SK285229B6

SK285229B6 - Spôsob výroby derivátov (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4- (hydroxymetyl)-2-cyklopenténu a enantioméru (1R,4S)-N-butyryl-1- amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

Info

Publication number: SK285229B6
Application number: SK54-2005A
Authority: SK
Inventors: Christine Bernegger; Eva Maria Urban; Olwen Mary Birch; Kurt Burgdorf; Frank Brux; Kay-Sara Etter; Pierre Bossard; Walter Brieden; Laurent Duc; John Gordon; Murchu Colm O'; Yves Guggisberg
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-04
Publication date: 2006-09-07
Also published as: CN1201794A; CN1515673A; CA2237297C; JP2010116397A; CN1115343C; ES2223095T3; DK0878548T3; EP0878548B1; CZ297888B6; HUP9801083A2; CZ297894B6; NO324679B1; US6262295B1; KR100601764B1; JP2010106025A; SK284810B6; PL326267A1; CN1302116C; US6252112B1; US6156893A

Abstract

Opisuje sa spôsob výroby enantioméru derivátu (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu všeobecných vzorcov (I) a (II), kde R1 znamená C1-4-alkyl, C1-4-alkoxy, aryl alebo aryloxy, pričom sa v prvom stupni premieňa derivát 1-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu všeobecného vzorca (IV), kde R1 znamená C1-4-alkyl, aryl alebo aryloxy, pomocou mikroorganizmu, ktorý je schopný zužitkovať derivát cyklopenténu všeobecného vzorca (IV) ako jediný zdroj dusíka, ako jediný zdroj uhlíka alebo ako jediný zdroj uhlíka a dusíka, pomocou enzýmu s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou alebo pomocou acylázy penicilínu G na (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4- (hydroxy-metyl)-2-cyklopentén vzorcov (V) alebo (VI), a ten sa v druhom stupni acyluje na zlúčeninu vzorca (I) alebo (II). Opisuje sa tiež enantiomér (1R,4S)-N-butyryl-1-amino-4- (hydroxymetyl)-2-cyklopenténu vzorca (III).

Description

Vynález sa týka nového spôsobu výroby opticky aktívnych zlúčenín všeobecných vzorcov (I) a (II)

a enantioméru (lR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymctyl)-2-cyklopenténu vzorca (III)

O (III).

Doterajší stav techniky

Spôsob výroby (lS,4R)-4-(2-amino-6-chlór-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopentén-l-metanolu z (lS,4R)-4-amino-2-cyklopentén-l-metanolu sa opisuje v WO 95/21 161. Nevýhodou tohto spôsobuje to, že je možné edukt (lS,4R)-4-amino-2-cyklopentén-l-metanol získať výhradne cez (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-ón substituovaný drahou BOC-chrániacou skupinou (ter. butyloxykarbonylová chrániaca skupina) (J. Org. Chem., 1995, 60,4602-4616).

Úlohou vynálezu bolo poskytnúť jednoduchý, výhodný a hospodárnejší spôsob výroby derivátov (1R,4S)- alebo (1 S,4R)-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu (1 S,4R)- a enantioméru (lR,4S)-N-butyryI-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu.

Podstata vynálezu

Táto úloha sa vyriešila spôsobom podľa vynálezu podľa nároku 1. Podstatou vynálezu je spôsob výroby opticky aktívnych zlúčenín všeobecných vzorcov (I), (II)

(I), ° (H).

kde R¹ znamená C^-alkyl, C_U4-alkoxy, aryl alebo aryloxy. C^j-alkyl môže byť substituovaný alebo nesubstituovaný. Pod pojmom substituovaný C^-alkyl sa v nasledujúcom rozumie C|_₄-alkyl substituovaný atómom halogénu. Ako atóm halogénu je možné použiť F, Cl, Br alebo I. Ako príklady pre C,_₄-alkyl sú metyl, etyl, propyl, butyl, izobutyl, terc, butyl, izopropyl, chlórmetyl, bróm-metyl, dichlórmetyl, dibrómmetyl. Výhodne sa ako C|_₄-alkyl používa metyl, etyl, propyl, butyl, izobutyl alebo chlórmetyl.

Ako C,.₄-aIkoxy je možné napríklad použiť metoxy, etoxy, propoxy, butoxy, terc, butoxy alebo izobutoxy. Výhodne sa ako Cj^-alkoxy používa terc, butoxy.

Ako aryl sa môže napríklad použiť fenyl alebo benzyl, výhodne fenyl. Ako aryloxy sa môže napríklad použiť benzyloxy alebo fenoxy.

Tieto zlúčeniny je možné získať premenou derivátu cyklopenténu všeobecného vzorca (IV)

O (iv), kde R¹ znamená C^-alkyl, C).₄-alkoxy, aryl alebo aryloxy, pomocou mikroorganizmov, pomocou enzýmu s N-acetylaminoalkohol-hydrolázovou aktivitou alebo pomocou acyláz penicilínu G na (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén vzorcov (V), (VI)

pričom naposledy uvedená zlúčenina sa acyluje na zlúčeninu vzorcov (I) alebo (II).

Na biotransformáciu sú vhodné všetky mikroorganizmy, ktoré zužitkujú derivát cyklopenténu všeobecného vzorca (IV) ako jediný zdroj dusíka, ako jediný zdroj uhlíka alebo ako jediný zdroj uhlíka a dusíka. Mikroorganizmy je možné izolovať zo vzoriek pôdy, kalu alebo odpadových vôd pomocou zvyčajných mikrobiologických techník. Izolácia mikroorganizmov sa uskutočňuje tak, že sa pestujú zvyčajným spôsobom v živnom médiu, ktoré obsahuje derivát cyklopenténu všeobecného vzorca (IV)

kde R¹ má uvedený význam,

- ako jediný zdroj uhlíka a dusíka,

- ako jediný zdroj dusíka s vhodným zdrojom uhlíka alebo

- ako jediný zdroj uhlíka s vhodným zdrojom dusíka.

Ako deriváty cyklopenténu všeobecného vzorca (IV) sú vhodné napríklad: N-acetyl-, Ν-propionyl-, N-izobutyryl, N-terc. butoxykarbonyl-(N-BOC), N-butyryl alebo N-fenylacetyl-1 -amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén.

Ako vhodný zdroj dusíka môžu mikroorganizmy ako rastový substrát využívať amónium, nitráty, aminokyseliny alebo močoviny. Ako vhodné zdroje uhlíka môžu mikroorganizmy využívať ako rastový substrát napríklad cukor, cukornaté alkoholy, C₂-C₄-karboxylové kyseliny alebo aminokyseliny. Ako cukor sa môžu použiť hexózy ako glukóza alebo pentózy. Ako cukornatý alkohol je možné napríklad použiť glycerín. Ako C₂-C₄-karboxylové kyseliny je možné napríklad použiť kyselinu octovú alebo propionovú. Ako aminokyseliny je možné napríklad použiť leucín, alanin, asparagín.

Ako selekčné a rastové médium sa môžu použiť v odbore bežne používané médiá, ako napríklad médium uvedené v tabuľke 1 alebo „plné médium“ (médium obsahujúce extrakt kvasníc) ako napríklad „Nutrient Yeast Broth“ (NYB), výhodne médium uvedené v tabuľke 1.

Pri pestovaní a selekcii sa účelne indukujú účinné enzýmy mikroorganizmov. Ako induktor enzýmov sa môžu použiť deriváty cyklopenténu všeobecného vzorca (IV).

Zvyčajne sa pestovanie a selekcia uskutočňuje pri teplote od 20 do 40 °C, výhodne od 30 do 38 °C a hodnote pH medzi 5,5 a 8, výhodne medzi pH 6,8 a pH 7,8.

Účelne sa uskutočňuje biotransformácia s mikroorganizmami, ktoré zužitkujú (lR,4S)-izoméry derivátu cyklo penténu ako jediný zdroj uhlíka, ako jediný zdroj uhlíka a dusíka alebo ako jediný zdroj dusíka.

Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas alebo Gordona, najmä druhu Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifícans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putioda K32 alebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), ako i s ich funkčne ekvivalentnými variantmi a mutantmi. Mikroorganizmy DSM 10686 a 10687 boli uložené 20.05.1996, mikroorganizmy DSM 10328 a DSM 10329 boli uložené 06.11.1995, mikroorganizmus DSM 11291 08.10.1996 a mikroorganizmus DSM 11172 20.09.1996 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH, Mascheroderweg lb, D38124 Braunschweig, podľa Budapeštianskeho dohovoru.

Pod výrazom „funkčne ekvivalentné varianty a mutanty“ sa rozumejú mikroorganizmy, ktoré majú v podstate rovnaké vlastnosti a funkcie ako pôvodné mikroorganizmy. Takéto varianty a mutanty môžu vzniknúť náhodne, napríklad UV-ožiarením.

Taxonomický opis Alcal igenes/Bordatclla FB 188 (DSM 11172) bunková forma tyčinky šírka pm 0,5 - 0,6 dĺžka pm 1,0 - 2,5 pohyblivosť+ kmitanie peritrich

Gram-reakcie lýza 3 % KOH+ aminopeptidáza (Cemy)+ spóry oxidáza+ kataláza+

ADH (alkoholdehydrogenáza) NO₂zNO₃denitrifikácia ureáza hydrolýza želatíny kyselina z (OF-test):

glukózy fruktózy arabinózy adipátu+ kaprátu+ citrátu+ malátu+ manitolu

Taxonomický opis Rhodococcus Erythropolis CB 101 (DSM 106 86)

1. Morfológia a farba kolónií: krátke rozvetvené hýfy, ktoré sa starnutím rozpadajú na tyčinky a koky, kolónie sú lesklé čiastočne roztečené, béžové s ružovým tónom, RAL 1001.

2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina mezo-diaminopimelinová.

3. Kyseliny mykolovč: kyseliny mykolové mikroorganizmu Rhodococcus; určenie dĺžky reťazca kyseliny mikolovej (C₃₂-C₄₄) a porovnanie údajov s údajmi zanesenými do databanky DSM-kyselín mikolových ukázalo na veľmi vysokú podobnosť so vzorkami kmeňov Rhodococcus erythropolis (podobnosť 0,588).

4. Vzorka mastných kyselín: nerozvetvené, nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearínová.

5. Pri parciálnom sekvencovaní 16S rDNA kmeňa sa zistila vysoká zhodnosť (100 %) so sekvenciami špecifických oblastí Rhodococcus erythropolis.

Výsledok identifikácie je jednoznačný, lebo tri od seba nezávislé metódy (kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) priradili kmeň druhu Rhodococcus erythropolis.

Taxonomický opis Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)

1. Morfológia a farba kolónií: krátke rozvetvené hýfy, ktoré sa starnutím rozpadajú na tyčinky a koky, kolónie sú svetlooranžové (RAL 2008).

2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina mezo-diaminopimelová.

3. Vzorka menachinónu: MK-9(H₂) 100 %.

4. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganizmu Gordona; určenie dĺžky reťazca kyseliny mykolovej (C₅o-C_6o) sa uskutočnilo pomocou vysokoteplotnej plynovej chromatografíe. Táto vzorka zodpovedá vzorke, aká sa nachádza pri zástupcoch rodu Gordona.

5. Vzorka mastných kyselín: nerozvetvené, nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearínová.

6. Pri parciálnom sekvencovaní 16S rDNA kmeňa sa zistila relatívne nízka zhodnosť (98,8 %) so sekvenciami špecifických oblastí Gordona rubropertineta.

Na základe predložených výsledkov (menachinóny, kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) je možné izolát síce jednoznačne priradiť rodu Gordona. Priradenie k známemu druhu Gordona nie je možné na základe týchto výsledkov. Je teda treba predpokladať, že pri kmeni DSM 10687 ide o nový dosiaľ neopísaný druh rodu Gordona.

Taxonomický opis Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifícans HSZ 17 (DSM 10329)

Vlastnosti kmeňa:	tyčinky
bunková forma
šírka pm	0,5 - 0,6
dĺžka pm	1,5-3,0
pohyblivosť	+
kmitanie	peritrich
Gram-reakcie	-
lýza 3 % KOH	+
aminopeptidáza (Cemy)	+
spóry	-
oxidáza	+
kataláza	+
rast anaeróbne	-
ADH (alkoholdehydrogenáza)	+

N0₂ z N0₃ denitrifikácia ureáza hydrolýza želatíny Tween 80 kyselina z (OF-test): glukózy aerobne xylózy 80 zúži tkovanie substrátu glukózy fruktózy arabinózy citrátu malátu manitolu

Taxonomický opis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) charakteristika: Gram-pozitívne nepravidelné tyčinky s výrazným rastovým cyklom tyčinkykoky; striktne aerobné; žiadna tvorba kyseliny alebo plynu z glukózy pohyblivosť spóry kataláza + mezo-diaminopimelinová kyselina v bunkovej stene: nie peptidoglykanový typ: A3a, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala podobnosť sekvencie lóSrDNA: sekvencovanie oblasti s najväčšou variabilitou preukázalo ako najvyššie hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A. ramosus a A. oxydans

Taxonomický opis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30

bunková forma	pleomorfné tyčinky
šírka pm	0,6-1,0
dĺžka pm	1,5-3,0
Gram-reakcie	-
lýza 3 % KOH	+
aminopeptidáza (Cemy)	+
spóry	-
oxidáza	4-
kataláza	+
pohyblivosť	+
rast anaeróbne	-
nitrit z nitrátu	-
denitrifikácia	-
ureáza	+
hydrolýza želatíny	-
kyselina z:
L-arabinózy	+
galaktózy	-
melezitózy	-
fruktózy	+
arabitolu	-
manitolu	-
erytritolu	-
alkalizácia lakmusového mlieka:	+
ketolaktóza	-

Parciálne sekvencovanie 16S rDNA dokázalo zrovnateľné veľké cca 96 % podobnosti k zástupcom rodov Agrobacterium a Rhizobium. Jednoznačné priradenie k jednému druhu opísanému v rámci týchto rodov nie je možné.

Taxonomický opis Bacillus simplex K2 bunková forma šírka pm dĺžka pm spóry elipsovité guľaté sporangium kataláza anaeróbny rast VP reakcia maximálna teplota pozitívny rast pri 0 °C negatívny rast pri 0 °C rast v médiu pH 5,7 NaCl 2 %

5%

7%

10% médium s lyzozómom kyselina z (ASS) D-glukózy L-arabinózy D-xylózy D-manitu

D-fŕuktózy plyn z fruktózy lecitináza hydrolýza škrobu želatíny kazeínu Tween 80 eskulínu zužitkovanie citrátu propionátu nitrit z nitrátu indol fenylalaníndezamináza arginindihydroláza tyčinky

0,8-1,0

3,0-5,0 +

k. W.

+ +

Analýza bunkových mastných kyselín potvrdila priradenie k rodu Bacillus. Parciálne sekvencovanie 16S rDNA dokázalo 100 % podobnosť k Bacillus simplex.

Taxanomický opis Pseudomonas putida K32

bunková forma	tyčinky
šírka pm	0,8 - 0,9
dĺžka pm	1,5-4,0
pohyblivosť	+
kmitanie	poláme >1
Gram-reakcia	-
lýza 3 % KOH	4-
aminopeptidáza
spóry	-
oxidáza	4-
kataláza	4-
rast anaeróbne	-
pigmenty
fluoreskujúce	4-
pyokyanín	-

ADH + nitrit z nitrátu denitrifikácia ureáza hydrolýza želatíny zúžitkovanie substrátu adipát citrát+ malát+

D-mandelát+ fenylacetát+

D-tartrát

D-glukóza+ trehalóza manitol benzoylformiát propylénglykol+ butylamín+ benzylamín+ tryptamín acetamid+ hipurát+

Profil bunkových mastných kyselín je typický pre Pseudomonas putida. Parciálne sekvencovanie 16S rDNA dokázalo cca 98 % podobnosť k Pseudomonas mendocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnosť k Pseudomonas putida bola 97,4 %.

Taxanomický opis Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)

1. Morfológia a farba kolónií: krátke rozvetvené hýfy, ktoré sa starnutím rozpadajú na tyčinky a koky, kolónie sú matné, svetločervenooranžové RAL 2008.

3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganizmu Rhodococcus.

Určenie dĺžky reťazca kyseliny mykolovej (C32-C44) a porovnanie údajov so záznamami DSMZ-databanky mykolových kyselín dokázalo len veľmi malú podobnosť ku vzorkám kmeňov Rhodococcus ruber (podobnosť, 0,019). Tento korelačný faktor je príliš malý na to, aby sa mohol použiť na identifikáciu druhu.

4. Vzorka mastných kyselín: nerozvetvené, nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearínová. Táto vzorka mastných kyselín je diagnostická pre všetkých zástupcov rodu Rhodococcus a ich blízkych príbuzných ako Mycobakterium, Nocardia a Gordona. Urobil sa pokus o diferenciáciu druhu pri zohľadnení kvalitatívnych a kvantitatívnych rozdielov vo vzorke mastných kyselín. Pomocou numerických metód sa vzorka mastných kyselín z Rhodococcus sp. FB 387 porovnala so záznamami databanky. Taktiež pomocou tejto metódy sa nemohol Rhodoccocus sp. FB 387 z dôvodu malej podobnosti (0,063) priradiť ku žiadnemu opísanému druhu Rhodoccocus.

5. Pri parciálnom sekvencovaní 16S rDNA kmeňa sa priradilo 96 - 818 s 97,9 % koreláciou Rhodococcus opacus. Táto zhodnosť sekvencie je oveľa viac pod 99,5 %, ako sa požaduje na jednoznačné priradenie k druhu v tomto taxóne.

Na základe predložených výsledkov je možné vychádzať z toho, že pri kmeni Rhodococcus sp. FB 387 ide o nový dosiaľ neopísaný druh.

Biotransformácia sa môže uskutočňovať po zvyčajnom pestovaní týchto mikroorganizmov s bunkami v pokoji (nerastúce bunky, ktoré už nepotrebujú žiadny zdroj uhlíka a energie) alebo s rastúcimi bunkami. Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje s bunkami v pokoji.

Enzýmy s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou vhodné na biotransformáciu je možné napríklad izolovať v odbore bežným spôsobom otvorením opísaných buniek mikroorganizmov. K tomu sa môže napríklad použiť metóda s ultrazvukom alebo Frenschova tlaková metóda. Výhodne sa tieto enzýmy izolujú z mikroorganizmov Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686).

Vhodné acylázy penicilínu G sa získajú z mnohých mikroorganizmov, napríklad z baktérii alebo aktinomyceténov, zvlášť z nasledujúcich mikroorganizmov: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 a Micrococcus roseus ATCC 416. Používajú sa najmä obchodne dostupné acylázy penicilínu G ako acyláza EC 3.5.1.11 penicilínu G z E. coli (Boehring Mannheim) alebo z Bacillus megaterium. Vo výhodnom uskutočnení sa používajú imobilizované acylázy penicilínu G.

Biotransformácia sa môže uskutočňovať v médiách známych v odbore, ako napríklad v nízkomolámych fosfátových, citrátových alebo Hepes-tlmivých roztokoch, vo vode, v úplných médiách ako napríklad „Nutrient Yeast Broth“ (NYB) alebo v médiách opísaných v tabuľke 1. Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje v médiu uvedenom v tabuľke 1 alebo v nízkomolámom fosfátovom tlmivom roztoku.

Účelne sa biotransformácia uskutočňuje za jednorazového alebo kontinuálneho pridávania derivátu cyklopenténu (vzorec (IV)) tak, že koncentrácia nepresiahne 10 % hmotn., výhodne 2 % hmotn.

Hodnota pH v priebehu biotransformácie môže byť v rozmedzí od 5 do 9, výhodne od 6 do 8. Účelne sa biotransformácia uskutočňuje pri teplote od 20 do 40 °C, výhodne od 25 do 30 °C.

Acyláciu je možné uskutočniť halogenidom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca (VII)

R1__Q_X (VII) alebo anhydridom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca (VIII)

(VIII), kde R¹ má uvedený význam a X znamená atóm halogénu. Ako atóm halogénu X sa môžu použiť F, Cl, Br alebo I. Výhodne sa používa Cl alebo F.

Príklady pre halogenidy karboxylových kyselín sú: acetylchlorid, chlóracetylchlorid, chlorid kyseliny maslovej, chlorid kyseliny izomaslovej, chlorid kyseliny fenyloctovej, benzylester kyseliny chlórmravčej (Cbz-CI), chlo rid kyseliny propionovej, benzoylchlorid, alylester kyseliny chlórmravčej alebo terc, butyloxykarbonylfluorid. Príklady pre anhydridy karboxylových kyselín sú: terc, butoxykarbonylanhydrid, anhydrid kyseliny maslovej, anhydrid kyseliny octovej alebo anhydrid kyseliny propionovej.

Acyláciu je možné uskutočniť bez rozpúšťadla alebo s aprotickým rozpúšťadlom. Účelne sa acylácia uskutočňuje v aprotickom rozpúšťadle. Ako aprotické rozpúšťadlo sú vhodné napríklad diizopropyléter, pyridín, acetonitril, dimetylformamid, trietylamín, tetrahydrofurán, toluén, metylénchlorid, N-mctyl-pyrolidón, prípadne ich zmesi.

Účelne sa acylácia uskutočňuje pri teplote od 20 do 100 °C, výhodne od Ó do 80 °C.

Príklady opticky aktívnych zlúčenín, ktoré sa vyrábajú podľa tohto spôsobu sú:

(1 R,4S)-N-terc.butoxykarbonyl-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén s hodnotou ee 98 %, (1 R,4S)-N-acetyl-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén s hodnotou ee 98 %, (1 R,4S)-N-butyryl-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén s hodnotou ee 98 %, opticky aktívny (lS,4R)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén a opticky aktívny (lS,4R)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

V ýroba (1 R,4Sj-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu pomocou acyláz penicilínu G

Na biotransformáciu sa použila acyláza EC 3.5.1.11 penicilínu G z E. coli (Boehring Mannhcim) 165 U (jednotiek)/g alebo acyláza EC 3.5.1.11 penicilínu G z Bacillus megaterium. K tomu sa inkubovalo 50 mM tlmivého roztoku fosforečnanu sodného (pH 5 - 9; 4 ml) s 1 % hmotn. neracemického N-fenylacetyl-1 -amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu a 400 mg zodpovedajúcej acylázy penicilínu G pri 37 °C. Po určitých časových intervaloch sa odoberali vzorky a analyzovali pomocou tenko-vrstvovej chromatografie (kremičitanový gél 60, butanol : voda : ľadová kys. octová =3:1:1; detekcia ninhydrínom), plynovej chromatografie (kapilárny stĺpec, HP - 5,5 % fenylmetylsiloxanu) alebo pomocou HPLC. Enzým odštiepil s vysokou aktivitou fenacetylovú skupinu a uvoľnil až 40 % zodpovedajúceho aminoalkoholu. Voľný aminoalkohol sa získal s ee - hodnotou 80 %.

Príklad 2

Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu pomocou mikroorganizmov

2.1 Kal (20 %) z čističky ARA vo Visp sa inkuboval v A + N médiu (pozri tabuľka 1), ktoré obsahovalo 0,5 % hmotn. Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, alebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu, pri 37 °C za trepania. Tvorba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu sa sledovala pomocou tenko-vrstvovej chromatografie.

% týchto obohatených vzoriek sa 1 - 3-krát preočkovalo a jednotlivo nanieslo na pevné média (Plate Count Agar v médiu z tabuľky 1; 20 g/1). Týmto spôsobom sa izolovali mikroorganizmy Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).

2.2 Takto izolované mikroorganizmy sa pestovali v médiu (tabuľka 1), ktoré obsahovalo 0,5 % Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, alebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu. Rástli 24 až 36 hodín až k optickej hustote (OD) od 2 do 3. Takto získané bunky sa zobrali v neskorej exponenciálnej rastovej fáze a premyli v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku.

Nasledujúca biotransformácia sa uskutočnila v 50 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 4,5 - 9), ktorý obsahoval 1 % hmotn. N-acetyl-, Ν-izobutyryl-, alebo N-butyryl-1-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu. Tenkovrstvovou chromatografíou sa zistilo, že 50 % substrátu sa hydrolyzovalo na (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén. HPLC analýzy udali ee - hodnoty medzi 80 a 93 %. Ak sa ako substrát použil N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén, biotransformácia bola 0,14 (g/l/h/OD) pre kmeň DSM 10686, keď sa pestovalo na A + N médiu a 0,03 (g/I/h/OD), keď sa pestovalo na NYB („Nutrient Yaest Broth“) médiu, ktoré obsahovalo N-butvryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén.

Ak sa uskutočnila rovnaká premena s kmeňom DSM 10687 pri koncentrácii substrátu (N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén) 200 mM, biotransformácia bola 0,161 (g/l/h/OD).

Tabuľka 1 médium A + N

MgCl₂ 0,4 g/1

CaCl₂ 0,014 g/1

FeCl₃ 0,8 mg/1

Na₂SO₄ 0,1 g/1

KH₂PO₄ 1 g/1

Na₂HPO₄ 2,5 g/1

NaCl 3 g/1 roztok vitamínov 1 ml/1 roztok stopových prvkov pH 7,5 1 ml/1

2.3 Rhodococcus erythropolis DSM 10686 sa pestoval v 6 1 fermentore v minimálnom médiu (porovnaj tabuľku 2) s octanom amónnym (3 g/1) ako zdroj uhlíka, prípadne dusíka pri 30 °C do bunkovej hustoty OD 650 > 25. V priebehu bunkového rastu sa kontinuálne pridávala 50 % kyselina octová ako dodatočný zdroj uhlíka. Na indukovanie enzýmovej aktivity sa potom pridalo 60 g (±)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu a inkubovalo sa niekoľko hodín. Nakoniec sa ešte raz pridalo 40 g (±)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu a potom sa ďalších desať hodín inkubovalo. Priebeh biotransformácie sa sledoval on-line pomocou HPLC. Pri dosiahnutí 40 % analytického výťažku, vzťažené na vnesený racemický substrát, a ee - hodnoty 85 % sa fermentácia ukončila pridaním kyseliny.

Tabuľka 2 Zloženie média

Komponenty Koncentrácia extrakt kvasníc 0,5g/1 pepton M66 0,5g/1

KH₂PO₄ 4,0g/1

Na₂HPO₄. 2 H₂O 0,5g/1

K₂SO₄ 2,0g/1

NH₄-acetát 3,0g/1

CaCl₂ 0,2g/1

MgCl₂. 6 H₂0 1,0g/1 roztok stopových prvkov (pozri dole) 1,5ml/1

PPG (polypropylénglykol) 0,1g/1

Roztok stopových prvkov

KOH 15,1g/1

EDTA ,Na₂.2 H₂O 100,0 g/1

ZnSO₄.7 H₂O 9,0 g/1

MnCl₂. 4 H₂O 4,0 g/1

H₃BO₃ 2,7 g/1

CoCl₂. 6 H₂O 1,8 g/1

CuCl₂.2H₂O 1,5 g/1

NiCl₂.6 H₂O 0,18 g/1

Na₂MoO₄.2 H₂O 0,27 g/1

2.4 Podobne ako v príklade 14.3 sa pestovali mikroorganizmy Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 a Pseudomonas putioda K32 na octane sodnom v médiu (tabuľka 1) so zlúčeninami a bez zlúčenín N-acetyl-, Ν-propionyl-, N-izobutyryl- alebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén, v ďalšom skrátene označené ako aminoalkoholy.

Nasledujúce výsledky sa dosiahli s exponenciálnymi bunkami, ktoré sa pestovali bez aminoalkoholov (analyzované HPLC):

Kmeň	Pomer v percentách	Hodnota
	[mMol/OD.h]	ee/premena [%l
HSZ 5(DSM 10328)	0,05	88,7/16
HSZ 17(DSM 10329)	0,005	95/23
K32	0,05	54/1
CB101 (DSM 10686)	0,1	84/39

Kmene K2 a KÍ7 sa pestovali, zobrali a podrobili sa 60hodinovej biotransformácii.

Kmeň Pomer v percentách [mMol/OD.h]

K2

HSZ 30 Hodnota ee/premena [%]

92/10

93/3,5

Zo všetkých násad sa zobrali exponenciálne a stacionárne bunky a použili sa na biotransformáciu ako bunky v pokoji. Na základe DC-analýzy sa nepozoroval žiadny rozdiel v počiatočnom pomere pri bunkách indukovaných alebo neindukovaných aminoalkoholom.

Príklad 3

Čistenie N-acetylaminoalkoholhydrolázy z Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)

Enzým sa čistil, ako sa ďalej uvádza, až sa pozoroval už len jeden zväzok proteínov v SDS-PAGE (Pharmacia Phast Gel, 10 - 15 % gradient) pri molekulovej hmotnosti 50 kD.

Bunky Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) sa premyli v 50 mM Tris-tlmivom roztoku (pH 6,2) a koncentrovali na optickú hustotu 190 pri OD_{650 nm}. Po pridaní fenylmetánsulfonylfluoridu (PMSF) na konečnú koncentráciu 1 mM a DNAzy sa bunky podrobili Frenchovmu lisu (tlakové zariadenie), aby sa získal surový extrakt. Po odstredení sa získalo 200 ml bezbunkového extraktu s koncentráciou proteínov 4,8 mg mľ¹.

960 mg benzbunkového extraktu sa nanieslo na ionexový chromatografický stĺpec HiLoad 26/10 Q-Sepharose (Pharmacia), ktorý sa ekvilibroval 50 mM Tristlmivým roztokom (pH 8,0), ktorý obsahoval 1 mM ditiotreitolu (DTT).

Po premytí stĺpca rovnakým tlmivým roztokom sa proteíny eluovali lineárnym gradientom tlmivého roztoku (1500 ml; gradient: 50 mM Tris-tlmivý roztok (pH 8,0), obsahujúci 1 mM DTT, 50 mM Tris-tlmivý roztok (pH 7,0), obsahujúci 1 mM DTT a 1 M NaCI). Enzým sa eluoval zo stĺpca medzi 370 a 430 mM NaCI a pri pH 7,6. Aktívne frakcie sa zbierali a zahustili na 9 ml. Obsah proteínov bol 41 mg.

Na ďalšie čistenie sa roztok proteínov naniesol na gelovofiltračný chromatografický stĺpec Hiload 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), ktorý sa ekvilibroval 50 mM Tris-tlmivým roztokom, ktorý obsahoval 50 mM NaCI a 1 mM DTT. Aktívne frakcie sa spojili a mali spoločný obsah proteínov 10,9 mg.

Tento proteínový roztok sa naniesol na stĺpec Mono Q HR5/5 (Pharmacia), ktorý sa ekvilibroval 50 mM Tris-tlmivým roztokom (pH 8,5) obsahujúcim 1 mM DDT. Proteíny sa eluovali lineárnym gradientom (40 ml) 50 mM Tris-tlmivým roztokom (pH 8,5), obsahujúcim 1 mM DTT - 50 mM Tris-tlmivý roztok (pH 8,5), obsahujúci 1 mM DTT a 1 M NaCI. Enzým sa eluoval medzi 390 mM NaCI a 440 mM NaCI. Aktívne frakcie obsahovali 1,4 mg proteínu.

V poslednom čistiacom kroku sa použil rovnaký stĺpec ekvilibrovaný rovnakým tlmivým roztokom. Ako elučný gradient slúžil rovnaký tlmivý roztok s 0 - 500 mM NaCI a pH 7,0 - 8,5. Týmto spôsobom sa izolovalo 430 pg čistého enzýmu.

N-koncová sekvencia enzýmu sa určila priamo z „Protein-Blot“. Získala sa sekvencia 20 nasledujúcich aminokyselín: Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn. Táto sekvencia nie je homológna k známym proteínom.

Príklad 4

Charakterizovanie enzýmu

Charakterizácia enzýmu sa uskutočnila tak s čistým enzýmom, ako aj s bezbunkovým extraktom, ktorý sa odsolil pomocou stĺpca Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia). Koncentrácia proteínov v bezbunkovom extrakte bola 7,3 mg mľ¹ a koncentrácia proteínov v čistenom enzýme bola 135 pg mľ¹. PMSF sa k bezbunkovému extraktu nepridával.

4.1 Určenie K_m

Určenie K_m sa uskutočnilo v bezbunkovom extrakte. Hodnota K_m reakcie bola pri pH 7,0 a pri teplote 30 °C 22,5 mM pre substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén.

4.2 pH optimum pH optimum na hydrolýzu N-acetyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu (25 mM) sa určovalo s čisteným enzýmom a v bczbunkovom extrakte v rozsahu pH od 6,2 - 9,0 v nasledujúcich roztokoch tlmivého roztoku. Tris-tlmivý roztok 100 mM pH 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 citrát-fosfátový tlmivý roztok 100 mM pH 7,0; 6,55; 6,2 Aktivita sa merala 24 hodín.

pH optimum reakcie bolo medzi pH 7,0 a 7,5 na produkciu 1R,4S a 1 S,4R enantioméru.

Pri bezbunkovom extrakte bolo pH optimum aktivity pri pH 7,0.

Selektivita však bola lepšia medzi pH 6,0 a pH 7,0.

Obr. 1 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbunkový extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti od hodnoty pH.

4.3 Teplotné optimum na reakciu uvedenú v príklade 4.2 ležalo medzi 25 a 30 °C.

Obr. 2 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbunkový extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti od teploty.

4.4 Molekulová hmotnosť sa určila podľa SDS-PAGE na 50 kD.

4.5 Ako substráty sa hydrolyzovali: N-acetyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén, N-propionyl-1 -amino-4-hydroxymctyl-2-cyklopentén, N-izobutyryl-1 -amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén, N-izobutyl-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentén.

Príklad 5

Výroba hydrochloridu (1R,4S)-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

374,1 g roztoku (lR,4S)-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu (obdobná výroba ako v príklade 4) sa odparilo na 123,7 g. Roztok obsahoval 60,2 mMol zlúčeniny (HPLC) a pH sa upravilo 30 % NaOH z hodnoty 2 na 11,7, potom sa extrahoval 3-krát 70 ml izobutanolu. Spojené izobutanolové extrakty sa plynným HCI upravili na pH 1, zahustili na 65 g a filtrovali (odstránenie pevných nečistôt). K filtrátu sa pri 20 °C a pri dobrom miešaní prikvapkalo 60 ml acetónu. Zakalená zmes sa naočkovala kryštálmi titulnej zlúčeniny a miešala 1 hod. pri 5 °C. Po filtrácii a sušení sa získalo 5,2 g produktu. Výťažok bol 58 %.

1.1: 125 - 127 °C.

ee - hodnota 98 % (kalibrovaný chirálny HPLC-stípec) ’H-NMR (DMSO-d₆): ô [ppm] 1,44 (m, 1 H);

400 MHz 2,35 (m, 1 H);

2,83 (m, 1H);

3,42 (m, 2H);

4,10 (s, 1H);

4.80 (s, 1H);

5.80 (d, 1H);

6,06 (d, 1H);

8,13 (s, 3H).

Príklad 6

Výroba (1 R,4S)-N-BOC-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu pH 75 g roztoku (lR,4S)-l-amino-4-hydroxymetyl-2cyklopcnténu (obdobná výroba ako v príklade 2; 44,6 mMol zlúčenín) sa upravilo 30 % NaOH na hodnotu 8 a k roztoku sa pridalo 6 g NaHCOj. Zmes sa zahriala na 52 °C. Za dobrého miešania sa k tomu pridalo 60 ml diizopropyléteru a potom v priebehu 2 hod. sa pridával roztok 11,12 g BOC-anhydridu v 18,2 ml diizopropyléteri. Zmes sa filtrovala cez Celíte a fázy sa oddelili. Vodná fáza sa extrahovala 65 ml diizopropyléteru. Spojené organické fázy sa premyli 45 ml vody, potom sa odparili na 37,5 g a zahriali na 50 °C. K roztoku sa prikvapkalo 31 ml n-hexánu. Po pomalom ochladení na 0 °C (2 hod.) sa titulná zlúčenina filtrovala, premyla 12 ml n-hexán/diizopropyléter 1/1 a sušila. Získalo sa 6,75 g produktu. Výťažok bol 71 %.

11: 70-71 °C ee - hodnota 98 % (kalibrovaný chirálny HPLC-stípec) ’H-NMR (DMSO-d₆): ô [ppm] 1,18 (m, 1H);

400 MHz 1,27 (s, 9H);

2,28 (m, 1H); 2,63 (m, 1H);

3,33 (q, 2H); 4,43 (m, 1H);

4,56 (t, 1H);

5,62 (m, 1H);

5,78 (m, 1H);

6,72 (d, 1H).

Príklad 7

Výroba hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

87,8 g (lR,4S)-N-BOC-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopenténu sa rozpustilo v 270 ml 2N HCI a 1340 ml metanolu. Zmes sa pri spätnom toku varila 4,5 hodiny. Po destilácii metanolu sa zvyšok rozpustil v 800 ml vody. Vodný roztok sa 2-krát extrahoval 340 ml etylacetátu. Vodná fáza sa úplne odparila (50 °C/6 kPa). Pevná látka sa vákuovo sušila pri 50 °C, suspendovala 150 ml dietyléteru, filtrovala a 2-krát premyla 50 ml dietyléteru. Po sušení sa získala titulná zlúčenina s 95 % výťažkom (58,4 g).

Fyzikálne a spektroskopické údaje produktu boli rovnaké ako v príklade 5.

Príklad 8

Výroba (1 R,4S)-N-acetyl-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu g hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu sa rozpustilo v 182 ml anhydridu kyseliny octovej a pri 0 °C sa pridal roztok 18,25 g trietylamínu v 60 ml anhydridu kyseliny octovej. Zmes sa miešala 3 hodiny pri 80 °C, potom sa ochladila na teplotu miestnosti. Trietylamínhydrochlorid sa odfiltroval a premyl 120 ml n-hexánu. Filtrát sa odparil. K zvyšku sa pridalo 300 ml toluénu a pri teplote miestnosti za prítomnosti 5,2 g aktívneho uhlia a 13 g Celitu sa 20 minút miešalo. Po filtrácii a premytí filtračného koláča (3-krát 40 ml toluénu) sa rozpúšťadlo úplne zahustilo. K zvyšku sa pridalo 180 ml metanolu a 15,5 k K₂CO₃ a miešalo sa 10 hodín pri teplote miestnosti. Suspenzia sa filtrovala a filtrát sa odparil. Zvyšok sa suspendoval v 750 ml izopropylacetátu a varilo sa

1,5 hodiny pri spätnom toku v prítomnosti 0,5 g aktívneho uhlia. Po odfiltrovaní aktívneho uhlia (70 - 80 °C) sa filtrát cez noc chladil na 0 °C. Titulná zlúčenina sa filtrovala, premyla 80 ml studeného izopropylacetátu a vákuovo sušila. Získalo sa 17,2 g produktu. Výťažok bol 66 %.

SK 285229 Β6

1.1.: 77 - 80 °C ee - hodnota 98 % (kalibrovaný chirálny HPLC-stípec) ’H-NMR (DMSO-d₆): δ [ppm] 1,15 (m, 1H);

400 MHz 1,78 (s, 3H);

2,25 (m, 1H);

2.66 (m, 1H);

3,35 (m, 2H);

4,58 (t, 1H);

4,70 (m, 1H);

5.62 (m, 1H);

5,85 (m, 1H);

7,80 (d, 1H).

Príklad 9

V ýroba (1 S,4R)-N-acetyl-1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

Z 25 g východiskového hydrochloridu (1S,4R)-1-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopcnténu sa spôsobom podľa príkladu 6 vyrobil titulný enantiomér (výťažok 68 %). Fyzikálne a spektroskopické údaje produktu boli rovnaké ako v príklade 8.

Príklad 10 Výroba (1 R,4S)-N-butyryl-l -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

34,7 g hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-hydroxymetyl-2-cyklopentcnu a 2 g 4-N,N-dimetylaminopyridínu sa rozpustilo v 600 ml metylénchloridu. Roztok sa ochladil na 0 °C. Potom sa prikvapkalo 52 g trietylamínu (5 min.). Zmes sa ešte 30 min. ďalej miešala. K zmesi sa pri 0X1 hodinu pridával roztok 35,2 g butyrylchloridu v 60 ml metylénchloridu. Zmes sa ešte ďalej miešala 1,5 hodiny medzi 0 až 20 °C, potom sa pridalo 600 ml vody. Po rozdelení fáz sa vodná fáza extrahovala 600 ml metylénchloridu. Spojené organické fázy sa 3-krát premyli zakaždým 500 ml 10 % NaOH, a potom sa úplne odparili. Suchá pevná látka sa rozpustila v 120 ml metanolu. K roztoku sa pridalo 5 g K₂CO₃ a pri teplote miestnosti sa ďalej miešalo 2 hodiny. Anorganické soli sa odfiltrovali a premyli 20 ml metanolu. Filtrát sa neutralizoval 2N HC1. Suspenzia sa odfiltrovala a filtračný koláč sa premyl 20 ml metanolu. Filtrát sa úplne odparil. Pevný zvyšok sa sušil a kryštalizoval v 150 ml toluénu. Získalo sa 28,5 g titulnej zlúčeniny. Výťažok bol 67 %.

1.1.: 71 - 72 °C ee - hodnota 98 % (kalibrovaný chirálny HPLC-stípec) 'H-NMR (DMSO-d₆): Ô [ppm] 0,85 (t, 3H);

400 MHz 1,15 (m, 1 H);

1,50 (q, 2H); 2,03 (d, 2H);

2,28 (m, 1H);

2.67 (m, 1H);

3,35 (d, 2H);

4.62 (s, 1H);

4.76 (m, 1H);

5.63 (m, 1H);

5,85 (m, 1H);

7.77 (d, 1H).

Príklad 11

Výroba (lS,4R)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu

Z 34,7 g hydrochloridu (lS,4R)-l-amino-4-hydroxymctyl-2-cyklopenténu ako východiskovej zlúčeniny sa spôsobom podľa príkladu 8 mohol vyrobiť titulný enantiomér (výťažok 63 %). Fyzikálne a spektroskopické údaje produktu boli rovnaké ako v príklade 10.

Claims

1. Spôsob výroby derivátov (1R,4S)- alebo (1S,4R)-1-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu všeobecných vzorcov (I) alebo (II) ⁰ θ (II), kde R¹ znamená C_w-alkyl, C_].₄-alkoxy, aryl alebo aryloxy, vyznačujúci sa tým, že sa v prvom stupni premieňa derivát 1 -amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopenténu všeobecného vzorca (IV)

O (IV), kde R¹ znamená C_M-alkyl, C₁.₄-alkoxy, aryl alebo aryloxy, pomocou mikroorganizmu, ktorý je schopný zužitkovať derivát cyklopenténu všeobecného vzorca (IV) ako jediný zdroj dusíka a/alebo ako jediný zdroj uhlíka, pomocou enzýmu s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou alebo pomocou acylázy penicilínu G na (1R,4S)- alebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén vzorcov (V) alebo (VI) (V) alebo (VI) a ten sa v druhom stupni acyluje na zlúčeninu vzorca (1) alebo (II).

2. Opticky aktívny (lR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymetyl)-2-cyklopentén vzorca (III) (I).

3. Zlúčenina podľa nároku 2, najmenej v 80 % enantiomémom prebytku.

4. Zlúčenina podľa nároku 2, najmenej v 90 % enantiomémom prebytku.

5. Zlúčenina podľa nároku 2, najmenej v 95 % enantiomémom prebytku.

6. Zlúčenina podľa nároku 2, najmenej v 98 % enantiomémom prebytku.