SI24570A - Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba - Google Patents
Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba Download PDFInfo
- Publication number
- SI24570A SI24570A SI201300443A SI201300443A SI24570A SI 24570 A SI24570 A SI 24570A SI 201300443 A SI201300443 A SI 201300443A SI 201300443 A SI201300443 A SI 201300443A SI 24570 A SI24570 A SI 24570A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- strain
- strains
- lactobacillus
- glucose
- lactose
- Prior art date
Links
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title claims abstract description 36
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 36
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 36
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 20
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims description 46
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims description 44
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims description 44
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 38
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 37
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 32
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 32
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 claims description 26
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 25
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 25
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 22
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 19
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 14
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 14
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 8
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 8
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 8
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 7
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 claims description 7
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 5
- 229960002615 dalfopristin Drugs 0.000 claims description 4
- 108700028430 dalfopristin Proteins 0.000 claims description 4
- SUYRLXYYZQTJHF-VMBLUXKRSA-N dalfopristin Chemical compound O=C([C@@H]1N(C2=O)CC[C@H]1S(=O)(=O)CCN(CC)CC)O[C@H](C(C)C)[C@H](C)\C=C\C(=O)NC\C=C\C(\C)=C\[C@@H](O)CC(=O)CC1=NC2=CO1 SUYRLXYYZQTJHF-VMBLUXKRSA-N 0.000 claims description 4
- 206010016766 flatulence Diseases 0.000 claims description 4
- WTHRRGMBUAHGNI-LCYNINFDSA-N quinupristin Chemical compound N([C@@H]1C(=O)N[C@@H](C(N2CCC[C@H]2C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC(=CC=2)N(C)C)C(=O)N2C[C@@H](CS[C@H]3C4CCN(CC4)C3)C(=O)C[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@@H]1C)C=1C=CC=CC=1)=O)CC)C(=O)C1=NC=CC=C1O WTHRRGMBUAHGNI-LCYNINFDSA-N 0.000 claims description 4
- 206010072104 Fructose intolerance Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019878 Hereditary fructose intolerance Diseases 0.000 claims description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 3
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 abstract 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 26
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 21
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 21
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 15
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 13
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 208000024330 bloating Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 4
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 4
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 4
- 241000186612 Lactobacillus sakei Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 3
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 3
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 3
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 3
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 3
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 2
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 2
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 2
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 2
- PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(3s,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-ZPYZYFCMSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 206010000087 Abdominal pain upper Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000483634 Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 1
- 241000218587 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Species 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 241000535428 Lactobacillus reuteri DSM 20016 Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000016127 added sugars Nutrition 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000008993 bowel inflammation Effects 0.000 description 1
- 235000015155 buttermilk Nutrition 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000021257 carbohydrate digestion Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021105 fermented cheese Nutrition 0.000 description 1
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 229960005442 quinupristin Drugs 0.000 description 1
- 108700028429 quinupristin Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 235000021404 traditional food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/169—Plantarum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
- A61K2035/115—Probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
- C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
Ta izum predstavlja nove seve iz rodu Lactobacillus, ki se lahko uporabljajo za izdelavo farmacevtskih proizvodov s probiotičnimi lastnostmi za uporabo v humani ali veterinarski medicini. Sevi tega izuma imajo metabolične funkcije in so posebej primerni za zdravljenje motenj, povezanih z laktozno malabsorpcijo in intoleranco, fruktozno malabsorpcijo in intoleranco ter napenjanjem.
Description
Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba
Tehnično področje
Predloženi izum se nanaša na področja medicine, mikrobiologije in prehrane, in še zlasti na nov probiotični sestavek. Izolirani so bili novi sevi rodu Lactobacillus, ki so kombinirani v formulaciji, uporabni pri zdravljenju laktozne malabsorpcije in intolerance, fruktozne malabsorpcije in intolerance ter napenjanja.
Tehnični problem
Tehnični problem, ki ga rešuje predlagani izum, je uporaba novih sevov rodu Lactobacillus za zdravljenje laktozne malabsorpcije in intolerance, fruktozne malabsorpcije in intolerance ter napenjanja. Sevi po tem izumu porabljajo fruktozo, laktozo in rafinozo, pri tem pa ne proizvajajo plina. Poleg tega so mutanti enega od sevov tega izuma odporni na 2-deoksiglukozo in sposobni porabljati fruktozo, laktozo in rafinozo ob prisotnosti glukoze, ko je v gojišču prisotnih več sladkorjev.
Stanje tehnike
Mlečnokislinske bakterije so Gram pozitivne, nesporogene bakterije, tolerantne na kisel pH s fakultativno anaerobnimi lastnostmi. So heterogena skupina bakterij, ki so naravno prisotne v s hranili bogatih okoljih. Njihova učinkovita uporaba hranil in proizvajanje mlečne kisline med rastjo sta pomembni selektivni prednosti. Mnoge vrste se uporabljajo za proizvodnjo in konzerviranje fermentirane krme in hrane, vendar so tudi pogoste med bakterijsko populacijo prebavil ljudi in živali. Med mlečnokislinskimi bakterijami je rod Lactobacillus največji in obsega več kot 190 vrst, čeprav število novo odkritih vrst še vedno narašča. Pojavljajo se v obliki paličastih ali okroglih bakterij, ki imajo v genomu delež gvaninskih in citozinskih prostankov običajno pod 50 %. Na splošno so najbolj kislinsko tolerantni mikroorganizmi med mlečnokislinskimi bakterijami in so zato terminatorji spontanih mlečnokislinskih fermentacij, kot sta silaža ali rastlinska fermentacija. Glede na presnovo jih lahko razdelimo v tri skupine. Prva skupina so obligatno homofermentativni laktobacili, ki proizvajajo mlečno kislino kot primarni stranski produkt fermentacije ogljikovih hidratov. Ti ne morejo fermentirati pentoze in glukonata in ne proizvajajo CO2. Druga skupina so fakultativno heterofermentativni laktobacili, ki ne proizvajajo CO2 iz glukoze, saj uporabljajo isto presnovno pot kot homofermentativni laktobacili, vendar pa lahko proizvajajo CO2 iz glukonata. So edina skupina, ki lahko fermentirajo pentozo v mlečno in ocetno kislino. Tretja skupina so obligatno heterofermentativni laktobacili, ki proizvajajo CO2 pri fermentaciji glukoze in glukonata, ne morejo pa fermentirati pentoze. Prav tako pri fermentaciji glukoze proizvajajo mlečno kislino, pa tudi druge produkte, kot so ocetna kislina, etanol in ogljikov dioksid. Lactobacillus plantarum je bil eden prvih, ki je bil taksonomsko opisan v rodu in spada v skupino fakultativnih heterofermentativnih predstavnikov rodu Lactobacillus. Vrsto pogosto najdemo v rastlinskih materialih, pa tudi v mlečnih izdelkih, debelem črevesu, odplakah in mnogih drugih okoljih. Ta fleksibilnost tudi pomeni, da je vrsta gensko in fenotipsko heterogena z enim od največjih genomov v skupini mlečnokislinskih bakterij. Najrazličnejši sevi Lactobacillus imajo dolgo zgodovino očitno vame uporabe. Zato ima celotna taksonomska enota Lactobacillus GRAS (generally recognised as safe - splošno priznane kot vame) ali QPS (qualified presumption of safety - domnevno vame) status, zaradi česar se sevi Lactobacillus lahko uporabljajo v prehranski industriji in femientaciji krme ter zaradi pozitivnega učinka na prebavni sistem tudi kot probiotiki. Probiotiki so opredeljeni kot živi mikroorganizmi, ki, če jih uporabimo v ustreznih količinah, prinašajo ugoden vpliv na gostitelja. Nekateri od teh ugodnih učinkov so uravnavanje črevesne mikrobiote, stimulacija imunskega sistema, zmanjšanje tveganja za nekatere bolezni in zmanjšanje simptomov laktozne intolerance in drugih malabsorpcij. Zaželeno je, da ima probiotik sposobnost vezave na črevesni epitelij, in je zaradi tega lahko prisoten v črevesu daljše časovno obdobje. Veliko prehranskih sladkorjev se ne absorbira učinkovito iz človeškega črevesa v
krvni obtok. Neabsorbirani sladkorji se nato razgradijo v debelem črevesu, kar vodi do proizvodnje velikih količin plinov, ki lahko povzročijo simptome: bolečino, napihnjenost, napenjanje in drisko. V primeru številnih rastlinskih oligosaharidov (npr. rafinoza) je to posledica naravne nezmožnosti človeškega prebavnega sistema za prebavo teh sladkorjev. Oligosaharidi so sestavljeni iz 3 do 10 monosaharidov, povezanih z alfa-galaktozidno vezjo in so pogosto vezani na beljakovine ali lipide. Bakterije lahko prebavijo te oligosaharide, ker imajo encim alfa- galaktozidazo, ki razgradi polisaharide v monosaharide. Manjše enote se lahko absorbirajo v človeškem prebavnem traktu. Po drugi strani pa je malabsorpcija definirana kot pomanjkljiva ali neustrezna absorpcija hranil iz prebavnega trakta. Incidenca za malabsorpcijo fruktoze je v Evropi 30 do 40 % in je črevesna nepravilnost, pri kateri imajo enterociti tankega črevesa okvarjene prenašalce fruktoze. Rezultat je povečana koncentracija fruktoze v celotnem črevesu, ki vodi k povečanju osmotskega tlaka in zmanjšani absorpciji vode. Črevesne bakterije prebavijo fruktozo v vodik, ogljikov dioksid in metan. Nenormalen porast vodika je mogoče zaznati z vodikovim dihalnim testom. Simptomi za fruktozno malabsorpcijo so napihnjenost, bolečine v trebuhu, krči, napenjanje in driska. Simptomi laktozne intolerance (laktozne malobsorbcije) so enaki kot pri fruktozni malabsorpciji, zato je tudi postopek za odkrivanje enak. Laktozna intoleranca je nesposobnost prebave laktoze zaradi nezadostne količine črevesne laktaze v odrasli dobi. Ta je redko absolutna in se lahko razlikuje med posamezniki. Neprebavljena laktoza potuje v debelo črevo, kjer jo prebavijo bakterije debelega črevesa, ki pri tem proizvajajo plin - glavni razlog za napenjanje in bolečine v želodcu.
EP0554418 razkriva sev Lactobacillus plantarum 299v, ki ima sposobnost kolonizacije in naselitve črevesne sluznice, kar dokazuje uporabnost L. plantarum kot sestavni del probiotičnih pripravkov.
WO2011/092261 razkriva več sevov Lactobacillus, vključno z Lactobacillus plantarum CECT 7485 in CECT 7484, ki sta učinkovita pri zdravljenju vnetja črevesa, npr. za zdravljenje simptomov običajno značilnih za vnetne črevesne bolezni • · · ·
(inflammatory bowel disease - IBD) in sindrom razdražljivega črevesa (irritable bowel syndrome - IBS). Ti sevi imajo tudi druge koristne lastnosti, zaradi katerih so primerni za uporabo v probiotičnih pripravkih, kot so neodpornost na antibiotike, odpornost na pogoje v gastrointestinalnem okolju in vezava na črevesni epitelij.
EP1268808 razkriva sev Lactobacillus casei z okvarjeno regulacijo ogljikovega katabolizma, ki se uporablja za fermentacijo hrane in krme. Ta sev je odporen na 2dezoksiglukozo, ki mu omogoča, da lahko hkrati porablja različne vire ogljika.
EPI 374878 razkriva metodo za preprečevanje ali lajšanje simptomov malabsorpcije z uživanjem prehranskega dopolnila, ki vsebuje bakterijske celice. Prehransko dopolnilo vsebuje vsaj 106 metabolno aktivnih celic rodu Propionibacterium, vsaj 0,5 g prebiotika in/ali vsaj 106 metabolno aktivnih homofermentativnih celic rodu Lactobacillus in/ali vsaj 106 metabolno aktivnih celic rodu Bifidobacterium.
V raziskavi Rampengan et al (Southeast Asian J Trop Med Pub Health, 2010, 41: 474 - 481) so opazili podobno učinkovitost živih ali mrtvih probiotikov pri otrocih z laktozno intoleranco. Ko so uživali probiotike dva tedna, se je vodik v izdihanem zraku zmanjšal.
V drugi raziskavi, ki so jo izvedli Di Stefano et al (J Ciin Gastroenterol., 2004, 38 Suppl: S102-103), so proučevali vpliv probiotika Lactobacillus rhamnosus LGG na funkcionalno napihnjen trebuh. LGG se je pokazal kot bolj učinkovit od placeba pri zmanjševanju resnosti simptomov.
V raziskavi Nobaek et al (Am J Gastroenterol. 2000, 95: 1231-1238) so primerjali bolnike s sindromom razdražljivega črevesa, pri čemer je ena skupina štiri tedne prejemala Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843, druga pa placebo. Vetrovi so se hitro in signifikantno zmanjšali v testni skupini, kije prejemala probiotični sev. Po 12
mesečnem obdobju spremljanja je testna skupina ohranila boljšo splošno prebavno funkcijo kot bolniki kontrolne skupine.
Nadalje WO2011/095339 razkriva sestavek za lajšanje simptomov laktozne intolerance, ki vsebuje encim laktazo in seve rodu Lactobacillus, ki vsebujejo laktazo. Še v enem primeru, W02008/001676 razkriva mlečnokislinske bakterije, ki so sposobne omiliti laktozno intoleranco. Izbrane bakterije so imele izboljšano lastnost pritrjevanja na enterocite in izboljšano encimsko aktivnost razgradnje laktoze od drugih mlečnokislinskih bakterij, ki spadajo v rod Lactobacillus.
Vendar pa sev iz rodu Lactobacillus, ki lahko hitro porablja ogljikove hidrate - kot so fruktoza, laktoza in rafinoza in so najpogosteje odgovorni za napenjanje - in pri tem ne proizvaja plina ter je primeren za pripravo probiotičnih sestavkov, doslej še ni bil opisan. Izkoriščanje teh presnovnih zmogljivosti sevov Lactobacillus (npr. poraba izbranih sestavin živil in njihova pretvorba v biomaso ali končne produkte, ki nimajo zdravju škodljivih lastnosti), zaradi katerih imajo zdravju koristne lastnosti, doslej še ni bilo predlagano. Tako trenutno uporabljeni probiotični pripravki in sevi, ko prispejo v črevesje, ne zmanjšujejo simptomov laktozne intolerance ali fruktozne malabsorpcije ali napihnjenosti na način, da bi porabljali fruktozo, laktozo in rafinozo in bi jih pretvorili v neplinaste metabolite.
Povzetek izuma
Ta izum predstavlja seve Lactobacillus, ki v prisotnosti bodisi fruktoze, laktoze ali rafinoze, ki predstavljajo nadomestek za enako maso glukoze v standardnem MRS mediju, rastejo z vsaj 0,7-kratnikom hitrosti rasti, ki jo dosežejo, če je v mediju prisotna glukoza.
• ·
........ ··· ’
Poleg tega sevi tega izuma rastejo v MRS mediju, ki vsebuje 25% peptona in kvasnega ekstrakta, s hitrostjo rasti, kije vsaj 0,7-kratnik hitrosti rasti, ki jo dosežejo v standardnem MRS mediju.
Poleg tega pri gojenju seva v MRS mediju ne pride do proizvodnje plina.
V nadaljnjem vidiku predloženega izuma, sevi Lactobacillus ne rastejo v prisotnosti antibiotikov ampicilina (več kot 4 mg/1), gentamicina (več kot 32 mg/1), kanamicina (več kot 64 mg/1), streptomicina (več kot 64 mg/1), eritromicina (več kot 1 mg/1), klindamicina (več kot 1 mg/1), tetraciklina (več kot 32 mg/1), kloramfenikola (več kot 8 mg/1) ali kinupristina + dalfopristina (več kot 4 mg/1) na agar ploščah, ki vsebujejo 90 % Mueller Hinton agarja (0,2 % govejega ekstrakta, 1,75 % kislinskega pripravka kazeina, 0,15 % škroba, 1,7% agarja) in 10 % MRS agarja s pH = 6,7.
Ta izum se nanaša predvsem na nov sev Lactobacillus, ki je bil 17. oktobra 2013 shranjen v skladu z Budimpeškim sporazumom v zbirko mikroorganizmov pri Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany, pod številko depozita DSM 27870. To je Lactobacillus plantarum DSM 27870, v nadaljevanju imenovan tudi KR6 in Lactobacillus plantarum KR6.
Ta izum se nanaša tudi na potomce seva Lactobacillus plantarum DSM 27870, pridobljene z metodami klasične selekcije, po možnosti ob pomoči mutageneze, ali metodami metabolnega inženiringa.
V eni izvedbi imajo sevi pričujočega izuma dodatno značilnost, in sicer so odporni na 2-deoksiglukozo. Ti sevi so zlasti koristni, ker nimajo katabolne represije z glukozo, zato porabljajo velike količine laktoze, fruktoze ali rafmoze iz gojišča, v katerem je prisotna tudi glukoza.
V tem primeru se ta izum nanaša na potomce Lactobacillus plantarum DSM 27870, ki jih je mogoče dobiti s postopki klasične mutageneze in selekcije ali z metodami genskega inženiringa. Še posebej, ta izum se nanaša na sev Lactobacillus, ki je bil 30. oktobra 2013 shranjen v skladu z Budimpeškim sporazumom v zbirko mikroorganizmov pri Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany, pod številko depozita DSM 26329. To je Lactobacillus plantarum DSM 26329, v nadaljevanju imenovan tudi MP2026 in Lactobacillus plantarum MP2026.
V enem vidiku se izum nanaša na sestavek, ki vsebuje vsaj enega od navedenih sevov ali njihovih analogov ali njihovih funkcionalno enakovrednih sevov, in po potrebi druge sestavine ali dodatke. Poleg tega se lahko sestavek uporablja za pripravo farmacevtskega proizvoda za humano ali veterinarsko uporabo, prednostno za zdravljenje laktozne intolerance in malabsorpcije, fruktozne intolerance in mal absorpcij e ter napenjanja.
Farmacevtski proizvodi vsebujejo učinkovito količino sestavka, skupaj z ustreznimi količinami farmacevtskih ali veterinarsko sprejemljivih pomožnih snovi. V zvezi s tem se lahko farmacevtski proizvod pripravi v katerikoli primerni obliki, ki nima negativnega vpliva na biološko razpoložljivost sevov v sestavku izuma. Tako lahko sestavek izuma formuliramo za oralno uporabo, na primer v obliki liofiliziranega prahu, kapsul, tekoči pripravki, itd. Izbiro pomožnih snovi in najprimernejših metod za formulacijo lahko izvede strokovnjak s tega področju, pri čemer je potrebno upoštevati namen sestavka. Zaželena je peroralna uporaba sestavka, vendar pa je lahko uporaba tudi rektalna, topična, enteralna ali kot injekcija.
Koristne lastnosti farmacevtskih sestavkov, ki vsebujejo vsaj enega od navedenih sevov, se lahko z dodajanjem drugih probiotičnih sevov še povečajo.
Mnogi probiotiki se uporabljajo za proizvodnjo hrane ali krme, zato je nadaljnji pomemben vidik tega izuma zagotavljanje takšne sestave človeške hrane ali živalske krme, ki vsebuje vsaj enega od navedenih sevov ali njihovih analogov ali njihovih funkcionalno ekvivalentnih sevov.
Pri pripravi takšne hrane ah krme proizvajalci običajno uporabljajo tako imenovane starter kulture, pri čemer se kulture uporabljajo za obdelavo hrane in krme. Starter kulture se pogosto uporabljajo v mlekarski industriji. Značilno je, da starter kulture dajo posebne lastnosti različni hrani ah krmi. Tako je nadaljnji aspekt predloženega izuma sestavek starter kulture, ki vsebuje vsaj enega od navedenih sevov ah njihovih analogov ah njihovih funkcionalno ekvivalentnih sevov, prednostno vsebuje sestavek starter kulture žive celice s koncentracijo v območju od 104 do 1014 CFU na gram pripravka.
Opis izuma
Sevi rodu Lactobacillus se enostavno izolirajo iz različnih virov, kot so živalsko črevesje, koža ah blato, tradicionalna živila rastlinskega ah živalskega izvora, itd. Običajno so presnovne poti izoliranih sevov optimizirane na učinkovito porabo virov ogljika, prisotnih v njihovem okolju. Presenetljivo, iz kisle repe smo izolirali sev Lactobacillus, ki je sposoben porabljati sladkorje iz različnih virov, na primer fruktozo iz sadja, laktozo iz mleka in rafinozo iz zelenjave, in sicer vse zelo učinkovito. Ta izum se torej nanaša na nove seve Lactobacillus, ki imajo sposobnost porabljati fruktozo, laktozo in rafinozo enako hitro, kot porabljajo glukozo, pri čemer poraba omenjenih sladkorjev ne vodi do proizvajanja večjih količin plina.
Postopek izolacije omenjenih sevov Lactobacillus je bil izveden na naslednji način: tekočina iz kisle repe je bila večkrat zaporedoma razredčena in nalita na MRS agamo ploščo. Posamezna kolonija je bila pridobljena, gojena v tekočem MRS mediju in nato kultura shranjena v 30 % glicerolu (glej Primer 1 in Primer 2). Kulture novo izoliranih sevov kot tudi nekateri komercialno razpoložljivi probiotični sevi so bili z uporabo
Durhamovih cevk testirani na proizvajanje plina med gojenjem v tekočem MRS mediju (glej Primer 3).
Kulture, za katere je bilo ugotovljeno, da ne proizvajajo velikih količin plina, so bile nadalje gojene v MRS mediju z 2% glukoze, kot tudi v različicah MRS medijev, v katerih je bila glukoza nadomeščena z 2 % fruktoze, laktoze ali rafinoze in v različici medija, kjer je bila namesto glukoze dodana voda (glej Primer 4). Gojenje je bilo izvedeno v plošči s 96 vdolbinami pri 37° C pod mikroaerobnimi pogoji, optična gostota kulture pa je bila izmerjena s spektrofotometrom pri valovni dolžini 600 nm (OD600). Kulture, pri katerih je bilo povečanje OD600 v prisotnosti fruktoze, laktoze ali rafinoze primerljivo s povečanjem v prisotnosti glukoze, so bile izbrane za nadaljnje testiranje. Za primemo hitrost rasti smo smatrali, če je bila hitrost rasti ob prisotnosti fruktoze, laktoze in rafinoze vsaj 0,7-kratnik glede na hitrost rasti ob prisotnosti glukoze (Preglednica 1). Dodatno so bili sevi tudi gojeni v spremenjenem MRS mediju s 25 % dušikom (0,25 % peptona, 0,125 % kvasnega ekstrakta, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na-acetata, 0,2 % (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 · 7H2O, 0,005 % MnSO4 · H2O, 2 % glukoze, pH = 6,4). Prav tako je veljalo za ustrezno, če je hitrost rasti preučevanih sevov v mediju z minimalnim dušikom bila vsaj 0,7-kratnik hitrosti rasti v prvotnem MRS mediju, ker je znano, da je lahko koncentracija dušika v črevesu zelo nizka. Pomembno je, da je bil sev Lactobacillus plantarum KR6 DSM 27870 (takrat imenovan KR6) prepoznan kot eden od sevov z optimalno hitrostjo rasti na fruktozi (88% rasti na glukozi), laktozi (85 % rasti na glukozi) in rafinozi (77% rasti na glukozi), kot tudi pri nizki koncentraciji dušika (83,7 % hitrosti rasti v normalnem MRS). V nasprotju s tem je komercialno dostopen sev Lactobacillus plantarum 299v (EP0554418) pokazal majhno hitrost rasti na rafinozi (21% rasti na glukozi). Podobno je Lactobacillus plantarum B-4496 pokazal neoptimalno hitrost rasti na laktozi (v povprečju 55 % rasti na glukozi). Hitrosti rasti nekaterih že znanih in na novo izoliranih sevov v različnih medijih so predstavljene v Preglednici 1. Iz preglednice razberemo, da večina sevov ne raste vsaj na enem od testiranih sladkorjev. Med sevi, predstavljenimi v Preglednici 1, Lactobacillus plantarum KR6 kaže optimalno rast na fruktozi, laktozi in rafinozi, hkrati pa ima tudi druge ustrezne lastnosti probiotičnih sevov, ki so opisane v nadaljevanju.
V naslednjem koraku smo testirali kulture na preživetje v pogojih, ki spominjajo na prehod skozi človeški prebavni trakt (glej Primer 5). To je pomembna lastnost, v kolikor nameravamo uporabiti sev Lactobacillus kot probiotik. Sev Lactobacillus plantarum DSM 27870 (takrat imenovan KR6) je pokazal zadostno odpornost na razmere v človeškem prebavnem traktu.
Pomembno je, da sevi, ki se smejo kot probiotiki uporabljati za prehrano ljudi, nimajo genov za odpornost na antibiotike. Zato so bili v naslednji stopnji sevi, ki kažejo pozitivne lastnosti glede porabe sladkorjev, testirani na odpornost na izbrane antibiotike: ampicilin, gentamicin, kanamicin, streptomicin, eritromicin, klindamicin, tetraciklin, kloramfenikol in kinupristin + dalfopristin (glej Primer 6). Za sev Lactobacillus plantarum DSM 27870 (takrat imenovan KR6), je bilo ugotovljeno, da ni odporen na nobenega od omenjenih antibiotikov.
Za nadaljnjo karakterizacijo seva, imenovanega KR6, smo izolirali DNA genom (glej Primer 8) in analizirali zaporedje genoma po metodi 454 pyrosequencing. Na osnovi genskega zaporedja za 16S RNA je bil sev KR6 razvrščen v vrsto Lactobacillus plantarum (Primer 9).
Značilnost večine mikrobnih sevov je, da bodo v prisotnosti več hranil porabili skoraj izključno najprej tisto hranilo, ki jim je najljubše. Šele ko je najljubše hranilo porabljeno, bo kultura začela porabljati druga hranila. Najpogostejše najljubše hranilo mikroorganizmov je glukoza, kar velja tudi za Lactobacillus plantarum DSM 27870. Da bi izboljšali lastnosti Lactobacillus plantarum DSM 27870, smo v nadaljevanju želeli z mutiranjem sevov doseči, da le-ti ne bi prednostno porabljali glukoze, temveč bi v prisotnosti glukoze porabljali tudi fruktozo, laktozo in rafinozo. Zato smo v nadaljevanju pridobili mutirane seve, ki so bili odporni na 2-deoksiglukozo ter preverili, ali na 2-deoksiglukozo odporni mutanti porabljajo fruktozo, laktozo in rafinozo v MRS mediju, v katerem je poleg glukoze prisoten še eden izmed omenjenih treh sladkorjev (glej Primer 7). Sevi, ki so porabljali fruktozo, laktozo in rafinozo v MRS mediju, v katerem je bila prisotna tudi glukoza, so bili prepoznani, da imajo deregulirano katabolno represijo ogljika. Med temi mutanti je bil izbran sev Lactobacillus plantarum DSM 26329.
Jasno je, da lahko strokovnjak na tem področju z uporabo deponiranih sevov kot izhodnim materialom in uporabo konvencionalne mutageneze ali tehnike ponovne izolacije pridobi nadaljnje mutante ali njihove derivate, ki imajo enake ali izboljšane opisane relevantne lastnosti ali prednosti kot seva Lactobacillus plantarum DSM 27870 in Lactobacillus plantarum DSM 26329. Strokovnjak s tega področja bo tudi znal izbrati metode, podobne tistim v primerih opisanih spodaj, za določanje metabolnega potenciala mutiranih sevov in njihove primernosti za uporabo v pripravkih za probiotično uporabo.
Ko seve tega izuma ali sestavke, ki vsebujejo te seve ali proizvode, ki vsebujejo te seve, zaužijejo ljudje ali živali, ki se počutijo nelagodno ali imajo bolečine, ko zaužijejo hrano, ki vsebuje laktozo, fruktozo ali rafinozo, bodo neabsorbirane sladkorje delno porabili omenjeni sevi.
Iz zgoraj navedenega je razvidno, da se lahko seve tega izuma koristno uporabi pri pripravi sestavka, ki se lahko nadalje uporablja za pripravo farmacevtskih in veterinarskih proizvodov za zdravljenje laktozne intolerance in malabsorpcije, fruktozne intolerance in malabsorpcije in napenjanja.
Sestavek vsebuje učinkovito količino vsaj enega izmed sevov izuma ali njegovih analogov ali funkcionalno enakovrednih sevov, in po potrebi tudi druge sestavine in dodatke. Ta sestavek lahko uporabimo za pripravo farmacevtskih proizvodov za humano ali veterinarsko uporabo ali za pripravo hrane ali krme.
Farmacevtski proizvodi vsebujejo učinkovito količino sestavka, skupaj z ustreznimi količinami farmacevtskih ali veterinarsko sprejemljivih pomožnih snovi. V zvezi s tem se lahko farmacevtski proizvod pripravi v katerikoli primerni obliki, ki nima negativnega vpliva na biološko razpoložljivost sevov v sestavku izuma. Tako lahko sestavek izuma pripravimo za oralno uporabo, na primer v obliki liofiliziranega prahu, kapsul, tekočega pripravka, itd. Izbiro pomožne snovi in najprimernejših metod za formulacijo lahko izvede strokovnjak s tega področju, pri čemer je potrebno upoštevati namen sestavka. Zaželena je peroralna uporaba, vendar pa je lahko uporaba tudi rektalna, topična, enteralna ali kot injekcija.
Koristne lastnosti sestavkov, ki vsebujejo vsaj enega od navedenih sevov, se lahko z dodajanjem drugih probiotičnih sevov še povečajo.
Mnogi probiotiki se uporabljajo za proizvodnjo hrane ali krme, zato je nadaljnji pomemben vidik tega izuma zagotavljanje takšne sestave človeške hrane ali živalske krme, ki vsebuje vsaj enega od navedenih sevov ali njihovih analogov ali njihovih funkcionalno ekvivalentnih sevov. Prednostno lahko seve izuma ali sestavek izuma uporabljamo kot dodatek k običajni prehrani ali kot sestavino hranilno popolne človeške hrane ali živalske krme. Dozirna oblika je lahko tekoča ali trdna. V zadnjem primeru je lahko proizvod uprašen in v tabletah, granulah ali kapsulah ali preprosto zmešan z drugimi prehranskimi sestavinami, da dobimo funkcionalno živilo.
Sestavek človeške hrane ali živalske krme ali odmerek mora vsebovati vsaj enega izmed sevov tega izuma ali njihove analoge ali njihove funkcionalno enakovredne seve, kot je opisano zgoraj, tako da je količina vsakega od sevov, ki je na voljo za posameznika, okoli 1O3-1O14 CFU na dan, bolje 106-1013 CFU na dan, vključno 1081012 CFU na dan ali celo 109-10H CFU na dan. Ta količina je odvisna od posameznikove telesne teže in je prednostno okoli 109-1012 CFU / dan za ljudi in 1071O10 CFU / dan za živali. Razume se, daje količina odmerka za vsakega posameznega bolnika odvisna od številnih dejavnikov, vključno z aktivnostjo uporabljene specifične • · učinkovine, starostjo, telesno težo, splošnim zdravjem, spolom, prehrano, trajanjem uporabe, načinom uporabe, stopnjo izločanja, kombinacijo zdravil in resnostjo določene bolezni, za katero se zdravi bolnik.
Mikroorganizmi so vključeni v proizvodnjo hrane in krme, vključno v večino mlečnih izdelkov. Različne bakterijske kulture, še posebej bakterijske kulture, ki so navadno razvrščene med mlečnokislinske bakterije, so bistvenega pomena pri proizvodnji vseh fermentiranih mlečnih proizvodov, sirov in masla. Kulture teh mikroorganizmov se pogosto uvršča med starter kulture, ki opravljajo številne naloge in dajejo posebne značilnosti različnim mlečnim proizvodom. Da bi starter kultura opravila svoje naloge, je bistveno, da so v starter kulturi zadostne količine živih celic. Tako je ena izmed izvedb predloženega izuma sestavek starter kulture, ki vsebuje vsaj enega od navedenih sevov ali njihovih analogov ali funkcionalno enakovrednih sevov, prednostno kjer je koncentracija živih celic v sestavku starter kulture v območju od 104 do 1014 CFU na gram sestavka.
Starter kulture se navadno uporabljajo za proizvodnjo hrane ali krme, pri čemer se sestavek starter kulture dodaja začetnemu materialu prehranskega ali krmilnega proizvoda in se s tem ohranja inokulacija izhodiščnega materiala pod pogoji, v katerih je mlečnokislinska bakterija metabolično aktivna. Prednostno, prehranski proizvod je na osnovi mleka, kot so sir, jogurt, maslo ali fermentirano mlečni proizvodi, kot sta pinjenec ali jogurt.
Kratek opis risbe
Slika 1: Graf predstavlja spremembo optične gostote (OD) v odvisnosti od časa za sev KR6 v gojiščih na osnovi MRS, ki vsebujejo različne sladkorje ali so brez sladkorja. Dobljene krivulje hitrosti rasti kažejo primerljivo rast seva KR6 v različnih medijih.
Naslednji primeri so za ilustracijo in niso namenjeni omejevanju izuma.
Primeri
Primer 1: Gojenje sevov Lactobacillus
Za namene shranjevanja in priprave tekočih kultur je bil uporabljen MRS medij (1 % peptona, 1 % govejega ekstrakta, 0,5 % kvasnega ekstrakta, 2 % glukoze, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na-acetata, 0,2% (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 7H2O, 0,005 % MnSO4 · H2O, pH = 6,4). Shranjen sev Lactobacillus (1 % v / v) smo inokulirali in gojili 14 do 18 ur pri 37° C pod mikroaerofilnimi pogoji. Kulturo smo 5 minut centrifugirali pri 3000 vrtljajev/min. Supematant smo odstranili, ostanek pa smo resuspendirali v MRS s 30 % glicerolom in shranili pri -80° C.
Primer 2: Izolacija sevov Lactobacillus iz kisle repe
Tekočina kisle repe je bila uporabljena za serijske razredčitve v sterilni fiziološki raztopini. Razredčine smo nanesli na MRS agar plošče (1 % peptona, 1 % govejega ekstrakta, 0,5 % kvasnega ekstrakta, 2 % glukoze, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na-acetata, 0,2% (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 · 7H2O, 0,005 % MnSO4 · H2O,
1,5 % agarja, pH = 6,4) in inkubirali za 48 ur pri 37° C v plastični škatli z GENbox anaer (bioMerieux). Vse bele okrogle kolonije so bile precepljene do posameznih kolonij na sveži MRS agar plošči, s posameznimi kolonijami pa je bil nato inokuliran tekoči MRS medij. Celice za hranjenje smo pridobili s centrifugiranjem in resuspenzijo v MRS s 30 % glicerolom.
Primer 3: selekcija sevov na osnovi proizvodnje plina
Z uporabo Durhamovih cevk so bili sevi v času rasti najprej preizkušeni na proizvodnjo plina. Epruvete so bile napolnjene s 7 ml MRS medija. Durhamove cevke so bile vstavljene in sterilizirane. Durhamove cevke so se med sterilizacijo napolnile z medijem. Če so bakterije proizvajale plin v času rasti, se je mehurček plina ujel v
Durhamovi cevki. Seve smo inokulirali (1 % v / v) in po 12 do 18 urah preverili, ali proizvajajo plin. Zaželeno je bilo, da sevi med rastjo ne proizvajajo plina.
Primer 4: Izbor sevov glede na porabo sladkorjev in hitrost rasti pri pogojih nizke koncentracije dušika
Različne seve smo inokulirali (1 % v/v) v 15 ml epruvetah Falcon z 10 ml MRS medija, in jih preko noči inkubirali pri 37° C pod mikroaerofilnimi pogoji. Cevke smo centrifugirali in celični pelet resuspendirali v sterilni fiziološki raztopini. Spremenjen MRS medij (1 % peptona, 0,5 % kvasnega ekstrakta, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na-acetata, 0,2% (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 · 7H2O, 0,005 % MnSO4 · H2O, pH = 6,4) smo zmešali z različnimi sladkorji (2%). Uporabili smo glukozo, rafinozo, laktozo in fruktozo, za kontrolo pa smo sladkor nadomestili s sterilno vodo. Medij je bil razdeljen po plošči s 96 vdolbinami, in sicer 190 pl v posamezno vdolbino. Vsaka vdolbina je bila inokulirana z 10 μΐ prekonočne kulture v sterilni fiziološki raztopini. Mikrotitrske plošče so bile inkubirane pri 37° C, OD 600 nm pa smo merili vsako uro. Krivulje rasti smo narisali ter primerjali krivulje rasti na posameznem sladkorju (Slika
1). Zaželena je bila dobra rast na rafinozi, laktozi in fruktozi (Preglednica 1). Vsi sevi, ki so ob prisotnosti glukoze proizvajali pline in sevi, ki so neučinkovito porabljali sladkorje, so bili izločeni iz nadaljnjih testiranj.
Da bi testirali sposobnost testiranih sevov na hitro rast pri pogojih nizke koncentracije dušika, smo dodatno gojili seve pri pogojih z nizko koncentracijo dušika. Eksperiment je bil izveden tako, kot je opisano v prejšnjem odstavku, pri čemer smo uporabili modificiran MRS medij s 25% dušikom (0,25 % peptona, 0,125 % kvasnega ekstrakta, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na-acetata, 0,2% (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 · 7H2O, 0,005 % MnSO4 · H2O, 2 % glukoze, pH = 6,4). Rezultati so predstavljeni v Preglednici 1, stolpec 6 (25 % dušika).
Preglednica 1: Hitrost rasti različnih sevov v MRS mediju brez dodatka sladkorja, z
dodatkom fruktoze, rafinoze in laktoze (izraženo kot % hitrost rasti v mediju z glukozo) in pri pogojih nizke koncentracije dušika. Proizvajanje plina v času rasti ob prisotnosti glukoze je označeno kot: + proizvajanje plina, - ni proizvajanja plina).
| Sev | Brez sladkorja (%) | Fruktoza (%) | Rafinoza (%) | Laktoza (%) | 25% dušika (%) | Proizvajanje plina med rastjo ob prisotnosti glukoze |
| Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB12 | 5,6 | 77,5 | 46,6 | 12,2 | 79,8 | |
| Bifidobacterium bifidum B-41410 | 8,1 | 93,5 | 11,7 | 56,4 | 66,3 | |
| Bifidobacterium breve B-41408 | 18,6 | 93,8 | 25,8 | 84,8 | 83,8 | |
| Bifidobacterium infantis B-41661 | 8,7 | 79,3 | 11,3 | 38,2 | 68,6 | |
| Bifidobacterium longum B-41409 | 10,1 | 89,7 | 15,4 | 27,9 | 71,3 | |
| Lactobacillus acidophilus B-4495 | 13,7 | 84,7 | 97,1 | 99,4 | 64,3 | |
| Lactobacillus acidophilus LA-5 | 26,9 | 53,9 | 49,2 | 91,5 | 35,9 | |
| Lactobacillus brevis B-3065 | 47,7 | 98,4 | 51,0 | 61,5 | 62,3 | + |
| Lactobacillus casei subsp. casei B-441 | 105 | 91,9 | 18,5 | 29,8 | 76,3 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B-548 | 9,6 | 88,8 | 14,5 | 50,2 | 69,5 | |
| Lactobacillus helveticus B-4526 | 40,8 | 82,3 | 38,4 | 74,4 | 85,8 | |
| Lactobacillus johonii B-2178 | 6,5 | 30,2 | 9,8 | 47,6 | 82,0 | |
| Lactobacillus paracasei sub. paracasei B-4560 | 17,1 | 91,3 | 23,2 | 78,9 | 84,6 | |
| Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DSM 20207 | 17,7 | 89,8 | 22,5 | 81,4 | 67,1 | |
| Lactobacillus plantarum B-4496 | 14,8 | 72,0 | 87,7 | 54,6 | 89,7 |
c ·
| Lactobacillus plantarum 299v | 16,7 | 79,2 | 21,4 | 95,5 | 86,3 | |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 19,3 | 18,4 | 88,1 | 74,9 | 28,7 | + |
| Lactobacillus reuteri Protectis | 12,8 | 16,6 | 97,8 | 105,6 | 84,1 | + |
| Lactobacillus rhamnosus B-442 | 18,8 | 92,3 | 24,3 | 80,5 | 72,1 | |
| Lactobacillus rhamnosus LGG | 9,8 | 88,0 | 12,7 | 15,9 | 54,2 | |
| Lactobacillus sakei DSM 20100 | 44,5 | 72,4 | 49,7 | 44,6 | 37,1 | |
| Lactobacillus sakei DSM 20101 | 28,9 | 91,3 | 34,7 | 41,1 | 78,3 | |
| Lactobacillus salivarius subsp. salicinius B-1950 | 10,3 | 97,5 | 106,3 | 110,8 | 15,5 | |
| KZ1 | 9,9 | 89,1 | 13,7 | 15,4 | 64,0 | - |
| KZ2 | 10,5 | 89,5 | 12,9 | 14,7 | 67,9 | - |
| KZ3 | 13,7 | 65,7 | 21,6 | 68,4 | 70,9 | - |
| KZ4 | 11,3 | 95,9 | 13,9 | 16,0 | 66,1 | - |
| KZ,5 | 7,0 | 81,4 | 9,9 | 14,5 | 56,5 | - |
| Lactobacillus casei KZ,6 | 8,5 | 87,5 | 20,6 | 18,6 | 62,1 | |
| KZ7 | 18,4 | 101,0 | 99,4 | 101,1 | 95,3 | + |
| KZ,8 | 19,3 | 102,1 | 98,5 | 100,3 | 95,6 | + |
| KZ,9 | 18,1 | 101,4 | 97,0 | 97,3 | 94,3 | + |
| KZ,10 | 16,8 | 101,5 | 97,0 | 98,2 | 95,1 | + |
| KRI | 15,8 | 72,1 | 25,4 | 74,0 | 76,4 | - |
| KR2 | 26,6 | 109,8 | 30,3 | 39,6 | 79,5 | + |
| Lactobacillus plantarum KR3 | 8 | 62 | 54 | 93 | 56,5 | |
| KR4 | 56,5 | 152,0 | 58,0 | 59,1 | 51,2 | + |
| KR5 | 20,0 | 95,3 | 20,7 | 21,3 | 71,2 | + |
| Lactobacillus plantarum KR6 | 12,0 | 88,0 | 77,0 | 85,0 | 83,7 | |
| KR7 | 14,4 | 70,7 | 17,3 | 70,2 | 70,8 | - |
| KR8 | 16,0 | 103,0 | 96,5 | 96,9 | 95,3 | + |
| KR9 | 15,7 | 101,3 | 97,2 | 97,7 | 96,1 | + |
| KR10 | 15,9 | 99,3 | 94,8 | 96,7 | 93,8 | + |
| KR11 | 18,6 | 102,6 | 98,0 | 97,8 | 94,0 | + |
| KRI 2 | 17,6 | 103,4 | 97,4 | 97,9 | 93,4 | + |
| KM1 | 13,7 | 67,9 | 18,2 | 89,7 | 76,7 | - |
| KM2 | 16,8 | 76,0 | 19,1 | 92,2 | 84,3 | - |
• ·
| KM3 | 16,6 | 92,4 | 21,4 | 90,9 | 61,1 | - |
| KM4 | 18,2 | 80,7 | 20,8 | 90,4 | 84,3 | - |
| KM5 | 16,7 | 62,2 | 21,4 | 92,6 | 84,9 | - |
| KM6 | 18,0 | 69,2 | 32,2 | 97,2 | 84,7 | - |
| KM7 | 13,0 | 62,8 | 19,6 | 98,4 | 84,9 | - |
| KM8 | 17,4 | 70,8 | 15,3 | 89,9 | 82,5 | - |
| KM9 | 12,4 | 79,2 | 6,2 | 88,5 | 50,3 | - |
| KM 10 | 13,5 | 96,7 | 6,2 | 91,9 | 54,2 | - |
| KM 11 | 21,7 | 91,9 | 15,9 | 82,1 | 57,5 | - |
| KM 12 | 14,9 | 86,0 | 14,6 | 13,7 | 79,7 | + |
Primer 5: Preživetje pri simuliranih želodčnih in črevesnih pogojih
Izvedli smo testiranje preživetja pri simuliranih želodčnih in črevesnih pogojih, da bi določili preživetje sevov pri prehodu skozi prebavni trakt. Prekonočne kulture (10 ml) smo centrifugirali (3000 vrtljaj e v/min, 3 min) in celice resuspendirali v 3 ml sterilne fiziološke raztopine. Z 1 ml te raztopine smo inokulirali 50 ml simuliranega želodčnega soka (125 mmol NaCI /1, 7 mmol KC1/1, 45 mmol/1, 3 g/1 pepsin) z različnimi pH vrednostmi (2,4, 3 ali 7). Vzorci so bili odvzeti po 0, 90 in 180 minutah po inkubaciji in serijsko razredčeni na MRS agarju. Po 3 urah smo s centrifugiranjem zbrali celice in jih resuspendirali v simulirani črevesni sok (0,1 % pankreatina, 0,3 % žolčnih soli, pH = 8). Vzorci so bili vzeti in prešteti na MRS agami plošči po 0, 90 in 180 minutah. Zaželeno je bilo dobro preživetje pri nizkem pH in v črevesnem soku.
Primer 6: Odpornost na antibiotike
Določene so bile minimalne inhibitome koncentracije (MIC) za antibiotike, kot jih zahteva EFSA (ampicilin (AM), gentamicin (GM), kanamicin (KM), streptomicin (SM), eritromicin (EM), klindamicin (CM), kloramfenikol (CL), kinupristin + dalfopristin (QDA) in tetraciklina (TC)). Najprej smo posušili agar plošče, sestavljene iz 90 % Mueller Hinton agarja (0,2 % govejega ekstrakta, 1,75 % kislinski hidrolizat kazeina, 0,15 % škroba, 1,7 % agar) in 10 % MRS agarja s pH = 6,7, ki vsebuje 25 ml medija v petrijevki (polmer 9 cm). Celice prekonočnih kultur smo zbrali s
centrifugiranjem in resuspendirali v sterilni fiziološki raztopini, da bi dosegli OD 600 nm okoli 0,3. Na vsako ploščo smo s sterilno bombažno blazinico nacepili 100 μΐ suspenzije. En E-Test® (bioMerieux) je bil nameščen na vsako ploščo. Plošče smo inkubirali 48 ur pri 37° C v anaerobnih pogojih in rezultate interpretirali v skladu z navodili proizvajalca (Preglednica 2). Vsi sevi, ki so bili odporni na vsaj en antibiotik, so bili izločeni iz nadaljnjih testiranj. Vsi rezultati so bili ponovno ovrednoteni. Sev KR6 je bil izbran za nadaljnjo mutagenezo in izboljšave.
Preglednica 2: Vrednosti minimalnih inhibitomih koncetracij (MIC) izbranih sevov. Vrednosti v krepkem tisku presegajo MIC vrednosti, ki jih določa EFSA (AM = 4 mg/1, GM = 32 mg/1, KM = 64 mg/1, SM = 64 mg/1, EM = 1 mg/1, CM = 1 mg/1, QDA = 4 mg/1, TC = 32 mg/1, CL = 8 mg/1) in se šteje, daje sev odporen. MIC za tetraciklin smo določili samo za neodporne seve.
| vrsta | sev | Antibiotik | ||||||||
| AM | GM | KM | SM | EM | CM | QDA | TC | CL | ||
| Lactobacillus plantarum | KR6 | 0,19 | 2 | 64 | 64 | 0,25 | 0,38 | 0,75 | 24 | 6 |
| Lactobacillus plantarum | B-4496 | 0,19 | 2 | 64 | 64 | 0,5 | 0,25 | 0,5 | 12 | 4 |
| Lactobacillus acidophilus | B-4495 | >256 | 1.5 | 32 | 8 | 0,047 | 2 | 0,5 | 0,5 | |
| Lactobacillus salivarius subsp. salicinius | B-1950 | 0,125 | 4 | >256 | 64 | 0,125 | 0,38 | 0,38 | 4 | |
| Lactobacillus helveticus | B-4526 | 2 | 12 | >256 | 128 | 0,19 | 0,125 | 4 | 3 | |
| Lactobacillus plantarum | KR3 | 0,19 | 1,5 | 32 | 48 | 1 | 1 | 0,75 | 10 | 6 |
| Lactobacillus sakei | DSM 20101 | 0,75 | 2 | 16 | 32 | 0,125 | 0,064 | 0,38 | 4 | |
| Lactobacillus casei | KZ6 | 0,75 | 8 | >256 | 64 | 0,064 | 0,094 | 0,75 | 2 | |
| Lactobacillus sakei | DSM 20100 | 1 | 8 | 8 | 16 | 0,19 | 0,094 | 2 | 1,5 | 3 |
Primer 7: Mutageneza in selekcija mutantov
UV mutageneza je bila izvedena na Lactobacillus plantarum KR6, da bi izboljšali preživetje v zgoraj navedenih simuliranih želodčnih in črevesnih pogojih. Prekonočno kulturo smo trikrat sprali s sterilno fiziološko raztopino. 2 ml kulture smo zmešali z 18 ml fiziološke raztopine in jo za 2 minuti izpostavili UV svetlobi (254 nm). Razdalja med svetilko in kulturo je bila 35 cm. Serijske razredčitve smo nanesli na MRS agar. Plošče smo hranili v temi in inkubirali 48 ur pri 37° C. Posamezne kolonije so bile izbrane, shranjene v 30 % glicerolom z MRS in testirane na preživetje v simuliranem želodčnem in črevesnem soku, kot je opisano zgoraj. Najboljša kolonija je bila izbrana za nadaljnjo prilagoditev {Lactobacillus plantarum MP-10).
EMS mutageneza je bila izvedena z 9% etil metansulfonatom na najboljšem mutantu kolonije pod UV izpostavitvijo (MP-10). Prekonočno kulturo smo trikrat sprali s sterilno fiziološko raztopino in razredčili, dokler ni vrednost OD 600 nm dosegla 0,2. 810 μΐ sterilnega 0,1 M fosfatnega pufra (pH 7) smo zmešali z 90 μΐ EMS in 100 ml celične kulture z ustrezno OD vrednostjo. Po 2 urah smo izvedli serijske razredčitve in jih nanesli na plošče z MRS medijem (1 % peptona, 0,5 % kvasnega ekstrakta, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K2HPO4, 0,5 % Na- acetata, 0,2 % (NH4)2 citrata, 0,02 % MgSO4 · 7H2O, 0.005 % MnSO4 · H2O, 1.5 % agarja, pH = 6,4) z 10 mM 2- deoksi-D-glukoze in 10 g/1 laktoze. Kolonije smo nanesli na enake plošče in jih shranili v MRS s 30 % glicerolom. Kolonije smo testirali na prebavo ogljikovih hidratov (Preglednica 3). Prekonočne kulture smo inokulirali v MRS tekočem mediju (5 % v/v), ki je vseboval vse štiri sladkorje (glukozo, fruktozo, rafinozo in laktozo) v koncentraciji 4 g sladkorja/1. Po 4 in 8 urah smo odvzeli vzorce, jih 30 minut segrevali pri 80° C, centrifugirali in v supematantu izmerili koncentracije sladkorjev (Preglednica 4). Prav tako so bili vsi prej omenjeni testi opravljeni na izbranih sevih. Zaželeno je bilo, da sev porablja vse sladkorje hkrati. Na osnovi tega je bil izbran sev Lactobacillus plantarum MP2026.
Preglednica 3: Hitrost rasti različnih sevov v MRS mediju brez dodanega sladkorja in z dodatkom fruktoze, rafinoze ali laktoze (izraženo kot % hitrosti rasti ob prisotnosti glukoze).
| Sev | Brez sladkorja (%) | Fruktoza (%) | Rafinoza (%) | Laktoza (%) |
| Lactobacillus plantarum KR6 | 12,0 | 88,0 | 77,0 | 85,0 |
| Lactobacillus plantarum MP-10 (izboljšano preživetje v simuliranih želodčnih pogojih) | 13,8 | 71,3 | 39,6 | 44,8 |
| Lactobacillus plantarum MP2026 | 10,5 | 98,2 | 98,0 | 92,1 |
Preglednica 4: Preostanek koncentracije fruktoze, glukoze, laktoze in rafinoze po 8 urnim gojenju sevov v MRS mediju, ki je na začetku vseboval vse štiri sladkorjev v koncentraciji 4 g sladkorja/1. Izvedena sta bila dva ločena poskusa.
| Sev | Meritev | Fruktoza | Glukoza | Laktoza | Rafinoza |
| Lactobacillus plantarum KR6 | 1. | 0 | 0 | 3,7 | 3,3 |
| 2. | 0 | 0 | 3,5 | 3,4 | |
| Lactobacillus plantarum MP10 | 1. | 0,3 | 0,4 | 4,3 | 3,7 |
| 2. | 0,1 | 0,2 | 3,5 | 3,4 | |
| Lactobacillus plantarum MP2026 | 1. | 0,3 | 1,1 | 2,2 | 1,7 |
| 2. | 0,1 | 1,3 | 3 | 3 |
Primer 8: Izolacija genoma DNA
Shranjeni sev Lactobacillus plantarum KR6 je bil uporabljen (1 % v/v) za inokulacijo 10 ml MRS medija v 15 ml epruvetah Falcon, ki smo jih preko noči (16 ur) inkubirali pri 37° C pod mikroaerofilnimi pogoji. Svež MRS medij smo inokulirali z 10% prekonočne kulture, da bi dobili celice v logaritemski fazi rasti. Kulture so rastle 5 ur pri 37° C pod mikroaerofilnimi pogoji. Celice smo izolirali s centrifugiranjem, genomsko DNA pa smo pripravili s kompletom PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen) v skladu z navodili izdelovalca kompleta, vendar z nekaj spremembami. Lizocimska inkubacija je bila podaljšana na 45 minut, vsa spiranja pa smo opravili dvakrat. DNA smo resuspendirali v 100 μΐ TE pufra.
Primer 9: Določanje vrste izolatov s sekvenciranjem fragmenta gena 16S
1. PCR z genomsko DNA, opisana v prejšnjem koraku, je bila opravljena z začetnima oligonukleotidoma Pl (5-GCGGCGTGCCTAATACATGC ) in P4 (5'-ATCTACGCATTTCACCGCTAC).
2. PCR produkt smo očistili s kompletom Wizard SV Gel in PCR Clean-Up System (Promega).
3. A-repi so bili dodani s polimerazo DreamTaq (30 ml očiščenega PCR produkta, 5 μΐ PCR pufra, 4 μΐ dNTP, 1 μΐ polimeraze DreamTaq, 72° C, 30 minut).
4. PCR produkt smo ponovno očistili tako, kot je zapisano v 2. koraku.
5. Izvedli smo ligacije (2 μΐ PCR 2.1 vektorja, 1 μΐ ligaze, 1 μΐ pufra za ligacijo, 6 μΐ očiščenega PCR produkta iz 4. koraka, čez noč na 4° C).
6. Elektroporacija je bila izvedena s kompetentnimi celicami E. coli ϋΗΙΟβ. 2 μΐ ligacijske reakcije smo dodali kompetentnim celicam, jih elektroporirali in zmešali z 1 ml 2ΤΥ medijem ter inkubirali 45 minut pri 37° C. Celice so bile ločene s centrifugiranjem (5000 vrtljaj ev/min, 3 min) in okrog 800 μΐ supematanta je bilo zavrženega. Preostanek je bil resuspendiran in nacepljen na 2ΤΥ ploščah z X-gal-om, IPTG in kanamicinom 25 mg/ml. Plošče smo inkubirali čez noč na 37° C.
7. Posamezne bele kolonije so bile izbrane iz prekonočnih kultur, ki smo jo hranili pri 37° C v tekočem 2ΤΥ mediju s 100 mg ampicilina/ml. Plazmidi so bili izolirani iz kulture, restrikcija pa je bila narejena z encimom EcoRI. Fragmenti naj bi bili dolgi približno 700 bp. 6 fragmentov vsakega seva, ki so
imeli pravo dolžino, smo poslali na sekvenciranje. Pridobljena zaporedja smo vnesli v BLAST, da se je določila vrsta. Prileganje zaporedja istega seva smo prav tako preverili. Za sev KR6 vrste Lactobacillus plantarum smo določili 99% ujemanje.
Del 16S zaporedja (634 bp) seva Lactobacillus plantarum KR6:
GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGG
TGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAAC
ACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGAT
GCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGAT
GGCTTCAGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGG
TGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGG
TAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGG
CAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACG
CCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAG
AAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCA
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG
GCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTT
TTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGG
AAACTGGGA « v /
SEZNAM SEKVENC <110> Mediš d.o.o.
<120> Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba <130> mediš 1 <160> 1 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 634 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220>
<223> 16 S rRNA gen delne sekvence <400> 1
| gcggcgtgcc | taatacatgc | aagtcgaacg | aactctggta | ttgattggtg | cttgcatcat | 60 |
| gatttacatt | tgagtgagtg | gcgaactggt | gagtaacacg | tgggaaacct | gcccagaagc | 120 |
| gggggataac | acctggaaac | agatgctaat | accgcataac | aacttggacc | gcatggtccg | 180 |
| agcttgaaag | atggcttcag | ctatcacttt | tggatggtcc | cgcggcgtat | tagctagatg | 240 |
| gtggggtaac | ggctcaccat | ggcaatgata | cgtagccgac | ctgagagggt | aatcggccac | 300 |
| attgggactg | agacacggcc | caaactccta | cgggaggcag | cagtagggaa | tcttccacaa | 360 |
| tggacgaaag | tctgatggag | caacgccgcg | tgagtgaaga | agggtttcgg | ctcgtaaaac | 420 |
| tctgttgtta | aagaagaaca | tatctgagag | taactgttca | ggtattgacg | gtatttaacc | 480 |
| agaaagccac | ggctaactac | gtgccagcag | ccgcggtaat | acgtaggtgg | caagcgttgt | 540 |
| ccggatttat | tgggcgtaaa | gcgagcgcag | gcggtttttt | aagtctgatg | tgaaagcctt | 600 |
cggctcaacc gaagaagtgc atcggaaact ggga
634
Claims (14)
1. Sev iz rodu Lactobacillus, ki v prisotnosti bodisi fruktoze, laktoze ali rafinoze, ki predstavljajo nadomestek za enako maso glukoze v standardnem MRS mediju, doseže hitrost rasti, kije vsaj 0,7-kratnik hitrosti rasti, kije dosežena, če je v mediju prisotna glukoza.
2. Sev po zahtevku 1, kjer navedeni sev lahko v MRS mediju, ki vsebuje 25 % peptona in kvasnega ekstrakta, raste z vsaj 0,7-kratnikom hitrosti rasti, ki je dosežena v standardnem MRS mediju.
3. Sev po zahtevku 1 ali zahtevku 2, pri čemer gojenje tega seva v MRS mediju ne povzroči proizvajanje plina.
4. Sev po kateremkoli od zahtevkov od 1 do 3, kjer sev Lactobacillus ne more rasti v prisotnosti naslednjih antibiotikov: ampicilin (več kot 4 mg/1), gentamicin (več kot 32 mg/1), kanamicin (več kot 64 mg/1), streptomicin (več kot 64 mg/1), eritromicin (več kot 1 mg/1), klindamicin (več kot 1 mg/1), tetraciklin (več kot 32 mg/1), kloramfenikol (več kot 8 mg/1) ali kinupristin + dalfopristin (več kot 4 mg/1) na agar ploščah, ki vsebujejo 90 % Mueller Hinton agarja (0,2 % govejega ekstrakta, 1,75 % kislinskega pripravka kazeina, 0,15 % škroba, 1,7% agarja) in 10 % MRS agarja s pH = 6,7.
5. Sev po kateremkoli od zahtevkov od 1 do 4, kjer je sev iz vrste Lactobacillus plantarum.
6. Sev po zahtevku 5, pri čemer je sev Lactobacillus plantarum, shranjen od 17. 10. 2013 pri Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraOe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany, pod številko depozita DMS 27870, njegovi analogi ali funkcionalno enakovredni sevi.
• · · ·
26 .:· ··· · : ··· '
7. Sev po zahtevku 5, pri čemer ima sev deregulirano katabolno represijo ogljika.
8. Sev po zahtevku 7, pri čemer je sev odporen na 2-dezoksiglukozo v gojišču, ki ne vsebuje glukoze.
9. Sev po zahtevku 8, pri čemer je sev Lactobacillus plantarum, shranjen od 30. 10. 2013 pri Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany, pod številko depozita DSM 26329, njegovi analogi ali funkcionalno enakovredni sevi.
10. Sestavek, ki vsebuje vsaj enega izmed sevov po katerem koli od zahtevkov od 1 do 9.
11. Farmacevtski proizvod za humano ali veterinarsko uporabo, ki vsebuje učinkovito količino sestavka po zahtevku 10.
12. Farmacevtski proizvod po zahtevku 11 za uporabo pri zdravljenju laktozne intolerance in malabsorpcije, fruktozne intolerance in malabsorpcije ter napenjanja.
13. Sestavek človeške hrane ali živalske krme, ki vsebuje vsaj enega izmed sevov po kateremkoli od zahtevkov od 1 do 9.
14. Sestavek starter kulture, ki vsebuje sev po kateremkoli od zahtevkov od 1 do 9, prednostno, kjer sestavek starter kulture vsebuje žive celice s koncentracijo v območju 104-1014 CFU na gram pripravka.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI201300443A SI24570A (sl) | 2013-12-23 | 2013-12-23 | Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba |
| EP14836985.3A EP3092320B1 (en) | 2013-12-23 | 2014-12-19 | New strains of the genus lactobacillus and use thereof |
| US15/105,876 US10098916B2 (en) | 2013-12-23 | 2014-12-19 | Strains of the genus Lactobacillus and use thereof |
| CA2934871A CA2934871A1 (en) | 2013-12-23 | 2014-12-19 | New strains of the genus lactobacillus and use thereof |
| PCT/SI2014/000079 WO2015099617A1 (en) | 2013-12-23 | 2014-12-19 | New strains of the genus lactobacillus and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI201300443A SI24570A (sl) | 2013-12-23 | 2013-12-23 | Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI24570A true SI24570A (sl) | 2015-06-30 |
Family
ID=52469889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI201300443A SI24570A (sl) | 2013-12-23 | 2013-12-23 | Novi sevi rodu Lactobacillus in njihova uporaba |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10098916B2 (sl) |
| EP (1) | EP3092320B1 (sl) |
| CA (1) | CA2934871A1 (sl) |
| SI (1) | SI24570A (sl) |
| WO (1) | WO2015099617A1 (sl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3768286A1 (en) | 2018-03-21 | 2021-01-27 | AixSwiss B.V. | Lactobacillus fermentum for treating fructose-related diseases |
| WO2020109567A1 (en) * | 2018-11-30 | 2020-06-04 | Chr. Hansen A/S | Increased bioactivity of bioprotective cultures against pathogenic bacteria |
| WO2023131670A2 (en) * | 2022-01-07 | 2023-07-13 | Novozymes A/S | Method for providing relief from fructan or fructose induced abdominal discomfort |
| KR102620909B1 (ko) * | 2022-06-15 | 2024-01-04 | 콜마비앤에이치 주식회사 | 신규 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) SKO-001 균주 및 이의 용도 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE469875C (sv) | 1991-07-25 | 1997-04-14 | Probi Ab | Stam av tarmkoloniserande Lactobacillus samt komposition för profylax eller behandling av infektioner i magtarmkanalen |
| EP1268808B1 (en) | 2000-03-31 | 2006-12-13 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Mutants of lactobacillus casei defective in carbon catabolism regulation |
| EP1374878A1 (en) | 2002-06-20 | 2004-01-02 | N.V. Nutricia | Method and composition for preventing or alleviating symptoms of malabsorption from the gastrointestinal tract |
| CN101479382B (zh) | 2006-06-26 | 2012-07-04 | 财团法人粮食研究会 | 用于改善乳糖不耐症的乳酸菌 |
| CA2774048C (en) * | 2009-11-25 | 2015-05-19 | Anitox Corporation | Fermentation of carbohydrate |
| WO2011092261A1 (en) | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Ab-Biotics S.A. | Probiotic composition for use in the treatment of bowel inflammation |
| DE102010009582A1 (de) | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Vitacare GmbH & Co. KG, 60318 | Mittel zur Anwendung bei Lactasemangel und Lactoseintoleranz |
-
2013
- 2013-12-23 SI SI201300443A patent/SI24570A/sl not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-12-19 WO PCT/SI2014/000079 patent/WO2015099617A1/en active Application Filing
- 2014-12-19 EP EP14836985.3A patent/EP3092320B1/en active Active
- 2014-12-19 CA CA2934871A patent/CA2934871A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-19 US US15/105,876 patent/US10098916B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20160375069A1 (en) | 2016-12-29 |
| US10098916B2 (en) | 2018-10-16 |
| EP3092320A1 (en) | 2016-11-16 |
| WO2015099617A1 (en) | 2015-07-02 |
| CA2934871A1 (en) | 2015-07-02 |
| EP3092320B1 (en) | 2019-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220169976A1 (en) | Probiotic bifidobacterium strain | |
| CN114317320B (zh) | 一种短双歧杆菌207-1及其应用 | |
| CN104508117B (zh) | 新的卷曲乳杆菌菌株 | |
| KR102091175B1 (ko) | 장내 항염증 및 균총 개선 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 균주 | |
| GB2418431A (en) | Metabolically active micro organisms and methods for their production | |
| WO2011141762A1 (en) | Synergistic fermentation of lactobacillus rhamnosus and lactobacillus paracasei subsp paracasei | |
| US20120207713A1 (en) | Probiotic bifidobacterium strains | |
| US10098916B2 (en) | Strains of the genus Lactobacillus and use thereof | |
| WO2021206106A1 (ja) | 腸内細菌叢改善用組成物 | |
| JP2008271931A (ja) | 新規な乳酸菌及び当該乳酸菌を使用して加工した各種製品 | |
| CN114729299A (zh) | 产生血清素的细菌 | |
| KR101453982B1 (ko) | 과민성 대장 증후군 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN117917475A (zh) | 一种调节肠道菌群的植物乳植杆菌p16及其应用、产品和方法 | |
| JP2022052715A (ja) | 腸内細菌叢改善用組成物 | |
| Lavanya et al. | Plasmid profiling and curing of Lactobacillus strains isolated from fermented milk for probiotic applications | |
| AU2021416723A1 (en) | Strains, compositions and methods of use | |
| Simova et al. | In vitro and in situ bacteriocin activity of lactic acid bacteria from Bulgarian dairy products and methods for making of Lactobacillus protective fermented milks with bacteriocin inhibitory substances | |
| CN117165497A (zh) | 一种改善便秘的植物乳植杆菌Lp18及其应用和产品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OO00 | Grant of patent |
Effective date: 20150706 |
|
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20230810 |