SI9200420A - Vakcina proti infekciji, ki jo povzroča človeški virus imunodeficience - Google Patents

Abstract

Izdela!: smo vakcino proti sindromu pridobljene imunodeficience (AIDS), ki vsebuje proteine ovojnice človeškega virusa imunodeficience, tip-1 (HIV-1), iz kloniranih genov ovojnice HIV-1 v vektorskem sistemu bakulovirus-celica insekta. Rekombinantne proteine HIV-1 smo prečistili, združili v delce in nato adsorbirali na adjuvantu aluminijevem fosfatu. Tako pridobljena oblika adsorbiranega rekombinantnega proteina ovojnice virusa HIV-1 (vakcina proti AIDS-u) je v živalih zelo imunogena in izvabi protitelesa, ki se vežejo za ovojnico HIV-1 virusa ter nevtralizirajo infektivnost virusa v testih in vitro. Ta vakcina preti A!DS-u inducira nove humoralne in celične odgovore v bolnikih inficiranih s HlV-om in je koristna kot oblika zdravljenja z vakcino, da bi odložili ali preprečili uničenje imunega sistema.

Description

Človeški virus imunodeficience tip-1 (HIV-1) je retrovirus, ki povzroča sistemsko infekcijo z glavno patologijo v imunem sistemu in je etiološki povzročitelj odgovoren za sindrom pridobljene imune deficience (AIDS). Barre-Sinoussi, et al., Science, 220: 868-871 (1983); Popovič et al., Science, 224: 497-500 (1984). Klinični izolati HIV-1 so objavljeni tudi kot virus povezan z limfadenopatijo (Feorino et al., Science, 225: 69-72 (1984) in AlDS-u soroden virus (Levy et al., Science 225: 840-842 (1984)).

AIDS je postal pandemičen in razvoj vakcine je zato glavna prioriteta za zdravje ljudi na svetu. Visok odstotek oseb inficiranih s HIV-1 kaže napredujočo izgubo imunega delovanja zahvaljujoč izpraznitvi T4 limfocitov. Te T4 celice, kakor tudi nekatere živčne celice, imajo na svoji površini molekulo, ki jo imenujemo CD4. HIV-1 razloči CD4 molekule z receptorji, ki se nahajajo na ovojnici virusnih delcev, prodre v te celice in se končno replicira ter ubije celico. Lahko pričakujemo, da bo vakcina proti AIDS-u izvabila protitelesa, ki bi se lahko vezala za ovoj2 nico HIV-l in mu preprečila, da inficira T4 limfocite ali druge občutljive celice.

Vakcine običajno dajemo zdravim posameznikom preden jih izpostavimo bolanemu organizmu, kot imuno profilaktično sredstvo. Toda, pametno je pretehtati tudi uporabo učinkovite vakcine proti AIDS-u v imunizaciji po izpostavljanju, kot imunoterapijo za bolezni. Salk, J., Nature, 327: 47 3476 (1987).

Prepričanje, da je ovojnica HIV-1 (env) najbolj obetajoč kandidat za razvoj vakcine proti AIDS-u, je zelo razširjeno. Francis in Petricciani, Nev Eng. J. Med. 1586-1559 (1985); Vogt in Hirsh, Revievs of Infectious Disease, 8: 991-1000 (1986); Fauci, Proč. Natl. Acad. Sci USA, 83: 9278-9283. Protein ovojnice HIV-1 se najprej sintetizira kot glikoprotein molekulske mase 160.000 (gpl60). Predhodnik gp-a 160 se nato cepi v zunanji glikoprotein molekulske mase 120.000 (gpl20) in transmembranski glikoprotein molekulske mase 41.000 (gp41). Ta dva proteina ovojnice sta glavna antigena, tarči za protitelesa v glodalcih, kozah, rhesus opicah in šimpanzah. Robey et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7023-7027 (1986).

Zahvaljujoč zelo niškim ravnem nativnega proteina ovojnice HIV-l v inficiranih celicah in nevarnostmi povezanimi s pripravo vakcine proti AIDS-u iz celic inficiranih s HIV-1, se za izdelovanje antigena ovojnice HIV-l za uporabo kot vakcine proti AIDS-u uporabljajo metode rekombinantne DNA. Zdi se, da tehnologija rekombinantne DNA predstavlja najboljšo izbiro za izdelovanje vakcine od podenot AIDS-a zaradi zmožnosti za proizvodnjo velikih količin varnih in ekonomičnih imunogenov. HIV-l gen so eksprimirali v genetično spremenjenih rekombinantih vaccinia virusih. Chakrabarti et al., Nature 320: 535-537 (1986); Hu et al., Nature, 320: 537-540 (1986); Kieny et al., Biotechnology, 4: 790-795 (1986). Protein ovojnice so tudi eksprimirali v bakterijskih celicah (Putney et al., Science, 234: 1392-1395 (1986)), v celicah sesalcev (Lasky et al., Science, 23: 209212 (1986)) in v celicah insektov. Sintetične peptide izvedene iz aminokislinskih sekvenc v gp41 iz HIV-1 so tudi videli kot kandidate za vakcino proti AIDS-u. Kennedy et al. (19 86) . Toda, s uporabo teh snovi in metod niso izdelali uspešnih vakcin proti AIDS-u.

Uporaba vektorskega sistema bakulovirus- celica insekta za izdelavo rekombinantnih proteinov ovojnice HIV-1 je eden vidik izuma odkritega v zaščitenem in podeljenem patentu v U.S. patent application Serial No. 920,197 vloženem 16 oktobra 1986 (sedaj Serial No. 585,266). Videti tudi Serial No. 151,976.

Dokazali so, da je sistem bakulovirusa splošno koristen v izdelavi proteinov HIV-l in drugih proteinov. Kot primeri, bakulovirus Autographa californica polihedrosis virus jedra (AcNPV) so uporabili kot vektor za ekspresijo cele dolžine gp-a 160 in različnih delov gena ovojnice HIV-1 v inficiranih celicah (Sf9 celice) Spodoptera frugiperada (vrsta črva). V predhodnih patentnih prijavah je odkrit tudi odcepljen gen za gpl60 (rekombinantno število Ac3046), protein, ki je izdelan iz rekombinantnega Ac3046 in tehnika prečiščevanja za produkt Ac3046, ki vključuje afinitetno kromatografijo s lektinom iz leče in kromatografijo z gel filtracijo. Odkrito je, da je protein gpl60 prečiščen na ta način, ki se agregira, da bi tvoril delce, zelo imunogen v glodalcih in vrstah primatov.

Idealna vakcina proti AIDS-u mora omogočiti, poleg zahtev po bistveni biološki čistoči in ne-pirogeničnosti, dolgotrajno zaščito proti infekciji s HIV-l po enem ali več injiciranjih. To je običajno v primeru živih razredčenih vakcin. Kadar za pripravo vakcine uporabimo ubite bakterije ali viruse, ali snovi izolirane iz njih, kot so toksoidi ali proteini, je odgovor z protitelesi velikokrat slab in imu4 niteta samo kratkotrajna. Da bi presegli ali zmanjšali te pomanjkljivosti vakcine ji lahko dodamo dodatno komponento, ki jo imenujemo adjuvant. Adjuvanti so snovi, ki pomagajo stimulirati imuni odgovor. Adjuvanti, ki se običajno uporabljajo v vakcinah za ljudi so geli ali aluminijeve soli (aluminijev fosfat ali aluminijev hidroksid), ki jih običajno navajamo kot galunovec adjuvante. Bomford et al., Adjuvants, Animal Celi Biotech. Vol 2: 235-250, Academic

Press Inc. (London: 1985).

Ta izum omogoča vakcino in metode zdravljenja za človeški virus imunodeficience (HIV), ki obsegajo dajanje iekombinantnega proteina ovojnice HIV inficirani ali občutljivi osebi. V realizaciji, ki ji dajemo prednost, lahko protein ovojnice prečistimo, agregiramo in kombiniramo z nekim adjuvantom (npr. galunovcem) za uporabo kot vakcino.

KRATEK OPIS SLIK

Posameznosti tega izuma razlagamo v nadaljevanju glede na slike, ki smo jih priložili.

Slika 1 ilustrira strategijo kloniranja, ki smo jo uporabili, da bi izolirali gen (env) ovojnice HIV-1 iz plazmida pNA2 E. coli. Črtkani deli so sekvence DNA iz HIV-1 in odprti deli so iz vektorjev za kloniranje. Črn del v plazmi du pl774 smo konstruirali iz sintetičnih oligonukleotidov in ga vstavili kot Smal-KpnI fragment v Smal-KpnI v mesta plazmida pl614. Pokazali smo sekvenco tega sintetičnega oligonukleotida.

Slika 2 ponazarja strategijo, ki smo jo uporabili, da bi konstruirali rekombinantni plazmidni vektor (p3046), ki smo ga potem uporabili, da bi konstruirali bakulovirusni vektor za ekspresijo Ac3046. Plazmid pMGS3 vsebuje sekvence (prečno črtkane površine) iz AcNPV bakulovirusa na obeh straneh mesta vkloniranja na položaju 4.00. To mesto ima edinstvena mesta za restrikcijske endonukleaze Smal, KpnI in Bglll. AcNPV polihedrinski promotor se nahaja v smeri 5' od položaja 4.00. Sekvenca 5TAATTAATTAA- 3' se nahaja v smeri 3' in ima translacijski kodon za terminacijo v vseh treh okvirjih čitanja. Plazmid pl774 in sekvenco območja sintetičnega oligonukleotida smo opisali na sliki 1. Plazmid p3046 vsebuje vse od pMGS3 razen sekvenc med Smal in Bglll mesti, kjer je vstavljen gen ovojnice HIV-1 iz pl774.

Slika 3 kaže nukleotidno sekvenco DNA ki se nahaja na koncih sekvenc, ki kodirajo gpl60 Ac3046. Sekvenco 3046 env DNA med +1 in +2264 smo pokazali na sliki 4.

Slike 4a-4t kažejo dejansko sekvenco DNA segmenta env gena HIV-1 skupaj s sekvencami sintetičnega oligonukleotida na 5' koncu env gena v Ac3046 (med +1 in +2264). Lokacije mest za restrikcijske endonukleaze smo vpisali nad sekvenco DNA in predvideno sekvenco aminokislin smo navedli pod sekvenco DNA. Baze smo označili s številkami na desni in levi strani.

Slike 5a-5h primerjajo sekvence DNA env gena iz Ac3046 z objavljeno sekvenco env gena iz LAV-1. Sekvenca LAV-1 je na vrhu in Ac3046 na dnu. Črta (1) pod sekvenco LAV-1 pokazuje, da je sekvenca v Ac3046 v tem položaju ista. Oštevilčenje sekvence DNA, ki smo ga uporabili je tisto, ki so ga opisali Wain-Hobson et al., Celi, 40: 9-17 (1985) za LAV-l.

Sliki 6 in 6a kažeta končni titer razredčenja pri ELISA testu človeškega seruma pozitivnega na HIV-1 protitelesa (zgornji graf) in seruma rhesus opic (spodnji graf) iz živali, ki smo jih imunizirali z gpl60 (IJ55, KL55) ali gpl20 (AB55, CD55, GH55). ELISA titre smo merili proti zelo prečiščenim proteinom gpl20 in gpl60. Specifično vezano protitelo smo merili s kozjim proti-humanim IgG HRP konjugatom. Največje razredčenje seruma, ki daje pozitiven odgovor v testu, je titer.

Slika 7 (a in b) je tabela, ki povzema imune odgovore inducirane z vakcino, ki vsebuje gpl60, pri vakciniranih seropozitivnih pacijentih, ki reagirajo (7a) oziroma, ki ne reagirajo (7b) na vakcino.

Slika 8 (a, b in c) kaže reakcije na protitelesa, usmerjene proti specifičnim epitopom na ovojnici HIV. Slika 8b ponazarja reakcije pacientov iz programa A, slika 8c reakcije pacientov iz programa B, medtem ko slika 8a podaja vrednosti za obe skupini pacientov.

Slika 9 (a - d) kaže proliferacijo T-celic v vakciniranih seropozitivnih pacientih, ki reagirajo na vakcino, inducirano z vakcino, ki vsebuje gpl60. Sliki 9a in 9c podajata reakcije dva tipična pacienta iz programa A, medtem ko sliki 9b in 9d ponazarjata reakcije dva tipična pacienta iz programa B.

Slika 10 (a - c) kaže prolif eracijo limfocitov kot odgovor povezan z vakcinacijo.

Slika ll je graf, ki kaže odstotek spremembe v CD4 celicah pri osebah, ki reagirajo in pri tistih, ki ne reagirajo, z časom.

POVZETEK IZUMA

Odkrili smo, da je rekombinantni protein ovojnice Hiv-i gpl60 (rgpieo), posebej kadar je adsorbiran na adjuvantu kot je galunovec (npr. aluminijev fosfat), zlasti koristen kot vakcina proti AIDS. Eden vidik tega izuma je AcNPV vektor za ekspresijo, ki ima sekvenco, ki kodira del gena ovojnice HIV-l, ki obdaja aminokisline 1-757 najdene v reΊ kombinantnem klonu št. 3046. Drugi vidik izuma je izdelava tega rekombinantnega proteina ovojnice HIV-1 (in proteina samega) v celicah insekta - posebno proteina rgpl60, ki ga kodirajo aminokislinske sekvence 1-757 (tj. 03046).

Drugi vidiki tega izuma obsegajo prečiščevanje in tvorbo delcev rekombinantnega proteina ovojnice iz produkta gena rekombinantnega bakulovirusa, ki proizvaja 3046 protein in adsorbcijo 3046 delcev na agregate aluminijevega fosfata.

Izum obsega tudi profilaktične in/ali terapevtske vakcine za infekcije AIDS ali HIV in metode preprečevanja ali zdravljenja infekcij AIDS ali HIV.

PODROBEN OPIS IZUMA

Sledeči primeri ilustrirajo izum ne da bi omejevali njegov namen.

Rekombinantni bakulovirus Autographa californica polihedrosis virus jedra (AcNPV), ki vsebuje odcepljen gen za gpl60 HIV-1, ki kodira aminokisline 1-757 proteina ovojnice HlV-a (rekombinantni Ac3046) je opisan v patentni prijavi U.S. application Serial No. 920,197 (sedaj Serial No. 585,260), ki skupno čakajo na priznanje. Faze kloniranja, ki so uporabljene za tvorbo rekombinantnega bakulovirusa, ki vsebuje gene ali dele genov iz HIV-1 so tudi odkrite tam in vključene z referenco.

Sledeče besedilo je podroben opis faz genetičnega inženiringa, ki smo jih uporabili za tvorbo Ac3046 vektorja za ekspresijo. Uporabljene snovi, vključujoč encime in imunološke reagente, smo dobili iz trgovskih virov. Preskrbeli smo tudi primere, ki kažejo kako se izum naredi in uporablja.

Preudarili smo tudi druge rekombinantne proteine ovojnice, skupaj označene kot rgpl60 in ti vključujejo rekombinantne gp!2 0 in gp41. Ac3046 je samo eden primer vektorja za ekspresijo in rekombinantnega proteina ovojnice po izumu.

PRIMER 1

Tvorba bakulovirusnega rekombinantnega Ac3046, ki nosi sekvence, ki kodirajo za aminokisline 1-757

Kloniranje in ekspresija tujega proteina v bakulovirusu kot vektorju zahteva, da je sekvenca, ki kodira poravnana na eni strani s polihedrinskim promotorjem in sekvencami na 5' koncu in na drugi strani s kodirajočimi sekvencami bakulovirusa. Razporeditev je taka, da iz homologe rekombinacije z genomom bakulovirusa sledi transfer tujih kodirajočih sekvenc, ki so poravnane s polihedrinskim promotorjem in neaktivnega gena za polihedrin.

Glede na to smo načrtovali različne vektorje za insercijo, da bi jih uporabili za tvorbo gena ovojnice HIV-a. Vektor za insercijo MGS3, opisan potem, smo načrtovali tako, da je dopolnil ATG iniciacijski kodon za translacijo. Insercijo tujih sekvenc v ta vektor moramo izpeljati tako, da se translacijski okvir ustanovljen z inicijacijskim kodonom pravilno obdrži v tujih sekvencah.

Vektor za insercijo MGS3 smo sestavili iz restrikcijskega fragmenta EcoRI-1 klona DNA izoliranega iz kolonije prečiščenega izolata AcMNPV (WT-1). MGS3 smo načrtovali tako, da je bil sestavljen iz sledečih strukturnih karakteristik; (a) 4000 bp sekvence na 5' koncu od ATG inicijacijskega kodona gena za polihedrin; (b) polilinkerja vstavljenega z mutagenezo usmerjeno na določeno mesto, ki se sestoji iz ATG inicijacijskega kodona na položaju ustreznega kodona polihedrina, restrikcijskih mest Smal, KpnI,

Bglll in splošnega segmenta stop kodona; (c) 1700 bp sekvence, ki se raztega od restrikcijskega mesta KpnI (ki se nahaja v genu za polihedrin) skozi terminalno restrikcijsko mesto EcoRI klona EcoRI-1. Videti npr.

sliko 2.

PRIMER 2

Tvorba rekombinantov bakulovirusa, ki nosijo sekvence, ki kodirajo LAV env

Rekombinantni plazmid, ki smo ga označili kot NA2 (sl. 1) je sestavljen iz 21,8 kb segmenta celega provirusa HIV-1 vstavljenega v pUC18. Navedli so, da je ta klon infektiven ker lahko proizvede virus po transfekciji nekaterih človeških celic. Adachi et al., J. virol. 59: 284 -291 (1986). Sekvence celega gena za proteine ovojnice, ki jih vsebuje NA2 so potekale iz LAV seva HlV-a. Barre-Sinoussi (1983) .

Gen za proteine ovojnice HIV-1 smo izolirali in ga podvrgli inženiringu, kakor je zatem opisano in pokazano na sliki 1. Gen za proteine ovojnice smo najprej izolirali iz NA2 kot 3846 bp dolg EcoRI/SacI restrikcijski fragment in ga klonirali v EcoRI/SacI restrikcijsko mesto pUC19. Plazmid, ki smo ga tako dobili, smo označili kot p708.

Gen za proteine ovojnice smo dodatno reizolirali kot 2800 bp dolg KpnI restrikcij ski fragment in ga klonirali v KpnI restrikcijsko mesto pUC18. Klon, ki smo ga tako debili, smo označili s pl6l4.

KpnI restrikcijski fragment v pl614 vsebuje neznatno odcepljen del gena ovojnice HIV-a tako, da je izpuščena sekvenca dolga 121 bp, ki ustreza N-terminalnem delu. Izpuščeni del gena,ki vključuje sekvence signalnega peptida, smo nadomesti10 li z insercijo dvo-verižnega sintetičnega oligomera. Določili smo, da naj bo vstavljeni oligomer sestavljen iz aminokislinske sekvence LAV-a, s uporabo kodona gena za polihedrin, ki mu dajemo prednost. Da bi olajšali nadaljni postopek smo obenem na mesto vpeljali ATG inicijacijski kodon. ATG inicijacijski kodon bomo dopolnili z bakulovirusnim vektorjem za insercijo. Plazmid, ki smo ga tako dobili, smo označili s p!774.

Sklicujoč se na sliko 2, smo restrikcijske fragmente iz pl774, ki vsesbujejo kodirajoče sekvence različnih domenov ovojnice HIV-1 vklonirali v MGS vektorje za insercijo (npr. MGS3) tako, da je ATG inicijacijski kodon vektorja za insercijo bil v okvirju s kodoni gena za proteine ovojnice. Tvorba p3406 je bila sestavljena iz Smal/BamHI restrikcijskega fragmenta izoliranega iz pl774 vstavljenega v Smal/Bglll mesto plazmidnega vektorja pMGS3. Ta klon vsebuje sekvence, ki kodirajo aminokisline 1 do 757 gpl60 in uporablja terminacijski kodon dopolnjen z MGS3 vektorjem.

PRIMER 3

Priprava in selekcija rekombinantnega bakulovirusa

Plazmid p3046 rekombinacije HIV env gena smo oborili s kalcijevim fosfatom skupaj z AcMNPV DNA (WT-1) in to dodali neinficiranim celicam Spodoptera f rugiperda. Himerni gen smo nato vstavili v genom AcMNPV s homologo rekombinacijo. Rekombinantne viruse smo identificirali z okluzijsko negativno morfologijo kolonij. Take kolonije kažejo citopatski efekt, ki ga lahko identificiramo, ne pa okluzije jedra. Izvedli smo dva dodatna prečiščevanja kolonij, da bi dobili čisti rekombinantni virus. Rekombinantno viralno DNA smo analizirali na insercijo na specifičnem mestu env sekvenc HlV-a s primerjavo njihovih restrikcijskih in hibiidizacijskih karakteristik s temi karakteristikami viralne

DNA divjega tipa.

PRIMER 4

Ekspresija HIV env iz rekombinantnega bakulovirusa v celicah insekta

Posledica ekspresije HIV env sekvenc iz rekombinantnih virusov v celicah insekta bi morala biti sinteza primarnega produkta translacije. Ta primarni produkt bo sestavljen iz aminokislin, ki so bile rezultat translacije s kodonov dopolnjenih z rekombinantnim vektorjem. Rezultat je protein, ki vsebuje vse aminokisline kodirane od ATG inicijacijskega kodona vektorja za ekspresijo na 3' koncu polihedrinskega promotorja do terminacijskega signala translacije na vektorju za ekspresijo (npr. rgpl60). Primarni produkt translacije Ac3046 bi moral čitati Met-Pro-Gly-Arg-Val na koncu verige kjer je Arg (položaj 4) Arg na položaju 2 v originalnem klonu LAV. Met-Pro-Gly kodoni so dopolnjeni kot rezultat strategije kloniranja.

PRIMER 5

Nukleotidna sekvenca vstavljenega gpl60 in DNA, ki se nahaja na njegovih koncih

Nukleotidno sekvenco vstavljenega gpl60 in DNA, ki se nahaja na njegovih koncih smo določili iz restrikcijskih fragmentov, ki smo jih izolirali iz DNA viralnega vektorja za ekspresijo Ac3046. Strategija sekvenciranja je vključevala sledeče faze. 3,9 kb EcoRV-BamHI fragment smo prečistili z restrikcijsko digestijo viralne DNA Ac3046. Viralno DNA Ac3046 smo pripravili iz izvenceličnega virusa prisotnega v celičnem mediju, ki smo ga uporabili za proizvodno serijo vakcine.

Kot smo pokazali na sliki 2, EcoRV-BamHl 3,9 kb fragment vsebuje cel gen gpl60 in 100 bp na 5' koncu in približno 1000 bp na 3' koncu DNA, ki se nahaja z ene in druge strani tega gena. Od tega smo določili nukleotidno sekvenco celega gpl60 gena, vključujoč 100 bp na 5' koncu in 100 bp na 3' koncu DNA, ki se nahaja ob genu.

V kratkem, rezultati sekvenciranja so odkrili himerno tvorbo, ki smo jo predvideli na osnovi strategije kloniranja. Sekvenca gpl60 je bila v bistvu ista kot tista, ki so jo objavili Wain-Hobson et al. (1985). Sekvenca 2253 baz med domnevnimi inicijacijskimi in terminacijskimi kodoni translacije predvideva 751 aminokislinskih kodonov in 28 potencijalnih N-vezanih mest glikoziliranja. Ocenjena molekulska masa tega rgpl60, vključujoč ostanke sladkorjev, je približno 145.000.

Analiza sekvence 200 baz DNA, ki se nahaja na obeh koncih gena, kaže pravilno insercijo , kot smo pokazali na slikah 3,4 in 5.

PRIMER 6

Aminokislinska sekvenca gpl6 0

S standardno avtomatizirano Edmanovo degradacijo in postopki HPLC smo ustanovili, da je N-terminalna sekvenca prvih 15 ostankov gpl60 identična tisti, ki smo jo predvideli na osnovi sekvence DNA. N-terminalni metionin ni prisoten na proteinu gpl60. To je dosledno z opažanjem, da se AcNPV protein polihedrin tudi tvori brez N-terminalnega metionina. Povzetek dejanskih sekvenc gpl60 DNA in Nterminalnega proteina, kot smo določili z analizo DNA AcNPV 3046 in prečiščenega gpl60, je kot sledi (tabela l).

Tabela 1

env	gen	LAV-a v	AcNPV 3046	vektorj u	za	ekspresijo
Ostanek
2	3	4 5	6	7	8	9	10	11	12	13 14
Pro	Gly	Arg Val	Lys	Glu	Lys	Tyr	Gin	His	Leu	Trp Arg	Trp
Gly
ATG CCC	GGG	CGT GTG	AAG	GAG	AAG	TAC	CAA	CAC	CTG	TGG CGT	TGG

GGC

Te rezultate primerjamo z originalnim klonom LAV-1 kot sledi (tabela 2).

Tabela 2 env gen LAV-a v originalnem klonu LAV-1

Ostanek

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gin His Leu Trp Arg Trp Gly

ATG AGA GTG AAG GAG AAG TAT CAG CAC TTG TGG AGA TGG GGG

PRIMER 7

Prečiščevanje rekombinantnega gpl60

Eden vidik predstavljenega izuma je postopek, ki smo ga uporabili, da bi ekstrahirali in prečistili rekombinantni protein ovojnice HIV-1, ki je kodiran v vektorju za ekspresijo Ac3046. Rekombinantni protein ovojnice HIV-1 gpl60 je izdelan v celicah S. frugiperda v času 4-5 dni po infekciji z Ac3046. Prečiščevanje tega proteina igpl60 vključuje faze:

1. Spiranje celic

2. Liziranje celic

3. Kromatografija s gel filtracijo

4. Afinitetna kromatografija na lektinu leče

5. Dializa

Ta primer opisuje prečiščevanje rekombinantnega gpl60 iz približno 2 χ 10⁹ celic inficiranih z Ac3046.

1. Spiranje celic. Inficirane celice smo sprali v puferju, ki vsebuje 50 mM Tris pufer (pH 7,5), l mM EDTA in 1% Triton Χ-100. Celice smo resuspendirali v tem puferju, homogenizirali s uporabo standardnih metod in centrifugirali na 5000 rpm 20 minut. Ta postopek smo ponovili trikrat.

2. Liziranje celic. Oprane celice smo lizirali s sonikacijo v 50 mM tris puferju (pH 8,0-8,5), 4% deoskiholatu in 1% -merkaptoetanolu. Sonikacijo smo izpeljali s stan15 dardnimi postopki. Po sonikaciji so nepoškodovani samo ostanki membrane jedra in njih smo odstranili s centrifugiranjem na 5000 rpm v teku 30 minut. Supernatant, ki vsebuje ekstrahiran gpl60 nima nepoškodovanih celic, kot smo določili z opazovanjem pod svetlobnim mikroskopom.

3. Gel filtracija. Gel filtracijo smo izpeljali v steklenih kolonah Pharmacia 5,0x50 cm, napolnjenih s smolo Sephacryl (Pharmacia). Celoten koristen volumen kolone je približno 1750 ml. Da bi depirogenirali in sterilizirali kolone in cevčice za povezavo smo skozi kolono spustili najmanj 6 litrov 0,1 M NaOH v času 24 ur. Eluent s kolone smo povezali na UV pretočno celico , monitor in pisalnik (Pharmacia) in jo nato uravnotežili s 4 litri puferja za gel filtracijo. Neprečiščen gpl60 smo vlili na kolono in jo razvili z puferjem za gel filtracijo.

Kolona ločuje neprečiščeno zmes v tri glavne frakcije, ki absorbirajo UV svetlobo. Prvi vrh prihaja med približno 500 in 700 ml, drugi med 700 in 14000 ml in tretji vrh med 1400 in 1900 ml puferja. Ta isti profil smo opazili na malih analitskih kolonah, na osnovi katerih smo določili, da je prvi vrh snov molekulske mase > 2.000,000.

Ta vrh je prozoren zahvaljujoč vsebnosti lipidov in lipidnih kompleksov velike molekulske mase. Ta vrh vsebuje tudi od 10 % do 20% gpl60, ki smo ga ekstrahirali iz inficiranih celic. Očitno je ta frakcija gpl60 kompleksirana sama s seboj ali pa z drugimi celičnimi komponentami, tako da tvori agregate velike molekulske mase.

Drugi široki vrh vsebuje večino gpl60 in proteine velike molekulske mase med približno 18.000 in 200.000.

Tretji vrh vsebuje malo proteina in večina UV absorbcije obstoja zahvaljujoč /-merakaptoetanolu, ki se nahaja v vzorcu.

Ko smo drugi vrh prvič opazili na zapisu UV absorbance smo eluent s kolone usmerili naravnost na kolono lektina iz leče. Ko je drugi vrh iztekel iz kolone smo pretrgali vezo med eluentom in kolono lektina iz leče in ga usmerili, v odliv,

4. Lektin iz leče. Medij za afinitetno kromatografijo na lektinu iz leče (Lentil Lectin-Sepharose 4B) smo v masi kupili od Pharmacie. Lektin iz leče smo izolirali z afinitetno kromatografijo na Sephadexu do čistoče večje od 98% in ga nato imobilizirali tako, sa smo ga združili s Sepharoso 4B, uporabljajoč za to bromcian. Ta matrica vsebuje približno 2 mg liganda ma ml gela. Kolona lektina iz leče je steklena kolona dimenzij 5,0 x 30 cm (Pharmacia), ki vsebuje 125 ml gela lektin iz leče-Sepharosa 4B. To afinitetno matrico smo ponovno uporabili potem ko smo jo obilno sprali in regenerirali s postopkom, ki ga priporoča proskrbovalec. Ko ga ne uporabljamo, gel shranimo v koloni v raztopini 0,9% NaCl, 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂ in 0,01% timerosala. Kolono pred vsako uporabo speremo in uravnotežimo z 250 ml puferja za lektin iz leče, ki smo ga zgoraj opisali.

Neprečiščen gpl60 smo vlili na kolono neposredno po tem ko smo ga eluirali s kolone za gel filtracijo, kot smo prej opisali. Ko se je neprečiščen gpl60 vezal za kolono smo jo izprali z 800 ml puferja za lektin iz leče, ki je vseboval 0,1% deoksiholata. v teh pogojih se ves gpl60 veže za kolono. Za eluiranje vezanih glikoproteinov smo uporabili pufer za lektin iz leče in 0,3 M ci-metil manozid in to opazovali skozi UV monitor na valovni dolžini 280 nm.

5. Dializa. Sladkorje in deoksiholate smo odstranili z običajno dializo.

Prečiščevanje gpl60 iz l L inficiranih celic lahko povzamemo v sledeči tabeli (tabela 3).

Tabela 3 Povzetek prečiščevanja

Faza prečiščevanj a	Celotni protein (mg) 1	gpi6 0 protein (mg)	% gpl60 od celotnega	Odstranj ene nečistoče
Oborina	1-2000	20	1-2	Medij za kulturo
1., 2 . in 3. spiranj e	250	15	6	Albumin seruma, večina nukleinskih kislin in topni celični proteini
Gel filtracija	120	12	12	Lipidi, nukleinske kisline in agregati velike mol. m.
Lektin iz leče	14	10	70	Neglikozilirani proteini
Dializa	13	9	70	Sladkor, deok-

ksiholat, presežek Tris puf.

^Celoten protein smo določili na osnovi absorbance na 280 nm

V drugi realizaciji eksperimenta lahko namesto gel filtracije uporabimo kromatografijo z ionsko izmenjavo. Podobno ni kritičen redosled faz: na primer, gel filtracija ali kromatografija z ionsko izmenjavo lahko sledijo fazi prečiščevanja z lektinom iz leče. Po izumu lahko uporabimo tudi druge reagente. Na primer, za prečiščevanje rekombinantnega proteina lahko namesto deoksiholata uporabimo druge detergente. To vključuje neionske detergente kot so Tween 20 (polisorbat 20), Tween 80, Lubrol in Triton Χ-100.

PRIMER 8

A. Združevanje delcev gpl60

Kot eden vidik tega izuma je odkrito, da se lahko gpl6 0 antigen v teku prečiščevanja združuje v delce molekulske mase > 2,000.000. Protein gpl60 ekstrahiramo iz celice kot zmes 80-90% monomerne (molekulska masa 160.000) in 10-20% polimerne (delci) oblike. Faza gel filtracija odstranjuje agregirane oblike gpl60. Poskusi, da bi prečistili gpl60 protein iz te frakcije (prvi vrh s kolone za gel filtracijo) navajajo na to, da je on kompleksiran z drugimi celičnimi proteini, mogoče celo z membranskimi fragmenti. Toda, molekulska masa gpl60 antigena, ki se nahaja v drugem vrhu, ki izhaja s kolone za gel filtracijo, je približno 160.000 300,000 in je on torej predvsem v monomerni ali dimerni obliki.

Do tvorbe agregatov ali polimerjev gpl60 prihaja med razvijanjem kolone lektina iz leče. Ustanovili smo, da antigen tvori agregate bodisi če ga eluiramo z lektinske kolone v 0,5% deoksiholatu, kar je približno 0,2% kritične koncentracije micele (CMC) za deoksiholat, ali kadar gpl60 eluiramo s kolone v 0,1% deoksiholatu.

Veličino agregatov smo merili na FPLC Superose 12 koloni velike rezolucije (Pharmacia). Veličina vzorcev iz reprezentativnih količin prečiščenega gpl60 je pretežno enaka ali pa večja od 2,000.000 molekulske mase veličine standarda plavega dekstrana.

Raziskava Schwallerja et al. (1989) s prečnim vezanjem je pokazala, da je gpl60, ki ga proizvajajo celice insekta, tetramer identičnih podenot. Ta raziskava je tudi pokazala, da je gpl60 v celicah inficiranih s HlV-om in v virusnih delcih tetrameričen. Tako imajo lahko delci rekombinantnega gpl60 terciarno in kvartarno strukturo podobno tisti, ki smo jo odkrili v nativnem HIV gpl60.

Točna 3-dimenzionalna strukura bi lahko bila pomembna za tvorbo epitopov, ki zahteva pravilno prostorno ureditev gpl6 0. Verjetno je, da zaradi tega ker med vezanjem za kolono lektina iz leče in spiranjem kolone odstranimo neglikozilirane proteine, ki so bili vezani za gpl60, hidrofobni deli gpl60 začenjajo tvoriti intermolekulske asocijacije. Deoksiholat se verjetno ne veže za gpl6 0 ko koncentracijo vzdržujemo nad CMC in bo antigen še zmeraj tvoril komplekse. Zdi se, da je združitev tega antigena v agregate notranja lastnost tega proteina ko je enkrat prečiščen po izumu. Mogoče je, da zelo hidrofobna N-terminalna sekvenca, ki se nahaja v gpl60 proteinu prispeva naravni sposobnosti tega proteina, da tvori delce. Po prečiščevanju lahko komplekse gpl60 sterilno filtriramo skozi 0,2 jim filter iz celuloznega acetata ne da bi ob tem prišlo do pomembne izgube proteina.

B. Analiza tvorbe drobcev

Z analizo prečiščenih drobcev, ki jih tvori gpl60, z elektronsko mikroskopijo smo ustanovili, da so to sferični delci podobni proteinom, velikosti 30-100 nM.

Dodatni test prisotnosti teh drobcev je bila analiza prečiščenega gpl60 z gel filtracijo. Približno 100 ug gpl60 smo vlili na HR 10/30 kolono Superose 12 (Pharmacia) za FPLC gel filtracijo. To kolono smo najprej kalibrirali s proteinskimi standardi znanih molekulskih mas. Proteinski profil iz te kolone je zelo reproducibilen; elucijski volumen je inverzno proporcionalen molekulski masi preoteinskih standardov. Kolona loči monomerične gpl60 od polimeričnih oblik in izloči globularne proteine molekulske mase >2 χ 10⁶ . Ko ga spustimo skozi to kolono, se v glavnem ves gpl60 eluira v izločilnem volumnu in je zato njegova molekulska masa > 2 x 10⁶ (2,000.000) .

PRIMER 9

A. Adsorbcija gpl60 na galunovec

Učinkovitost netopnih aluminijevih spojin kot imunoloških adjuvantov je odvisna od popolnosti adsorbcije antigena na trdno fazo. Kot del pričujočega izuma smo odkrili, da lahko pripravimo sestavke galunovca, ki bodo učinkovito adsorbirali gpl60, toda pri pH, ki ne bo zmanjšal moč kompleksa gpl60-galunovec kot imunogena. Faktorji, ki jih kontroliramo med tvorbo tega galunovca (gel aluminijevega fosfata) so:

1. Optimalni pH za adsorpcijo antigena na galunovec je približno 5,0. Toda, odkrili smo, da gpl60 izgubi imunogeničnost na pH 6,5, v primerjavi s pH 7,5, tako da galunovec pripravimo na pH 7,1 + 0,1. Odkrili smo, da se pri tem pH 100% gpl60 še zmeraj adsorbira na galunovec .

2. Ionska moč, ki poteka od prisotnega NaCl, je relativno mala in znaša manj kot 0,15 M.

Prisoten je molarni presežek aluminijevega klorida v odnosu na natrijev fosfat, da bi zagotovili, da v supernatantu ni prostih fosfatnih ionov.

4. Antigen gpl60 dodamo sveže nastalemu galunovcu, da bi zaustavili rast kristala in zmanjšali velikost delcev.

Postopek za pripravo 200 ml galunovca in adsorbcijo prečiščenega gpl6 0 na galunovec je tak, da je končna vsebnost antigena 40 pg/ml, kot je pod tem pokazano v glavnih potezah.

B. Priprava reagentov (200 ml cele oblikovane količine)

Pripravimo sledeče raztopine v 100 ml sterilnih flašah ali čašah prostih pirogenov. Pomešamo soli za raztopino l in raztopino 2 in natrijev hidroksid ter filtriramo skozi 0,2 pm filtre iz celuloznega acetata v 100 ml sterilne flaše proste pirogenov.

Raztopina 1

AlCl₃.6H₂O NaHAc.3H₂O

0,895 g 0,136 g

Raztopimo v 40 ml vode za injiciranje (WFI), 0,2 pm filter

Raztopina 2 Na₃PO₄.12H₂O

1,234 g

Raztopimo v 40 ml WFI, 0,2 um filter

Raztopina 3

NaOH

2,0 g

Raztopimo v 100 ml WFI, 0,2 um filter

Raztopina 4 Tris 1,25 g

Raztopimo v 100 ml WFI, dodamo l ml v 90 ml WFI, uravnamo pH do 7,5 z 0,5 M HCl in s WFI dopolnimo do 100 ml.

Raztopine avtoklaviramo 30 minut; počasi spustimo paro. Ohladimo do sobne temperature.

C. Tvorba galunovca

1. Raztopino 1 (aluminijev klorid-natrijev acetat) dodamo v posodo za oblikovanje, uporabljajoč sterilne odstranljive pipete volumna 25 ml. Zabeležimo volumen raztopine 1 in začnemo z mešanjem.

2. Raztopino 2 (natrijev fosfat) dodamo v posodo uporabljajoč sterilne odstranljive pipete volumna 25 ml in nadajujemo z mešanjem ko se tvori oborina ter zabeležimo volumen raztopine 2.

3. Dodamo 3 ml raztopine 3 (natrijev hidroksid) in nadaljujemo z mešanjem 5 minut. Vzamemo 0,5 ml vzorca in izmerimo pH. Če je pH nižji od 7,0, dodamo še 0,5 ml natrijevega hidroksida, mešamo nadaljnih 5 minut in ponovno izmerimo pH. Nadaljujemo dokler ne uravnamo pH med 7,0 in 7,2.

4. Določimo celoten volumen, ki smo ga dodali posodi za oblikovanje (raztopina 1 + raztopina 2 + raztopina 3) in nato dodamo sterilno WFI da volumen uravnamo do 100 ml.

5. Takoj dodamo 8,000 jjg prečiščenega gpl60 in 100 ml lmM Tris pH 7,5 naravnost v posodo za oblikovanje.

6. Nadaljujemo z mešanjem najmanj 20 minut in nato podelimo oblikovano vakcino v sterilne stekleničke.

PRIMER 10

Imunogeničnost gpl60 absorbiranega na galunovcu (specifičen At odgovor)

Priznana metoda za določanje imunogeničnosti preparata anti gena (vakcine) je meritev specifičnega odgovora protiteles v skupini miši, ki smo jim dali eno samo dozo antigena. Na koncu 4 tednov mišim spustimo kri in merimo s standardnimi testi za protitelesa, npr. ELISA (preizkus z imunosorbentom vezanim za encim) raven protiteles na določen antigen v serumu (običajno antigen, ki smo ga uporabili za imuniziranje živali).

ImunogeniČnosti prečiščenega gpl60 brez adjuvanta na pH 6,0 in pH 7,5 adsorbiranega z galunovcem (kot smo opisali v primeru 9) ali pomešanega s Freundovim popolnim adjuvantom določene v miši so povzete zatem (tabela 4).

Skupina

Konverzija seruma

Tabela 4 gpl60 sr. vrednost ELISA

gpl6 0	Adj uvant	Partija	OD2	%	(P/N)3
i ug	Nobeden, pH 7,5	8702	0,140	57%	4/6
	Nobeden, pH 6,0	8702	0,110	26%	2/7
	Galunovec	8702	1,000	90%	9/10
	Galunovec	8705	2,285	100%	9/6
	Freundov	8604	1,108	83%	5/6
	Freundov	8702	1,396	100%	7/7
0,1 pg	Freundov	8604	0,434	67%	4/6
	Galunovec	8705	1.003	67%	4/6
2 Miši	smo izkrvaveli 28	dni po	imunizaciji in	serum
testirali pri razredčitvi 1	: 10 v	preizkusu	ELISA	proti
gpl6 0 prečiščenemu na gelu.	Podobne	rezultate	smo dobili s
uporabo	komercialnega ELISA	(Genetic Systems	Inc.;	EIAtrn
ELISA)	testa proti nativnim protinom iz	HIV-	1 pri
razredčitvi seruma 1 : 400.

³ Število miši s konverzijo seruma (P) z ozirom na celotno število testiranih (N).

Miši , ki smo jih imunizirali z eno samo 1,0 pg dozo antigena gp!6 0 brez kakršnega koli dodanega adjuvanta bodo izzvale odgovor z protitelesi proti gpl60 (videti zgornjo tabelo). Toda, mnogo močnejši odgovor z proitelesi se opazi v skupini miši, ki smo jih imunizirali z 1,0 pg gpl6 0 adsorbiranem na adjuvantu galunovcu. Ena sama doza manj kot 0,1 pg gpl6 0 pomešanega s popolnim Freundovim ali oblikovana z galunovcem bo serokonvertirala > 50% imuniziranih miši. čeprav manj kot to je bil gpl60 imunogeničen v miših kot neoblikovan antigen pri pH 7,5 in pri pH 6,0, toda prišlo je do izgube imunogeničnosti pri nižjih pH.

PRIMER 11

Imunogeničnost gpl60 absorbiranega na galunovcu (raziskava seruma z ELISA testom)

Zmožnost kandidata za vakcino, da izvabi imuni odgovor je zelo pomembna biološka lastnost. Sledeče eksperimente smo izvedli, da bi potrdili, da je vakcina iz gp!60 oblikovana z galunovcem imunogenična v živalih in da bi potrdili, da adjuvant galunovec povečuje to imunogeničnost.

Na dan 0 smo v miši (skupine po 10) injicirali eno samo dozo (0,5 ug, 1,0 pg ali 5,0 pg) gpl60 samega, gpl60 adsorbiranega na galunovcu ali pa gpl60 v popolnem Freundovem adiuvantu (CFA) . 28. dne smo živalim vzeli kri in s testom ELISA (razredčitev 1 : 10) preiskali če so v serumu prisotna protitelesa na gpl60.

Rezultate za serum, ki smo ga vzeli 28. dneva smo povzeli v tabeli, ki sledi (tabela 5). V vseh skupinah kaže več kakor 50% miši konverzijo seruma. Pri vseh dozah sta število kon verzij seruma in povprečna absorbanca seruma (OD₄tj₀ nm pri razredčitvi l : 10 v preizkusu ELISA) večja če je gpl60 adsorbiran na galunovcu kakor pa v primeru miši, ki smo jih imunizirali samo z gpl60.

Ti rezultati kažejo, da adjuvant galunovec značilno povečuje imunogeničnost antigena gp!60.

Tabela 5 - 28 dni	po injiciranju
Doza	0,5 pg Doza 0,5 pg	Doza 0,5 pg
Sred,	.vrednost Sred.vrednost	Sred.vrednost

	P/N4	OD5	P/N	OD	P/N	OD
gpl6 0		9/10	.407	7/10	.699	7/10	.430
gpl6 0	(galun.	) 9/10	.547	8/10	.797	10/10	1.347
gpl6 0	(CFA)	10/10	1.130	10/10	1.967	10/10	1.317

⁴ Število miši, ki serokonvertirajo (P) v primerjavi s celotnim številom testiranih miši 28 dni potem ko smo jih imunizirali z 0,5 pg, 1 pg ali 5 pg VaxSyn^tm HIV-1.

⁵ Srednja vrednost absorbance (OD_45Q) miši, ki je serokonvertirala kot smo je izmerili s sponzorjevim preizkusom ELISA proti gpl60 pri razredčitvi seruma 1 : 10.

PRIMER 12

Podatki nevtralizacije

Preizkus nevtralizacije HIV-1 je priznana metoda za določanje ali bo pripravek nekega protitelesa inhibiral HIV1 virus iz človeške limfocitne celice v kulturi, ki je občutljiva na infekcijo. Antiserum iz živali imuniziranih z gpl60 smo testirali v preizkusu nevtralizacije HIV-1 in rezultate povzeli v spodnji tabeli (tabela 6).

Tabela 6

žival	Identifi- kacija	Imugen/ Adj uvant	g 6	Titer nev- tralizac.
Rhesus	G55	gpl20/galun.	16/8/8	1:80-1:160
Rhesus	H55	gpl20/galun.	16/8/8	1:80-1:160
Rhesus	L55	gpl60/galun.	16/8/8	> 1:80
Miš	Pool 3	gpl20/Freundov	.25/.25/.25	1:40-1:80
Miš	Pool 8	gpl60/Freundov	.l/.l/.l	1:40-1:80
Morski prašiček	Prečiščeni IgG	gp!60/Freundov	10/10/10	1:320

^b gpl60 ali gpl20, ki smo jih dajali med prvo, drugo in tretjo imunizacijo.

Največja razredčitev antiseruma, ki bo inhibirala infekcijo za 50% v odnosu na celice inficirane s HIV-l, ki so bile izpostavljene serumu neimuniziranih živali.

PRIMER 13

Imunogeničnost v šimpanzih

Genetično je šimpanza človekov naj bijižji sorodnik in je sedaj edini živalski model za infekcijo s HIV-l. v poskusu varnost/imunogeničnost na treh šimpanzih smo dve šimapnzi imunizirali s 40 pg , oziroma 80 ug gpl60. Kontrolno žival smo istočasno vakcinirali z 1 ml raztopine natrijevega klo28 rida. Tedensko smo v vzorcih seruma iz vsake od treh šimpanz analizirali prisotnost protiteles na gpl60 in viralnih antigenov HIV-1 s uporabo treh imunoloških preizkusov, testa ELISA proti prečiščenim gpl60, ki ga je razvil MicrogeneSys, Inc., Western blot analizo in komercialnega ELISA testa za HIV-l. Rezultate teh analiz opisujemo v tekstu, ki sledi.

A. ELISA (MGSearch HIV 160)

Preizkus ELISA, MGSearch HIV 160, MGSearch je trgovska znamka MicxoGeneSys, Inc. iz Meridena, Connecticur, U.S.A., je imunosorbentski preizkus proti gpl60 in je opisan v U.S. Patent Application Serial No. 920,197 (sedaj No. 585,166), ki skupno čaka na priznanje,

Vzorce seruma, ki smo jih vzeli pred imunizacijo in 11 tednov po primarni imunizaciji smo razredčili od 1 : 10 do ; 100.000 in nato inkubirali z nitroceluloznimi trakovi, ki so vsebovali 100 ug prečiščenega gpl60 v lisi. Končni titer razredčitve je največja razredčitev pri kateri je test bil pozitiven za anti-gpl60 protitelesa, kot smo to zapazili s kozjim proti - človeškim konjugatom IgG-alkalna fosfataza.

Vzorci seruma iz kontrolne živali in pre-imunega seruma imunizirane živali so bili negativni. Šimpanza, ki je dobila dozo 80 ug je bila pozitivna pri razredčitvi l : 100 v tednu in šimpanza, ki je dobila dozo 40 p.g je bila pozitivna pri razredčitvi 1 : 10 v tednu 4. Titer protiteles proti gpl60 je nadaljeval z rastom do tedna 5, ko so končni titri razredčitve bili približno 1 : 100.000, oziroma 1 : 2,000.000. Titer protiteles je v obeh živalih čisto neznatno padel v tednih 6-11.

Ta tip odgovora je in kvantitativno in kvalitativno podoben odgovorom z protitelesi, ki jih običajno opazimo pri šimpanzah, ki smo jih vakcinirali s vakcino človeškega hepatitis B virusa .

B. Komercialni test ELISA

Na osnovi MGSearch HIV 160 ELISA in Western blot analize seruma iz VaxSyn⁸ imuniziranih šimpanz je postalo jasno, da so serumkonvertirale in da imajo protitelesa proti rekombinantnemu gpl60. Z namenom, da bi določili ali one sintetizirajo tudi anti-HIV protitelesa, ki razločijo nativne proteine virusne ovojnice smo pre-imuni serum vzet v tednih 1 do 11 testirali s licenčnim, komercialnim kitom za ELISA test, kit za test LAV ΕΙΑ™, ki ga proizvaja Genetic System Corporation, Seattle, Washington. Žival imunizirana z 80 pg gpl60 je bila pozitivna pri razredčitvi 1 : 100 po 2 tednih in je nadaljevala s povečanjem ravni protiteles skozi teden 6. Žival imunizirana s 40 pg je bila pozitivna pri razredčitvi 1 : 100 v tednu 6.

PRIMER 14

Porazdelitev protiteles med gpl20 in gp41

Pomembno je določiti ali je odgovor z protitelesi proti gpl60 v vakcinirani živali usmerjen proti gp41, gpl20 ali proti obem. Za detekcijo in meritve porazdelitve protiteles proti različnim delom proteinov ovojnice HIV-1 smo uporabili različne imunološke metode, vključujoč radioimunoprecipitacijo (RIP), imunofluorescenco (IF), Western blot analizo (WB) in kvantitativni test ELISA proti trem različnim rekombinantnim antigenom ovojnice.

⁸ VaxSyn je trgovska znamka MicroGeneSys, Inc. za AIDS vakcino tu opisano.

Slika 6 povzema imunoreaktivnost treh različnih rekombinantnih antigenov: ART TAB (1) gpl20-delta (okrnjen rekombinantni gpl20 iz HIV-1 s približno 40 manjkajočih aminokislin s C-terminalnega dela molekule); [ARTJ [TABj (2) gpl20 (cela dolžina rekombinantnega gpl20 iz HIV-1); in [ARTj [TAB] (3) gpl6 0.

človeški serum iz posameznikov pozitivnih na protitelesa 50 HIV-l in 3 združena človeška seruma so bili zelo reaktivni s gpl60, zmerno reaktivni s gpl20 in malo ali pa nič protitelesno reaktivni z okrnjenim gpl20. Verjetno okrnjeni gpl20, ki predstavlja več kot 90% zunanjega glikoproteina HIV-1, vsebuje zaščitne determinante. Opažanje, da ima človeški serum pozitiven na AIDS malo protiteles proti tem delu proteinov ovojnice je dosledno z dejstvom, da imuni odgovor na virusno infekcijo ni popolna zaščita in da človeški pozitivni serum običajno kaže nizko raven nevtralizirajoče aktivnosti in vitro.

Nasprotno temu imajo rhesus opice imunizirane bodisi z imunogenom gpl60 ali z okrnjenim gpl20 protitelesa, ki močno reagirajo s okrnjenim delom gpl20 ovojnice HIV-1. Ta razlika v porazdelitvi mest, ki jih razločijo protitelesa, vzdolž ovojnice virusa in višji titri ki smo jih opazili pri opicah lahko razloži dejstvo, da ima opičji serum višje titre nevtralizacije.

Kvantitativno ocenitev imunoreaktivnosti teh treh rekombinantnih antigenov ovojnice s človeškim in imunim rhesus serumom smo prikazali na sliki 7. Vsi opičji serumi, ki smo jih testirali, imajo visoki titer protiteles proti okrnjenemu gp!20 antigenu (gpl20-delta), vključujoč tiste iz živali, ki smo jih imunizirali s gpl60.

Ti rezultati kažejo, da rekombinantni gpl60 izvabi v rhesus opicah odgovor z protitelesi, ki je drugačen od tistega, do katerega velikokrat pride med naravno infekcijo. V gpl2031 delta delu gpl60 se nahajajo epitopi, ki jih imunizirane opice učinkovito razločijo, ki pa jih človeški imuni sistem med infekcijo ne vidi. Lahko, da so ti novi epitopi pomembni za zaščito proti HIV-1 in bi lahko bili pomembna lastnost rekombinantnega gpl60 za preprečitev in zdravljenje infekcije s HlV-om.

PRIMER 15

Terapevtsko dajanje vakcine

Izpeljali smo klinični poskus s 30 HIV-seropozitivnih človeških bolnikov, da bi določili učinke vakcinacije s kloniranim gpl60 HlV-a (izdelanim v sistemu bakulovirusa, kot smo zgoraj opisali) na posameznike inficirane s HlV-om.

Vakcinacija s rekombinantnim gpl60 je pripeljala do povečanja specifičnega humoralnega in celičnega imunega odgovora na gpl60 HlV-a pri 19 od 30 (63%) HIVseropozitivnih prostovoljcih. Štirinajst od 15 (93%) prostovoljcev, ki so dobili 6 doz vakcine, so pokazali povečanje njihovih celotnih protiteles proti gpl60. Zato se lahko rekombinantni proteini HlV-a (tj . rgp41, rgpl20, rgpl60 in njihove primesi) koristno uporabljajo v postopku zdravljenja človeškega bolnika inficiranega s HlV-om.

Učinkovite količine proteina HlV-a, ki smo jih uporabili v tej realizaciji izuma lahko določimo s tehnikami dobro znanimi na tem področju, kakor so tiste, ki jih zatem prikazujemo. Običajno so takšne učinkovite količine med približno 1 pg in približno 100 pg na kg telesne mase bolnika. Pogostnost dajanja tudi lahko določimo na znane načine. V realizaciji, ki ji dajemo prednost, gre dajanje preko parenteralne poti, tj. intravenozno, intraperitonealno, intramuskularno, intradermalno, itn. kakor je dobro znano tistim, ki so na običajen način izurjeni v tej veščini.

A. Selekcija prostovoljcev

Določeno je trideset prostovoljcev, ki so bili inficirani s HIV-om. Za uvrščanje v eksperiment so bili godni samo seropozitivni prostovoljci z infekcijo s HIV-om v zgodnjem stadiju, ki ga definiramo kot Walter Reed stadij 1 ali 2 (CD4 celi ne štejejo manj kot 400 za več kot 3 meseca, z ali brez limf adenopati j e) . (Redfield et al., Nev Engl. J. Med. 314 : 131-132 (1986). Dodatno merilo je omejilo prostovoljce na odrasle osebe v dobi med 18 in 50, z normalno popolno krvno sliko, brez evidence o končnih organskih boleznih, brez zlouporabe alkohola ali drog tekom predhodnih 12 mesecev in na tiste, ki niso proti-retrovirusno ali imunomodulatorično zdravilo. Vsi bolniki so bili v teku 2 mesecev podvrženi ocenitvi njihovega osnovnega stanja preden smo jih po naključju podelili v skupine za zdravljenje. Med poskusom ni nobeden prostovoljec dobil kakršnokoli protiretrovirusno ali pa imunomodulatorično zdravilo.

Šestindvajset prostovoljcev od 30 so bili moški; 4 so bile ženske. štirinajst so bili Kavkazijci, 13 črnci in 3 španskega porekla. Povprečna starostna doba je bila 29 (obseg 18-49). Ob registraciji je 8 prostovoljcev bilo v Walter Reed stadiju 1, 22 prostovoljcev pa v Walter Reed stadiju 2. Osnovna črta srednje vrednosti štetja CD4 je bila 668 (obseg 388-1639). Povprečen čas med začetno dijagnozo in vstopa v preučevanje je bil 24 mesecev (obseg 3 meseca do 49 mesecev).

B. Vakcinski produkt in shema imunizacije

Kot smo tu opisali, poskusna vakcina vsebuje neinfektivno podenoto glikoproteina, ki izhaja iz gpl60 kot rekombinantni protein eksprimiran v bakulovirusu. Imunogenični pro33 tein smo proizvedli v celicah insekta Lepidoptera, ga biokemično prečistili in adsorbirali na aluminijev fosfat za končno oblikovanje vakcine.

Uporabili smo tri formulacije z različnimi dozami gpl60: 40 pg/ml, 160 pg/ml in 320 pg/ml. Volumen za injiciranje je bil za 40 pg/ml in 160 pg/ml 1 ml, 2 ml 320 pg/ ml pa smo uporabili za dajanje 640 pg odmerkov z injiciranjem.

Trideset prostovol j cev smo razdelili v šest skupin po pet prostovoljcev. Raziskovali smo dve imunizacijski shemi: shema A, s cepljenjem na dan 0, 30. dan in 120. dan; shema B, s cepljenjem na 0. dan, 30. dan, 60. dan, 120. dan, 150. dan in 180. dan. Pri vsaki imunizacijski shemi (shema A ali B) so bile tri skupine, ki so dobivale različne odmerke cepiva (tabela 7 spodaj). Vsa cepljenja smo opravili z injiciranjem v deltoidno mišico. Poskus je trajal 10 mesecev: 2 meseca osnovnega vrednotenja in 8 mesecev vrednotenja koristi po začetnem cepljenju.

Tabela 7 Imunizacijske sheme

	Dana	količina	gpl60	(pg)
		Dan 0	30	00	120	100	100
Skupina	I	40	40		40
Skupina	-*»	160	160		160
Skupina	5	64 0	640		640
Shema B
Skupina	2	40	40	40	160	160	160
Skupina	4	160	160	160	640	640	640
Skupina	6	640	640	640	640	640	64 0

C. Ocenitev vernosti in strupenosti

Vsakega od prostovoljcev smo izprašali in pregledali na dan prvega injiciranja ter še ob dnevih 1, 2, 3, 15 in 30 po vsakem injiciranju. Prostovoljce smo izprašali o morebitnih pojavih vročice, mrzlice, slabosti, bruhanja, artralgije (boleči sklepi), mišičnega revmatizma (bolečine v mišicah), slabotnosti, koprivnice (izpuščaji), sopenja, vrtoglavice ali glavobola. Pregledi so potekali v smeri ocenitve lokalnih reakcij na mestih injiciranja, zasledovali smo rdeče kožne madeže, otekline, srbenje, bolečine in občutljivost, razbarvanje kože, poškodbe kože, sprembe v regionalni limfadenopatiji, funkcijske spremembe na udu, kamor smo injicirali, ter nastajanje podkožnih vozličev na mestu injiciranja. Mesečno smo opravili in ocenili popolno krvno sliko, serumsko kemijo, koagulacijski profil in urinske analize.

In vitro smo ocenili celično imunsko funkcijo s fenotipizacijo T-celic (fenotipi celotnih limfocitov, CD4 in CD8 celic), kakor je opisano v Rickman et al., Clinical Immuno. 52: 85-95, 1989; in v Birx et al., J. Acquir. Immune Defic. Sindr. 4: 188-196, 1991. Proliferativni odgovori na mitogene (pokeveed in Con A) in kontrolne antigene (Candida albicans in tetanus) smo prav tako ocenili. Birx et al. supra. In vivo smo ocenili celično imunsko funkcijo s hipersenzitivnimi zakasnitvenimi kožnimi testi za kontrolo antigenov (npr. mumps, tetanus toksoid, Candida albicans in trichophyton).

Kvantitativne virusne kulture perifernih krvnih enojedrnih celic (PBMCO) in plazme smo ocenili kakor je opisano v Burke et al., J. Acquir. Inanune Defic. Sindr. 3: 1159 -1167, 1991. Verižna reakcija DNA polimeraze (Wages et al., J. Med. Virol. 33: 58-63, 1991) in nivo serumskega p24 antigena smo ocenili z opazovanjem in vivo HIV viralne obremenitve.

Za sistematično toksičnost ni bilo nobenega dokaza, vendar je bila opažena lokalna reaktogeneza pri 87% osebkov (13 v vsaki skupini). Lokalne reakcije so vključile otrdline, občutljivost in prehodne podkožne vozliče na mestih injiciranja; porast regionalne adenopatije pa je bil redko opažen. Noben osebek ni zavrnil dodatne injekcije. Opaziti ni bilo nobene razlike, pri pojavu lokalnih reakcij, med primarno imunizacijo, dodatno injekcijo ali pri odmerjanju.

Za adverzne efekte na imunski sistem ni bilo nobenega dokaza pri merjenju specifičnega proliferativnega odgovora in vitro z mitogenom in antigenom, in vivo s hipersenzitivnim zakasnitvenim kožnim testnim odgovorom, ali pa s pospešitvijo kvantitativnega izčrpanja CD4 celic. Osnovno povprečje štetja CD4 celic je bilo 714 in 605 za vakcino dovzetne in nedovzetne. Povprečje štetja CD4 celic med dnevi poskusa (180-240) je bilo 714 oziroma 561 za cepivo dovzetne in nedovzetne. Med 240 dni trajajočim poskusom je bila čista razlika v spremembi povprečja štetja CD4 celic -0,2% za cepivo dovzetne, za cepivo nedovzetne pa je povprečje odstopalo za 7,3% (slika 11). S cepivom inducirana imunogenost ni bila povezana z dokazi o odstopanju pospešenih CD4 celic pri nobenem individuumu, v času trajanja celotnega poskusa.

Za ocenitev možnosti pospešene replikacije HIV in viralnega tovora, kot posledice cepljenja, smo pri osebkih in vivo merili aktivnost s kvantitativno plazino in PBMC vitalnimi kulturami, PBMS verižno reakcijo DNA polimeraze, ter serumski nivo p24 antigena. Kvantitativne kulture in test verižne reakcije DNA polimeraze so dokazali, da ni bilo nobenih sprememb tokom tega poskusa. Serumskega p24 antigena ni bilo moč detektirati pri osebkih.

D. Ocenitev imunogeničnosti

Protitelesa, usmerjena proti celotnim HIV proteinom, smo merili z uporabo tako rekombinantno pridobljenih virusnih genskih produktov gpl60, p66, p24, kakor celotnega virusnega lizata prototipa HIV seva MN. Uporabljali smo tehniki dot blot in Western blot, kakor je opisano v Toubin et al. ,

Proč. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979). Prav tako smo merili tudi odgovor protiteles na specifični epitop ovojnic (glej sliko 7).

Na sliki 7 sta bila izbrana epitopa 88 (aminokisline 88-98 v gpl20) in 448C (aminokisline 448-514 v gpl20), ker smo ugotovili, da je protitelo, usmerjeno proti tem regijam, v korelaciji s zgodnjo stopnjo HIV infekcije.

Epitopi 106 (aminokisline 106-121 v gpl20), 241 (aminokisline 241-272), 254 (aminokisline 254-272), 300 (aminokisline 300-340), 308 (aminokisline 308-322), 422 (aminokisline 422454) in 735 (aminokisline 735-752) so bili izbrani zaradi domneve o njihovem funkcijskem pomenu. Epitopa 106 in 422 smo vključili v CD4 vezavna mesta; epitopa 241, 254 in 735 smo vključili v skupinsko-specifično nevtralizacijo; epitopa 300 in 308 smo vključili v tipsko-specifično nevtralizacijo.

Epitop 582 (aminokisline 49-128) smo izbrali za kontrolo, ker predstavlja imunodominantno področje ovojnice pri naravni HIV infekciji, še drugi, raziskani, epitopi vključujejo 49 (aminokisline 49-128) in 342 (aminokisline 342-405).

Na sliki 7 predstavljajo zasenčene škatlice dokumentirano spremembo v ovojnico HIV usmerjenem imunskem odgovoru. Zasenčene škatlice s znakom (=) predstavljajo primarni humoralni odgovor; zasenčene škatlice s znakom (+) predstavljajo sekundarni humoralni odgovor; (-) predstavlja protitelesa negativna na specifični epitop pred in po imunizaciji; (+) predstavlja protitelesa pozitivna na specifični epitop pred in po imunizaciji, vendar brez kvantitativne spremembe. Zasenčene škatlice s znakom (.) predstavljajo nov T-celični proliferativni odgovor na gpl60 sledeč imunizaciji. Znak (.) sam predstavlja stanje brez celičnega odgovora na gpl60; medtem, ko hb predstavlja visoko ozadje (high

Ύ7 background) (ni moč interpretirati); nd pomeni ni narejeno (not done).

Nevtralizacijsko aktivnost smo merili proti trem prototipnim izolatom (HIV-IIIB, RF in MN) v sincitijskem inhibicijskem testu, kakor je opisano v Nara, Nature, 333: 469-470 (1988). HIV specifične celične odgovore smo merili s znanimi testnimi tehnikami limfocitne proliferacij e, s uporabo gpl60, p24 in kontrolnega proteina za bakulovirusni eskpresijski sistem (Birx, supra) .

E. Za vakcino dovzetni in nedovzetni osebki

Osebke smo določili za vakcino dovzetne le, če je bil reproduktivni selektivni porast obeh, celičnega in humoralnega, imunskih odgovorov proti specifičnim epitopom HIV ovojnice v povezavi s serijami cepljenja (slika 7). S cepivom inducirana humoralna imunost je definirana kot serokonverzija na specifične epitope HIV ovojnice in/ali sekundarni, dodatni imunski odgovor na specifične epitope ovojnice. S cepivom inducirana celična imunost je definirana kot razvoj novih, reproducibilnih, s cepivom povzročenih proliferativnih odgovorov na gp!60⁹. Osebki, ki ne razvijejo niti humoralnega niti celičnega proliferativnega odgovora na gpl60 ali HIV ovojnico, ali tisti, ki razvijejo le humoralni ali le celični proliferativni odgovor na gpl60 ali HIV ovojnico, so določeni kot na cepivo nedovzetni.

F. Z vakcino induciran humoralni odgovor

Glede na sliko 7, je 19 izmed 30 osebkov (63%) pokazalo, z ⁹ Ta definicija za vakcino dovzetnih je zelo restriktivna v luči znanstvenih ciljev tega poskusa, tj. doseči učinkovitost post - infekcijske imunizacije.

vakcino inducirano, povečanje obeh specifičnih imunskih odgovorov (humoralni in celični) na HIV gpl60. Teh 19 osebkov so okarakterizirali za vakcino dovzetne. Štirje, izmed 11 za vakcino nedovzetnih, so razvili le humoralni ali le celični odgovor. Vseh 7 osebkov, ki niso pokazali niti enega izmed obeh odgovorov, povzročenih s cepivom, je dobilo le tri odmerke cepiva (shema A). Nobenih sprememb niso zaznali pri vezavi protitelesa na HIV polimerazo (p66), produkte stukturnega gena (p24) in ne-HIV kontrolno protitelo za tetanus. Pri nobenem izmed osebkov se ni razvilo protitelo za proti-bakulovirusni Lepidopteran celični kontrolni protein.

Povečanje protiteles za ovojnico (gpl60) so opazili pri 13 osebkih z Western blotom, s uporabo lizata celotnega virusa HIV-MN. Spremembe so bile povezane z imunizacijsko shemo. Trije izmed 15 osebkov v shemi A (20%) in 10 izmed 15 osebkov (67%). Shema B pokaže porast protiteles za proteine iz ovojnice (P=0,025 po Fisherjevem testu točnosti, dvosmernem). Vseh 13 osebkov je prav tako serokonvertiralo na specifične epitope ovojnic.

Nasprotno pa 10 osebkov, ki niso serokonvertirali na noben specifičen epitop ovojnice, ni pokazalo povečanja protiteles za ovojnico po Western blotu. Preostalih 7 osebkov, ki so serokonvertirali le na nekatere specifične epitope ovojnice, ni pokazalo nobene spremembe pri protitelesih za celotno virusno ovojnico. Pri nobenem osebku nisu opazili sprememb pri protitelesih za proteine HIV brez ovojnice.

Štirinajst izmed 15 osebkov (93%) iz sheme B je pokazalo povečanje pri protitelesih za celotni gpl60, v nasprotju z le 7 izmed 15 (47%) osebkov iz sheme A (3 odmerki) (P=0,01 Fisher, dvosmerni), (slika 7).

Kot je pokazano na sliki 8, pred-imunizacija prevladuje post vakcinacijo za vsak specifičen gpl60 epitop, oziroma, kakor sledi: epitop 49 (27-70%), epitop 88 (28-52%), epitop 106 (50-87%), epitop 214 (0-14%), epitop 254 (0-13%), epitop 300 (47-77%), epitop 308 (42-69%), epitop 342 (0-27%), epitop 422 (3 -10%), epitop 448 (73 -87%) in epitop 735 (17 -33%). Serokonverzij o povzročeno s cepivom smo opazili proti vsem specifičnim epitopom, razen proti epitopu 582 (slika 7). Protitelesa (serokonverzij a) , usmerjena proti epitopom 241, 254 ali 342 smo detektirali le v spremstvu cepljenja.

Sekundarni imunski odgovor smo detektirali za sledeče epitope: 88, 106, 300, 448C in 582. Prevlada protiteles, usmerjenih proti epitopu 582, je bila 100% pred cepljenjem, le en osebek (3%) pa je pokazal sekundarni imunski odgovor.

Vzorec, s cepljenjem induciranih, protiteles za epitope ovojnic je bil variabilen (slika 7). Primarni odgovor protiteles (serokonverzija) na vsaj en epitop se je pojavil pri 20 osebkih; 14 od 15 po shemi B in 6 od 15 naključno po shemi A (P=0,005, Fisher, dvosmerni). Osebki po shemi A so serokonvertirali le na 14% (15 od 110) izmed potencialnih epitopov, za katere niso imeli predimunizacijskih protiteles. Osebki iz sheme B so serokonver tirali na 60 od 190 epitopov (47%) (P<0,0001, Fisher, dvosmerni). Serokonverzija na tri ali več epitopov ovojnice se je pojavila pri 9 osebkih (&0%), naključno po shemi B, toda le pri 2 osebkih (13%) naključno po shemi A (P=0,02, Fisher, dvosmerni).

Serumske nevtralizacijske aktivnosti proti trem različnim sevom (HIV-IIIB, MN in RF) smo določili ob dnevih 0, 9 0 in 195 pri 7 osebkih. Štirje od petih, za cepivo dovzetnih, so pokazali povečano nevtralizacijsko aktivnost na enega ali več izolatov. Prav tako pa smo pokazali tudi povečano zmožnost inhibicije nastajanja sincicija, v primerjavi z nedovzetnimi.

G. Z vakcino inducirani celični odgovor

Spremembe v celičnem imunskem odgovoru so temeljile na primerjavi povprečja, pred cepljenjem (osnovna linija) in po cepljenju, indeksov stimulacije limfocitov (LSI), s uporabo Wilcoxonovega testa.

Enaindvajset od 30 osebkov (70%) je razvilo nov celični proliferativni odgovor na gpl60 po cepljenju (slika 7).

Slika 9 prikazuje proliferativni odgovor na gpl60, p24 in bakulovirusni kontrolni protein pri 4 tipičnih dovzetnih osebkih. Pri vseh osebkih je gpl60 induciral proliferacijo nad osnovno povprečje od LSI 3 na LSI 10 (izračunano s uporabo 4 vrednosti, sledeč zadnji imunizaciji). Nasprotno, ni bilo opaziti spremembe pri proliferativnih odgovorih proti HIV p24 proteinu ali za kontrolni bakulovirusni protein.

S cepivom povzročene spremembe v povprečju LSI vrednosti smo ilustrirali na sliki 10 za vse osebke, za osebke, razvrščene v podskupine glede na odvisnost na cepivo in za osebke razvrščene po imunizacijskih shemah.

Sprememba v proliferacijskem odgvoru na gpl60, je bila očitno drugačna med dovzetnimi in nedovzetnimi osebki {<0,001, Wilcoxon, enosmerni). Proliferacijski odgovori na gpl60, inducirani po shemi B (6 odmerkov), so bili večji, kot tisti, inducirani po shemi A (3 odmerki) (P<0,10, wilcoxon, enosmerni).

Devetnajst od 21 osebkov, ki so razvili proliferacijske odgovore na gpl60, je prav tako razvilo humoralni odgovor (za cepivo dovzetni). Najvišje povprečje vrednosti LSI za gpl60 je bilo 50,1 za vse dovzetne osebke. Kakorkoli že, vsak odgovor dovzetnih je bil različen (interval dobljenih vrednosti je med 3 in 171) (slika 7), kakor so bila različna tudi časovna in velikostna razmerja cepljenj (slika 9).

H. Razpravljanje o rezultatih

Ne glede na omejeno število vzorcev v tem poskusu, je bilo dokazano, da je precej faktorjev povezanih z vakcinacijsko imunogeničnost jo. šest od 15 (40%) osebkov po shemi A nasproti 13 od 15 (87%) po shemi B je bilo dovzetnih za cepivo (P=0,02, Fisher, dvosmerni) (slika 7), Izmed 16 osebkov, z osnovnim povprečjem CD4 vrednosti večjim od 600/ml, ih je bilo 13 dovzetnih (81%), nasprotno pa je bilo 6 osebkov izmed 14, ki so imeli osnovno povprečje CD4 vrednosti manjše od 600 celic na mililiter (P=0,07, Fisher, dvosmeren).

Multipla imunizacija poveča imunogeničnost, celo med pacienti z osnovnim povprečjem CD4 vrednosti manjšim od 600 ml, kar je razvidno v tabeli 8. Na primer, 5 od 6 osebkov po shemi B (6 injiciranj) je bilo dovzetnih v primerjavi z le l od 8 osebkov, ki so dobivali cepivo po shemi A (3 injiciranja) (P=0,03, Fisher, dvosmerni), tabela 8.

Tabela 8

Imunska odzivnost na gpl60 cepivo Osnovna vrednost; CD4 in imunizaci-jske sheme

CD4 vrednost N ft Dovzetni (%) tt Nedovzetni.....(11

SHEMA A
>600	7	5	(71%)	2	(29%)
500-600	5	1	(20%)	4	(80%)
<500	3	0		3	(100%)
Skupno	15	6	(40%)	9	(60%)
SHEMA B
>600	9	8	(89%)	1	(11%)
500-600	2	2	(100%)	0
<500	4	3	(75%)	1	(25%)
Skupno	15	13	(87%)	2	(13%)
CELOTNO	30	19	(63%)	11	(37%)

Terapevtsko uporabo cepiv je vpeljal Pasteur v 19. stoletju za zdravljenje stekline. Uporaba tega načina zdravljenja še drugih infekcij se je hitro razmahnila, čeprav so tudi drugi primeri postinfekcijske modifikacije virusno-specifične imunosti (kot po hepatitisu A ali B) , ni dobro znanih študij pri človeku, ki bi pokazale, da je možno uporabiti ta način za zdravljenje dognanih ali kroničnih virusnih infekcij.

Tukaj izum omogoča virusno-specifično imuno modifikacijo z aktivno imunizacijo po infekciji. Specifična, iz gena ovojnice HIV izpeljana, gpl60 vakcina je povečala usmerjen virusno-specifični humoralni in celični odgovor človeškega gostitelja pri 19 izmed 30 osebkov, v zgodnjem stadiju okužbe.

V tej študiji smo kvalitativno in kvantitativno merili različne odgovore protiteles na specifične HIV epitope pri naravni infekciji proti postinfekcijski imunizaciji. Na ta način smo natančno določili, z vakcino inducirano, humoralno imunogeničnost pri 70% že okuženih oseb. Na primer 20 oseb (19 dovzetnih in 1 nedovzetna) je serokonvertiralo na specifične epitope. Serokonverzija, ki je nastopila le zaradi cepljenja, se je pojavila pri 10 osebah.

Dodatno, variacije pri humoralnih odgovorih pri tem cepivu, kakor je okarakterizirano v mapi epitopa, bodo dovolile razvoj in unčinkovite analize specifičnih odgovorov protiteles, ter pripeljale do enkratnih priložnosti za določitev potencialnih imunoregulatornih mehanizmov, ne izsiljenih z naravno infekcijo.

čeprav je in vivo pomen serumskih nevtralizacijskih aktivnosti do danes neznan, pa opazovanja povečanih nevtralizacij skih serumskih aktivnosti proti različnim sevom HIV (HIB, RF, MN) pri 4 ali 5 za cepivo dovzetnih osebah namigujejo, da postinfekcijska imunizacija inducira spremembe pri funkcionalnih protitelesih. Testna vakcina inducira povečanje serumske nevtralizacijske kapacitete proti določenim HIV sevom in bo potencialna pomoč pri definiciji skupine specifičnih nevtralizacijskih epitopov.

Proliferacijski odgovor na proteine HIV ovojnice se redko pojavi pri naravni HIV infekciji. Kakorkoli, po imunizaciji z gpl60, so bili dokumentirani specifični proliferacijski odzivi T-celic pri 21 (70%) osebah. Razlog za tako razliko je neznan. Možna razlaga je, da je novi proliferacijski odziv usmerjen proti epitopu ovojnice iz vakcine (kot posledica metode za proizvodnjo vakcine ali in vivo procesiranja antigena). Alternativno lahko protein, uporabljen v proliferacijskem testu, ne stimulira proliferativnega odgovora primarnih T-celic proti homolognim ovojnicam divjega tipa naravnega virusa. Dokaz, da cepljenje spodbu44 di gostiteljev celični imunski odgovor, obstaja: izbrani za vakcino dovzetni osebki so dali HIV-IIIB tipsko-specifičen citotoksičen odgovor T-celic po dodatni imunizaciji.

Faktorji, ki so odgovorni za imunoodgovor vakcine pri s HIV okuženih osebah, še niso razjasnjeni. Celo pri zgodnji HIV infekciji osebki reagirajo podoptimalno na različna cepiva v primerjavi s ustreznimi kontrolami. Ta hipoodzivnost je v povezavi s zgodnjimi motnjami v funkcijah B in T-celic. Tukaj je bila imunoodzivnost povezana z osnovno vrednostjo CD4 celic, kar ustreza hipotezi, da je imunološko stanje gostitelja pomemben pokazatelj odzivnosti na vakcino. Imunizacijska shema, s specifičnimi intervali vrednosti T-celic, prav tako vpliva na odzivnost na vakcino: shema B (6 injiciranj) je bila najboljša. Zmanjšan odziv na vakcino pri osebkih z nižjo vrednostjo CD4 celic lahko popravimo s povečanim številom cepljenj; to kaže, da so potrebne še nadaljne modifikacije pri odmerjanju, režimu, adjuvantih ali formulacijah za povečanje imunoodzivnosti gostitelja.

Čeprav je bilo veliko skrbi zaradi varnosti gostitelja, okuženega s HIV, pri aktivni imunizaciji s HIV specifično vakcino, ni dokazov za imuno - specifično toksičnost. Kvantitativne kulture, testi verižne reakcije DNA polimeraze in testi serumskih protiteles pokažejo povečano in vivo HIV breme. Izvrsten pokazatelj HIV replikacije in vivo, upadanje nivoja CD4 celic, je bil zelo uporaben pri posebej dovzetnih osebkih. Sprememba v povprečju CD4 vrednosti je bila -0,2% za dovzetne in -7,3% za nedovzetne. Podatki kažejo, da postinfekcijski imunski odgovor ni povezan s povečanjem uničevanja CD4 celic in napeljujejo na povezavo s zmanjšano HIV replikacijo in vivo.

Rezultate cepljenja smo primerjali s podatki desetih inficiranih in nezdravljenih oseb, podobnih starosti, etničnih skupin in s podobnim osnovnim povprečjem CD4 vrednosti. Povprečje CD4 vrednosti se je zmanjšalo za 8,6% pri tej skupini, za 7,3% pri skupini po shemi A in povečalo za 0,6% pri skupini po shemi B. Ti rezultati kažejo, da je možno postinfekcijsko cepljenje z rekombinantnim proteinom HIV ovojnice, še več, rezultati so vzpodbudni z ozirom na profilaktično uporabo takih vakcin.

ZA

Claims (12)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Vakcina proti infekciji, ki jo povzroča človeški virus imunodeficience (HIV), označena s tem, da vsebuje rekombinantni protein ovojnice HIV.
2. 2. Vakcina po zahtevku 1, označena s tem, da rekombinantni protein proizvajajo celice insekta s sistemom za ekspresijo bakulovirusa.
3. 3. Vakcina po zahtevku 2, označena s tem, da se rekombinantni protein eksprimira z uporabo vektorja Ac3046, ki je bakulovirusni vektor celic insekta.
4. 4. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da rekombinantni protein predstavlja rekombinantni glikoprotein ovojnice HlV-a z molekulsko maso 160.000, rekombinantni zunanji glikoprotein ovojnice z molekulsko maso 120.000, rekombinantni transmembranski glikoprotein z molekulsko maso 41.000, ali kombinacijo teh proteinov .
5. 5. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da rekombinantni protein vsebuje približno 757 zaporednih aminokislin iz glikoproteina z molekulsko maso 160.000, pri tem je pa 40 zaporednih terminalnih aminokislin tega glikoproteina skoraj popolnoma izključenih.
6. 6. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da je molekulska masa rekombinantnega proteina približno 145.000.
7. 7.

   Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtev4Ί kov, označena s tem, da rekombinantni protein aglomerira in tvori delce, katerih molekulska masa je najmanj približno 2.000.000.
8. 8. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da je rekombinantni protein kombiniran z nekim adjuvantom.
9. 9. Vakcina po zahtevku 8, označena s tem, da se uporablja adjuvant na bazi galunovca.
10. 10. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da se proizvaja v obliki posameznih odmerkov, ki vsebujejo od približno 10 do približno 4000 ug rekombinantnega proteina.
11. 11. Vakcina po zahtevku 10, označena s tem, da posamezen odmerek vsebuje od približno 40 do približno 1280 ug rekombinantnega proteina.
12. 12. Vakcina po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da se uporablja za preprečitev in/ali zdravljenje infekcije, ki jo povzroča človeški virus imunodeficience (HIV).