SE0950225A1 - Metod och anordning för detektering av läkemedel i ett prov - Google Patents

Description

2 är utveckling av altemativa metoder önskvärda, för att bestämning av en mängd eller koncentration av till exempel warfarin som finns i en patients blod, vilka helst skall vara mer robusta och mer känsliga.

Det skall observeras att andra tekniker har föreslagits har för mätning av proteinbindning, vilka inkluderar dialys, ultrafiltrering, cirkulär dikroism och yttre fluorescens.

Sammanfattning Mot bakgrund av föregående är ett syfte med uppfinningen att tillhandahålla en förbättring av ovan nämnd känd teknik. Mer specifikt är ett syfte att tillhandahålla en metod och anordning för effektiv detektering för en mängd vitamin K-motverkande antikoagulant såsom warfarin som finns i en patient.

Således tillhandahålls en metod för mätning av en vitamin K- motverkande antikoagulant som finns i ett prov, varvid metoden innefattar: belysning av provet med ljus från en ljuskälla för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid excitationen av provet resulterar i en fluorescensemission från provet; mätning av fluorescensemission från provet; bestämning av en fluorescenslivstid för fluorescensemission från provet; bestämning av en intensitet (amplitud) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden; och bestämning av en mängd av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten av den fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden.

Fluorescenslivstiden och intensiteten beskriven ovan kan hänföras till som en första fluorescenslivstid och en första intensitet, i vilket fall metoden kan innefatta; bestämning av i) en andra eller ii) en andra och en tredje fluorescenslivstid för provets fluorescensemission; bestämning av intensiteter för fluorescensemission vid respektive fluorescenslivstid; och bestämning av mängden antikoagulant, som en funktion av intensiteterna för fluorescensemissionen vid respektive fluorescenslivstider.

Bestämning av en mängd warfarin innefattar också möjligheten att bestämma en koncentration av warfarin, eftersom ett koncentrationsvärde är associerat med ett mängdvärde. Således kan en ”mängd” tolkas som en ”koncentration” och vice versa, så länge koncentrationsvärdet kan bestämmas genom att använda mängdvärdet i kombination med ett volymvärde för provet.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls en anordning för mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som finns i ett prov, varvid 3 anordningen innefattar: en ljuskälla anordnad för att belysa provet med ljus för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid excitationen av provet resulterar i en fluorescerande emission av provet; mätningsorgan anordnade att mäta fluorescensemissionen från provet; och åtminstone en processor anordnad att i) bestämma en fluorescenslivstid för provets fluorescensemíssion, ii) bestämma en intensitet för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden, och iii) bestämma en mängd av antikoagulanten, som en funktion av fluorescensemissionens intensitet vid fluorescenslivstiden.

Den uppñnningsenliga apparaten kan innefatta organ för vara konfigurerad att utföra vilket som helst av särdragen beskrivna ovan och nedanför i samband med den uppfinningsenliga metoden, och har motsvarande fördelar. I synnerhet kan en andra eller en andra och en tredje fluorescenslivstid med associerade intensiteter bestämmas och användas för att estimera mängden.

Kortfattat medger den fluorufora egenskapen för Warfarins coumarin- ringstruktur (de Melo et al., J Phys. Chem. 1994, 98, 6054-6058) tidsupplöst fluorescensspektroskopisk detektion av detta läkemedel.

Senare forskning (Karlsson et al., J. Phys. Chem. B 2007, 1 l l, 10520- 10528) som använder sig av en serie av teoretiska och spektroskopiska studier som belyser warfarins komplexa karaktär, och i synnerhet dess mediumberoende isomering, kan illustrera varför till exempel spektroskopibaserade metoder för direkt bestämning av warfarin inte funnits tillhands.

Utredandet av förhållandet mellan molekylär miljö, isomerisk fördelning och de spektroskopiska särdragen för warfarin har oväntat tillhandahållit en grund för utveckling av Warfarindetekterings- och kvantifieringsmetoder, vilka kan särskilja warfarin i olika tillstånd, till exempel bundet till protein eller fri i plasma.

Såsom angett tillhandahåller uppfinningen tidsupplöst fluorescensspektroskopisk detektering och kvantifiering av warfarin som är bundet till protein eller fri i plasma. I detalj främjar detta en ny och alternativ metod för effektiv och direkt övervakning av warfarins effekt på blodkoagulering.

Kort beskrivning_av ritninsarna Utförningsformer av uppfinningen beslnivs härefter, genom exempel, med hänvisning till de bifogade schematiska ritningarna, i vilka fig. 1 visar en anordning enligt uppfinningen för detektering av en vitamin K-motverkande antikoagulant,. 4 fig. 2 visar användarutrustning som inkorporerar anordningen i fig. 1, fig. 3 visar ett flödesschema för mät- och analysmetod enligt en utföringsform av uppfinningen, och fig. 4 visar en mängd warfarin vid olika fluorescenslivstider och intensitetsvärden.

Detalierad beskrivning av föredragna utföringsforrner Med hänvisning till fig. 1 har en anordning 102 för detektering av vitamin K-motverkande antikoagulant en behållare 1 18 som innehåller ett prov 1 16 som skall analyseras för förekomsten av ett läkemedel såsom warfarin eller något annat derivat av coumarin.

En excitationsljusskälla 1 14 för att återupprepat belysa provet 1 16 med pulser av excitationsljus tillhandahålls. Ljuskällan 1 14 är företrädesvis en pulslaser men kan också vara en ljusemitterande diod (LED). En driv- och kontrollenhet 112 för ljuskällan innefattar en kraftkälla för lasern och är anordnad för att generera en startsignal l 10 till en fotontidtagningsenhet 124. Repetitionshastigheten för det exciterande ljuset är tillräckligt låg för att medge påtaglig ñrsvagning av fluorescensen för provet 1 16 före nästa excitationspuls. En pulsfrekvens av till exempel runt 1 MHz kan vanligtvis vara lämplig. Varaktigheten av pulsen för excitationsljuset ska vara väsentligt kortare än fluorescenslivstiden för fluoreforen (dvs. läkemedlet) för att få tillförlitliga livstidsmätningar.

En typisk fluorofor har en fluorescenslivstid inom området 0,02-20 ns och en lämplig längd av ljuspulsen kan vara i storleken 0,001 ns. Pulsfrekvensen är ett exempel på en parameter som vanligtvis justeras för provet som undersöks. l tillägg underlättar ljuskällan 1 14 och driv- och kontrollenheten l 12 för ljuskållan justering av andra parametrar såsom antalet pulser och intensiteten för excitationsljuset för att ta hänsyn till tillexempel mängden fluorofor i provet, erforderlig mätnoggrannhet ßr resultatet etc.. Ljuskällor, såsom pulslasrar eller ljusemitterande dioder med ovan beskrivna särdrag och med tillhörande driv- och kontrollenheter är kända inom teknikområdet och är kommersiellt tillgängliga.

Positionerad angränsande behållaren 1 18 som innehåller provet 1 16 är en fotodetektor 120 vilken har som syfte att detektera de emitteracle fluorescenta fotonerna. Olika optiska komponenter är placerade mellan provet 1 18 och detektorn 120. Till exempel används flera linser för att maximera mängden fluorescerande ljus som samlas från provet 1 18 och för att fokusera ljuset på detektorn 120. Vidare 5 kan dikroiska speglar och filter användas för att välja ett våglängdsomräde för att förhindra excitationsljuset från att nå detektorn 120, så att enbart ljus som har ett väglångdsomräde som motsvarar fluorescensspektrat för fluoreforen när detektorn 120.

En optisk komponent kan också användas för att dela upp det fluorescerande ljusets ljusstråle i flera ljusstrålar som sedan riktas mot olika detektorer. Denna stråluppdelning kan uppnås på olika sätt, till exempel genom att använda en stråldelningskub eller genom att använda flergrenad fiberoptik. Sådana komponenter är välkända inom teknikomrädet och är kommersiellt tillgängliga på marknaden.

Fotodetektorn 120 innefattar ett fotonräknande fotomultiplikatorrör (PMT) men andra detektorer såsom en lavinfotodiod kan användas. Signalen från fotodetektorn 120 är vanligtvis förstärkt i en för-förstärkare 122. Efter förstärkning kan signalen gå igenom en diskriminatorenhet som tar bort oönskat brus från signalen och som enbart behåller de elektriska pulser som genereras av fotonerna på PMTn. Diskriminatorenheten är sedan kopplad till en fotontidsräkningsenhet 124.

Fotontidsräkningsenheten 124 innefattar en snabb analog-till-digital- omvandlare (A / D-omvandlare) och ett minne för att lagra datapunkter. Såsom nämnt ovan är det möjligt för mer än en foton per excitation, vilka resulterar från excitationsljuspulsen, att registreras av fotodetektorn 120 och fotontidsberäknings- enheten 124. En foton som detekteras av PMT:n kommer att ge en out-put-puls och för att identifiera en PMT-pulsposition i tiden insamlas ett lämpligt antal (såsom 6- 10) datapunkter per puls.

De insamlade datapunkterna analyseras medelst en modul 126 för bestämning av ankomsttid vilken realiseras som en mjukvaruprograrnsmodul som tillhör antingen fotontidsberäkningsenheten 124 eller alternativt en extern dator 130, för att bestämma fluorescensfotonernas ankomsttid. Exempel på lämpliga algoritmer för ankomsttidsberäkning är kända inom teknikomrädet och implementeras i befintliga utrustningar.

En analysmodul 132 är anordnad att motta och analysera en. uppsättning fotonankomsttider från modulen 126 för bestämning av ankomsttid.

Denna modul 132 är företrädesvis en mjukvarumodul 131 som är implementerad i och som exekveras på datorn 130. Datorn 130 är en mikroprocessor med en associerad minnesanordning (ej visad) men kan vara en konventionell PC. 6 Mikroprocessorn 130 är utrustad med kommunikationsorgan (ej visade) som år kopplade till andra enheter i systemet 102.

Installerad i och exekverad i mikroprocessorn 130 finns också en mjukvaruprogrammodul 133 för måtstyming. Såsom fackmannen inser kan installation och exekvering av mjukvarumodulerna 126, 132 och 133 i sig utföras på olika sätt och i olika datorkonfigurationer. Till exempel kan mätkontrollenheten exekveras i en PC lämpad för laboratorieförhållande, modulen 126 för bestämning av ankomsttid kan byggas in i fotontidstagriingsenheten, och analysmodulen 132 i en specialmaskin konstruerad för de höga beråkningshastigheter som behövs för viss analys.

Fotodetektorn 120, för-förstärkaren 122 och fotontidstagningsenheten 124 kan i kombination ses som måtorgan anordnade att mäta fluorescensemissionen från provet 1 16, medan datorn 130 kan vara processorn som exekverar mjukvara som implementerar nedan beskrivna metod.

Anordningen 102 år emellertid företrädesvis inbyggd i en liten bärbar enhet 202 såsom illustrerad i fig. 2. Denna enhet 202 har en LCD-display 204 för användarinteraktion och kontrollknappar 206, 208 för kontroll av apparaten via kommandon såsom ”på/av”, ”utför mätning” etc.. En behållare 210 år anordnad på apparatens 202 framsida för att motta provet, och återstående komponenter i apparaten i fig. 1 år anordnade inuti den bärbara apparaten 202. Företrådesvis drivs apparaten 202 med hjälp av ett internt batteri men en adapterenhet kan likaväl användas.

Såsom kommer att beskrivas nedan bestäms ganska specifika vården för fluorescenslivstider och associerade intensitetsvården då warfarin år läkemedlet som skall detekteras, vilket gör att komponenterna i anordningen 102 kan optimeras och således göra mindre när de används i apparaten 202.

Med hänvisning till fig. 3 beskrivs metoden som utförs i anordningen, vilken utför steg för mätning av vitamin K-motverkande antikoagulant såsom warfarin som finns i provet 116.

Metoden kan implementeras i form av rnjukvaruinstruktioner, dvs. ett datorprogram för att utföra de häri beskrivna metodema för enklare utveckling skrivas på ett högnivåspråk såsom Java, C och/ eller C++ men också på andra programspråk såsom, men en begränsat till, tolkade språk. En del moduler och rutiner kan skrivas i assembly eller i mikrokod för att förbättra prestanda och / eller minnesanvåndning. Det uppskattas vidare att funktionaliteten för en eller samtliga 7 av de funktionella stegen i metoden kan också implementeras genom att använda diskreta hårdvarukomponenter, eller en eller flera applikationsspecifika, integrerade kretsar, eller en programmerad digital signalprocessor eller mikroprocessor.

I metoden belyses 304 först provet 1 16 med ljus från ljuskällan 1 14 vilket exciterar antikoagulanten genom antikoagulantens ljusabsorbtion.

Excitationen av provet 1 16 resulterar i en fluorescensemission från provet 1 16, och denna fluorescensemission mäts 306. Härnäst bestäms 308 en fluorescenslivstid T1 för fluorescensemissionen, och efter detta bestäms 310 en intensitet A1 för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden T1. Slutligen bestäms 3 12 en mängd eller en koncentration c av antikoagulanten som en funktion av intensiteten A1 vid fluorescenslivstiden T1.

En andra fluorescenslivstid T2 för fluorescensemissionen från provet 1 16 kan bestämmas 308b, vilket kan göras samtidigt som bestämningen av den första fluorescenslivstiden T1. En intensitet A2 för fluorescensemissionen vid den andra fluorescenslivstiden Tg bestäms också 310b (vid samma tid och på samma sätt som bestämningen av den första intensiteten A1). I detta fall, när mängden c av antikoagulanten bestäms, bestäms 312b mängden också som en funktion av den andra intensiteten A2 vid den andra fluorescenslivstiden Tg genom att använda värdena för Tg och A2 på ett liknande sätt som för T1 och A1. Genom att ta med intensiteten för den andra fluorescenslivstiden i beräkningen är det möjligt att göra en mer ”noggran” bestämning av mängden warfarin, eftersom olika tillstånd (tex. obunden warfarin eller warfarin bundet till någon protein) för warfarin visar sig ha olika fluorescenslivstider.

För samma syfte kan en tredje fluorescenslivstid 'P3 och en tredje intensitet A3 vid den tredje fluorescenslivstiden T3 bestämmas och användas på ett liknande sätt. Detta i kombination med den andra livstiden T; och intensiteten A2, är särskilt relevant om warfarins bindning till HSA skall tas med i beräkningen vid bestämning av det bästa (unika) terapeutiska fönstret för olika individer.

Relevansen för olika livstider och intensiteter har påvisats vid tester med hjälp av tidsupplöst fluorescensspektroskopiska mätningar i vilka warfarins bindning till HSAi PBS (fosfastbuffrad saltlösning) buffert undersöktes.

Under dessa tester kunde det observeras att excitation vid 334 nm ger information om interaktionen för en avprotoniserad (eng: deprotonated) form av warfarin och HSA med tre tydligt urskiljbara fluorescenslivstider med Ti < 100 ps, T2=1-l,5 ns och T3=3~4 ns. Vid excitation vid 334 nm, samtidigt som HSA inte 8 exciteras, bidrar den avprotonerade formen av warfarin till den observerade emmisionen. Isolerad warfarin i PBS gav en icke-upplöst livstid i exciterat tillstånd, dvs. T1s 100 ps. Från dessa experiment observerades det att den kortaste fluorescenslivstiden som uppmättes (Tl) uppkom från den fria, obundna delen av warfarin lösningen, vilken var tillgänglig för huvuddelen av lösningen, medan de två längre livstiderna (T 2, Te.) uppkom, från till HSA-bundna tillstånd. Således har det kunnat påvisats att användning av olika livstider förbättrar noggrannheten vid bestämning av lämplig warfarindosering för varje patient.

Bestämningen av mängden c kan innefatta jämförelse av intensiteten A1, A2, A3 för åtminstone någon fluorescenslivstid T1, T2, T; med ett känt intensitetvärde Afefi, Area, Aæß associerat med ett bestämt (känd) mängdvärde cfef. På ett liknande sätt kan bestärnningen av c innefatta jämförelse av åtminstone en fluorescenslivstid T1, T2, T3 med en känd fluorescenslivstid Trefl, Tæf2, Tmß associerat med ett bestämt mängdvärde cref.

Denna jämförande operation illustreras ytterligare av diagrammet i fig. 4 där x-axeln representerar den totala mängden warfarin (vilken hänför sig till mängden warfarin) som finns i ett prov av människoblod (vilket väsentligen motsvarar mängden som finns i en PBS-buffer), och y-axeln representerar det uppmätta intensitetsvärdena (Ann, Ang, Areß) som ett procenttal av den totala mängden warfarin (cmf), dvs. summan av Aten, Aæf2, och Amß är 100 % eller 1,00.

Eftersom varje intensitet (arnplitud) är förknippad med en relativt konstant fluorescenslivstid (Trefl, Tm2, Treß) är det möjligt att bestämma hur mycket warfarin som är bundet till protein och hur mycket som inte är det.

Såsom indikerat motsvarar intensitetsvärdena och fluorescenslivstiderna i fig. 4 referensvärdena Afefl, Amra, Amra och Tfefi, Tfem, Tfefa OCh gßl-'IOIH att kåïlfla till A1, A2, Aß, och Tl, T2, T3 och genom att jämföra dessa värden med referensvärdena så kan mängden warfarin utläsas från diagrammet.

För att förbättra jämförelsen kan bestärnningen av mängden c innefatta användning av regressionsanalys för anpassning av åtminstone ett (men företrädesvis samtliga) intensitetsvärde A1, A2, A3 för en fluorescenslivstid T1, T2, T3 med ett känt intensitetsvärde Area, Anm, Amra associerat med ett bestämt mängdvärde cæf. Det samma gäller för fluorescenslivstiden T1, T2, T3, dvs. bestämningen av mängden c kan innefatta användning av regressionsanalys för anpassning av åtminstone en fluorescenslivstid T1, T2, T3 med en känd fluorescenslivstid Tfefl, Tfem, Trefl; associerad med ett bestämt mängdvärde cref. 9 Användning av regressionsanalys av detta sätt är ett exempel på att använda korrelaüon mellan fluorescenslivstiderna T1, T2, T3 och kända fluorescenslivstider Tfefl, Trefg, Tfeß associerade med ett bestämt mängdvärde cæf, och andra metoder kan likaväl användas.

Metoden kan också innefatta beräkning av en sannolikhetsfördelning vid beståmningen 310 av ett intensitetsvärde A1, A2, A3 för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden T1, Tg, Tg. För detta syfte samt för utföring av ovannämnda regressionsanalys kan det allmänt tillgängliga GNU Scientific Library användas.

Såsom indikerat innefattar mätningen av fluorescensemissionen från provet utförande av tidsupplösta fluorescensspektroskopiska mätningar. Ljuset från ljuskällan som används har en väsentligen konstant våglängd, och har mer specifikt en våglängd som är lämplig för excitering av warfarin, såsom en våglängd mellan 305 nm till 350 nm, eller mer specifikt 334 nm. För att förbättra resultatet kan provet 1 16 röras runt när mätningarna för fluorescensemissionen utförs, vilket betyder att behållaren innefattar omrörningsorgan.

För att illustrera ett numeriskt exempel som använder diagrammet i fig. 4, kan ett blodprov från en patient typiskt uppvisa en första fluorescenslivstid T1 med ett uppmätt intensitetsvärde Am av 0,51. I detta fall, såsom de streckade linjerna indikerar i fig. 4, är den uppmätta mängden warfarin cm då 6,25 uM.

Således jämförs den uppmätta intensiteten för den första fluorescenslivstiden med kända intensitetsvärden (värdena på y-axeln i fig. 4) som är associerade med ett bestämt warfarinmängdvärde (värdena på x-axeln i fig. 4).

Eftersom en lärnplig kurva (den för den första fluorescenslivstiden) används, inkluderar bestämningen av mängden också jämförelse av fluorescenslivstiden med en känd fluorescenslivstid (dvs. med en av kurvorna i diagrammet i fig. 4) som är associerad med ett bestämt warfarinmängdvärde. Även om de numeriska exemplen diskuterar den första fluorescenslivstiden så gäller samma sak för den andra och tredje fluorescenslivstiden. Naturligtvis, för att förbättra resultatet kan olika statistiska metoder användas för att vikta de uppmätta värdena A1, A2, A3 för att förbättra resultatet, tex. de på grund av varierande mätnoggrannhet ger något olika rnängdvärden.

Om en koncentration ska bestämmas från mängden warfarin så divideras mängden warfarin med volymen av provet för vilken mängden bestämdes. 10 Vidare kan fördelningen av A1, A2, A; användas för att analysera Warfarinets tillstånd (obundet eller en typ av bunden warfarin).

Mängden warfarin kan också användas för att bestämma en koagulationstid för blodet. Koagulationstid är emellertid ofta individuell för patienten från vilken provet togs, och för att korrelera koagulationstiden med ett mängd / koncentrationsvärde för warfarin kan empiriska metoder användas, dvs. en uppsättning koagulationstider bestäms för en uppsättning blodprov som har olika mängd/ koncentrationsvärden för warfarin. När korrelationen väl är utförd sä är kunskap om Warfarinets mängd/ koncentrationsvärde tillräckligt för att bestämma om läkemedlet är inom sitt terapeutiska fönster.

Exempel Vid genereringen av datan (se fig. 4) som är nödvändig för att bestämma mängden i ett godtyckligt prov så som beskrivits ovan, användes en experimentell version av anordningen i fig. 1 för mänskligt blod buffrat med en fostfatbuffrad saltlösning (PBS). Det skall noteras att även om en bufferlösning användes, så erhålls väsentligen samma resultat för blod som fås direkt från en människa. I vilket fall fungerar den experimentella apparatversionen på samma sätt som apparaten 102 i ñg. 1.

I den experimentella apparatversionen utfördes tidsupplöst iluorescensspektroskopiska mätningar i ett tidskorrelerat system för mätning av enskilda fotoner (TCSPC), IBH SOOOM (Jobin Yvon IBH Ltd., Glasgow, UK).

Fluorescenslivstiderna (sönderfallstiderna) T; med associerade amplituder A1 bestämdes genom att använda en ljusemitterande diod, NanoLED-17 (HORIBA J obin Yvon IBH) som alstrade 334 nm (bindningsexperiment för warfarin-mänsklig blodplasmai PBS) och excitationspulser vid 1,0 MHz upprepningshastigheter. En monokromator med singel-gitter (modell SOOOM IBH) med en spektral bandbredd inställd på 32 nm användes. Datan samlades in i 4048 kanaler och tidskalibreringen var 13,4 ps / kanal. Fluorescensemissionen detekterades med en IBH TBS-O4 fotondetekteringsmodul vid TCSPC-förhällanden, och den fulla bredden vid halvt maximum (fwhm) för den instrumentala responsfunktionen var typiskt runt 560 ps, vilken mättes med en upphängning (eng: suspension) av kiselpartiklar (Ludox TMA-34 Sigrna-Aldrich) upplösta i avj oniserat vatten.

Alla experiment utfördes genom att mäta kinetiken, huvudsakligen vid 390 nm (bindningsexperiment för warfarin-mänskligt blodplasma i PBS) vid en ll vinkel av 90” i förhållande till excitationsljuset. Tidsupplöst fluorescensdata analyserades genom användning av IBH DAS6 mjukvara för sönderfallsanalys, vilken fungerar baserat på algoritmer för minsta kvadratanpassning och rekonvultion med experimentell svarsfunktion. Tre sönderfallstider behövdes generellt för att erhålla tillfredställande resultat, dvs. X2 s 1,2.

Anpassningsresultaten från tids-(t)-beroendet presenterades som amplituder (Ai) och sönderfallstider (Ti) i förhållande till ekvationen (2): I I l F(t) = A0 + Ale f* + Aze ”2 + A3e 73 Nyligen frusen plasma erhölls och initialt samlades mänskligt blod i rör med additiv av citrat. I ett andra steg separerades plasma genom centrifugering vid 3000-3500xg vid rumstemperatur i 20 min och lagrades slutligen vid ~80°C.

Bufferlösningen som användes var fostatbuffrad saltlösning (PBS) bestående av 0,5 M Na2HPO4 (Scharlau)/ KH2PO4 (Merck) och 0,1 M NaCl vid pH 7,3.

Samtliga fluorescensspektroskopiska mätningar utfördes typiskt under kontinuerlig omrörning genom att använda en standard kvarts-cuvett (1 cm strålgång, total volym 3 ml) vid rumstemperatur. Före fluorescensexperimenten, vilka studerade bindningen av warfarin till blodserumplasmaproteiner, tinades prov av nyligen frusen plasma till 37 °C och alikvoter (600 ul) blandades såsom kan ses i tabellen nedan med olika mängder inom det terapeutiska fönstret för läkemedlet (0,1 - 14 pM) warfarin i PBS (total volym 2 ml, inkuberingstiden 10 min).

Data erhållen från experimenten visas i tabell 1 nedan.

Livstider (ns) Amplitud (%L [Warfarin] pM 1:1 172 Ta A1 A2 A3 X2 PLASMA 0 0.07 1.9 8.4 87 7 6 1.04 (14 mg/mL) 0.5 0.07 1.8 7.8 84 1 l 6 1.09 10 0.15 1.5 4.3 44 43 14 1.18 HSA (O,65 mg/mL) 10 0.22 1.3 3.7 25 46 29 0.82 Tabell 1 12 Även om olika utiöringsforrner av uppfinningen beskrivits och visats så är uppfinningen inte begränsad till dessa utarnkan också utformas på andra sätt genom ramen för det som anges i följande krav. I synnerhet kan uppfinningen implementeras genom att använda andra tekniker för att excitera ett prov. Till exempel kan skinnet eller ögat på en patient belysas varefter fluorescensemissionen från ett läkemedel i skinnet/ ögat sedan mäts. Efterföljande steg år sedan liknande med tekniken som används när provet och blod eller någon annan kroppsvätska, men som angivet, måste”provet” inte nödvändigtvis avlägsnas eller tas från en patient.

Claims (12)

13 PATENTKRAV

1. Metod för mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som finns i ett prov (1 16), varvid metoden innefattar: belysning (304) av provet (116) med ljus från en ljuskälla (1 14) för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid exeitationen av provet (1 16) resulterar i fluorescensemission från provet (116), mätning (306) av fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (308) av en fluorescenslivstid (T1) för fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (310) av en intensitet (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (Tl), och bestämning (312) av en mängd (e) av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (T1).

2. Metod enligt krav 1, vidare innefattande stegen: bestämning (308b) av en andra fluorescenslivstid (T2) för fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (310b) av en intensitet (A2) för fluorescensemissionen vid den andra fluorescenslivstiden (T2), och bestämning (312b) av mängden (c) antikoagulant, som en funktion av intensiteten (A2) för fluorescensemissionen vid den andra fluorescenslivstiden (T2).

3. Metod enligt krav 2, vidare innefattande stegen: bestämning (308c) av en tredje fluorescenslivstid (Ta) för fluorescensemissionen från provet (1 16), bestämning (310c) av en intensitet (A2) för fluorescensemissionen vid den tredje fluorescenslivstiden (T3), och bestämning (3120) av mängden (c) antikoagulant, som en funktion av intensiteten (A2) för fluorescensemissionen vid den tredje fluorescenslivstiden (Tg).

4. Metod enligt något av kraven 1-3, varvid bestämningen (312) av mängden (c) innefattar järnfórelse av intensiteten (A1; A2; A3) för åtminstone en fluorescenslivstid (T1; T2; T3) med ett känt intensitetsvärde (Amfu Alan; Amra) associerat med ett bestämt mängdvärde (cfef).

5. 4. Metod enligt något av kraven 1-4, varvid bestämningen (312) av mängden (c) innefattar jämförelse av åtminstone en fluorescenslivstid (T1; Tz; T s) 14 med en känd fluorescenslivstid (Tfefß Trefg; Tfeß) associerad med ett bestämt mängdvärde (cfei).

6. Metod enligt något av kraven 1-5, varvid bestämningen (3 12) av mängden (c) innefattar användning av regressionsanalys för anpassning av åtminstone ett intensitetsvärde (A1; A2; A3) för en fluorescenslivstid (T1; Tg; Tg) med ett känt intensitetsvärde (Area: Anm; Afeß) associerat med ett bestämt mängdvärde (Cref).

7. Metod enligt något av kraven 1-6, varvid bestämningen (312) av mängden (c) innefattar användning av korrelation mellan åtminstone en fluorescenslivstid (T1; Tg; T3) och åtminstone en känd fluorescenslivstid (Trefg Trefg; Treß) associerad med ett bestämt mängdvärde (cfef).

8. Metod enligt något av kraven 1-7, varvid mätningen (306) av fluorescensemissionen från provet (1 16) innefattar utförande av tidsupplösta fluorescensspektroskopiska mätningar.

9. Metod enligt något av kraven 1-8, varvid den vitamin K-motverkande antikoagulanten är ett syntetiskt derivat av coumañn.

10. Metod enligt något av kraven l-9, varvid den vitamin K-motverkande antikoagulanten är warfarin.

11. 1 1. Metod enligt något av kraven 1-10, varvid provet består av mänskligt prov.

12. Anordning fór mätning av en vitamin K-motverkande antikoagulant som finns i ett prov (1 16), varvid anordningen innefattar: en ljuskälla (1 14) anordnad att belysa (304) provet (1 16) med ljus för att excitera antikoagulanten genom dess absorption av ljuset, varvid exciteringen av provet (1 16) resulterar i en fluorescensemission från provet (1 16), mätorgan (120, 122, 124) anordnade att mäta fluorescensemission från provet (1 16), och åtminstone en processor (130) anordnad att - bestämma en fluorescenslivstid (T1) för fluorescensemissionen från provet (1 16) - bestämma en intensitet (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (Ti), och - bestärnma en mängd (c) av antikoagulanten, som en funktion av intensiteten (A1) för fluorescensemissionen vid fluorescenslivstiden (T1).