SK287621B6

SK287621B6 - Spôsob produkcie heterológneho proteínu hubou

Info

Publication number: SK287621B6
Application number: SK740-2003A
Authority: SK
Inventors: De Laar Antonius Martinus Johannes Van; Nigel Malcolm Lindner; Peter Nieuwpoort
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2011-04-05
Also published as: PL204737B1; SK7402003A3; JP4494716B2; AU1604902A; WO2002048382A3; AU2002216049B2; US7560249B2; BR0116675A; ATE351911T1; US20040077069A1; HUP0302655A2; EP1349945A2; ES2278681T3; HUP0302655A3; IL156438A0; CZ20031659A3; CN1481439A; JP2004515249A; ZA200303353B; DE60126148T2

Abstract

Spôsob produkcie heterológneho proteínu hubou zahŕňajúci rast huby na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, v ktorom 50 až 100 % hmotnostných zdroja uhlíka je etanol, a médium okrem toho obsahuje induktor.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu produkcie heterológneho proteínu alebo peptidu v hube a heterológny proteín.

Doterajší stav techniky

Produkcia heterológneho proteínu v hostiteľovi, ako napríklad v hube, je dobre známa. EP-A 481008 opisuje produkciu heterológneho proteínu v kvasinke, ktorá rastie na glukóze.

Priemyselná produkcia heterológneho proteínu hostiteľským organizmom vo veľkom meradle, fermentáciou príprava-dodávanie, vo všeobecnosti zahŕňa tri fázy.

Prvou fázou je prípravná fáza, ktorá je definovaná ako fáza, v ktorej bunky rastú do požadovanej koncentrácie. V tejto fáze bunky rastú exponenciálne. Modely opisujúce prípravnú fázu počítajú s tým, že bunky neumierajú, s tým, že kyslík je prítomný v nadbytku, a s tým, že všetky ostatné podmienky sú také, že rast môže byť neobmedzený. Z toho vyplýva, že v prípravnej fáze sú všetky výživové požiadavky spĺňané v dostatočnej kvantite. Sumárne je prípravná fáza fázou, v ktorej sa bunky amplifikujú, zatiaľ čo produkcia (heterológneho) proteínu je ešte nízka.

Druhou fázou je dodávacia fáza, ktorá je definovaná ako fáza, v ktorej sa pridáva zdroj uhlíka a iné potrebné zložky do fermentora v relatívne koncentrovanom prúde kvapaliny vopred vypočítanou rýchlosťou, „dodávacou rýchlosťou“. V tejto fáze sa kladie dôraz na produkciu proteínu rastúcimi bunkami a rast buniek vedie k nárastu biomasy. Substrát, ktorý sa pridáva do fermentora, je v tomto štádiu používaný vo všeobecnosti na rast buniek a na syntézu produktu. Bunkový rast je riadený prostredníctvom dodávacej rýchlosti tak, aby sa získal optimálny rast buniek a optimálna produkcia heterológneho proteínu.

Eventuálne sa dosiahne tretia fáza, ktorá je definovaná ako poklesová fáza, keď vznikajú limitujúce podmienky. V tejto fáze je napríklad koncentrácia kyslíka vo fementore blízka nule, čo v niektorých prípadoch vedie k vytváraniu etanolu. V tomto stave sa väčšina buniek bude sústreďovať na udržanie a zvyčajne je redukovaná syntéza produktu. Hoci je ešte možné v tejto fáze pozorovať bunkový rast, je tento rast vo všeobecnosti veľmi blízky nule. Postupne môžu bunky v tejto fáze stratiť životaschopnosť.

Produkcia heterológneho proteínu v médiu zahŕňajúcom bežný zdroj uhlíka, ako napríklad glukózu, alebo iný zdroj uhlíka založený na sacharide, je postačujúca, až kým nezačnú existovať limitujúce podmienky na konci dodávacej fázy. Príklady limitujúcich podmienok zahŕňajú zníženú koncentráciu kyslíka, znížené nutričné látky, ako napríklad vitamíny, uhlík, dusík, a akumuláciu toxických zlúčenín v rastovom médiu.

Ak huba, najmä kvasinka, rastie na médiu obsahujúcom glukózu ako zdroj uhlíka, hneď ako nastanú limitujúce podmienky, značne sa zníži produkcia heterológneho proteínu.

Pri kvasinkách rastúcich na bežnom médiu obsahujúcom sacharid ako zdroj uhlíka, opísané fázy existujú pri fermentácii príprava-dodávanie. Takže, keď sa už začne poklesová fáza, špecifická produkcia, ktorá je definovaná ako množstvo heterológneho proteínu alebo peptidu produkované na gram biomasy, ostáva rovnaká alebo sa znižuje. Hoci je aj hustota buniek vysoká, je tým syntéza produktu v poklesovej fáze nízka. Inou nevýhodou bežného média, ktoré často obsahuje glukózu ako zdroj uhlíka, je vysoké množstvo substrátu, ktoré sa konvertuje na biomasu, namiesto toho, aby sa konvertoval na produkt, ktorým je v kontexte tohto vynálezu zvyčajne heterológny proteín. Takže v takýchto systémoch sprevádza produkciu vysokých hladín heterológneho proteínu nevyhnutne relatívne vysoké množstvo biomasy. Toto veľké množstvo biomasy vedie k viskóznemu fermentačnému médiu, v ktorom napríklad jednoducho vzniká limitácia kyslíka.

Preto je potrebný spôsob produkcie heterológneho proteínu v hostiteľovi, ako napríklad hube, ktorý vedie k vysokému výťažku heterológneho proteínu aj v limitujúcich podmienkach, pri ktorých by normálne existoval pokles alebo redukcia špecifickej produkcie, pričom by sa zároveň špecifická produkcia rastového systému udržiavala taká istá alebo zvýšená v porovnaní so známymi rastovými systémami.

Spôsob podľa predloženého vynálezu prekonáva aspoň jeden z uvedených problémov.

Prekvapujúco sa zistilo, že huby rastúce na médiu obsahujúcom etanol, ako hlavný zdroj uhlíka, a induktor, ako napríklad galaktózu, na riadenie produkcie heterológneho proteínu, vykazujú vysokú špecifickú produkciu heterológneho proteínu, pričom špecifická produkcia heterológneho proteínu je prekvapujúco vysoká aj v limitujúcich podmienkach.

Prekvapujúco, huby pestované v súlade s touto metódou nevykazujú dobre známe charakteristiky poklesu, s ktorými sa potýkajú huby rastúce na tradičnom médiu založenom na glukóze. Pri pokračovaní dodávania média obsahujúceho tento špecifický zdroj uhlíka, huby udržiavajú alebo aj zvyšujú úroveň absolútnej a špecifickej produkcie heterológneho proteínu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob produkcie heterológneho proteínu hubou zahŕňajúci rast huby na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, pričom 50 až 100 % hmotn. tohto zdroja uhlíka predstavuje etanol, a médium obsahuje aj induktor.

V kontexte tohto vynálezu zahŕňa výraz huba kvasinky a plesne.

Na účely tohto vynálezu je výraz heterológny proteín mienený tak, že zahŕňa tak proteíny, ako aj peptidy.

Heterológny proteín je proteín, ktorý nie je prirodzene produkovaný hubou, ale len vtedy, keď bola huba modifikovaná na tento účel.

Tam, kde sú uvedené hmotnostné percentá, ide o hmotnostné percentá hmotnosti celkového produktu alebo hmotnosti celkového média, pokiaľ nie je uvedené inak.

Tam, kde sa používa výraz koncentrácia kyslíka, ide o koncentráciu rozpusteného kyslíka, ktorá sa meria spôsobom ilustrovaným v príkladoch.

Koniec prípravnej fázy sa definuje ako moment, v ktorom bol spotrebovaný všetok uhlíkový substrát poskytnutý bunkám.

Indukčná fáza sa definuje ako fáza, ktorá začína po prípravnej fáze od momentu, keď sa začne indukcia heterológneho proteínu, do momentu, keď sa získa maximálna indukcia pre použitú koncentráciu špecifického induktora.

Zdroj uhlíka je definovaný ako substrát, ktorý poskytuje dodávanie uhlíka a energie bunke. Huby získavajú ich bunkový uhlík prevažne z organických zlúčenín. Tieto bežne slúžia ako zdroj uhlíka, ako aj zdroj energie. Čiastočne sa asimilujú do bunkového materiálu a čiastočne sa oxidujú na poskytnutie energie. V tomto kontexte sa odvolávame na H. Schlegel v General microbiology, Cambridge University press, 1992, 7. vydanie, strana 194.

Vynález sa týka spôsobu produkcie heterológneho proteínu hubou. Na produkciu tohto proteínu sa huba geneticky modifikuje tak, aby bola možná riadená produkcia tohto heterológneho proteínu alebo peptidu. Na túto genetickú modifikáciu sa môže použiť akákoľvek vhodná konštrukčná alebo transformačná metóda. Príklady vhodných konštruktov a transformačných metód sú uvedené v EP-A-481008, ktorý je tu zahrnutý prostredníctvom jeho citácie.

Vo všeobecnosti bude modifikovaná huba po modifikácii obsahovať (integrovaný) vektor, ktorý obsahuje gén kódujúci heterológny proteín, pod kontrolou promótora. Aktivita promótora sa reguluje takzvaným induktorom. Príklady promótorov zahŕňajú galaktózové promótory, ako napríklad GAL4, GAL7, ktoré sú indukované galaktózou; metanolom indukované promótory, indukované metanolom; etanolové promótory, indukované etanolom; teplotou regulované promótory indukované zmenou teploty; fosfátom regulované promótory, indukované prítomnosťou fosfátu; a glukózou reprimovateľné promótory, indukované neprítomnosťou glukózy.

Huba rastie na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % tvorí etanol, v kombinácii s prítomnosťou induktora v médiu.

V oblasti techniky sa vo všeobecnosti neodporúča použitie etanolu ako zdroja uhlíka, ako napríklad v už citovanom opise. Stručne, uvádza sa, že pri použití etanolu namiesto glukózy, ako zdroja uhlíka, je znížený výťažok biomasy, vyžaduje sa vyššia spotreba kyslíka, a tým sa neposkytuje žiadny, alebo obmedzený rast v podmienkach limitovaného kyslíka. Okrem toho, etanolová toxicita pre kmene môže viesť k strate životaschopnosti a k smrti buniek. To je napísané napríklad v tabuľke 1 v publikácii The yeasts, zv. 3, 2. vyd., kapitola 6. Špeciálne upozorňujeme na dodatok 1 tohto opisu, ktorý uvádza, že pre kvasinky je rýchlosť ratu na etanole 0,1 h'¹ oproti rýchlosti rastu na glukóze 0,35 h'¹. Tento dodatok tiež uvádza, že na médiu s etanolom ako zdrojom uhlíka vykazujú kvasinky vyššiu spotrebu kyslíka, ako na médiu obsahujúcom glukózu ako zdroj uhlíka.

Rast buniek na etanole ako zdroji uhlíka je ďalej opísaný v Shiba a ďalší (J. of bioscience and bioengineering, zv. 89, str. 426-430, 2000). Shiba opisuje expresiu karboxypeptidázy Y (CPY) použitím GAL10 promótora v Saccharomyces cerevisiae gall80 mutante. Rastové médium obsahuje etanol ako jediný zdroj uhlíka. Uvádza sa, že na začiatku dodávania etanolu klesá tak rýchlosť rastu, ako aj produkcia CPY. Tento systém nie je riadený induktorom.

Predložený vynález poskytuje spôsob, pri ktorom sa udržiava alebo aj zvyšuje proteínová produkcia v prítomnosti média obsahujúceho zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % tvorí etanol, najmä ak vzniknú limitujúce rastové podmienky. Okrem toho proces podľa vynálezu je aplikovateľný na akýkoľvek typ huby a nevyžaduje pre rast špecifické gall80 mutanty. Spôsob podľa vynálezu je možné dobre riadiť prostredníctvom indukcie.

, Saliola, M a ďalší (Applied and environmental microbiology, Jan 1999, str. 53-960) opisuje použitie etanolom indukovateľného KÍ ADH4 promótora na expresiu heterológneho génu v Kluyveromyces lactis. Tento dokument uvádza, že expresia je optimálna, keď sa etanol používa ako promótor a zároveň ako jediný zdroj uhlíka vo systéme príprava-dodávanie. Tento produkčný systém neumožňuje riadenie génovej expresie v dodávacej fáze.

Ďalším prínosom spôsobu podľa vynálezu je riadenie produkcie tepla, ktoré je dôležité pri produkcii tepelne labilných proteínov.

Výhodné je, aby médium obsahovalo zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % tvorí etanol, v kombinácii s prítomnosťou induktora v médiu, v priebehu všetkých fáz, ale zistilo sa, že je možné použiť médium, ktoré nespĺňa tieto požiadavky, v prípravnej fáze, pokiaľ sú tieto požiadavky splnené médiom vo dodávacej fáze.

Vo výhodnom uskutočnení sa vynález týka spôsobu produkcie heterológneho proteínu hubou, ktorý zahŕňa prípravnú fázu a dodávaciu fázu, pričom médium dodávacej fázy obsahuje zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % tvorí etanol, a médium dodávacej fázy okrem toho obsahuje induktor.

V porovnaní so známymi rastovými systémami, ktoré zvyčajne obsahujú glukózu alebo iný sacharid ako hlavný zdroj uhlíka, médium podľa vynálezu umožňuje vysoko špecifické produkčné hladiny aj v limitujúcich podmienkach, tzn. že výhodne sa nevyskytuje poklesová fáza.

Ešte sa zistilo, že špecifická produkcia je najvyššia v dodávacej fáze v podmienkach limitovaného kyslíka, zatiaľ čo v rastových systémoch založených na glukóze sa najvyššia špecifická produkcia zvyčajne zisťuje v dodávacej fáze, keď je množstvo biomasy ešte relatívne nízke.

Bez toho, aby si prihlasovatelia želali byť viazaní akoukoľvek teóriou, veria, že poklesová fáza je posunutá alebo aj chýba vďaka použitiu média obsahujúceho zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % tvorí etanol, v spôsobe podľa vynálezu.

V spôsobe produkcie heterológneho proteínu sú dodávacie podmienky výhodne optimalizované tak, aby bola optimálna rýchlosť bunkového rastu a produkcia heterológneho proteínu. Ako je uvedené, ak sa huba pestuje v priemyselnom meradle, veľmi výhodný je systém príprava-dodávanie použitím fermentora.

V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka spôsobu produkcie heterológeho proteínu hubou, ktorý zahŕňa prípravnú fázu, indukčnú fázu a dodávaciu fázu, pričom v dodávacej fáze:

a) bunky huby rastú do bunkovej hustoty aspoň 5 g/1 média obsahujúceho akýkoľvek zdroj uhlíka, bez špecifickej preferencie a následne bunky huby rastú na bunkovú hustotu viac ako 5 g/1, výhodne 10 až 90 g/1, výhodnejšie 40 až 60 g/1, použitím média obsahujúceho induktor a zdroj uhlíka, pričom 50 až 100 % uvedeného zdroja uhlíka tvorí etanol,

b) po získaní bunkovej hustoty kroku a) sa vytvoria limitujúce rastové podmienky,

c) po ustanovení týchto limitujúcich podmienok bunky ďalej rastú na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, pričom 50 až 100 % uvedeného zdroja uhlíka tvorí etanol.

V tomto výhodnom spôsobe v prvom kroku bunky rastú v prípravnej fáze, až kým sa nespotrebuje uhlíkový substrát, a v druhom kroku bunky rastú do dostatočnej bunkovej hustoty, aby sa umožnila produkcia heterológneho proteínu vo vysokých množstvách. V prvých štádiách tejto druhej fázy sa indukuje produkcia heterológneho proteínu pridaním induktora do dodávacieho média. Čas, ktorý prejde od nulovej indukcie, a teda veľmi nízkej úrovne produkcie heterológneho proteínu, po maximálnu indukciu, sa nazýva indukčná fáza. Táto indukčná fáza tvorí prvé štádium dodávacej fázy.

Limitujúce podmienky je možné vo fermentore získať niekoľkými spôsobmi. Limitujúce podmienky sú definované ako také podmienky, pri ktorých nie už nie je možný exponenciálny bunkový rast a bunkový rast klesá.

Výhodne sa v spôsobe podľa vynálezu vytvárajú limitujúce podmienky v médiu metódou vybranou zo skupiny, ktorá zahŕňa:

a) redukciu koncentrácie kyslíka vo fermentorovom médiu, výhodne pod 30 %, výhodnejšie pod 15 %,

b) predávkovanie média s etanolom, až kým nie je hladina etanolu v médiu rovnajúca sa alebo vyššia ako rastová limitujúca koncentrácia pre bunky kmeňa, ktorý rastie v médiu,

c) zníženie hladiny iných zložiek nevyhnutných pre rast buniek, pričom uvedená zložka je výhodne vybraná zo skupiny, ktorá obsahuje dusík, fosfor, síru a vitamíny.

Výhodne sa po prípravnej fáze dodávací profil exponenciálne zvyšuje s produkciou biomasy. Keď nastane limitácia kyslíka a nastupuje poklesová fáza, dodávacia rýchlosť sa výhodne nastaví na takú rýchlosť, aby sa udržiavala koncentrácia etanolu pod 10 % obj. vo fermentorovom médiu. Toto sa môže získať napríklad lineárnou dodávacou rýchlosťou alebo pulznou dodávacou rýchlosťou alebo postupnou dodávacou rýchlosťou.

V ešte výhodnejšom uskutočnení sa spôsob podľa vynálezu uskutočňuje opakovaným spôsobom príprava-dodávanie.

Výhodne je induktor vhodný na zapnutie promótora, ktorý je operatívne spojený s heterológnym génom, v génovom konštrukte použitom na transformáciu hostiteľskej huby. Výhodnými induktormi sú galaktóza, metanol, teplota a fosfáty.

Najvýhodnejším induktorom je galaktóza.

Predložený vynález sa netýka spôsobov expresie, v ktorých je etanol použitý ako induktor a zároveň ako zdroj uhlíka (časť zdroja uhlíka).

Keď je induktorom galaktóza, množstvo galaktózy v médiu by malo byť výhodne také, aby sa promótor zapol na požadovanú úroveň, a zároveň, aby bolo také nízke, aby sa galaktóza nemetabolizovala. Na predchádzanie tomuto, je možné použiť kmeň, ktorý nie je schopný metabolizovať induktor.

Výhodne je zloženie dodávacieho média také, že médium vo fermentore obsahuje od 0,1 do 10 % hmotn. galaktózy, výhodnejšie od 0,05 do 1 % hmota., ešte výhodnejšie od 0,05 do 0,2 % hmotn. galaktózy.

Zdroj uhlíka v médiu podľa vynálezu obsahuje aspoň 50 % hmota, a až 100 % hmota, etanolu. Výhodne zdroj uhlíka obsahuje od 80 do 100 % hmota, etanolu. Zvyšok zdroja uhlíka môže byť napríklad sacharid, ako napríklad glukóza, galaktóza, laktóza, sacharóza, fruktóza, alebo iná zlúčenina, ako glycerol, acetát alebo komplexné uhlíkové substráty, ako srvátka a melasa.

Hubou môže byť kvasinka alebo pleseň. Príklady vhodných kvasinkových rodov zahŕňajú Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. Príklady vhodných plesní zahŕňajú Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma. Výnimočne výhodným organizmom je Saccharomyces cerevisiae.

Heterológnym proteínom môže byť akýkoľvek proteín alebo peptid, ktorého produkcia je želateľná. Zistilo sa, že spôsob podľa vynálezu je výnimočne vhodný na produkciu protimrazových peptidov, protilátok alebo ich fragmentov, alebo enzýmov, ako napríklad kutinázy a galaktozidázy. Protimrazové peptidy sú proteíny, ktoré majú schopnosť modifikovať rast ľadu a sú opísané napríklad v Biotechnology advances, zv. 13, č. 3, str. 375-402, 1995 Griffithoma ďalšími, pričom táto publikácia je tu zahrnutá prostredníctvom jej citácie.

Médium pre rôzne fázy rastu húb vo všeobecnosti obsahuje zdroj uhlíka, voliteľne induktor, ktorého prítomnosť je potrebná po prípravnej fáze, a voliteľne ďalšie zložky, ako napríklad vitamíny, kvasinkový extrakt, stopové kovové ióny, okysľovacie činidlá na udržiavanie pH na požadovanej úrovni, fosfátové soli, sulfátové soli, vodu a protipenivé činidlo.

V súlade s iným výhodným uskutočnením sa vynález týka spôsobu produkcie heterológneho proteínu alebo peptidu, pričom prípravné médium obsahuje 1 až 40 % hmota, glukózy, vodu, stopové kovy, voliteľne protipenivé činidlo, kvasinkový extrakt, vitamíny, fosfátové soli a sulfátové soli, a dodávacie médium obsahuje 5 až 35 % obj. etanolu, 0,1 až 10 % hmotn. galaktózy, vodu, stopové kovy a voliteľne protipenivé činidlo, kvasinkový extrakt, vitamíny, fosfátové soli a sulfátové soli, a „dodávacia rýchlosť“, ,,φ“ je v rozsahu od 0,25 do 4 g/min. na 10 litrové množstvo alebo zodpovedajúca hodnota pre fermentáciu vo väčšom meradle.

Vynález sa ďalej týka heterológneho proteínového izolátu, konkrétne protimrazového peptidového izoláta získaného spôsobom podľa vynálezu.

Vynález bude teraz ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Médiá a kultivácia

Všetky údaje o médiách a kultivácii sa vzťahujú na etanolovú fermentáciu v 10 litroch. Pre množstvo 10 m³ ide o to isté, ale upravené prostredníctvom faktora 1000.

Médiá

Predkultivačné médiá:

Inokulačné médiá	Zlúčenina	g/i	Dodávateľ
YNB kvasinková dusíková báza	YNB hmota./obj. aminokyseliny	6,7	Difco
Glukóza*laq	5	AVEBE
V demineralizovanej vode
YPD kvasinková peptónová dextróza	YE	10	Difco
bacto peptón	20	Difco
Glukóza*laq	20	AVEBE
V demineralizovanej vode

Prípravné a dodávacie médiá sú uvedené v tabuľke 1 pre 10-litrové množstvo.

Tabuľka 1

Zlúčenina	Dodávateľ	Koncentrácia (g/kg)
		Prípravné	Dodávacie etanol	Dodávacie kômp. príklad glukóza
Glukóza	Avebe	22,0	-	440,0

Voda z vodov.

EtOH*	Lamers a Pleuger	-	333,84	-
Voda z vodov.

Galaktóza	HMS	-	3,0	3,0
Voda z vodov.

YE Kat G	Ohly	10,0	25,0	25,0
KH₂PO₄	Acros	2,1	12,0	12,0
MgSO₄.7H₂O	Merck	0,6	2,5	2,5
Egli vitamíny	pozri tabuľku 2	1,0	2,0	2,0
Egli stop. kovy	pozri tabuľku 2	10,0	20,0	20,0
Structol J 673	Schill a Seilacher	0,4	0,8	0,8
Voda z vodov.

Celková hmotnosť (g)		5500	4000	4000

čistý etanol, 96,2% obj. obsah, nedenaturovaný

Všetky média sa sterilizovali 25 minút pri 121 °C/1,2 bar (Linden autokláv), sacharidy oddelene. Množstvo vody z vodovodu je opísané neskôr a celkové množstvo je uvedené ako celková hmotnosť v spodnom riadku tabuľky 1.

Tabuľka 2

Zloženie Egli vitamínov a stopových kovov

Egli vitamíny (lOOOx zásobný roztok)	Egli stopové kovy (lOOx zásobný roztok)
Zlúčenina	g/i	Zlúčenina	g/i
Tiamín (HC1)	5,00	CaCl₂.2H₂O	5,50
Mezo-inozit	47,00	FeSO₄.7H₂O	3,73
Pyridoxín	1,20	MnSO₄.lH₂O	1,40
Kys. pantoténová	23,00	ZnSO₄.7H₂O	1,35
Biotín	0,05	CuSO₄.5H₂O	0,40
		CoC1₂.6H₂O	0,45

Vitamíny sa sterilizovali pre filtrovaním cez 0,22pm filter.

Kmeň

Použitým kmeňom bol Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A. Základný CEN.PK2 S. cerevisiae kmeň je komerčne dostupný od EUROSCARF, Inštitúte for Microbiology, Johann Wolfgang GoetheUniversity Frankfurt, Marie-Curie-Strasse 9; Building N250, D-60439 Frankfurt, Nemecko.

Tento S. cerevisiae kmeň nie je schopný metabolizovať galaktózu, keďže GALJ gén bol prerušený inzerciou sekvencii odvodených z S. cerevisiae URA3 génu. Hostiteľský kmeň sa transformoval s expresným plazmidom obsahujúcim nasledujúce elementy:

Promótor: GAL7 promótor, líder GAPDH.GAL7 promótor: dve protismemé aktivačné sekvencie, ktoré sú vždy prítomné. Sú to 2 prirodzené elementy, ktoré sú súčasťou pripojenej sekvencie.

Selekčný marker: Leu2d

Signálna ekvencia: invertáza (SUC3)

Integračný cieľ: fragment rDNA opakovania s unikátnym reštrikčným miestom na cielenú integráciu špecifickej oblasti do kvasinkového chromozómu XII.

Heterológny gén:

Príklad 1: protimrazový proteínový gén kódujúci morskú rybu Macrozoarces americanus rodu Zoarcidae (oceán pout) HPLC12 protimrazový proteín (WO-A-9702343).

Príklad 2: K609, protilátka proti virulentnému faktoru u prasiatok.

Príklad 3: Proteín VHH G, ktorý je HGL11, ktorý je ťažkým reťazcom imuno-globulínu; lipázový inhibítor proti ľudskej žalúdočnej lipáze, opísaný v EP-A-1134231.

Príklad 4: Proteín VHH P, ktorý je HPL18, ktorý je ťažkým reťazcom imuno-globulínu; lipázový inhibítor proti ľudskej pankreatickej lipáze, opísaný v EP-A-1134231.

Proteíny v príkladoch 2 až 4 sú protilátkami získanými imunizáciou lamy v súlade s postupmi opísanými v EP-A-1134231.

Kultivácia

Uskladňovanie kmeňov

Kmene sa uskladňovali pri -80 °C v jedinej prípravnej vzorke z kultúr rastúcich na YNB nariedených 1 : : 1 so zmesou odstredeného mlieka a 20 % glycerolu.

Inokulácia ml YNB sa inokulovalo s 1 ml uskladneného kmeňa a inkubovalo sa 48 hodín ± 2 hodiny pri 30 °C, pri 150 ot./min. Následne sa inokulum prenieslo do 500 ml 2 % YPD, nasledovala inkubácia v priebehu 24 ho-dín ± 2 hodiny, pri 30 °C, pri 150 ot./min.

Fermentor:

Fermentácie sa uskutočňovali v štandardných fermentoroch s pracovným objemom desať litrov. Na kontrolu teploty sa fermentor vybavil ochladzovacou špirálou a zahrievacím prúžkom. Priečky mali štandardné rozmery. Na miešanie sa použil rotor Rushton typu so šiestimi ramenami. Rozpustený kyslík (DO₂) sa meral s Ingold DO₂-eletródou (Mettler-Toledo) a pH sa merala s Ingold Impro 3000 gélovou elektródou (Mettler-Toledo). Hmotnostný spektrofotometer Príma 600 (VG gas analysis systems) sa použil na meranie odchádzajúceho plynu. Celý fermentačný proces bol automatizovaný a riadený softvérom, ale mohlo by sa uskutočňovať aj manuálne na základe poskytnutého návodu.

Dodávací profil sa využíval na kontrolu fermentácie. pH sa kontrolovalo použitím 3M kyseliny fosforečnej (Baker) a 12,5 % obj. amoniaku (Merck). DO₂ sa kontroloval na 30 % automatickým nastavením rýchlosti rotora, až kým sa nedosiahla maximálna rýchlosť miešania (1000 ot./min).

V priebehu fermentácie sa odoberali 5 ml vzorky a schladzovali sa na 4 °C s automatickým odoberačom vzoriek na determináciu suchej hmotnosti a na analýzu koncentrácie produktu.

Prípravná fáza

Na začatie prípravnej fázy sa 500 ml YPD inokula pridalo do 5,5 litra prípravného média. Fermentačné parametre boli v súlade s tabuľkou 3.1. Keď poklesol obsah etanolu vo vychádzajúcom plyne na 300 ppm, začalo sa exponenciálne dodávanie.

Dodávacia fáza

Dodávacie médium sa rozdelilo do dvoch dodávacích fliaš napojených na rovnaké čerpadlo. Jedna dodávacia fľaša obsahovala etanol a vodu z vodovodu do 2 litrov a bola dodávaná do fermentora cez spodnú platňu.

Druhá dodávacia fľaša obsahovala všetky ostatné dodávacie zložky a vodu do 2 litrov a bola dodávaná cez hornú platňu.

Z oboch fliaš, napojených na jedno čerpadlo, sa médium dodávalo rovnakou exponenciálnou dodávacou rýchlosťou podľa rovnice 1. Pre dve fľaše je výsledná dodávacia rýchlosť dvojnásobkom rýchlosti čerpania.

Φν,, =μ . Y_o e μ-t

Pdod. · Yx,S · 60 [g/min.] (rovnica 1)

Φ_ν1 = dodávacia rýchlosť μ = rastová rýchlosť

Y_o = biomasa na začiatku dodávania t = čas od začiatku dodávania

Pdod. ⁼ hustota dodávania

Yx s = odhadovaný výťažok biomasy = časový faktor

Parametre dodávania boli v súlade s tabuľkou 3.

g/min.

h’¹ g (molekulová hmotn. = 24,6 g/mol) min.

g etanol/ g dodávanie g X/ g substrátu min./h

Tabuľka 3

Fermentačné dodávacie parametre pre 10 litrovú etanolovú fermentáciu

Parameter	Hodnota
p(l/h)	0,06
X_o (mol)	1,06
Pdod. (g/g)	0,41
Yxs (g/g)	0,45

Parameter	Hodnota
prípravná T (°C)	30
dodávacia T (°C)	21
prípravný prietok vzduchu (1/min.)	2
dodávací prietok vzduchu (1/min.)	6
DO₂ (%)	30
DO₂ minimum (%)	0
PH	5
SS min (ot./min.)	300
SS max (ot. min.)	1000
EtOH kritérium na začiatku dodávania (ppm)	300
EtOH kritérium na začiatku poklesu (ppm)	800
EtOH maximum (ppm)	2000
Počiatočná celková rýchlosť dodávania (g/min.)	0,28
Lineárna celková rýchlosť dodávania (g/min.)	2

Keď bola koncentrácia kyslíka 0 %, nastavili sa limitujúce podmienky a rýchlosť pumpovania sa nastavila na lineárnu dodávaciu rýchlosť. Toto dodávanie pokračovalo, až kým sa nevyčerpala všetka dodávaná výživa.

Výsledky - Príklad 1

Etanol ako zdroj uhlíka
Čas (h)	AFP (mg/kg fermentačného média)	Suchá hmota (g/kg)	Špecifická produkcia* (mg/g)
0	0	2,4	0
3	0	3,4	0
6	0	5,7	0
9	0	7,6	0
12	0	10,9	0
15	0	10,5	0
18	0	11,7	0
21	0	13,3	0
24	0	15,6	0
27	7,0	17,9	0,393
30	11,4	20,7	0,549
33	17,9	24,8	0,721
36	24,2	28,8	0,840
39	32,4	32,7	0,990
42	41,8	38,4	1,089
45	52,4	42,7	1,227
48	66,9	49,0	1,366
51	78,7	55,0	1,432
51	78,7	55,0	1,432
54	93,7	60,6	1,546
57	112,2	64,8	1,732
60	132,1	68,6	1,925
63	151,2	71,9	2,104
66	165,8	75,5	2,195

* Špecifická produkcia: mg AFP/g suchej hmoty

Z týchto výsledkov vyplýva, že pri produkcii AFP, keď v dodávacej fáze po vzniku limitujúcich podmie10 nok pokračuje dodávanie média obsahujúceho zdroj uhlíka, ktorým je 100 % hmotn. etanol, prekvapujúco vedie k vyššej špecifickej produkcii AFP.

Pozorovalo sa, že produkcia biomasy je konštantná bez straty absolútnej AFP produktivity.

Porovnávací príklad

Rastové médium vdodávacej fáze neobsahovalo etanol, ale 100 % hmotn. glukózy ako zdroja uhlíka. Médium pre tento experiment je opísané skôr. Aj fermentorové dodávacie podmienky sú špecifikované skôr s nasledujúcimi výnimkami:

Dodávacie médium sa aplikovalo do fermentora z jednej dodávacej fľaše obsahujúcej všetky zložky a bolo napĺňané do fermentora cez spodnú platňu. Exponenciálna dodávacia rýchlosť sa aplikovala podľa rovnice 1.

Dodávacie parametre boli v súlade s tabuľkou 3 s tou výnimkou, že X_o hodnota sa nastavila na 2,11 mol, aby viedla k dodávacej rýchlosti s jednou dodávacou fľašou, ako pri etanolovej fermentácii s dvoma dodáva10 cími fľašami na j ednom čerpadle.

Výsledky boli nasledujúce:

Čas (hod.)	AFP (mg/kg)	Suchá hmota (g/kg)	Špecifická produkcia* (mg/g)
0	0	1,9	0
3	0	3,3	0
6	0	5,5	0
9	0	7,2	0
12	0	10,4	0
15	0	11,4	0
18	0	13,3	0
21	0,8	15,8	0,049
24	2,6	18,4	0,142
27	5,8	20,3	0,286
30	10,3	24,6	0,421
33	16,8	28,6	0,588
36	25,5	33,0	0,773
39	35,4	37,5	0,942
42	46,8	43,4	1,077
45	60,3	50,0	1,204
48	74,4	55,9	1,331
51	90,8	62,9	1,445
57	126,4	79,2	1,596
60	135,2	79,5	1,701
63	135,13	79,3	1,705

Z toho vyplýva, že keď rastové médium obsahuje len glukózu, ako zdroj uhlíka, AFP produkcia sa zníži 15 od momentu, keď nastanú limitujúce podmienky. AFP produkcia sa už nezvýši a produkcia klesá.

Výsledky - Príklad 2

Etanol ako zdroj uhlíka	Glukóza ako zdroj uhlíka (porovnávací príklad 2)
VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. produkcia n* (mg/g)	VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. produkcia n* (mg/g)
0	0,91	0	0	6,63	0,00
0	6,17	0	0	12,34	0,00
0	11,66	0	106,33	25,60	4,15
141,77	21,26	6,67	248,09	35,65	6,96
927,40	48,68	19,05	425,30	45,02	9,45
1063,26	51,65	20,58	673,40	57,59	11,69
1222,75	56,68	21,57	856,52	72,22	11,86
1151,87	55,31	20,83	915,59	71,31	12,84

*Špecifícká produkcia: mg heterológneho proteínu/g suchej hmotnosti

Z toho vyplýva, že špecifická produkcia heterológneho proteínu použitím etanolu ako zdroja uhlíka je oveľa vyššia ako pri použití glukózy ako zdroja uhlíka.

Výsledky - Príklad 3

Etanol ako zdroj uhlíka	Glukóza ako zdroj uhlíka (porovnávací príklad 3)
Čas (h)	VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. pro- dukcia n* (mg/g)	Čas (h)	VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. produkcia n* (mg/g)
3	0	2,87	0	21	103,45	17,19	6,02
6	0	5,73	0	27	127,5	20,78	6,14
9	0	6,93	0	33	227,59	28,66	7,94
33	268,97	45,37	5,93	39	272,41	36,78	7,41
36	417,24	50,86	8,20	45	327,59	47,52	6,89
39	537,93	54,45	9,88	51	413,79	57,07	7,25
42	689,66	56,36	12,24	57	503,45	64,48	7,81
				63	565,52	67,10	8,43
				69	596,55	69,73	8,56

*Specifická produkcia: mg heterológneho proteínu/g suchej hmotnosti

Výsledky - Príklad 4

Etanol ako zdroj uhlíka	Glukóza ako zdroj uhlíka (porovnávací príklad 3)
Čas (h)	VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. produkcia n* (mg/g)	Čas (h)	VHH (mg/kg fermentač. média	Suchá hmota (g/kg)	Špec. pro- dukcia n* (mg/g)
0	0,00	0,72	0,00	15	13,79	10,51	1,31
12	0,00	9,79	0,00	21	27,59	16,00	1,72
18	13,79	17,19	0,80	27	55,19	19,10	2,89
24	155,17	25,31	6,13	33	117,24	25,07	4,68
30	275,86	35,82	7,70	39	155,17	32,00	4,85
36	403,45	46,80	8,62	45	213,79	45,13	4,74
39	472,41	50,63	9,33	51	210,34	56,83	3,70
42	620,69	53,49	11,60	57	255,17	68,30	3,74
45	675,86	58,03	11,65

*Špecifická produkcia: mg heterológneho proteínu/g suchej hmotnosti

Claims

1. Spôsob produkcie heterológneho proteínu hubou zahŕňajúci rast huby na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, vyznačujúci sa tým, že 50 až 100 % hmotnostných zdroja uhlíka je etanol, a médium okrem toho obsahuje induktor.

2. Spôsob podľa nároku 1 zahŕňajúci prípravnú fázu a dodávaciu fázu, vyznačujúci sa tým, že médium dodávacej fázy obsahuje zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % hmotnostných tvorí etanol, a médium dodávacej fázy okrem toho obsahuje induktor.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že médium dodávacej fázy obsahuje zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % hmotnostných tvorí etanol, a okrem toho galaktózu ako induktor.

4. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje vo fermentore, ktorý je napĺňaný médiom takou dodávacou rýchlosťou, aby sa koncentrácia etanolu vo fermentore udržiavala pod 10 % objemovými.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 zahŕňajúci prípravnú fázu, indukčnú fázu a dodávaciu fázu, vyznačujúci sa tým, že v dodávacej fáze:

a) bunky huby rastú do bunkovej hustoty aspoň 5 g/1 na médiu obsahujúcom akýkoľvek zdroj uhlíka bez špecifickej preferencie, a následne bunky huby rastú do bunkovej hustoty vyššej ako 5 g/1, výhodne 10 až 90 g/1, výhodnejšie 40 až 60 g/1, použitím média obsahujúceho induktor a zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % hmotnostných tvorí etanol;

b) po dosiahnutí bunkovej hustoty podľa kroku (a) sa vytvoria limitujúce rastové podmienky;

c) po vytvorení týchto limitujúcich podmienok bunky ďalej rastú na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka, ktorého 50 až 100 % hmotnostných tvorí etanol.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje ako opakovaný proces prípravy a dodávania.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že induktor je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje galaktózu, metanol, teplotu a fosfáty.

8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7, vyznačujúci sa tým, že dodávacie médium obsahuje 0,1 až 10 % hmotnostných galaktózy.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že zdroj uhlíka obsahuje 80 až 100 % hmotnostných etanolu.

10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že hubou je kvasinka, výhodne Saccharomyces cerevisiae.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že heterológny proteín alebo peptid je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje protimrazové peptidy, protilátky alebo ich fragmenty a enzýmy.

12. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že prípravné médium obsahuje 1 až 40 % hmotnostných glukózy, vodu, stopové kovy, voliteľne protipenivé činidlo, kvasinkový extrakt, vitamíny, fosfátové soli a sulfátové soli, a že dodávacie médium obsahuje 5 až 35 % objemových etanolu, 0,1 až 10 % objemových galaktózy, vodu, stopové kovy a voliteľne protipenivé činidlo, kvasinkový extrakt, vitamíny, fosfátové soli a sulfátové soli, a že „rýchlosť dodávania“ ,,φ“ je od 0,25 do 4 g/min. v 10 litrovom množstve.