SK283485B6

SK283485B6 - Deriváty parathormónu, spôsob ich prípravy a farmaceutické kompozície, ktoré ich obsahujú

Info

Publication number: SK283485B6
Application number: SK43-95A
Authority: SK
Inventors: Wilfried Bauer; Robin Breckenridge; Francois Cardinaux; Frank Gombert; Hermann Gram; Paul Ramage; Helmut Schneider; Rudolf Waelchli; Rainer Albert; Ian Lewis
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1993-07-06
Publication date: 2003-08-05
Also published as: EP0672057B1; NO950123D0; SG63625A1; EP0672057A1; US20050009147A1; AU4156693A; AU672790B2; HU9500115D0; CN1099801A; SK4395A3; ES2150948T3; DE4393381T1; KR100321651B1; CZ286889B6; WO1994002510A3; HU211856A9; CN1051769C; CH688195A5; FI113872B; US20080318838A1

Abstract

Sú opísané deriváty parathormónu vykazujúce aktivitu podobnú PTH, ktoré obsahujú aspoň jednu modifikáciu, ktorá spočíva v tom, že 1) je ku koncovej aminoskupine PTH a/alebo k jednej, alebo niekoľkým aminoskupinám bočných reťazcov PTH naviazaný aspoň jeden organický zvyšok, alebo 2) je aspoň jedna alfa-aminokyselinová jednotka v polohách 1 až 38 prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie PTH nahradená prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinovou jednotkou prípadne v chránenej forme, pričom alfa-aminokyselinové jednotky prítomné v polohách 1 a 2 na N-konci sekvencie PTH môžu byť spoločne nahradené pseudopeptidom, alebo kombináciou týchto modifikácií. Ďalej sú opísané spôsoby výroby týchto derivátov, najmä použitím techník génového inžinierstva a farmaceutické kompozície s ich obsahom. ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka variantov parathormónu (paratyroidného hormónu PTH), spôsobu ich prípravy a farmaceutických kompozícií, ktoré ich obsahujú a ich použitia ako liečiva.

Doterajší stav techniky

Parathormón sa syntetizuje v prištítnej žľaze a má dôležitú úlohu pri kontrole koncentrácie vápnika v krvi alebo koncentrácie iónov kyseliny fosforečnej s účinkom na kosti, obličky a črevá. PTH je peptidový hormón, ktorý pozostáva z 84 aminokyselín a jeho biologické pôsobenie sa môže reprodukovať peptidovým fragmentom N-koncovej (1-34 aminokyselina) časti, G.W. Tregear et al., Endocrinology93,1349-1353 (1973).

Dokument G.W. Tregear et al.: Synthetic analogues of residues 1-34 of human parathyroid hormone: Influence of residues number 1 on biologicai potency in vitro; Endocrine Research Comm. 1975, 2(8) 561-570, sa týka biologicky aktívneho tetratriacontapeptidu ľudského parathormónu hPTH (1-34) a série štruktúrnych analógov, ktoré zahŕňajú zmeny na N-aminokoncovom zvyšku, pričom sa skúma dopad týchto zmien na aktivitu peptidu.

Dokument S.A. Rabbani et al.: Recombinant human parathyroid hormone synthesised in E. coli, J. Biol. Chem. 1988, 263(3), 1307-1313, sa týka rekombinantného hPTH, ktorý je exprimovaný v E. coli, ktoré nesú plazmid so syntetickým génom pre hPTH pod kontrolou lac promótora.

Dokument F.E. Cohen et al.: Analogues of parathyroid hormone modified at positions 3 a 6, J. Biol. Chem. 1991, 266(3), 1997-2004, sa zaoberá novými analógmi bovinného PTH (bPTH) a dopadom modifikácii na väzbu na receptor a aktiváciu adenyleyklázy v obličke a kosti.

Dokument E. Roubini et al.: Synthesis of fully active biotinylated analogues of parathyroid hormone and parathyroid hormonerelated proteín as tools for the characterisation of parathyroid hormone receptors, Biochemistry 1992, 31, 4026-4033, sa týka biotinylovaných analógov PTH a PTHrP (PTH related proteín) a ich rádioaktívne značených derivátov, ktoré slúžia ako vhodný nástroj na identifikáciu a izoláciu PTH receptorov.

Dokumenty WO 90/10067 a EP prihláška 91116303.8 sa zaoberajú derivátmi a variantami PTH, ich prípravou a použitím v terapii.

V dokumente WO 92/11286 ide o metionínom substituované varianty parathormónu, ktoré vzhľadom na ich prírodné náprotivky majú zníženú citlivosť na oxidáciu a značnú PTH aktivitu. Opisuje sa ich príprava pomocou rekombinantných techník založených na DNA a ich terapeutické použitie.

Podstata vynálezu

Termín „PTH^;‘, ktorý sa tu používa, označuje akúkoľvek geneticky kódovanú formu parathormónu, vrátane maturovanej formy obsahujúcej 84 aminokyselín PTH určitého druhu stavovca, napríklad ľudského, prasačieho, potkanieho, hovädzieho alebo kuracieho PTH, a ich fragmentov, ako aj ich analógov a derivátov, ktoré majú aktivitu podobnú PTH. Poloha každej aminokyseliny obsiahnutej v sekvencii PTH sa čísluje podľa medzinárodne uznávaného postupu. Z dôvodov jednotnosti, ako je to bežné, sa v nasledujúcom texte používa rovnaký systém číslovania aminokyselín sekvencie PTH nezávisle od substitúcií v molekule.

Konkrétne vynález opisuje deriváty parathormónu majúce aktivitu podobnú PTH a obsahujúce aspoň jednu modifikáciu, táto modifikácia spočíva buď v tom, že (1) je ku koncovej aminoskupine PTH alebo zlúčenine na báze PTH naviazaný aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej L- a D- -aminokyseliny, alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, a pripadne substituované alkylové skupiny s 1 az 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny a cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, a/alebo je k jednej alebo niekoľkým aminoskupinám bočných reťazcov PTH alebo zlúčeniny na báze PTH naviazaný aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, a prípadne substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny a cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkyiovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, alebo (2) je aspoň jedna ct-aminokyselinová jednotka v polohách 1 až 38 prirodzene sa vyskytujúcej sekvencie PTH nahradená prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinovou jednotkou prípadne v chránenej forme, pričom a-aminokyselinové jednotky prítomné v polohách 1 a 2 na N-konci sekvencie PTH môžu byť spolu nahradené pseudopeptidom, alebo kombináciou týchto modifikácií, s tým, že pokiaľ derivát PTH neobsahuje D- alebo L-a-aminokyselinu naviazanú na N-koniec alebo alkoxykarbonylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alebo prípadne substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylovú skupinu, aralkenylovú skupinu či cykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu v cykloalkyiovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, ide o inú zlúčeninu ako je PTH obsahujúcu prirodzene sa vyskytujúcu sekvenciu a-aminokyselín, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH(l-34), v ktorom

i. je α-aminokyselinou v polohe 1 Gly, D-Ser, D-Ala alebo Tyr, alebo ii. je α-aminokyselinou v polohe 2 Ala, D-Val, Lys, Arg alebo Cit a α-aminokyselinou v polohe 34 je Tyr, alebo je α-aminokyselinou v polohe 2 D-Val a a-aminokyselinou v polohe 34 D-Tyr a prípadne je každá z a-aminokyselín v polohách 8 a 18 Nie, alebo iii. sú α-aminokyseliny v polohách 3 a/alebo 6, a/alebo 9 nahradené prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinou, alebo iv. je α-aminokyselina v polohe 23 nahradená Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Gly, His, íle, Lys, Met, Pro, Ser alebo Thr, alebo

v. je a-aminokyselina v polohe 25 a/alebo 26, a/alebo 27 nahradená Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr alebo Val, alebo vi. je každá z α-aminokyselín v polohách 8 a 18 Nie alebo Met(O) a prípadne je α-aminokyselinou v polohe 34 Tyr, alebo je každá z α-aminokyselin v polohách 8 a 18 Nie a α-aminokyselinou v polohe 34 je Tyr a buď je a-aminokyselinou v polohe 12 L- alebo D-Pro, L- alebo D-Ala,

Aib alebo NMeGly, alebo je α-aminokyselinou v polohe 23 Phe, Leu, Nie, Val, Tyr, α-Nal alebo B-Nal, alebo vii. je α-aminokyselinou v polohe 28 Lys a a-aminokyselinou v polohe 30 Leu, alebo viii. je α-aminokyselinou v polohe 1 Aib, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Leu, íle, Val, Phe alebo Trp, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 11 Ser, Lys, Phe, β-Nal, Trp alebo Tyr, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-B-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(9-fluorenylmetoxykarbonyl), D-Phe alebo D-Asn, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 13 Leu, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 19 a/alebo v polohe 21 Arg, Lys, Asn alebo His, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 23 2-(l ,3-ditiolan-2-yl)Trp, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 25 a/alebo v polohe 26 His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 27 Gin alebo Leu, alebo ix. je α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Ala alebo Ser, alebo je α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Ala, Val, Leu, íle, Ser alebo Trp a α-aminokyselinou v polohe 34 Tyr, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH(l-84), v ktorom

i. je α-aminokyselinou v polohe 1 Tyr, Val, Pro, Asp alebo Cys, alebo ii. je α-aminokyselinou v polohe 2 Ala, Glu, Leu, Ser alebo Arg, alebo iii. sú α-aminokyseliny v polohe 3 a/alebo 6, a/alebo 9 nahradené prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinou, alebo i v. je α-aminokyselina v polohe 23 nahradená Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, íle, Lys, Met, Pro, Ser alebo Thr, alebo

V. je α-aminokyselina v polohe 25 a/alebo 26, a/alebo 27 nahradená Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, íle, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr alebo Val, alebo vi. je α-aminokyselinou v polohe 8 Met, Met(O), Ala, Val, Leu, íle, Ser, Trp, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr alebo Gly a α-aminokyselinou v polohe 18 Leu, alebo je a-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Ala, Val, Leu, íle, Ser alebo Trp, a prípadne je α-aminokyselinou v polohe 34 Tyr, alebo je α-aminokyselinou v polohe 8 a v polohe 18 vždy Met(O), alebo je α-aminokyselinou v polohe 8 Leu a α-aminokyselinou v polohe 18 Met(O), alebo vii. je α-aminokyselinou v polohe 26 Gin, pričom ide o inú zlúčeninu ako je Pro°PTH(l-84) alebo [Met⁰, Leu⁸, Leu^ls]PTH(l-84), alebo ide o iný derivát PTH ako je hPTH(l-36), v ktorom je a-aminokyselinou v polohe 36 Leu, vo voľnej forme alebo vo forme soli či vo forme komplexu.

Ak je sekvencia PTH odvodená od fragmentu PTH, ide o fragment PTH majúci aktivitu podobnú PTH a obsahujúci aspoň prvých 27 N-koncových aminokysclinových jednotiek PTH, výhodne až prvých 38 N-koncových aminokyselinových jednotiek PTH, napríklad 1-34 až 1-38, napríklad 1-34, 1-36, 1-37 alebo 1-38 PTH, pričom je aspoň jedna z α-aminokyselín nahradená podľa vynálezu. Môže byť tiež vynechaná jedna alebo niekoľko α-aminokyselinových jednotiek normálne prítomných v prirodzene sa vyskytujúcej sekvencií PTH. Výhodné sú fragmenty hPTH, najmä hPTH(l-34)ahPTH(l-36).

C-koncom derivátu ΡΤΉ môže byť karboxylová skupina, esterifikovaná karboxylová skupina, napríklad skupina -COOR_a, kde R_a predstavuje nižšiu alkylovú skupinu, napríklad alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, karba moylovú skupinu alebo mono-, či disubstituovaný amid, napríklad skupina -CONR_bfL, kde jeden zo symbolov R_b a Rc znamená atóm vodíka a druhý predstavuje alifatický zvyšok, napríklad alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alebo oba tieto symboly znamenajú vždy alifatický zvyšok, alebo R_b a R_c spolu s atómom dusíka, na ktorý sa viažu, tvoria heterocyklický zvyšok, napríklad pyrolidinylovú alebo piperidinylovú skupinu.

Ďalej budú tieto zlúčeniny označované ako zlúčeniny podľa vynálezu.

„Prirodzené aminokyseliny“ sú v odbore dobre známe. Sú uvedené spolu so štandardnými skratkami v publikácii U.S.P. T.O., Trademark Oficial Gazette, publikované 15. mája 1990, str. 33 až 46.

Prirodzené aminokyseliny sú uvedené nižšie:

A	Ala	alanín
D	Asp	kyselina asparagová
E	Glu	kyselina glutamová
F	Phe	fenylalanín
G	Gly	glycín
H	His	histidín
I	íle	izoleucín
K	Lys	lyzín
L	Leu	leucín
M	Met	metionín
N	Asn	asparagín
Q	Gin	glutamín
R	Arg	arginín
S	Ser	serin
T	Thr	treonín
V	Val	valín
W	Trp	tryptofán
Y	Tyr	tyrozín

Termín „neprirodzená aminokyselinová jednotka“ označuje aminokyselinovú jednotku, ktorá nie je geneticky kódovaná. Medzi príklady neprirodzených aminokyselinových jednotiek patria napríklad D-izoméry prirodzených a-aminokyselín, ako sú uvedené skôr, Aib (kyselina aminoizomaslová), bAib (kyselina aminoizomaslová), Nva (norvalín), B-Ala, Aad (kyselina 2-aminoadipová), bAad (kyselina 3-aminoadipová), Abu (kyselina 2-aminomaslová), Gaba (kyselina γ-aminomaslová), Acp (kyselina 6-aminokaprová), Dbu (kyselina 2,4-diaminomaslová), TMSA (trimctylsilyl-Ala), alle (alloisoleucín), Nie (norleucín), terc.Leu, Cit (citrulín), Om, Dpm (kyselina 2,2‘-diaminopimelová), Dpr (kyselina 2,3-diaminopropionová), a- alebo B-Nal, Cha (cyklohexyl-Ala), hydroxyprolín, Sar (sarkozín) a podobne, cyklické aminokyselinové jednotky a N-alkylované aminokyselinové jednotky, napríklad MeGly (N-metylglycín), EtGly (N-etylglycín), EtAsn (N-etylasparagín).

Termín aminokyselina v chránenej forme označuje prirodzenú alebo neprirodzenú aminokyselinu, ktorá ma napríklad bočný reťazec obsahujúci heteroatóm, ako je kyslík, síra alebo dusík, ktorý môže byť chránený chrániacou skupinou pre kyslík, síru alebo dusík. N-koniec derivátu PTH podľa vynálezu môže byť tiež v chránenej forme.

Medzi chrániace skupiny pre dusík, ako môžu byť prítomné na aminoskupinách aminokyselinových jednotiek na N-konci alebo v bočných reťazcoch, patria skupiny, ako sú napríklad opísané v práci „Protective Groups in Organic Synthesis“, T.W. Greene, J. Wiiey and Sons NY (1981), 219 - 287, napríklad acylová skupina, ako je formylová skupina, acetylová skupina, trifluóracetylová skupina, me toxysukcinylová skupina, hydroxysukcinylová skupina alebo benzoylová skupina prípadne substituovaná na fenylovom kruhu napríklad p-metoxykarbonylovou skupinou, p-metoxyskupinou, p-nitroskupinou alebo p-fenylsulfónamidokarbonylovou skupinou; alkoxykarbonylová skupina ako je terc.-butyloxykarbonylová skupina, izobutyloxykarbonylová skupina alebo metoxykarbonylová skupina; alyloxykarbonylová skupina; tritylová skupina; 2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonylová skupina; arylmetoxykarbonylová skupina ako je 9-fluorenylmetoxykarbonylová skupina alebo benzyloxykarbonylová skupina prípadne substituovaná na fenylovom kruhu p-metoxyskupinou, p-nitroskupinou, atómom chlóru v polohe orto alebo para, m-fenylovou skupinou alebo dvomi metylovými skupinami, a to v polohe 3 a 4; arylmetylová skupina ako je benzylová skupina prípadne substituovaná na kruhu p-metoxyskupinou, p-nitroskupinou alebo atómom chlóru v polohe para; alebo arylsulfonylová skupina, ako je fenylsulfonylová skupina prípadne substituovaná na kruhu p-metylovou alebo p-metoxyskupinou, alebo naftylsulfonylová skupina prípadne substituovaná na kruhu napríklad aminoskupinou alebo dialkylaminoskupinou obsahujúcou v každej alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka.

Chrániace skupiny pre kyslík v bočných reťazcoch obsahujúcich kyslík sú napríklad opísané v práci „The Peptides“, 3, (1981), E. Gross a J. Meinhofer (Ed.). Pre alifatické hydroxylové funkcie sú vhodné chrániace skupiny kyslíka, napríklad opísané v uvedenej práci v „Protection of the Hydroxy Groups“, J.M. Stewart, 169 - 201 a patrí medzi ne benzylová skupina, terc .butylovú skupina a metylová skupina. Medzi vhodné chrániace skupiny pre kyslík v prípade aromatických hydroxylových funkcií patrí benzylová skupina, terc.-butylová skupina, metylová skupina, tosylová skupina a benzyloxykarbonylová skupina. Chrániacimi skupinami pre kyslík v prípade karboxylových funkcii na aminokyselinových bočných reťazcoch sú dobre známe esterové skupiny opísané napríklad v práci „The Peptides“, 3,101 -135 (R. W. Roeske, „Carboxyl Protecting Groups“) a patria medzi ne metylová skupina, etylová skupina, terc.butylová skupina a benzylová skupina. Chrániace skupiny pre síru v prípade tiolových funkcií na aminokyselinových bočných reťazcoch sú známe a opísané napríklad v práci „The Peptides“, 3, 137 - 167 (R. G.Hiskey, „Sulfhydryl Group Protection“). Medzi príklady patrí metylová skupina, terc, butylová skupina, benzylová skupina, pmetoxyfenylmetylová skupina, etylaminokarbonylová skupina a benzyloxykarbonylová skupina.

Podľa vynálezu môžu deriváty PTH niesť na svojej koncovej aminoskupine aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny zahŕňajúcej L- alebo D-a-aminokyseliny, alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, a prípadne substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny a cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, a/alebo na jednej alebo niekoľkých aminoskupinách bočných reťazcov aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, a prípadne susbtituované alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny a cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka. Pokiaľ je takáto skupina naviazaná na aminoskupinu bočného reťazca, nachádza sa výhodne na ε-amino skupine jednotky Lys. Výhodnými substituentmi alkylovej, alkenylovej, aralkylovej, aralkenylovej alebo cykloalkylalkylovej skupiny sú hydroxylová skupina, aminoskupina, a v prípade arylového zvyšku tiež halogén a/alebo alkoxylová skupina s l až 4 atómami uhlíka. Alkylová skupina alebo alkylový zvyšok môže byť lineárny alebo s rozvetveným reťazcom, a prípadne prerušený kyslíkom, sírou alebo dusíkom. Výhodne je ktorákoľvek z arylových skupín s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylových skupín s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylových skupín, aralkenylových skupín alebo cykloalkylalkylových skupín obsahujúcich v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka na aminoskupine derivátu PTH nesubstituovaná. Ako príklady alkylovej skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka možno uviesť alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, výhodne metylovú skupinu, etylovú skupinu, propylovú skupinu, izopropylovú skupinu, butylovú skupinu, izobutylovú skupinu a terc.butylovú skupinu; ako príklady alkenylovej skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka alkenylovú skupinu s 2 až 4 atómami uhlíka, výhodne alylovú skupinu; ako príklady alkinylovej skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka alkinylovú skupinu s 2 až 4 atómami uhlíka, výhodne 2-propinylovú skupinu; ako príklady aralkylovej skupiny fenylovú alebo benzylovú skupinu; ako príklad aralkenylovej skupiny styrylovú skupinu; ako príklad cykloalkylalkylovej skupiny obsahujúcej v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka cyklohexylmetylovú skupinu. Alkoxykarbonylovou skupinou s 2 až 6 atómami uhlíka je výhodne formylová alebo acetylová skupina. Medzi vhodné príklady D- alebo L-ct-aminokyselín naviazaných na N-koniec patrí napríklad D- alebo L-Pro, Ala. Výhodnými substituentmi, pokiaľ sú prítomné, sú alkylová skupina, alkinylová skupina, alkoxykarbonylová skupina, alebo D- alebo L-a-aminokyselina naviazaná na N-koniec derivátu PTH a/alebo aspoň jedna alkylová skupina alebo alkoxykarbonylová skupina naviazaná na jednu alebo niekoľko aminokyselín bočných reťazcov.

Výhodnými derivátmi PTH podľa vynálezu sú tie deriváty, ktoré majú nahradenú aspoň jednu aminokyselinovú jednotku v jednej z nasledujúcich polôh sekvencie PTH: 1, 2, 3, 8 až 11, 13 až 19, 21, 22, 29 až 34, najmä 8 až 11, 16 až 19, 33 a/alebo 34. Ďalej sú výhodnými derivátmi PTH podľa vynálezu tie deriváty, ktoré majú nahradenú viac ako jednu aminokyselinovú jednotku, najmä viac ako dve aminokyselinové jednotky, zvlášť viac ako tri aminokyselinové jednotky, najmä ktoré majú nahradených 5 až 7 aminokyselinových jednotiek, výhodne v ľubovoľnej kombinácii uvedcných polôh sekvencie PTH.

V rade špecifických alebo alternatívnych uskutočnení vynález zahrnuje deriváty PTH, ako sú opísané skôr, v ktorých sú najmä α-aminokyscliny v polohách 1 a 2 na N-konci sekvencie PTH nahradené pseudodipeptidom.

Termín „pseudodipeptid“, ktorý sa tu používa, označuje izostér dipeptidu, v ktorom je peptidická väzba medzi dvomi aminokyselinovými zvyškami, či už prirodzenými alebo neprirodzenými, nahradená izostérickou skupinou, napríklad -CH₂-NH-, -C(halogén)=CH- alebo -C(alkyl)=CH-.

Medzi príklady zlúčenín podľa vynálezu, v ktorých sú α-aminokyseliny v polohách 1 a 2 nahradené pseudodipeptidom, patria napríklad zlúčeniny všeobecného vzorca (I)

X-Pi (I), v ktorom

X predstavuje zvyšok všeobecného vzorca (a) y I z - N - CH - C = CH - CH - CO -(a) í II z' wy alebo všeobecného vzorca (b)

Y_Z

Γi

Z - N - CH - CH_a - N - CH - CO -(b) í II z- y_ar v ktorých symboly Z a Z‘ nezávisle od seba predstavujú vždy atóm vodíka, prípadne substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylovú skupinu, aralkenylovú skupinu alebo cykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, alebo chrániacu skupinu, pričom najviac jedna zo skupín ’LaĽ znamená chrániacu skupinu,

Z“ predstavuje atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka alebo chrániacu skupinu, symboly Y a Y‘ nezávisle od seba znamenajú vždy prípadne chránený bočný reťazec prirodzenej alebo neprirodzenej a-aminokyseliny, jeden zo symbolov Y_a a Y_b predstavuje atóm vodíka a druhý znamená prípadne chránený bočný reťazec prirodzenej alebo neprirodzenej α-aminokyseliny alebo Y_a a Y_bspolu s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, tvoria cykloalkylovú skupinu s 3 až 6 atómami uhlíka, a

W predstavuje atóm halogénu alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka,

-C—CH-CHalebo symboly W a Y‘ spolu so zvyškom I I , na ktorý sú naviazané, tvoria prípadne substituovaný aromatický cyklický alebo heterocyklický zvyšok, a

Pi znamená sekvenciu PTH, ako je definovaná skôr, v ktorej sú aminokyselinové jednotky v polohách 1 a 2 na N-konci vynechané, vo voľnej forme alebo vo forme soli či vo forme komplexu.

Pri zlúčeninách všeobecného vzorca (I) môže byť P, fragmentom (3-z), kde z má hodnotu 84 alebo znamená celé číslo od 27 do 38, výhodne od 34 do 38, najmä 34, 36, 37 alebo 38, zvlášť 34 alebo 36. Sekvencia PTH predstavovaná symbolom P; môže zodpovedať buď prirodzene sa vyskytujúcej sekvencií PTH, alebo prirodzene sa vyskytujúcej sekvencií PTH, v ktorej bola aspoň jedna a-aminokyselinová jednotka nahradená prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinou, prípadne v chránenej forme a/alebo je jedna, alebo niekoľko α-aminokyselinových jednotiek vynechaných. Pj môže tiež obsahovať aspoň jednu aminokyselinu na bočnom reťazci substituovanú, ako je to opísané.

Halogénom je výhodne fluór alebo chlór.

V zvyšku všeobecného vzorca (a) je dvojitá väzba výhodne v trans-konfigurácii (E).

Ako zvyšok naviazaný na atóm α-uhlíka prirodzenej a-aminokyseliny môže symbol Y, Y', Y_a alebo Y_b znamenať bočný reťazec prirodzenej α-aminokyseliny, ako jc uvedená, napríklad ako je prítomný v Gly, (t. j. vodík), Ala, Val, Ser, Leu, íle, Phe, Trp. Y, Y', Y_a alebo Y_b môže tiež predstavovať zvyšok naviazaný na atóm α-uhlíka neprirodzenej α-aminokyseliny, ako sú uvedené skôr, napríklad ako je prítomný v Nva, Om, Abu, Aib, Nie. Pokiaľ bočný reťazec prirodzenej alebo neprirodzenej aminokyseliny v zmysle symbolu Y, Y‘, Y_o alebo Y_b obsahuje heteroatómy, ako je kyslík, síra alebo dusík, môžu byť tieto heteroatómy na bočnom reťazci pripadne chránené chrániacou skupinou pre kyslík, síru alebo dusík, napríklad ako sú uvedené skôr.

Chrániace skupiny vo význame symbolu Z alebo Z‘ alebo Z“ môžu byť ako je opísané skôr. Alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka vo význame symbolu Z alebo Z‘ alebo Z“ môžu byť ako je uvedené skôr.

Výhodne Z alebo Z‘ predstavuje atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, najmä atóm vodíka alebo metylovú skupinu.

Y výhodne znamená atóm vodíka alebo metylovú skupinu.

Pokiaľ W predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, výhodne predstavuje metylovú skupinu.

Pokiaľ W a Y‘ spolu so zvyškom, na ktorý sú naviazané, tvoria prípadne substituovaný aromatický cyklický alebo heterocyklický zvyšok, môže ísť o aromatický päť- alebo šesť-Členný cyklický zvyšok obsahujúci prípadne 1 alebo 2 heteroatómy vybrané zo skupiny zahŕňajúcej dusík, síru a kyslík, napríklad môže ísť o fenylovú skupinu, imidazolylovú skupinu, pyridylovú skupinu, oxazolylovú skupinu alebo tiazolylovú skupinu. Výhodným substituentom je hydroxylovú skupina alebo metoxyskupina, najmä v prípade fenylového kruhu.

Y‘ výhodne znamená atóm vodíka, metylovú skupinu, izopropylovú skupinu alebo benzylovú skupinu.

Pokiaľ Z“ predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, ide výhodne o metylovú skupinu, etylovú skupinu alebo izopropylovú skupinu.

Cykloalkylovou skupinou s 3 až 6 atómami uhlíka, ktorú znamenajú spolu symboly Y_a a Y_b, je výhodne cyklopropylová skupina alebo cyklopentylová skupina.

Pokiaľ Z“ znamená chrániacu skupinu, ide výhodne o acylovú skupinu, najmä acetylovú skupinu.

V rade špecifických a alternatívnych uskutočnení vynález zahŕňa deriváty PTH, ako sú opísané skôr, v ktorých je α-aminokyselinová jednotka v polohe 1 a/alebo a-aminokyselinová jednotka v polohe 2 N-konca sekvencie PTH nahradená pripadne chráneným zvyškom prirodzenej alebo neprirodzenej aminokyseliny s tým, že pokiaľ derivát PTH neobsahuje D- alebo L-a-aminokyselinu naviazanú na N-koniec alebo alkoxykarbonylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alebo prípadne substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylovú skupinu, aralkenylovú skupinu či cykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, ide o inú zlúčeninu ako je PTH, obsahujúcu prirodzene sa vyskytujúcu sekvenciu a-aminokyselín, alebo ide o iný derivát PTH ako je ΡΊΉ(1 -34), v ktorom

i. je α-aminokyselinou v polohe 1 Aib, Gly, D-Ser, D-Ala alebo Tyr, alebo ii. je α-aminokyselinou v polohe 2 Ala, D-Val, Lys, Cit alebo Arg a α-aminokyselinou v polohe 34 je Tyr, alebo je α-aminokyselinou v polohe 2 D-Val a α-aminokyselinou v polohe 34 D-Tyr a prípadne je každá z α-aminokyselín v polohách 8 a 18 Nie, alebo iii. je α-aminokyselinou v polohe 1 Aib, a aspoň jedna ďalšia α-aminokyselinová jednotka je nahradená nasledujúcim spôsobom: α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 je Leu, íle, Val, Phe alebo Trp, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 11 Ser, Lys, Phe, B-Nal, Trp alebo Tyr, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-B-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(9-fluor enylmetoxykarbonyl), D-Phe alebo D-Asn, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 13 Leu, a/alebo je ot-aminokyselinou v polohe 19 a/alebo v polohe 21 Arg, Lys, Asn alebo His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 23 2-(l,3-ditiolan-2-yl)Trp, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 25 a/alebo v polohe 26 His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 27 Gin alebo Leu, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH(l-84), v ktorom

i. je α-aminokyselinou v polohe 1 Tyr, Val, Pro, Asp alebo Cys, alebo ii. je α-aminokyselinou v polohe 2 Ala, Glu, Leu, Ser alebo Arg.

Príklady zlúčenín podľa vynálezu, v ktorých sú «-aminokyseliny v polohe 1 a/alebo v polohe 2 nahradené, ako je uvedené skôr, zahrnujú napríklad zlúčeniny všeobecného vzorca (II)

X_la-Y_2i.-P2 (Π), v ktorom

X_la predstavuje zvyšok prípadne chránenej prirodzenej α-aminokyseliny alebo zvyšok všeobecného vzorca (Ila)

- N - [CJ - CO - (Ila)

I i ^Z'v ktorom symboly Z_a a Z‘_a nezávisle od seba znamenajú vždy atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka alebo chrániacu skupinu, pričom najviac jeden zo symbolov Z_aa Z‘_a predstavuje chrániacu skupinu, a buď n má hodnotu 1 a

i. symboly R, a R₂ nezávisle od seba znamenajú vždy alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alebo ii. jeden zo symbolov Rj a R₂ predstavuje metylovú alebo etylovú skupinu a druhý znamená pripadne chránený zvyšok naviazaný na atóm α-uhlíka prirodzenej a-aminokyseliny inej ako Ala, Leu, íle alebo Val, alebo iii. jeden zo symbolov R| a R₂ znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo etylovú skupinu, a druhý predstavuje prípadne chránený zvyšok naviazaný na atóm a-uhlika neprirodzenej α-aminokyseliny, alebo iv. R₁ a R₂ tvoria spolu s atómom uhlíka, na ktorý sú naviazané, cykloalkylovú skupinu s 3 až 6 atómami uhlíka, alebo

- n - ΟΙ, I

v. zvyšok ^z . ^R _a znamená heterocyklický zvyšok prípadne kondenzovaný na benzénový kruh, alebo má n hodnotu 2, 3, 4 alebo 5 a každý zo symbolov R, a R₂ znamená vždy atóm vodíka alebo metylovú skupinu,

Y_2a predstavuje zvyšok prípadne chránenej prirodzenej α-aminokyseliny alebo zvyšok všeobecného vzorca (Ilb) r

- N - [C)_ - CO (Ilb)

Z_b znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka a buď m má hodnotu 1 a

i. symboly R₃ a R₄ nezávisle od seba predstavujú vždy alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alebo ii. jeden zo symbolov R₃ a R| znamená metylovú skupinu alebo etylovú skupinu a druhý predstavuje prípadne chránený zvyšok naviazaný na atóm α-uhlíka prirodzenej α-atninokyseliny inej ako Ala, Leu, íle alebo Val, alebo iii. jeden zo symbolov R₃ a R, znamená atóm vodíka, metylovú skupinu alebo etylovú skupinu, a druhý predstavuje prípadne chránený zvyšok naviazaný na atóm a-uhlíka neprirodzenej a-aminokyseliny, alebo má m hodnotu 2, 3, 4 alebo 5 a symboly R₃ a R₄znamenajú vždy atóm vodíka alebo metylovú skupinu, a

P₂ predstavuje sekvenciu PTH, ako je definovaná skôr, v ktorej sú vynechané aminokyselinové jednotky v polo

hách 1 a/alebo 2 N-konca.	1
	1 - N - C -
	t 1
Pokiaľ je zvyškom	í __ 1 ^z . ^H _a heterocyklický zvy-

šok prípadne kondenzovaný na benzénový kruh, môže ísť o zvyšok odvodený od nasýteného alebo nenasýteného päťalebo šesťčlenného heterocyklu obsahujúci jeden alebo niekoľko heteroatómov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej dusík, kyslík a síru. Medzi príklady takýchto hctcrocyklických zvyškov patrí napríklad 2-pyridylová skupina, 3-morfolinylová skupina, hexahydropyridazinylová skupina, 2alebo 3-indolylová skupina.

Pokiaľ má n alebo m hodnotu viac ako 1, môže byť zvyškom CR]R₂ alebo CR,R₄ skupina -CH(CH₃)-CH₂-, propylová skupina, butylová skupina alebo pentylová skupina.

Cykloalkylovou skupinou, ktorú tvoria spolu Rj a R₂, je výhodne cyklopropylová skupina alebo cyklopentylová skupina.

Zvyškom naviazaným na atóm α-uhlíka prirodzenej a-aminokyseliny vo význame symbolov R_b R₂, R₃ alebo R4 môže byť bočný reťazec prítomný v prirodzenej a-aminokyseline, ako je uvedená skôr, napríklad prítomný v Gly, Ser alebo Thr. Jeden zo symbolov R₃ a R₂ alebo jeden zo symbolov R₃ aRj môže predstavovať metylovú skupinu alebo etylovú skupinu a druhý môže znamenať metylovú skupinu, izopropylovú skupinu, izobutylovú skupinu alebo skupinu CH₃-CH₂-CH(CH₃)-. R_b R₂, R₃ alebo R4 môže znamenať tiež zvyšok naviazaný na atóm a-uhlíka neprirodzenej α-aminokyseliny, ako je uvedená skôr, napríklad ak je prítomný v Abu, Gaba, Nva, Aib, TMSA alebo Nie. Pokiaľ bočný reťazec prirodzených alebo neprirodzených aminokyselín vo význame symbolu R_b R₂, R₃ alebo R4 obsahuje heteroatómy, ako je kyslík, síra alebo dusík, môžu byť heteroatómy bočného reťazca prípadne chránené chrániacou skupinou pre kyslík, síru alebo dusík, napríklad, ako je uvedená skôr. Chrániace skupiny vo význame symbolu Z_a alebo Z‘_a môžu mať opísaný význam. Alkylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka vo význame symbolu Z_b je výhodne metylová alebo etylová skupina. Výhodne Z_b predstavuje atóm vodíka. Alkylovou skupinou s 1 až 6 atómami uhlíka vo význame symbolu Z_a alebo Z‘_a je výhodne alkylová skupina s 1 až 4 atómami uhlíka s priamym či rozvetveným reťazcom. Výhodne jeden zo symbolov Z_a a Z‘_aznamená atóm vodíka a druhý predstavuje atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo chrániacu skupinu, najmä atóm vodíka.

kde

Podľa ďalšieho alternatívneho uskutočnenia vynález tiež zahŕňa deriváty PTH, ako sú opísané skôr, v ktorých je α-aminokyselinová jednotka v polohe 8 a/alebo a-aminokyselinová jednotka v polohe 18 nahradená prípadne chráneným zvyškom prirodzenej alebo neprirodzenej aminokyseliny s tým, že pokiaľ derivát PTH neobsahuje D- alebo L-a-aminokyselinu naviazanú na N-koniec alebo alkoxykarbonylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alebo prípadne substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylovú skupinu, aralkenylovú skupinu či cykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, ide o inú zlúčeninu ako je PTH obsahujúca prirodzene sa vyskytujúcu sekvenciu a-aminokyselín, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH(l-34), v ktorom

i. je každá z α-aminokyselín v polohách 8 a 18 Nie alebo Met(O) a pripadne je α-aminokyselinou v polohe 34 Tyr, alebo je každá z a-aminokyselín v polohách 8 a 18 Nie a α-aminokyselinou v polohe 34 je Tyr a buď je a-aminokyselinou v polohe 12 L- alebo D-Pro, L- alebo D-Ala, Aib alebo NMeGly, alebo je α-aminokyselinou v polohe 23 Phe, Leu, Nlc, Val, Tyr, α-Nal alebo β-Nal, alebo je každá z α-aminokysclín v polohách 8 a 18 Nie a a-aminokyselinou v polohe 2 je D-Val a α-aminokysclinou v polohe 34 je D-Tyr, alebo ii. je α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Leu, íle, Val, Phe alebo Trp, a aspoň jedna ďalšia a-aminokysclinová jednotka je prípadne nahradená nasledujúcim spôsobom: α-aminokyselinou v polohe 1 je Aib, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 11 Ser, Lys, Phe, β-Nal, Trp alebo Tyr, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-B-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(9-fluorenylmetoxykarbonyl), D-Phe alebo D-Asn, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 13 Leu, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 19 a/alebo v polohe 21 Arg, Lys, Asn alebo His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 23 2-(1,3-ditiolan-2-yl)Trp, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 25 a/alebo v polohe 26 His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 27 Gin alebo Leu, alebo iii. je α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Ala alebo Ser, alebo j c α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Leu a α-aminokyselinou v polohe 34 Tyr, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH( 1 -84), v ktorom jc α-aminokyselinou v polohe 8 Met, Met(O), Ala, Val, Leu, íle, Ser, Trp, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr alebo Gly a α-aminokyselinou v polohe 18 Leu, alebo je a-aminokyselinou v polohe 8 a v polohe 18 vždy Met(O), alebo je α-aminokyselinou v polohe 8 Leu a α-aminokyselinou v polohe 18 Met(O), alebo ide o iný derivát PTH ako je [Leu^lsTyr³⁴]hPTH(l-84), [Leu⁸Tyr³⁴]hPTH(l-84), [lle’Leu^Tyr³⁴] hPTH(l-84) alebo [Leu⁸Leu’⁸Tyr³⁴]hPTH(l-84).

Pokiaľ je α-aminokyselinová jednotka v polohe 8 nahradená neprirodzenou aminokyselinou, môže ísť o neprirodzenú aminokyselinu, ako je opísaná, napríklad Nva, Nie alebo Cha. Výhodne ide o neprirodzenú lipofilnú aminokyselinu výhodne takú, ktorá obsahuje alkylový zvyšok s priamym reťazcom. Najmä výhodný je Nva (norvalín) a jeho homológy. Neprirodzenou aminokyselinou v polohe 8 sekvencie PTH môže byť tiež Ca-metylovaná alebo Ca-etylovaná prirodzená a-aminokyselina.

Medzi príklady derivátov PTH podľa vynálezu, v ktorých je nahradená α-aminokyselinová jednotka v polohe 18, patria napríklad deriváty PTH, v ktorých je a-aminokyselinový zvyšok v polohe 18 nahradený prirodzeným aminokyselinovým zvyškom, ako je Gin, Tyr alebo Lys, napríklad [Gln¹⁸]-PTH, [Lys¹⁸]-PTH a [Tyr^ls]-PTH, najmä [Gin¹⁸ alebo Lys¹⁸, alebo Tyr¹⁸]-hPTH- (1-x), v ktorom má x hodnotu 84 alebo predstavuje celé číslo od 27 do 38, najmä od 34 do 38. Výhodný je tiež Ala v polohe 18, najmä pokiaľ je sekvenciou PTH fragment PTH (1-36). V týchto zlúčeninách môže byť aminokyselinou v polohe 8 Met alebo môže byť nahradený aminokyselinou vybranou zo skupiny zahrnujúcej Leu, íle, Val, Phe, Gin, Trp, Ser a Ala, alebo môže ísť o zvyšok neprirodzenej lipofilnej aminokyseliny, napríklad Nva alebo Nie.

Iná skupina derivátov PTH podľa vynálezu zahŕňa napríklad deriváty PTH, v ktorých je aminokyselinový zvyšok v polohe 8 nahradený zvyškom neprirodzenej lipofilnej aminokyseliny, napríklad Nie alebo výhodnejšie Nva, V týchto zlúčeninách môže byť aminokyselinou v polohe 18 Met alebo môže byť nahradený aminokyselinou vybranou zo skupiny zahŕňajúcej Leu, íle, Val, Phe, Trp, Ser, Ala, Gin, Lys a Tyr, výhodne Leu, Gin, Ala alebo Tyr.

Ďalšou skupinou derivátov PTII podľa vynálezu sú deriváty, v ktorých je okrem nahradenia cc-aminokyselinovej jednotky v polohe 8 a/alebo vynechaná, alebo nahradená jedna alebo niekoľko aminokyselinových jednotiek v zvyšných polohách, napríklad 1 až 7, 9 až 17 a/alebo 19 až 38. V takom prípade je α-aminokyselina v polohe 8 výhodne nahradená Leu a α-aminokyselina v polohe 18 Gin, Leu, Ala alebo Tyr.

Podľa ešte ďalšieho alternatívneho uskutočnenia vynález zahŕňa tiež deriváty PTH, ako sú opísané, v ktorých je aspoň jedna α-aminokyselinová jednotka sekvencie PTH nahradená α-aminokyselinovou jednotkou, ktorá je prítomná v zodpovedajúcej polohe v PTHrP, s tým, že pokiaľ derivát PTH neobsahuje D- alebo L-a-aminokyselinu naviazanú na N-koniec alebo alkoxykarbonylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, alebo prípadne substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylovú skupinu s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylovú skupinu, aralkenylovú skupinu či cykloalkylalkylovú skupinu obsahujúcu v cykloalkylovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, ide o inú zlúčeninu ako je PTH obsahujúca prirodzene sa vyskytujúcu sekvenciu a-aminokyselin, alebo ide o iný derivát PTH ako je PTH(l-34), v ktorom

i. je α-aminokyselinou v polohe 8 a/alebo 18 Leu, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 11 Lys, a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 19 a/alebo v polohe 21 Arg, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 25 a/alebo v polohe 26 His, a/alebo je α-aminokyselinou v polohe 27 Leu, alebo ii. je a-aminokyselinou v polohe 25 Gin a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 26 Asn a/alebo je a-aminokyselinou v polohe 27 je prípadne Leu, alebo ide o iný derivát PTH ako je [Leu³Leu^l8]PTH(l-84).

Termín „PTHrP“ označuje akúkoľvek geneticky kódovanú formu PTHrP, napríklad ľudský, kurací, potkaní alebo myší PTHrP. Z dôvodov jednotnosti, ako je to bežné, sa v nasledujúcom texte používa rovnaký systém číslovania aminokyselín sekvencie PTHrP počnúc Ala v polohe 1 a obsahujúcej napríklad Ala v polohe 38.

Touto skupinou zlúčenín podľa vynálezu sú hybridy medzi PTH a homológnymi sekvenciami PTHrP (označo

SK 283485 Β6 vanými ako hybridy PTH-rP). Aminokyselinovú sekvenciu, v ktorej prebieha substitúcia podľa vynálezu je od polohy 1 do polohy 38, najmä 1 až 36, zvlášť 1 až 34.

Výhodnými derivátmi PTH podľa vynálezu sú hybridy PTH-rP, v ktorých je viac ako jedna a-aminokyselinová jednotka sekvencie PTH, napríklad najmenej 2, výhodne od 3 do 5 α-aminokyselinových jednotiek, nahradená podľa vynálezu.

Výhodná skupina hybridov PTH-rP podľa vynálezu zahŕňa deriváty PTH, v ktorých je aspoň jedna a-aminokyselinová jednotka α-aminokyselinovej sekvencie PTH v polohách 8 až 11, t. j. Met⁸, His⁹, Asn¹⁰ alebo Leu¹¹ nahradená zodpovedajúcou α-aminokyselinovou jednotkou zodpovedajúcej sekvencie PTHrP, t. j. Leu⁸, His⁹, Asp¹⁰ alebo Lys¹¹. Výhodné je nahradenie v polohe 8 a/alebo 10, najmä v polohách 8 a 10. Ešte výhodnejšie sú α-aminokyseliny v polohách 8, 10 a ll uvedenej sekvencie PTH nahradené Leu⁸, Asp¹⁰ a Lys¹¹.

Iná výhodná skupina hybridov PRH-rP podľa vynálezu zahrnuje deriváty PTH, v ktorých je aspoň jedna a-aminokyselinová jednotka α-aminokyselinovej sekvencie PTH v polohách 16 až 19 nahradená zodpovedajúcou a-aminokyselinovou jednotkou zodpovedajúcej sekvencie PTHrP, t. j. Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹’ Výhodne sú nahradené 3 alebo všetky 4 α-aminokyseliny uvedenej sekvencie. Výhodné sú najmä deriváty PTH podľa vynálezu, v ktorých je a-aminokyselinou v polohe 16 Gin, α-aminokyselinou v polohe 18 Leu a α-aminokyselinou v polohe 19 Arg.

Ďalšia výhodná skupina hybridov PRH-rP podľa vynálezu zahrnuje deriváty PTH, v ktorých je aspoň jedna a-aminokyselinová jednotka α-aminokyselinovej sekvencie PTH v polohách 33 a 34 nahradená zodpovedajúcou a-aminokyselinovou jednotkou zodpovedajúcej sekvencie PTHrP, t. j. Thr³³, Ala³⁴. Výhodne sú nahradené obe a-aminokyseliny.

Ešte ďalšiu výhodnú skupinu hybridov PTH-rP podľa vynálezu tvoria deriváty PTH, ktoré obsahujú ľubovoľnú kombináciu uvedených substitúcií a-aminokyselín (8 - 11, 16 - 19, 33 - 34), výhodnejšie kombináciu substitúcií vybranú z označených sekvencii 8 - 11 a 33 - 34.

Je zrejmé, že v hybridoch PTH-rP podľa vynálezu môže byť jedna alebo niekoľko α-aminokyselín v polohách 1 až 38 ďalej nahradená prirodzenou alebo neprirodzenou aminokyselinovou jednotkou, ako je uvedené skôr, alebo vynechaná. V polohe 10 môže byť α-aminokyselina vybraná zo súboru zahŕňajúceho Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr a Tyr. V polohe 13 môže byť D- alebo L-a-aminokyselina iná ako Arg, napríklad Ala, Cys, Gin, íle, Asn, Trp, Asp, Val, Ser, Thr, Tyr, Met, Leu alebo Gly, v polohe 16 môže byť D- alebo L-a-aminokyselina, napríklad Lys, Ser, Leu, Ala, Gin alebo Gly, v polohe 17 Ala alebo Ser, alebo výhodne aminokyselina, ktorá má väčší bočný reťazec alebo Ala, alebo Ser, napríklad Glu, Gin, Phe, His, íle alebo Lys, v polohe 18 Gin alebo Tyr, v polohe 19, Ala, Arg, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn alebo íle, v polohe 26 Gin alebo Arg, a/alebo v polohe 33 D- alebo L-a-aminokyselina, napríklad Ser, Thr, Leu, Gly, Gin, Arg, Pro, Asp, íle, Lys alebo Thr. Môžu byť tiež substituované na N-konci alebo na aminoskupine bočného reťazca, ako je uvedené skôr. Pokiaľ je to žiaduce, môžu byť bočné reťazce hybridov PTH-rP podľa vynálezu obsahujúce síru alebo kyslík tiež chránené, ako je opísané skôr.

Ako príklady výhodných hybridov PTH-rP podľa vynálezu možno uviesť:

[Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gln¹⁸]PTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]PTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Gln¹⁸]PTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]PTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]PTH a [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH.

Výhodnými hybridmi PTH-rP podľa vynálezu sú deriváty PTH(l-x'), kde x‘ znamená celé číslo od 34 do 38, najmä 34, 36, 37 alebo 38, zvlášť hPTH(l-x'), kde je jedna alebo niekoľko α-aminokyselín nahradených a-aminokyselinou alebo α-aminokyselinami prítomnými v zodpovedajúcej polohe v PTHrP, výhodne ako je uvedené skôr. Pokiaľ sú α-aminokyseliny v polohách 33 a 34 nahradené zodpovedajúcou α-aminokyselinovou sekvenciou PTHrP, je derivátom PTH výhodne fragment hPTH obsahujúci 34 α-aminokyselinových jednotiek. Výhodne sú hybridy PTH-rP s C-koncom.

PTHrP je výhodne hPTHrP.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť napríklad vo voľnej forme, vo forme soli alebo vo forme ich komplexov. Môžu vytvárať adičné soli s kyselinami napríklad s organickými kyselinami, polymémymi kyselinami a anorganickými kyselinami. Takéto adičné soli s kyselinami zahŕňajú napríklad hydrochloridy a acetáty. Komplexy sa napríklad vytvárajú zo zlúčeniny podľa vynálezu pridaním anorganických látok, napríklad anorganických solí alebo hydroxidov, ako sú soli vápnika a zinku, a/alebo pridaním polymémych organických látok.

Vynález tiež opisuje spôsob výroby zlúčenín podľa vynálezu. Možno ich pripraviť postupným spôsobom buď v roztoku, alebo použitím postupu syntézy na pevnej fáze alebo pomocou genetického inžinierstva.

Zlúčeniny podľa vynálezu možno vyrobiť napríklad nasledujúcim spôsobom tak, že

a) sa odstráni aspoň jedna chrániaca skupina, ktorá je prítomná v zlúčenine podľa vynálezu v chránenej forme, alebo

b) sa navzájom spoja amidickou väzbou dva peptidové fragmenty, pričom tieto peptidové fragmenty sú také, že sa získa žiadaná zlúčenina so žiadanou sekvenciou aminokyselín, a potom sa prípadne uskutoční bod a) postupu,

c) na výrobu derivátu PTH, v ktorom sú a-aminokyselinové jednotky v polohách 1 a 2 na N-konci nahradené pseudopeptidom, sa pseudopeptid v chránenej alebo nechránenej forme podrobí reakcii s peptidom PTH v chránenej alebo nechránenej forme, v ktorom sú vynechané aminokyselinové zvyšky v polohách 1 a 2, a pokiaľ je to nutné, uskutočnením bodu a) postupu, alebo

d) sa na výrobu derivátu PTH, ktorý obsahuje aspoň jeden zvyšok vybraný zo súboru zahŕňajúceho D- alebo L-a-aminokyseliny naviazané na N-koniec a alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, a prípadne substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylová skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny či cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkylovej Časti 3 až 6 atómov uhlíka a alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka naviazané na koncovú aminoskupinu a/alebo na aminoskupinu bočného reťazca, takýto zvyšok vnesie do derivátu PTH v chránenej alebo nechránenej forme, neobsahujúceho takýto zvyšok, a pokiaľ je to nutné, uskutoční sa bod a) postupu, a takto získané zlúčeniny sa izolujú vo voľnej forme, vo forme soli alebo vo forme komplexu.

Body a), b) a c) možno uskutočňovať analogicky so známymi spôsobmi, napríklad ako sú známe v odbore ché mie peptidov alebo ako sú opísané v nasledujúcich príkladoch. Pokiaľ je to žiaduce, môžu byť v týchto reakciách pre funkčné skupiny, ktoré sa nezúčastnia reakcie, použité chrániace skupiny, ktoré sú vhodné na použitie v peptidoch. Termín chrániaca skupina môže zahrnovať tiež polymérnu živicu, ktorá má funkčné skupiny.

V bode b) na výrobu derivátu PTH, v ktorom sú a-aminokyselinové jednotky v polohách 1 a 2 na N-konci nahradené pseudodipeptidom, môže jeden peptidový fragment používaný ako východiskový materiál na svojom N-konci obsahovať tento pseudodipeptid. Tento východiskový materiál možno pripraviť podľa bodu c).

V bode c) môže byť pseudodipeptidom používaným ako východiskový materiál zlúčenina všeobecného vzorca (Ilaa) alebo (Ilbb)

ZZ‘N-CHY-CW = CH-CHY‘ -COOH (Ilaa),

ZZ‘N - CY_aY_b - CH₂ -NZ“ - CHY‘ - COOH (Ilbb), v ktorom majú symboly Y, Y‘, Y_a, Y_b, Z, Z‘, Z“ a W definovaný význam, alebo jej ftinkčný derivát, napríklad ester, halogenid kyseliny alebo symetrický či nesymetrický anhydrid. Zlúčeniny všeobecného vzorca (Ilaa), v ktoiých -C=CH-CHsymboly W a Y‘ tvoria spolu so zvyškom 1 I , na ktorý sa viažu, prípadne substituovaný aromatický cyklický alebo heterocyklický zvyšok, a zlúčeniny všeobecného vzorca (Ilbb), v ktorom Z“ znamená alkylovú skupinu alebo chrániacu skupinu, napríklad acetylovú skupinu, alebo v ktorom -CY_aY_b predstavuje cykloalkylovú skupinu s 3 až 6 atómami uhlíka a Z“ znamená atóm vodíka, sú nové a tvoria súčasť vynálezu.

Bod d) možno uskutočňovať analogicky so známymi postupmi, napríklad alkylačným postupom. Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu sa alkylácia uskutočňuje pri redukčných podmienkach, napríklad použitím zodpovedajúceho aldehydu alebo ketónu. Možno ju uskutočňovať napríklad v prítomnosti nátriumkyánborohydridu, výhodne pri kyslom pH, napríklad od 5 do 7. Teplota reakcie môže byť napríklad od -20 °C do 100°C, Môže byť výhodné uskutočňovať túto reakciu v inertnom rozpúšťadle, napríklad vode, alkohole, dioxáne či dimetylformamide alebo v ich zmesi. D- alebo L-a-aminokyselina môže byť tiež naviazaná na N-koniec v súlade so známymi postupmi.

Peptidový fragment používaný ako východiskový materiál v bode b) môže obsahovať jednu alebo niekoľko neprirodzených aminokyselinových jednotiek. Môže byť tiež substituovaný na aminoskupine N-konca a/alebo bočného reťazca zvyškom vybraným zo súboru zahrnujúceho alkoxykarbonylové skupiny s 2 až 6 atómami uhlíka, prípadne substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atómami uhlíka, alkenylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, alkinylové skupiny s 2 až 8 atómami uhlíka, aralkylové skupiny, aralkenylové skupiny a cykloalkylalkylové skupiny obsahujúce v cykloalkyiovej časti 3 až 6 atómov uhlíka a v alkylovej časti 1 až 4 atómy uhlíka, alebo môže na N-konci niesť Dalebo L-a-aminokyselinu.

Zlúčeniny podľa vynálezu alebo ich fragmenty obsahujúce prirodzené a-aminokyselinové jednotky možno taktiež pripraviť pomocou génového inžinierstva

Podľa výhodného uskutočnenia vynález opisuje tiež spôsob výroby stredne veľkého peptidu, pri ktorom je v bakteriálnych bunkách exprimovaný fúzny proteín obsahujúci N-koncový polypeptid génu 55 bakterioľágu T4, ktorý má na svoj C-koniec naviazaný žiadaný polypeptid.

Polypeptid génu 55 môže obsahovať úplný proteín gp55 bakteriofágu T4 (188 aminokyselinových zvyškov), ktorý opísali Gram, H. a Rilger, R., 1985, The EMBO Journal, 4, (1), str. 257 - 264. Alternatívne možno použiť fragment, výhodne N-koncový fragment proteínu gp55. Napríklad, možno použiť fragment proteínu gp55 obsahujúci prvých 112 N-koncových aminokyselinových zvyškov proteínu. Typicky však polypeptid génu 55 obsahuje aspoň prvých 25 N-koncových zvyškov proteínu gp55.

Stredne veľký polypeptid môže mať dĺžku od približne 20 do 100, napríklad 150, výhodne od približne 20 do približne 50 aminokyselín. Medzi príklady stredne veľkých polypeptidov patria kalcitoníny, endorfíny, gastrické inhibičné peptidy, glukagón, neuropeptid Y, neuropeptid Y, faktor uvoľňujúci rastový hormón (GHRF, growth hormone releasing factor), fragmenty proteínu amyíoid B, hirudín, inzulín, somatostatín, epidermálny rastový faktor, nervový rastový faktor a PTH alebo jeho fragmenty. Najmä výhodnými stredne veľkými polypeptidmi, ktoré možno pripraviť spôsobom podľa vynálezu sú zlúčeniny podľa vynálezu alebo ich fragmenty, ktoré obsahujú substitúcie prirodzenými aminokyselinami.

Účelne fúzny proteín génu 55-PTH tiež obsahuje štiepiteľný spojovník medzi polypeptidom génu 55 a žiadaným polypeptidom. Výhodne je štiepiteľný spojovník chemicky štiepiteľný a ešte výhodnejšie obsahuje sekvencie aminokyselín Asp-Pro-Pro alebo Asn-Gly-Pro.

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynález zahŕňa nukleotidovú sekvenciu kódujúcu fúzny proteín obsahujúci N-koncový polypeptid génu 55 bakteriofágu T4 a žiadaný stredne veľký polypeptid naviazaný na jeho C-koniec.

Nukleotidovou sekvenciou je výhodne DNA-sekvencia vhodná na expresiu v baktériách. Sekvencia typicky obsahuje medzi kódujúcimi sekvenciami génu 55 a žiadaného polypeptidu nukleotidy kódujúce štiepiteľný spojovník.

Vynález tiež zahrnuje bakteriálny expresívny vektor obsahujúci DNA-sekvenciu kódujúcu fúzny proteín.

Expresívny vektor typicky obsahuje okrem kódujúcej sekvencie fúzneho proteínu príslušné sekvencie kontrolujúce expresiu, vrátane vhodného promótora, operátora a miesta viažuceho sa na ribozóm, a ďalšie vhodné regulačné sekvencie. Obvykle expresívny vektor obsahuje tiež jeden alebo niekoľko selektabilných markérov.

Môže sa použiť ľubovoľný vhodný promótor, ako je promótor TrpE, λΡΙ, ZPr, lac alebo Tac. Výhodne je promótorom promótor bakteriofágu T7 a expresívnym vektorom je plazmid. Na expresiu v Escherichia coli možno použiť vektor odvodený od plazmidu RI alebo Col-El. Napríklad možno použiť expresívny vektor pET 17B, ktorý možno získať od firmy Novagen, alebo podobné expresívne vektory.

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynález opisuje bakteriálne hostiteľské bunky transformované kódujúcou sekvenciou fúzneho proteínu alebo expresívnym vektorom, ako je opísaný. Možno použiť ľubovoľný vhodný bakteriálny hostiteľ, i keď výhodným hostiteľom je Escherichia coli. Napríklad možno použiť kmeň Escherichia coli BL21 (DE3) Lys E a podobné kmene.

Výhodne sa fúzny proteín akumuluje v hostiteľských bunkách vo forme nerozpustných inklúznych teliesok, a tým uľahčuje izoláciu fúzneho proteínového produktu z buniek. Na izoláciu žiadaného polypeptidového produktu z fúzneho proteínu sa proteín inklúznych teliesok solubilizuje a žiadaný polypeptidový produkt sa odštiepi od fúzneho proteínu. Možno použiť ľubovoľný vhodný postup solubilizácie, vrátane ošetrenia kyselinou, napríklad pri približne pH 2 až 4, výhodne kyselinou pri približne pH 2,5 alebo o šetrenia denaturačným činidlom, napríklad miernym denaturačným činidlom, ako je guanidín-hydrochlorid. Okrem toho môže byť nutné odstrániť z produktu, ktorý zostane po štiepení, jeden alebo niekoľko žiaducich N-koncových aminokyselinových zvyškov.

Podľa ďalšieho uskutočnenia teda vynález opisuje spôsob výroby žiadaného stredne veľkého polypeptidu v bakteriálnom hostiteľovi, tento spôsob zahrnuje: vyvolanie toho, že transformované bakteriálne hostiteľské bunky, ako sú definované, exprimujú fúzny proteín vo forme inklúznych teliesok, izoláciu inklúznych teliesok, solubilizáciu inklúznych teliesok a odštiepenie žiadaného polypeptidu od fuzneho proteinu.

V prípade niektorých stredne veľkých polypeptidov, ako sú deriváty PTH, nie je normálne nutné uskutočňovať starostlivo riadené postupy denaturácie a renaturácie na získanie derivátov PTH v aktívnej forme, napríklad majúcich aktivitu podobnú PTH. Stredne veľké polypeptidy ako produkty možno získať v aktívnej forme samotnou neutralizáciou kyslých podmienok použitých na solubilizáciu. Solubilizáciu a štiepenie fuzneho proteinu možno uskutočňovať v jedinom kroku.

Vynález tiež zahrnuje fuzny proteín obsahujúci N-koncový polypeptid génu 55 bakteriofága T4 a žiadaný stredne veľký polypeptid naviazaný na jeho C-koniec.

Použitím spôsobov a vektorov podľa vynálezu sa zistilo, že je možné dosiahnuť vysoké koncentrácie stredne veľkých polypeptidov, najmä derivátov PTH. Pri Escherichia coli sa zistilo, že až približne 50 % celkového exprimovaného proteinu je žiadaným fúznym proteínom. Fúzny proteín tiež tvorí inklúzne telieska, ktoré možno ľahko oddeliť od iného materiálu buniek. Navyše sú inklúzne telieska často tvorené aspoň približne 90 % žiadaného fuzneho proteinu, čo môže výrazne znížiť nutný rozsah purifikácie. Ďalej expresia derivátu vo forme fuzneho proteinu môže podstatne znížiť endogénne úpravy (processing) polypeptidu v bakteriálnych bunkách, čo umožňuje získať homogénne produkty.

Výhodne štiepiteľný spojovník obsahuje chemicky štiepiteľné aminokyseliny susediace s N-koncom žiadaného polypeptidu, aby bolo možné odštiepiť žiadaný polypeptid od fuzneho proteinu jednoduchými chemickými spôsobmi. Výhodne žiadaný polypeptid neobsahuje chemicky štiepiteľné skupiny.

Výhodne chemicky štiepiteľné spojovníky obsahujú aminokyseliny Asp-Pro-Pro alebo Asn-Gly-Pro. Väzby Asp-Pro alebo Asn-Gly sa môžu chemicky štiepiť použitím kyslých podmienok, napríklad kyseliny mravčej (normálne približne pH 2,5), prípadne hydroxylamínu. Dipeptidy ProPro alebo Gly-Pro, ktoré zostávajú na N-konci žiadaného polypeptidu, možno potom odstrániť použitím vhodného dipeptidyl-peptidázy. Možno napríklad použiť dipeptidylpeptidázu EC 3.4.14.5 z L.lactis X-Pro. Túto peptidázu opísali Nardi a kol., 1991, Applied and Environmental Microbiology, 57, str. 45 až 50.

Žiadaný polypeptid možno po odštiepení z fuzneho proteinu purifikovať. Možno použiť techniku purifikácie pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Purifikáciu možno uskutočňovať pred odstránením akýchkoľvek nežiaducich N-koncových aminokyselinových zvyškov.

Spôsob podľa vynálezu ďalej ilustrujú príklady 306 až 312, ktoré odkazujú na sekvencie uvedené ďalej v časti Zobrazenie sekvencií, v ktorej SEQ ID č. 1 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu a zodpovedajúcu DNA-sekvenciu skráteného fuzneho proteinu gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l

-38)OH, ako je klonovaný do plazmidu pET17B, a SEQ ID č. 3 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu a zodpovedajúcu DNA-sekvenciu fuzneho proteinu gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38)OH s plnou dĺžkou, ako je klonovaný do plazmidu pET17B.

V nasledujúcich príkladoch uskutočnenia vynálezu sa používajú nasledujúce skratky: Boe = terc.butyloxykarbonyl, Fmoc = 9-fluorenylmetoxykarbonyl, Trt = trityl, Tos = tosyl, Pmc = 2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonyl, Ip = izopropyl, For = formyl, Cpe = kyselina 1-aminocyklopentán-1-karboxylová, Cha =cyklohexylalanín, tBu = = terc.butyl, Me = metyl.

SEQ ID č. 11 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu hPTH-(l-34), SEQ ID č. 12 zobrazuje aminokyselinovú sekvenciu hPTH-(l-36), SEQ ID č. 13 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu hPTH(l-38). Príklady 1, 2, 5, 6, 11, 20 - 24, 27 - 30, 36, 37, 40, 41, 47, 49, 51, 53, 54, 57, 58, 61, 76 - 80, 82, 179, 185, 187, 191 - 193, 226, 230, 237, 239, 256 a 289 sú založené na SEQ ID č. H, pričom sú zmenené aminokyselinové jednotky a ich polohy uvedené v hranatých zátvorkách. Príklady 12, 13, 18, 19, 31 - 35, 38, 39, 42 - 46, 48, 50, 52, 55, 59, 60, 62 - 71, 81, 83 - 85, 165 - 178, 180 - 184, 186, 188 - 190, 194 - 225, 227 - 229, 231 - 236, 238, 240 - 255, 257 - 266, 268 - 279, 282 - 288, 290 - 300 a 302 - 304 sú založené na SEQ ID č. 12, pričom sú zmenené aminokyselinové jednotky a ich polohy uvedené v hranatých zátvorkách. Príklady 3, 4, 7 - 10, 14 - 17, 25, 26, 56, 72 - 75,81 - 86 - 164, 267, 280 a 281 sú založené na SEQ ID č. 13, pričom sú zmenené aminokyselinové jednotky a ich polohy uvedené v hranatých zátvorkách.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

N“-izopropyl hPTH(l-34) NH₂

Tento peptid sa vytvorí postupným spôsobom na nosiči predstavovanom živicou na báze polystyrénu. Na chránenie α-aminoskupiny sa použije terc.butyloxykarbonylová skupina a funkčné skupiny bočných reťazcov sa chránia nasledujúcimi skupinami uvedenými v zátvorkách: Lys(2-chlórbenzyloxykarbonyl), Ser(benzyl), Thr(benzyl), Glu(benzyl), Asp(benzyl), Met-(O), His(dinitrofenyl), Arg(tosyl) a Trp(HCO). Ostatné zvyšky sa nechajú nechránené.

Amino-4-metylfenylmetyl-ko(polystyrén-divinylbenzén) (= MBHA-živica) (0,7 mmol/g) sa podrobí nasledujúcemu cyklu spracovania, skladajúceho sa z krokov (1) až (7):

(1) dichlórmetán, (2) 50 % kyselina trifluóroctová v dichlórmetáne, (3) dichlórmetán, (4) 10 % diizopropyletylamín v dimetylformamide, (5) dimetylformamid, (6) vopred pripravený symetrický anhydrid (1,4 mmol/g východiskovej živice) terc.butyloxykarbonylaminokyseliny v dimetylformamide, (7) dimetylformamid.

Objemy premývacich kvapalín a činidiel tvoria od 5 do 20 ml na gram východiskovej živice. Každý krok sa opakuje toľkokrát, koľkokrát je to nutné, aby sa dosiahla buď úplná reakcia živice (kroky 2, 4, 6), alebo úplné odstránenie predchádzajúceho činidla zo živice (kroky 1, 3, 5, 7). Po každom cykle sa odoberú vzorky živice a skontroluje sa pri nich dokončenie kondenzačnej reakcie kolorimetrickým testom na stanovenie zvyškových aminoskupín použitím ninhydrínu.

Symetrické anhydridy terc.butyloxykarbonylaminokyselín sa pripravia bezprostredne pred použitím reakciou 2,8 mmol terc.butyloxykarbonylaminokyseliny na g živice a 1,4 mmol dicykiohexylkarbodiimidu na g živice v dichlórmetáne, obsahujúcom dimetylformamid v množstvách dostatočných na úplné rozpustenie terc.butyloxykarbonylaminokyseliny. Zmes sa prefiltruje, k filtrátu, ktorý sa zahustí odparením prchavých zložiek pri teplote neprekračujúcej 15 °C, sa pridá ďalší dimetylformamid a výsledný roztok sa použije v kroku (6).

Cyklus reakcií (1) až (7) sa opakuje pre každý aminokyselinový zvyšok kvôli získaniu sekvencie zlúčeniny uvedenej v názve, s výnimkou v prípade Boc-Gln-OH a Boc-Arg(tosyl)-OH, ktoré sa kondenzujú v kroku (6) ako ich vopred pripravené estery s 1-hydroxybenzotriazolom v dimetylformamide.

Na živicu a naviazaným úplne vytvoreným peptidom sa nechá dvakrát pôsobiť v priebehu asi 1 hodiny 20 ml 5 % tiofenolu v dimetylformamide pri izbovej teplote a potom sa premyje dimetylformamidom, metanolom a dichlórmetánom. Živica s naviazaným peptidom sa potom znovu podrobí krokom (1) až (5), následne sa pridá 0,5 ml acetónu, 84 mg nátriumkyanoborohydridu a 0,2 ml kyseliny octovej v 20 ml dimetylformamidu na gram živice. Po 16 hodinách pri izbovej teplote sa živica premyje dimetylformamidom a dichlórmetánom a vysuší.

Živica s naviazaným peptidom sa ošetrí kvapalným chlorovodíkom, dimetylsulfidom, p-krezolom a etán-1,2-ditiolom podľa tzv. „low-high“ postupu, ktorý je opísaný napríklad v Intemational Joumal of Peptide and Proteín Research, zväzok 26, str. 262 - 273 (1985). Po odstránení prchavých zložiek a premytí etylacetátom sa zvyšok extrahuje niekoľkými dávkami 1 % kyseliny octovej, prefiltruje a filtrát lyofilizuje. Lyofilizovaný produkt sa purifíkuje opakovanou chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci C18-silikagélu použitím gradientovej elúcie s gradientom acetonitrilu v 2 % kyseline fosforečnej alebo v 20 mM tetrametylamóniumfosfátu. Frakcie obsahujúce čistú zlúčeninu sa zmiešajú, prefiitrujú cez jemne zásaditý iónomenič v acetátovom cykle a filtrát sa na získanie zlúčeniny uvedenej v názve lyofilizuje.

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4160

Príklad 2 [Lys (N^E-izopropyl)²⁶’²⁷]hPTH(l -34) NH₂

Peptid sa vytvorí, ako je opísané v príklade 1 s tým, že sa použije Lys(9-fluorenylmetoxykarbonyl) na začlenenie v polohe 13 a 9-fluorenylmetoxykarbonyl-Ser( terc.butyl) v koncovej polohe 1.

Na živicu s naviazaným úplne vytvoreným peptidom sa nechá dvakrát po 1 hodine pôsobiť 20 ml 5 % tiofenolu v dimetylfluóramide pri izbovej teplote a potom sa premyje dimetylformamidom, metanolom a dichlórmetánom. Suchá živica sa ošetrí kvapalným fluorovodíkom, ako je opísané v príklade 1. Odštiepený produkt (350 mg) sa suspenduje v zmesi 5 ml metanolu, 5 ml fosfátového pufra s pH = 5,0, 48 mg nátriumkyánborohydridu a 0,28 ml acetónu. Po 16 hodinách sa pri izbovej teplote reakčná zmes prefiltruje a filtrát sa odparí. Odparok sa suspenduje v 20 % piperidíne v dimetylformamide počas 15 minúť zmes sa zriedi dvadsaťnásobným objemom éteru a prefiltruje. Zvyšok sa rozpustí v 100 ml vody, pridaním kyseliny octovej sa upraví pH na hodnotu 3, zmes sa prefiltruje a filtrát lyofilizuje. Lyofilizát sa purifíkuje chromatografiou s obrátenými fázami na stĺpci C18-silikagélu použitím gradientovej elúcie s gradientom acetonitrilu v 2 % kyseline fosforečnej. Frakcie obsahujúce čistú zlúčeninu sa zmiešajú, prefiitrujú cez jemne zásaditý iónomenič v acetátovom cykle a filtrát sa na získanie zlúčeniny uvedenej v názve lyofilizuje. Hmotnostná spektometria (iónový spray): 4205,6 Príklad 3

N“-izopropyl [Lys (N^E-izopropyl)^13,26,27]hPTH(l-38)-OH

a) Syntéza peptidu na pevnej fáze

Peptid sa vytvorí postupným spôsobom na nosiči predstavovaným živicou na báze polystyrénu. Na chránenie a-aminoskupiny sa použije 9-fluorenylmetoxykarbonylová skupina a funkčné skupiny bočných reťazcov sa chránia nasledujúcimi skupinami uvedenými v zátvorkách: Asp(O-terc.butyl), Glu(O-terc.butyl), His(trityl), Lys(terc.butyloxykarbonyl), Asn(trityl), Gln(trityl), Arg(2,2,5,7,8-pentametylchroman-6-sulfonyl) a Ser(terc.butyl). Ostatné aminokyseliny sa nechajú nechránené.

9-Fluorenylmetoxykarbonyl-Gly esterifikovaný na 4-hydroxymetylfenoxymetyl-ko(polystyrén-divinylbenzén) (s obsahom 1 % divinylbenzénu) (0,5 mmol/g) sa použije ako východiskový materiál na postupnú syntézu na pevnej fáze, ktorá pozostáva z opakovaných cyklov odstránenia chrániacej skupiny z alfa-aminoskupiny, premytia, kondenzácie (naviazanie novej aminokyseliny) a premytia. Na kondenzáciu sa použije tri- až päťnásobný nadbytok 9-fluorenylmetoxykarbonylaminokyselín ako vopred pripravených esterov s 1-hydroxybenzotriazolom pri použití diizopropylkarbodiimidu. 9-Fluórenylmetoxykarbonyl-Arg(2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonyl), 9-fluórenyímetoxykarbonyl-Asn-(trityl) a 9-fluórenylmetoxykarbonyl-Gln(trityl)m sa kondenzujú ako symetrické anhydridy pri použití diizopropylkarbodiimidu. Po úplnom vytvorení peptidového reťazca sa chrániaca skupina Ser¹, ktorou je 9-fluórenylmetoxykarbonylová skupina, odstráni pomocou 20 % piperidínu v dimetylformamide. Odštiepenie peptidu z polystyrénovej živice a odstránenie všetkých chrániacich skupín bočných reťazcov sa vykoná tak, že sa na živicu s naviazaným peptidom nechá pôsobiť počas troch hodín pri izbovej teplote zmes 10 % etánditiolu, tioanizolu, tiokrezolu a vody v 90 % kyseline trifluóroctovej. Častice živice sa odfiltrujú a premyjú kyselinou trifíuóroctovou. Zo zmiešaných filtrátov sa vyzráža produkt pridaním éteru, odfiltruje sa a vysuší. Produkt sa purifíkuje chromatograficky na stĺpci C18-siiikagélu pri použití gradientovej elúcie s gradientom acetonitrilu v 2 % kyseline fosforečnej vo vode. Frakcie obsahujúce čistý produkt sa oddelia, prefiitrujú cez anex (Biorad, AG 4-X4, 100 - 200 mesh, v acetátovom cykle) a na získanie hPTH(l-38)-OH sa vykoná lyofilizácia.

b) Alkylácia

V 1,2 ml metanolu, 1,2 ml fosfátového pufra (Merck č. 9887 upravený na pH 5,0), 45 mg (716 mmol) nátriumkyánborohydridu (s molámou hmotnosťou 62,84 g/mol) a 0,8 ml (11 mmol) acetónu (s molámym objemom 73,52 ml/mol) sa rozpustí 40 mg (9 mol) hPTH(l-38)-OH (s molámou hmotnosťou 4458,2 g/mol). Reakcia sa sleduje pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s obrátenými fázami (RP-HPLC) na stĺpci C18-silikagélu a skončí po 15 hodinách pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa zriedi vodou a chromatografuje na stĺpci Cl8-silikagélu použitím gradientovej elúcie s gradientom acetonitrilu v 2 % kyseline fosforečnej vo vode. Frakcie obsahujúce čistú zlúčeninu sa oddelia, prefiitrujú cez anex (v acetátovom cykle) a lyofilizujú, čím sa získa zlúčenina uvedená v názve vo forme polyacetátu a polyhydrátu.

[a]_D ²⁰ = -5,7° (c = 0,317 v 95 % kyseline octovej) Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4626

Príklad 4

N“-metyl [Ala‘]PTH(l-38)-OH

Peptidový reťazec sa vytvorí rovnakým spôsobom ako v príklade 3a. V polohe 1 je k živici s naviazaným peptidom namiesto 9-fluorenylmetoxykarbonyl-Ser(terc.butyl)-OH kondenzovaná neprirodzená aminokyselina 9-fluórenylmetoxykarbonyl-N^a-metyl-Ala-OH. Odštiepenie, odstránenie chrániacich skupín a purifikácia sa vykonávajú ako v príklade 3a.

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4455,91

Príklad 5 [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Phe²³, His²⁵, His²⁶,Leu²⁷,Thr³³, Ala³⁴ ]hPTH(l-34)OH

Tento peptid sa pripraví analogicky s postupom uvedeným v príklade 3a. Namiesto 9-fluórenylmetyloxykarbonyl-Gly esterifikovaného na 4-hydroxymetylfenoxymetylko(poiystyrén-divinylbenzén) sa použije príslušná 9-fluórenylmetyloxykarbonylaminokyselina, napríklad 9-fluórenylmetoxykarbonyl-Ala, 9-fluórenylmetoxykarbonyl-Phe, 9-fluorenylmetoxykarbonyl-D-Ala, 9-fluórenylmetoxykarbonyl-D-Phe, atď. Chránia sa tiež ďalšou funkčnou skupinou bočných reťazcov, a to zvyškami uvedenými v zátvorkách: Tht(terc.butyl), Trp(terc.butyloxykarbonyl) a Tyiýterc.butyi)Opakovaním postupu opísaného v príkladoch 3 a 5, ale použitím príslušných východiskových materiálov, sa získajú nasledujúce zlúčeniny:

Príklad 6 [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸,Thr³³]hPTH(l-34)OH

Príklad?

[Ile']hPTH(l-38)OH Hmotnostná spektometria (iónový spray): 4484

Príklad 8 [Ala¹, Abu²]hPTH(l-38)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4428

Príklad 9 [Ala¹, Nva²]hPTH(l-38)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4442

Príklad 10 [Ala¹, Ile²]hPTH(l-38)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4456

Príklad 11 [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 12 [N-MeAla']hPTH(l-36)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4286

Príklad 13 [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln^l8]hPTH(l-36)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4235

Príklad 14 [Thr'jhPTHfl-38)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4472

Príklad 15 [Leu']hPTH(l-38)OH Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4484

Príklad 16 [Abu’]hPTH(l-38)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4456

Príklad 17 [Gaba']hPTH(l-38)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4456

Príklad 18 [Leu¹, Lys, Gln^I8]hPTH(l-36)OH

Príklad 19 [Leu⁸, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Arg²²]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový' spray): 4347

Príklad 20 [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4007

Príklad 21 [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3906

Príklad 22 [Leu⁸, Ala¹³, Gin¹⁸, Gin²⁵, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 23

Izopropyl-[Leu⁸, Lys(izopropyl)¹³, Gin¹⁸, Lys(izopropyl)^26,27,

Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4175

Príklad 24 lzopropyl[Leu⁸, Ala¹³, Gin¹⁸, Gin²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH-(1-34)OH

Príklad 25 [Gln¹⁶]hPTH(l-38)OH

Príklad 26 [Ser¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 27 [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, His²⁵, His²⁶,

Leu¹⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 28 [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Gin²⁶, Phe²⁷,

Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 29 [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový· spray): 3965

Príklad 30 [Leu⁸, Gin¹⁸, Ala²⁹, Glu³⁰, Ile³¹]hPTH(l-34)OH

Príklad 31 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln^l8]hPTH(l-36)OH

Príklad 32 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ser¹⁴, íle¹⁵, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹]hPTH(l-36)OH

Príklad 33 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Leu¹⁸]hPTH(l-36)OH

Príklad 34 [Leu⁸, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹]hPTH(l-36)OH

Príklad 35 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁷, Leu^ls]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray); 4252

Príklad 36 [Leu⁸, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁵, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 37 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4022

Príklad 38 [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Príklad 39 [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Príklad 40 [Leu⁸, Gin¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 41 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, A

-la³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4077

Príklad 42 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4181

Príklad 43 [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Hmotnostnáspektrometria(iónový spray): 4193

Príklad 44 [Leu⁸, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4149

Príklad 45 [Leu⁸, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Príklad 46 [Leu⁸, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4219

Príklad 47 [Leu⁸, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3960

Príklad 48 [Leu⁸, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Príklad 49 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3980

Príklad 50 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4240

Príklad 51 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH-(1-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3923

Príklad 52 [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4225

Príklad 53 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³]hPTH(l-34)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3999

Príklad 54 [Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³]hPTH-(J-34)OH

Príklad 55 [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(l-36)OH

Príklad 56 [Ile^l5]hPTH(l-38)OH

Príklad 57 [Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², His²⁶, Leu²⁷, Thr³³,

Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 58 [Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Arg¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, ·Πιγ³³,Α -la³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 59 [Leu⁸, Ser¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(l-36)OH

Príklad 60 [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Arg²⁶, Arg²⁷]hPTH(l-36)OH

Príklad 61 [Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Arg³³, A -la³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 62 [Leu⁸, Ala^16,17'^18,19]hPTH(l -36)OH

Príklad 63 [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Gin²⁶, Phe²⁷]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4127

Príklad 64

Izopropyl-[Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Gin²⁶, Phe²⁷]hPTH(I-36)OH

Príklad 65

Izopropyl-[Leu⁸, Lys(izopropyl)¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹,Lys(izopropyl)^26,27]hPTH( 1 -36)OH

Príklad 66 [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4166

Príklad 67

Izopropyl-[Leu⁸, Lys(izopropyl)¹³,Ala¹⁶, Ala¹⁷, Ala¹⁸, Ala¹⁹, Lys-(izopropyl^26,27)]hPTH( 1 -36)OH

Príklad 68 [Aib³,Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

SK 283485 Β6

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4283

Príklad 69

Izopropyl-[Leu⁸,Asp¹⁰,Lys(izopropyl)'¹³'^26,27,Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH

Príklad 70

Izopropyl-[Leu⁸,Ser¹³,Ala^le,Gln^I8,Ala^I9,Arg²²,Lys(izopropyl)^26,27]hPTH(l-36)OH

Príklad 71 [Leu⁸,Tyr¹⁸]hPTH(l-36)OH

Príklad 72 [Ser^hPTHO-aSjOH

Príklad 73 [Thr³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 74 [Leu³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 75 [Gly”]hPTH(l-38)OH

Príklad 76 [Leu⁸,His' °,Gln¹⁸,Arg²²,Thr³³Ala³⁴]hPTH( 1 -34)OH

Príklad 77 [Leu⁸,Gly¹⁰,Gln¹⁸,Arg²²,Thr³³Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 78 [Leu⁸,Glu^lo,Gln¹⁸,Arg²²,Thr³³Ala^M]hPTH(l-34)OH

Príklad 79 [Leu⁸,Thr^lo,Gln¹⁸,Arg²²,Thr³³Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 80 [Leu⁸,Gln'°,Gln¹⁸,Arg²²,Thr³³Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 81 [Gln³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 82 [Leu⁸,Tyr^lo,Gln¹⁸,Arg²²,Thr^MAla³⁴]hPTH(l-34)OH

Príklad 83 [Kyselina 1-aminocyklopentán-l-karboxylová¹, Leu⁸, Αία'⁶, Gin¹⁸, Ala^l9]hPTH(l-36)OH

Príklad 84 [Kyselina 1-aminocyklopentán-l-karboxylová¹, Leu⁸, Ala¹³’¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹Arg^2W7]hPTH(l-36)OH

Príklad 85 [Kyselina 1-aminocyklopentán-l-karboxylová³, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4309

Príklad 86 [Arg¹²]hPTH(l-38)OH

Príklad 87 [Ser¹²]hPTH(l-38)OH

Príklad 88 [Cys¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 89 [Ile'³]hPTH(l-38)OH

Príklad 90 [Asn¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 91 [Trp¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 92 [Asp¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 93 [Val¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 94 [Thr¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 95 [Ser¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 96 [Tyr¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 97 [Met¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 98 [Gln¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 99 [Leu¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 100 [Ala¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 101 [Gly^,3]hPTH(l-38)OH

Príklad 102 [Val¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 103 [Ala¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 104 [Lys¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 105 [Arg^l4]hPTH(l-38)OH

Príklad 106 [Thr¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 107 [Ile¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 108 [Tyr¹⁴]hPTH(l-38)OH

Príklad 109 [Tyr¹³]hPTH(l-38)OH

Príklad 110 [Arg^ls]hPTH(l-38)OH

Príkladlll [Val'⁵]hPTH(l-38)OH	Príklad 133 [Arg¹⁹]hPTH(l-38)OH
Príklad 112 [Lys¹⁶]hPTH(l-38)OH	Príklad 134 [Phe^2O]hPTH(l-38)OH
Príklad 113 [Ser^l6]hPTH(l-38)OH	Príklad 135 [Ala²¹]hPTH(l-38)OH
Príklad 114 [Lcu^I6]hPTH(l-38)OH	Príklad 136 [Ο1/']ΗΡΤΗ(1-38)ΟΗ
Príklad 115 [Ala^,s]hPTH(l-38)OH	Príklad 137 [Phe²¹]hPTH(l-38)OH
Príklad 116 [Gly¹⁶]hPTH(l-38)OH	Príklad 138 [Leu²¹]hPTH(l-38)OH
Príklad 117 [Ala¹⁷]hPTH(l-38)OH	Príklad 139 [Asn²']hPTH(l-38)OH
Príklad 118 [Met¹⁷]hPTH(l-38)OH	Príklad 140 [Gln²¹]hPTH(l-38)OH
Príklad 119 [Ile^l7]hPTH(l-38)OH	Príklad 141 [Ser^2l]hPTH(l-38)OH
Príklad 120 [Ser^I9]hPTH(l-38)OH	Príklad 142 [α/²]1ιΡΤΗ(1-38)ΟΗ
Príklad 121 [Lys'⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 143 [Leu²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 122 [Leu'⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 144 [His²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 123 [Ala^l9]hPTH(l-38)OH	Príklad 145 [Ala²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 124 [Tyr¹⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 146 [Ile²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 125 [Met^I9]hPTH(l-38)OH	Príklad 147 [Val²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 126 [His¹⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 148 [Ser²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 127 [Val¹⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 149 [Arg²²]hPTH(l-38)OH
Príklad 128 [Giy^l9]hPTH(l-38)OH	Príklad 150 [Arg²⁶]hPTH(l-38)OH
Príklad 129 [Pro¹⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 151 [Val²⁷]hPTH(l-38)OH
Príklad 130 [Asp'⁹]hPTH(l-38)OH	Príklad 152 [Ile²⁷]hPTH(l-38)OH
Príklad 131 [Ile^l9]hPTH(l-38)OH	Príklad 153 [Leu²⁷]hPTH(l-38)OH
Príklad 132 [Val¹⁹,Gln²⁴]hPTH(l-38)OH	Príklad 154 [Arg²⁷]hPTH(l-38)OH

Príklad 155 [Ala²⁷]hPTH(l-38)OH

Príklad 156 [Val²⁸]hPTH(l-38)OH

Príklad 157 [Ile^2S]hPTH(l-38)OH

Príklad 158 [Pro’,Thr¹’]hPTH( 1-38)011

Príklad 159 [Arg³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 160 [Pro³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 161 [Asp³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 162 [Ile³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 163 [Lys³³]hPTH(l-38)OH

Príklad 164 [íle³¹, Arg^3J]hPTH(l-38)OH

Príklad 165 [Kyselina l-aminocyklopentán-l-karboxylová^!]hPTH(l-36)NH₂

Peptid sa vytvorí postupným spôsobom na nosiči, ktorý predstavuje živica na báze polystyrénu. Na chránenie a-aminoskupín sa použije 9-íluórenylmetoxykarbonylová skupina.

Funkčné skupiny bočných reťazcov sa chránia nasledujúcimi skupinami uvedenými v zátvorkách: Arg(2,2,5,7,8-pentametylchróman-ó-sulfonyl), Asn(trityl), Asp(O-terc.butyl), Gln(trityl), Glu((O-terc.butyl), His(trityl), Lys(terc.butyioxykarbonyl), Ser(terc.butyl), Thr(terc.butyl), Trp(terc.butyloxykarbonyl) a Tyr(terc.butyl). Ostatné aminokyseliny sa nechajú nechránené.

4-(2‘,4‘-Dimetoxyfenyl-9-fluórenylmetoxykarbonylaminokarbonyl)fenoxy-ko(polystyrén-divinylbenzén) (0,4 mmol/g), ktoré možno pripraviť napríklad ako je opísané v Tetrah. Letters, 28, 3787 - 3790 (1987) sa podrobí nasledujúcemu cyklu spracovania, pozostávajúcemu z krokov (1) až (5):

(1) dimetylformamid, (2) 20 % piperidín v dimetylformamide, (3) dimetylformamid, (4) zmes 1-hydroxybenzotriazolu, diizopropylkarbodiimidu a 9-fluórenylmetoxykarbonylalanínu (každý v množstve 0,8 mmol na gram východiskovej živice), (5) dimetylformamid.

Objemy premývacích kvapalín a činidiel tvoria od 5 do 20 ml na gram východiskovej živice.

V nasledujúcom cykle spracovania (1) až (5) je 9-fluórenylmetoxykarbonylalanín nahradený 9-fluorenylmetoxykarbonylvalínom, a takto sa postupuje v každom cykle, aby sa na živici vytvorila správna sekvencia aminokyselín zlúčeniny uvedenej v názve.

Každý krok sa opakuje toľkokrát, koľkokrát je to nutné, aby sa dosiahla buď úplná reakcia živice (kroky 2, 4) alebo úplné odstránenie predchádzajúceho činidla alebo činidiel zo živice (kroky 3, 5). Po každom cykle sa odoberú vzorky živice a skontroluje sa v nich dokončenie kondenzačnej re akcie kolorimetrickým testom na stanovenie zvyškových aminoskupín pri použití ninhydrínu.

Na konci syntézy sa uskutoční koncový cyklus obsahujúci iba kroky (1) až (3) a živice s naviazaným peptidom sa premyje 2-propanolom, potom zmesou metanolu a metylénchloridu v pomere 1 : 1 (objem/objem) a dôkladne vysuší vo vákuovom exikátore.

g živice s naviazaným peptidom sa suspenduje v 20 ml zmesi kyseliny trifluóroctovej, vody a 1,2-etánditiolu v pomere 90 : 5 : 5 (objem/objem) 2 hodiny pri izbovej teplote, častice živice sa odfiltrujú a premyjú malým objemom kyseliny trifluóroctovej. Produkt sa vyzráža zo zmiešaných filtrátov pridaním dvadsaťnásobného objemu éteru, odfiltruje sa, premyje ďalším éterom a vysuší. Zvyšok sa rozpustí v 2 % kyseline octovej, roztok sa nechá stáť pri izbovej teplote 8 hodín a potom sa uskutoční lyofilizácia. Lyofilizát sa chromatograftije na stĺpci C18-silikagélu použitím gradientovej elúcie s gradientom acetonitrilu v 2 % kyseline fosforečnej. Frakcie sa kontrolujú analytickou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou a tie z nich, ktoré obsahujú čistú zlúčeninu sa odoberú, prefiltrujú cez anex v acetátovom cykle a uskutoční sa lyofilizácia, čím sa získa zlúčenina uvedená v názve ako polyacetát a polyhydrát.

Kyselinu 9-fluórenylmetoxykarbonyl-1 -aminocyklopentán-1-karboxylovú používanú pri príprave intermediárnej živice s naviazaným peptidom možno pripraviť napríklad podľa opisu - G. Valle a kol., 1988, v Can. J. Chem. 66: 2575 - 2582.

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4312

Príklad 166 [Kyselina 1 -(1 -aminocyklopropán-1 -karboxylová]hPTH( 1 -36)NH₂

Tento peptid sa pripraví analogicky s postupom opísaným v príklade 165. Kyselinu 9-fluórenylmetoxykarbonyl-1-aminocyklopropán-l-karboxylovú používanú pri príprave intermediámej živice s naviazaným peptidom možno pripraviť napríklad podľa opisu - M. Crisma a kol. (1989) v Int. J. Biol. Macromol. 11: 345 - 352.

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4283

Opakovaním postupu opísaného v príklade 165, ale použitím príslušných východiskových materiálov, sa získajú nasledujúce zlúčeniny:

Príklad 167 [D-Pro¹]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 168 [Nva']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 169 [NMeSer’jhPTHjl-SójNHj

Príklad 170 [Kyselina indol-2-karboxylová¹]hPTH(l -36)NH₂

Príklad 171 [Kyselina indol-3-karboxylová’]hPTH(l -36)NH₂

Príklad 172 [kyselina pyridín-3-karboxylová’]hPTH(l -36)NH₂

Príklad 173 [kyselina pyridín-2-karboxylová’]hPTH(l -36)NH₂

Príklad 174 [Kyselina hexahydropyridazín-3-karboxylová‘]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 175 [Kyselina morfolín-2-karboxylová’]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 176 [Pro']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 177 [Leu’]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 178 [I1e']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 179 [Thr”, AIa^M]hPTH( 1 -34)NH₂

Príklad 180 [Nva⁸]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 181 [Gln^,s]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 182 [Tyr¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 183 [Lys¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 184 [Ala¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 185 [Phe²³,His²⁵,His²⁶,Leu²⁷]hPTH(l-34)NH₂

Príklad 186 [Phe²³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4247

Príklad 187 [Phe²³)His²⁵,His²⁶,Leu²⁷,Ile²⁸,Ala²⁹,Glu^3O,ne³',Thr³³,Ala³⁴]hPTH(l-34)NH2

Hmotnostná spektrometria (iónový spray); 3934

Príklad 188 [Ala²⁹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4248

Príklad 189 [Ala³⁴]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4210

Príklad 190 [Gln²⁵]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 191 [Leu⁸,Asp¹⁰,Lys“,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(l-34)NH₂

Príklad 192 [Ala^l,His⁵,Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Thr³³,AJa³⁴]hPTH(J-34)NH₂

Príklad 193 [Ser¹⁴,lle¹⁵,Gln’⁶,Asp¹⁷,Leu¹⁸,Arg¹’,Thr³³,Ala³⁴]hPTH(l-34)NH₂

Príklad 194 [D-Phe³⁴,D-AIa³⁶]hPTH(l -36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4290

Príklad 195 [Ala³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271

Príklad 196 [D-Ser³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4290

Príklad 197 [D-GJu⁴]hPTH(]-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4290

Príklad 198 [D-His⁹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4286

Príklad 199 [Ala¹⁰]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4243

Príklad 200 [D-Asn‘°]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 201 [Ala^,2]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray); 4299

Príklad 202 [Gln'³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4287

Príklad 203 [His¹³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4296

Príklad 204 [Leu^l3]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4371

Príklad 205 [Ala¹³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4228

Príklad 206 [Ala^l3,Gln²⁶,Phe²⁷,D-Phe³⁴,D-Ala³⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4249

Príklad 207 [Ala^l4]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4219

Príklad 208 [D-His¹⁴]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 209 [D-Asn'⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4284

Príklad 210 [Ala'⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4270

SK 283485 Β6

Príklad 211 [D-Ser'⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 212 [Ala¹⁹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4228

Príklad 213 [D-Glu^l9]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 214 [Ala²¹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4257

Príklad 215 [Ala²²]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4227

Príklad 216 [Gln²⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4287

Príklad 217 [Nle²⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271

Príklad 218 [D-Lys²⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 219 [Nle⁸’^l8,27]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 220 [His²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4294

Príklad 221 [Phe²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4304

Príklad 222 [Nle²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271

Príklad 223 [Asn²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271

Príklad 224 [Ala²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4228

Príklad 225 [D-Gln²’]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4289

Príklad 226 [D-Asp^w]hPTH(l-34)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4118

Príklad 227 [Ala^3O]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4241

Príklad 228 [D-Val³¹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4290

Príklad 229 [Ala^3l]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4258

Príklad 230 [Lys³²]hPTH(l-34)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 3832

Príklad 231 [D-His³²]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 232 [Ala³²]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4219

Príklad 233 [S-Asn³³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 234 [Ala³³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4210

Príklad 235 [NMePhe³⁴]hPTH( 1 -36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4301

Príklad 236 [D-Asp^3O]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4290

Príklad 237

Izopropyl-[Nle⁸¹⁸Lys(izopropyl)¹³'²⁶’²⁷,D-Asn³³,D-Phe³⁴]hPTH-(l-34)NH₂

Príklad 238

Izopropyl-[Nle⁸'^ls'²⁷Lys(izopropyl)^l3’²⁶]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 239 [Nie⁸·¹⁸, D-Asn³³, D-Phe^M]hPTH(l-34)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4080

Príklad 240 [Lys(izopropyl^l3]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4331

Príklad 241

Proparyl-[ A¹ ]hPTH( 1 -36)NH₂

Príklad 242 [Ala°]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 243 [Pro°]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 244

Acetyl-hPTH(l-36)NH₂

Príklad 245 [HyPro']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 246

N-Dimetyl-[Ala']hPTH( 1 -36)NH₂

Príklad 247 [D-Scr']hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 248 (Lys(For']hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4356

Príklad 249 [Kyselina D-glycerová']hPTH(l -36)NH₂

Príklad 250 [Asn']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 251 [Kyselina 4-aminobenzoová¹]hPTH( 1 -36)NH₂

Príklad 252 [Kyselina 4-aminosalicylová¹ ]hPTH( 1 -36)NH₂

Príklad 253 [TMSA‘]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4343

Príklad 254 [Phe']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 255 [Propargylglycín¹]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 256 [Ala¹, His⁵, Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Gin¹⁸, Phe²², Phe²³, His²⁵,

His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)NH₂

Príklad 257 [Abu²]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 258 [D-Val²]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray):4288

Príklad 259 [Terc.Leu²]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 260 [Ala']hPTH(l-36)NH₂

Príklad 261 [D-Ile⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 262 [D-Gln^č]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 263 [D-Leu⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 264 [Nle⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4268

Príklad 265 [Phe⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4303

Príklad 266 [Cha⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4309

Príklad 267 [Leu^s]hPTH(l-38)NH₂

Príklad 268 [D-Leu¹¹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4287

Príklad 269 [Ala¹¹]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4244

Príklad 270 [D-Lys¹³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 271 [D-Leu¹⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 272 [Ala¹⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4243

Príklad 273 [Ala¹⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4243

Príklad 274 [Met(O₂)¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4320

Príklad 275 [Nle^I8]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4268

Príklad 276 [D-Met¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 277 [Lys^2O]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4259

Príklad 278 [D-Ard^2O]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 279 [D-Val^2l]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 280 [Trp(SO₂Pmc)²³]hPTH( 1 -38)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4723

Príklad 281 [Trp(Pmc)²³]hPTH(l-38)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4660

Príklad 282 [D-Trp²³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 283 [Ala²³]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový· spray): 4171

Príklad 284 [D-Leu²⁴]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 285 [Phe²⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4277

Príklad 286 [Lys²⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4258

Príklad 287 [Ala²⁵]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový- spray): 4201

Príklad 288 [Ala²⁶]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4229

Príklad 289 [Lys^26Z27(For)]hPTH(l -34)NH₂

Príklad 290 [D-Lys²⁷]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový- spray): 4288

Príklad 291 [D-Leu²⁸]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 292 [D-Phe³⁴]hPTH(l-36)NH₂

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4288

Príklad 293 [D-Vaľ³⁵]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 294 [Ala³⁵]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 295 [Pro³⁵]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 296 [NMeVal³⁵]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 297 [Thr³⁵, Ala³⁶]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 298 [D-Ala³⁶]hPTH(l-36)NH₂

Príklad 299 [NMeAla^3ó]hPTH(l -36)NH₂

Príklad 300 (5-Amino-4-fluór-2-izopropyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)NH₂

a) Príprava hPTH(3-36)-NH-živice

Tento medziprodukt sa pripraví analogicky s postupom podľa príkladu 165

b) [(5-Amino-4-fluór-2-izopropyl)-3-hexenoyl]hPTH(3-36)-amid

Na 204,6 g 9-fluórenylmetoxykarbonyl-hPTH(3-36)-NH-živice získanej v bode a) sa nechá pôsobiť počas 5 minút dimetylformamid, a potom sa niekoľkokrát premyje izopropanolom a dimetylformamidom. Chrániaca 9-fluórenylmetoxykarbonylová skupina sa odstráni pôsobením zmesi dimetylformamidu a piperidínu v pomere 8 : 2 počas 10 minút. PTH-fragmcnt zbavený chrániacich skupín, 38,1 mg kyseliny 4-fluór-2-izopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénovej, 68,7 mg l-benzotriazolyloxytris(pyrrolidinojfosfónium-hexafluórfosfátu (PyBOP) a 26,6 mg 4-metylmorfolínu sa trepe počas 80 minút v 0,7 ml dimetylformamidu. Po niekoľkých premytiach izopropanolom a dimetylformamidom sa na pevný zvyšok nechá pôsobiť počas 55 minút zmes 4,5 ml kyseliny trifluóroctovcj, 0,25 ml vody a 0,25 ml etánditiolu. Táto zmes sa potom prefiltruje a pridaním dietyléteru sa zlúčenina uvedená v názve vyzráža zo zvyšného roztoku. Zlúčenina uvedená v názve sa purifikuje pomocou preparatívnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie na kolóne Vydac pri použití gradientovej elúcie (A = voda, B = zmes acetonitrilu, vody a kyseliny fosforečnej v pomere 7:3: 0,2).

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4272 [a]^H836s nm ⁼ -66,8° (c = 0,25 v 95 % kyseline octovej)

Príklad 301 4-Fluór-2-izopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenoát

a) (S)-3-(l -oxo(4-Fluór-3-hydroxy-2-izopropyl)-4-hexenyl)-4-fenylmetyl-2-oxazolidinón

Zlúčenina uvedená v názve sa pripravia analogicky s postupom, ktorý opísali D. A. Evans a kol., Org. Synth. 68, 1990, pri použití (S)-3-(l-oxoizobutyl)-4-fenylmetyl-2-oxazolidinónu a 2-fluór-2-butenolu ako východiskových látok. Hmotnostná spektrometria (FAB - ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺ 350

b) (S)-3-(l-oxo(4-Fluór-3-0-(2,2,2-trichlóretánimino)-2-izopropyl)-4-hexenyl)-4-fenylmetyl-2-oxazolidinón

1,5 g zlúčeniny z príkladu 301a) sa rozpustí v 6 ml dichlórmetánu. Pri teplote 0 °C sa pridá 0,0958 ml 1,8-diazabicyklo(5,4,0)-7-undecénu (DBU). K tomuto roztoku sa pri teplote 0 °C po kvapkách pridá 0,475 ml trichlóracetonitrilu v 2 ml dichlórmetánu. Po 1 hodine sa reakčná zmes odparí a odparok sa purifikuje stĺpcovou chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi hexánu a dietyléteru v pomere 2 : 1 ako elučného činidla.

Hmotnostná spektrometria (FAB - ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺ 493

c) (S)-3-(l-oxo(4-Fluór-6-N-2,2,2-trichlóracetylamino)-2-izopropyl)-3-hexenyl)-4-fenylmetyl-2-oxazolidinón g zlúčeniny z príkladu 301b) sa rozpustí v 150 ml o-xylénu a zmes sa mieša pri zahrievaní na teplotu I60°C pod spätným chladičom 3 hodiny. Potom sa oxylén odstráni a zvyšok sa purifikuje stĺpcovou chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi toluénu a etylacetátu v pomere 98 : 2 ako elučného činidla.

d) Kyselina 4-fluór-5-N-2,2,2-trichlóracetylamino)-2-izopropyl)-3-hexénová

Zlúčenina uvedená v názve sa pripraví analogicky s postupom, ktorý opísali D. A. Evans a kol., Org. Synth. 68, 1990, ale pri použití ako východiskového materiálu zlúčeniny z príkladu 301c).

Hmotnostná spektrometria (FAB - ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺ 335

e) Kyselina 5-amino-4-fluór-2-izopropyl-3-hexénová

899 mg zlúčeniny z príkladu 301 d) sa rozpustí v 20 ml etanolu a pridá sa 13,5 ml 6N roztoku hydroxidu sodného. Táto zmes sa mieša pri izbovej teplote 20 hodín. Potom sa etanol odstráni, zvyšná vodná frakcia sa okyslí 2N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 2 a zmes sa extrahuje n-butanolom. Extrakt sa odparí a odparok sa prefiltruje cez silikagél pri použití zmesi dichlórmetánu a metanolu v pomere 1 : 1 ako elučného činidla, čím sa získa čistá zlúčenina uvedená v názve.

Hmotnostná spektrometria (FAB - ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺ 190

f) Kyselina 4-fluór-2-izopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová

0,56 g zlúčeniny z príkladu 301 e) sa rozpustí v 12 ml vody a pridá sa 1,5 g uhličitanu sodného. K tomuto roztoku sa pridá 0,4 g diterc.butylkarbonátu rozpusteného v 12 ml tetrahydrofuránu. Zmes sa mieša pri izbovej teplote 18 hodín. Potom sa pridá 50 ml n-butanolu a 50 ml vody a pri intenzívnom miešaní sa pridáva IN kyselina chlorovodíková až do dosiahnutia pH = 2. Organická frakcia sa odparí a odparok sa purifikuje stĺpcovou chromatografiou na silikagéli pri použití zmesi hexánu a acetónu v pomere 1 : 2 ako elučného činidla.

Hmotnostná spektrometria (FAB - ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺ 290 [a]_D = -61,3° (1 % v metanole)

Opakovaním uvedených postupov sa pri použití príslušných východiskových materiálov pripravia nasledujúce zlúčeniny:

kyselina 4-fluór-2-metyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová, kyselina 4-chlór-2-metyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová, kyselina 4-fluór-2-benzyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová, kyselina 4-chlór-2-izopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová, kyselina 4-metyl-2-izopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexénová.

Príklad 302

Podľa postupu z príkladu 300, ale pri použití príslušných východiskových materiálov, sa pripravia nasledujúce zlúčeniny: (5-amino-4-fluór-2-metyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid, Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4245, (5-amino-4-chlór-2-metyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid, Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4260, (5-amino-4-fluór-2-benzyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid, Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4320, (5-amino-4-chlór-2-izopropyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid,

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4289, (5-amino-4-metyl-2-izopropyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid,

Hmotnostná spektrometria (iónový spray): zistená hmotnosť 4269.

Príklad 303

Podľa postupu z príkladu 300, ale pri použití príslušných východiskových materiálov, sa pripravia nasledujúce zlúčeniny:

a) 5-Amino-3-aza-2-izopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid, (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4257), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánovej.

b) 5-Amino-3-aza-3-N-acetyl-2-izopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4299), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánovej.

c) 5 -Amino-3 -aza-3 -N-acetyl)hexanoyl-hPTH(3 -3 6)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4257), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)hexánovej.

d) 5-Metylamino-3-aza-2-izopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny [4-aza-2-(N-terc.-butoxykarbonyl-N-metylamino)-5-izopropyl]hexánovej

e) 5-Metylamino-3-aza-3-N-metyl-2-izopropyl)hexanoyl-hPTH-(3-36)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4285), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny [4-aza-4-N-metyl-2-(N-terc.butoxykarbonylamino)-5-izopropyl]hexánovej

f) 5-Amino-3-aza-3-N-metyl-2-izopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4271), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza-4-N-metyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánovej

g) 5-Amino-3-aza-3-N-izopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4257), pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza-4-N-izopropyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-ízopropyl)hexánovej

h) [Kyselina l-cyklopentán-l-amino-l-karboxylová(psí CH₂-NH)-Val²]-hPTH(l-36)-amid, pričom sa ako východiskový materiál použije kyselina 1-cyklopentán-l-terc.butoxykarbonylamino-1 -karboxylová(psi CH₂-NH)-Val-OH.

Príklad 304

Podľa postupu z príkladu 3a) skôr, ale pri použití príslušných východiskových materiálov, sa pripraví nasledujúca zlúčenina: (5-amino-3-aza-2-izopropyl)hexanoyI-[Leu⁸,Ala^l6,Gln¹⁸,ALa¹⁹]-hPTH(3-36)OH (Hmotnostná spektrometria (iónový spray): 4135) pri použití ako východiskového materiálu kyseliny (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino)hexánovej

Príklad 305

Kyselina (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)-5-izopropyl)hexánová

a) Kyselina metyl(4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)-hexánová

Boc-Ala-Val-OMe sa ošetria Lawessonovým činidlom (S. O. Lawesson a kol., Tetrahedron, 1981, 37, 3635). Výsledný endotiopeptid sa potom redukuje podľa postupu, ktorý opísali F. S. Guziec akol., THL, 1990, 23 - 26. Hmotnostná spektrometria (ionizácia nárazom elektrónov): MH⁺ 289

b) Metyl(4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)-5-izopropyljhexanoát

264 mg zlúčeniny z príkladu 305a) sa rozpustí v 5 ml dichlórmetánu a potom sa pridá 0,14 ml trietylaminu a 0,072 ml acetylchloridu. Táto zmes sa mieša pri teplote 40 °C 24 hodín. Po pridaní 50 ml dichlórmetánu sa roztok dvakrát premyje vodou. Organická frakcia sa vysuší a odparí. Takto získaná zlúčenina uvedená v názve sa purifikuje stĺpcovou chromatografiou pri použití zmesi hexánu a etylacetátu v pomere 4 :1 ako elučného činidla.

Hmotnostná spektrometria (ionizácia nárazom elektrónov): M⁺330

c) Kyselina (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)-5-izopropyl)hexánová

356 mg zlúčeniny z príkladu 305b) sa rozpustí v 4 ml zmesi metanolu a vody v pomere 3:1a pridá sa 53 mg hydroxidu lítneho. Táto zmes sa mieša pri teplote 60 °C dve hodiny. Potom sa pridá 25 ml dichlórmetánu a pri intenzívnom miešaní sa pridáva IN kyselina chlorovodíková až po dosiahnutie pH = 2. Organická frakcia sa oddelí, vysuší a odparí, čím sa získa zlúčenina v čistej forme uvedená v názve.

Hmotnostná spektrometria (ionizácia rýchlymi neutrálnymi časticami): MH⁺317

Opakovaním tohto postupu, ale pri použití príslušných východiskových materiálov, sa získajú nasledujúce zlúčeniny:

kyselina (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)hexánová, kyselina (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánová, kyselina [4-aza-2-(N-terc.butoxykarbonyl-N-metylamino-5-izopropyl)hexánová, kyselina (4-aza-4-N-metyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánová, kyselina (4-aza-4-N-izopropyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-izopropyl)hexánová, kyselina (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino)hexánová.

Zlúčeniny z príkladov 1 až 300 a 302 až 304 majú pri kvantitatívnej aminokyselinovej analýze správne pomery aminokyselín.

V nasledujúcich príkladoch ilustrujúcich rekombinantný spôsob podľa vynálezu, pokiaľ nie je uvedené inak, sa používajú štandardné postupy, ktoré opísali Ausubel a kol., 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York.

Príklad 306

Klonovanie génu 55 bakteriofága T4

Dva DNA-fragmenty, z ktorých jeden obsahuje celú kódujúcu sekvenciu génu 55 bakteriofága T4, a druhý fragment kóduje časti tohto génu, sa amplifikujú pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pri použití purifikovanej T4-DNA ako matrice. Ako priméry sa použijú oligonukleotidy, ktoré obsahujú rozpoznávacie miesta pre endonukleázu Ndel alebo BamHI. Reakcia PCR (25 cyklov, z ktorých každý pozostáva z 30 s pri teplote 94 °C, 30 s pri 50 °C a 30 s pri 72 °C) sa uskutočňuje s 1 ng matrice a 100 pM upstream-priméru (znázorneného ako SEQ ID č. 5, pričom rozpoznávacie miesto pre Ndel je tvorené jeho nukleotidmi 7 - 12) a 100 pM downstream-priméru (znázorneného ako SEQ ID č. 6, pričom rozpoznávacie miesto pre BamHI je tvorené jeho nukleotidmi 5 - 10) v 100 1 reakčného pufra, ktorý obsahuje 10 mM Tris-HCl, 50 mM chlorid draselný, 1,5 mM chlorid horečnatý, 0,2 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, a 0,1 % Triton X 100, pH 9,0. Získa sa fragment s veľkosťou 0,6 kb.

Skrátená forma génu 55 sa pripraví pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, ako je opísaná pre celý gén s tým rozdielom, že sa použije iný oligonukleotid ako downstream-primér (znázornený ako SEQ ID č. 7, pričom rozpoznávacie miesto pre BamHI je tvorené jeho nukleotidmi 5 - 10). Získa sa fragment s veľkosťou 0,35 kb.

Tieto DNA-fragmenty s veľkosťou 0,6 kb a 0,35 kb sa rozštiepia reštrikčnými endonukleázami Ndel a BamHI a klonujú sa do expresívneho vektora pET17B (získaného od firmy Novagen), rozštiepeného Ndel a BamHI. DNA-fragment s veľkosťou 0,6 kb kóduje celý protein gp55 (188 aminokyselinových zvyškov - pozri SEQ ID č. 1), zatiaľ čo fragment s veľkosťou 0,35 kb kóduje N-koncový fragment gp55 s hmotnosťou 12 kD (112 aminokyselinových zvyškov - pozri SEQ ID č. 3).

Príklad 307

Príprava a klonovanie DNA kódujúcej hPTH(l-38)OH

DNA-fragmenty kódujúce a) spojovníkový peptid zodpovedajúci aminokyselinovým zvyškom 110 - 115 v SWQ ID č. 1 a hPTH- (1-38) alebo b) spojovníkový peptid zodpovedajúci aminokyselinovým zvyškom 186 - 191 v SEQ ID č. 3 a hPTH(l-38) sa vytvoria pomocou polymerázovej reťazovej reakcie pri použití klonovanej syntetickej kódujúcej sekvencie PTH(l-38) ako matrice. Ako upstream-priméry sa použijú oligonukleotidv kódujúce spojovník a) (SEQ ID č. 8) alebo spojovník b) (SEQ ID č. 9). Downstream-primér je znázornený ako SEQ ID č. 10. Každý z upstream-primérov obsahuje klonovacie miesto BamHI a down-stream-primér obsahuje rozpoznávacie miesto pre Xhol (nukleotidy 5 - 10 každej zo sekvencii). Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočňuje pri rovnakých podmienkach ako sú opísané v príklade 306.

Po rozštiepení BamHI a Xhol sa produkty polymerázovej reťazovej reakcie s veľkosťou 0,23 kb inzertujú do plazmidov gp55-pET17B získaných v príklade 306, rozštiepených BamHI a Xhol.

Na expresiu fúznych proteínov sa výsledné skonštruované plazmidy transformujú do Escherichia coli BL21 (DE3) LysE, a jednotlivé bakteriálne kolónie sa ďalej rozmnožujú. Expresia fúznych proteínov sa dosiahne inkubáciou prípravnej kultúry pri teplote 37 °C na rotačnej trepačke cez noc v rastovom médiu circle growth médium Bio 101. Hlavná kultúra sa inokuluje prípravnou kultúrou tvoriacou 1 až 5 % objemu hlavnej kultúry. Hlavná kultúra sa potom fermentuje pri teplote 37 °C a pri pH 6,9 až 7,1, pričom sa prevzdušňuje 10 1 za minútu a mieša sa rýchlosťou 200 - 400 otáčok za minútu. Expresia sa indukuje pridaním lmM izopropyl-beta-tiogalaktozidu (IPTG), sotva kultúra dosiahne optickú denzitu OD₅₅o približne 1,0 až 5,0. Po indukcii sa vo fermentácii pokračuje päť hodín a potom sa z fermentačnej zmesi izolujú bunky Escherichia coli bez ich usmrtenia. Izolované bunky sa centrifugujú na tubulámej odstredivke, resuspendujú v pufre a expresia sa testuje pomocou elektroforézy v SDS-polyakrylamidovom géli. Potom sa zmrazí bunková paleta až do purifikácie. Použité postupy a hostiteľské bunky sú opísané v práci, ktorú publikovali Studier a kol., 1990, „Use of T7 RNA Polymerase to direct expression of Cloned Genes“, Methods in Enzymology, Academic Press, str. 60 až 89.

Príklad 308

Preparácia inklúznych teliesok

Zmrazené pelety Escherichia coli získané v príklade 307 sa resuspendujú v koncentrácii 25 % (hmotnosť/objem) v pufri A (50 mM Tris (trís(hydroxymetyl)aminometán) s pH 8,0, obsahujúci 2 mM ditiotreitol, 5 mM benzamidín-hydrochlorid, 1,5 mM chlorid horečnatý', 1,0 mM chlorid manganatý, 10 g/ml DNAzy 1 a 2 mg/ml Lyzozýmu) a zmes sa mieša 1 hodinu pri izbovej teplote. Resuspendované bunky sa lýzujú dvojitým prelisovaním tlakom 120 MPa na Manton-Gaulinovom homogenizéri a výsledný lyzát sa chladí na ľade. Lyzát sa dvojnásobne nariedi pufrom B (50 mM Tris s pH 8,0, obsahujúci 2 mM ditiotreitol, 5 mM benzamidín-hydrochlorid a 4 mM kyselinu etyléndiamintetraoctovú), ktorý má teplotu ľadu a zmes sa centrifúguje 30 minút pri 27 500 g.

Supematant z centrifúgy sa opatrne odstráni. Peleta sa resuspenduje na koncentráciu 25 % (hmotnosť/objem) v pufre B, ešte raz sa prelisuje na Manton-Gaulinovom homogenizéri a centrifúguje, ako bolo uvedené predtým. Tento postup sa opakuje raz pri použití pufra B a raz pri použití vody. Výsledné pelety inklúznych teliesok sa zvážia a udržujú sa až do okamihu použitia na -20 °C.

Príklad 309

Solubilizácia a štiepenie inklúznych teliesok gp55-Asp-Pro-Pro(l-38)hPTH-OH

Zmrazené inklúzne telieska obsahujúce gp55-Asp-Pro-Pro-( l-38)hPTH, ako sú získané v príklade 308, sa suspendujú v 10 mM roztoku kyseliny chlorovodíkovej (analyticky čistom) na konečnej koncentrácii 6 % (hmotnosť/objem). Roztok sa inkubuje 24 hodín pri teplote 50 °C a reakcia sa ukončí pridaním rovnakého objemu vodného 100 mM roztoku octanu sodného. Nariedený supematant sa vyčistí centrifugáciou pri 27 500 g v priebehu 30 minút a prefiltruje cez filter so sklenenou vatou.

Príklad 310

Solubilizácia a štiepenie inklúznych teliesok gp55-Asn-Gly-Pro(l-38)hPTH

Zmrazené inklúzne telieska obsahujúce gp55-Asn-Gly-Pro-(l-38)hPTH, ako sú získané v príklade 308, sa rozpustia v 6M guanidín-hydrochloride (obsahujúcom 2M hydroxylamín-hydrochlorid a s pH upraveným na hodnotu 9,0 pridaním 4,5 M hydroxidu lítneho), na dosiahnutie odhadovanej koncentrácie 5 mg proteínu/ml. pH sa znovu upraví na pH 9 ďalším pridaním hydroxidu lítneho a roztok sa inkubuje 4 hodiny pri teplote 45 °C. Reakcia sa ukončí pridaním kyseliny mravčej na pH 4 a roztok sa centrifúguje a filtruje, ako je opísané v príklade 309.

Príklad 311

Preparatívna vysokoúčinná kvapalinová chromatografla Gly-Pro- a Pm-Pro-(1 -38)-hPTH

Prefiltrované supematanty vzniknuté po štiepení sa analyzujú pomocou analytickej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s obrátenými fázami (na kolóne Orpogen HD-Gél-RP-7s-300 s rozmermi 4 x 150 mm) a porovnávajú sa so štandardom (l-38)hPTH (Bachem), na stanovenie koncentrácie PTH. Kolóna sa ekvilibruje s 85 % pufra A a pre HPLC (90 % vody, 10 % acetonitrilu, s obsahom 0,1 % (objem/objem) kyseliny trifluóroctovej) a 15 % pufra B pre HPLC (10 % vody, 90 % acetonitrilu, s obsahom 0,1 % kyseliny trifluóroctovej) a premýva sa 15 minút pri prietoku 0,75 ml/min. použitím gradientovej elúcie s gradientom 15 % pufra B pre HPLC až 100 % pufra B pre HPLC.

V závislosti od rozsahu prípravy sa supematanty nanesú buď na kolónu C4 Vydac s rozmermi 1,0 x 25 cm, alebo C4 Vydac 2,2 x 25 cm. Kolóny sa ekvilibrujú 85 % pufra A pre HPLC a 15 % pufra B pre HPLC pri prietoku 4 ml/min., prípadne 10 ml/min. Kolóny sa premývajú použitím gradientovej elúcie s gradientom 15 % pufra B až 85 % pufru B pri použití objemu 80 ml, pripadne 15 % pufra B až 55 % pufra B pri použití objemu 300 ml.

Piky Gly-Pro-hPTH(l-38) alebo Pro-Pro-hPTH(l-38) sa manuálne izolujú a potom sa vo vákuu odstráni acetonitril. Na stanovenie koncentrácie peptidu po štiepení i v izolovaných frakciách sa použije analytická vysokoúčinná kvapalinová chromatografla.

Roztoky peptidov bez rozpúšťadla sa nariedia rovnakým objemom 100 mM octanu sodného a pH sa upraví, pokiaľ je to nutné, na pH 5,4. Po filtrácii (0,2 m) sa roztok nanesie na katexovú kolónu (buď Mono S, alebo SP-Sepharose High Performance, naplnený v kolóne HR10/10 alebo XK16/10), ekvilibrovanou s 50 mM octanom sodným s pH 5,4 (pufer C). Kolóna sa premýva pri použití gradientovej elúcie s gradientom 0 až 500mM chloridu sodného v pufre C objemom tvoriacom 7,5-násobok objemu kolóny. Izolujú sa frakcie s objemom 10 ml a frakcie tvoriace pík X-X-(l-38)hPTH sa spoja. Koncentrácia peptidu sa stanoví, ako je opísané, pri použití vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.

Táto kolóna slúži jednak na prevedenie peptidov do viac fyziologického pufra a jednak na odstránenie ďalších peptidov vytvorených chemickým štiepením samotného fúzneho proteínu.

Príklad 312

Enzymatické odstránenie X-X z X-X-(l-38)hPTH-OH pH spojených frakcií peptidov, ako sú získané v príklade 311 (koncentrácia sa pohybuje v rozmedzí 1,5 - 2,0 mg/ml) sa upraví na pH 8,0 pridaním pevného Tris. Pridá sa purifikovaná X-prolyl-dipeptidáza (s koncentráciou 0,5 mg/ml v PBS (fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátovým pufrom) s pH 7,2) (Nardi a kol., 1991, App. Env. Microbiol., 57, č. 1, 45 - 50) v pomere 1 : 1000 a roztok sa inkubuje 24 hodín pri teplote 37 °C. Reakcia sa zastaví pridaním kyseliny trifluóroctovej v množstve 0,2 % (pH = 5,0) a výsledný (1-38)PTH sa izoluje pomocou preparatívnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (pri použití rovnakých podmienok, ako sú opísané v príklade 6). Rozpúšťadlo sa odstráni a produkt sa po odobratí vzoriek pre N-koncovú sekvenčnú analýzu a analýzu pomocou hmotovej spektrometrie lyofilizuje. Príklady výťažkov, ktoré sa dosiahnu pri použití postupov s dvoma fuznymi proteínmi opísanými skôr sú nasledujúce: Gén55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l-38)OH (pri použití „skrátenej“ formy génu 55).

Pri čiastočne optimaíizovaných fermentačných podmienkach sa z 10 litrov fermentovanej zmesi získa peleta mokrých buniek s hmotnosťou 215 g. Percentuálna úroveň expresie fúzneho proteínu je približne 37 %. Z tejto pelety sa izoluje 31 g inlúznych teliesok. Čistota proteínu (vzhľadom na íuzny proteín) týchto teliesok je 61 %. Po solubili zácii, štiepení a centifugácii sa zistí približne 620 mg Pro-Pro-PTH. Z tohto materiálu sa po nasledujúcej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii na kolóne C4-Vydac získa 580 mg Pro-Pro-PTH. Po nariedení, katiónovej výmene na Mono S, štiepení X-prolyldipeptidázou (pri koncentrácii Pro-Pro-PTH 2 mg/ml), vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii a lyofilizácii sa získa 440 mg lyofilizovaného čistého produktu s plnou biologickou aktivitou. To znamená výťažok 71 % finálneho produktu v porovnaní s časom ukončenia štiepenia.

Gén55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38)OH (pri použití „dlhej“ formy génu 55)

Z 20 litrov neoptimalizovanej fermentačnej zmesi sa izoluje peleta 78 g mokrých buniek s 50 % expresiou fúzneho proteínu. Po lýzovaní a centrifugácii sa získa 18 g „90 % čistých“ inklúznych teliesok. Po zastavení reakcie kyselinou a centrifugácii a filtrácii sa detekuje zhruba 470 mg Gly-Pro-PTH. Po vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii na kolóne C4-Vydac sa zistí 355 mg peptidu, toto množstvo sa po katiónovej výmene na SP-Scpharose zníži na 321 mg. Enzymatické odstránenie zvyškov Gly a Pro sa uskutočňuje pri koncentrácii 2 mg/ml. Po záverečnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii a lyofilizácii sa izoluje 244 mg čistého, plne biologicky aktívneho hPTH(l-38)OH, čo predstavuje výťažok 52 % v porovnaní so stavom v čase zastavenia štiepiacej reakcie.

Zlúčeniny podľa príkladov 25, 26, 56 a 86 - 164 sa tiež pripravia použitím postupu podľa príkladov 306 až 312.

Zlúčeniny podľa vynálezu vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľných solí a komplexov majú cenné farmakologické vlastnosti, ako o tom svedčia testy na zvieratách, a sú teda vhodné na terapiu.

Biologická aktivita zlúčenín podľa vynálezu sa stanoví in vitro meraním ich schopnosti stimulovať syntézu cyklického AMP v osteosarkomatických bunkách potkana UMR 106-06 a človeka SaOS-2 podľa spôsobu, ktorý opísali Marcus a Aurbach v Endocrinology, 85, 801 - 810 (1969). Potkanie osteosarkomatické bunky UMR 106 sa nechajú rásť do konfigurácie v Englovom minimálnom esenciálnom médiu (Eagle‘s Minimum Essential Médium) s 10 % FCS (sérum z teľacieho plodu) na doštičkách s 12 jamkami, ľudské osteosarkomatické bunky SaOS-2 sa pestujú v McCoyovom 5A médiu s 10 % FCS. Médium sa potom zmení na médium s 2 % FCS a pridá sa [3H]-adenín v množstve 1 - 5 Ci na jamku. Dve hodiny potom sa bunky premyjú dvakrát médiom neobsahujúcim sérum a inkubujú sa v DMEM (Dulbeccem modifikovanej Eaglovo médium) s 1 % BSA (album hovädzieho séra) obsahujúcim 1 mM 3-izobutyl-l-metyl-xantín, aby sa zabránilo pôsobeniu fosfodiesteráz. Testované látky sa pridajú o 20 minút neskoršie. Reakcie sa zastavia a cAMP sa extrahuje po 15 minútach pridaním 5 % kyseliny trichlóroctovej. V množstve 0,5 ml na jamku sa pridá roztok nosiča obsahujúci 5 mM neznačeného adenínu, adenoxínu, AMP, ADP, ATP a cAMP, ako i [14C]-adenozínu v množstve 0,4 Ci na stanovenie regenerácie. [3H]-cAMP sa oddelí použitím chromatografie na sériovej kolóne Dowex 50W-X4 (200-400 mesh) a chromatografie na oxide hlinitom a vykoná sa meranie rádioaktivity. Výsledky sa vypočítajú v % porovnaní s kontrolným rozpúšťadlom a hodnoty EC₅₀ sa stanovia z regresných kriviek DRC. Zlúčeniny podľa vynálezu stimulujú produkciu cAMP v osteosarkomatických bunkách potkanov UMR 106-06 a človeka SaOS-2 v koncentrácii 10' až 10‘⁶M.

Zlúčeniny podľa vynálezu tiež majú väzbovú afinitu na receptory PTH, napríklad ako sa stanovia nasledovne.

Kurací [Tyr³⁶]PTHrP(l-36)amid sajóduje na špecifickú aktivitu 2 200 Ci/mmol použitím laktoperoxidázového postupu (Anawa Lab. AG, Wangen). Obličkové bunky vačice v jednej vrstve sa premyjú 200 1 DMEM a F12 (HAM) v pomere 1 :1 s obsahom 1 % BSA, a inkubujú sa pri teplote 16 “C s [¹²⁵I-Tyr³⁶]-chPTHrP(l-36)amidu v dávke zodpovedajúcej 50 000 pulzov za minútu na jamku, v prítomnosti alebo neprítomnosti 1 M [^l25I-Tyr³⁶]chPTHrP(l-36)ami-du. Po inkubácii sa bunky premyjú 0,5 ml média s teplotou 4 °C, lýzuju sa účinkom 0,5 ml IN hydroxidu sodného a zmeria sa rádioaktivita. Špecifická väzba sa stanoví ako celková väzba mínus nešpecifická väzba. Kompetitívne krivky sa analyzujú použitím počítačového programu pre nelineárnu regresiu SCTFIT (Feyen a kol., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 8 - 13) a údaje sa uvádzajú ako priemerné hodnoty pK_D (n = 2 až 3). Zlúčeniny podľa vynálezu majú v tomto teste väzbovú afinitu vyjadrenú ako priemerná hodnota pK_D od 7 do 10.

Ďalej zlúčeniny podľa vynálezu zvyšujú hladinu vápnika v plazme po kontinuálnej subkutánnej infúzii, napríklad ako sa stanoví pri samcoch tyroparatyroidektomizovaných potkanov Wistar s hmotnosťou 140 až 170 g. 5 dní po tyroparatyroidektómii sa potkanom do krku implantujú minipumpy Alzet a na potkanoch sa uskutočňuje infúzia testovaných zlúčenín v množstvách od 0,3 do 30 g/deň na potkana. Retroorbitálnou punkciou sa ráno 1, 2, 3 a 6 dní potom odoberie krv a koncentrácia vápnika v plazme sa stanoví fotometrický. V tomto teste zlúčeniny podľa vynálezu zvyšujú množstvo vápnika v plazme.

ZJúčeniny podľa vynálezu sú v súlade s tým vhodné na prevenciu alebo liečenie všetkých chorôb kostí, ktoré sú spojené so zvýšeným vyčerpaním alebo resorpciou vápnika, alebo pri ktorých je žiaduca fixácia vápnika v kostiach, napríklad osteoporózy rôzneho pôvodu (napríklad juvenilná, menopauzálna, postmenopauzálna, posttraumatická, spôsobené vysokým vekom alebo kortikosteroidnou terapiou alebo nečinnosťou), zlomenín, osteopatie, vrátane akútnych a chronických stavov spojených s kostemou demineralizáciou, mäknutím kostí, periodontálneho úbytku kostného tkaniva alebo úbytku kostného tkaniva spôsobeného artritídou alebo osteoartritídou, alebo na liečenie hypoparatyroidizmu.

Zlúčeniny podľa vynálezu sú vhodné najmä na prevenciu alebo liečenie osteoporózy rôzneho pôvodu.

Pre všetky uvedené použitia sa odporúčaná denná dávka pohybuje v rozmedzí od približne 0,003 do 10 mg, výhodne 0,003 až 3 mg, ešte výhodnejšie 0,01 až 1 mg zlúčeniny podľa vynálezu. Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať jedenkrát denne až dvakrát týždenne.

Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, alebo komplexov. Takéto soli a komplexy možno pripraviť bežným spôsobom a majú rovnaký druh aktivity ako voľné zlúčeniny. Vynález tiež zahrnuje farmaceutický prostriedok obsahujúci zlúčeninu podľa vynálezu vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľné soli alebo komplexu, v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom. Takéto prostriedky možno vytvoriť bežným spôsobom. Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať ľubovoľným vhodným spôsobom, napríklad parenterálne napríklad vo forme injikovateľných roztokov alebo suspenzií, enterálne, napríklad orálne, ako vo forme tabliet alebo kapsúl, alebo v transdermálnej alebo nazálnej forme, alebo vo forme čapíkov.

V súlade s uvedenými skutočnosťami vynález ďalej zahrnuje:

a) zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ alebo komplex na použitie ako liečiva,

b) spôsob na zlepšenie tvorby kostí, napríklad prevenciu alebo liečenie všetkých chorôb kostí, ktoré sú spojené so zvýšeným vyčerpaním alebo resorpciou vápnika, alebo pri ktorých je žiaduca fixácia vápnika v kostiach, napríklad osteoporózy rôzneho pôvodu (napríklad juvenilná, menopauzálna, postmenopauzálna, posttraumatická, spôsobené vysokým vekom alebo kortikosteroidnou terapiou alebo nečinnosťou), zlomenín, osteopatie, vrátane akútnych a chronických stavov spojených s kostemou demineralizáciou, mäknutie kostí, periodontálneho úbytku kostného tkaniva alebo úbytku kostného tkaniva spôsobeného artritídou alebo osteoartritídou alebo na liečenie hypoparatyroidizmu, u pacienta, ktorý takéto ošetrenie potrebuje, tento spôsob zahrnuje podanie účinného množstva zlúčeniny podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, alebo komplexu skôr uvedenému pacientovi,

c) zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ, alebo komplex na použitie pri príprave ľarmaceutického prostriedku na použitie podľa spôsobu uvedeného v odseku b).

Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu možno zlúčeniny podľa vynálezu použiť ako prídavnú alebo pomocnú látku na inú terapiu, napríklad terapiu pri použití inhibítorov kostnej rezorpcie, napríklad ako je to pri liečení osteoporózy, najmä na terapiu používajúcu kalcium, kalcitonín alebo jeho analóg, alebo derivát, napríklad kalcitonín lososa, úhora alebo človeka, steroidný hormón, ako je estrogén, čiastočný agonista estrogénu alebo kombinácia estrogén - gestagén, bifosfonát, vitamín D alebo jeho analóg, alebo ich ľubovoľnú kombináciu.

Pokiaľ sa zlúčeniny podľa vynálezu podávajú, napríklad ako pomocná látka, v kombinácii s terapiou inhibujúcou kostnú resorpciu, líšia sa samozrejme dávky takéhoto spoločne podávaného inhibítora v závislosti od typu použitého inhibičného lieku, napríklad v závislosti od toho, či ide o steroid alebo kalcitonín, od ošetrovanej choroby, od toho, či ide o kuratívnu alebo preventívnu terapiu, od režimu atď.

V súlade s uvedenými skutočnosťami vynález zahrnuje ešte ďalšie uskutočnenia, a to:

d) spôsob na zlepšenie tvorby kosti, napríklad prevenciu alebo liečenie vyčerpania vápnika, napríklad na prevenciu alebo liečenie uvedených ľubovoľných konkrétnych porúch alebo chorôb, u pacienta, ktorý potrebuje takéto ošetrenie, tento spôsob zahrnuje podanie účinného množstva a) zlúčeniny podľa vynálezu a b) druhej liečivej látky, pričom táto druhá liečivá látka je inhibítorom kostnej resorpcie, napríklad ako sú uvedené skôr, tomuto pacientovi.

Výhodné sú zlúčeniny podľa príkladov 20, 29,37, 49 a 50.

Zoznam sekvencií (iii) Počet xekvencii: 12 {2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 1;

_(i. Charakteristika sekvencie:

(Aj dĺžka: 717 búových párov (B) typ;nukleová kyaoiiiK (C) nťazQovosť; jednenťazoová topológá: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (1U) hypotetická: nie (iii) aotiscnsc: nit (»> typ fragmentu: vnútorný (vil Pôvodný zdroj:

(Al organizmus: bakteriofágT4/Homo sapiens (U> Vlastnosti:

(A) oázov/kľúč. CDS tokácia: 101.559 <κϋ Opis sekvencie: SEQ IDNO: 1:

AGATCTCGAT CCCGCGAAXT TAMACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GSTHCCCtt 60

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG WATAtACAT ATG TCA GAA ACT AAG X15

Met 1

Sex

Glu

Thr

Lys 5

CCT

AAA

TAT

MX

TAC

GTA

AAC

AAT

AAA

GAG

CTT

TTA

CAA

GCT

ATT

163

Trh

W

Tyr

Asn

Tyr

Val

Asn

Lys

Glu

L*u

Uu

Gin

Al*

Ila

íle

10

15

20

GAT

TGG

AAA

ACA

GAA

TTA

GCA

AAT

AAA

GAC

CCA

AAT

AAA

GTA

GTT

211

Asp

Trp

Lys

Thr

Glu

Leu

Ala

Asn

Lys

Aap

íro

Asn

Lye

Val

25

30

35

CGT

CAG

AAT

GAT

ACT

ATC

GGA

TTA

GCC

ATT

ATG

CTT

ATT

GCA

GAA

GGC

259

Arg

Gin

Asn

Asp

Thr

íle

Gly

Leu

Ala

íle

Met

Uu

Xle

lli

Glu

Gly

40

«5

50

TTA

TCT

AAA

CGT

TTC

AAC

TTT

TCA

GGA

TAC

ACC

CAG

TCT

TG®

AAA

CAA

307

Leu

Sex

Lys

^A=7

Ph«

Asn

Ph·

Sex

Gly

Tyr

thr

Gin

Sex

Trp

Lys

Glft

53

so

65

GAA

ATG

ATT

GCA

GAT

SG7

ATA

GAA

GCT

TCT

ATT

AAG

GGG

CTT

CAC

AAT

335

Glu

Mat

11«

Ala

Asp

Gly

Tia

G2

Ala

Sa r

Ue

Lys

Gly

Uu

His

Asn

70

75.

80

85

TTT

GAT

GAA

ACG

AAA

TAT

AAA

AAC

CCA

CAT

GCG

TAT

ATA

ACT

GAA

GCT

403

9h«

Asp

Glu

Thr

Lys

Tyr

lys

Asn

P«

Hla

Ala

Tyr

Ila

Thr

Gin

Ala

90

95

100

TGT

TCT

AAT

GCA

TTC

GTC

CAA

CGT

GGA

TCC

ATC

GAT

CCA

TCC

GTA

451

Cys

Phe

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Ar?

Gly

Ser

llt

Asp

Pre

Pro

Ser

Val

105

110

115

TCA

GAA

ATA

CAA

CTA

A7G

CAT

AAT

CTG

GGT

AAA

CAT

CTG

AAT

TCA

ATG

499

Ser

Glu

Xle

Gin

Uu

Met

Hls

Asn

Uu

Gly

Lys

Hls

Uu

Asn

Ser

Met

uo

125

130

GAA

CC?

GTA

GAA

TGG

CTG

CGT

AAA

CTG

CAG

GAT

GTA

CAT

AAT

TTT

S47

Glu

Arg

Val

Glu

Trp

Uu

Arg

Lyi

Lya

Uu

Gin

Äso

Val

Hla

Asn

Phe

135

140

145

GTA GCT CTG GGT TAÄCTCGAGC AGATCCGGCT GCTääCAAAG CCCGääAGGA 599

Val Ala Uu Gly

150

AGCTGACTTG 3CTGCTGCCA CCCCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG

GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA

ÍS9

71?

(2) InfonnáäaosekveacuSEQIDNO:2:

_(x j Charakteristika sekvencie: jjy dĺžka; IS3 amiakyeelin tB) typ: taninokywtwvá (0) topottgi·; Imtáma iii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Met

Ser

Glu

ir.s

Lys

Pro

Lys

T/x

Asn

Tyr

Val

Asn

Lys

GXU

Leu

1

5

10

15

Uu

Gin

Ala

:i«

íle

*Sp

Trp

Lys

Thr

Glu

Uu

Ala

Asn

Lys

Asp

20

25

30

Pro

Asn

Lys

Val

Arg

Gin

Asn

Asp

Thr

íle

Gly

Uu

Ala

íle

Met

35

40

45

Uu

Íle

Ala

Glu

Gly

Leu

Sex

Lys

Arg

Phe

Asn

Pha

Sex

Gly

Tyr

Thr

50

55

60

Gin

Sax

Trp

Lys

Gin

Glu

Het

ru

Ala

Asp

Gly

Ila

Glu

Ala

Ser

ila

<5

70

73

80

Lys

Gly

Uu

His

Asn

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asn

Prô

His

Ala

85

90

95

Tyr

íle

Thr

Gin

Ala

Cy.

PU

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Arg

Gly

Ser

11«

10C U5 110

Asp

Pro

Pre

Sar

Val

Sar

Glu

11«

Gin Lau Mat

Kis

Asn

Lau

Gly

Lys

115

120

125

His

Lau

Asn

Ser

Het

Glu

Arg

Val

Glu Trp Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

135

143

Asp

Val

His

Asn

Phe

Val

Ala

Lau

Gly

145

150

Clu	Arg	Lys	Gh	Val	ALa	Lys	iys	Tyr	Ser
		115					120
?yx	Asp	Sex	Arg	Asp	Mp	Μ»	Het	Val	hla
	130					135
11«	Gin	Asp	Zle	Tyr	Mp	Lys	Mec	Thr	His
145			15C
Arg	Thr	Pro	Gly	Ala	Clu	Lys	Lys	Sar	Val
		168					170

(21 Informáciao sekvencií SEQ ID NO: 3:

ii. Charakteristika sekvencie:

(Al dĺžka; 945 bi2ovýchpárov (B) typ: nukleová kywlira <G) teťucovosrijednoretacová ^(Ď* topológia: lineárna tm typ molekuly: DNA (genómovi) (iii) hypotetická: nie (iii) antisense: nie (v) typ fragmentu: vnútorný (vi> Pôvodný zdroj :

ía' organizmus: bakteriofág T4/Horoo sapiens <ix) Vlastnosti:

t*i nízov/kľuč: CDS ^ia’ lokácia: 101..787 (xí> Opis sekvencie: SEQ 1DNO: 3;

XOATCTOCAT CCCGCGAAAT TWACGACT CACTAŤAGSG AGACCACAAC GOTTTCCCTC60

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC ZTTAAGAAGG AGATA7ACA? ATG TCA GAA ACT AAG11S

Mat Sex Glu the Lya 15

Leu Asp Phe Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Gly

130185

Val Ser Glu 11» Gin Leu Met His Aan Leu 195200

Mec Glu Arg Val Glu Trp Uu Arg ly« Lys 210215

Phe Val Ala Lea Gly

22$ (2) Informácia o sekvencií SEQΠΟΝΟ: 5:

_(i) Charakteristikasekvencie:

|A) dĺžka: 27 bázových párov (B) typ: aukteevákyselina (C) H^ieeovoiť:jednoreťazeovk (t)) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA ^(i£i* hypotetická: nie (iii) antisense: nie

M typ fragmentu: vnútorný

Ty: íh·

Leu Val

140

Tyr Glu

155 val Asp

Ser Val

Gly Lys

Leu Gin

220

Val 125	His	Asn	Val
Mp	Glu	Thr	Phe
Glu	Ser	Thx	Tyr 160
Mp	Sex	Pro 175	Sar
Asn	Gly 190	Pro	Ser
His 205	Lau	Mn	Sex
Axo	Val	His	Mn

CCT AAA Pes Lys

TAT AAT TAC GTA AAC

AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ΑΤΊ

163

Tyr Asn Tyr 10

Val Aan

Asn Lys

Glu 15

Lau. Lau

Gla ALa tie 20

Ila

GAT

TGG

AAA

ACA GAA

TTA

GCA

AAT

AAA

GAC

CCA

AAT

AAA

GTA

GTT

211

Asp Trp

Lys

Thr 25

Glu

Lau

Ala

Asn

Asn 30

Lys

A*p

Pro

Mn

l>ys 35

Vsi

Val

CGT

CAG

AAT

GAT

ACT

ATC

GGA

TTA

GCC

ATT

ATG

CTT

ATT

GCA

GM

GGC

259

Arg

Gin

Asn

Asp

Thr

Zle

GLy

Leu

Ala

Ila

Mar

Lau

Ila

Ala

Glu

Gly

40

45

50

TTA

TCT

AAA

CGT

TTC

AAC

TTT

TCA

GGA

TAC

ACG

CAG

TCT

TGG

AAA

CAA

307

Leu

Sar

Lys

Arg

Pha

Aar.

Phe

Sar

Gly

Tyr

Thr

Gin

Sar

Trp

Lya

Glfl

53

¢0

65

GAA

ATG

ATT

GCA

GAT

GGT

ATA

GAA

GCT

TCT

ATT

AAG

GGG

CTT

CAC

AAT

355

Glu

Mat

Ila

Ala

Asp

Gly

Zla

Glu

Ala

Ser

Ila

Lys

Gly

Leu

His

Asn

70

75

80

15

TTT

GAT

GAA

ACG

AAA

IAT

AAA

AAC

CCA

CA“

GCG

TAT

ATA

ACT

CAA

GCT

<03

Pha

Asp

G1U

Thr

Lys

Tyr

Lys

Mn

Pro

HiS

Al*

Tyr

11«

Thr

Gin

Ala

90

95

100

T5T

TT7

AAT

GCA

TTC

GTC

CAA

CGT

ATT

AAA

GAA

CGT

AAG

GAA

GTT

451

Cya

Pha

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Arg

Ila

Lys

Lya

Glu

Arg

Lys

Glu

Val

105

no

115

(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5:

GAGGTGCATA TGTCAGMAC TAAGCCT (2) Infonnácia osekvencií SEQ ID NO: 6:

_ti) Charakteristika sekvencie: (Aj dĺžka: 40 bázových párov (B) typ- nukleová kyselina fC) reťazcovosf:jednoreťazcová iDl topológixlineárna iii) typ molekuly: cDNA t^ii) hypotetická: nie (iii) antisense: nie <v) typ fragmentu: vnútorný (*i) Opis sekvencie: SEQ IDNO: 6.

GGTCGGATCC ATCGCTAGCG TTAGCCTCAT AlAAAAAATC

GCA Al*

AAG AAA

TAT AGT Tyr Ser

TAC TTC GTT CAC AAT GTC TAT GAC AGC CGT GAC

499

Lys

Lys 120

Tyr Pht

Val 125

HU

Asn

VaL

Tyr

Asp Sar Arg Asp 130

GAC

GAT

ATG

GTT

GCG

TTA

GTA

GAT

GAA

ACT

TTT

ATT

CAA

GAC

ATC

TAT

547

Asp

Mp

Met

val

Ala

Lau

val

Mp

Glu

Thr

Phe

Zla

Gin

Mp

ri«

Tyr

135

140

145

GAT

AAA

ATG

ACG

CAT

TAC

GAA

TCA

ACC

TAT

AGA

ÄCA

CCG

GGG

GCT

595

Asp

Lys

Met

Thr

HÍS

Tyr

Glu

Str

Thr

Tyr Arg

Thr

Pro

Gly

Ala

150

1SS

160

165

GAA

AAC

AAA

AGT

GTT

GTA

GAT

tct

CCT

AGT

TTG

GAT

TTT

TTA

TAT

643

Glu

Lys

Ly«

Sar

Val

Asp

Ser

Pro

Sex

Lau

Mp

Phe

Leu

Tyr

no

175

1Θ0

GAG

GCT

AAC

GAT

GGA

TCC

GTT

AAC

GGT

CCA

TCC

GTA

TCA GAA

MA

CAA

691

Glu

Ala

Mn

Mp

Gly

sar

val

Asn

Gly

Pro

Sar

Val

Ser

Glu

11«

Gla

185

190

195

CTA

ATG

CAT

AAT

CTG

GGT

AAA

CA?

ere

AAT

TCA

ATG

GM

CGT

GTA

GAA

739

Leu

Met

HU

Asn

Lau

Gly

Lys

Kla

Lea

Asn

Sar

Met

Glu

Arg

Val

Glu

200

205

210

TGG

CTG

CGT

AAA

CTG

CAG

GAT

GTA

CAT

AAT

TTT

GTA

GCT

CTG

GGT

787

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

HiS

Mn

Phe

Val

Ala

Leu

Gly

215

220

225

TAACTCGAGC i

AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA

AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA

847

CCGCTGAGCA i

WAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG

GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA

907

GGGGTTTTTT i

3CTGAAAGGA GGAACTATAT CCSGATAA

945

(2)

Infcamád

a o sekvencií SEQ ID NO: 4:

di Charakteristike sekvencie (A) dĺžka' 229 aminotyseHn (B) typiMumokystónovi (ď) topotógia: lineárna

1ii)

Typ molekuly: proteín

(xi)

Opis sekvMwie: SEQ TD NO

:4:

Met

Sar

Glu Thr

Lys

Pro

Lys

Tyr

Asn

Tyr

Val

Asn

Ly»

Glu

Lau

1

s

10

15

Leu

Gin

Ala Ila

íle

Mp

Trp

Lys

Thr

Glu

Leu

Ala

Asn

Lys

Asp

20

25

30

Pro

Asn

Lys Val

Val

Arg

Gin

Mn

Asp

Thr

íle

Gly

Leu

Ala

Zle

Met

35

40

45

Leu

íle

Ala Glu

Gly

Leu

Sar

Lys

Arg

Phe

Asn

Phe

Ser

Gly

Tyr

Thr

50

55

60

Gin

Sar

Trp Lys

Gin

Glu

Het

íle

Ala

Asp

Gly

íle

Glu

Ala

Ser

11«

6S

70

75

80

Lys

Gly

Leu His

Asn

Phe

Asp

Glu

Tbz

Lya

Tys

Lys

Aan

Prv

81«

Ala

85

90

9$

Tyr

íle

Thr Gin

Ala

Cys

Phe

Mn

Ala

Phe

Val

Gin

Arg

Ila

Lys

100 105' 110 (2) Informácia o sekvencií SEQ 03 NO: 7:

₍£ i Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 28 bázových párov (9) typ: nukleová kyselina (G) réťa2coYoat':jednoreťazocvá ''^D) topológia: lineárna < i i» typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iii) antisense: nie <v; typ fragmentu: vnútorný (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 7:

GGTCGGATCC TACGTTGGfcC GMTGCAT 28 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 8:

_(i] Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka; 42 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) reťazcovosť: jednoreftmwvi <°1 topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iií) antisense: nie <v) typ fragmentu: vnútorný ťxi) Opis sekvencie: SEQ IDNO: 8:

GAQTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC JLGAMTACAA CT 42 (2) Wormádao$ekveDCÍiSEQIDNO:9:

_{i) Charakteristika sekvencie:

'A) dĺžka: 42 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) réťazcovoiť: jednoreťazcová ďl topalógit lineárna ⁽ⁱⁱ> typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iii) antisense: nie iv) typ fragmentu: vnútorný (*i) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 9:

CAGTGGAŤCC GÍTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42 (2) Informácia o sekvendi SEQ ID NO: 10:

iii Charakteristika sekvencie:

(A) díikaj 34 bázových párov (B) typ: nufcieová kyselina (C> niteaxmsf.jednoreťazoová topológuu lineárna ^,IÍ1 typ molekuly: cDNA (i L i > hypotetická: nie (iii) aniigense: nie <v> typ fragmentu: vnútorný <xi> Opis sekvencie: SEQ IDNO: 10:

TCTACTCGAG TTÄACCCAGA GCTACAAÄAT IATG 34 <21 Infanxiácia o sekvencií SEQ ID NO: 11:

(.-) Charakteristika sekvencie:

(_Äj dĺžka: 34 anunckyseifa (B> typraraicotyselinove

CC) rcťazoovosl’ jedrtorcťazcavň (D) tcpolôgia: nie je známa <íi) typ molekuly: proteín tiiií hypotetická: nie (Híí antisense: nie ivii Pôvodný zdroj:

•Λ) organizmus: Homo sapiens íxi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11:

Se; Vai Ser Glu XX· Gin L*u His Asn Leu Gly Lys Hia Leu Asn 15 LG 15

Ser Met Glu Ar? Val Glu Trp Uu Ar? Lys Lys Lsu Gin Asp Val His

2C 25 30

Asn Ph« <2> Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 12:

_(ij Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 36 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová ťCl rét*&zcovoď:jednoreťKZCová topdógia: oleje známe c ii) typ molekuly: proteín (iii) hypotetická: nie ciiit antisense: me (vii Pôvodný 2droj:

^<A> organizmus: Homo sapiens (xO Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12:

Ser Val Ser Glu 11« Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys Ria Leu Asn 15 10 15

Ser Met Glu Ar? VaL Glu Trp Leu Axg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe Val Ala (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO. .13:

(i) Charakteristikasekvencie:

(A; dĺžka; JSamnakyschn (B) typ: aminokysaSMVá (C) róťucovosf;jedaoroŕazoová (D) topoíogia: nie je známi

Hl] typ molekuly: proteín (iii) hypotetická:me (iii) antisense:nie (vil Pôvodný zdroj;

CA) organizmus; Homo sapiens (xi) Opis sekvencie: SEQ IDNO: 13:

Ser Val Ser glu íle Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Mec Glu Are Val Glu Trp Lau Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlúčenina všeobecného vzorca (1)

Ser-Val-.Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Ri-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu R₅-R₆-R₇-R_g-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Rio-Rir(Ri2)n-X, kde

Ri je Met alebo Leu;

R₂ je Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His Ser, Thr alebo Tyr;

R₃ j c Leu alebo Lys;

R₄ jc Lys alebo D-, alebo L-Ala, -Cys, -Gin, -íle, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu alebo -Gly;

R₅ je Asn, Gin, D-Gln alebo D-, alebo L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala alebo -Gly;

Rý je Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, íle alebo Lys;

R₇je Gin;

Rg je Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn alebo íle;

R₉ je Lys, Gin alebo Arg;

R]₀ je Asn, Thr, D-Thr alebo D-, alebo L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -íle alebo -Lys;

Ruje Phe alebo Ala;

R12 je Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu alebo Val-Ala-Leu-Gly;

n je 0 alebo 1; a

X je OH, OR_a, NHj alebo NRbR_c, kde R_a je C_walkyl, jeden z R_h a Rc je H a druhý je C^alkyl, zlúčenina, ktorá prípadne obsahuje aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny obsahujúcej L- alebo D-a-aminokyselinu, C₂.₆alkoxykarbonylovú skupinu a prípadne substituovanú C|.₈alkylovú, C₂.₈alkenylovú, C₂.₈alkinylovú, aralkylovú, aralkenylovú alebo C₃.₆cykloalkyl-C|.4alkylovú skupinu a naviazaný na jej koncovú aminoskupinu, a/alebo zlúčenina, ktorá prípadne obsahuje aspoň jeden zvyšok, vybraný zo skupiny obsahujúcej C₂.₆alkoxykarbonylovú skupinu a prípadne substituovanú Cý _galkylovú, C₂.8alkenylovú, C₂.₈alkinylovú. aralkylovú, aralkenylovú alebo C₃.₆cykloalkyl-C).₄alkylovú skupinu, naviazaný na jeden alebo viac aminoskupín bočného reťazca zlúčeniny, vo voľnej forme alebo vo forme soli alebo komplexu.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde Rio je Thr.
3. Zlúčenina podľa nároku 1 alebo 2, kde R,, je Ala.
4. Zlúčenina vybraná z [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶ Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala”]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹. Thr³³, Ala³⁴]hPTH a [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, kde zlúčenina prípadne obsahuje aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny obsahujúcej L- alebo D-a-aminokyselinu, C₂.₆alkoxykarbonylovú skupinu a prípadne substituovanú C ^alkylovú, C₂.₈alkenylovú, C₂.₈alkinyiovú, aralkylovú, aralkenylovú alebo C₃.₆cykloalkyl-C_Malkylovú skupinu, a naviazaný na jej koncovú aminoskupinu, a/alebo aspoň jeden zvyšok vybraný zo skupiny obsahujúcej C₂.₆alkoxykarbonylovú skupinu a prípadne substituovanú C]._salkylovú, C2.₈alkenylovú, C₂._galkinylovú, aralkylovú, aralkenylovú alebo C₃.₆cykloalkyl-C₁.₄alkylovú skupinu, naviazaný na jeden alebo viac aminoskupín bočného reťazca zlúčeniny, vo voľnej forme alebo vo forme soli alebo komplexu.
5. Zlúčenina vybraná z [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]l-hPTH(l-34)OH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH , [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH((l-34)OH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶ Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys, Ala¹⁶, Gln^ls]hPTH(l-36)OH a [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH, vo voľnej forme alebo vo forme soli, alebo komplexu.
6. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v ktorom fuzny proteín, ktorý' obsahuje N-koncový polypeptid génu 55 bakteriofága T4 majúci požadovanú zlúčeninu naviazanú na jeho C-koniec, sa exprimuje v bakteriálnych bunkách a ak je to potrebné, zavedie sa C₂^alkoxykarbonylová skupina a prípadne substituovaná Cj.jalkylová, C₂.₈alkenylová, C₂.₈alkinylová, aralkylová, aralkenylová alebo C₃.₆cykloalkyl-C_Malkylová skupina na koncovú aminoskupinu a/alebo aminoskupinu bočného reťazca zlúčeniny v chránenej alebo nechránenej forme a, ak je to potrebné, odstráni sa ochranná skupina prítomná v chránenej forme.
7. Spôsob podľa nároku 6, v ktorom fiizny proteín obsahuje chemicky štiepiteľný linker medzi génom 55 a požadovanou zlúčeninou.
8. Spôsob podľa nároku 7, v ktorom štiepiteľný linker obsahuje aminokyselinové sekvencie Asp-Pro-Pro alebo Asn-Gly-Ρτο.
9. Nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje fúzny proteín obsahujúci N-koncový polypeptid génu 55 bakteriofága T4 a požadovanú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, naviazanú na jeho C-koniec.
10. Bakteriálny expresný vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa nároku 9.

H. Bakteriálne hostiteľské bunky transformované DNA sekvenciou podľa nároku 9 alebo bakteriálny vektor podľa nároku 10.
12. Fúzny proteín, ktorý obsahuje N-koncový polypeptid génu 55 bakteriofága T4 a požadovanú zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, naviazanú na jeho C-koniec.
13. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli na použitie ako farmaceutikum.
14. Farmaceutická kompozícia obsahujúca zlúčeninu ako je definovaná v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 5 vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, spolu s farmaceutický prijateľným rozpúšťadlom alebo nosičom.
15. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, alebo komplexu na použitie v prípravku farmaceutickej kompozície na použitie na zlepšenie tvorby kostí.
16. Zlúčenina podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, alebo komplexu na použitie spolu s inhibítorom kostnej resorpcie na zlepšenie tvorby kostí.