SE458505B - Anvaendningen av rifamycin sv och salter daerav foer framstaellning av en beredning foer behandling av reumatoid artrit samt vissa av salterna och deras framstaellning - Google Patents

Description

458 505 'i 10 15 20 25 30 35 ståndet och till fullständigt hotande av patienten.

Alla kommersiellt tillgängliga lösningar av rifamycin SV innehåller, förutom antibiotikumet i form av natriumsal- tet, även en viss mängd natriumaskorbat (tillsatt i syfte att förhindra omvandling av rifamycin SV till en rifa- mycin S-lösning) och dessutom lämplig mängd polyvinylpyrro- lidon tillsatt i syfte att öka injektionens otillräckliga lokala tolerabilitet och därmed göra detta antibiotikum mer tillgängligt.

I själva verket har alla vattenlösningar av natriumsaltet av rifamycin SV använda fram till nu för alla kända tera- peutiska tillämpningar iakttagits knappast vara lämpade för injektioner i leder. Nämnda lösningar fordrar faktiskt närvaro av polyvinylpyrrolidon, som inte bara är nödvändigt för att uppnå tillräcklig koncentration av nämnda salt, som i sig självt är nätt och jämnt lösligt i vatten, utan ock- så för att öka den antibiotiska biotillgängligheten. Nämn- da kännemärke, vanligen positivt i en drog,utgör en tydlig olägenhet för den terapeutiska àtgärds syften som är ända- målet med föreliggande uppfinning, eftersom man finner att ju större varaktigheten av rifamycin SV är i den led i vilken det har injicerats desto snabbare blir-upplösningen av det patologiska tillståndet.

Man har för ändamålet enligt uppfinningen funnit att rifa- mycin SV-salter, speciellt natriumsaltet, kan framstäl- las i huvudsakligen vattenfri form exempelvis genom lyo- filisering; nämnda salter ger efter tillsats av lämplig mängd destillerat vatten, sterila lösningar avsedda att användas ex tempore. Motsvarande lyofiliserade ampuller innehållande antibiotikumet som natriumsalt i torrt till- stånd kan förvaras i år vid rumstemperatur. Vad gäller lyofiliseringsprocessen skall de vattenlösningar av rifa- 10 15 20 25 30 35 i* 458 505 mycin SV som erhålles vid saltbildningen av antibioti- kumet med NaHC03 eller Na0H i sådan mängd att ett pH i området mellan 7 och 8 uppnås aldrig bringas över en tem- peratur av +4°C och skall sedan frysas vid -35°C så snabbt som möjligt.

Ingen speciell försiktighet erfordras vid den efterföljan- de lyofiliseringsprocessen.

Vattenlösningarna av rifamycin SV-salter med basiska amino- syror såsom arginin, lysin, histidin, aspangfin, etc. har visat sig särskilt användbara för de terapeutiska till- lämpningarna av uppfinningen.

Nämnda salter, påtagligt mer vattenlösliga än natriumsal- tet, kännetecknas av otillfredsställande biotillgänglighet och kvarstannar därför i den angripna leden under till- räckligt lång tid för att erhålla den önskade terapeutis- ka effekten. ' Rifamycín SV-salter med histidin, lysin och arginin visar sig mycket typiska i detta sammanhang, eftersom deras 20- procentiga vattenlösningar kännetecknas av ett pH 6,4-6,7 perfekt lämpat både för bevarandet av antibiotikumet och för injektion i leder.

Nämnda lösningar, uppvisande ett pH mellan 6,5 och 7, är klart mer stabila än lösningarna av natriumsaltet. Efter lyofilisering, som à andra sidan kan utföras utan speciel- la försiktighetsåtgärder, kan salterna av basiska aminosy- ror med rifamycin SV bevaras länge, varvid de lätt ger bruksfärdiga extempore-lösningar efter tillsats av lämplig mängd destillerat vatten.

Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning består 458 505 10 15 20 25 30 35 därför i saltet av rifamycin SV med en basisk aminosyra ur gruppen arginin, lysin och histidin.

Argininsaltet av rifamycin SV visade sig särskilt använd-1 bart för syftet på grund av sina optimala vattenlöslig- hetsegenskaper.

Dess 10-procentiga vattenlösning visar ett pH av 6,7; dess lokala tolerabilitet, bestämd efter en 60 mg injek- tion given en gång dagligen under tre på varandra följan- de dagar i kaninspinalsäck, i jämförelse med motsvarande mängd av kommersiella lösningar av rifamycin SV visade sig optimal och definitivt bättre än den som iakttogs vid de kommersiella lösningarna.

Uppfinningen avser även ett förfarande för framställning av salter av rifamycin SV med basiska aminosyror, vilket kännetecknas av att rifamycín SV löses i vatten med stökio- metrisk mängd av en basisk amínosyra ur gruppen arginin, lysin och histidin och att saltet frånskiljes som en fast produkt genom att ett med vatten blandbart icke-lös- ningsmedel, t.ex. isopropanol, tillsättes eller att vatten avlägsnas fràilösningen, t.ex. genom lyofilisering.

Nedan givna exempel illustrerar förfarandet enligt upp- finningen men utgör inte någon begränsning för detta.

EXEMPEL 12,5 g (7l,8 mmol) L-arginin och 50 g (7l,8 mmol) rifa- mycin SV löses i 200 ml vatten för injicerbara beredning- ar under vakuum. Den erhållna lösningen filtreras under vakuum och sterila betingelser och överföres sedan till en lyofiliseringsanordning och kyls ned till -3500.

Den erhållna lösningen hålls vid nämnda temperatur i 3 h __.- '10 15 20 25 30 35 458 505 före vakuumfasen. Fasen för primärtorkning, dvs. värme- plattans bringande till OOC, börjas när det önskade vakuum- värdet erhållits, dvs. 0.1 Torr. Denna fas har en varak- tighet av 24 h. Sekundärtorkníngen, vid vilken plattan hålls vid rumstemperatur, har en varaktighet av 3 h. Den slutliga fukthalten hos produkten ligger vid en nivå av omkring 1 %. Salterna av L-lysín och L-histidin framställs i enlighet med samma schema utgående från 1,050 resp. 1,113 g av de båda aminosyrorna.

Tunnskiktskromatoqrafi av de salter som erhållits enligt ovan nämnda tillvägagångssätt (60 F254kiselgelplattor, Merck 10 x 10) med 3:1 kloroform-metanol som eluerings- medel möjliggör erhàllandet av följande Rf: . rifamycín SV-salt med arginin: 0,54 rifamycin SV-salt med histidin: 0,46 rifamycin SV-salt med lysin: 0,48 Elementaranalys av salterna har gett följande värden: (a) L-argíninsalt för C433 N 0 (molvikt 871,96) 61 5 14 % beräknat: C = 59,23; H = 7,05; N = 8,03 % funnet: C = 58,85; H = 6,93; N = 7,85 (b) L-histidinsalt för C43H56N40l4 (molvikt 852,91) % beräknat: C = 60,55; H = 6,62; N = 6,57 % funnet: C = 69,88; H = 6,45; N = 6,48 (c) L-lysinsalt 458 sos 6 för C43H61N3014 (molvikt 843,94) % beräknat: C = 61,19; H = 7,28; N = 4,98 % funnet: C = 60,80; H = 7,41; N = 4,71 Lösiigheten för saiterna av histidin och Iysin är hög i vatten och metanol, god i etanol och aceton och praktisktc taget no11 i isopropanoï, eter, bensen, etyïacetat, Arginin- saltet, i hög grad iösïigt i vatten, metanoi och aceton, är också svårïösiigt i etyïacetat och kïoroform.

Biotiïigängïighetsdata - Den knappa biotiïigängïigheten för saiterna enïigt upp- finningen har redan nämnts. Nämnda saiter gör det möjïigt att erhålia (efter injektion i en ied) höga koncentrationer av rifamycin i synoviaivätskan under 24 - 48 h efter injektionen; under tiden uppnår rifamycin sin maximaia serumkoncentration efter 30 minuter och fortfarande visar det sig vara närvarande i små mängder 24 h efter injektionen. Rifamycinnivåerna när- varande i de bioiogiska vätskorna hos behandïade patienter undersöktes genom högtryckskromatografi (HPLC); en metod, som är mer tilïförlitiig och reproducerbar än uitravioiett- eïïer mikrobioiogiska metoden.

Synovialvätskeproverna injicerades direkt i kromatografen efter fäïining av proteinerna med acetonitrii, medan serum- proverna å andra sidan först måste extraheras med etyïacetat vid surt pH.

Endast rifamycin SV är närvarande i synovialvätskan, me- dan seret också innehåïier rifamycin S.

En Hewïett Packard = kromatograf används, modeil 104 B, utrustad med en fast vågïängds-detektor (254 nm) 3 RP 18 (10 mc) koionn, 25 cm iängd, 4 cm diameter.

Följande eïueringsmedel används: (A) en 80:20-biandning av 0,01 M fosfatbuffert vid pH 7 och acetonitrii; (B) acetonitriï. Gradienten växiar från 10 % av B tiïi 70 % av B inom 15 minuter; fiödet är 1,6 mi/min.

Ugnens temperatur är 3500; eiueringsmedïets A är 60% och eluentens B 40%. 458 505 'l Framställning av standard Rifamycin SV och dess oxiderade form, dvs rifamycin S, används som standard.

För att upprätta standardlinjer i synovialvätskan löses 500 mg av varje enskild förening i en liter exakt av en 1:1 vatten-metanol-blandning.

De båda absorptionslinjerna upprättas genom att injicera 5/ul, 10 /ul och 15/ul av nämnda lösningar i kromatografen.

De tidigare lösningarna späds tiofaldigt vad gäller serastandardlinjerna; ovan nämnda operationer upprepas där- efter.

' Bestämning av rifamycin SV i synovialvätskan Denna bestämning utförs direkt på den deproteiniserade synovialvätskan. 200/ul prov införs i ett centrifugprovrör och försättes med 2 ml acetonitril.

Den erhållna lösningen rörs om och får klarna; 20 /ul överstående vätska injiceras sedan i kromatografen. Proven ana- lyseras omedelbart för att förhindra oxidation av rifamycin SV till rifamycin S.

Bestämning av rifamycin i serum 2ml serum försätts med lika stor volym av en buffertlös-1 ning vid pH 1,71. Nämndaälösning framställs genom att 200 ml N ättiksyra, 200 ml N Na0H och 220 ml N saltsyra blandas och blandningen sedan bringas till den exakta volymen av en liter med vatten. Den erhållna lösningen extraheras två gågner med 10 ml etylacetat. Den organiska fasen bringas till torrhet och återtages sedan med 500/ul acetonitril. 20/ul av nämnda lös- ning injiceras för analysen.

Tabell 1 summerar rifamycinnivåerna i seret och i syno- vialvätskan hos patienter, som givits en injektion i en led av 500 ml L-argininsalt av rifamycin SV. Data uttrycks i /ug/ml. 458 505 wfim m~fl@~ Qwfißw owflwß @~_fim~m Qmmflowæ Qæmflowmw °_mfi@mw~ ommfiomae ;@w>@= 1 7.... .šošw m~.ofiom~.o ~_.Qfl_N~.o _~.cHw.m.° wm.=w-m.o m@.oHmæm.@ m_.=flmm.c ~«.@flmm.D N.QHwm._ Lww>.= åëüw :N =_ .om .m_ :we :vw :w gm se cflh F 44wm<» 458 505 Tabefl 2 åandmasidæi framhåller mönsterskillnaderna vad gäller behandling av reumatoid artrit i enlighet med uppfin- ningen mellan rifamycin SV-s natriumsalt och rifamycin SV-salterna med basiska aminosyror. De data som visas i Tabell 2 (som representerar medelvärdet för åtta bestämningar och ut- trycks i mg/ml) jämför nivåerna av rifamycin i synovialvätskan hos patienter som givits en injektion i en led av natrium- och argininsalterna i mängder ekvivalenta med 500 mg rifamycin SV; nämnda data visar den tydliga överlägsenheten hos arginin- saltet.

TABELL 2 5' 1 h 2 h ' 4 h 8 h natriumsalt 6,7 1 0,2 1,53 É 0,49 0,485 3 0,18 0,439 É 0,18 0,140ïI0,067 argininsalt 7,46 i' 2,1 3,85 t 0,8 1,73 :1 0,75 i 0,3 0,173 r 0,1 Iakttagelsen att man i monoartritiska marsvin (ar -globulin- artrit) kan iakttaga rifamycin-argininsaltnivâer, som är 10 i gånger högre än vid rifamycin-natriumsalt efter administration i en led av antingen rifamyçin-natriumsalt eller -argininsalt visar full överensstämmelse med ovan nämnda data.

Kliniska data Effekten av injektion i en led av rifamycin SV-lösningar i reumatoid synovit bestämdes i två kliniska försök, varvid det ena utfördes enligt en öppen teknik och det andra enligt en dubbelblind experimentell modell.

Sammanlagt 35 patienter behandlades med en injektion i en led med 200 - 500 mg per vecka under högst 10 Veckor. Patienter- na följdes upp i tre år. Följande diagnostiska laboratorietest gjordes varje vecka på synovialvätskorna: differentiell räkning av vita blodkroppar, RA-test,Waaler-Rose -test, latextest, im- munoglobuliner, T- och B-lymfocyter, C surt fosfatas. 3 och C4-nivåer, glukos, 1o 458 5Û5 i Bioptiska undersökningar utfördes både innan och efter olika månader (1-18) efter behandlingens början.

Exudatet visade sig ha försvunnit fullständigt efter det tredje och inom det tionde införandet av rifamycin SV. Nämnda exudat visade sig igen endast i två patienter, dvs i ett fall 2 månader och i det andra fallet tolv månader efter behand- lingens avbrytande.

En betydande nedgång i totala leukocyter, polymorfocyt- procenttal och RA-celler iakttogs vid slutet av behandlingen.

Inga förändringariäkttogs i de immunologiska parametrarna. knäna hos de patienter som behandlats på ovan angivna sätt med rifamycin SV visade följande förändringar ur histologisk syn- punkt: Minskning av synovialcellinfiltrat, ökning av nybildad bindväv, omgivande områden med rester av hyperplastisk synovia, avlagringar av nytt delvis organiskt fibrin. Inga betydande för- ändringar iakttogs“ i kontrollpatienterna som givits koksalt- lösning.

I en andra klinisk experimentserie gavs 75 patienter drab- _ bade av envisa utgjutningar i ena eller båda knäna 500 mg rifa- ' mycin SV (i form av L-argininsalt) var sjunde dag, fortfarande genom injektion i en led.

En fullständig nedgång av utgjutningarna och en tydlig klinisk förbättring iakttogs i 72 av nämnda patienter; 28 av dem följdes upp i i-- 6 månader, 10 i 7 - 12 månader, 16 i 1 - 2 år och 15 i 2 - 5 år. Endast 3 patienter drabbades av ett utgjutningsåterfall 1_- 6 månader efter behandlingens bör- jan. 12 av 72 patienter fordrade 1 - 3 infiltreringar; 33 ford- rade 4 - 6 infiltreringar och 27 patienter 7 - 12 infiltre- ringar för att framkalla nedgång i utgjutningen. Endast en patient svarade inte på 12 infiltreringar. Antalet infiltre- ringar var strängt förknippat med aktiviteten av lokal synovit (P < 0,05). Den gradvisa tillbakagången av utgjutningen visade sig stå i samband med förändringar i anomalier hos synovial- vätskan, dvs betydande minskning av leukocyter (P<: 0,001) och ökning av C3- och C4-komplementfraktioner (P~< 0,005).

Rifamycin SV åstadkom en inledande lokal smärta i huvud- delen av patienterna och en lokal fördröjd smärtsam reaktion i 28 av 72 patienter. Två av de 75 patienterna måste avbryta be- ll 458 505 handlingen på grund av ovan nämnda besvärliga bieffekt. In- filtrering av rifamycin SV-L-amgäninsalt i andra leder än knät (vrist, handens metakarpofalangeal- och -interfalangeal- leder, tibiatarsalïedef, etc. i en sammanlagd mängd av omkring 300 leder) visar den kraftiga analgetiska och antiinflammato- riska verkan hos läkemedlet: Behandlingen leder till en tydlig minskning, och rätt ofta till fullständig nedgång av morgon- styvhet, ökad greppstyrka varierande mellan 60 och 100%-nivåer- na tillsammans med en allmän förbättring av ledfunktionen.

Under behandlingarna givna för reumatoid artrit och andra for- mer av artrit genom injektioner av rifamycin SV i en led visades rifamycin SV:s inhiberande verkan på kulturer av synovial- membranfragment uttagna med nàlbiopsi gjord för diagnostiska ändamål i patienter drabbade av reumatoid artrit. i Dessutom iakttogs den dåliga diffusionen av rifamycin SV direkt injicerat i leden, och följaktligen dess eventuella inhiberande verkan på de kemiska förmedlarna av inflammation och lymfokines.

För att uppnå nämnda resultat måste rifamycin SV, före- trädesvis i form av ett sàlt, injiceras direkt i ledhâlig- heten för att uppnå så höga koncentrationer som inte kan upp- nås på annat sätt vid systemisk användning av läkemedlet.

Rifamycin SV kvarstannar i den angripna leden tillräck- ligt lång tid för att möjliggöra ett dosschema av 200/1000 MQ en_gâng_per vecka såsom visas av tidigare nämnda kinetiska undersökning utförd på synovialvätskan.

Claims (4)

12 458 505 10 15 20 25 30 35 P A T E N T K R A V

1. Användning av rifamycin SV och salter därav för fram- ställning av en farmaceutisk beredning för behandling av reumatoid artrit genom injektion i en led.

2. Användning enligt krav l, varvid den farmaceutiska be- redningen har formen av en vattenlösning av natriumsaltet av rifamycin SV eller av ett salt av rifamycin SV med en basisk aminosyra ur gruppen arginin, lysin och histidin.

3. Saltet av rifamycin SV med en basisk aminosyra ur grup- pen arginin, lysin och histidin.

4. Förfarande för framställning av salter av rifamycin SV med basiska aminosyror, k ä n n e t e c k n a t av att rifamycin SV löses i vatten med stökiometrisk mängd av en basisk aminosyra ur gruppen arginin, lysin och histidin och att saltet frànskiljes som en fast produkt genom att ett med vatten blandbart icke-lösningsmedel tillsättes eller att vatten avlägsnas från lösningen.