SE451539B - Hemjernanrikat aminosyrapreparat framstellt av hemproteiner och forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

15 20 25 451 539 h) dietsammanhang skulle således vara dess naturegenhet med oberoende av andra födokomponenter vid upptagningen i kroppen samt mindre biverkningar. En viktig förutsättning för rätt resorption av häm är emellertid, att det är bundet vid en lämpliga bärare. Järnet i häm utnyttjas säledes mycket däligt, om hämet först skiljes från protein ooh tillföres kroppen separat. Härav kan man sluta sig till att den aminosyrakedja, vid vilken hämet ursprungligen är bundet, torde ha positiv inverkan i detta avseende.

Hämoglobinmolekylen utgöres viktmässigt till övervägande del av aminosyror. I 1000 mg hämoglobin utgör aminosyrorna tillsammans cirka 960 mg och häm endast 40 mg, vilket är ekvivalent med 3,5 mg järn, dvs. endast 4 viktprooent häm resp. 0,35 viktprooent järn.

Detta innebär, att en stor mängd aminosyror automatiskt maste tillföras kroppen i förhållande till mängden järn, om hämoglobin skall användas som järnkälla. Om exempelvis dags- behovet av järn (15 mg) skulle tillföras i form av hämoglobin, skulle samtidigt 4,2 g aminosyror (7% av dagsbehovet protein) behöva konsumeras. En terapeutisk dos om 100 mg järn dagligen skulle innebära extra tillförsel av cirka 28 g aminosyror, motsvarande nära hälften av dagsbehovet protein. Sådana mäng- der aminosyror är orealistiska att tillföra utöver den mängd protein, som tillföres genom födan.

Om hämoglobin skulle användas för jârnberikning av livs- medel, skulle pa motsvarande sätt allt protein som därmed tillföres, inverka menligt pa livsmedlets tekniska egenskaper och eventuellt även pa dess näringsvärde. Det synes därför finnas ett behov av en hämjärnprodukt med följande egenskaper: - högre hämhalt (ooh därmed järnhalt) än hämoglobin - hämet bundet pa liknande sätt som i hämoglobin - goda löslighetsegenskaper för inblandning i alla typer av livsmedel och farmaoeutiska preparat Det har nu visat sig, att dessa fordringar uppfylles av ett hämjärnanrikat aminosyrapreparat, som är framställt fran hämproteiner, ooh som kännetecknas därav, att preparatets järninnehall uteslutande utgöres av det ursprungliga hämproteinets porfyrinjärn bundet i denna form (häm) vid resterande aminosyrakedjor sedan merparten av aminosyrorna i 10 15 451 539 OJ hämproteinet är avspjälkade genom enzymatisk hydrolys, varvid den efter hydrolysen uppkomna hämprodukten har egenskapen att ha bildat aggregat, vilka har större dimensioner än de enskilda, korta, hämjårninnehallande aminosyrakedjorna, och att vara separerbar fran de avspjälkade aminosyrorna genom membranteknik ooh/eller genom utfällning vid pH 4-5 och att hämprodukten är befriad frän avspjälkade aminosyror. Det ursprungliga hämproteinets porfyrinjärn är sålunda bundet vid aminosyrakedjor, som är avsevärt kortare än aminosyrakedjorna i det ursprungliga hämproteinet, varvid dessa aminosyrakedjor dock har dimensioner, vilka är större än de enskilda korta, hämjärninnehallande aminosyrakedjorna, varvid denna större dimension har uppkommit genom aggregering. Härigenom tillätes separation från aminosyrakedjor, som icke innehåller hämjärn.

Det är lämpligt att preparatet har ett konstant förhållande mellan häm och järn och har en porfyrinhämjärnhalt av lägst 0,5% och företrädesvis högst 5%, räknat som det järn som är bundet vid porfyrin.

Föreliggande förfarande för framställning av ett häm- järnanrikat aminosyrapreparat frän hämproteiner, speciellt hämoglobin, kännetecknas därav, att hämproteinet pä i och för sig känt sätt först utvinnes genom hämolys och denatureras och därefter spjälkas med hjälp av proteolytiska enzym till en hämjärnanrikad och en aminosyraanrikad fraktion samt att den hämjärnanrikade fraktionen separeras frän den aminosyraan- rikade fraktionen genom utfällning vid ett pH av 4-5 och/eller genom membranteknik, såsom ultrafiltrering, samt stabiliseras genom värmebehandling och avvattnas, företrädesvis genom torkning.

Stabiliseringen av den hämjärnanrikade fraktionen sker genom värmebehandling, varvid enzym inaktiveras. Den vanli- gaste behandlingen är pastörisering vid exempelvis 70°C under 30 minuter och/eller sterilisering vid l21°C under 5 minuter.

Pastörisering utföres företrädesvis vid 60-90°C under 30-10 minuter men kan ävenledes ske vid högre temperatur, t.ex. 90-i1ÜÜC under kortare tid. Sterilisering utföres företrädes- vis vid 11D-i21°C under 20-5 minuter och kan även ske vid högre temperatur och under motsvarande kortare tid. Det är en fackmannamässig åtgärd att bestämma lämplig temperatur och 1D 15 20 451 539 tid.

En hämoglobinmolekyl består, såsom angivits, av fyra aminosyrakedjor, var och en innehållande en hämgrupp, vars järnatom är bunden vid en av kedjans hístidingrupper. Dessa kedjor är i naturligt tillstånd hopnystade på ett komplext sätt, så att varje hämgrupp är belägen inuti den hoprullade kedjan. 8törre'delen“av de bindningar, som haller ihop kedjorna och ävenledes hämgruppen vid kedjan, är oåtkomliga för större molekyler, t.ex. sådana enzym som kan spjälka de bindningar, vilka håller ihop kedjan; bindningarna är dock åtkomliga för små molekyler, t.ex. syre, vilket transporteras i kroppen bundet vid häm. Detta naturliga tillstånd framgår av följande bild: Princip För framställning av hämjärnanrikat preparat Å a Denaturering 1/Irz___-__'S:>/ø_\\\\_'/!,/-\ ® (altan) 'x Fyra hoprullade kedjor .iärnhalt-nassa; Fyra uträtade kedjor [:] = hämgrupp (porfyrin med central järnatom Jfl.

De hoprullade kedjorna kan "upprullas" till rakare kedjor med hjälp av denaturerande medel, t.ex. urea, alkali, syra, värme, organiska lösningsmedel eller kombinationer därav. De fyra kedjorna i en hämoglobinmolekyl kommer därvid att skiljas från varandra, vilket framgår av B i den visade bilden. Varje sådan "upprullad" kedja är nu tillgänglig för angrepp av proteo- lytiskt enzym, som kan bryta bindningen mellan aminosyror i en aminosyrakedja, t.ex. i hämoglobin. Olika proteolytiska enzym kan bryta olika sådana bindningar, men resultatet blir alltid att aminosyrans längd förkortas. Proteolytiska enzym kan utvinnas ur organ från växter och djur samt ur mikroorga- nismer. Graden av nedbrytning bestämmes härvid av enzymets j? 5 451 539 natur, tiden, pH och temperatur vid enzymets inverkan samt sammansättningen hos de uppkomna reaktionsprodukterna. Detta framgår av följande bild: C Hydrolys i z ///,f" *\\\;ø áš:;:>,~\ ~\\_ø/ ^š','_ .SÉ2fXÜl..._.; Varje kedja nedbrytes av ; proteolytiskt enzym (pilar) '*\__ /-I ”kJ-g + ya Aminosyrafraktion lagmolekylär, kan ej utfällas, pas_ Hämgrupp på liten aminosyrakedja, '1ågmolekylär* šzïzzaïzfraaëe I :I ' F yyyyïïflm Flera smâ aminosyrabitar med hämgrupp slår sig samman till aggregat vilka ar olösliga vid pH 4,5 och ej heller kan passera membran Enligt föreliggande uppfinning hydrolyseras således hämprotein med hjälp av proteolytiska enzym, så att över- flödiga aminoayror kan avlägsnas, medan det naturliga hämjär- net kvarhàlles vid den aminosyra, där det ursprungligen är bundet, varvid sa manga aminosyror intill detta bindnings- LH lü 15 [vi Uï 451 539 ställe far kvarstanna, att lämpliga tekniska och fysiologiska egenskaper erhålles resp. bíbehalles hos produkten. Efter hydrolysen kan hämproteinet separeras i tva huvudfaktioner, nämligen en som innehaller huvuddelen av hämproteinets hämjärn och har en hämjärnhalt, som upp till 16 ganger överstiger det ursprungliga hämproteinets hämjärnhalt, och en annan, som innehaller huvuddelen av hämproteinets aminosyror. Den häm- järnrika fraktionen kan vid reaktionen bibringas större mole- kyldimensioner än den andra fraktionen, vilket kan utnyttjas för separation av fraktionerna.

Det är viktigt, att järnet koncentreras i den hämjärn- rika fraktionen utan tillsats av järn utifrån, eftersom järnet i hämproteinet och även i den hämjärnrika fraktionen förelig- ger i en speciell, av naturen bildad form med särskilt god resorberbarhet i människokroppen. Den erhållna fraktionen utgör genom sin höga halt av detta speciella järn en god järnkälla för livsmedelsbruk och farmaceutisk (terapeutisk) användning.

Det finns ett flertal proteiner som är uppbyggda av aminoyror och häm, här benämnda hämproteiner, av vilka märkes hämoglobin, myoglobin, cytokrom, katalas och peroxidas i de flesta celler av animalt, vegetabiliskt och mikrobiologiskt ursprung. Uppfinningen är tillämplig pa alla dessa hämpro- teiner, men hämoglobin är det enda material som synes vara av praktisk betydelse.

Vid föreliggande sönderdelning av ett hämprotein erhal- ler den resulterande blandningen Chydrolysatetl andra egen- skaper än det ursprungliga proteinet. Hydrolysatets vatten- löslighet är normalt oberoende av pH, medan utgangsproteinets vattenlöslighet vanligen är beroende av lösningens pH. Häm- gruppen själv pâverkas ej av enzymen vid föreliggande för- farande.

Genom förfarandet har hittills icke àstadkommits nagon större skillnad i molekylstorlek mellan den hämjärninnehàl~ lande och den icke-hämjärninnehallande fraktionen (D-E). Genom ett aggregeringsförfarande kan dock den hämjärninnehallande fraktionen hibringas sadana molekyldimensioner, att den lätt kan separeras från den icke-hämjärninnehàllande fraktionen.

Detta framgar av F-G. Sådan aggregering kan åstadkommas nå) 10 15 .-, f. 451 539 antingen genom justering av pH eller koncentrering. Om pH instâlles på 4,5 kommer hämjärnprodukten att bilda aggregat så, att den utfälles och lätt kan frånskiljas. Om koncentra- tionen ökas genom membranfiltrering med tätt membran, aggre- gerar hämjärnfraktíonen kontinuerligt och passerar icke genom membranet. Om pH inställes på cirka 7 före ultrafiltrering och utan att utfällning först har skett, kan porösare membran användas.

Enligt uppfinningen har man, såsom framgått, uppnått att de prcteinrester, vid vilka hämgruppen är bunden, uppnår sådan storlek att de kan utnyttjas för separation av den hämrika fraktionen (hämhaltiga produkten). Att sådan storlek uppnås hos häm plus proteinrester synes bero på, att antingen a) de hämjärnhaltiga resterna primärt har små dimensioner, men under hand slår sig samman till större aggregat på grund av hydrofoba interaktioner. Dessa aggregat kommer då att inne- hålla nästan allt hämjärn och kan avskiljas enligt följande flytschema. bl En del av proteinet lämnas väsentligen cpåverkat vid den enzymatiska hydrolysen. Dessa proteinkedjor "tar hand om" hämgruppen, som under fortskridande hydrolys av andra pro- teinkedjor icke längre kan bindas vid de mindre aggregaten.

Härvid skulle superhämprotein bildas, dvs. hämprotein med mer än en hämgrupp per amincsyrakedja, på grund av hydrofob interaktion.

Följande försök har utförts i syfte att avgöra vilken av mekanismerna a) och bl som är troligast: 250 mg obehandlat hämcglobin och en hämjärnprodukt fram- ställd enligt A i exempel 1 löstes å ena sidan i 25 ml 10 M tris-buffert med pH 8,0, och å andra sidan i 25 ml av samma buffert innehållande 2% natriumlaurylsulfat (NLS). Alla lös- ningarna var starkt färgade och överfördes till dialysslangar ooh dialyserades mot lösningsmedlet (identiskt samma inuti och utanför slangen). Dialysslangen hindrar proteiner från att passera genom slangen (till ytterlösningen), men tillåter passage av mindre molekyler, t.ex. hämpeptider. NLS har för- måga att bryta hydrofob interaktion och sönderdelar därmed stora molekylaggregat till enskilda molekyler. Under dialysen var det endast i det system, där hämjärnprodukten var upplöst f-J LH 10 15 451 559 ooh dialyserad med tris-buffert innehållande NLS, som passage av färgat material skedde. I samtliga andra fall förblev färgen (hämet) kvar innanför slangväggen. Särskild analys av det färgade material, som hade passerat slangväggen, visade att detta hade samma proportioner mellan järn och aminosyror som materialet inuti slangen. Av detta försök kan den slut- satsen dragas, att hydrofob interaktion medförande aggregat- S! bildning av hämhaltiga peptider, utgör den huvudsakligen detta åskådliggöres i F-G.

En fortskridande enzymatisk hydrolys enligt uppfinningen mekanismen (enligt alternativ a); av hämoglobin torde således åstadkomma sådan hydrofob inter- aktion mellan hämhaltiga hämoglobinfragment, att dessa samman- föres till aggregat, som kan avskiljas från material som icke innehåller häm, i stället för att som väntat fördela sig jämnt över hydrolys- och restfraktionen.

Man kan således enligt uppfinningen genom lämpligt val av denatureringsmetod, reaktionsbetingelserna för enzymatisk hydrolys av hämprotein ooh separationsmetod framställa häm- järnprodukter med förhöjd halt av hämjärn, genom att de vid hydrolys frigjorda aminosyrorna avlägsnas; varken häm eller järn behöver eller bör härvid tillsättas utifrån.

Lämpligt utgångsmaterial för föreliggande förfarande är helblod från djur eller blodkroppar, vilka innehåller allt hämoglobin i blodet. Blodkropparna utgör den del av helblodet, som återstår sedan blodplasman avskilts. För användning vid föreliggande förfarande måste de röda blodkropparna sönder- delas antingen de användes såsom sådana eller i form av hel- blod. Sönderdelningen sker enklast genom osmotisk behandling i närvaro av vatten; blodkropparna spricker vid tillförsel av vatten och deras innehåll av hämoglobin avges till lösningen (hämolys). Lämpligen utföres hämolysen genom att en del hel- l föl- jande flytsohema visas sohematiskt föreliggande förfarande blod eller blodkroppar försattes med 1-4 delar vatten. såsom i ett led vid framställningen av en anrikad hämjärn- produkt från ett hämprotein. 10 15 bl U! 451 '539 Flytsohema över alternativa förfaranden för framställ nino av hämïärnanrikat preparat Röda blodkroppar (återstod efter plasmaseparering) Hämolys (spädning med vatten) Denaturering Calkali, urea, syra, värme) Hydrolys (proteolytiskt enzym, pH, temp., tid) Separation Alt. l 1 Alt. 2 Utfällning Ultrafiltrering (pH) Aminosyra~ Häm- Häm- Aminosyra- fraktion järn- järn- fraktion anrikad anrikad produkt produkt Alt. 3 + utfällning Starkt anrikad hämjärnprodukt Denatureringen av hämproteinet kan lämpligen ske genom tillsats av alkali, NaOH eller KOH, till pH il, varefter pH li bibehàlles i 30 minuter till 8 timmar; före hydrolysen sänkas pH lämpligen, företrädesvis Ca(0H)2 och framför allt t.ex. med mineralsyra, till 7~9 i beroende av det valda enzymet. Denaturering kan även åstadkommas genom tillsats av 10 15 451 539 10 urea eller syra eller nagot med vatten blandbart lösnings- medel. Hydrolysen kan utföras sä, att denaturerat hämoglobin i en koncentration av exempelvis 1~l2% i vatten, företrädesvis 4-8%, tillföres ett proteolytiskt enzym. Detta enzym kan vara av animalt ursprung, t.ex. trypsin och kymotrypsin, eller ett växtenzym, t.ex. papain, bromelain och fícin, eller av mikro- biellt ursprung, lämpligen enzym frän mikroorganismer som är godkända för livsmedelsbruk, t.ex. vissa bakterier tillhörande Bacillus-släktet eller svampar tillhörande Aspergi1lus-släk- tet. Sådana mikrobiella enzym finnes i handeln, t.ex. under namnen Alcalase ® och Neutrase a, som utvinnes ur baciller och har en styrka av 6 resp. 1,5 Ansonenheter/g och är godkända för användning i livsmedel. Alla de exemplifierade enzymerna framställes av en rad olika tillverkare och är för förelig- gande uppfinnings syfte likvärda, under förutsättning att de användes pä likartat sätt. Härvid gäller det att använda sä mycket samma effekt uppnäs. Ett sätt att uttrycka proteo- lytiska enzyms aktivitet i s.k. Ansonenheter (se N.L. Davis och E.L. Smith: "Methods of Biochemical Analysis", vol. II, sid. 215, Interscience Publ. N.Y. 1955). En Ansonenhet är den mängd enzym, som erfordras för nedbrytning av ett standard- protein till en viss grad pä en viss tid. Vanligen innehåller kommersiella enzympreparat 0,1-SD Ansonenheter per gram bero- ende pä anrikningsgrad.

Den enzymatiska hydrolysen genomföres lämpligen vid konstant temperatur. t.ex. inom intervallete 10-8D°C, lämp- ligen 25-6000, beroende pä temperaturoptimum och stabilitet hos det valda enzymet. Valet av temperatur kan även bestämmas av önskad reaktionshastighet. En ändring av temperaturen till laga eller höga värden, t.ex. till mindre än 1U°C och högre än BUQC, kan användas för kraftig minskning av reaktionshastíg- heten eller fullständigt avbrytande av reaktionen.

Vid hydrolysen är pH en annan parameter, som även kan väljas beroende pa pH-optimum och -stabilitet, för det valda enzymet, t.ex. inom intervallet 4-11. För växtenzym, sasom 1 papain, kan pH vara relativt lagt, t.ex. 5,lmedan för alka- liska mikrobiella proteaser ett högre värde lämpligen väljes, t.ex. 9-lü. Reaktionshatigheten kan även styras med hjälp av pH. .1/ 10 15 DI Û 451 559 11 Vid hydrolys av proteiner frigöres karboxigrupper, vilka tenderar att sänka pH i reaktionsblandningen. Om pH tillätes sjunka pà detta sätt, uppnås en genom pH-sänkningen kontinuer- ligt ändrad reaktionshastighet. Om reaktionen igängsättes vid eller under enzymets pH-optimum, kommer reaktionshastigheten att gradvis avta, medan om utgängs-pH väljes över enzymets _ pH-optimum, reaktionshastigheten först ökar, tills pH-optimum uppnätts, varefter hastigheten gradvis avtar. pH kan även hällas konstant under reaktionen genom kontinuerlig tillsats lämpligen NaOH eller KOH, lösning, varvid den tillsatta mängden alkali per tidsenhet av alkali, företrädesvis i vatten- även utgör ett mätt pa reaktionshastigheten ooh den totalt tillsatta mängden alkali utgör ett mätt pä hydrolysgraden.

De hydrolysprodukter, som uppstår under reaktionen, hämmar reaktionen genom sin blookerande inverkan pä enzymet; hydrolysprodukterna styr säledes även reaktionens förlopp. Om dessa hydrolysprodukter fär kvarstanna i reaktionsnbland- ningen, kommer de ensamma eller tillsammans med andra betin- gelser, som styr reaktionen, t.ex. temperatur och pH, att inverka pä reaktionens hastighet och hydrolysgraden, Sadana i vilket reaktanterna blandas ooh reaktionen fär fortgå, tills den förhållanden räder i ett enkelt reaktionskärl, avstannar.

Om reaktionen utföres under sådana förhållanden, att hydrolysprodukterna kontinuerligt avlägsnas, kommer reaktionen ä andra sidan att pâverkas mycket mindre av dessa produkter; reaktionen kan följaktligen beträffande hastighet ooh hydro- lysgrad väsentligen styras pä annat sätt, t.ex. med temperatur och pH. Hydrolysprodukterna kan kontinuerligt avlägsnas pà flera sätt, företrädesvis genom ultrafiltrering. Ultrafiltre- ring tillgar sä, att reaktionsblandningen pressas mot ett porigt membran, som är sä beskaffat att molekyler upp till en viss storlek kan passera genom membranet, medan större molekyler kvarhälles. Genom val av membran med lämplig por- storlek kan man välja den största storlek, som de molekyler har, vilka passerar genom membranet. Egenskaperna hos säväl det material, som passerar genom membranet, som ej passerar genom membranet, kan liksom reaktionshastighet ooh hydrolys- grad styras genom lämpligt val av reaktions- och ultra- 10 15 F: J. 451 539 filtreringsparametrar, sasom temperatur, pH, prcteinenzymför- hållande, membranval, tryck- och cirkulationsförhàlIanden, reakticnsbaldningsvolym, tillsats av alkali, etc. m* Eftersom hämjärnhalten är den i detta sammanhang intres- santa egenskapen hos det slutliga preparatet, mäste reaktionen genomföras sa, att företrädesvis aminosyror och så litet som , möjligt av hämjärnet avlägsnas. Den hämjärninnehallande frak- U tionens egenskaper bör dessutom avpassas sa, att den lätt kan skiljas från övrigt material. Detta uppnås genom lämpligt val av reakticnsbetingelser, framför allt valet av enzym, hydro- lys-pH och reakticnstid, utfällnings- eller membranfiltrering; halten hämjärn kan även varieras pà detta sätt.

I det visade flytschemat äskadliggöres föreliggande fär- farande, såsom det har beskrivits. Enligt den visade vägen (alternativ 1) kan endast den hämhaltiga fraktionen utfällas vid pH 4-5. Enligt alternativ 2 kan endast den hämhaltiga fraktionen koncentreras genom ultrafiltrering. Genom kombi- nation av ultrafiltrering och utfällning (alternativ 3) kan ävenledes den hämhaltiga frakticnen koncentreras.

De tekniska fordringar, som ställes pa föreliggande häm- järnsprodukt, beror pà den avsedda användningen. I det föl- jande kommer endast att visas hur man kan framställa ett häm- järnanrikat preparat enligt uppfinningen och därvid styra häm- järnanrikningen. Produkten kan anpassas till de tekniska fordringar, som ställes pa den, med hjälp av samma atgärder som dem som användes vid styrning vid hämjärnn, men även andra metoder kan tillgripas, vilka i och för sig icke har någon inverkan pà hämjärnanrikningen.

Uppfinníngen beskrives närmare i följande exempel.

Exempel 1.

Inverkan av enzym och pH Till var och en av sex satser (A - F) om vardera 1000 g ån mörkplasma innehållande 350 g protein, 14 g häm och 1,1 g järn sattes 1000 g vatten under omröring för hämlys av blodkrop- u parna. ligare 3000 g vatten samt sa mycket 5 N vattenhaltig NaOH, att pH höjdes till il.

Efter 1 h vid rumstemperatur tillsattes till sats A, C Därefter sattes till var och en av satserna A F ytter- och E sä mycket 1 M vattenhaltig citronsyralösning, att pH 10 15 25 30 UI III 451 539 13 blev 9,0, ooh till sats B, D ooh F sa mycket att pH blev 7,5.

Alla satserna filtrerades genom pappersfilter. Temperaturerna i satserna A ~ F inställdes pa 50°C. Till sats A ooh B sattes därefter 3,5 g Aloalase ®, till sats C ooh D 'Mg Neutrase ® ooh till sats E och F 7 g papain. Alla dessa enzympreparat, Aloalase ®), Neutrase @) och papain, var upplösta i 50 ml 0,1 M fosfatbuffert med pH 8. Genom tillsats av enzympreparaten igàngsattes hydrolysen i samtliga satser. Under hydrolysen följdes förändringarna i pH med hjälp av pH-meter och S N vattenhaltig NaOH tillsattes portionsvis med sådan frekvens, att pH hela tiden hölls inom intervallet 8,7-9 i sats A, C ooh E ooh inom intervallet 7,2-7,8 i sats B, D ooh F. Efter 2 h minskades hydrolyshastigheten genom sänkning av temperaturen till 1090, varefter i sats A - F sa mycket 3 M vattenhaltig HC1 tillsattes, att pH i alla satserna sjönk till 4,5. Härvid uppstod i alla satserna en mörk fällning, som avcentrifuge- rades och torkades; kväve- och järnanalys utfördes därefter på den torkade fällningen. Redan okulärhesiktning av fällningarna och lösningarna visade, att skillnader förelag i hämhalt.

Resultaten av analyserna framgår av följande tabell.

Sats Ensym pH Järninnehall Anrikningsgrad* (md/U) Nörkplasma A Aloalase® 9,0 12,9 4,0 B " 7,5 5,2 1,6 C Neutrase (D 9,0 5,6 1,8 D " 7,5 6,0 1,9 E Papain 9,0 12,9 4,0 F " 7.5 5.2 1.6 * Antal gånger anrikat i förhållande till mörkplasmans järn- innehäll Av detta exempel framgår, att anrikade järnpreparat kan framställas därigenom, att hämoglobin med hjälp av enzymer uppdelas i en järnanrikad fraktion ooh en fraktion innehal- lande avspjälkade aminosyror ooh att dessa fraktioner separe- ras genom utfällning av den hämjärnanrikade fraktionen. Anrik- ningsgraden vid konstant hydrolystid och-temperatur har styrts genom inställning av pH ooh/eller valet av enzym. Såväl 10 15 40 451 539 14 Aloalase (D som papain har salunda givit betydligt större järnanrikning vid pH 9,0 än vid pH 7,5, medan Neutrase ® väsentligen givit samma resultat vid pH 9,0 ooh 7,5.

Exempel 2.

Membranförfarande mv Till var ooh en av tva satser CA ooh B) om vardera 5 kg .M mörkplasma innehallande 1600 g protein sattes 5 kg vatten för hämolys av blodkropparna, varefter denaturering utfördes genom alkalibehandling vid pH ll och filtrering analogt med exempel 1. Därefter tillsattes ytterligare 35 kg vatten, sa att varje sats totalt vägde 45 kg, varefter pH inställdes pa 9,0 med 2 M vattenhaltig HCl. Efter inställning av temperaturen pa 50°C i ett mantlat stalkärl tillsattes till bada satserna 22,5 g A1=a1a§@ É), 1asfi 1 son m1 0,1 M vattenha1tig'fusfatbuffevt av pH 8,0, varvid hydrolysreaktionen igangsattes. Under reak- tionen hölls pH i intervallet 8,8-9,2 pa det i exempel 1 be- skrivna sättet. Hydrolysen genomfördes med väsentligen kon- stant pH genom tillsats av vattenhaltig natriumhydroxid- lösning, först under en kort förhydrolystid i det mantalde kärlet, varvid denna förhydrolystid för sats A var 21 min och för sats B 7,5 min. Därefter utfördes hydrolysen under ultra- filtrering, som för sats Å pagiok i 64 min ooh för sats E i 45 min. Ultrafiltreringen, genom vilken den järnanrikade frak- tionen separerades fran aminosyrafraktionen, utfördes i membran av typen "ihalig fiber" med en nominell avskiljnings- grad av 10 000 dalton för sats A resp 7000 dalton för sats B pa sätt som närmare beskrives i exempel 3. Behandlingen avbröts i bada fallen, da 3,0 mol NaOH hade tillsatte. Av var- dera satsen aterstod da 5 l, dvs. 11% av ursprungsvolymen. I bada fallen torkades aterstoden och analyserades pa järn.

Resultaten framgar av följande tabell: Sats Ultrafiltrering Järn Anrikningsgrad cua1tDn> (ma/ua f Utgangsmaterial - 2,2 1 A 10 000 5,2 2,4 3 B 7 000 8.8 4.4 Anrikningsgraden för järn kan saledes styras med hjälp av membranet porositet. 10 15 451 559 15 Exempel 3.

Membranförfarande Tre satser (A - C) om vardera 5000 g mörkplasma innehal- lande cirka 1750 g hämoglobin, 70 g häm och 5,5 g järn, hämo- lyserades och denaturerades analogt med exempel 1.

Till sats A och B sattes 1 M vattenhaltig citronsyra för sänkning av pH till 9,0 och till sats C sattes 1 M vattenhal- tig citronsyra för sänkning av pH till 7,5. Alla satserna inställdes pa 54°C, varefter enzym tillsattes. Till var och en av satserna A och B sattes 18,6 g Alcalase ® , löst i 400 ml 0,1 N vattenhaltig fosfatbuffert som filtrerats genom pappers- filter, och till sats C sattes 74,4 g Neutrase Û i 400 ml 0,1 M vattenhaltig fosfatbuffert med pH 7,5, vilken likaledes filtrerats; hydrolysen igangsattes härvid. pH hölls konstant mellan 8,7 och 9,3 beträffande satserna A och B och mellan 7,2 och 7,8 i sats C pà sätt som beskrivits i exempel 1. Reak- tionshastigheterna i sats A, B och C sänktes efter 20 min, 105 min resp. 210 min genom sänkning av temperaturen till cirka 4000 (för alla satserna A ~ C), varvid dessutom till sats B sattes E M vattenhaltig HCl för sänkning av pH till 7,6.

Ultrafiltrering igangsattes härefter omedelbart och tempera- turen sänktes efter hand till omgivningstemperatur (cirka 2000). Ultrafiltreringen utfördes i samtliga fall med membran av typ "ihalig fiber" med en avskiljningsgräns Cnominell molekylviktsuteslutningsgräns) av 50 000 dalton och med en aktiv yta av 2,46 mi. Trycket var före membranet 100 kPa och efter membranet 70 kPa. Flödet uppmättes till 90 1/m2.h pa permeatet, dvs. den del av lösningen som passerade genom membranet. När cirka 5 l lösning aterstod tillsattes vatten i tva omgångar, vardera om 8 1, i syfte att ytterligare avlägsna avspjälkade aminosyror. Den kvarvarande lösningen koncentre- rades slutligen genom indunstning till cirka 3,5 1. De erhall- na koncentraten fran satserna - C torkades och vägdes, var- efter kväve- och järnanalys utfördes. Resultaten framgår av följande tabell: 451 539 16' Prov Hydro- Filtre- Tid Järn Anrik- Beteck- Enzym lys rings- (min) (mg/g) ningsgrad ning DH pH Mörx- - - - - 3,3 1,0 plasma A Alcalasâ 9,0 9,0 20 10,4 3,2 s Alcalasaß 9,0 7,6 105 18,8 5,7 c Neutraså 7.5 7.5 210 12.2 3.7 Av resultaten framgar att anrikat hämjärnpreparat kan framställas genom att hämoglobin hydrolyserar med enzym till en järnanrikad fraktion och en annan fraktion innehàllande avspjälkade aminosyror och genom att dessa fraktioner separe- ras genom ultlrafiltrering med användning av membran med en avskiljningsgrad av 50 000 dalton samt att ett lägre filtre- rings-pH gynnar avrikningsgraden.

Utbytet av hämjärnanrikad fraktion visade sig bli större, om pH vid ultrafiltlreringen var 7 i stället för 9.

Genom denna inställning av pH före ultrafiltrering är det möj- ligt att använda porösare membran än vad molekylviktsför- hállandena för hämpglobin och hämjärnanrikad (hämanrikad) fraktion anger. Man vinner pà detta sätt snabbare ultrafiltre- ring. Det framgår även att hämjärnanrikningen kan styras genom valet av hydrolystid, varvid samma enzym och samma pH använ- des, eller genom valet av enzym.

Exempel 4.

Förbehandling och hydrolys av mörkplasma skedde analogt med exempel 3, varvid pH under hydrolysen hölls vid 9. Ultra- filtreringen utfördes i ett första fall (A) med membran med avskiljningsgraden 10 000 dalton och i ett andra fall (B) först genom membran med avskiljningsgraden 50 000 dalton följt av filtrering genom membran med avskiljningsgraden 10 000 dalton. I fallet B passerade förhållandevis mer hämjärn mem- branet med avskiljningsgränsen 50 000 dalton, eftersom pH vid ultrafiltreringen var 9, i jämförelse med exempel 3, där pH var 7. Hämjärnfraktionen fràn filtratet i fall B kunde kon- centreras, genom att det första filtratet ånyo ultrafiltre- rades, men nu genom ett membran med avskiljningsgränsen 10 000 dalton. I båda fallen (A, B) uttogs materialet, när 5 1 åter- JL 10 15 451 559 17 stod, varefter pH i bada fallen sänktes till 4,5 genom till- sats av saltsyra. Härvid erhölls fällningar, vilka tillvara- togs, torkades, vägdes ooh analyserades pä järn.

Resultaten framgår av följande tabell: Prov Järn Anrikningsgrad _ beteckning mo/o Mörkplasma 1,8 1,0 Fällning A 19,5 6,9 Fällníno B 46.1 16.5 Av detta exempel framgar, att anrikningsgraden kan styras genom olika kombinationer av ultrafiltrering ooh utfällning. De material (fällning A och B), som framställts enligt detta exempel, bestar således av 1,95 resp. 4,ó% järn, vilket motsvarar 22 resp. 54 häm (järn x 11,64 = häml; de innehåller säledes 78 resp. 46% annat material, som till allra största delen utgöres av aminosyror.

Av exemplen framgår, att hämjärnpreparat kan framställas genom enzymatisk hydrolys av hämoglobin till en hämjärnanrikad aminosyrafraktion och en aminosyrafraktion utan hämjärn och att dessa bada fraktioner kan separeras, t.ex. genom utfäll- ning av den hämjärnanrikade fraktionen eller genom ultrafil- trering eller nagon kombination av dessa metoder. Den hämjärn- anrikade fraktionen innehåller fortfarande aminosyror, vilka spelar en stor roll för hämjärnets transport och resorption.

Utbytet järn, räknat pa den ursprungliga mörkplasmans järn- innehall, var i alla exemplen cirka 50%.

Den lämpligaste utföringsformen för framställning av föreliggande hämjärnanrikade aminosyrapreparat beror pä användningen. För astadkommande av den bästa hämjärnanrik- ningen är utföringsformen enligt exempel 13 lämligast, om man arbetar utan memhranteknik, vid membranteknik är utförings- formen enligt exempel 38 lämpligast ooh kombinationen av membranteknik och utfällning är lämpligast enligt utförings- formen i exempel 48.

Claims (7)

451 539 1% Pategtkgav

1. Hämjärnanrikat aminosyrapreparat framställt av häm- proteiner, k ä n n e t e c k n a t därav, att preparatete järninnehall uteslutande utgöres av det ursprungliga hämpro- teinets porfyrinjärn bundet i denna form (häm) vid resterande M, aminosyrakedjor sedan merparten av aminosyrorna i hämproteinet är avspjälkade genom enzymatisk hydrolys, varvid den efter hydrolysen uppkomna hämprodukten har egenskapen att ha bildat aggregat, vilka har större dimensioner än de enskilda, korta, hämjärninnehállande aminosyrakedjorna, och att vara separerbar fràn de avspjälkade aminosyrorna genom membranteknik och/eller genom utfällning vid pH 4-5 och att hämprodukten är befriad fran avspjälkade aminosyror.

2. Aminosyrapreparat enligt krav 1, k ä n n e t e c k- n a t av ett konstant förhållande mellan häm och järn och av en porfyrinhämjärnhalt av lägst 0,5! och företrädesvis högst 5%, räknat som det järn som är bundet vid porfyrin.

3. Förfarande för framställning av ett hämjärnanrikat aminosyrapreparat frán hämproteiner, speciellt hämoglobin. k ä n n e t e c k n a t därav, att hämproteinet pa i och för sig känt sätt först utvinnes genom hämolys och denatureras och därefter spjälkas med hjälp av proteolytiska enzym till en hämjärnanrikad och en aminosyraanrikad fraktion samt att den hämjärnanrikade fraktionen separeras från den aminosyraan- rikade fraktionen genom utfällning vid ett pH av 4-5 och/eller genom membranteknik, såsom ultrafiltrering, samt stabiliseras genom värmebehandling och avvattnas, företrädesvis genom torkning.

4. Förfarande enligt krav 3, k ä n n s t e c k n a t därav, att enzymatiska spjälkningen utföres i pH-intervallet 4-11.

5. Förfarande enligt krav 3 eller 4, k ä n n e t e c k- n a t därav, att enzymatiska spjälkningen utföres vid en temperatur av 10-80°C.

6. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att ultrafiltrering sker vid ett pH av 5-9.

7. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t 'w 451 5.39 H därav, att ultrafiltreringen utföres med membran, som har en avekiljningegrad av 1000-501300 dalton eller med en kombina- tion av membran med en avekiljningagräne av 1000-50.000 dal- ton.