (312) 474-0448 (C) Telefax: 25-3658 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIA: lineárna (ií) TYP MOLEKULY: peptld (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO: 1:(A) LENGTH: 17 amino acids (B) TYPE: amino acid CD) TOPOLOGY: linear (s) MOLECULA TYPE: peptld (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO: 2:
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu íle Ala 15 10 15Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn
PhePhe
106106
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO: 2:C2) INFORMATION ON SEO ID NO: 2:
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:(Cl) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
CA) DĹŽKA: 16 aminokyselínCA) LENGTH: 16 amino acids
CB) TYP: aminokyselina CD) TOPOLÓGIAt lineárnaCB) TYPE: amino acid CD) TOPOLOGY linear
Cii) TYP MOLEKULY: peptidCii) MOLECULA TYPE: peptide
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 2:Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO. 2:
íle Gin Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Lys íle Pro 15 10 15Gin Val Leu Met Ala Ala Ala Phe Gly Gin Thr Lys Pro 15 10 15
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 3.C2) SEO ID NO. Third
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.Ci) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
C A) DĹŽKA: 11 aminokyselínC A) LENGTH: 11 amino acids
CB) TYP. aminokyselina CD) TOPOLÓGIAt lineárnaCB) TYPE. amino acid CD) TOPOLOGY linear
Cii) TYP MOLEKULY, peptidCii) MOLECULA TYPE, peptide
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 3.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. Third
Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly 15 10Met Lys Pro Leu Gly Gly 15 10
C2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO. 4.C2) SEQ ID NO. 4th
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.C (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 32 párov bázCA) LENGTH. 32 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA: lineárnaCD) TOPOLOGY: linear
Cii) TYP MOLEKULY. DNA(Cii) MOLECULA TYPE. DNA
Cix) VLASTNOSTI:Cix) FEATURES:
C A) MENO/KLÚČ: Upravené-miestoC A) NAME / KEY: Modified-place
CB) UMIESTENIE, skupina C13, 21. 27)CB) LOCATION, Group C13, 21. 27)
CC) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = Nukleotid na každej z týchto pozícií je inozínCC) ADDITIONAL INFORMATION: / note = The nucleotide at each of these positions is inosine
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 4.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 4th
ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA 32ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA 32
C2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO. 5:C2) SEQ ID NO. 5:
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.Ci) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 32 párov bázCA) LENGTH. 32 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jedenCB) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
107 (ii) TYP MOLEKULY* DNA (xi) POPIS SEKVENCIE* SEO ID NO* 5*107 (ii) MOLECULA TYPE * DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION * SEO ID NO * 5 *
TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO* 6* (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE* (A) DĹŽKA* 32 párov báz (B) TYP* nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV* jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY* DNA (xi) POPIS SEKVENCIE* SEO ID NO* 6.TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) SEO ID NO * 6 * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS * (A) LENGTH * 32 base pairs (B) TYPE * nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS * one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE * DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION * SEO ID NO * 6.
CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC 32 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO* 7* (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC 32 (2) SEO ID NO * 7 * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA* 1520 párov báz (B) TYP* nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY* cDNA (ix) VLASTNOSTI.(A) LENGTH * 1520 base pairs (B) TYPE * nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE * cDNA (ix) CHARACTERISTICS.
(A) MENO/KLÚČ. CDS (B) UMIESTENIE. 162..1484 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 7.(A) NAME / KEY. CDS (B) LOCATION. 162..1484 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 7th
Met Val Pro Pro 1Met Val Pro Pro 2
109109
110110
111111
Asp Phe Asp Gin Tzp Asp Cys Leu íle Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu 405 410 415 íle Pro Gly Thr Asn íle Asn Thr Thr Asn Gin His íle Met Leu Gin 420 425 430Asp Phe Asp Gin Tzp Asp Cys Leu Clay Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu 405 410 415 Clay Pro Gly Thr Asn Clay Asn Thr Thr Asn Gin His Clay Met Leu Gin 420 425 430
Asn Ser Ser Gly íle Glu Lys Tyr Asn 435 440Asn Ser Ser Gly White Glu Lys Tyr Asn 435 440
C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NO· 9·.C 2) INFORMATION ON SEO ID NO.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA· 1123 párov báz (B) TYP· nukleová kyselina(1) SEQUENCE CHARACTERISTICS · (A) LENGTH · 1123 base pairs (B) TYPE · nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA· lineárnaCD) TOPOLOGY · Linear
C11) TYP MOLEKULY: DNA (genómová)C11) MOLECULA TYPE: DNA (genomic)
Clx) VLASTNOSTI:Clx) FEATURES:
CA) MENO/KLÚČ: exúnCA) NAME / KEY: exun
CB) UMIESTENIE» NestanovenéCB) LOCATION »Not determined
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO. 9«Cxl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO. 9 '
ΑΆΑΤΑΤΑΑΑΤ TTTAATAACA CCACACATAAΑΆΑΤΑΤΑΑΑΤ TTTAATAACA CCACACATAA
TGAAGTTTTA AATGAGTGTG TTTTTAATTTTGAAGTTTTA AATGAGTGTG TTTTTAATTT
GAAGATGAAG GAAGGCGTTT CAGTTAAACCGAAGATGAAG GAAGGCGTTT CAGTTAAACC
AAACGGCTCC TTCTAGCTCC ATTTCTCCTCAAACGGCTCC TTCTAGCTCC ATTTCTCCTC
ATTGTCATTT CCAGGGAGAA ATGACACCAGATTGTCATTT CCAGGGAGAA ATGACACCAG
GGTCCACACA ACTTCCGAAT TGGTGTTCAGGGTCCACACA ACTTCCGAAT TGGTGTTCAG
CAGGGCATTG CCAACTATAG ATGCTCGGAGCAGGGCATTG CCAACTATAG ATGCTCGGAG
ACAAGGAAAA CCGGCCTGAC TGGGGGGTGAACAAGGAAAA CCGGCCTGAC TGGGGGGTGA
AGGTCTGCGG AAAGGAGCTG GTGAGCACGAAGGTCTGCGG AAAGGAGCTG GTGAGCACGA
GGCGGGCTAA GTTAACCTCG GGTCCAGGTGGGCGGGCTAA GTTAACCTCG GGTCCAGGTG
GCGCTCGAGC AGGCTACGTC GGGAGCCGCCGCGCTCGAGC AGGCTACGTC GGGAGCCGCC
CCTCCCCGGT ACCTCCTCCA GCATCACCAGCCTCCCCGGT ACCTCCTCCA GCATCACCAG
AGGCGGACCC AGACACAGCC GCGCGCAGCCAGGCGGACCC AGACACAGCC GCGCGCAGCC
GCCCGCAGCC AGGGGGACAG CGGCTGGTCGGCCCGCAGCC AGGGGGACAC CGGCTGGTCG
TCGGGTTTGG AGCGCTTGGG TCGCGTTGGTTCGGGTTTGG AGCGCTTGGG TCGCGTTGGT
CCCGCGAGCA GCTCCGCGCC GCGCCTGAGTCCCGCGAGCA GCTCCGCGCC GCGCCTGAGT
GGGAGGAAGG GCACGGTCGC CGCGCTGGAGGGGAGGAAGG GCACGGTCGC CGCGCTGGAG
GTGGGCTCGC TGAGTCGCAC CCGCTCTGCTGTGGGCTCGC TGAGTCGCAC CCGCTCTGCT
ATTTCAAACT ACTTTCCCTA AGTTTCTAGC 60ATTTCAAACT ACTTTCCCTA AGTTTCTAGC 60
ATTAGAAAGT GGATTGAAGA GAAAACATTG 120ATTAGAAAGT GGATTGAAGA GAAAACATTG 120
CCAAATAACT CTGTGTTACA CTGAGCTATG 180CCAAATAACT CTGTGTTACA CTGAGCTATG 180
AGACCTAAGT GCTATTCCTG ATTGTCCTTC 240AGACCTAAGT GCTATTCCTG ATTGTCCTTC 240
CACAGTGGCA GGCCTTCCAA TCTGGAGCAC 300CACAGTGGCA GGCCTTCCAA TCTGGAGCAC 300
TGTAAAGTGT ATCGGAGTGC GGAAAATGCG 360TGTAAAGTGT ATCGGAGTGC GGAAAATGCG 360
TAATTCAGTG TATTCAGAGA ACACGGTGAA 420TAATTCAGTG TATTCAGAGA ACACGGTGAA 420
ATTCAGCAGG GAGTAAATCT GATCGGCATC 480ATTCAGCAGG GAGTAAATCT GATCGGCATC 480
CACCACCAGG CATTGCCTGG CTCTCTCCGC 540CACCACCAGG CATTGCCTGG CTCTCTCCGC 540
CGGGCCATGG TCTTGGGGAG GGTGCTGGGT 600CGGGCCATGG TCTTGGGGAG GGTGCTGGGT 600
GCTGCTAGTG AGAGCCGGGC CACACACGCT- 660GCTGCTAGTG AGAGCCGGGC CACACACGCT- 660
GGGAGGAGAG GGTCGGGCAC AAGGCGCGCT 720GGGAGGAGAG GGTCGGGCAC AAGGCGCGCT 720
CACCCGCCCG CCGCCTGCCA GAGCTGCTCG 780CACCCGCCCG CCGCCTGCCA GAGCTGCTCG 780
GAGGCTCGCA GTGCTGTCGG CGAGAAGCAG 840GAGGCTCGCA GTGCTGTCGG CGAGAAGCAG 840
GCGCGGTGGA ACCCCCCAGG GACCCCAGTT 900GCGCGGTGGA ACCCCCCAGG GACCCCAGTT 900
GAGGAGGGGC CCCGGGGGCG AGGCGGGAGT 960GAGGAGGGGC CCCGGGGGCG AGGCGGGAGT 960
GTCGGGACCC CGGAGCGGCG ACCGGCCGGG 1020GTCGGGACCC CGGAGCGGCG ACCGGCCGGG 1020
GGCCGGTCCT GGGCTCACAG TCCCTGCAGC 1080GGCCGGTCCT GGGCTCACAG TCCCTGCAGC 1080
112112
CCTCGGAAAC AGCGCTAGGA TCCTTCGGGA GAGGAGAGAT GAC 1123CCTCGGAAAC AGCGCTAGGA TCCTTCGGGA GAGGAGAGAT GAC 1123
C2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID Nb. 10.C2) INFORMATION 0 SEQ ID Nb. 10th
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 417 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY. DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI.(A) LENGTH. 417 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE. DNA (genomic) (ix) PROPERTIES.
(A) MENO/KLÚČ. exón (B) UMIESTENIE. 145..287 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 10.(A) NAME / KEY. exon (B) LOCATION. 145..287 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 10th
GTACCAATCT AAAACCCAGC ACAGAAAAAT ACATGTTTTA TTTTTTCCAA GTGTTACTAG 60GTACCAATCT AAAACCCAGC ACAGAAAAAT ACATGTTTTA TTTTTTCCAA GTGTTACTAG 60
TACCTCAGCC TTTCTTGATT TGTCAGCTTA TTTAAGGCCT CTTCATTGCA TACTTCTTTT 120TACCTCAGCC TTTCTTGATT TGTCAGCTTA TTTAAGGCCT CTTCATTGCA TACTTCTTTT 120
TTCTTTTAAT CATCTGCTTC GAAGGAGACT AAGCTGAAAC TGCTGCTCAG CTCCCAAGAT 180TTCTTTTAAT CATCTGCTTC GAAGGAGACT AAGCTGAAAC TGCTGCTCAG CTCCCAAGAT 180
GGTGCCACCC AAATTGCATG TGCTTTTCTG CCTCTGCGGC TGCCTGGCTG TGGTTTATCC 240GGTGCCACCC AAATTGCATG TGCTTTTCTG CCTCTGCGGC TGCCTGGCTG TGGTTTATCC 240
TTTTGACTGG CAATACATAA ATCCTGTTGC CCATATGAAA TCATCAGGTA AGAGGTGTAT 300TTTTGACTGG CAATACATAA ATCCTGTTGC CCATATGAAA TCATCAGGTA AGAGGTGTAT 300
TTGTTCAAGG TCTTGAGCAA CTGATCTGTC GCCATACTTC AAGTGGGCCC CAAGAAGTTG 360TTGTTCAAGG TCTTGAGCAA CTGATCTGTC GCCATACTTC AAGTGGGCCC CAAGAAGTTG 360
CACATCTGCA CATCTAAACA AGTCCTATTT AAAGGCTTAT GGAGATCCTG TATTCTC 417 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 11.CACATCTGCA CATCTAAACA AGTCCTATTT AAAGGCTTAT GGAGATCCTG TATTCTC 417 (2) INFORMATION ABOUT SEO ID NO. 11th
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 498 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (11) TYP MOLEKULY. DNA (genómová) (Ix) VLASTNOSTI.(A) LENGTH. 498 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (11) MOLECULA TYPE. DNA (genomic) (1x) FEATURES.
(A) MENO/KLÚČ. exón (B) UMIESTENIE. 251..372 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 11.(A) NAME / KEY. exon (B) LOCATION. 251..372 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 11th
CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT 60CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT 60
ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTTTGAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT 120ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTTTGAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT 120
ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG 180ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG 180
GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC 240GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC 240
TGTTTTTCAG catgggtcaa CAAAATAGAA GTACTGATGG CTGCTGCAAC GTTTGGCCAA 300TGTTTTTCAG catgggtcaa CAAAATAGAA GTACTGATGG CTGCTGCAAC GTTTGGCCAA 300
113113
ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT 360ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT 360
CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG 420CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG 420
TCGCTATGGA CCACTAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA 480TCGCTATGGA CCACTAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA 480
TTTTCGAATT TGTATTGT 498TTTTCGAATT TGTATTGT 498
C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NOs 12» (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.C 2) INFORMATION ON SEO ID NOs 12 »(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 433 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina(A) LENGTH. 433 base pairs (B) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
C11) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)C11) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Clx) VLASTNOSTI.Clx) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. exón (B) UMIESTENIE. 130..274CA) NAME / KEY. exon (B) LOCATION. 130..274
Cxl) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 12.Cxl) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 12th
CAGCAGCCTA AAGTCTTAGA CTTTGTGAAC ACAGAGGTAT TGAGTCCCAC TAATTAATAT 60CAGCAGCCTA AAGTCTTAGA CTTTGTGAAC ACAGAGGTAT TGAGTCCCAC TAATTAATAT 60
CGAAAATAGC TGCTGGAATA TGTTTGAGAC ACAACTTCTC TAAAAGTGCA TTAATTTCTT 120CGAAAATAGC TGCTGGAATA TGTTTGAGAC ACAACTTCTC TAAAAGTGCA TTAATTTCTT 120
TCTTAACAGG GCACCTTCTT GCGTTTATAT TATCCATCCC AAGATAATGA TCACCTTGAC 180TCTTAACAGG GCACCTTCTT GCGTTTATAT TATCCATCCC AAGATAATGA TCACCTTGAC 180
ACCCTTTGGA TCCCAAATAA AGAATATTTT TGGGGTCTTA GCAAATTTCT TGGAACACAC 240ACCCTTTGGA TCCCAAATAA AGAATATTTT TGGGGTCTTA GCAAATTTCT TGGAACACAC 240
TGGCTTATGG GCAACATTTT GAGGTTACTC TTTGGTAAGA TTTCTGTTGA TCCTTCTTTG 300TGGCTTATGG GCAACATTTT GAGGTTACTC TTTGGTAAGA TTTCTGTTGA TCCTTCTTTG 300
TAGGCTCTTG CATGTATGAA AACCTTGAAA ACAACAAGAA CTTCAAGTAG TTAAGACCAA 360TAGGCTCTTG CATGTATGAA AACCTTGAAA ACAACAAGAA CTTCAAGTAG TTAAGACCAA 360
AGTAGATTTT TCTTCAGTCC AAATAGCTCC TAAAATGATA AGGAAAGTAT TTCTTTAAAG 420AGTAGATTTT TCTTCAGTCC AAATAGCTCC TAAAATGATA AGGAAAGTAT TTCTTTAAAG 420
CCCAGGCAAC TAC 433CCCAGGCAAC TAC 433
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 13»C2) SEO ID NO. 13 »
C±) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE.
CA) DĹŽKA. 486 párov bázCA) LENGTH. 486 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
C11) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)C11) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. exónCA) NAME / KEY. exon
CB) UMIESTENIE. 164..257CB) LOCATION. 164..257
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 13«Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 13 «
TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG 60TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG 60
ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA 120ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA 120
114114
CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT 180CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT 180
GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAATATC CACTTGTTGT TTTTTCTCAT 240 ggtcttgggg CATTCAGGTA atgtttgaga' GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA 300GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAAATATC CACTTGTTGT TTTTTCTCAT 240 ggtcttgggg CATTCAGGTA atgtttgaga 'GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA 300
TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT 360TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT 360
CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTGATCAGT CCTAGACCTG 420CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTGATCAGT CCTAGACCTG 420
TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA 480TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA 480
GAAAGG 486GAAAGG 486
C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO. 14» (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE» (Á) DĹŽKA» 363 párov báz (B) TYP» nukleová kyselinaC 2) INFORMATION ON SEQ ID NO. 14 »(1) SEQUENCE CHARACTERISTICS» (L) LENGTH »363 base pairs (B) TYPE» nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cil) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)(A) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Cix) VLASTNOSTI:Cix) FEATURES:
CA) MENO/KLÚČ. exónCA) NAME / KEY. exon
CB) UMIESTENIE: 113..181CB) PLACEMENT: 113..181
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO: 14.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION:.
CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG 60CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG 60
CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120 attctgctat TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 180CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120 Attctgctat TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 180
GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 240GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 240
ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300
TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 360TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 360
AAC 363AAC 363
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO: 15.C2) INFORMATION ON SEO ID NO: 15.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(Cl) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 441 párov bázCA) LENGTH. 441 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cii) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)(Cii) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Clx) VLASTNOSTI.Clx) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. exón C B) UMIESTENIE» 68..191CA) NAME / KEY. exon C B) LOCATION »68..191
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 15«Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 15 «
115 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:115 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT GCATAAATAA TTTTGCTTGT 60GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT GCATAAATAA TTTTGCTTGT 60
ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT GCTGCAGAAA 120ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT GCTGCAGAAA 120
TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC 180TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC 180
GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA 240GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA 240
AAAGGATGAC ATTTGTTAAT TTAATTTTAC ACCTGGCAAG TTATGCTCCT AGCTCTCCTA 300AAAGGATGAC ATTTGTTAAT TTAATTTTAC ACCTGGCAAG TTATGCTCCT AGCTCTCCTA 300
TTTCCCATTC CCAAAAGATC TGTCAATAGA TTCCTGGAGC AGTAAAATTC CCTTAATGGA 360TTTCCCATTC CCAAAAGATC TGTCAATAGA TTCCTGGAGC AGTAAAATTC CCTTAATGGA 360
ATATCTAGTT CATAGTAAAA ACAAAGGCAA ATACAAAAAT TTGGGAGATG ACAGTGAATA 420ATATCTAGTT CATAGTAAAA ACAAAGGCAA ATACAAAAAT TTGGGAGATG ACAGTGAATA 420
TTCAGAATTC CTCGAGCCGG G 441TTCAGAATTC CTCGAGCCGG G 441
C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:C 2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 16:
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(Cl) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA: 577 párov bázCA) LENGTH: 577 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárna Cil) TYP MOLEKULY: DNA Cgenúmová)CD) TOPOLOGY. linear Cil) MOLECULA TYPE: DNA Genomic)
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ: exúnCA) NAME / KEY: exun
CB) UMIESTENIE. 245..358CB) LOCATION. 245..358
Cxl) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 16.Cxl) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 16th
GGTTAAGTAA ATCGTCTGAA GTCACATAGT AGGTAAGGCA AAACAGAGCC AGGATTTGGA 60GGTTAAGTAA ATCGTCTGAA GTCACATAGT AGGTAAGGCA AAACAGAGCC AGGATTTGGA 60
CTAAGGCTAT ACCTATGTGC AAAGCTGGGG CCTGTGTCAT TATGGTAGCA AGTAATAGTC 120CTAAGGCTAT ACCTATGTGC AAAGCTGGGG CCTGTGTCAT TATGGTAGCA AGTAATAGTC 120
ACTAATCAGA TTTCCAGTTT ATAACTGACC AACGATTTTT CCCAAATACA GCTTCTACCT 180ACTAATCAGA TTTCCAGTTT ATAACTGACC AACGATTTTT CCCAAATACA GCTTCTACCT 180
AAACTTTAAA ATAAGTGTTA TAACTTTTTA CTTTGTCATT TCCTTCTTCT AATAATTATA 240AAACTTTAAA ATAAGTGTTA TAACTTTTTA CTTTGTCATT TCCTTCTTCT AATAATTATA 240
TTAGGTACGG CAAAGAGCAA AAGAATGTTC CCAAGCTCTC AGTCTGATTC TTGACATTGA 300TTAGGTACGG CAAAGAGCAA AAGAATGTTC CCAAGCTCTC AGTCTGATTC TTGACATTGA 300
TCATGGAAAG CCAGTGAAGA ATGCATTAGA TTTAAAGTTT GATATGGAAC AACTGAAGGT- 360TCATGGAAAG CCAGTGAAGA ATGCATTAGA TTTAAAGTT GATATGGAAC AACTGAAGGT- 360
AAGCTATAAA AAGTAATTTT TCTCTTGTCC TACAGTTCTT TATTGTTTTT TGTCATTTAA 420AAGCTATAAA AAGTAATTTT TCTCTTGTCC TACAGTTCTT TATTGTTTTT TGTCATTTAA 420
TTTTCTGCCT ATATTGCAAG GTACAATATG ATAAAGGGCT GCAACCAGCC CCTCCCCAAT 480TTTTCTGCCT ATATTGCAAG GTACAATATG ATAAAGGGCT GCAACCAGCC CCTCCCCAAT 480
GCGCACACAC AGACACACAA AGCAGTACAG GTAAAGTATT GCAGCAATGA AGAATGCATT 540GCGCACACAC AGACACACAA AGCAGTACAG GTAAAGTATT GCAGCAATGA AGAATGCATT 540
ATCTTGGACT AGATATGAAT GCAAAGTTAG TCAGTTT 577ATCTTGGACT AGATATGAAT GCAAAGTTAG TCAGTTT 577
C2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17.C2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 17.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(Cl) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 396 párov bázCA) LENGTH. 396 base pairs
116 (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden116 (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
C11) TYP MOLEKULY. DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI.C11) MOLECULA TYPE. DNA (genomic) (ix) PROPERTIES.
(A) MENO/KLÚČ. exón (B) UMIESTENIE. 108..199 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 17.(A) NAME / KEY. exon (B) LOCATION. 108..199 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 17th
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(A) DĹŽKA. 519 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY. DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS (A) LENGTH. 519 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE. DNA (genomic) (ix) PROPERTIES.
(A) MENO/KLÚČ. exón (B) UMIESTENIE. 181..351 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 18.(A) NAME / KEY. exon (B) LOCATION. 181..351 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 18th
CTTACAAAGT TAATCATATC CCTTTCCCAC ATTGAAGTAT GATACCTCTT TATTCCAATC 60CTTACAAAGT TAATCATATC CCTTTCCCAC ATTGAAGTAT GATACCTCTT TATTCCAATC 60
AGATAACCCA TAATAAACTG GTATGGTGCG TGTCCACCAA TCCTAGCATT ATTAGGATGT 120AGATAACCCA TAATAAACTG GTATGGTGCG TGTCCACCAA TCCTAGCATT ATTAGGATGT 120
CCTCAATGTT GGCTAGTATG TAACCAGTTT AATTTCATCA TTGTCAACAA ATATCTACAG 180CCTCAATGTT GGCTAGTATG TAACCAGTTT AATTTCATCA TTGTCAACAA ATATCTACAG 180
ATGTGGTATT GCCCTGGATG CATGGATGTT tccactgggt GATGAAGTAT ATTCCAGAAT 240ATGTGGTATT GCCCTGGATG CATGGATGTT tccactgggt GATGAAGTAT ATTCCAGAAT 240
TCCTCAGCCC CTCTTTTTTA TCAACTCTGA ATATTTCCAA TATCCTGCTA ATATCATAAA 300TCCTCAGCCC CTCTTTTTTA TCAACTCTGA ATATTTCCAA TATCCTGCTA ATATCATAAA 300
AATGAAAAAA TGCTACTCAC CTGATAAAGA AAGAAAGATG ATTACAATCA GGTAAGTATT 360AATGAAAAAA TGCTACTCAC CTGATAAAGA AAGAAAGATG ATTACAATCA GGTAAGTATT 360
AGTGACTTAT TTCATTATGT GAAACAAACT TGAAGCTTGG GTAAATATCA ATCGATATCA 420AGTGACTTAT TTCATTATGT GAAACAAACT TGAAGCTTGG GTAAATATCA ATCGATATCA 420
TTTGGTAACT ATTAAAGAAT TGCTGAATTG GTTGTTTAGA CTTTGAATAA GGAGAGAATT 480TTTGGTAACT ATTAAAGAAT TGCTGAATTG GTTGTTTAGA CTTTGAATAA GGAGAGAATT 480
AGATAATCTC AGTTTCTAAG TACATTTAGT CTACTCTTTAGATAATCTC AGTTTCTAAG TACATTTAGT CTACTCTTT
519519
117 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 19.117 (2) INFORMATION ON SEO ID NO. 19th
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 569 párov báz (B) TYP. nukleová kyselinaCA) LENGTH. 569 base pairs (B) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cii) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)(Cii) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
C A) MENO/KLÚČ. exónC A) NAME / KEY. exon
CB) UMIESTENIE. 156..304CB) LOCATION. 156..304
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 19.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 19th
C2) INFORMÁCIE 0 SEO ID NO. 20.C2) INFORMATION 0 SEO ID NO. 20th
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.Ci) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
C A) DĹŽKA. 469 párov bázC A) LENGTH. 469 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cii) TYP MOLEKULY. DNA Cgenómová)(Cii) MOLECULA TYPE. DNA (Genomic)
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
C A) MENO/KLÚČ. exón CB) UMIESTENIE. 137..253C A) NAME / KEY. exon CB) LOCATION. 137..253
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 20.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 20th
GATACAGAGG CACATCGTCT CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA 60GATACAGAGG CACATCGTCT CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA 60
TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT GTTGATTAAC 120TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT GTTGATTAAC 120
ACTTTATATT TTATAGGACT TCATAAAGAT TTTGATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA 180ACTTTATATT TTATAGGACT TCATAAAGAT TTTGATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA 180
GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA CATCATGTTA 240GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA CATCATGTTA 240
118118
CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT 300CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT 300
GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG 360GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG 360
AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG 420AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG 420
GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT TTTCCCTTT 469GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA CTAAGAATTT TTTCCCTTT 469
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO: 21.C2) INFORMATION ON SEO ID NO: 21.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(Cl) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA. 1494 párov bázCA) LENGTH. 1494 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cii) TYP MOLEKULY: cDNACii) MOLECULA TYPE: cDNA
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. CDSCA) NAME / KEY. CDS
CB) UMIESTENIE. 117..1436CB) LOCATION. 117..1436
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 21.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 21st
GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC 60GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC
CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116
120120
CTC TGC TGC CTC 164CTC TGC TGC CTC 164
Leu Cys Cys LeuCys Leu
TCT TTT GAC TTC 212TCT TTT GAC TTC 212
Ser Phe Asp PheSer Phe Asp Phe
ATG TCT GCT GCC 260ATG TCT GCT GCC 260
Met Ser Ala AlaMet Ser Ala Ala
TCG TAC CCC GTC 308TCG TAC CCC GTC 308
Ser Tyr Pro ValSer Tyr Pro Val
AGC GTC TTC GTG 356AGC GTC TTC GTG 356
Ser Val Phe ValSer Val
GAC ACT GTT TGG 404GAC ACT GTT 404
Asp Thr Val TrpAsp Thr Val Trp
TTT CTT GGA ACA 452TTT CTT GGA ACA 452
Phe Leu Gly ThrPhe Leu Gly Thr
110110
GGT TCT CTG ACA 500GGT TCT CTG ACA 500
Gly Ser Leu ThrGly Ser Leu Thr
125125
113113
120120
TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG 1494TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG 1494
C 2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO. 22.C 2) INFORMATION ON SEQ ID NO. 22nd
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:C (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) DĹŽKA. 2191 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina(A) LENGTH. 2191 base pairs (B) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
Cii) TYP MOLEKULY. cDNA(Cii) MOLECULA TYPE. cDNA
Cix) VLASTNOSTI.CIX) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. CDSCA) NAME / KEY. CDS
CB) UMIESTENIE. 92..1423CB) LOCATION. 92..1423
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 22.Cxi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 22nd
CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG 60CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG 60
TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT 112TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G
Met Leu Pro Pro Lys Leu HisMet Leu Pro Lys Leu His
55
65 7065 70
121121
122122
AAA TCG ΑΑΤ ΤΤΑ GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA 1463AAA TCG ΑΑΤΤΑ GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA 1463
Lys Ser Asn Leu AspLys Ser Asn Leu Asp
440440
AAAATGTGTG TATGACTTTT AATATATTTT CTCAAATAAC TCATATTGGA AAATGTAGGC 1523AAAATGTGTG TATGACTTTT AATATATTTT CTCAAATAAC TCATATTGGA AAATGTAGGC 1523
TATCCCATAA AAGTGATTGA AGCTTGGACT AGGAGGTTTT TTTCTTTAAA GAAAGATTGG 1583TATCCCATAA AAGTGATTGA AGCTTGGACT AGGAGGTTTT TTTCTTTAAA GAAAGATTGG 1583
TGTCTATCGA AATCATGCCA GCCTAAATTT TAATTTTACT AAAATGATGC TGTGTCAAAA 1643TGTCTATCGA AATCATGCCA GCCTAAATTT TAATTTTACT AAAATGATGC TGTGTCAAAA 1643
TTAATAACTA CTTTTACATT CTTTAATGGA CAAGTATAAC AGGCACAAGG CTAATGAAAA 1703TTAATAACTA CTTTTACATT CTTTAATGGA CAAGTATAAC AGGCACAAGG CTAATGAAAA 1703
CGTGTTGCAA TGACATAACA ATCCCTAAAA ATACAGATGT TCTTGCCTCT TTTTTCTATT 1763CGTGTTGCAA TGACATAACA ATCCCTAAAA ATACAGATGT TCTTGCCTCT TTTTTCTATT 1763
ATAATTGAGT TTTAGCAACA TGTTATGCTA GGTAGAATTT GGAAGCACTT CCCTTTGACT 1823ATAATTGAGT TTTAGCAACA TGTTATGCTA GGTAGAATTT GGAAGCACTT CCCTTTGACT 1823
TTTGGTCATG ATAAGAAAAA TTAGATCAAG CAAATGATAA AAGCAGTGTT TTACCAAGGA 1883TTTGGTCATG ATAAGAAAAA TTAGATCAAG CAAATGATAA AAGCAGTGTT TTACCAAGGA 1883
TTAGGGATAC TGAACAATTT CACTATGGTA ACTGAATGGG GAGTGACCAA GGGTAAAAAT 1943TTAGGGATAC TGAACAATTT CACTATGGTA ACTGAATGGG GAGTGACCAA GGGTAAAAAT 1943
ATTAAAGCCA AGGCAAAGGC AGCAGATTAG AATGGATTAA AGAGAGTTTA TAATTTGTTT 2003ATTAAAGCCA AGGCAAAGGC AGCAGATTAG AATGGATTAA AGAGAGTTTA TAATTTGTTT 2003
GCATTTACTT GATGGTTTAT CTCATGGATT CATGAGTCAA GAAAGGTGCG TAGGACAGGC 2063GCATTTACTT GATGGTTTAT CTCATGGATT CATGAGTCAA GAAAGGTGCG TAGGACAGGC 2063
CAGGGATTCC AGTTATAACA CATTATTCAC CCAAAGGGTT CTTTAATTCT GTATGAGTAT 2123CAGGGATTCC AGTTATAACA CATTATTCAC CCAAAGGGTT CTTTAATTCT GTATGAGTAT 2123
TGGGAGTGGA TTAGCACAAT AGAGGCATAT GTTGCTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2183TGGGAGTGGA TTAGCACAAT AGAGGCATAT GTTGCTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2183
123123
ΑΑΑΑΆΑΑΑ 2191 (2) INFORMÁCIE Ο SEO ID NO.· 23« (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.ΑΑΑΑΆΑΑΑ 2191 (2) INFORMATION Ο SEO ID NO. · 23 «(1) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 1533 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden(A) LENGTH. 1533 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (ix) VLASTNOSTI.CD) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE: protein (ix) CHARACTERISTICS.
CA) MENO/KLÚČ. CDS C B) UMIESTENIE. 62..1394 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 23«CA) NAME / KEY. (B) LOCATION. 62..1394 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 23 «
CCGCGAGCAG TTCACCGCGG CGTCCGGAAG GTTAAGCTGA AACGGCAGCT CAGCTTCGGA 60CCGCGAGCAG TTCACCGCGG CGTCCGGAAG GTTAAGCTGA AACGGCAGCT CAGCTTCGGA 60
G ATG TTA CCG TCC AAA TTG CAT GCG CTT TTC TGC CTC TGC ACC TGC 106G ATG TTA CCG TCC AAA TTG CAT
Met Leu Pro Ser Lys Leu His Ala Leu Phe Cys Leu Cys Thr CysMet Leu Pro Lys Leu His Ala Leu Phe Cys Leu Cys Thr Cys
10 1510 15
124124
145 150 155145 150 155
385 390 395385 390 395
125125
CAG AAA GAT TTT GAT CAG TGG GAT TCT TTA GTT GAA GGC GAA GAT CAC 1306CAG AAA GAT TTT GAT CAG TGG GAT TCT TTA GTT
Gin Lys Asp Phe Asp Gin Trp Asp Ser Leu Val Glu Gly Glu Asp HlsGin Lys Asp Phe Asp Gin Asp Ser Leu Val Glu Gly Glu Asp Hls
400 405 410 415(+420) 400 405 410 415
AAT CTT ATT CCA GGG ACC AAC ATT AAC ACA ACC AAC CAC CAA GCC ATT 1354AAT CTT ATT CCA GGG ACC AAC ATT AAC ACA ACC AAC CAC CAA GCC ATT 1354
Asn Leu íle Pro Gly Thr Asn íle Asn Thr Thr Asn His Gin Ala íleAsn Leu White For Gly Thr Asn White Asn Thr White Asn His Gin Ala White
420 425 430420 425 430
CTG CAG AAC TCC ACA GGA ATA GAG AGA CCA AAT TTA GAT T AAAAGAGCTT 1404 Leu Gin Asn Ser Thr Gly íle Glu Arg Pro Asn Leu AspCAG AAC TCC ACA GGA ATA GAG AGA CCA AAT TTA GAT T AAAAGAGCTT 1404 Leu Gin Asn Ser Thr Gly White Glu Arg Pro Asn Leu Asp
435 440435 440
TTTAAAAAGT TTTGTTTACG AACTTGTCTA AAAGTGTGTG TGTGTATGAT TTAAATGTAT 1464TTTAAAAAGT TTTGTTTACG AACTTGTCTA AAAGTGTGTG TGTGTATGAT TTAAATGTAT 1464
TTTCTCAAAT AGCTCATATT AAAAAATGTA GGCTATAGCA CAAAAAAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 1524TTTCTCAAAT AGCTCATATT AAAAAATGTA GGCTATAGCA CAAAAAAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 1524
ΑΑΑΆΆΑΑΆΑ 1533ΑΑΑΆΆΑΑΆΑ 1533
C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NOs 24.C 2) INFORMATION ON SEO ID NOs 24.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 1876 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden(A) LENGTH. 1876 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
C11) TYP MOLEKULY, proteín (lx) VLASTNOSTI.C11) MOLECULA TYPE, protein (1x) PROPERTIES.
CA) MENO/KLÚČ. CDSCA) NAME / KEY. CDS
CB) UMIESTENIE. 468..1734CB) LOCATION. 468..1734
Cxl) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 24.Cxl) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 24th
CGGCGGGCTG CTGGCCCTTC CCGGCTGTTC GTAGAGCCGG ATCCTGCAGC GCCCCTGAGA 60CGGCGGGCTG CTGGCCCTTC CCGGCTGTTC GTAGAGCCGG ATCCTGCAGC GCCCCTGAGA 60
CGAACCGCCC CGATGCGGTG CTCCTCAGCG CCACGGGACG CAGCCGGGGC CGGCCGTGTT 120CGAACCGCCC CGATGCGGTG CTCCTCAGCG CCACGGGACG CAGCCGGGGC CGGCCGTGTT 120
GGCGCAGCTC CCACGACGTA CGCTTCCTTT CCAGGCTCGA GGAAAGCCTC TCCCACAAAC 180GGCGCAGCTC CCACGACGTA CGCTTCCTTT CCAGGCTCGA GGAAAGCCTC TCCCACAAAC 180
ACCGTCCCAG CTGGGAAGTG AGGCGGAGTT TTGGTCCCTC CCCTCCGGCA GCGCCCGGCA 240ACCGTCCCAG CTGGGAAGTG AGGCGGAGTT TTGGTCCCTC CCCTCCGGCA GCGCCCGGCA 240
TTCCGTCCGT CCGTCCGTCC GTCCGTGCGG CGCACGGCGC CCTGCAGAGC CGGGACACCG- 300TTCCGTCCGT CCGTCCGTCC GTCCGTGCGG CGCACGGCGC CCTGCAGAGC CGGGACACCG- 300
CAGCAGGGTA GGAGGACCCG GAGGTGGTGT GCAGCCACAG GTTTCCATCC TGCCCCCACC 360CAGCAGGGTA GGAGGACCCG GAGGTGGTGT GCAGCCACAG GTTTCCATCC TGCCCCCACC 360
TCCCGGGGAG CAGCCCTGTG CTATACCCAA CCCCCCGCAC AGAGCACTGA GCCGGCTGCT 420TCCCGGGGAG CAGCCCTGTG CTATACCCAA CCCCCCGCAC AGAGCACTGA GCCGGCTGCT 420
GCCTGCCTGC ACCCCGCCGT GGGACCTTCT GCTCTTCCCA ACAAGTG ATG GCA TCG 476GCCTGCCTGC ACCCCGCCGT GGGACCTTCT GCTCTTCCCA ACAAGTG ATG GCA TCG 476
Met Ala SerMet. Ala Ser
CTG TGG GTG AGA GCC AGG AGG GTG TTC ATG AAA AGT CGT GCT TCA GGT 524GTC AGG GTC AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG AGG
Leu Trp Val Arg Ala Arg Arg Val Phe Met Lys Ser Arg Ala Ser GlyLeu Trp Val Arg
10 1510 15
TTC TCG GCG AAG GCG GCG ACG GAG ATG GGG AGC GGC GGC GCG GAG AAG 572TTC TCG GCG AAG GCG GCG ACG GAG ATG GGG AGC GGC GGC GCG GAG AAG 572
126126
127127
260 265 270 275260 265 270 275
405 410 415405 410 415
CCA ACT GAG T AAGGAGTACA AGAAGTACTG CAAAGGCCAC CAGCAGCAGG 1774CCA ACT GAG T AAGGAGTACA AGAAGTACTG CAAAGGCCAC CAGCAGCAGG 1774
Pro Thr GluFor Thr Glu
420420
ACACCAACGT TGGCCACACA TTGCTTGGAG CTGAGATAGC ACTGGCCTCC CACACAGCTT 1834ACACCAACGT TGGCCACACA TTGCTTGGAG CTGAGATAGC ACTGGCCTCC CACACAGCTT 1834
TTGGAGTGTG AAACAACAAA AAAAAAAATC ACAGGGGAGC CG 1876TTGGAGTGTG AAACAACAAA AAAAAAAATC ACAGGGGAGC CG 1876
C 2) INFORMÁCIE O SEO ID NO: 25.C 2) INFORMATION ON SEO ID NO: 25.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE. (A) DĹŽKA: 517 párov báz(1) SEQUENCE CHARACTERISTICS. (A) LENGTH: 517 base pairs
CB) TYP. nukleová kyselinaCB) TYPE. nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA: lineárnaCD) TOPOLOGY: linear
C11) TYP MOLEKULY. cDNAC11) MOLECULA TYPE. cDNA
Clx) VLASTNOSTI.Clx) CHARACTERISTICS.
C A) MENO/KC.ÚČ. CDS CB) UMIESTENIE: 2..514C A) NAME / KC.ÚČ. CDS CB) LOCATION: 2..514
128128
Cxl) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 25.Cxl) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEO ID NO. 25th
G GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GTT TTT CAA GCC CTA AGT GAA 46GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GTT TTT CAA
Gly Hls Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Phe Gin Ala Leu Ser GluGly Hls Ser Phe
10 1510 15
160 165 170160
C2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 26»C2) SEO ID NO. 26 »
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.C (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
CA) DĹŽKA» 580 párov bázCA) 580 base pairs
CB) TYP» nukleová kyselinaCB) TYPE »nucleic acid
CC) POČET REŤAZCOV, jedenCC) NUMBER OF CHAINS, one
CD) TOPOLÓGIA. lineárnaCD) TOPOLOGY. straight
C11) TYP MOLEKULY. cDNAC11) MOLECULA TYPE. cDNA
Clx) VLASTNOSTI.Clx) CHARACTERISTICS.
C A) MENO/KLIJČ. CDSC A) NAME / KEY. CDS
129 (B) UMIESTENIE. 1..580 (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO. 26.129 (B) LOCATION. 1..580 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEO ID NO. 26th
180 185 190180 185 190
CTG A 580CTG A 580
Leu (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 27.Leu (2) INFORMATION ABOUT SEO ID NO. 27th
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.Ci) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
130 (A) DĹŽKA: 5 aminokyselín CB) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27:130 (A) LENGTH: 5 amino acids CB) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:
Gly Xaa Ser Xaa GlyGly Xaa Gly Xaa Ser
5 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 28:5 (2) INFORMATION ON SEO ID NO. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 41 párov báz (B) TYP« nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO: 28.(A) LENGTH. 41 base pairs (B) TYPE «nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE. DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO: 28.
TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G 41 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO. 29.TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G 41 (2) INFORMATION ON SEO ID NO. 29th
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA. 32 párov báz (B) TYP« nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO: 29.(A) LENGTH. 32 base pairs (B) TYPE «nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULA TYPE. DNA (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO: 29.
ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG 32 (2) INFORMÁCIE O SEO ID NO: 30.ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG 32 (2) SEO ID NO: 30.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) DĹŽKA: 1335 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV, jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY. cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO. 30:(A) LENGTH: 1335 base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) NUMBER OF STRINGS, one (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE. cDNA (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE. SEQ ID NO. 30:
ATGGTACCCC CAAAGCTGCA CGTCCTGTTT TGTCTGTGTG GATGTCTCGC CGTCGTGTAC 60ATGGTACCCC CAAAGCTGCA CGTCCTGTTT TGTCTGTGTG GATGTCTCGC CGTCGTGTAC 60
CCCTTCGATT GGCAGTATAT CAACCCCGTG GCTCACATGA AGAGCAGCGC CTGGGTGAAT 120CCCTTCGATT GGCAGTATAT CAACCCCGTG GCTCACATGA AGAGCAGCGC CTGGGTGAAT 120
AAGATCCAGG TGCTCATGGC CGCACCAAGC TTCGGTCAGA CCAAGATTCC TAGAGGCAAC 180AAGATCCAGG TGCTCATGGC CGCACCAAGC TTCGGTCAGA CCAAGATTCC TAGAGGCAAC 180
GGCCCCTACA GCGTGGGCTG CACCGATCTG ATGTTCGACC ATACCAACAA AGGAACTTTT 240GGCCCCTACA GCGTGGGCTG CACCGATCTG ATGTTCGACC ATACCAACAA AGGAACTTTT 240
131131
AATTAGGATT CTAGAAATTAGGATT CTAGA
Claims (13)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/US1997/014212 WO1999009147A1 (en) | 1997-08-13 | 1997-08-13 | Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK47399A3 true SK47399A3 (en) | 2000-11-07 |
SK286518B6 SK286518B6 (en) | 2008-12-05 |
Family
ID=22261441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK473-99A SK286518B6 (en) | 1997-08-13 | 1997-08-13 | Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0948605A1 (en) |
JP (1) | JP2001502163A (en) |
AU (1) | AU751594B2 (en) |
BR (1) | BR9711882A (en) |
CA (1) | CA2267994C (en) |
CZ (1) | CZ297603B6 (en) |
HU (1) | HUP9903959A3 (en) |
IL (3) | IL129262A0 (en) |
NO (1) | NO326968B1 (en) |
PL (1) | PL190532B1 (en) |
SK (1) | SK286518B6 (en) |
WO (1) | WO1999009147A1 (en) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0658205B1 (en) | 1993-06-25 | 2000-03-15 | Smithkline Beecham Plc | Lipoprotein associated phospholipase a2, inhibitors thereof and use of the same in diagnosis and therapy |
WO2001053529A2 (en) * | 2000-01-20 | 2001-07-26 | Genome Therapeutics Corporation | RAPID DETERMINATION OF GENE STRUCTURE USING cDNA SEQUENCE |
CN103891709A (en) * | 2012-12-24 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | Cell cryopreservation liquid and cell cryopreservation method |
CN112575057B (en) * | 2020-12-11 | 2021-07-30 | 深圳上泰生物工程有限公司 | Composition and application thereof in detecting activity of lipoprotein-associated phospholipase A2 |
WO2022120784A1 (en) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 深圳上泰生物工程有限公司 | Composition and application thereof in detecting activity of lipoprotein-related phospholipase a2 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0658205B1 (en) * | 1993-06-25 | 2000-03-15 | Smithkline Beecham Plc | Lipoprotein associated phospholipase a2, inhibitors thereof and use of the same in diagnosis and therapy |
ES2159573T3 (en) * | 1993-10-06 | 2001-10-16 | Icos Corp | ACETILHIDROLASA OF THE PLATE ACTIVATOR FACTOR. |
CA2233300A1 (en) * | 1995-09-29 | 1997-04-10 | Christopher Donald Southan | A paf-acetylhydrolase and use in therapy |
EP0853673A1 (en) * | 1995-09-29 | 1998-07-22 | Smithkline Beecham Plc | COMPOUND HAVING SEQUENCE HOMOLOGY WITH LIPOPROTEIN ASSOCIATED PHOSPHOLIPASE A2 (Lp-PLA2)/PAF ACETYL HYDROLASE |
JPH1017600A (en) * | 1996-06-28 | 1998-01-20 | Suntory Ltd | Blood platelet activating factor acetyl hydrolase and its gene |
-
1997
- 1997-08-13 PL PL97332833A patent/PL190532B1/en unknown
- 1997-08-13 EP EP97937217A patent/EP0948605A1/en not_active Withdrawn
- 1997-08-13 WO PCT/US1997/014212 patent/WO1999009147A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-13 BR BR9711882-6A patent/BR9711882A/en not_active Application Discontinuation
- 1997-08-13 AU AU39782/97A patent/AU751594B2/en not_active Expired
- 1997-08-13 CZ CZ0124199A patent/CZ297603B6/en not_active IP Right Cessation
- 1997-08-13 JP JP10509976A patent/JP2001502163A/en active Pending
- 1997-08-13 HU HU9903959A patent/HUP9903959A3/en unknown
- 1997-08-13 CA CA002267994A patent/CA2267994C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-13 IL IL12926297A patent/IL129262A0/en active IP Right Grant
- 1997-08-13 SK SK473-99A patent/SK286518B6/en not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-30 IL IL129262A patent/IL129262A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-04-12 NO NO19991717A patent/NO326968B1/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-21 IL IL173867A patent/IL173867A0/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0948605A1 (en) | 1999-10-13 |
AU3978297A (en) | 1999-03-08 |
PL332833A1 (en) | 1999-10-11 |
NO991717L (en) | 1999-06-11 |
HUP9903959A2 (en) | 2000-03-28 |
CZ124199A3 (en) | 2000-06-14 |
CA2267994C (en) | 2005-04-12 |
BR9711882A (en) | 1999-09-21 |
IL129262A0 (en) | 2000-02-17 |
SK286518B6 (en) | 2008-12-05 |
NO991717D0 (en) | 1999-04-12 |
PL190532B1 (en) | 2005-12-30 |
IL173867A0 (en) | 2006-07-05 |
CZ297603B6 (en) | 2007-02-07 |
CA2267994A1 (en) | 1999-02-25 |
JP2001502163A (en) | 2001-02-20 |
IL129262A (en) | 2006-06-11 |
AU751594B2 (en) | 2002-08-22 |
HUP9903959A3 (en) | 2002-01-28 |
WO1999009147A1 (en) | 1999-02-25 |
NO326968B1 (en) | 2009-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0673426B1 (en) | Platelet-activating factor acetylhydrolase | |
US10111937B2 (en) | Method of reducing accumulation of intracellular tingible body macrophages | |
US6045794A (en) | Platelet-activating factor acetylhydrolase | |
US6203790B1 (en) | Platelet-activating factor acetylhydrolase | |
BG64798B1 (en) | Polypeptides encoded by a human lipase-like gene, compositions and methods | |
US5847088A (en) | Antibodies specific for platelet-activating factor acetylhydrolase | |
SK47399A3 (en) | Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase | |
US5656431A (en) | Platelet-activating factor acetylhydrolase | |
RU2207875C2 (en) | Accelerated acetyl hydrolase of platelet activation factor | |
KR20000068780A (en) | Truncated platelet-activating factor acetylhydrolase | |
JP2009005705A (en) | Platelet-activating factor acetylhydrolase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Expiry of patent |
Expiry date: 20170813 |