RU2829857C9 - Варианты скваленгопенциклазы (shc) - Google Patents
Варианты скваленгопенциклазы (shc) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2829857C9 RU2829857C9 RU2022114050A RU2022114050A RU2829857C9 RU 2829857 C9 RU2829857 C9 RU 2829857C9 RU 2022114050 A RU2022114050 A RU 2022114050A RU 2022114050 A RU2022114050 A RU 2022114050A RU 2829857 C9 RU2829857 C9 RU 2829857C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- shc
- variant
- hac
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 846
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 846
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 823
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 362
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 362
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 153
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 146
- YPZUZOLGGMJZJO-LQKXBSAESA-N ambroxan Chemical compound CC([C@@H]1CC2)(C)CCC[C@]1(C)[C@@H]1[C@]2(C)OCC1 YPZUZOLGGMJZJO-LQKXBSAESA-N 0.000 claims abstract description 119
- YPZUZOLGGMJZJO-UHFFFAOYSA-N ambrofix Natural products C1CC2C(C)(C)CCCC2(C)C2C1(C)OCC2 YPZUZOLGGMJZJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 118
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 80
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108091000048 Squalene hopene cyclase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 112
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 34
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 30
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 26
- KOICZDDAVPYKKX-NCZFFCEISA-N (3e,7e)-4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trien-1-ol Chemical class CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CCO KOICZDDAVPYKKX-NCZFFCEISA-N 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 102200065287 rs199924386 Human genes 0.000 claims description 13
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 338
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 30
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102100022340 SHC-transforming protein 1 Human genes 0.000 description 828
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 785
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 759
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 71
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 69
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 69
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 66
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 66
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 59
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 58
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 58
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 56
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 51
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 51
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 49
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 41
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 20
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 18
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 241000640374 Alicyclobacillus acidocaldarius Species 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 10
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 10
- KOICZDDAVPYKKX-UHFFFAOYSA-N (3E,7Z)-4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trien-1-ol Chemical compound CC(=C/CCO)CCC=C(/CCC=C(C)C)C KOICZDDAVPYKKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 9
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 8
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 7
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 7
- 241001594094 Gluconobacter morbifer Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000589212 Acetobacter pasteurianus Species 0.000 description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 6
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 6
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 6
- 102220085520 rs864309581 Human genes 0.000 description 6
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000970324 Kitasatospora albolonga Species 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 102220057396 rs150354152 Human genes 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 3
- 241001646647 Burkholderia ambifaria Species 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000187804 Frankia alni Species 0.000 description 3
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 description 3
- 241000863394 Pelobacter carbinolicus Species 0.000 description 3
- 241000190950 Rhodopseudomonas palustris Species 0.000 description 3
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 3
- 241000206216 Teredinibacter turnerae Species 0.000 description 3
- 241000248418 Tetrahymena pyriformis Species 0.000 description 3
- 241001313699 Thermosynechococcus elongatus Species 0.000 description 3
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HHXYJYBYNZMZKX-PYQRSULMSA-N 22(29)-Hopene Chemical compound C([C@]1(C)[C@H]2CC[C@H]34)CCC(C)(C)[C@@H]1CC[C@@]2(C)[C@]4(C)CC[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@@H]1C(=C)C HHXYJYBYNZMZKX-PYQRSULMSA-N 0.000 description 2
- HHXYJYBYNZMZKX-UHFFFAOYSA-N 3,4:15,16-diepoxy-7-oxo-13(16),14-clerodadien-20,12-olide-(3alpha,4alpha)-form Natural products C12CCC3C4(C)CCCC(C)(C)C4CCC3(C)C1(C)CCC1C2(C)CCC1C(=C)C HHXYJYBYNZMZKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 229930186351 Hopene Natural products 0.000 description 2
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIYYUMANFSBVAV-MZIWDXLGSA-N (3r,3as,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13ar,13bs)-5a,5b,8,8,11a,13b-hexamethyl-3-propan-2-yl-1,2,3,3a,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysen-9-ol Chemical compound C([C@]1(C)[C@H]2CC[C@H]34)C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]1CC[C@@]2(C)[C@]4(C)CC[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@@H]1C(C)C KIYYUMANFSBVAV-MZIWDXLGSA-N 0.000 description 1
- XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N (4as,6as,6br,8ar,9r,10s,12ar,12br,14bs)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-9-[(sulfooxy)methyl]-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid Chemical compound C1C[C@H](O)[C@@](C)(COS(O)(=O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- DLTTWXWDLCGBRD-UHFFFAOYSA-N Hydroxyhopane Natural products CC12CCCC(C)(C)C1CCC1(C)C2CCC2C3(C)CCC(C(C)C)C3(O)CCC21C DLTTWXWDLCGBRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200099204 rs4280262 Human genes 0.000 description 1
- 102220106769 rs879255496 Human genes 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 description 1
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N taurodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения (-)-амброкса в изомерно чистой форме или в смеси, включающий ферментативное превращение (3E, 7E)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс в изомерно чистой форме или в смеси, с использованием варианта фермента SHC (сквален-гопен-циклаза)/НАС(гомофарнезол-амброкс-циклаза), где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно, и где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1, где одна или более аминокислотных модификаций в положениях 81, 431, 557 или 613 представляют собой замены, предпочтительно неконсервативные замены. Изобретение позволяет эффективно получать (-)-амброкс. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 16 ил., 19 табл., 17 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в общем относится к ферментам SHC/HAC и их вариантам. Настоящее изобретение, кроме того, относится к разным применениям ферментов SHC/HAC и их вариантов, например для ферментативного превращения (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) в (-)-амброкс или для ферментативного превращения Е,E-бисгомофарнезола (BisEEH) а оксид амбры. Настоящее изобретение также относится к продуктам ферментативных реакций, например к (-)-амброксу или оксиду амбры, полученным с использованием ферментов SHC/HAC и их вариантов, и к разным применениям указанных продуктов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Скваленгопенциклазы (SHC) представляют собой мембраносвязанные ферменты, которые действуют в качестве биокатализаторов для циклизации линейного тритерпеноида сквалена до гопена и гопанола.
Было продемонстрировано, что целый ряд ферментов SHC дикого типа и вариантов из широкого спектра бактерий являются полезными для превращения (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) в (-)-амброкс (см., например, WO 2016/170099; WO 2018/157021; Neumann & Simon 1986, Biol Chem Hoppe-Seyler 367, 723-729; JP 2009060799; Seckler & Poralla 1986, Biochem Biophys Act 356-363; Ochs et al. 1990, J Bacterid 174, 298-302; WO 2010/139719; US 8759043; WO 2012/066059; Seitz et al. 2012, J Molecular Catalysis B: Enzymatic 84, 72-77 и PhD диссертацию Seitz 2012 (http://elib.uni-stuttgart.de/handle/1_1682/1400), содержание которых включено в данное описание изобретения посредством ссылки). Желательно предложить новые и улучшенные способы получения (-)-амброкса, например с использованием новых ферментов SHC или вариантов ферментов. Также желательно предложить новые и улучшенные способы циклизации других субстратов, например с образованием соединений, полезных в ароматизаторах или в качестве ароматизаторов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смеси, содержащей (-)-амброкс, с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1,
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен (-)-амброкс, полученный или получаемый способом по первому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложено применение (-)-амброкса по второму аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение, в качестве части ароматизатора или косметического, или потребительского продукта.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предложен ароматизатор, или косметический, или потребительский продукт, содержащий (-)-амброкс по второму аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно пятому аспекту настоящего изобретения предложен вариант фермента SHC/HAC, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1,
где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет модификации аминокислот относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T, соответственно, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC, кроме того, имеет модификации аминокислот относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
Согласно шестому аспекту настоящего изобретения предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант фермента SHC/HAC по пятому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно седьмому аспекту настоящего изобретения предложена конструкция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по шестому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно восьмому аспекту настоящего изобретения предложен вектор, содержащий конструкцию по седьмому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно девятому аспекту настоящего изобретения предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по шестому аспекту настоящего изобретения, конструкцию по седьмому аспекту настоящего изобретения или вектор по восьмому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно десятому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием варианта фермента SHC/HAC, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, и где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 557, 81, 431 и 613 в SEQ ID NO: 1.
Согласно одиннадцатому аспекту настоящего изобретения предложен вариант фермента SHC/HAC, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, и где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 557, 81, 431 и 613 в SEQ ID NO: 1.
Согласно двенадцатому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC, где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Согласно тринадцатому аспекту настоящего изобретения предложен фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Согласно четырнадцатому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения оксида амбры, включающий ферментативное превращения Е,Е-бисгомофарнезола или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей Е,Е-бисгомофарнезол, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC. Фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, например, может находиться в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения.
Согласно пятнадцатому аспекту настоящего изобретения предложен оксид амбры, полученный или получаемый способом по четырнадцатому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
Согласно шестнадцатому аспекту настоящего изобретения предложено применение оксида амбры по пятнадцатому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение, в качестве части ароматизатора или косметического, или потребительского продукта.
Согласно семнадцатому аспекту настоящего изобретения предложен ароматизатор, или косметический, или потребительский продукт, содержащий оксид амбры по пятнадцатому аспекту настоящего изобретения, включая его любое воплощение.
В некоторых воплощениях любого аспекта настоящего изобретения вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и/или SEQ ID NO: 30.
В некоторых воплощениях любого аспекта настоящего изобретения вариант фермента SHC/HAC кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
Некоторые воплощения настоящего изобретения могут обеспечивать одно или более чем одно из следующих преимуществ:
• улучшенная скорость превращения ЕЕН, особенно в первые 12 часов или в первые 6 часов;
• циклизация новых субстратов и/или идентификация новых продуктов;
• улучшенная продуктивность (г/л/час или г/л/час/г биокатализатора);
• способ получения конечного продукта, такого как (-)-амброкс и оксид амбры и/или его смеси изомеров в промышленном масштабе;
• улучшенная селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола.
Подробности, примеры и предпочтения, предложенные в связи с любым конкретным одним или более заявленными аспектами настоящего изобретения, будут дополнительно описаны в описании изобретения и равным образом применимы ко всем аспектам настоящего изобретения. Любая описанная здесь комбинация воплощений, примеров и предпочтений во всех возможных ее вариациях охватывается настоящим изобретением, если здесь не указано иное или это иным образом явно противоречит контексту.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показаны относительные активности вариантов SHC в исходных и оптимизированных условиях реакции. Реакции проводили при 4 г/л ЕЕН и биокатализатора, загруженных до OD650нм (оптическая плотность при 650 нм) 10,0, либо при исходных условиях (35°С, рН 5,4, 0,070% SDS (додецилсульфат натрия)), либо при установках Т (температура), рН и [SDS], определенных как оптимальные для каждого из вариантов (оптимизированные условия).
На Фиг. 2 показана относительная активность вариантов SHC в оптимизированных условиях по сравнению с активностью родительского фермента SHC 215G2. Реакции проводили при 4 г/л ЕЕН и биокатализатора, загруженных до OD650нм 10,0, при установках Т, рН и [SDS], определенных как оптимальные для каждого из вариантов.
На Фиг. 3 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс вариантами фермента SHC/HAC в оптимальных условиях по сравнению с родительским ферментом SHC/HAC 215G2. Реакции проводили при 125 г/л ЕЕН и 250 г/л биокатализатора в присутствии 1,3% SDS (додецилсульфат натрия) и в условиях Т и рН, определенных как оптимальные для каждого из вариантов.
На Фиг. 4 показано относительное улучшение превращения ЕЕН наилучшими вариантами фермента SHC/HAC по сравнению с эталонным родительским ферментом SHC/HAC 215G2. Реакции проводили при 125 г/л ЕЕН и 250 г/л биокатализатора в присутствии 1,3% SDS и в условиях Т и рН, определенных как оптимальные для каждого из вариантов. Во все моменты времени превращение ЕЕН, полученное с SHC 215G2, было принято за 100% (эталон).
На Фиг. 5 показана относительная активность вариантов SHC/HAC в оптимальных условиях по сравнению с родительским (эталонным) ферментом SHC/HAC 215G2. Реакции проводили при 4 г/л BisEEH и биокатализатора, загруженных до OD650нм 10,0, при установках Т, рН и [SDS], определенных как оптимальные для каждого из вариантов.
На Фиг. 6 показана циклизация бисгомофарнезола родительским (эталонным) ферментом SHC/HAC 215G2 и новыми вариантами ферментов SHC/HAC. Реакции проводили при 125 г/л BisEEH и 250 г/л биокатализатора в присутствии 1,3% SDS и при 35°С, и рН 5,4 (все ферменты SHC).
На Фиг. 7 показано выравнивание аминокислотной последовательности SHC/HAC 215G2 (SEQ ID NO: 10) и вариантов фермента SHC/HAC №49 (SEQ ID NO: 2), №65 (SEQ ID NO: 3), №66 (SEQ ID NO: 4), №90C7 (SEQ ID NO: 17), №110B8 (SEQ ID NO: 5) и №115A7 (SEQ ID NO: 18).
На Фиг. 8 показано выравнивание аминокислотной последовательности 215G2 (SEQ ID NO: 10) и вариантов фермента SHC/HAC, полученными из 215G2, с одной или более заменами VI741, F601Y и L37Q.
На Фиг. 9А показано выравнивание аминокислотной последовательности с использованием CLUSTAL О (1.2.4) AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) и TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13) и GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14). Положения аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа выделены белой буквой на темном фоне.
На Фиг. 9Б показано выравнивание аминокислотной последовательности с использованием CLUSTAL О (1.2.4) AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) и TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13), GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), Bme SHC дикого типа (SEQ ID NO; 28), SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29) и ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30), положения аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа выделены белой буквой на черном фоне.
Фиг. 10 представляет собой схему реакции, используемую для получения исходной смеси E,E/Z-бисгомофарнезола.
Фиг. 11 представляет собой схему реакции, демонстрирующую циклизацию бисгомофарнезола ферментами SHC. Использованный бисгомофарнезол состоял из смеси изомеров.
На Фиг. 12 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс вариантами фермента SHC/HAC в оптимальных условиях по сравнению с родительским ферментом SHC/HAC 216G2. Реакции проводили при 125 г/л ЕЕН и 250 г/л биокатализатора в присутствии 1,3% SDS и в условиях Т и рН, определенных как оптимальные для каждого из вариантов.
На Фиг. 13 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс вариантами фермента SHC/HAC в оптимальных условиях по сравнению с родительским ферментом SHC/HAC 215G2. Реакции проводили при 125 г/л ЕЕН и 125 г/л биокатализатора в присутствии 0,65% SDS и в условиях Т и рН, определенных как оптимальные для каждого из вариантов.
На Фиг. 14 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс вариантом SHC №65 фермента SHC/HAC в оптимальных условиях по сравнению с родительским ферментом SHC/HAC 215G2. Реакции проводили при от 125 г/л до 300 г/л ЕЕН и либо при 250 г/л биокатализатора, либо при отношении [ЕЕН]:[клетки] 1. SDS поставляли при постоянном отношении [SDS]:[клетки] 0,052. Реакции проводили в условиях Т и рН, определенных как оптимальные для варианта SHC SHC №65.
На Фиг. 15 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13), Bme SHC дикого типа (SEQ ID NO; 28), GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29), TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11) и ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12). Реакции проводили при 4 г/л ЕЕН для всех перечисленных ферментов SHC дикого типа и при 125 г/л ЕЕН для всех перечисленных ферментов SHC дикого типа, отличных от ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30), SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29), TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19) и ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12). Реакции проводили в условиях Т и рН, и концентрации SDS, определенных как оптимальные для каждого перечисленного фермента SHC дикого типа. Концентрацию SDS корректировали при биопревращении 125 г/л ЕЕН для обеспечения наилучшей активности биокатализатора.
На Фиг. 16 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс посредством SHC/HAC. Биопревращения проводили с использованием биокатализатора SHC №65. Реакции проводили при 125 г/л ЕЕН со 150 г/л клеток при 45°С и рН 5,6 и в присутствии от 0,060 до 0,090% SDS, что соответствует отношению [SDS]:[клетки], варьирующему от 0,040 до 0,060. Указаны значения превращения ЕЕН при 72 ч реакции.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность SHC Alicyclobacillus acidocaldarius (Аас) дикого типа.
SEQ ID NO: 2 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, A557T и H431L, и может здесь упоминаться как вариант №49 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 3 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, A557T и R613S, и может здесь упоминаться как вариант №65 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 4 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, Y81H, A557T и R613S, и может здесь упоминаться как вариант №66 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 5 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, Y81H, H431L и A557T, и может здесь упоминаться как вариант №110В8 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 6 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 2 (вариант №49 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 3 (вариант №65 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 4 (вариант №66 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 9 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 5 (вариант №110В8 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 10 может называться 215G2 и соответствует аминокислотной последовательности AacSHC дикого типа с мутациями M132R, A224V и I432T.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность ZmoSHC1 дикого типа.
SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность ZmoSHC2 дикого типа.
SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность BjpSHC/BjaSHC дикого типа.
SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность GmoSHC дикого типа.
SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую AacSHC дикого типа.
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую SHC 215G2.
SEQ ID NO: 17 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, Т90А и R613S, и может здесь упоминаться как вариант №90С7 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 18 соответствует SEQ ID NO: 1 с заменами M132R, A224V, I432T, A172T и M277K и может здесь упоминаться как вариант №115А7 фермента SHC/HAC.
SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность TelSHC дикого типа.
SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность ApaSHC1 дикого типа.
SEQ ID NO: 21 представляет собой вариант GmoSHC.
SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 17 (вариант №90С7 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 23 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 18 (вариант №115A7 фермента SHC/HAC).
SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность варианта SHC 215G2 SHC/HAC с дополнительной мутацией L37Q.
SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность варианта SHC 215G2 SHC/HAC с дополнительной мутацией V174I.
SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность варианта SHC 215G2 SHC/HAC с дополнительными мутациями V174I и F601Y.
SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность варианта SHC 215G2 SHC/HAC с дополнительными мутациями L37Q, V174I и F601Y.
SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность дикого типа BmeSHC.
SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислотную последовательность SalSHC дикого типа.
SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность ApaSHCA дикого типа.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ФЕРМЕНТЫ SHC/HAC И ИХ ВАРИАНТЫ
Термин «фермент SHC», как он здесь используется, означает фермент скваленгопенциклазу дикого типа (WT), который встречается в природе, например, у термофильной бактерии, такой как Alicyclobacillus acidocaldarius. SHC, которые работают при циклизации гомофарнезола до амброкса, также могут упоминаться как ферменты гомофарнезоламброксциклазы (НАС). Следовательно, здесь может использоваться термин «фермент SHC/НАС».
Термин «вариант», как он здесь используется, следует понимать, как полипептид, который отличается по сравнению с полипептидом, из которого он происходит, одним или более изменениями в аминокислотной последовательности. Полипептид, из которого происходит вариант, также известен как родительский или эталонный полипептид. Обычно вариант конструируют искусственно, предпочтительно посредством методов генетических технологий. Обычно полипептид, из которого происходит вариант, представляет собой белок дикого типа или домен белка дикого типа. Однако применимые в настоящем раскрытии варианты также могут быть получены из гомологов, ортологов или паралогов родительского полипептида, или из искусственно сконструированных вариантов, при условии, что данный вариант демонстрирует по меньшей мере одну биологическую активность родительского полипептида. Изменения в аминокислотной последовательности могут представлять собой аминокислотные обмены (замены), вставки, делеции, N-концевые усечения или С-концевые усечения, или любую комбинацию данных изменений, которые могут иметь место в одном или нескольких местах.
Термин «вариант фермента SHC/НАС», как он здесь используется, означает фермент, который происходит из фермента SHC дикого типа, но имеет одну или более аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC дикого типа и, следовательно, не встречается в природе у прокариота. Одна или более аминокислотных модификаций, например, может модифицировать (например увеличивать) ферментативную активность в отношении субстрата (например ЕЕН).
Анализы для определения и количественного измерения активности фермента SHC/HAC и/или варианта фермента SHC/HAC описаны здесь и известны в данной области. В качестве примера, активность фермента SHC/HAC и/или варианта фермента SHC/HAC можно определить путем инкубирования очищенного фермента SHC/HAC или варианта фермента, или экстрактов из клеток-хозяев, или полного рекомбинантного организма-хозяина, который продуцировал фермент или вариант фермента SHC/HAC, с подходящим субстратом в подходящих условиях и проведения анализа продуктов реакции (например, посредством газовой хроматографии (ГХ) или анализа ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)). Дополнительные подробности по анализам активности фермента SHC/HAC и/или варианта фермента SHC/HAC и анализу продуктов реакции приведены в Примерах. Эти анализы включают продуцирование варианта фермента SHC/HAC в рекомбинантных клетках-хозяевах (например Е. coli).
Термин «активность», как он здесь используется, означает способность фермента реагировать с субстратом с получением желательного продукта. Активность может быть определена в том, что известно, как анализ активности для отслеживания образования желательного продукта. Производные фермента SHC/HAC по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы по их способности циклизовать гомофарнезол (например ЕЕН) в (-)-амброкс и демонстрировать биологическую активность, такой как активность НАС. Производные фермента SHC/HAC по настоящему изобретению могут отличаться по их способности к циклизации бисгомофарнезола (например Е,E-бисгомофарнезола) в оксид амбры.
Термин «биологическая активность», как он здесь используется, относится к любой активности, которую может демонстрировать полипептид, включая без ограничения: ферментативную активность; активность связывания с другим соединением (например связывание с другим полипептидом, в частности связывание с рецептором или связывание с нуклеиновой кислотой); ингибирующую активность (например активность ингибирования фермента); активирующую активность (например активность активирования фермента); или токсические эффекты. Не требуется, чтобы вариант демонстрировал такую активность в той же самой степени, что и родительский полипептид или полипептид дикого типа. Вариант рассматривается как вариант в контексте настоящей заявки, если он демонстрирует релевантную активность в степени, составляющей по меньшей мере 10% от активности родительского полипептида. Аналогично, вариант рассматривается как вариант в контексте настоящей заявки, если он демонстрирует релевантную биологическую активность в степени, составляющей по меньшей мере 10% от активности родительского полипептида (так как термины «производное» и «вариант» используются во всем настоящем описании взаимозаменяемо). В других воплощениях варианты фермента SHC/HAC по настоящему изобретению демонстрируют лучший выход, чем эталонный белок SHC (например фермент SHC/HAC дикого типа или известный вариант фермента SHC/HAC). Термин «выход» относится к грамму выделяемого продукта на грамм сырья (который можно рассчитать в виде показателя превращения в молярных процентах). В дополнительных воплощениях варианты фермента SHC/HAC по настоящему изобретению демонстрируют модифицированную (например повышенную) продуктивность относительно эталонного белка SHC (например AacSHC дикого типа или AacSHC 215G2). Термин «продуктивность» относится к количеству выделяемого продукта в граммах на литр объема реакционной смеси за час времени биопревращения (т.е. времени после добавления субстрата). Термин «продуктивность» также относится к количеству выделяемого продукта в граммах на литр объема реакционной смеси за час времени биопревращения (т.е. времени после добавления субстрата) на грамм биокатализатора, используемого в реакции.
В других воплощениях варианты фермента SHC/HAC по настоящему изобретению демонстрируют модифицированный выход по сравнению с эталонным белком SHC (например, AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) или AacSHC 215G2 (SEQ ID NO: 10), или ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), или ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), или BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13), или GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), или TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), или ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), или BmeSHC дикого типа (SEQ ID NO: 28), или SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29), или ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30)). Термин «целевой коэффициент выхода» относится к отношению концентрации полученного продукта и концентрации варианта фермента SHC/HAC (например очищенного варианта фермента SHC/HAC или экстракта из рекомбинантных клеток-хозяев, продуцирующих вариант фермента SHC/HAC) в реакционной среде. В различных воплощениях варианты фермента SHC/HAC по настоящему изобретению демонстрируют модифицированную (например повышенную) кратность увеличения ферментативной активности (например модифицированной/повышенной активности гомофарнезоламброксциклазы (НАС)) относительно эталонного белка SHC (например SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 28, или SEQ ID NO: 29, или SEQ ID NO: 30). Кратность данного увеличения активности может составлять по меньшей мере: 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и/или 100.
Термин «аминокислотная модификация», как он здесь используется, означает вставку одной или более аминокислот между двумя аминокислотами, делецию одной или более аминокислот, или замену (которая может быть консервативной или неконсервативной) одной или более аминокислот одной или более чем одной другой аминокислотой относительно аминокислотной последовательности эталонной аминокислотной последовательности. Замены заменяют аминокислоты эталонной последовательности тем же самым числом аминокислот в варианте последовательности. Эталонные аминокислотные последовательности могут, например, представлять собой аминокислотную последовательность дикого типа (WT) (например SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 19, или SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 28, или SEQ ID NO: 29, или SEQ ID NO: 30), или, например, сами могут представлять собой последовательность варианта фермента SHC/HAC (например вариант 215G2 Аас - SEQ ID NO: 10).
Аминокислотные модификации могут быть легко идентифицированы путем сравнения аминокислотных последовательностей варианта фермента SHC/HAC с аминокислотной последовательностью эталонной аминокислотной последовательности.
Консервативные аминокислотные замены, например, могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, размера, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы участвующих аминокислотных остатков. 20 встречающихся в природе аминокислот, как описано выше, могут быть сгруппированы в следующие шесть стандартных групп аминокислот:
(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro и
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Соответственно, термин «консервативные замены», как он здесь используется, означает замену аминокислоты другой аминокислотой, перечисленной в пределах той же самой группы из шести стандартных групп аминокислот, показанных выше. Например, замена Asp на Glu сохраняет один отрицательный заряд в модифицированном таким образом полипептиде. Кроме того, глицин и пролин могут быть заменены друг на друга на основе их способности разрушать альфа-спирали. Некоторые предпочтительные консервативные замены в пределах приведенных выше шести групп представляют собой замены в пределах следующих подгрупп: (1) Ala, Val, Leu и Ile; (2) Ser и Thr; (3) Asn и Gln; (4) Lys и Arg; и (5) Tyr и Phe. Принимая во внимание известный генетический код и методы рекомбинации и синтеза ДНК, квалифицированный ученый легко может сконструировать ДНК, кодирующие консервативные аминокислотные варианты.
Термины «неконсервативные замены» или «неконсервативные аминокислотные замены» в том виде, как они здесь используются, определяются как обмен аминокислоты на другую аминокислоту, перечисленную в другой группе из шести стандартных групп аминокислот (1) - (6), как показано выше. Обычно описанные здесь варианты фермента SHC/HAC получают с использованием неконсервативных замен, которые изменяют биологическую функцию (например активность НАС) раскрытых вариантов фермента SHC/HAC. Для удобства ссылки указываются однобуквенные символы аминокислот, рекомендованные Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (Международный союз теоретической и прикладной химии Международный биохимический союз), следующим образом. Для ссылки также приводятся трехбуквенные коды.
Аминокислотные модификации, такие как аминокислотные замены, могут быть введены с использованием известных протоколов рекомбинантной генной технологии, включая ПЦР (полимеразная цепная реакция), клонирование генов, сайт-направленный мутагенез кДНК, трансфекцию клеток-хозяев и транскрипцию in vitro, которые можно использовать для введения таких изменений в эталонную последовательность, что приводит к варианту фермента SHC/HAC. Варианты фермента можно затем подвергать скринингу на функциональную активность SHC/HAC.
Подходящие источники ферментов SHC/HAC включают, например, Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac), Zymomonas mobilis (Zmo), Bradyrhizobium japonicum (Bjp), Gluconobacter morbifer (Gmo), Burkholderia ambifaria, Bacillus anthracis, Methylococcus capsulatus, Frankia alni, Acetobacter pasteurianus (Ара), Thermosynechococcus elongatus (Tel), Streptomyces coelicolor (Sco), Rhodopseudomonas palustris (Rpa), Teredinibacter turnerae (Ttu), Pelobacter carbinolicus (Pea), Bacillus megaterium (Bme), Streptomyces albolongus (Sal) и Tetrahymena pyriformis (см., например, WO 2010/139719, US 2012/01345477, WO 2012/066059, содержание которых включено в данное описание изобретения посредством ссылки).
В частности, фермент SHC/HAC (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может представлять собой фермент SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Аас), фермент SHC/HAC (ZmoSHC1) Zymomonas mobilis, фермент SHC/HAC Bradyrhizobium japonicum (Bjp или Bja) или фермент SHC/HAC Gluconobacter morbifer (Gmo), или фермент SHC/HAC Acetobacter pasteurianus (ApaSHC1), или фермент SHC/HAC Bacillus megaterium (Bme). В частности, фермент SHC/HAC (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может представлять собой фермент SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Аас).
Для удобства ссылки обозначение «AacSHC» может использоваться для названия фермента SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Аас), «ZmoSHC» может использоваться для названия ферментов SHC/HAC Zymomonas mobilis (Zmo), «BjpSHC» или «BjaSHC» может использоваться для названия фермента SHC/HAC Bradyrhizobium japonicum (Bjp), «ApaSHC» может использоваться для названия ферментов SHC/HAC Acetobacter pasteurianus (Ара), «BmeSHC» может использоваться для названия фермента SHC/HAC Bacillus megaterium (Bme), «SalSHC» может использоваться для названия фермента SHC/HAC Streptomyces albolongus (Sal), и «GmoSHC» может использоваться для названия фермента SHC/HAC Gluconobacter morbifer (Gmo).
Последовательности фермента AacSHC, ZmoSHC и BjpSHC раскрыты в BASF WO 2010/139719, US 2012/01345477 A1, Seitz et al (как указано выше) и Seitz (2012 PhD диссертация, указанная выше). Для ZmoSHC раскрыты две разные последовательности, именуемые ZmoSHC1 и ZmoSHC2. Последовательность фермента SHC/HAC Gmo раскрыта в WO 2018/157021. Фермент SalSHC раскрыт в Liu et al (2020): A Novel Soluble Squalene-Hopene Cyclase and Its Application in Efficient Synthesis of Hopene, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol 8, article 426, https://doi.org/10.3389/rbioe.2020.00426).
В Таблице 1 раскрыты источники и номера доступа ферментов SHC дикого типа.
Здесь также раскрываются последовательности AacSHC дикого типа, ZmoSHCl дикого типа, ZmoSHC2 дикого типа, BjpSHC дикого типа, GmoSHC дикого типа, TelSHC дикого типа и ApaSHC1 дикого типа, BmeSHC дикого типа, SalSHC дикого типа и ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 соответственно).
Выравнивание последовательностей SHC WT, полученное Hoshino and Sato (2002, как указано выше) указывает то, что были обнаружены многие мотивы во всех четырех последовательностях, и они состоят из центральной последовательности Gln-X-X-X-Gly-X-Trp, которая встречается шесть раз в последовательностях SHC как Z. mobilis, так и А. acidocaldarius (см. Фиг. 3 Reipen et at 1995, Microbiology 141, 155-161). Hoshino и Sato (2002, как указано выше) сообщают о том, что ароматические аминокислоты являются необычно многочисленными в SHC, и что в SHC отмечали два характерных мотива: один представляет собой мотив QW, представленный специфическими аминокислотными мотивами [(K/R)(G/A)X2-3(F/Y/W)(L/IV)3X3QX2-5GXW], а альтернативный представляет собой мотив DXDDTA. Wendt et at (1997, Science 277, 1811-1815 и 1999, J Mol Biol 286, 175-187) сообщили о рентгеноструктурном анализе SHC A. acidocaldarius. По-видимому, мотив DXDDTA коррелирует с активным сайтом SHC.
Эталонный белок AacSHC в том виде, в котором он здесь используется, может относится к белку AacSHC дикого типа, как раскрыто в SEQ ID NO: 1. AacSHC имеет активность гомофарнезоламброксциклазы (НАС), полезной в получении производных амброкса через биокаталитическую реакцию SHC с субстратом гомофарнезолом. Главной реакцией AacSHC является циклизация линейного или нелинейного субстрата, такого как гомофарнезол, с получением амброкса.
Функциональные гомологи описанных здесь ферментов SHC/HAC дикого типа или вариантов ферментов SHC/HAC также подходят для применения в реакциях циклизации, например для продуцирования (-)-амброкса, например в рекомбинантном хозяине. Таким образом, рекомбинантный хозяин может включать одну или более чем одну гетер о логичную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональные гомологи описанных выше полипептидов и/или гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую производное фермента SHC/HAC, как описано здесь.
Функциональный гомолог представляет собой полипептид, который имеет сходство последовательности с эталонным полипептидом, и который выполняет одну или более чем одну биохимическую или физиологическую функцию данного эталонного полипептида. Функциональный гомолог и эталонный полипептид могут представлять собой природные полипептиды, и сходство последовательностей может быть обусловлено конвергентными или дивергентными эволюционными событиями. Функциональные гомологи, как таковые, иногда обозначаются в литературе как гомологи, или ортологи, или паралоги. Варианты встречающегося в природе функционального гомолога, такие как полипептиды, кодируемые мутантами кодирующей последовательности дикого типа, сами могут представлять собой функциональные гомологи. Функциональные гомологи также могут быть созданы посредством сайт-направленного мутагенеза кодирующей последовательности полипептида или посредством объединения доменов из кодирующих последовательностей разных природных полипептидов («обмен доменами»). Известны методики модифицирования генов, кодирующих описанные здесь функциональные гомологи, и они включают, среди прочих, методики направленной эволюции, методики сайт-направленного мутагенеза и методики случайного мутагенеза, и могут быть полезными для повышения удельной активности полипептида, изменения субстратной специфичности, изменения уровней экспрессии, изменения субклеточной локализации или модификации взаимодействий полипептид : полипептид желательным образом. Такие модифицированные полипептиды рассматриваются как функциональные гомологи. Термин «функциональный гомолог» иногда применяют к нуклеиновой кислоте, которая кодирует функционально гомологичный полипептид.
Функциональные гомологи могут быть идентифицированы путем анализа выравниваний нуклеотидных и полипептидных последовательностей. Например, осуществление запроса в базе данных нуклеотидных или полипептидных последовательностей может идентифицировать гомологи последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды-производные SHC и тому подобное.
Для идентификации функциональных гомологов и/или в качестве меры гомологии двух последовательностей нуклеиновых кислот также можно использовать гибридизацию. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из раскрытых здесь белков или его часть, можно использовать в качестве гибридизационного зонда согласно стандартным методикам гибридизации. Гибридизация зонда с ДНК или РНК из анализируемого источника (например клетки млекопитающего) является указанием присутствия релевантной ДНК или РНК в анализируемом источнике. Условия гибридизации известны специалистам в данной области и могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Умеренные условия гибридизации определяются как эквивалентные гибридизации в 2× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при 30°С с последующей промывкой в 1× SSC, 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) при 50°С. Условия высокой жесткости определяются как эквивалентные гибридизации в 6× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при 45°С с последующей промывкой в 0,2× SSC, 0,1% SDS при 65°С. Анализ последовательности для идентификации функциональных гомологов также может включать анализ BLAST, обратный BLAST или PSI-BLAST анализ неизбыточных баз данных с использованием релевантной аминокислотной последовательности в качестве эталонной последовательности. Аминокислотная последовательность в некоторых случаях выводится из нуклеотидной последовательности. Те полипептиды в базе данных, которые имеют больше, чем 40%-ную идентичность последовательности, являются кандидатами для дальнейшей оценки на пригодность для применения в реакции биопревращения SHC/HAC. Сходство аминокислотной последовательности обеспечивает возможность консервативных аминокислотных замен, таких как замена одного гидрофобного остатка на другой или замена одного полярного остатка на другой. Если желательно, можно провести проверка таких кандидатов вручную для того, чтобы сузить число кандидатов, подлежащих дальнейшей оценке. Проверка вручную может осуществляться посредством отбора тех кандидатов, которые по-видимому имеют, например, консервативные функциональные домены.
Обычно полипептиды, которые демонстрируют по меньшей мере примерно 30%-ную идентичность аминокислотной последовательности, являются полезными для идентификации консервативных областей. Консервативные области родственных полипептидов демонстрируют по меньшей мере 30%-ную, 40%-ную, 41%-ную, 42%-ную, 43%-ную, 44%-ную, 45%-ную, 46%-ную, 47%-ную, 48%-ную, 49%-ную, 50%-ную, 51%-ную, 52%-ную, 53%-ную, 54%-ную, 55%-ную, 56%-ную, 57%-ную, 58%-ную, 59%-ную, 60%-ную, 61%-ную, 62%-ную, 63%-ную, 64%-ную, 65%-ную, 66%-ную, 67%-ную, 68%-ную, 69%-ную идентичность аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях консервативная область демонстрирует по меньшей мере 70%-ную, 71%-ную, 72%-ную, 73%-ную, 74%-ную, 75%-ную, 76%-ную, 77%-ную, 78%-ную, 79%-ную, 80%-ную, по меньшей мере 81%-ную, по меньшей мере 82%-ную, по меньшей мере 83%-ную, по меньшей мере 84%-ную, по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 86%-ную, по меньшей мере 87%-ную, по меньшей мере 88%-ную, по меньшей мере 89%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 91%-ную, по меньшей мере 92%-ную, по меньшей мере 93%-ную, по меньшей мере 94%-ную, по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 96%-ную, по меньшей мере 97%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности. Идентичность последовательности можно определять, как изложено выше и ниже.
Описанные здесь и используемые в описанных здесь способах ферменты SHC/HAC или варианты ферментов могут быть, например, основаны на аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или ее варианте, гомологе, мутанте, производном или фрагменте. Фермент SHC/HAC или вариант фермента, например, может иметь аминокислотную последовательность по меньшей мере с 30%-ной, 40%-ной, 41%-ной, 42%-ной, 43%-ной, 44%-ной, 45%-ной, 46%-ной, 47%-ной, 48%-ной, 49%-ной, 50%-ной, 51%-ной, 52%-ной, 53%-ной, 54%-ной, 55%-ной, 56%-ной, 57%-ной, 58%-ной, 59%-ной, 60%-ной, 61%-ной, 62%-ной, 63%-ной, 64%-ной, 65%-ной, 66%-ной, 67%-ной, 68%-ной, 69%-ной, 70%-ной, 71%-ной, 72%-ной, 73%-ной, 74%-ной, 75%-ной, 76%-ной, 77%-ной, 78%-ной, 79%-ной, 80%-ной, по меньшей мере 81%-ной, по меньшей мере 82%-ной, по меньшей мере 83%-ной, по меньшей мере 84%-ной, по меньшей мере 85%-ной, по меньшей мере 86%-ной, по меньшей мере 87%-ной, по меньшей мере 88%-ной, по меньшей мере 89%-ной, по меньшей мере 90%-ной, по меньшей мере 91%-ной, по меньшей мере 92%-ной, по меньшей мере 93%-ной, по меньшей мере 94%-ной, по меньшей мере 95%-ной, по меньшей мере 96%-ной, по меньшей мере 97%-ной, по меньшей мере 98%-ной или по меньшей мере 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Кроме того, полученная эталонная SHC может быть основана на аминокислотной последовательности, полученной из Е. coli.
«Процент (%) идентичности» в отношении нуклеотидной последовательности гена определяется как процентная доля нуклеотидов в кандидатной последовательности ДНК, которые являются идентичными нуклеотидам в последовательности ДНК после выравнивания данной последовательности и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть данной идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности нуклеотидной последовательности может достигаться разными путями, которые находятся в пределах уровня знаний специалиста в данной области, например с использованием общедоступных компьютерных программ. Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо и означают любую цепь связанных пептидными связями аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации.
Термин «производное», как он здесь используется, включает вариант, но не ограничивается им. Термины «производное» и «вариант» используются здесь взаимозаменяемо.
В предпочтительных воплощениях вариант фермента, используемый в настоящем раскрытии, демонстрирует общее число изменений (модификаций) в аминокислотной последовательности (например замены, вставки, делеции, N-концевые усечения и/или С-концевые усечения) вплоть до 200 (вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200). Аминокислотные замены могут быть консервативными и/или неконсервативными. В предпочтительных воплощениях вариант, используемый в настоящем раскрытии, отличается от белка или домена, из которого он происходит, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислотными обменами, предпочтительно консервативными аминокислотными заменами. Варианты могут дополнительно или альтернативно содержать делеции аминокислот, которые могут представлять собой N-концевые усечения, С-концевые усечения или внутренние делеции или их любую комбинацию. Такие варианты, содержащие N-концевые усечения, С-концевые усечения и/или внутренние делеции, называются в контексте настоящей заявки «вариантами с делециями» или «фрагментами». Термины «вариант с делециями» и «фрагмент» используются здесь взаимозаменяемо. Вариант с делециями может быть природным (например сплайс-варианты) или может быть сконструирован искусственно, предпочтительно посредством методов генетических технологий. Обычно белок или белковый домен, из которого происходит вариант с делециями, представляет собой белок дикого типа. Однако варианты с делециями по настоящему изобретению также могут происходить из гомологов, ортологов или паралогов родительского полипептида или из искусственно сконструированных вариантов, при условии, что варианты с делециями демонстрируют по меньшей мере одну биологическую активность родительского полипептида. Предпочтительно вариант с делециями (или фрагмент) имеет делецию вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислот на своем N-конце и/или на своем С-конце, и/или внутри по сравнению с родительским полипептидом.
В некоторых воплощениях описанные здесь варианты фермента SHC/HAC включают только замены и не включают какие-либо делеции или вставки.
Термин «вариант», как он здесь используется, может альтернативно или дополнительно характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности с родительским полипептидом, из которого он происходит. Вариант WT/эталонного SHC/HAC или производного SHC/HAC по настоящему изобретению может иметь идентичность последовательности по меньшей мере 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с соответствующим эталонным полипептидом или с соответствующим эталонным полинуклеотидом.
Выражение «по меньшей мере 30%-ная, 40%-ная, 41%-ная, 42%-ная, 43%-ная, 44%-ная, 45%-ная, 46%-ная, 47%-ная, 48%-ная, 49%-ная, 50%-ная, 51%-ная, 52%-ная, 53%-ная, 54%-ная, 55%-ная, 56%-ная, 57%-ная, 58%-ная, 59%-ная, 60%-ная, 61%-ная, 62%-ная, 63%-ная, 64%-ная, 65%-ная, 66%-ная, 67%-ная, 68%-ная, 69%-ная, 70%-ная, 71%-ная, 72%-ная, 73%-ная, 74%-ная, 75%-ная, 76%-ная, 77%-ная, 78%-ная, 79%-ная, 80%-ная, по меньшей мере 81%-ная, по меньшей мере 82%-ная, по меньшей мере 83%-ная, по меньшей мере 84%-ная, по меньшей мере 85%-ная, по меньшей мере 86%-ная, по меньшей мере 87%-ная, по меньшей мере 88%-ная, по меньшей мере 89%-ная, по меньшей мере 90%-ная, по меньшей мере 91%-ная, по меньшей мере 92%-ная, по меньшей мере 93%-ная, по меньшей мере 94%-ная, по меньшей мере 95%-ная, по меньшей мере 96%-ная, по меньшей мере 97%-ная, по меньшей мере 98%-ная или по меньшей мере 99%-ная идентичность последовательности» используется во всем данном описании изобретения в отношении сравнений полипептидных или полинуклеотидных последовательностей. Полинуклеотид, принадлежащий к семейству любого из раскрытых здесь ферментов, или белок могут быть идентифицированы на основе его сходства с релевантным геном или белком соответственно. Например, идентификация может быть основана на идентичности последовательности. В некоторых предпочтительных воплощениях в описании изобретения охарактеризованы выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые являются по меньшей мере на 30%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными (а) раскрытой здесь молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид фермента SHC/HAC дикого типа (например SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30), (б) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 15 и (в) молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает отрезок из по меньшей мере 30 (например по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 80, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 850, 900, 950, 1000 или 1010) нуклеотидов SEQ ID NO: 15.
Предпочтительно, рассматриваемый полипептид и эталонный полипептид демонстрируют указанную идентичность последовательности на непрерывном отрезке из 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более аминокислот. Предпочтительно, рассматриваемый полипептид и эталонный полипептид демонстрируют указанную идентичность последовательности на непрерывном отрезке из 60, 90, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 или более нуклеотидов. В случае, когда сравнивают две последовательности, и эталонная последовательность, в сравнении с которой следует рассчитывать процентную идентичность последовательности, не конкретизирована, идентичность последовательности подлежит расчету относительно более длиной из двух последовательностей, подлежащих сравнению, если конкретно не указано иное. Если указана эталонная последовательность, идентичность последовательности определяется на основе полной длины эталонной последовательности (например SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30), если конкретно не указано иное.
Например, пептидная последовательность, состоящая из 130 аминокислот, сравниваемая с аминокислотами полноразмерного AacSHC дикого типа с 631 аминокислотным остатком, может демонстрировать максимальную процентную идентичность последовательности 20,6% (130/631×100), тогда как последовательность с длиной 300 аминокислот может демонстрировать максимальную процентную идентичность последовательности 47,5% (300/631×100).
Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, т.е. процент идентичности последовательности, может быть определен посредством выравниваний последовательностей. Такие выравнивания могут быть выполнены с использованием нескольких известных в данной области алгоритмов, предпочтительно с использованием математического алгоритма Karlin и Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), с использованием hmmalign (пакет HMMER, http://hmmer.wust1.edu/) или с использованием алгоритма CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), доступного, например, на https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. или программы GAP (математический алгоритм Университета Айовы), или математического алгоритма Myers и Miller (1989 - Cabios 4: 11-17) или Clone Manager 9. Предпочтительными используемыми параметрами являются параметры по умолчанию в том виде, в котором они изложены на https://www.ebi.ас.uk7Tools/msa/clustalo/.
Степень идентичности последовательности (совпадения последовательности) может быть рассчитана с использованием, например, BLAST, BLAT или BlastZ (или BlastX). Аналогичный алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTP Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Поиски полинуклеотидов BLAST проводятся с использованием программы BLASTN, балл равен 100, длина слова равна 12, с получением полинуклеотидных последовательностей, которые являются гомологичными тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют релевантный белок.
Поиски белка BLAST проводятся с использованием программы BLASTP, балл равен 50, длина слова равна 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных полипептиду SHC. Для получения выравниваний с пробелами с целью сравнения используется Gapped BLAST, как описано в Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию соответствующих программ. Анализ совпадения последовательности может быть дополнен установленными методиками картирования гомологии, подобными Shuffle-LAGAN (Brudno М., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) или случайным полям Маркова. Когда в настоящей заявке упоминается проценты идентичности последовательности, эти проценты рассчитываются по отношению к полной длине более длинной последовательности, если конкретно не указано иное.
В конкретных воплощениях % идентичности между двумя последовательностями определяют с использованием CLUSTAL О (версии 1.2.4).
Конкретные ферменты SHC/HAC и варианты ферментов, которые можно использовать в описанных здесь способах, дополнительно описаны ниже.
ВАРИАНТЫ SHC/HAC Aac 215G2 С НОВЫМИ МУТАЦИЯМИ
Неожиданно было обнаружено, что варианты фермента SHC/HAC, происходящие от варианта фермента SHC/HAC Aac, раскрытого в WO 2016/170099 (вариант фермента SHC/HAC 215G2), обеспечивают улучшенную ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс. Дополнительно неожиданно было обнаружено, что варианты фермента SHC/HAC, происходящие от 215G2, обеспечивают улучшенную ферментативную активность в отношении превращения E,E-бисгомофарнезола в оксид амбры.
Эти новые варианты фермента SHC/HAC имеют две или три аминокислотные модификации, помимо аминокислотных замен, уже присутствующих в варианте фермента SHC/HAC 215G2.
Следовательно, здесь предложен способ получения (-)-амброкса посредством ферментативного превращения ЕЕН в (-)-амброкс. Здесь также предложен способ получения оксида амбры посредством ферментативного превращения Е,Е-бисгомофарнезола в оксид амбры. В данных способах можно использовать любой описанный здесь фермент SHC/HAC дикого типа или вариант фермента, в частности описанные здесь варианты SHC/HAC Aac 215G2.
Вариант фермента SHC/HAC SHC/HAC Aac 215G2 имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь по меньшей мере примерно 75,0%-ную, или по меньшей мере примерно 80,0%-ную, или по меньшей мере примерно 85,0%-ную, или по меньшей мере примерно 90,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,5%-ную, или по меньшей мере примерно 96,0%-ную, или по меньшей мере примерно 96,5%-ную, или по меньшей мере примерно 97,0%-ную, или по меньшей мере примерно 97,5%-ную, или по меньшей мере примерно 98,0%-ную, или по меньшей мере примерно 98,5%-ную, или по меньшей мере примерно 99,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1.
Вариант фермента SHC/HAC Aac 215G2 имеет менее чем 100%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь идентичность с SEQ ID NO: 1, равную или менее чем примерно 99,5% или равную или менее чем примерно 99,0%.
Например, вариант фермента SHC/HAC Aac 215G2 может иметь идентичность с SEQ ID NO: 1 от примерно 70,0%-ной до примерно 99,5%-ной или от примерно 80,0%-ной до примерно 99,0%-ной, или от примерно 85,0%-ной до примерно 98,5%-ной, или от примерно 90,0%-ной до примерно 98,0%-ной.
«Процент (%) идентичности» в отношении полипептида или нуклеотидной последовательности определяется, соответственно, как процент аминокислот или нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотам или нуклеотидам в эталонной последовательности, после выравнивания данной последовательности и введения, если необходимо, пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности последовательности может быть достигнуто различными путями, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области, например, с использованием общедоступной компьютерной программы. Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо и означают любую цепь аминокислот, связанных пептидными связями, независимо от длины или посттрансляционной модификации.
Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, т.е. процент идентичности последовательности, может быть определено посредством выравниваний последовательностей. Такие выравнивания могут быть выполнены с использованием нескольких известных в данной области алгоритмов, предпочтительно с использованием математического алгоритма Karlin и Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), с использованием hmmalign (пакет HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) или с использованием алгоритма CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), доступного, например, на https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. или программы GAP (математический алгоритм Университета Айовы), или математического алгоритма Myers и Miller (1989 - Cabios 4: 11-17). Предпочтительными используемыми параметрами являются параметры по умолчанию в том виде, в котором они изложены на https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
Процент идентичности последовательности может быть рассчитана с использованием, например, BLAST, BLAT или BlastZ (или BlastX). Аналогичный алгоритм включается в программы BLASTN и BLASTP Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Поиски полинуклеотидов BLAST можно проводить с использованием программы BLASTN, балл равен 100, длина слова равна 12, с получением полинуклеотидных последовательностей, которые являются гомологичными тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют релевантный белок. Поиски белка BLAST можно проводить с использованием программы BLASTP, балл равен 50, длина слова равна 3, с получением гомологичных аминокислотных последовательностей данному полипептиду.
Для получения выравниваний с пробелами с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию соответствующих программ. Анализ совпадения последовательности может быть дополнен установленными методиками картирования гомологии, подобными Shuffle-LAGAN (Brudno М., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) или случайным полям Маркова. Когда в настоящей заявке упоминается процент идентичности последовательности, данные проценты рассчитывают по отношению к полной длине более длинной последовательности, если конкретно не указано иное.
В конкретных воплощениях % идентичности двух последовательностей определяют с использованием CLUSTAL О (версии 1.2.4).
В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC может иметь число аминокислотных модификаций, равное или менее чем примерно 30 по сравнению с SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь число аминокислотных модификаций, равное или менее чем примерно 25, или равное или менее чем примерно 20, или равное или менее чем примерно 15, или равное или менее чем примерно 10, или равное или менее чем примерно 9, или равное или менее чем примерно 8, или равное или менее чем примерно 7, или равное или менее чем примерно 6, по сравнению с SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь по меньшей мере примерно 5 или по меньшей мере примерно 6 аминокислотных модификаций по сравнению с SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации могут представлять собой, например, вставки, делеции и/или замены, как описано выше.
В некоторых воплощениях единственными аминокислотными модификациями в варианте фермента SHC/HAC по сравнению с SEQ ID NO: 1 являются замены (т.е. нет вставок или делеций).
Аминокислотные модификации определяются относительно эталонной последовательности. Аминокислотная модификация относительно эталонной последовательности означает, что аминокислотная последовательность последовательности варианта отличается от эталонной последовательности.
Аминокислотам в эталонной последовательности и в последовательности варианта может быть присвоен номер, где нумерация начинается с аминокислоты на N-конце полипептида (т.е. аминокислота на N-конце полипептида нумеруется как 1, следующая аминокислота нумеруется как 2 и т.д.). «Положение» в эталонной последовательности относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в эталонной последовательности, идентифицированному конкретной нумерацией аминокислот в эталонной последовательности. «Положение» в последовательности варианта относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в последовательности варианта, идентифицированному посредством конкретной нумерации аминокислот в последовательности варианта.
Поскольку последовательность варианта может включать делеции или вставки по сравнению с эталонной последовательностью, аминокислоты в последовательности варианта могут быть пронумерованы иначе, чем такие же аминокислоты в эталонной последовательности. В качестве примера, при вставке аминокислоты между аминокислотами 131 и 132 в SEQ ID NO: 1, аминокислота после вставки будет иметь номер 133 в последовательности варианта, в то время как она сохраняет номер 132 в эталонной последовательности. В данном примере положение последовательности варианта, которое соответствует положению 132 в эталонной последовательности, представляет собой положение 133. Следовательно, аминокислоты в последовательности варианта, которые сохранились из эталонной последовательности, могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности. Другими словами, «положение» в последовательности варианта может быть определено посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности. В частности, замены в последовательности варианта по сравнению с эталонной последовательностью могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности, несмотря на любые вставки и/или делеции в данной эталонной последовательности. Когда аминокислоты эталонной последовательности были делетированы, в последовательности варианта нет «соответствующего положения». Когда нет вставок или делеций по сравнению с эталонной последовательностью (т.е. имеются только замены), «соответствующее положение» в эталонной последовательности будет таким же, что и положение в последовательности варианта.
Исходные аминокислотные модификации в варианте фермента SHC/HAC 215G2 (по сравнению с SHC Аас дикого типа) сохраняются в описанном здесь новом варианте фермента SHC/HAC Aac 215G2. Исходные аминокислотные модификации в варианте фермента SHC/HAC 215G2 по сравнению с SHC Аас дикого типа представляли собой замены M132R, A224V и I432T (т.е. замена остатка М в положении 132 остатком R, замена остатка А в положении 224 остатком V и замена остатка I в положении 432 остатком Т).
Следовательно, новые варианты фермента SHC/HAC Аас 215G2 имеют аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно. Номер "132" в "M132R", "224" в "A224V" и "432" в "I432T" относится к нумерации SEQ ID NO: 1 и, как обсуждалось выше, не обязательно соответствует нумерации последовательности варианта из-за возможных дополнительных вставок и/или делеций.
Аминокислотная последовательность нового варианта фермента SHC/HAC Aac 215G2 также имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут представлять собой, например замены, например неконсервативные замены.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, ив одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и в двух положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и во всех положениях, соответствующих положениям 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 431 и 557 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены. В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC имеет последовательность SEQ ID NO: 2.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены. В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC имеет последовательность SEQ ID NO: 3.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 81, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены. В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC имеет последовательность SEQ ID NO: 4.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 81, 431 и 557 в SEQ ID NO: 1. Данные аминокислотные модификации могут, например, представлять собой замены, например неконсервативные замены. В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC имеет последовательность SEQ ID NO: 5.
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой А557Х. Это относится к замене аминокислоты А в положении 557 в SEQ ID NO: 1 любой другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 557.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. А) на нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. А) на треонин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, представляет собой А557Т).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Y81X. Это относится к замене аминокислоты Y в положении 81 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 81.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Y) на основную аминокислоту (т.е. His, Lys или Arg). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Y) на гистидин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, представляет собой Y81H).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Н431Х. Это относится к замене аминокислоты Н в положении 431 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 431.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Н) на гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Н) на лейцин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, представляет собой H431L).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой R613X. Это относится к замене аминокислоты R в положении 613 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 613.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 631 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. R) на нейтральную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. R) на серии (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, представляет собой R613S).
В некоторых воплощениях новый вариант SHC Аас 215G2 является идентичным SEQ ID NO: 1 за исключением следующих аминокислотных замен:
(1) M132R, A224V, I432T, А557Т и H431L (SEQ ID NO: 2); или
(2) M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S (SEQ ID NO: 3); или
(3) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и R613S (SEQ ID NO: 4); или
(4) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и H431L (SEQ ID NO: 5).
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь одну или более дополнительные аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 90, 172 и/или 277 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Т90Х. Это относится к замене аминокислоты Т в положении 90 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 90.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Т) на гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu, Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. T) на аланин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, представляет собой Т90А).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой А172Х. Это относится к замене аминокислоты Т в положении 172 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 172.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. А) на нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn, Gln). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. А) на треонин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, представляет собой А172Т).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой М277Х. Это относится к замене аминокислоты М в положении 277 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 277.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. М) на основную аминокислоту (т.е. Hys, Lys, Arg). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. М) на лизин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, представляет собой M277K).
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь одну или более дополнительные аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 37, 174 и/или 601 в SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более чем одну аминокислотную замену (например консервативные или неконсервативные замены) в положениях, соответствующих положениям 37, 174 и/или 601 в SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой L37X. Это относится к замене аминокислоты L в положении 37 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 37.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. L) на нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. L) на глутамин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, представляет собой L37Q).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой V174X. Это относится к замене аминокислоты V в положении 174 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 174.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Leu или Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. V) на изолейцин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, представляет собой V174I).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой F601X. Это относится к замене аминокислоты F в положении 601 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 601.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой ароматическую аминокислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. F) на тирозин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, представляет собой F601Y).
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь одну или более дополнительные аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 77, 92, 129, 579, 601 и/или 605 в SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более чем одну аминокислотную замену (например консервативные или неконсервативные замены) в положениях, соответствующих положениям 77, 92, 129, 579, 601 и/или 605 в SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Т77Х. Это относится к замене аминокислоты Т в положении 77 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 77.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. L) на гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Т) на аланин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, представляет собой Т77А).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой I92X. Это относится к замене аминокислоты I в положении 92 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 92.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. I) на гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. I) на валин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, представляет собой I92V).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой F129X. Это относится к замене аминокислоты F в положении 129 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 129.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. F) на гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. F) на лейцин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, представляет собой F129L).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Q579X. Это относится к замене аминокислоты Q в положении 579 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 579.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Q) на основную аминокислоту (т.е. His, Lys или Arg). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. Q) на гистидин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, представляет собой Q579H).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой F601X. Это относится к замене аминокислоты F в положении 601 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 601.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой ароматическую кислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. F) на гистидин (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, представляет собой F601Y).
Аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой F605X. Это относится к замене аминокислоты F в положении 605 в SEQ ID NO: 1 на любую другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку варианты фермента SHC/HAC могут дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в новом варианте фермента SHC/HAC может быть не 605.
Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Новая аминокислота (X) в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, может, например, представлять собой ароматическую кислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe). Например, аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, может заменять аминокислоту из SEQ ID NO: 1 (т.е. F) на триптофан (т.е. аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, представляет собой F605W).
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 132 и 432 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотную модификацию (например замену) в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 77, 92 и 129 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 579 и 601 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 129, 132 и 432 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 132, 432 и 601 в SEQ ID NO: 1.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации (например замены) в положениях, соответствующих положениям 129, 132, 432 и 601 в SEQ ID NO: 1.
Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут иметь повышенную ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс или превращения BisEEH в оксид амбры по сравнению с ферментом SHC/HAC с SEQ ID NO: 1 и/или вариантом фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Повышенная ферментативная активность может относиться к любому аспекту ферментативного превращения ЕЕН в (-)-амброкс или ферментативного превращения BisEEH в оксид амбры, включая, например, повышенное общее превращение ЕЕН или BisEEH, повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH (например, в первые 6 часов или в первые 12 часов реакции), повышенное производство (-)-амброкса или оксида амбры и пониженное производство побочных продуктов. Повышенная ферментативная активность может определяться повышенной продуктивностью в целом, которая может быть определена в показателях (-)-амброкса или оксида амбры, полученных на грамм биокатализатора в час и на литр реакционной смеси.
Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенное превращение ЕЕН или E,E-бисгомофарнезола (BisEEH) по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или с вариантом фермента SHC/HAC Aac 215G2 SEQ ID NO: 10. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенный уровень превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению со способом с использованием фермента SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или варианта фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или с вариантом фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или с вариантом фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH в течение первых 4 часов или в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов, или в течение первых 24 часов реакции по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или вариантом фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH в течение первых 4 часов, или в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов, или в течение первых 24 часов реакции по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа с SEQ ID NO: 1 и/или с вариантом фермента SHC/HAC с SEQ ID NO: 10. Это может наблюдаться при сравнении с применением обоих ферментов (т.е. с новым вариантом фермента SHC/HAC Аас 215G2 и ферментом дикого типа с SEQ ID NO: 1 или ферментом 215G2 с SEQ ID NO: 10) при тех же самых условиях реакции (например при таких же значениях рН и температуры) или при сравнении с применением каждого фермента при соответствующих ему оптимизированных условиях реакции (например, оптимизированных рН и температуре), которые могут отличаться друг от друга.
Например, новый вариант фермента SHC/HAC может обеспечивать или данный способ может иметь по меньшей мере примерно 40%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может обеспечивать или данный способ может иметь по меньшей мере примерно 45%-ное или по меньшей мере примерно 50%-ное, или по меньшей мере примерно 55%-ное, или по меньшей мере примерно 60%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может обеспечивать или данный способ может иметь по меньшей мере примерно 30%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 6 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может обеспечивать или данный способ может иметь по меньшей мере примерно 35%-ное или по меньшей мере примерно 45%-ное, или по меньшей мере примерно 50%-ное, или по меньшей мере примерно 55%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Это может наблюдаться при сравнении с применением обоих ферментов (т.е. с новым вариантом фермента SHC/HAC и ферментом с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 10) при тех же самых условиях реакции (например при таких же значениях рН и температуры) или при сравнении с применением каждого фермента при соответствующих ему оптимизированных условиях реакции (например оптимизированных значениях рН и температуры), которые могут отличаться друг от друга.
Превращение ЕЕН в (-)-амброкс или превращение BisEEH в оксид амбры, например, может быть определено с использованием анализа активности, как описано выше, и может быть рассчитано в виде граммов выделяемого продукта на грамм сырья (что может быть рассчитано в виде показателя превращения в молярных процентах).
Любая ссылка здесь на показатель превращения 99%/100% субстрата гомофарнезола в (-)-амброкс, как она здесь используется, представляет собой ссылку на 99%-ное/100%-ное превращение изомера гомофарнезола (т.е. ЕЕН), способного превращаться в (-)-амброкс при использовании фермента SHC/HAC или варианта фермента.
Любая ссылка здесь на показатель превращения 99%/100% субстрата бисгомофарнезола в оксид амбры, как она здесь используется, представляет собой ссылку на 99%-ное/100%-ное превращение изомера бисгомофарнезола (т.е. BisEEH), способного превращаться в оксид амбры при использовании фермента SHC/HAC или варианта фермента.
Оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2, например, может быть равной или более, чем примерно 35°С.Например, оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2 может находиться в диапазоне от примерно 40°С до примерно 50°С, например от примерно 42°С до примерно 48°С, или от примерно 44°С до примерно 46°С. Например, оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2 может составлять примерно 45°С. Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальной температуре для варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальное значение рН для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2, например, может быть равным или более, чем примерно 5,4. Например, оптимальное значение рН для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2 может находиться в диапазоне от примерно 5,2 до примерно 6,0, например от примерно 5,4 до примерно 5,8, например от примерно 5,6 до примерно 5,8. Например, оптимальный рН для вариантов фермента SHC/HAC Аас 215G2 может составлять примерно 5,6 или примерно 5,8. Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальном рН для варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде раскрытого здесь способа получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 0,010% масс./масс. до примерно 0,10% масс./масс. Например, оптимальная концентрация SDS может составлять от примерно 0,040% масс./масс. до примерно 0,080% масс./масс., например примерно 0,050% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 4 г/л с клетками, доведенными до OD650нм (оптическая плотность при 650 нм) 10. Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде раскрытых здесь способов получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 1,0% масс./масс. до примерно 1,5% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток. Например, оптимальная концентрация SDS может составлять от примерно 1,2% масс./масс. до примерно 1,4% масс./масс., например примерно 1,3% масс./масс., при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток.
Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить в оптимальном диапазоне температуры, или при оптимальной температуре, и/или в оптимальном диапазоне рН, или при оптимальном рН, и/или в оптимальном диапазоне концентрации SDS, или при оптимальной концентрации SDS для конкретного используемого фермента, как изложено в Таблице 7, или 9, или 11 в приведенных ниже Примерах.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ С НОВЫМИ МУТАЦИЯМИ В ПОЛОЖЕНИЯХ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ПОЛОЖЕНИЯМ 81, 90, 172, 277, 431, 557 И/ИЛИ 613 в SEP ID NO: 1
Как обсуждалось выше, неожиданно было обнаружено, что варианты фермента SHC/HAC, происходящие от варианта фермента SHC/HAC Aac, раскрытого в WO 2016/170099 (вариант фермента SHC/HAC 215G2), обеспечивают улучшенную ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс и превращения BisEEH в оксид амбры. Новые варианты фермента SHC/HAC имеют две или три аминокислотные модификации, в дополнение к аминокислотным заменам, уже присутствующим в варианте фермента SHC/HAC 215G2.
Ожидается то, что другие варианты фермента SHC/HAC, имеющие одну или более чем одну новую мутацию, идентифицированную в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1, также будут обеспечивать ферментативную активность (например улучшенную ферментативную активность) в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры.
В частности, ожидается то, что варианты фермента SHC/HAC, происходящие от другого вида, не являющегося Аас, но имеющие одну или более новых аминокислотных модификаций, идентифицированных в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1, также будут обеспечивать ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры. В частности, ожидается, что варианты фермента, происходящие от ZmoSHC1, ZmoSHC2, BjpSHC, GmoSHC, TelSHC, ApaSHC1, BmeSHC, SalSHC или ApaSHCA, имеющие одну или более новых аминокислотных модификаций, идентифицированных в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1, также будут обеспечивать ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры.
Следовательно, здесь предложен способ получения (-)-амброкса посредством ферментативного превращения ЕЕН в (-)-амброкс. Также здесь предложен способ получения оксида амбры посредством ферментативного превращения Е,Е-бисгомофарнезола в оксид амбры. В данных способах могут использоваться любые описанные здесь фермент SHC/HAC дикого типа или вариант фермента.
Кроме того, здесь предложен вариант фермента SHC/HAC, имеющий по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
В частности, здесь предложен способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение ЕЕН или смеси, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием варианта SHC/HAC, имеющего по меньшей мере 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
В частности, здесь предложен способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, включающий ферментативное превращение BisEEH или смеси, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием варианта SHC/HAC, имеющего по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа. Например, вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 75,0%-ную, или по меньшей мере примерно 80,0%-ную, или по меньшей мере примерно 85,0%-ную, или по меньшей мере примерно 90,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,5%-ную, или по меньшей мере примерно 96,5%-ную, или по меньшей мере примерно 97,0%-ную, или по меньшей мере примерно 97,5%-ную, или по меньшей мере примерно 98,0%-ную, или по меньшей мере примерно 98,5%-ную, или по меньшей мере примерно 99,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Например, вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь аминокислотную последовательность, имеющую менее чем 100%-ную идентичность, например равную или менее чем примерно 99,5%, или равную или менее чем примерно 99,0% идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 70,0% до примерно 99,5% или от примерно 80,0% до примерно 99,0%, или от примерно 85,0% до примерно 98,5%, или от примерно 90,0% до примерно 98,0% идентичности с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой аминокислотную последовательность AacSHC (SEQ ID NO: 1), ZmoSHC1 (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 (SEQ ID NO: 12), BjpSHC (SEQ ID NO: 13), GmoSHC (SEQ ID NO: 14), TelSHC (SEQ ID NO: 19) или ApaSHC1 (SEQ ID NO: 20), BmeSHC (SEQ ID NO: 28), SalSHC (SEQ ID NO: 29), или ApaSHCA (SEQ ID NO: 30). В частности, аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа может представлять собой аминокислотную последовательность AacSHC (SEQ ID NO: 1).
Следовательно, в некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20. Например, вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 75,0%-ную или по меньшей мере примерно 80,0%-ную, или по меньшей мере примерно 85,0%-ную, или по меньшей мере примерно 90,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,5%-ную, или по меньшей мере примерно 96,5%-ную, или по меньшей мере примерно 97,0%-ную, или по меньшей мере примерно 97,5%-ную, или по меньшей мере примерно 98,0%-ную, или по меньшей мере примерно 98,5%-ную, или по меньшей мере примерно 99,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC может, например, иметь аминокислотную последовательность, имеющую менее чем 100%-ную идентичность, например, равную или менее чем примерно 99,5%-ную, или равную или менее чем примерно 99,0%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 70,0%-ной до примерно 99,5%-ной, или от примерно 80,0%-ной до примерно 99,0%-ной, или от примерно 85,0%-ной до примерно 98,5%-ной, или от примерно 90,0%-ной до примерно 98,0%-ной идентичности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
«Процент (%) идентичности» в отношении полипептидной или нуклеотидной последовательности определяется, соответственно, как процент аминокислот или нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотам или нуклеотидам в эталонной последовательности после выравнивания данной последовательности и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательности может достигаться разными способами, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области, например с использованием общедоступной компьютерной программы. Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо и означают любую цепь аминокислот, связанных пептидными связями, независимо от длины или посттрансляционной модификации.
Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, т.е. процент идентичности последовательности, может быть определен посредством выравниваний последовательностей. Такие выравнивания могут осуществляться в соответствии с несколькими известными в данной области алгоритмами, предпочтительно с использованием математического алгоритма Karlin и Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), с использованием hmmalign (пакет HMMER, http://hmmer.wust1.edu/) или с использованием алгоритма CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), доступного, например, на https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. или программы GAP (математический алгоритм Университета Айовы), или математического алгоритма Myers и Miller (1989 - Cabios 4: 11-17). Предпочтительными используемыми параметрами являются параметры по умолчанию, как они изложены на https://www.ebi.ас.uk/Tools/msa/clustalo/.
Процент идентичности последовательности может быть рассчитан с использованием, например, BLAST, BLAT или BlastZ (или BlastX). Аналогичный алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTP Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Поиски полинуклеотидов BLAST можно проводить с использованием программы BLASTN, балл равен 100, длина слова равна 12, с получением полинуклеотидных последовательностей, которые являются гомологичными тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют релевантный белок. Поиски белка BLAST можно проводить с использованием программы BLASTP, балл равен 50, длина слова равна 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных данному полипептиду.
Для получения выравниваний с пробелами с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию соответствующих программ. Анализ совпадения последовательности может быть дополнен установленными методиками картирования гомологии, подобными Shuffle-LAGAN (Brudno М., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) или случайным полям Маркова. Когда в настоящей заявке дается ссылка на проценты идентичности последовательности, данные проценты рассчитывают по отношению к полной длине более длинной последовательности, если конкретно не указано иное.
В конкретных воплощениях % двух последовательностей определяют с использованием CLUSTAL О (версии 1.2.4).
В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC может иметь число аминокислотных модификаций, равное или менее чем примерно 200 по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь число аминокислотных модификаций, равное или менее чем примерно 150, или равное или менее чем примерно 120, или равное или менее чем примерно 100, или равное или менее чем примерно 95, или равное или менее чем примерно 90, или равное или менее чем примерно 85, или равное или менее чем примерно 80, или равное или менее чем примерно 75, или равное или менее чем примерно 70, или равное или менее чем примерно 65, или равное или менее чем примерно 60, или равное или менее чем примерно 55, или равное или менее чем примерно 50, или равное или менее чем примерно 45, или равное или менее чем примерно 40, или равное или менее чем примерно 35, или равное или менее чем примерно 30, или равное или менее чем примерно 25, или равное или менее чем примерно 20, или равное или менее чем примерно 15, или равное или менее чем примерно 10 по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь по меньшей мере примерно 1 или по меньшей мере примерно 2, или по меньшей мере примерно 3, или по меньшей мере примерно 4, или по меньшей мере примерно 5, или по меньшей мере примерно 6 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 1 до примерно 30 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 2 до примерно 25 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 3 до примерно 20 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 4 до примерно 15 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 5 до примерно 10 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Аминокислотные модификации могут представлять собой, например, вставки, делеции и/или замены, как описано выше. Например, данные аминокислотные модификации могут представлять собой замены, например неконсервативные замены.
В некоторых воплощениях единственными аминокислотными модификациями по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа (например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30) являются замены (т.е. нет вставок или делеций).
Аминокислотные модификации определяют по отношению к эталонной последовательности. Аминокислотная модификация относительно эталонной последовательности означает, что аминокислотная последовательность варианта последовательности отличается от эталонной последовательности.
Аминокислотам в эталонной последовательности и варианте последовательности может быть присвоен номер, где нумерация начинается с аминокислоты на N-конце полипептида (т.е. аминокислота на N-конце полипептида имеет номер 1, следующая аминокислота имеет номер 2 и т.д.). «Положение» в эталонной последовательности относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в эталонной последовательности, идентифицированному посредством конкретной нумерации аминокислот в эталонной последовательности. «Положение» последовательности варианта относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в последовательности варианта, идентифицированному посредством конкретной нумерации аминокислот в последовательности варианта.
Поскольку последовательность варианта может включать делеций или вставки по сравнению с эталонной последовательностью, аминокислоты в последовательности варианта могут быть пронумерованы по-другому относительно таких же аминокислот в эталонной последовательности. В качестве примера, при вставке аминокислоты между аминокислотами 131 и 132 в SEQ ID NO: 1, аминокислота после вставки будет иметь номер 133 в последовательности варианта, в то время как она сохраняет номер 132 в эталонной последовательности. В данном примере положение в последовательности варианта, которое соответствует положению 132 в эталонной последовательности, представляет собой положение 133. Следовательно, аминокислоты в последовательности варианта, которые сохранились из эталонной последовательности, могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности. Другими словами, «положение» в последовательности варианта может быть определено посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности. В частности, замены в последовательности варианта по сравнению с эталонной последовательностью могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности, несмотря на любые вставки и/или делеций в эталонной последовательности. Когда аминокислоты эталонной последовательности были делетированы, в последовательности варианта нет «соответствующего положения». Когда нет вставок или делеций по сравнению с эталонной последовательностью (т.е. имеются только замены), «соответствующее положение» эталонной последовательности будет тем же самым, что и положение в последовательности варианта.
Ферменты SHC/HAC дикого типа из разных видов имеют разную длину полипептида. Последовательности дикого типа можно выравнивать с использованием алгоритмов, как описано выше, чтобы идентифицировать «соответствующие положения» в двух разных ферментах SHC/HAC дикого типа. Следовательно, аминокислота в положении варианта последовательности, соответствующем положению в эталонной последовательности, может представлять собой, например, другой аминокислотный остаток и/или может иметь другой номер по отношению к номеру эталонной последовательности. В качестве примера, аминокислота М в положении 132 в AacSHC (SEQ ID NO: 1) может соответствовать аминокислоте Y в положении 185 в ZmoSHC1 (SEQ ID NO: 11).
Аминокислотная модификация, следовательно, может быть определена по отношению к двум разным эталонным последовательностям. Например, аминокислотную модификацию может представлять собой изменение по сравнению с первой эталонной последовательностью (например последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, от которой происходит вариант), и положение аминокислотной модификации в последовательности варианта может быть определено посредством ссылки на вторую эталонную последовательность (например AacSHC (SEQ ID NO: 1)). Таким образом, аминокислотную модификацию в варианте фермента SHC/HAC может быть определено относительно первого фермента SHC/HAC дикого типа в положении, определенном посредством ссылки на второй фермент SHC/HAC дикого типа.
Аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Например, аминокислотные модификации могут находиться в одном или более положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 81, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотную модификацию относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и в двух положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и во всех положениях, соответствующих положениям 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 90 и 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 172 и 277 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 81, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 81, 431 и 557 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены, например неконсервативные замены. Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, последовательность дикого типа может представлять собой SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) в последовательности данного варианта может быть не 557.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, данная новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой треонин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты в ферменте SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеций, номером новой аминокислоты (X) может быть не 81.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой основную аминокислоту (т.е. His, Lys или Arg). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гистидин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты в ферменте SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 90.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu, Ile). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой аланин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты в ферменте SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 172.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn, Gln). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой треонин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 277.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой основную аминокислоту (т.е. His, Lys, Arg). Например, данная новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой лизин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) может быть не 431.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, данная новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой лейцин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа на другую аминокислоту (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номером новой аминокислоты (X) может быть не 613.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, данная новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой серии.
Аминокислоты и положения в последовательностях ZmoSHC1, ZmoSHC2, BjpSHC, GmoSHC, TelSHC и ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 19 и 20 соответственно), которые соответствуют аминокислотам AacSHC (SEQ ID NO: 1) (например аминокислотам в положениях 81, 431, 557 и 613 в AacSHC), показаны на Фиг. 9А. Аминокислоты и положения в последовательностях ZmoSHC1, ZmoSHC2, BjpSHC, GmoSHC, TelSHC, ApaSHC1, BmeSHC, SalSHC и ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 19, 20, 28, 29 и 30 соответственно), которые соответствуют аминокислотам AacSHC (SEQ ID NO: 1) (например аминокислотам в положениях 81, 431, 557 и 613 в AacSHC), показаны на Фиг. 9Б.
Положения аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа выделены белой буквой на черном фоне. Аминокислоты непосредственно над или под выделенной аминокислотой, следовательно, представляют собой аминокислоты и положения в ZmoSHC2, BjaSHC, GmoSHC, ApaSHC1, ApaSHC1, ZmoSHC1 и TelSHC, которые соответствуют положениям 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 AacSHC (SEQ ID NO: 1). Например, аминокислота в BjaSHC, GmoSHC, ApaSHC1 и ZmoSHC1, которая соответствует аминокислоте Y в положении 81 AacSHC (SEQ ID NO: 1), представляет собой Y. Аминокислота в ZmoSHC2 и TelSHC, которая соответствует аминокислоте Y в положении 81 AacSHC (SEQ ID NO: 1), представляет собой F. Положение 84 в TelSHC представляет собой положение TelSHC, которое соответствует положении 81 в AacSHC (SEQ ID NO: 1).
В некоторых воплощениях одна или более исходных аминокислотных модификаций в варианте фермента SHC/HAC 215G2 (по сравнению с SHC Аас дикого типа (SEQ ID NO: 1)) может сохраняться в описанных здесь новых вариантах фермента SHC/HAC. Аминокислотные модификации в варианте фермента SHC/HAC 215G2 по сравнению с SHC Аас дикого типа представляли собой замены M132R, A224V и I432T (т.е. замену остатка М в положении 132 остатком R, замену остатка А в положении 224 остатком V и замену остатка I в положении 432 остатком Т).
Следовательно, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой замены.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь одну, две или три аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 132 и 432 в SEQ ID NO: 1.
Например, аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC может иметь аминокислотные модификации относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеций, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 132.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Tip, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой основную аминокислоту (т.е. His, Lys или Arg). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой аргинин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 224.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Val, Leu или Ile). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой валин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 432.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой треонин.
Аминокислоты и положения в последовательностях ZmoSHC1, ZmoSHC2, BjpSHC, GmoSHC, TelSHC и ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 19 и 20 соответственно), которые соответствуют аминокислотам AacSHC (SEQ ID NO: 1) (например в положениях 132, 224 и 432 в AacSHC), показаны на Фиг. 9.
Описанные здесь варианты фермента SHC/HAC, например, могут дополнительно иметь одну или более аминокислотных модификаций (например замены) в других положениях AacSHC, идентифицированных в WO 2016/170099.
Следовательно, описанные здесь варианты фермента SHC/HAC могут иметь одну или более дополнительных аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 77, 92, 129, 579, 601 и/или 605 в SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более замен аминокислот относительно фермента SHC/HAC дикого типа (например консервативные или неконсервативные замены) в положениях, соответствующих положениям 77, 92, 129, 579, 601 и/или 605 в SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 77.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой аланин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 92.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой валин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 129.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой лейцин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 579.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой основную аминокислоту (т.е. His, Lys, Arg). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гистидин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеций, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 601.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой ароматическую аминокислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой тирозин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеций, номер новой аминокислоты (X) в последовательности варианта может быть не 605.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой ароматическую аминокислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe). Например, новая аминокислота в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой триптофан.
Положения аминокислот в последовательностях TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13) и GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), которые соответствуют положениям аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа, выделены белой буквой на черном фоне в AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) на Фиг. 9А.
Положения аминокислот в TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13), GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), Bme SHC дикого типа (SEQ ID NO; 28), SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29) и ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30), которые соответствуют положениям аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа, выделены белой буквой на черном фоне в AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) на Фиг. 9Б.
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь одну или более дополнительных аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 37, 174 и/или 601 в SEQ ID NO: 1. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более аминокислотных замен (например консервативную или неконсервативную) относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 37, 174 и/или 601 в SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь отличную длину от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) может быть не 37.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Val, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой нейтральную гидрофильную аминокислоту (т.е. Cys, Ser, Thr, Asn или Gln), например глутамин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь длину, отличную от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) может быть не 174.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Leu, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp, Tyr или Phe. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой гидрофобную аминокислоту (т.е. Met, Ala, Val, Leu или Ile), например изолейцин.
Аминокислотная модификация относительно аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой замену аминокислоты фермента SHC/HAC дикого типа другой аминокислотой (X). Как отмечено выше, поскольку последовательность дикого типа может иметь длину, отличную от SEQ ID NO: 1, и поскольку данный вариант может дополнительно содержать вставки и/или делеции, номер новой аминокислоты (X) может быть не 601.
Новая аминокислота (X) в аминокислотной последовательности варианта фермента SHC/HAC в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, например, может представлять собой Met, Ala, Leu, Val, Ile, Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Gly, Pro, Trp или Tyr. Например, новая аминокислота (X) в варианте фермента SHC/HAC может представлять собой ароматическую аминокислоту (т.е. Trp, Tyr, Phe), например тирозин.
Положения аминокислот в последовательностях TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13) и GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), которые соответствуют положениям аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа, выделены белой буквой на черном фоне в AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) на Фиг. 9А.
Положения аминокислот в TelSHC дикого типа (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 20), ZmoSHC1 дикого типа (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 дикого типа (SEQ ID NO: 12), BjpSHC дикого типа (SEQ ID NO: 13), GmoSHC дикого типа (SEQ ID NO: 14), Bme SHC дикого типа (SEQ ID NO; 28), SalSHC дикого типа (SEQ ID NO: 29) и ApaSHCA дикого типа (SEQ ID NO: 30), которые соответствуют положениям аминокислот 81, 90, 132, 224, 172, 277, 431, 432, 557 и 613 в AacSHC дикого типа, выделены белой буквой на черном фоне в AacSHC дикого типа (SEQ ID NO: 1) на Фиг. 9Б.
Рассматривается любая комбинация описанных здесь аминокислотных модификаций. В частности, рассматриваются комбинации аминокислотных модификаций в положениях, соответствующих комбинациям аминокислотных модификаций, идентифицированных здесь в AacSHC и в WO 2016/17009.
В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC является идентичным SEQ ID NO: 1 за исключением следующих аминокислотных замен:
(1) M132R, A224V, I432T, А557Т и H4331L (SEQ ID NO: 2); или
(2) M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S (SEQ ID NO: 3); или
(3) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и R613S (SEQ ID NO: 4); или
(4) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и H431L (SEQ ID NO: 5); или
(5) M132R, A224V, I432T, Т90А и R613S (SEQ ID NO: 17); или
(6) M132R, A224V, I432T, А172Т и M277K (SEQ ID NO: 18).
Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут иметь повышенную ферментативную активность в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс или превращения BisEEH в оксид амбры по сравнению с ферментом SHC 215G2. Повышенная ферментативная активность может относиться к любому аспекту ферментативного превращения ЕЕН в (-)-амброкс или ферментативного превращения BisEEH в оксид амбры, включая, например, повышенное общее превращения ЕЕН или BisEEH, повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH (например в первые 6 часов или в первые 12 часов реакции), повышенное производство (-)-амброкса или оксида амбры и пониженное производство побочных продуктов. Повышенная ферментативная активность в общем случае может транслироваться в повышенную продуктивность в общем, которая может быть определена в показателях (-)-амброкса или оксида амбры, полученных на литр объема реакционной смеси и за час времени биопревращения, или (-)-амброкса или оксида амбры, полученных на литр объема реакционной смеси за час времени реакции (т.е. времени после добавления субстрата) и на грамм биокатализатора, используемого в данной реакции.
Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенное превращение ЕЕН или BisEEH по сравнению с ферментом SHC 215G2. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенный уровень превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению со способом с использованием фермента SHC 215G2. Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению с ферментом SHC 215G2. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH по сравнению с ферментом SHC 215G2.
Новые варианты фермента SHC/HAC, например, могут обеспечивать повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH в течение первых 4 часов или в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов, или в течение первых 24 часов реакции по сравнению с ферментом SHC 215G2. Следовательно, описанный здесь способ может иметь повышенную скорость превращения ЕЕН или BisEEH в течение первых 4 часов или в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов, или в течение первых 24 часов реакции по сравнению с ферментом SHC 215G2. Это может быть при сравнении с применением обоих ферментов (т.е. нового варианта фермента SHC/HAC и фермента SHC 215G2) при одинаковых условиях реакции (например одинаковых значениях рН и температуры) или при сравнении с применением каждого фермента в оптимизированных для них условиях реакции (например оптимизированных значениях рН и температуры), которые могут отличаться друг от друга.
Например, новый вариант фермента SHC/HAC может осуществлять превращение или данный способ может обеспечивать по меньшей мере примерно 40%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может осуществлять превращение или данный способ может обеспечивать по меньшей мере примерно 45%-ное или по меньшей мере примерно 50%-ное, или по меньшей мере примерно 55%-ное, или по меньшей мере примерно 60%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может осуществлять превращение или данный способ может обеспечивать по меньшей мере примерно 30%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 6 часов реакции. Например, новый вариант фермента SHC/HAC может осуществлять превращение или данный способ может обеспечивать по меньшей мере примерно 35%-ное или по меньшей мере примерно 45%-ное, или по меньшей мере примерно 50%-ное, или по меньшей мере примерно 55%-ное превращение ЕЕН или BisEEH в первые 12 часов реакции. Это может быть при сравнении с применением обоих ферментов (т.е. нового варианта фермента SHC/HAC и фермента SHC 215G2) при одинаковых условиях реакции (например одинаковых значениях рН и температуры) или при сравнении с применением каждого фермента в оптимизированных для них условиях реакции (например оптимизированных значениях рН и температуры), которые могут отличаться друг от друга.
Превращение ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры, например, можно определять с использованием анализа активности, как описано выше, и можно рассчитывать в виде граммов выделяемого продукта на грамм сырья (что можно рассчитывать в виде показателя превращения в молярных процентах).
При использовании в данном описании изобретения, любая приведенная здесь ссылка на 99%/100%-ный показатель превращения для субстрата - гомофарнезола в (-)-амброкс или субстрата - бисгомофарнезола в оксид, представляет собой ссылку на 99%/100%-ное превращение изомера, способного превращаться в (-)-амброкс или оксид амбры с использованием фермента или варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальная температура для варианта фермента SHC/HAC, например, может быть равна или более чем примерно 35°С. Например, оптимальная температура для варианта фермента SHC/HAC может находиться в диапазоне от примерно 40°С до примерно 50°С, например от примерно 42°С до примерно 48°С, или от примерно 44°С до примерно 46°С. Например, оптимальная температура для варианта фермента SHC/HAC может составлять примерно 45°С. Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальной температуре для варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальный рН для варианта фермента SHC/HAC, например, может быть равен или больше чем примерно 5,4. Например, оптимальный рН для варианта фермента SHC/HAC может находиться в диапазоне от примерно 5,2 до примерно 6,0, например от примерно 5,4 до примерно 5,8, например от примерно 5,6 до примерно 5,8. Например, оптимальный рН варианта фермента SHC/HAC может составлять примерно 5,6 или примерно 5,8. Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальном рН для варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде для раскрытых здесь способов получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 0,010% масс./масс. до примерно 0,10% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 4 г/л с клетками до OD650нм 10. Например, оптимальная концентрация SDS может составлять от примерно 0,040% масс./масс. до примерно 0,080% масс./масс., например примерно 0,050% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 4 г/л с клетками до OD650нм 10. Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде для раскрытых здесь способов получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 1,0% масс./масс. до примерно 1,5% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток. Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде раскрытых здесь способов получения (-)-амброкса или оксида амбры может составлять, например от примерно 0,45% масс./масс. до примерно 0,85% масс./масс., например примерно 0,65% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л со 125 г/л клеток. Например, оптимальная концентрация SDS может составлять, от примерно 1,2% масс./масс. до примерно 1,4% масс./масс., например примерно 1,3% масс./масс. при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток.
Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить в оптимальном диапазоне температур или при оптимальной температуре, и/или в оптимальном диапазоне рН или при оптимальном рН, и/или в оптимальном диапазоне концентрации SDS или при оптимальной концентрации SDS для конкретного используемого фермента, как изложено в Таблице 7, или 9, или 11 в приведенных ниже Примерах.
Следующие пронумерованные абзацы определяют дополнительные аспекты настоящего раскрытия.
1. Способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
2. Способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, включающий ферментативное превращение Е,Е-бисгомофарнезола (BisEEH) или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
3. Способ по любому из аспектов 1-2, где фермент SHC/HAC дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.
4. Способ по любому из аспектов 1-3, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную или по меньшей мере примерно 95,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
5. Способ по любому из аспектов 1-4, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 90 и 613 в SEQ ID NO: 1.
6. Способ по любому из аспектов 1-4, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 172 и 277 в SEQ ID NO: 1.
7. Способ по любому из аспектов 1-4, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
8. Способ по аспекту 7, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
9. Способ по аспекту 7, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
10. Способ по аспекту 8 или 9, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
11. Способ по любому из аспектов 1-10, где одна или более, например все аминокислотные модификации в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 представляют собой замены, например неконсервативные замены.
12. Способ по любому из аспектов 1-11, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например лизин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например серии.
13. Способ по любому из аспектов 1-12, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1;
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1 и
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1.
14. Способ по аспекту 13, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например аргинин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин.
15. Способ по любому из аспектов 1-14, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1.
16. Способ по аспекту 15, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например триптофан.
17. Способ по любому из аспектов 1-16, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранную из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1.
18. Способ по аспекту 17, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например глутамин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например изолейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин.
19. Способ по любому из аспектов 1-18, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.
20. Способ по любому из аспектов 1-19, который включает культивирование рекомбинантных клеток-хозяев, которые продуцируют вариант фермента SHC/HAC.
21. Способ по аспекту 20, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент SHC/HAC, например, выбранный из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
22. Способ по любому из аспектов 1-21, где (-)-амброкс продуцируется в смеси по меньшей мере с одним или более побочными продуктами (II), (III) или (IV).
23. Способ получения (-)-амброкса или реакционной смеси, содержащей (-)-амброкс, по любому из аспектов 1-22, включающий ферментативное превращение (3Е,7Е)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1,
где смесь изомеров, содержащая ЕЕН, выбрана из одной или более следующих групп, состоящих из [(3Е,7Е) и [(3Z,7E)], и/или [(3Е,7Е) и (3E,7Z)], и/или [(3Z,7E), (3Е,7Е) и (3E,7Z)], также обозначенных как [EE:EZ], [EE:ZE] и [EE:EZ:ZE] соответственно.
24. Способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, по любому из аспектов 1-23, включающий ферментативное превращение (Е,Е)-бисгомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1,
где смесь изомеров, содержащая BisEEH, выбрана из одной или более следующих групп, состоящих из [(Е,Е) и [(Z,E)], и/или [(Е,Е) и (E,Z)], и/или [(Z,E), (Е,Е) и (E,Z)], также обозначенных как [EE:EZ], [EE:ZE] и [EE:EZ:ZE] соответственно.
25. (-)-Амброкс, полученный или получаемый способом по любому из аспектов 1-24, например, в аморфной или кристаллической форме.
26. Оксид амбры, полученный или получаемый способом по любому из аспектов 1-25, например, в аморфной или кристаллической форме.
27. Применение (-)-амброкса по аспекту 25 и/или оксида амбры по аспекту 26 в виде части ароматизатора, или косметического средства, или потребительского продукта.
28. Ароматизатор, или косметическое средство, или потребительский продукт, содержащий (-)-амброкс по аспекту 25 и/или оксида амбры по аспекту 26.
29. Вариант фермента SHC/HAC, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, выбранном из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
30. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 29, где фермент SHC/HAC дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.
31. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 29 или 30, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную или по меньшей мере примерно 95,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
32. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-31, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 90 и 613 в SEQ ID NO: 1.
33. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-31, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 172 и 277 в SEQ ID NO: 1.
34. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-31, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
35. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-31, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
36. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-31, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
37. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 35 или 36, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
38. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-37, где одна или более, например все, из аминокислотных модификаций в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 или 613 представляют собой замены, например неконсервативные замены.
39. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-38, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например лизин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например серии.
40. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранные из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1;
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1; и
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1.
41. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 40, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например аргинин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин.
42. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-41, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1.
43. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 42, в котором:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например триптофан.
44. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-43, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1.
45. Вариант фермента SHC/HAC по аспекту 44, в котором:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например глутамин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например изолейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин.
46. Вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-45, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
47. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 29-46.
48. Последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 47, которая выбрана из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
49. Конструкция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 47 или 48.
50. Вектор, содержащий конструкцию по аспекту 49.
51. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 47 или 48, конструкцию по аспекту 49 или вектор по аспекту 50.
52. Рекомбинантная клетка-хозяин по аспекту 51, где конструкция интегрирована в геном клетки-хозяина.
53. Рекомбинантная клетка-хозяин по аспекту 51 или 52, которая выбрана из прокариотических, дрожжевых, растительных клеток-хозяев и/или клеток-хозяев насекомых.
54. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из аспектов 51-53, которая представляет собой бактерию рода, выбранного из Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus и Lactococcus, например, где рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
55. Способ по любому из аспектов 1-24, где смесь изомеров гомофарнезола, содержащая ЕЕН, содержит смесь изомеров EE:EZ.
56. Способ по аспекту 55, где смесь изомеров EE:EZ находится в массовом отношении: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 или EE:EZ 66:34, или смесь изомеров EE:EZ выбрана из группы, состоящей из: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 и EE:EZ 66:34.
57. Способ по аспекту 56, где смесь изомеров EE:EZ находится в массовом отношении 80:20.
58. Способ по любому из аспектов 1-24 или по любому из аспектов 55-57, где массовое отношение биокатализатора SHC/HAC к ЕЕН или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН (предпочтительно смеси изомеров EE:EZ в массовом соотношении 80:20), находится в диапазоне примерно 0,5-2:1 или примерно 0,25-2:1, или примерно 0,1-2:1, или примерно 1:1, или примерно 0,5:1.
59. Способ по аспекту 58, где массовое отношение биокатализатора SHC/HAC к ЕЕН или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН (предпочтительно смеси изомеров EE:EZ в массовом соотношении 80:20), находится в диапазоне примерно 1:1, или примерно 0,5:1, или примерно 0,1:1.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ SHC/HAC И ВАРИАНТЫ ФЕРМЕНТОВ
Дополнительно неожиданно было обнаружено, что варианты фермента SHC/HAC также действуют на другие субстраты, такие как Е,Е-бисгомофарнезол, с образованием таких продуктов, как оксид амбры.
Кроме того, неожиданно было обнаружено, что некоторые ферменты SHC дикого типа обеспечивают улучшенную (т.е. более высокую) селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола при сравнении с AacSHC WT.
Следовательно, ожидается, что другие ферменты SHC/HAC дикого типа и другие варианты ферментов SHC/HAC дикого типа также будут обеспечивать ферментативную активность (например улучшенную ферментативную активность) в отношении превращения ЕЕН в (-)-амброкс и/или превращения BisEEH в оксид амбры.
Следовательно, здесь предложен способ получения (-)-амброкса посредством ферментативного превращения ЕЕН в (-)-амброкс. Здесь также предложен способ получения оксида амбры посредством ферментативного превращения Е,Е-бисгомофарнезола в оксид амбры. В данных способах может применяться любой описанный здесь фермент SHC/HAC дикого типа или вариант фермента.
Кроме того, здесь предложен фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, имеющий по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
В частности, здесь предложен способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение ЕЕН или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC, имеющего по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
В частности, здесь предложен способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, включающий ферментативное превращение BisEEH или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC, имеющего по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
«Селективность» фермента или варианта фермента относится к способности данного фермента или варианта фермента взаимодействовать с конкретным субстратом по сравнению с другим субстратом. Например, фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT, который является селективным в отношении ЕЕН по сравнению другими изомерами гомофарнезола, или селективным в отношении BisEEH по сравнению с другими изомерами гомофарнезола, означает, что фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT с большей вероятностью превращает ЕЕН, чем другие изомеры гомофарнезола, или с большей вероятностью превращает BisEEH, чем другие изомеры бисгомофарнезола.
Например, % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть по меньшей мере на примерно 1 процентный пункт больше, чем % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть по меньшей мере на примерно 2 или по меньшей мере на примерно 3, или по меньшей мере на примерно 4 процентных пункта больше, чем % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть вплоть до примерно 40, или вплоть до примерно 30, или вплоть до примерно 20, или вплоть до примерно 15, или вплоть до примерно 10 процентных пунктов больше, чем % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть на от примерно 1 до примерно 40, или от примерно 2 до примерно 30, или от примерно 3 до примерно 20, или от примерно 4 до примерно 10 процентных пунктов больше, чем % по массе от общего количества продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Совокупный продукт, образовавшийся в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT, или AacSHC WT, или варианта AacSHC WT, например, может содержать, по существу состоять из или состоять из описанных здесь соединений формулы (I) ((-)-амброкс) и формулы (IV) при использовании ЕЕН в качестве субстрата. Совокупный продукт, образовавшийся в результате взаимодействия фермента SHC WT, или варианта фермента SHC WT, или AacSHC WT, или варианта AacSHC WT, например, может содержать, по существу состоять, или состоять из описанных здесь соединений формулы (X) и/или формулы (XII) при использовании bisEEH в качестве субстрата.
Например, % по массе (-)-амброкса, образовавшегося при использовании фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT, например, может быть по меньшей мере на примерно 1 процентный пункт больше, чем % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть по меньшей мере на примерно 2 или по меньшей мере на примерно 3, или по меньшей мере на примерно 4 процентных пунктов больше, чем % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть вплоть до примерно 40, или вплоть до примерно 30, или вплоть до примерно 20, или вплоть до примерно 15, или вплоть до примерно 10 процентных пунктов больше, чем % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН. Например, % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT с ЕЕН, может быть на от примерно 1 до примерно 40 или от примерно 2 до примерно 30, или от примерно 3 до примерно 20, или от примерно 4 до примерно 10 процентных пунктов больше, чем % по массе (-)-амброкса, образовавшегося в результате взаимодействия AacSHC WT с ЕЕН.
Селективность фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT также можно сравнивать с селективностью AacSHC WT или варианта AacSHC WT путем сравнения соотношения превращения EEH:EZH (т.е. % превращения ЕЕН: % превращения EZH) или соотношения превращения bisEEH:bisEZH (т.е. % превращения bisEEH: % превращения bisEZH) для взаимодействий с использованием каждого фермента. Это может быть определено путем измерения количества ЕЕН или EZH, или bisEEH и bisEZH, остающихся в реакционной смеси при завершении реакции. В качестве альтернативы, селективность фермента SHC WT или варианта фермента SHC WT также можно сравнивать с селективностью AacSHC WT или варианта AacSHC WT путем сравнения соотношения продуктов, возникающих при превращении ЕЕН (соединения формул I и IV) и EZH (соединения формул II и III) соответственно, или при превращении bisEEH (соединения формул X и XII) и bisEZH (XI и XIII) соответственно.
Фермент SHC или вариант фермента SHC WT, например, может обеспечивать соотношение превращения EEH:EZH по меньшей мере примерно 2,0 в способе получения (-)-амброкса из смеси, содержащей ЕЕН и EZH. Например, фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT может обеспечивать отношение превращения EEH:EZH по меньшей мере примерно 2,5, или по меньшей мере примерно 3,0, или по меньшей мере примерно 3,5 в способе получения (-)-амброкса из смеси, содержащей ЕЕН и EZH. Например, фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT может обеспечивать отношение превращения EEH:EZH вплоть до примерно 5,0, или вплоть до примерно 4,5, или вплоть до примерно 4,0 в способе получения (-)-амброкса из смеси, содержащей ЕЕН и EZH. Например, фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT может обеспечивать отношение превращения EEH:EZH в диапазоне от примерно 2,0 до примерно 5,0, или от примерно 2,5 до примерно 4,5, или от примерно 3,0 до примерно 4,0 в способе получения (-)-амброкса из смеси, содержащей ЕЕН и EZH. Оно, например, может отличаться от отношения превращения, обеспечиваемого AacSHC в способе получения (-)-амброкса из смеси, содержащей ЕЕН и EZH, которое, например, может составлять менее чем примерно 2,0.
Фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC), например, может представлять собой SHC, полученный из Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac), Zymomonas mobilis (Zmo), Bradyrhizobium japonicum (Bjp), Gluconobacter morbifer (Gmo), Burkholderia ambifaria, Bacillus anthracis, Methylococcus capsulatus, Frankia alni, Acetobacter pasteurianus (Ара), Thermosynechococcus elongatus (Tel), Streptomyces coelicolor (Sco), Rhodopseudomonas palustris (Rpa), Teredinibacter turnerae (Ttu), Pelobacter carbinolicus (Pca), Tetrahymena pyriformis (Тру), Bacillus megaterium (Bme) или Streptomyces albolongus (Sal) (см., например, WO 2010/139719, US 2012/01345477, WO 2012/066059, содержание которых включено сюда посредством ссылки).
В частности, фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может представлять собой фермент SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac), фермент SHC/HAC Zymomonas mobilis (Zmo), фермент SHC/HAC Bradyrhizobium japonicum (Bjp/Bja), фермент SHC/HAC Acetobacter pasteurianus (Ара), фермент SHC/HAC Bacillus megaterium (Bme) или фермент SHC/HAC Gluconobacter morbifer (Gmo). В частности, фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может представлять собой фермент SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac).
Когда фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT имеет более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола при сравнении с AacSHC и/или вариантами AacSHC, фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) не является ферментом SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac). В частности, когда фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT имеет более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола при сравнении с AacSHC WT и/или вариантами AacSHC WT, фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может быть выбран из TelSHC1, ApaSHC1, ZmoSHC1, ZmoSHC2, BjaSHC, GmoSHC BmeSHC, SalSHC, ApaSHCA. Например, когда фермент SHC WT или вариант фермента SHC WT имеет более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола при сравнении с AacSHC WT и/или вариантами AacSHC WT, фермент SHC/HAC дикого типа (например, от которого может происходить вариант фермента SHC/HAC) может быть выбран из ZmoSHC1, BjaSHC, GmoSHC, ApaSHC1 и BmeSHC.
Для удобства ссылки обозначение "AacSHC" может быть использовано для ссылки на фермент SHC/HAC Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac), "ZmoSHC" может использоваться для ссылки на фермент SHC/HAC Zymomonas mobilis (Zmo), "BjpSHC" или "BjaSHC" может использоваться для ссылки на фермент SHC/HAC Bradyrhizobium japonicum (Bjp), "GmoSHC" может использоваться для ссылки на фермент SHC/HAC Gluconobacter morbifer (Gmo)," BmeSHC" может использоваться для ссылки на фермент SHC/HAC Bacillus megaterium.
Фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа. Например, фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 75,0%-ную или по меньшей мере примерно 80,0%-ную, или по меньшей мере примерно 85,0%-ную, или по меньшей мере примерно 90,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,5%-ную, или по меньшей мере примерно 96,5%-ную, или по меньшей мере примерно 97,0%-ную, или по меньшей мере примерно 97,5%-ную, или по меньшей мере примерно 98,0%-ную, или по меньшей мере примерно 98,5%-ную, или по меньшей мере примерно 99,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Фермент SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую 100%-ную идентичность с ферментом SHC/HAC дикого типа.
Вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую менее чем 100%-ную идентичность, например равную или менее чем примерно 99,5%-ную, или равную или менее чем примерно 99,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 70,0%-ной до примерно 99,5%-ной, или от примерно 80,0%-ной до примерно 99,0%-ной, или от примерно 85,0%-ной до примерно 98,5%-ной, или от примерно 90,0%-ной до примерно 98,0%-ной идентичности с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
Аминокислотная последовательность фермента SHC/HAC дикого типа, например, может представлять собой AacSHC (SEQ ID NO: 1), ZmoSHC1 (SEQ ID NO: 11), ZmoSHC2 (SEQ ID NO: 12), BjpSHC (SEQ ID NO: 13), GmoSHC (SEQ ID NO: 14), TelSHC (SEQ ID NO: 19), ApaSHC1 (SEQ ID NO: 20), BmeSHC (SEQ ID NO: 28), SalSHC (SEQ ID NO: 29) или ApaSHCA (SEQ ID NO: 30). Например, фермент SHC/HAC дикого типа может представлять собой AacSHC (SEQ ID NO: 1).
Следовательно, в некоторых воплощениях фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC может иметь аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 75,0%-ную или по меньшей мере примерно 80,0%-ную, или по меньшей мере примерно 85,0%-ную, или по меньшей мере примерно 90,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,0%-ную, или по меньшей мере примерно 95,5%-ную, или по меньшей мере примерно 96,5%-ную, или по меньшей мере примерно 97,0%-ную, или по меньшей мере примерно 97,5%-ную, или по меньшей мере примерно 98,0%-ную, или по меньшей мере примерно 98,5%-ную, или по меньшей мере примерно 99,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, фермент SHC/HAC может иметь аминокислотную последовательность, имеющую 100%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь аминокислотную последовательность, имеющую менее чем 100%-ную идентичность, например равную или менее чем примерно 99,5%, или равную или менее чем примерно 99,0%, идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 70,0% до примерно 99,5% или от примерно 80,0% до примерно 99,0%, или от примерно 85,0% до примерно 98,5%, или от примерно 90,0% до примерно 98,0% идентичности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
«Процент (%) идентичности» в отношении полипептидной или нуклеотидной последовательности определяется соответственно, как процент аминокислот или нуклеотидов в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотам или нуклеотидам в эталонной последовательности после выравнивания последовательности и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, и не рассматривая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательности может достигаться разными путями, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ. Специалисты в данной области могут определять подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо и означают любую цепь аминокислот, связанных пептидными связями, независимо от длины или посттрансляционной модификации.
Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, т.е. процент идентичности последовательности, можно определять посредством выравниваний последовательности. Такие выравнивания могут проводиться с использованием нескольких известных в данной области алгоритмов, предпочтительно с использованием математического алгоритма Karlin и Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), hmmalign (пакет HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) или с использованием алгоритма CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), доступного, например, на https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, или программы GAP (математический алгоритм Университета Айовы), или математического алгоритма Myers и Miller (1989 - Cabios 4: 11-17). Предпочтительными используемыми параметрами являются параметры по умолчанию, как они изложены на https://www.ebi.ас.uk/Tools/msa/clustalo/.
Процентная идентичность последовательности может быть рассчитана с использованием, например, BLAST, BLAT или BlastZ (или BlastX). Аналогичный алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTP в Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Поиски полинуклеотидов BLAST можно проводить с использованием программы BLASTN, балл равен 100, длина слова равна 12, с получением полинуклеотидных последовательностей, которые гомологичны тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют релевантный белок. Поиски белка BLAST можно проводить с использованием программы BLASTP, балл равен 50, длина слова равна 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных данному полипептиду.
Для получения выравниваний с пробелами с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию соответствующих программ. Анализ совпадения последовательности может быть дополнен установленными методиками картирования гомологии, подобными Shuffle-LAGAN (Brudno М., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) или случайным полям Маркова. Когда в настоящей заявке упоминаются проценты идентичности последовательности, эти проценты рассчитывают по отношению к полной длине более длинной последовательности, если конкретно не указано иное.
В конкретных воплощениях % идентичности двух последовательностей определяют с использованием CLUSTAL О (версии 1.2.4).
В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC может ровно или менее чем примерно 200 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь число аминокислотных модификаций, равное или менее чем примерно 150, или равное или менее чем примерно 120, или равное или менее чем примерно 100, или равное или менее чем примерно 95, или равное или менее чем примерно 90, или равное или менее чем примерно 85, или равное или менее чем примерно 80, или равное или менее чем примерно 75, или равное или менее чем примерно 70, или равное или менее чем примерно 65, или равное или менее чем примерно 60, или равное или менее чем примерно 55, или равное или менее чем примерно 50, или равное или менее чем примерно 45, или равное или менее чем примерно 40, или равное или менее чем примерно 35, или равное или менее чем примерно 30, или равное или менее чем примерно 25, или равное или менее чем примерно 20, или равное или менее чем примерно 15, или равное или менее чем примерно 10 по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь по меньшей мере примерно 1, или по меньшей мере примерно 2, или по меньшей мере примерно 3, или по меньшей мере примерно 4, или по меньшей мере примерно 5, или по меньшей мере примерно 6 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Например, вариант фермента SHC/HAC, может иметь от примерно 1 до примерно 30 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC, может иметь от примерно 2 до примерно 25 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC, может иметь от примерно 3 до примерно 20 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC может иметь от примерно 4 до примерно 15 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30. Например, вариант фермента SHC/HAC, может иметь от примерно 5 до примерно 10 аминокислотных модификаций по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа, например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30.
Аминокислотные модификации, например, могут представлять собой вставки, делеции и/или замены, как описано выше. Например, аминокислотные модификации могут представлять собой замены, например неконсервативные замены.
В некоторых воплощениях единственными аминокислотными модификациями по сравнению с ферментом SHC/HAC дикого типа (например, по сравнению с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30) являются замены (т.е. нет вставок или делеции).
Аминокислотные модификации определяются относительно эталонной последовательности. Аминокислотная модификация относительно эталонной последовательности означает, что аминокислотная последовательность последовательности варианта отличается от эталонной последовательности.
Аминокислотам в эталонной последовательности и последовательности варианта может быть присвоен номер, при этом нумерация начинается с аминокислоты на N-конце полипептида (т.е. аминокислота на N-конце полипептида имеет номер 1, следующая аминокислота имеет номер 2 и т.д.). «Положение» в эталонной последовательности относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в эталонной последовательности, идентифицированному посредством конкретной нумерации аминокислот в эталонной последовательности. «Положение» в последовательности варианта относится к конкретному аминокислотному остатку, присутствующему в последовательности варианта, идентифицированному посредством конкретной нумерации аминокислот в последовательности варианта.
Поскольку последовательность варианта может включать делеций или вставки по сравнению с эталонной последовательностью, аминокислоты в последовательности варианта могут быть пронумерованы отлично от таких же аминокислот в эталонной последовательностью. В качестве примера, при вставке аминокислоты между аминокислотами 131 и 132 в SEQ ID NO: 1 аминокислота после вставки будет иметь номер 133 в последовательности варианта, в то время как она сохраняет номер 132 в эталонной последовательности. В данном примере положение в последовательности варианта, которое соответствует положению 132 в эталонной последовательности, представляет собой положение 133. Следовательно, аминокислоты в последовательности варианта, которые сохранились из эталонной последовательности, могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» эталонной последовательности. Другими словами, «положение» в последовательности варианта может быть определено посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности. В частности, замены в последовательности варианта по сравнению с эталонной последовательностью могут быть определены посредством ссылки на «соответствующее положение» в эталонной последовательности, несмотря на любые вставки и/или делеций в эталонной последовательности. Когда аминокислоты эталонной последовательности были делетированы, в последовательности варианта нет «соответствующего положения». Когда нет вставок или делеций по сравнению с эталонной последовательностью (т.е. имеются только замены), «соответствующее положение» эталонной последовательности будет тем же самым, что и положение в последовательности варианта.
Ферменты SHC/HAC дикого типа из разных видов имеют разную длину полипептидов. Последовательности дикого типа могут быть выровнены с использованием описанных выше алгоритмов для того, чтобы идентифицировать «соответствующие положения» в двух разных ферментах SHC/HAC дикого типа. Следовательно, аминокислота в положении последовательности варианта, соответствующем положению в эталонной последовательности, например, может представлять собой другой аминокислотный остаток и/или может иметь другой номер относительно номера эталонной последовательности. В качестве примера, аминокислота М в положении 132 в AacSHC (SEQ ID NO: 1) может соответствовать аминокислоте Y в положении 185 в ZmoSHC1 (SEQ ID NO: 11).
Аминокислотная модификация, следовательно, может быть определена относительно двух разных эталонных последовательностей. Например, аминокислотная модификация может представлять собой изменение по сравнению с первой эталонной последовательностью (например последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа, от которой происходит вариант) и положение аминокислотной модификации в последовательности варианта может быть определено посредством ссылки на вторую эталонную последовательность (например AacSHC (SEQ ID NO: 1)). Таким образом, аминокислотная модификация в варианте фермента SHC/HAC может быть указана относительно первого фермента SHC/HAC дикого типа в положении, определенном посредством ссылки на второй фермент SHC/HAC дикого типа.
Вариант фермента SHC/HAC, например, может иметь одну или более чем одну конкретную замену или комбинации замен, определенные выше со ссылкой на SEQ ID NO: 1.
В частности, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более чем одну конкретную замену или комбинации замен в одном или более положениях, соответствующих положениям 77, 81, 90, 92, 129, 132, 172, 224, 277, 431, 432, 557, 579, 601, 605 и 613 в SEQ ID NO: 1.
Каждая из данных замен, например, может быть независимо такой, как определено выше в подразделах, озаглавленных «Варианты Aac 215G2» и «Другие варианты с новыми мутациями в положениях, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1".
В частности, вариант фермента SHC/HAC может иметь одну или более из следующих комбинаций замен:
(1) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1;
(2) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 557 и 431 в SEQ ID NO: 1;
(3) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1;
(4) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 557, 81 и 613 в SEQ ID NO: 1;
(5) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 557, 81 и 431 в SEQ ID NO: 1;
(6) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 90 и 613 в SEQ ID NO: 1;
(7) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 172 и 277 в SEQ ID NO: 1;
(8) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432 и 37 в SEQ ID NO: 1;
(9) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432 и 174 в SEQ ID NO: 1;
(10) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 174 и 601 в SEQ ID NO: 1;
(11) замены в положениях, соответствующих положениям 132, 224, 432, 37, 174 и 601 в SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях вариант фермента SHC/HAC является идентичным SEQ ID NO: 1 за исключением следующих аминокислотных замен:
(1) M132R, A224V, I432T, А557Т и H431L (SEQ ID NO: 2); или
(2) M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S (SEQ ID NO: 3); или
(3) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и R613S (SEQ ID NO: 4); или
(4) M132R, A224V, I432T, А557Т, Y81H и H431L (SEQ ID NO: 5); или
(5) M132R, A224V, I432T, Т90А и R613S (SEQ ID NO: 17); или
(6) M132R, A224V, I432T, А172Т и М277К (SEQ ID NO: 18); или
(7) M132R, A224V, I432T и L37Q (SEQ ID NO: 24); или
(8) M132R, A224V, I432T, V174I (SEQ ID NO: 25); или
(9) M132R, A224V, I432T, V174I и F601Y (SEQ ID NO: 26); или
(10) M132R, A224V, I432T, L37Q, V174I и F601Y (SEQ ID NO: 27).
Следующие пронумерованные аспекты определяют дополнительные аспекты настоящего раскрытия:
1. Способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение (3Е,7E)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC,
где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа,
где фермент SHC/HAC WT имеет более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола.
2. Способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, включающий ферментативное превращение E,Е-бисгомофарнезола (BisEEH) или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC,
где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
3. Способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, включающий ферментативное превращение 3Е,7E-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC,
где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30; и
где смесь изомеров, содержащая ЕЕН, выбрана из одной или более чем одной из следующих групп, состоящих из [(3Е,7Е) и [(3Z,7E)], и/или [(3Е,7Е) и (3E,7Z)], и/или [(3Z,7E), (3Е,7Е) и (3E,7Z)], также обозначенных как [EE:EZ], [EE:ZE] и [EE:EZ:ZE] соответственно.
4. Способ получения оксида амбры или смеси, содержащей оксид амбры, включающий ферментативное превращение E,Е-бисгомофарнезола (BisEEH) или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры или смесь, содержащую оксид амбры, с использованием фермента SHC/HAC или варианта фермента SHC/HAC,
где фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30; и
где смесь изомеров, содержащая ЕЕН, выбрана из одной или более чем одной из следующих групп, состоящих из [(Е,Е) и [(Z,E)], и/или [(Е,Е) и (E,Z)], и/или [(Z,E), (Е,Е) и (E,Z)], также обозначенных как [EE:EZ], [EE:ZE] и [EE:EZ:ZE] соответственно.
5. Способ по аспекту 1 или 3, где фермент SHC/HAC имеет более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с другими изомерами гомофарнезола по сравнению с селективностью AacSHC WT.
6. Способ по любому из аспектов 1, 3 или 5, где % по массе совокупного продукта, образовавшегося в результате взаимодействия фермента или варианта фермента SHC/HAC с ЕЕН, по меньшей мере на примерно 1 процентный пункт, например по меньшей мере на примерно 2 процентных пункта или по меньшей мере на примерно 3 процентных пункта больше, чем % по массе совокупного продукта, образовавшегося в результате взаимодействия AacSHC с ЕЕН.
7. Способ по любому из аспектов 1, 3, 5 или 6, где соотношение превращения EEH:EZH составляет по меньшей мере примерно 2,0, например по меньшей мере примерно 2,5 или по меньшей мере примерно 3,0.
8. Способ по любому из аспектов 1-7, где фермент SHC/HAC дикого типа получен из Alicyclobacillus acidocaldarius (Aac), Zymomonas mobilis (Zmo), Bradyrhizobium japonicum (Bjp), Gluconobacter morbifer (Gmo), Burkholderia ambifaria, Bacillus anthracis, Methylococcus capsulatus, Frankia alni, Acetobacter pasteurianus (Ара), Thermosynechococcus elongatus (Tel), Streptomyces coelicolor (Sco), Rhodopseudomonas palustris (Rpa), Teredinibacter turnerae (Ttu), Pelobacter carbinolicus (Pca), Tetrahymena pyriformis, Bacillus megaterium или Streptomyces albolongus.
9. Способ по любому из аспектов 1-8, где фермент SHC/HAC дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, например, где фермент SHC/HAC дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1.
10. Способ по аспекту 1, где смесь изомеров гомофарнезола выбрана из одной или более следующих смесей: [(3Z,7Z), (3Е,7Z), (3Z,7Е), и (3Е,7Е), [(3Z,7Е), (3Е/7Е), и (3Е,7Z)], [(3Z,7Е), и (3Е,7Е), [(3Z,7Е), (3Е,7Z)], и/или [(3Е,7Е) и (3Е,7Z)].
11. Способ по любому из аспектов 1-10, в котором используют солюбилизатор, выбранный из Triton Х-100, Tween 80, тауродезоксихолата, тауродезоксихолата натрия, додецилсульфата натрия (SDS) и/или лаурилсульфата натрия (SLS).
12. Способ по любому из аспектов 1-11, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную или по меньшей мере примерно 95,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
13. Способ по любому из аспектов 1-12, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в одном или более положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
14. Способ по любому из аспектов 1-13, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 90 и 613 в SEQ ID NO: 1.
15. Способ по любому из аспектов 1-13, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 172 и 277 в SEQ ID NO: 1.
16. Способ по любому из аспектов 1-13, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
17. Способ по аспекту 16, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
18. Способ по аспекту 16, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
19. Способ по аспекту 17 или 18, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
20. Способ по любому из аспектов 1-19, где одна или более, например все аминокислотные модификации в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 или 613 представляют собой замены, например неконсервативные замены.
21. Способ по любому из аспектов 1-20, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например лизин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например серии.
22. Способ по любому из аспектов 1-21, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1;
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, и
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1.
23. Способ по аспекту 22, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например аргинин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин.
24. Способ по любому из аспектов 1-23, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1.
25. Способ по аспекту 24, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например триптофан.
26. Способ по любому из аспектов 1-25, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более дополнительных аминокислотных модификации относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1.
27. Способ по аспекту 26, где:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/НАС дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например глутамин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например изолейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин.
28. Способ по любому из аспектов 1-27, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.
29. Способ по любому из аспектов 1-28, который включает культивирование рекомбинантных клеток-хозяев, продуцирующих вариант фермента SHC/HAC.
30. Способ по аспекту 29, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент SHC/HAC, например выбранный из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
31. Способ по любому из аспектов 1-30, где (-)-амброкс продуцируется в смеси по меньшей мере с одним или более побочными продуктами (II), (III) или (IV).
32. (-)-Амброкс, полученный или получаемый способом по любому из аспектов 1-31, например, в аморфной или в кристаллической форме.
33. Оксид амбры, полученный или получаемый способом по любому из аспектов 1-32, например, в аморфной или в кристаллической форме.
34. Применение (-)-амброкса по аспекту 32 и/или оксида амбры по аспекту 33 в виде части ароматизатора, или косметического средства, или потребительского продукта.
35. Ароматизатор, или косметическое средство, или потребительский продукт, содержащий (-)-амброкс по аспекту 32 и/или оксид амбры по аспекту 33.
36. Фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 70,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
37. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 36, где фермент SHC/HAC дикого типа представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 30, например SEQ ID NO: 1.
38. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 36 или 37, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную или по меньшей мере примерно 95,0%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью фермента SHC/HAC дикого типа.
39. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-38, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в одном или более положениях, выбранных из положений, соответствующих положениям 81, 90, 172, 277, 431, 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
40. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 90 и 613 в SEQ ID NO: 1.
41. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации в положениях, соответствующих положениям 172 и 277 в SEQ ID NO: 1.
42. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1.
43. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
44. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-39, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
45. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 43 или 44, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотную модификацию относительно фермента SHC/HAC дикого типа в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
46. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-45, где одна или более, например все, из аминокислотных модификаций в положениях 81, 90, 172, 277, 431, 557 или 613 представляют собой замены, например неконсервативные замены.
47. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-46, в котором:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 90 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 172 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 277 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например лизин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например серии.
48. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-47, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1;
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1; и
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1.
49. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 48, в котором: аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 132 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например аргинин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 224 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например треонин.
50. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-49, где аминокислотная последовательность данного варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1.
51. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 50, в котором: аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 77 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например аланин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 92 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например валин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 129 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 579 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на основную аминокислоту, например гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 605 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например триптофан.
52. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-51, в котором аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет одну или более аминокислотных модификаций относительно аминокислотной последовательности SHC/HAC дикого типа, выбранных из следующих:
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1.
53. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по аспекту 52, в котором: аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на нейтральную гидрофильную аминокислоту, например глутамин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 174 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на гидрофобную аминокислоту, например изолейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 601 в SEQ ID NO: 1, заменяет аминокислоту аминокислотной последовательности фермента SHC/HAC дикого типа на ароматическую аминокислоту, например тирозин.
54. Фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-53, где данный вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.
55. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент или вариант фермента SHC/HAC по любому из аспектов 36-54.
56. Последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 55, которая выбрана из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23.
57. Конструкция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 55 или 56.
58. Вектор, содержащий конструкцию по аспекту 57.
59. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты по аспекту 52 или 53, конструкцию по аспекту 57 или вектор по аспекту 58.
60. Рекомбинантная клетка-хозяин по аспекту 59, где конструкция интегрирована в геном клетки-хозяина.
61. Рекомбинантная клетка-хозяин по аспекту 59 или 60, которая выбрана из прокариотических, дрожжевых, растительных клеток-хозяев и/или клеток-хозяев насекомых.
62. Рекомбинантная клетка-хозяин по любому из аспектов 59-61, которая представляет собой бактерию рода, выбранного из Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus и Lactococcus, например, где данная рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
63. Способ по любому из аспектов 1-31, где смесь изомеров гомофарнезола, содержащая ЕЕН, содержит смесь изомеров EE:EZ.
64. Способ по аспекту 63, где смесь изомеров EE:EZ выбрана из группы, состоящей из: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 и EE:EZ 66:34, или где смесь изомеров EE:EZ представляет собой EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 или EE:EZ 66:34.
65. Способ по аспекту 64, в котором смесь изомеров EE:EZ находится в массовом отношении 80:20.
66. Способ по любому из аспектов 1-31 или 63-65, где массовое отношение фермента SHC/HAC к ЕЕН или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН (предпочтительно смеси изомеров EE:EZ в массовом отношении 80:20), находится в диапазоне примерно 0,5-2:1, или примерно 0,25-2:1, или примерно 0,1-2:1, или примерно 1:1, или примерно 0,5:1.
67. Способ по аспекту 66, где массовое отношение фермента SHC/HAC к ЕЕН или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН (предпочтительно смеси изомеров EE:EZ в массовом отношении 80:20), находится в диапазоне примерно 1:1, или примерно 0,5:1, или примерно 0,1:1.
Следующие пронумерованные аспекты определяют дополнительные аспекты настоящего изобретения.
1. Способ получения (-)-амброкса или смеси, содержащей (-)-амброкс, где ЕЕ-гомофарнезол (ЕЕН) или смесь изомеров, содержащая ЕЕ-гомофарнезол (ЕЕН), ферментативно превращается в (-)-амброкс или смесь, содержащую (-)-амброкс, где ферментативное превращение проводят с использованием биокатализатора скваленгопенциклазы/гомофарнезоламброксциклазы (SHC/HAC), имеющего полипептидную последовательность по меньшей мере с 70%-ной, по меньшей мере с 75%-ной, по меньшей мере с 80%-ной, по меньшей мере с 85%-ной, по меньшей мере с 90%-ной, по меньшей мере с 91%-ной, по меньшей мере с 92%-ной, по меньшей мере с 93%-ной, по меньшей мере с 94%-ной, по меньшей мере с 95%-ной, по меньшей мере с 96%-ной, по меньшей мере с 97%-ной, по меньшей мере с 98%-ной, по меньшей мере с 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO:20 (ApaSHCl), SEQ ID NO: 19 (TelSHC), SEQ ID NO: 14 (GmoSHC), SEQ ID NO:28 (BmeSHC), SEQ ID NO:29 (SalSHC) и/или SEQ ID NO: 30 (ApaSHCA) в условиях взаимодействия, подходящих для получения (-)-амброкса, и где смесь изомеров, содержащая ЕЕН, выбрана из одной или более следующих групп, состоящих из [(3Е,7Е) и [(3Z,7E)], и/или [(3Е,7Е) и (3E,7Z)], и/или [(3Z,7E), (3E,7Е) и (3E,7Z)], также обозначенных как [EE:EZ], и/или [EE:ZE], и/или [EE:EZ:ZE] соответственно.
2. Способ по аспекту 1, который проводят с использованием биокатализатора SHC/HAC по меньшей мере с 70%-ной, по меньшей мере 75%-ной, по меньшей мере 80%-ной, по меньшей мере 85%-ной, по меньшей мере 90%-ной, по меньшей мере 91%-ной, по меньшей мере 92%-ной, по меньшей мере 93%-ной, по меньшей мере 94%-ной, по меньшей мере 95%-ной, по меньшей мере 96%-ной, по меньшей мере 97%-ной, по меньшей мере 98%-ной, по меньшей мере с 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 20 (ApaSHCl) или SEQ ID NO: 28 (BmeSHC).
3. Способ по аспекту 2, где превращение ЕЕН или смеси изомеров, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс происходит при температуре в диапазоне от примерно 30°С до примерно 50°С, например от примерно 35°С до примерно 50°С, при рН в диапазоне от примерно 5 до примерно 7.
4. Способ по аспекту 1 или п. 2, который проводят в присутствии солюбилизатора, например SDS.
5. Способ по любому из аспектов 1-4, который включает (а) культивирование одной или более рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих фермент SHC/HAC, в условиях, которые обеспечивают получение биокатализатора SHC/HAC WT перед превращением ЕЕН или смеси изомеров, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс или в смесь, содержащую (-)-амброкс.
6. Способ по аспекту 5, в котором стадия культивирования и последующая стадия превращения возможно происходят в том же самом реакционном сосуде при разных условиях реакции.
7. Способ по аспекту 6, в котором стадия культивирования осуществляется в диапазоне рН от 6 до 7, и стадия превращения ЕЕН в (-)-амброкс осуществляется в диапазоне рН 4,8-5,5.
8. Способ по любому из аспектов 1-7, где смесь изомеров, содержащая ЕЕН, содержит смесь изомеров EE:EZ.
9. Способ по аспекту 8, где смесь изомеров EE:EZ находится в массовом соотношении, выбранном из группы, состоящей из: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 и EE:EZ 66:34, или смесь изомеров EE:EZ находится в массовом соотношении: EE:EZ 90:10; EE:EZ 80:20; EE:EZ 86:14; EE:EZ 70:30; EE:EZ 69:31 и/или EE:EZ 66:34.
10. Способ по аспекту 9, где смесь изомеров EE:EZ находится в массовом соотношении 80:20.
11. Способ по любому из аспектов 1-10, где массовое отношение биокатализатора SHC/HAC к ЕЕН или к смеси изомеров, содержащей ЕЕН (предпочтительно смесь изомеров EE:EZ с массовым соотношением 80:20), находится в диапазоне примерно 0,5-2:1, или примерно 0,25-2:1, или примерно 0,1-2:1, или примерно 1:1, или примерно 0,5:1.
12. Способ по аспекту 11, где массовое отношение фермента SHC/HAC к ЕЕН или к смеси изомеров, содержащей ЕЕН (предпочтительно смесь изомеров EE:EZ с массовым соотношением 80:20), составляет примерно 1:1, или примерно 0,5:1, или примерно 0,1:1.
13. Способ по любому из аспектов 1-12, где (-)-амброкс получают в смеси с одним или более побочными продуктами (II), (IV) и/или (III).
14. Способ по аспекту 13, где (-)-амброкс выделяют из реакционной среды.
15. Способ по аспекту 14, в котором (-)-амброкс отделяют от реакционной смеси с использованием стадии фильтрования, стадии декантации или комбинации фильтрования и стадии декантации.
16. Способ по аспекту 15, в котором стадия фильтрования представляет собой стадию ленточного фильтрования или ротационного фильтрования.
17. Способ по любому из аспектов 13-16, где перед стадией отделения (-)-амброкс нагревают до максимальной температуры 55°С.
18. Способ по аспекту 17, в котором выделенный (-)-амброкс солюбилизируют в растворителе.
19. Способ по аспекту 18, в котором солюбилизированный (-)-амброкс фильтруют.
20. Способ по аспекту 18 или 19, в котором (-)-амброкс выделяют в твердой форме посредством удаления растворителя выпариванием.
21. Способ по любому из аспектов 14-20, где (-)-амброкс по существу не содержит побочных продуктов (II), (IV) и/или (III).
22. Реакционный продукт, содержащий (-)-амброкс, получаемый способом по любому из аспектов 1-21.
23. Реакционный продукт по аспекту 22, в котором (-)-амброкс находится в твердой форме.
24. Реакционный продукт по аспекту 23, в котором (-)-амброкс находится в аморфной или в кристаллической форме.
25. Способ получения продукта, содержащего (-)-амброкс, включающий включение реакционного продукта по любому из аспектов 22-24 в данный продукт.
26. Способ по аспекту 25, где продукт представляет собой ароматизирующий продукт, косметический продукт, чистящий продукт, детергентный продукт и/или мыльный продукт.
27. Ароматизатор, или косметическое средство, или потребительский продукт для ухода, содержащий реакционный продукт по любому из аспектов 22-24.
28. Композиция ароматизатора, или косметического средства, или потребительского продукта для ухода, содержащая реакционный продукт по любому из аспектов 22-24 и дополнительный компонент.
29. Применение реакционного продукта по любому из аспектов 22-24 в виде части ароматизатора или косметического потребительского продукта для ухода.
АМБРОКС И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
Здесь дополнительно предложены реакционные продукты, полученные описанными здесь способами. Данные реакционные продукты, например, могут содержать, по существу состоять или состоять из (-)-амброкса и одного или более чем одного дополнительного соединения, например одного или более чем одного соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV).
Термин «амброкс», как он здесь используется, включает (-)-амброкс формулы (I), приведенной ниже, а также (-)-амброкс в изомерно чистой форме или в смеси с одной или более следующих молекул формул (II), (III) и/или (IV),
Названия реакционных продуктов формул (I), (II), (III) и (IV) приведены ниже.
(-)-Амброкс известен в торговле как амброкс (Firmenich), амброксан (Henkel), амброфикс (Givaudan), амберлин (Quest), цеталокслево (Firmenich), амбермор (Aromor) и/или норамбренолидовьй эфир (Pacific).
(-)-Амброкс представляет собой важное в промышленности ароматическое соединение, и его использовали в производстве ароматизаторов в течение длительного времени. Особенно желательные полезные органолептические свойства (-)-амброкса происходят от (-)-изомера, а не от (+)-изомера. Аромат (-)-изомера описывается как похожий на мускус, древесный, теплый или амбровый, тогда как энантиомер (+)-амброкс имеет относительно слабые ароматические нотки. Запах и пороги восприятия запаха для продуктов, подобных амброксу, также являются разными. В то время как различные вещества, обогащенные (-)-амброксом, имеются в продаже, желательно получать высокообогащенные (-)-амброксом вещества, в идеале чистый (-)-амброкс. В описанных здесь способах можно получать (-)-амброкс формулы (I) сам по себе или в смеси с побочными продуктами, такими как соединения, показанные в формулах (II), (III) и/или (IV) выше.
(-)-Амброкс может быть получен из склареолида согласно способу получения, как описано ниже. Склареол представляет собой продукт, экстрагированный из дикого растения шалфея мускатного. Однако из-за того, что в данном способе используется природное сырье, имеются потенциальные проблемы в том, что он включает многоэтапную реакцию, его функционирование не является прямым, количество и стабильность поставки сырья не всегда могут быть удовлетворительными, и данная реакция может не быть безвредной для окружающей среды, так как на стадии окислительной деградации (+)-склареола используется окислитель, такой как хромовая кислота или перманганат.
(-)-Амброкс также может быть синтезирован из гомофарнезола с использованием разных путей. В качестве примера гомофарнезол можно получать путем бромирования, цианирования или гидролиза неролидола с получением гомофарнезиловой кислоты, с последующим восстановлением. В качестве альтернативы, гомофарнезол может быть получен из фарнезола, фарнезилхлорида, бета-фарнезена или других субстратов.
В описанных здесь способах можно получать (-)-амброкс формулы (I) сам по себе или в смеси с побочными продуктами, такими как соединение, показанное в формулах (II), (III) и/или (IV). Например, описанными здесь способами можно получать другие стереоизомеры формулы (I).
Следовательно, здесь предложено соединение формулы (I) или композиция, содержащая соединение формулы (I), полученное или получаемое описанными здесь способами, включая все их воплощения.
В некоторых воплощениях не весь гомофарнезол (например ЕЕН) превращается в (-)-амброкс или побочный продукт реакции. Следовательно, описанные здесь композиции, например композиции, полученные или получаемые описанными здесь способами, могут содержать гомофарнезол (например ЕЕН, например в дополнение к соединениям формулы (I) и/или соединениям формул (II), (III) и/или (IV)). Любой остающийся гомофарнезол может быть отделен от других продуктов реакции так, что продукт (-)-амброкс не содержит гомофарнезол. В других воплощениях посредством описанных здесь способов все сырье в виде гомофарнезола превращается в (-)-амброкс формулы (I) или побочный продукт реакции.
Следовательно, описанные здесь композиции могут содержать, по существу состоять или состоять из одного или более чем одного соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III), соединения формулы (IV), сырья в виде гомофарнезола (например ЕЕН) и других стереоизомеров соединения формулы (I). Например, описанные здесь композиции могут содержать, по существу состоять или состоять из соединения формулы (I) и одного или более чем одного соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV).
Следовательно, описанные здесь композиции могут содержать ровно или более чем, примерно ровно или более чем примерно 50% по массе соединения формулы (I) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV). Например, описанные здесь композиции могут содержать ровно или более чем примерно 55% по массе, или ровно или более чем примерно 60% по массе, или ровно или более чем примерно 65% по массе, или ровно или более чем примерно 70% по массе, или ровно или более чем примерно 75% по массе, или ровно или более чем примерно 80% по массе, или ровно или более чем примерно 85% по массе, или ровно или более чем примерно 90% по массе, или ровно или более чем примерно 95% по массе соединения формулы (I) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV). Например, описанные здесь композиции могут содержать ровно или менее чем примерно 100% по массе соединения формулы (I) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV). Например, смесь может содержать ровно или менее чем примерно 99% по массе, или ровно или менее чем примерно 98% по массе, или ровно или менее чем примерно 97% по массе соединения формулы (I) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV). Например, описанные здесь композиции могут содержать от примерно 50% по массе до примерно 100% по массе, или от примерно 60% по массе до примерно 99% по массе, или от примерно 70% по массе до примерно 98% по массе, или от примерно 80% по массе до примерно 97% по массе, или от примерно 90% по массе до примерно 97% по массе соединения формулы (I) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV).
Массовое отношение соединения формулы (I) к общей массе соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV) в описанных здесь композициях, например, может находиться в диапазоне от примерно 60:40 до примерно 99:1. Например, массовое отношение соединения формулы (I) к общей массе соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV) может находиться в диапазоне от примерно 65:35 до примерно 99:1 или от примерно 70:30 до примерно 99:1, или от примерно 75:25 до примерно 99:1, или от примерно 80:20 до примерно 99:1, или от примерно 85:15 до примерно 99:1, или от примерно 90:10 до примерно 99:1, или от примерно 95:5 до примерно 99:1. Например, массовое отношение соединения формулы (I) к общей массе соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV) может находиться в диапазоне от примерно 65:35 до примерно 98:2 или от примерно 70:30 до примерно 97:3, или от примерно 75:25 до примерно 96:4, или от примерно 80:20 до примерно 95:5, или от примерно 85:15 до примерно 90:10.
Массовое отношение соединения формулы (I) к гомофарнезолу (например ЕЕН) в описанных здесь композициях, например, может находиться в диапазоне от примерно 90:10 до примерно 100:0. Например, массовое отношение соединения формулы (I) к гомофарнезолу (например ЕЕН) в описанных здесь композициях может находиться в диапазоне от примерно 92:8 до примерно 100:0, или от примерно 94:6 до примерно 100:0, или от примерно 95:5 до примерно 100:0, или от примерно 96:4 до примерно 99,5:0,5, или от примерно 97:3 до примерно 99,0:1,0, или от примерно 98:2 до примерно 99,0:1,0.
Количество соединения формулы (I), соединения формулы (II), соединения формулы (III) и соединения формулы (IV) в смеси стереоизомеров, например, может быть количественно определено посредством газовой хроматографии и/или быть идентифицировано посредством ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектроскопии.
(-)-Амброкс, синтезированный описанными здесь способами (например с использованием ферментов SHC/HAC или их вариантов и, возможно, рекомбинантных клеток-хозяев), например, может находиться в аморфной форме или в кристаллической форме.
(-)-Амброкс, полученный описанными здесь способами (например с использованием ферментов SHC/HAC или их вариантов и, возможно, рекомбинантных клеток-хозяев), может быть выделен паровой экстракцией/перегонкой или экстракцией органическим растворителем с использованием несмешивающегося с водой растворителя (для отделения продуктов реакции и непрореагировавшего субстрата от биокатализатора, который остается в водной фазе), с последующим выпариванием растворителя с получением неочищенного продукта реакции при определении анализом газовой хроматографией (ГХ). Способы паровой экстракции/перегонки и экстракции органическим растворителем известны специалистам в данной области.
В качестве примера, образующийся (-)-амброкс может быть экстрагирован из полной реакционной смеси с использованием органического растворителя, такого как несмешивающийся с водой растворитель (например толуол). В качестве альтернативы, образующийся (-)-амброкс может быть экстрагирован из твердой фазы реакционной смеси (полученной, например, посредством центрифугирования или фильтрации) с использованием смешивающегося с водой растворителя (например этанола) или несмешивающегося с водой растворителя (например толуола). В качестве альтернативы, образующийся (-)-амброкс может быть экстрагирован из твердой фазы реакционной смеси с использованием смеси растворителей. В качестве другого примера, (-)-амброкс присутствует в твердой фазе в виде кристаллов или в аморфной форме и может быть отделен от остальной твердой фазы (клеточного вещества или его обломков) и жидкой фазы также посредством фильтрования. В качестве другого примера, при температуре выше температуры плавления (-)-амброкса (примерно 75°С) (-)-амброкс может образовать масляный слой на поверхности водной фазы, который может быть удален и собран. Чтобы гарантировать полное выделение (-)-амброкса после удаления масляного слоя, в водную фазу, содержащую биомассу, может быть добавлен органический растворитель для того, чтобы экстрагировать любой остаточный (-)-амброкс, содержащийся в или на, или около биомассы. Органический слой может быть объединен с масляным слоем перед тем, как данное объединение дополнительно обратывают для выделения и очистки (-)-амброкса. (-)-Амброкс может быть дополнительно селективно закристаллизован с удалением побочных продуктов (II), (IV) и (III) и любого непрореагировавшего субстрата-гомофарнезола из конечного продукта (-)-амброкса. Термин «селективная кристаллизация» относится к стадии способа, посредством которой вызывается кристаллизация (-)-амброкса из растворителя в то время, как соединения (II), (III) и (IV) остаются растворенными в кристаллизующем растворителе в такой степени, что выделенное кристаллическое вещество содержит только продукт (-)-амброкс, или, если оно содержит какие-либо другие соединения (II), (III) или (IV), тогда они присутствуют только в приемлемых для обоняния количествах. Например, (-)-амброкс может не содержать или по существу не содержать побочных продуктов (II), (III) и (IV). На стадии селективной кристаллизации можно использовать смешиваемый с водой растворитель, такой как этанол или тому подобное. На селективную кристаллизацию (-)-амброкса может влиять присутствие непрореагировавшего субстрата-гомофарнезола, а также отношение (-)-амброкса к другим обнаруживаемым побочным продуктам (II), (III) и/или (IV). Даже при получении только 10%-ного превращения субстрата-гомофарнезола все еще возможна селективная кристаллизация (-)-амброкса.
Обонятельная чистота конечного продукта (-)-амброкса может быть определена с использованием 10%-ного этанольного экстракта в воде или посредством анализа кристаллического вещества. Конечный продукт (-)-амброкс анализируют относительно имеющегося в продаже эталонного продукта (-)-амброкса на его обонятельную чистоту, качество и его органолептические свойства. Вещество (-)-амброкс также анализируют в прикладных исследованиях экспертами для того, чтобы определить, удовлетворяет ли данное вещество спецификациям в отношении его органолептических свойств.
Примеры подходящих смешивающихся с водой и несмешивающихся с водой органических растворителей, подходящих для применения в экстракции и/или селективной кристаллизации (-)-амброкса, включают алифатические углеводороды, предпочтительно имеющие от 5 до 8 атомов углерода, такие как пентан, циклопентан, гексан, циклогексан, гептан, октан или циклооктан, галогенированные алифатические углеводороды, предпочтительно имеющие один или два атома углерода, такие как дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан или тетрахлорэтан, ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилолы, хлорбензол или дихлорбензол, алифатические ациклические и циклические простые эфиры или спирты, предпочтительно имеющие от 4 до 8 атомов углерода, такие как этанол, изопропанол, диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, этил-трет-бутиловый эфир, дипропиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или сложные эфиры, такие как этилацетат или н-бутилацетат, или кетоны, такие как метилизобутилкетон или диоксан, или их смеси, но не ограничиваются ими. Растворители, которые особенно предпочтительно используются, представляют собой вышеупомянутые гептан, метил-трет-бутиловый эфир (также известный как МТВЕ, трет-бутилметиловый эфир, третичный бутилметиловый эфир и tBME), диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, этилацетат и/или их смеси. Предпочтительно для экстракции (-)-амброкса из твердой фазы реакционной смеси используют смешивающийся с водой растворитель, такой как этанол. Применение этанола является предпочтительным, так как с ним легко обращаться, он не является токсичным, и он является безвредным для окружающей среды.
Термин «выделенный», как он здесь используется, относится к продукту биопревращения, такому как (-)-амброкс, который был отделен или очищен от компонентов, которые его сопровождают. Объект, который получают в клеточной системе, отличной от источника, из которого оно происходит в природе, является «выделенным», т.к. оно обязательно не будет содержать компонентов, которые сопровождают его в природе. Степень выделения или чистоты можно измерять любым подходящим методом, например посредством анализа при помощи газовой хроматографии (ГХ), ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или ЯМР.
В некоторых воплощениях конечный продукт ((-)-амброкс) выделяют и очищают до гомогенности (например до чистоты по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 89,5%, или до чистоты 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5%).
При необходимости, количество полученного (-)-амброкса может составлять от примерно 1 мг/л до примерно 20000 мг/л (20 г/л) или более, например от примерно 20 г/л до примерно 200 г/л, или от 100-200 г/л, предпочтительно примерно 125 г/л или 150 г/л, или примерно 188 г/л.
В реакции биопревращения можно получать по меньшей мере 125 г/л (-)-амброкса с использованием рекомбинантной клетки-хозяина Е. coli, продуцирующей фермент или вариант фермента SHC/HAC, примерно за 2 суток. Можно проводить биопревращения при концентрации ЕЕН 188 г/л или выше, при условии достижения эффективного смешивания, так как эффективность перемешивания может быть единственным ограничением для данной системы. Кроме того, биокатализатор с улучшенной активностью (например, в показателях вариантов SHC с дополнительно улучшенной активностью или в показателях повышенной продукции фермента SHC) может улучшать или поддерживать продуктивность с использованием меньшего количества биомассы или увеличенной концентрации субстрата, что предпочтительно в отношении эффективностей смешивания. Например, получают от примерно 1 до примерно 100 мг/л, от примерно 30 до примерно 100 мг/л, от примерно 50 до примерно 200 мг/л, от примерно 100 до примерно 500 мг/л, от примерно 100 до примерно 1000 мг/л, от примерно 250 до примерно 5000 мг/л, от примерно 1000 (1 г/л) до примерно 15000 мг/л (15 г/л), от примерно 2000 (2 г/л) до примерно 10000 мг/л (10 г/л) или от примерно 2000 (2 г/л) до примерно 25000 мг/л (25 г/л), 26000 мг/л (26 г/л), 27000 мг/л (27 г/л), 28000 мг/л (28 г/л), 29000 мг/л (29 г/л), 30000 мг/л (30 г/л), 40 г/л, 50 г/л, 60 г/л, 70 г/л, 80 г/л, 90 г/л, 100 г/л, 110 г/л, 120 г/л, 125 г/л, 130 г/л, 140 г/л, 150 г/л, 160 г/л, 170 г/л, 180 г/л, 190 г/л или 200 г/л, или 300 г/л, или 400 г/л, или 500 г/л (-)-амброкса.
Предпочтительно, (-)-амброкс в концентрации по меньшей мере 100 г/л получают в пределах периода от 48 до 72 часов.
Предпочтительно, (-)-амброкс в концентрации примерно 150 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов. Предпочтительно, (-)-амброкс в концентрации примерно 200 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов.
Предпочтительно, (-)-амброкс в концентрации примерно 250 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов.
В результате биопревращения гомофарнезола в (-)-амброкс согласно настоящему раскрытию получают (-)-амброкс в качестве преобладающего соединения, но также можно получать другие соединения, отличные от (-)-амброкса, которые могут или не могут придавать приятные нотки запаха смеси биопревращения и, таким образом, могут положительно или отрицательно влиять на органолептические характеристики конечного продукта (-)-амброкса. Соответственно, органолептический анализ проводится с использованием общепринятых органолептических тестов, используемых обученными экспертами (например парфюмерами) таким образом, что этот анализ может способствовать определению того, является ли химически релевантный продукт также релевантным с точки зрения обоняния конечным продуктом относительно эталонного продукта. Удаление одного или более побочных соединений из (-)-амброкса может улучшить аромат смеси реакционных продуктов, содержащей
(-)-амброкс, даже если удаленные соединения сами по себе фактически являются соединениями без запаха. То есть, в отсутствие соединений II, III и IV может наблюдаться усиление аромата (-)-амброкса.
Разные применения (-)-амброкса включают ароматизатор с тонким запахом или потребительский продукт, такой как средство ухода за тканью, туалетные принадлежности, косметическое средство ухода, чистящий продукт, детергентный продукт и/или мыльный продукт, но не ограничиваются ими, включая по существу все продукты, где доступные в настоящее время ингредиенты амброкса используются в коммерческих целях, включая следующие продукты: амброкс (Firmenich), амброксан (Henkel), амброфикс (Givaudan), амберлин (Quest), цеталокс лево (Firmenich), амбермор (Aromor) и норамбренолидовый эфир (Pacific), но не ограничиваясь ими.
Таким образом, здесь дополнительно предложено применение (-)-амброкса, полученного или получаемого описанным здесь способом, в виде части ароматизатора, или косметического средства, или потребительского продукта. Здесь также предложен продукт, содержащий (-)-амброкс, полученный или получаемый описанным здесь способом. Данный продукт, например, может представлять собой ароматизатор или косметическое средство, или потребительский продукт.
ОКСИД АМБРЫ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
Здесь дополнительно предложены реакционные продукты, полученные описанными здесь способами. Данные реакционные продукты, например, могут содержать, по существу состоять или состоять из оксида амбры и одного или более чем одного дополнительного соединения, например одного или более чем одного соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII).
Термин «оксид амбры», как он здесь используется, включает оксид амбры формулы (X), приведенной ниже, а также оксид амбры формулы (X) в изомерно чистой форме или в смеси с одной или более чем одной из следующих молекул формулы (XI), (XII) и/или (XIII),
Названия реакционных продуктов формул (X), (XI), (XII) и (XIII) приведены ниже.
Оксид амбры может быть получен из (+)-лариксола, как описано в Bolster et al., Tetrahedron, 2002, 58(26), с. 5275-5285. Однако желательно предложить альтернативные или улучшенные способы получения оксида амбры.
В описанных здесь способах может быть получен оксид амбры формулы (X) сам по себе или в смеси с побочными продуктами, такими как соединение, показанное в формулах (XI), (XII) и/или (XIII). Например, посредством описанных здесь способов могут быть получены другие стереоизомеры формулы (X).
Следовательно, здесь предложено соединение формулы (X) или композиция, содержащая соединение формулы (X), полученные или получаемые описанными здесь способами, включая все их воплощения.
В некоторых воплощениях не весь бисгомофарнезол (например BisEEH) превращается в оксид амбры или побочный продукт реакции. Следовательно, описанные здесь композиции, например композиции, полученные или получаемые описанными здесь способами, могут содержать бисгомофарнезол (например BisEEH, например, в дополнение к соединению формулы (X) и/или соединениям формул (XI), (XII) и/или (XIII)). Любой остающийся гомофарнезол может быть отделен от других продуктов реакции таким образом, что продукт в виде оксида амбры не содержит бисгомофарнезола. В других воплощениях все исходное вещество бисгомофарнезола превращается в оксид амбры формулы (X) или побочный продукт реакции посредством описанных здесь способов.
Следовательно, описанные здесь композиции могут содержать, по существу состоять или состоять из одного или более чем одного соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII), соединения формулы (XIII), исходного вещества бисгомофарнезола (например bisEEH) и других стереоизомеров соединения формулы (X). Например, описанные здесь композиции могут содержать, по существу состоять или состоять из соединения формулы (X) и одного или более чем одного соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII).
Описанные здесь композиции, следовательно, могут содержать ровно или более чем, примерно ровно или более чем примерно 50% по массе соединения формулы (X) на основе общей массы соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII). Например, описанные здесь композиции могут содержать ровно или более чем примерно 55% по массе, или ровно или более чем примерно 60% по массе, или ровно или более чем примерно 65% по массе, или ровно или более чем примерно 70% по массе, или ровно или более чем примерно 75% по массе, или ровно или более чем примерно 80% по массе, или ровно или более чем примерно 85% по массе, или ровно или более чем примерно 90% по массе, или ровно или более чем примерно 95% по массе соединения формулы (X) на основе общей массы соединения формулы (I), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII). Например, описанные здесь композиции могут содержать ровно или менее чем примерно 100% по массе соединения формулы (X) на основе общей массы соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII). Например, данная смесь может содержать ровно или менее чем примерно 99% по массе, или ровно или менее чем примерно 98% по массе, или ровно или менее чем примерно 97% по массе соединения формулы (X) на основе общей массы соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII). Например, описанные здесь композиции могут содержать от примерно 50% по массе до примерно 100% по массе, или от примерно 60% по массе до примерно 99% по массе, или от примерно 70% по массе до примерно 98% по массе, или от примерно 80% по массе до примерно 97% по массе, или от примерно 90% по массе до примерно 97% по массе соединения формулы (X) на основе общей массы соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII).
Массовое отношение соединения формулы (X) к общей массе соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII) в описанных здесь композициях, например, может находиться в диапазоне от примерно 60:40 до примерно 99:1. Например, массовое отношение соединения формулы (X) к общей массе соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII) может находиться в диапазоне от примерно 65:35 до примерно 99:1 или от примерно 70:30 до примерно 99:1, или от примерно 75:25 до примерно 99:1, или от примерно 80:20 до примерно 99:1, или от примерно 85:15 до примерно 99:1, или от примерно 90:10 до примерно 99:1, или от примерно 95:5 до примерно 99:1. Например, массовое отношение соединения формулы (X) к общей массе соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII) может находиться в диапазоне от примерно 65:35 до примерно 98:2 или от примерно 70:30 до примерно 97:3, или от примерно 75:25 до примерно 96:4, или от примерно 80:20 до примерно 95:5, или от примерно 85:15 до примерно 90:10.
Массовое отношение соединения формулы (XI) к бисгомофарнезолу (например bisEEH) в описанных здесь композициях, например, может находиться в диапазоне от примерно 90:10 до примерно 100:0. Например, массовое отношение соединения формулы (X) к бисгомофарнезолу (например bisEEH) в описанных здесь композициях может находиться в диапазоне от примерно 92:8 до примерно 100:0 или от примерно 94:6 до примерно 100:0, или от примерно 95:5 до примерно 100:0, или от примерно 96:4 до примерно 99,5:0,5, или от примерно 97:3 до примерно 99,0:1,0, или от примерно 98:2 до примерно 99,0:1,0.
Количество соединения формулы (X), соединения формулы (XI), соединения формулы (XII) и соединения формулы (XIII) в смеси стереоизомеров, например, может быть количественно измерено при помощи газовой хроматографии и/или идентифицировано посредством ЯМР-спектроскопии.
Оксид амбры, синтезированный описанными здесь способами (например с использованием ферментов SHC/HAC или их вариантов и, возможно, рекомбинантных клеток-хозяев), например, может находиться в аморфной форме или в кристаллической форме.
Оксид амбры, полученный описанными здесь способами (например с использованием ферментов SHC/HAC или их вариантов и рекомбинантных клеток-хозяев), может быть выделен посредством паровой экстракции/перегонки или посредством экстракции органическим растворителем с использованием несмешивающегося с водой растворителя (для отделения продуктов реакции и непрореагировавшего субстрата от биокатализатора, который остается в водной фазе), с последующим выпариванием растворителя с получением неочищенного реакционного продукта при определении анализом газовой хроматографией (ГХ). Методы паровой экстракции/перегонки и экстракции органическим растворителем известны специалистам в данной области.
В качестве примера, образующийся оксид амбры может быть экстрагирован из полной реакционной смеси с использованием органического растворителя, такого как несмешивающийся с водой растворитель (например толуол). В качестве альтернативы, образующийся оксид амбры может быть экстрагирован из твердой фазы реакционной смеси (полученной, например, посредством центрифугирования или фильтрации) с использованием смешивающегося с водой растворителя (например этанола) или несмешивающегося с водой растворителя (например толуола). В качестве другого примера, оксид амбры присутствует в твердой фазе в виде кристаллов или в аморфной форме и может быть отделен от остальной твердой фазы (клеточного вещества или его обломков) и жидкой фазы также посредством фильтрования.
В качестве другого примера, при температуре выше температуры плавления оксида амбры оксид амбры может образовать масляный слой на поверхности водной фазы, который может быть удален и собран. Для гарантии полного выделения оксида амбры после удаления масляного слоя в водную фазу, содержащую биомассу, может быть добавлен органический растворитель, чтобы экстрагировать любой остаточный оксид амбры, содержащийся в или на, или около биомассы. Органический слой может быть объединен с масляным слоем перед тем, как данное объединение дополнительно обрабатывают для выделения и очистки оксида амбры. Оксид амбры может быть дополнительно селективно закристаллизован с удалением побочных продуктов (XI), (XII) и (XIII) и любого непрореагировавшего субстрата бисгомофарнезола из конечного продукта оксида амбры. Термин «селективная кристаллизация» относится к стадии способа, посредством которой вызывается кристаллизация оксида амбры из растворителя, в то время как соединения (XI), (XII) и (XIII) остаются растворенными в кристаллизующем растворителе в такой степени, что выделенное кристаллическое вещество содержит только продукт оксид амбры, или, если оно содержит какие-либо другие соединения (X), (XII) или (XIII), тогда они присутствуют только в обонятельно приемлемых количествах. Например, оксид амбры может не содержать или по существу не содержать побочных продуктов (XI), (XII) и (XIII). На стадии селективной кристаллизации может использоваться смешиваемый с водой растворитель, такой как этанол или тому подобное. На селективную кристаллизацию оксида амбры может влиять присутствие непрореагировавшего субстрата-гомофарнезола и также отношение оксида амбры к другим обнаруживаемым побочным продуктам (XI), (XII) и/или (XIII). Даже при получении только 10%-ного превращения субстрата-гомофарнезола в оксид амбры все еще возможна селективная кристаллизация оксида амбры.
Обонятельная чистота конечного продукта оксида амбры может быть определена с использованием 10%-ного этанольного экстракта в воде или посредством проведения анализа кристаллического вещества. Конечный продукт оксид амбры анализируют относительно имеющегося в продаже эталонного продукта оксида амбры на его обонятельную чистоту, качество и его органолептические свойства. Вещество оксид амбры также анализируют в прикладных исследованиях экспертами для того, чтобы определить, удовлетворяет ли данное вещество спецификациям в отношении его органолептических свойств.
Примеры подходящих смешивающихся с водой и несмешивающихся с водой органических растворителей, подходящих для применения в экстракции и/или селективной кристаллизации оксида амбры, включают алифатические углеводороды, предпочтительно имеющие от 5 до 8 атомов углерода, такие как пентан, циклопентан, гексан, циклогексан, гептан, октан или циклооктан, галогенированные алифатические углеводороды, предпочтительно имеющие один или два атома углерода, такие как дихлорметан, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан или тетрахлорэтан, ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилолы, хлорбензол или дихлорбензол, алифатические ациклические и циклические простые эфиры или спирты, предпочтительно имеющие от 4 до 8 атомов углерода, такие как этанол, изопропанол, диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир, этил-трет-бутиловый эфир, дипропиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, тетрагидрофуран или сложные эфиры, такие как этилацетат или н-бутилацетат, или кетоны, такие как метилизобутилкетон или диоксан, или их смеси, но не ограничиваются ими. Растворители, которые особенно предпочтительно используются, представляют собой вышеупомянутые гептан, метил-трет-бутиловый эфир (также известный как МТВЕ, трет-бутилметиловый эфир, третичный бутилметиловый эфир и tBME), диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, этилацетат и/или их смеси.
Предпочтительно для экстракции оксида амбры из твердой фазы реакционной среды используют смешивающийся с водой растворитель, такой как этанол. Применение этанола предпочтительно, так как с ним легко обращаться, он не является токсичным, и он является безвредным для окружающей среды.
Термин «выделенный», как он здесь используется, относится к продукту биопревращения, такому как оксид амбры, который был отделен или очищен от компонентов, которые его сопровождают. Соединение, которое получают в клеточной системе, отличной от источника, из которого оно происходит в природе, является «выделенным», так как оно обязательно не будет содержать компонентов, которые сопровождают его в природе. Степень выделения или чистоты можно измерять любым подходящим способом, например посредством анализа при помощи газовой хроматографии (ГХ), ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или ЯМР. В некоторых воплощениях конечный продукт (оксид амбры) выделяют и очищают до гомогенности (например до чистоты по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 89,5%, или до чистоты 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5%).
При необходимости, количество полученного оксида амбры может составлять от примерно 1 мг/л до примерно 20000 мг/л (20 г/л) или более, например от примерно 20 г/л до примерно 200 г/л, или от 100-200 н/л, предпочтительно примерно 125 г/л, или 150 г/л, или примерно 188 г/л.
Например, получают от примерно 1 до примерно 100 мг/л, от примерно 30 до примерно 100 мг/л, от примерно 50 до примерно 200 мг/л, от примерно 100 до примерно 500 мг/л, от примерно 100 до примерно 1000 мг/л, от примерно 250 до примерно 5000 мг/л, от примерно 1000 (1 г/л) до примерно 15000 мг/л (15 г/л), от примерно 2000 (2 г/л) до примерно 10000 мг/л (10 г/л) или от примерно 2000 (2 г/л) до примерно 25000 мг/л (25 г/л), 26000 мг/л (26 г/л), 27000 мг/л (27 г/л), 28000 мг/л (28 г/л), 29000 мг/л (29 г/л), 30000 мг/л (30 г/л), 40 г/л, 50 г/л, 60 г/л, 70 г/л, 80 г/л, 90 г/л, 100 г/л, 110 г/л, 120 г/л, 125 г/л, 130 г/л, 140 г/л, 150 г/л, 160 г/л, 170 г/л, 180 г/л, 190 г/л или 200 г/л, или 300 г/л, или 400 г/л, или 500 г/л оксида амбры. Предпочтительно оксид амбры в концентрации по меньшей мере 100 г/л получают в пределах периода от 48 до 72 часов.
Предпочтительно оксид амбры в концентрации примерно 150 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов. Предпочтительно оксид амбры в концентрации примерно 200 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов.
Предпочтительно оксид амбры в концентрации примерно 250 г/л получают в пределах периода примерно от 48 до 72 часов.
В результате биопревращения бисгомофарнезола в оксид амбры согласно настоящему изобретению получают оксид амбры в качестве преобладающего соединения, но также можно получать соединения, отличные от оксида амбры, которые могут или не могут придавать приятные нотки запаха смеси биопревращения и, таким образом, могут положительно или отрицательно влиять на органолептические характеристики конечного продукта оксида амбры. Соответственно, органолептический анализ проводят с использованием общепринятых органолептических тестов, используемых обученными экспертами (например парфюмерами) таким образом, что этот анализ может способствовать определению того, является ли химически релеватный продукт также релевантным с точки зрения обоняния конечным продуктом относительно эталонного продукта. Удаление одного или более побочных соединений из оксида амбры может улучшать аромат остающегося соединения (оксида амбры), даже если удаленные соединения сами по себе фактически представляют собой соединения без запаха. То есть, в отсутствие соединений XI, XII и XIII может наблюдаться усиление аромата оксида амбры.
Разные применения оксида амбры включают ароматизатор с тонким запахом или потребительский продукт, такой как средство ухода за тканью, туалетные принадлежности, косметическое средство ухода, чистящий продукт, детергентный продукт и/или мыльный продукт, но не ограничиваются ими, включая по существу все продукты, где доступные в настоящее время ингредиенты в виде оксида амбры используются в коммерческих целях.
Таким образом, здесь дополнительно предложено применение оксида амбры, полученного или получаемого описанным здесь способом, в виде части ароматизатора, или косметического средства, или потребительского продукта. Здесь также предложен продукт, содержащий оксид амбры, полученный или получаемый описанным здесь способом. Данный продукт, например, может представлять собой ароматизатор, или косметическое средство, или потребительский продукт.
КОМПОЗИЦИИ АРОМАТИЗАТОРА
Здесь дополнительно предложено применение описанных здесь соединений и композиций в качестве или в композиции ароматизатора.
Таким образом, здесь также предложена композиция ароматизатора, содержащая одно или более чем одно соединение формулы (I) или (X). «Композицией ароматизатора», например, может быть любая композиция, содержащая одно или более чем одно соединение формулы (I) или (X) и вещество основы.
Термин «вещество основы», как он здесь используется, включает все известные ингредиенты ароматизаторов, выбранные из обширного спектра природных продуктов, и синтетических молекул, доступных в настоящее время, таких как эфирные масла, спирты, альдегиды и кетоны, простые эфиры и ацетали, сложные эфиры и лактоны, макроциклы и гетероциклы, и/или в смеси с одним или более чем одним ингредиентом или эксципиентом, традиционно используемым в композициях ароматизаторов в сочетании с отдушками, например, веществами носителей, разбавителями и другими вспомогательными средствами, обычно используемыми в данной области.
Ингредиенты ароматизаторов, известные в данной области, легко доступны в продаже от главных изготовителей ароматизаторов. Неограничивающие примеры таких ингредиентов включают:
- эфирные масла и экстракты, например бобровый мускус, масло корня костуса, пахучую основу дубового мха, масло герани, пахучую основу древесного мха, масло базилика, фруктовые масла, такие как масло бергамота и масло мандарина, масло мирта, масло пальмарозы, масло пачули, петигреновое масло, жасминовое масло, розовое масло, сандаловое масло, полынное масло, лавандовое масло и/или иланг-иланговое масло;
- спирты, например коричный спирт ((E)-3-фенилпроп-2-ен-1-ол); цис-3-гексенол ((Z)-гекс-3-ен-1-ол); цитронеллол (3,7-диметилокт-6-ен-1-ол); дигидромирценол (2,6-диметилокт-7-ен-2-ол); Эбанол™ ((E)-3-метил-5-(2,2,3-триметилциклопент-3-ен-1-ил)пент-4-ен-2-ол); евгенол (4-аллил-2-метоксифенол); этиллиналоол ((E)-3,7-диметилнона-1,6-диен-3-ол); фарнезол ((2E,6Z)-3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триен-1-ол); гераниол ((E)-3,7-диметилокта-2,6-диен-1-ол); Super Muguet™ ((E)-6-этил-3-метилокт-6-ен-1-ол); линалоол (3,7-диметилокта-1,6-диен-3-ол); ментол (2-изопропил-5-метилциклогексанол); нерол (3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ол); фенилэтиловый спирт (2-фенилэтанол); родинол™ (3,7-диметилокт-6-ен-1-ол); сандалор™ (3-метил-5-(2,2,3-триметилциклопент-3-ен-1-ил)пентан-2-ол); терпинеол (2-(4-метилциклогекс-3-ен-1-ил)пропан-2-ил) или тимберол™ (1-(2,2,6-триметилциклогексил)гексан-3-ол); 2,4,7-триметилокта-2,6-диен-1-ол и/или [1-метил-2(5-метилгекс-4-ен-2-ил)циклопропил]-метанол;
- альдегиды и кетоны, например анисовый альдегид (4-метоксибензальдегид); альфаамилкоричный альдегид (2-бензилиденгептаналь); георгивуд™ (1-(1,2,8,8-тетраметил-1,2,3,4,5,6,7,8-октагидронафталин-2-ил)этанон); гидроксицитронеллал (7-гидрокси-3,7-диметилоктанал); Iso Е Super® (1-(2,3,8,8-тетраметил-1,2,3,4,5,6,7,8-октагидронафталин-2-ил)этанон); изоральдеин® ((Е)-3-метил-4-(2,6,6-триметилциклогекс-2-ен-1-ил)бут-3-ен-2-он); 3-(4-изобутил-2-метилфенил)пропаналь; мальтол; метилцедрилкетон; метилионон; вербенон и/или ванилин;
простой эфир и ацетали, например амброкс® (3а,6,6,9а-тетраметил-2,4,5,5а,7,8,9,9b-октагидро-1H-бензо[е][1]бензофуран); геранилметиловый эфир ((2Е)-1-метокси-3,7-диметилокта-2,6-диен); розеноксид (4-метил-2-(2-метилпроп-1-ен-1-ил)тетрагидро-2H-пиран) и/или спирамбрен® (2',2',3,7,7-пентаметилспиро[бицикло[4.1.0]гептан-2,5'-[1,3] диоксан]);
- макроциклы, например амбреттолид ((Z)-оксациклогептадец-10-ен-2-он); этиленбрассилат (1,4-диоксациклогептадекан-5,17-дион) и/или эксальтолид® (16-оксациклогексадекан-1-он); и
- гетероциклы, например изобутилхинолин (2-изобутилхинолин).
Термин «вещество носителя», как он здесь используется, означает вещество, которое является практически нейтральным с точки зрения обоняния, т.е. вещество, которое значимо не изменяет органолептические свойства отдушек.
Под «разбавителями» подразумевается любой разбавитель, традиционно используемый в сочетании с отдушками, такой как диэтилфталат (DEP), дипропиленгликоль (DPG), изопропилмиристат (IPM), триэтилцитрат (ТЕС) и спирт (например этанол).
Термин «вспомогательный агент» относится к ингредиентам, которые могут быть использованы в композиции ароматизатора по причинам, конкретно не связанным с ароматической эффективностью указанной композиции. Например, вспомогательный агент может представлять собой ингредиент, который способствует обработке ингредиента или ингредиентов ароматизатора, или композиции, содержащей указанный(ные) ингредиент(ты), или он может улучшать легкость в обращении или хранении ингредиента ароматизатора или содержащей его композиции, как, например, антиоксидантный адъювант. Указанный антиоксидант может быть выбран, например, из тиногард® ТТ (BASF), тиногард® Q (BASF), токоферола (включая его изомеры, CAS 59-02-9; 364-49-8; 18920-62-2; 121854-78-2), 2,6-бис(1,1-диметилэтил)-4-метилфенола (ВНТ, CAS 128-37-0) и родственных фенолов, гидрохинонов (CAS 121-31-9).
Он также может представлять собой ингредиент, который обеспечивает дополнительную пользу, такую как придание цвета или текстуры. Он также может представлять собой ингредиент, который придает светоустойчивость или химическую стабильность одному или более ингредиентам, содержащимся в композиции ароматизатора.
Подробное описание природы и типа вспомогательного агента, обычно используемого в содержащих его композициях, не может быть исчерпывающим, но следует упомянуть то, что указанные ингредиенты хорошо известны специалисту в данной области.
Здесь также предложен потребительский продукт, содержащий соединение или композицию, или композицию ароматизатора, как описано здесь, включая любые его воплощения. Данный потребительский продукт, например, может представлять собой косметический продукт (например духи или туалетную воду), чистящий продукт, детергентный продукт или мыльный продукт.
ГОМОФАРНЕЗОЛ
Гомофарнезол может иметь изомерию, как показано ниже.
Бета-фарнезен может быть превращен в E,E-гомофарнезол (ЕЕН) прямо или косвенно через E,Е-гомофарнезат, который затем превращается в ЕЕН. Обзор получения (-)-амброкса из разных субстратов можно найти в US 2012/0135477 A1, WO 2010/139719, US 2013.0273619 A1, WO 2013/156398А1, в PhD диссертации Seitz (2012, как указано выше) и Schaefer 2011 (Chemie Unserer Zeit 45, 374-388), содержание которых включено сюда посредством ссылки.
В US 2012/0135477 A1 описывается превращение (3Z,7E) в (-)-амброкс с использованием ZmoSHC, но согласно раскрытию Schaefer (2011) (как указано выше) (7E,3Z) превращается только в 9b-эпи-амброкс (т.е. соединение (III), как описано выше), а не в (-)-амброкс. Ссылка на (3Z, 7E)-гомофарнезол в том виде, как она здесь используется, представляет собой ссылку на E,Z-гомофарнезол, который также обозначается как EZH.
В то время как гомофарнезол может представлять собой смесь четырех изомеров, изомеров (3Z,ZZ), (3Е,7Z), (3Z,7Е) и (3Е,7Е), из литературы, по-видимому, следует то, что (-)-амброкс получают только из (3Е,7Е) гомофарнезола (см. Neumann и Simon (1986), как указано выше). Ссылка на (3Е,7E)-гомофарнезол в том виде, как она здесь используется, представляет собой ссылку на E,Е-гомофарнезол, который также обозначается как ЕЕН.
Исходные вещества для описанных здесь способов получения (-)-амброкса, например, могут представлять собой (3Е,7E)-гомофарнезол или смесь, содержащую (ЗЕ, 7£)-гомофарнезол, например смесь изомеров гомофарнезола, содержащую (3Е,7Е)-гомофарнезол.
Предпочтительно исходное вещество гомофарнезола содержит смесь (3Е,7Е) и (3Z,7E), именуемую здесь изомерная смесь EE:EZ. Изомерная смесь EE:EZ гомофарнезола имеет номер CAS 35826-67-6.
Сырье/исходное вещество гомофарнезола может представлять собой смесь изомеров. Соответственно, исходное вещество гомофарнезола также может содержать смесь четырех изомеров EE:EZ:ZZ:ZE, которая соответствует (3Е,7Е), (3Z,ZE), (3Z,7Z) и (3E,7Z). Предпочтительно исходное вещество гомофарнезола выбрано из одной или более чем одной следующей смеси [(3Z,7Z), (3E,7Z), [3Z,7E) и (3Е,7Е)], [(3Z,7E) и (3E,7E)], [(3Z,7E), (3E,7Z)] и/или [(3E,7E) и (3E,7Z)].
Предпочтительно исходное вещество гомофарнезола выбрано из одной или более чем одной из следующих смесей: [(3E,7E), (3Z,7E)] и/или [(3Z,7E), (3Е/7Е) и (3E,7Z)], также обозначенных [EE:EZ] и [EE:EZ:ZE] соответственно.
Соответственно, в некоторых воплощениях соотношение EEH:EZH составляет примерно 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29; 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38: 61:39; 60:40; 59:41; 58:42; 57:43; 56:44; 55:45: 54:46; 53:47: 52:48; 51:49 или примерно 50:50. Например, соотношение EEH:EZH может находиться в диапазоне от примерно 50:50 до примерно 100:0, или от примерно 50:50 до примерно 99:1, или от примерно 60:40 до примерно 99:1, или от примерно 70:30 до примерно 95:5, или от примерно 80:20 до примерно 95:5.
В некоторых воплощениях предпочтительно исходное вещество гомофарнезола содержит более 90% E,Е-гомофарнезола (ЕЕН).
В других воплощениях исходное вещество гомофарнезола имеет массовое соотношение ЕЕ:EZ 86:14.
В некоторых воплощениях исходное вещество гомофарнезола имеет массовое соотношение EE:EZ 80:20.
В некоторых воплощениях исходное вещество гомофарнезола имеет массовое соотношение EE:EZ 70:30.
В других воплощениях исходное вещество гомофарнезола имеет массовое соотношение EE:EZ 69:31.
Число присутствующих изомеров гомофарнезола может влиять на скорость реакции. Фермент или вариант фермента SHC/HAC может быть способен превращать E,Е-гомофарнезол в (-)-амброкс из сложной смеси изомеров гомофарнезола (например EE:EZ:ZE:ZZ). Однако может наблюдаться меньшая скорость превращения, что согласуется с мнением о том, что отличные от ЕЕН изомеры гомофарнезола могут конкурировать с ЕЕН за доступ к производным фермента SHC/HAC и, таким образом, могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов превращения ЕЕН в (-)-амброкс и/или также действовать в качестве альтернативных субстратов (см., например, Eichhorn et al (2018) Adv. Synth. Catal. 360: 2339-2351, содержание которой включено сюда посредством ссылки). Соответственно, субстрат гомофарнезол может содержать изомерную смесь 2-4 изомеров, предпочтительно двух изомеров.
Соответственно, субстрат гомофарнезол может состоять или по существу состоять из изомерной смеси 2-4 изомеров, предпочтительно двух изомеров.
Предпочтительно субстрат гомофарнезол содержит изомерную смесь EE:EZ. Предпочтительно субстрат гомофарнезол состоит или по существу состоит из изомерной смеси EE:EZ.
Если, например, используется изомерная смесь EE:EZ, тогда соединения (например соединения II, III и IV, как изложено в Таблице 2), отличные от (-)-амброкса, находятся в «масляной» форме (а не в твердой форме), что облегчает перемешивание реакционной смеси и, таким образом, происходящий в результате процесс биопревращения.
БИСГОМОФАРНЕЗОЛ
Бисгомофарнезол может иметь изомерию, как показано в Таблице 5 ниже.
Бисгомофарнезол может быть получен из E-неролидола, как описано в Примерах, приведенных ниже. Например, бисгомофарнезол может быть получен в виде смеси двух или более изомеров (например смеси E,E-бисгомофарнезола и E,Z-бисгомофарнезола). В то время как бисгомофарнезол может присутствовать в виде смеси четырех изомеров (изомеров (Z,Z), (E,Z), (Z,E) и (Е,Е), оксид амбры, по-видимому, получается только из E,Е-бисгомофарнезола.
Исходными веществами для описанных здесь способов получения оксида амбры могут быть, например, E,E-бисгомофарнезол или смесь, содержащая Е,Е-бисгомофарнезол, например смесь изомеров бисгомофарнезола, содержащая Е,Е-бисгомофарнезол.
Предпочтительно исходное вещество бисгомофарнезола содержит смесь (BisEEH) и (BisEZH), именуемую здесь изомерная смесь EE:EZ.
Сырье/исходное вещество бисгомофарнезола может представлять собой смесь изомеров. Соответственно, исходное вещество бисгомофарнезола также может содержать смесь четырех изомеров EE:EZ:ZZ:ZE.
Соответственно, в некоторых воплощениях соотношение BisEEH:BisEZH составляет примерно 100:00; 99:01; 98:02; 97:03; 96:04; 95:05; 94:06; 93:07; 92:08; 91:09; 90:10; 89:11; 88:12; 87:13; 86:14; 85:15; 84:16; 83:17; 82:18; 81:19; 80:20; 79:21; 78:22; 77:23; 76:24; 75:25; 74:26; 73:27; 72:28; 71:29; 70:30; 69:31; 68:32; 67:33; 66:34; 65:35; 64:36; 63:37; 62:38: 61:39; 60:40; 59:41; 58:42; 57:43; 56:44; 55:45: 54:46; 53:47: 52:48; 51:49 или примерно 50:50. Например, соотношение BisEEH:BisEZH может находиться в диапазоне от примерно 50:50 до примерно 100:0 или от примерно 50:50 до примерно 99:1, или от примерно 60:40 до примерно 99:1, или от примерно 70:30 до примерно 95:5, или от примерно 80:20 до примерно 95:5. В некоторых воплощениях исходное вещество бисгомофарнезола содержит более 90% E,E-бисгомофарнезола (ЕЕН).
В других воплощениях исходное вещество бисгомофарнезола имеет массовое соотношение BisEEH:BisEZH 86:14. В некоторых воплощениях исходное вещество бисгомофарнезола имеет массовое соотношение BisEEH:BisEZH 80:20.
В некоторых воплощениях исходное вещество бисгомофарнезола имеет массовое соотношение BisEEH:BisEZH 70:30.
В других воплощениях исходное вещество бисгомофарнезола имеет массовое соотношение BisEEH:BisEZH 69:31.
Число присутствующих изомеров бисгомофарнезола может влиять на скорость взаимодействия. Фермент или вариант фермента SHC/HAC может быть способен превращать E,E-бисгомофарнезол в оксид амбры из сложной смеси изомеров бисгомофарнезола (например EE:EZ:ZE:ZZ). Однако может наблюдаться меньшая скорость превращения, что согласуется с мнением о том, что отличные от BisEEH изомеры бисгомофарнезола могут конкурировать с BisEEH за доступ к ферменту или варианту фермента SHC/HAC и, таким образом, могут действовать в качестве конкурентных ингибиторов превращения BisEEH в оксид амбры и/или также действовать в качестве альтернативных субстратов. Соответственно, субстрат бисгомофарнезол может содержать изомерную смесь 2-4 изомеров, предпочтительно двух изомеров.
Соответственно, субстрат бисгомофарнезол может состоять или по существу состоять из изомерной смеси 2-4 изомеров, предпочтительно двух изомеров.
Предпочтительно субстрат бисгомофарнезол содержит изомерную смесь EE:EZ.
Предпочтительно субстрат бисгомофарнезол состоит или по существу состоит из изомерной смеси EE:EZ.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В данном изобретении дополнительно предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент SHC/HAC или вариант фермента SHC/HAC, как описано здесь. Нуклеиновая кислота может представлять собой, например, выделенную нуклеиновую кислоту.
В частности, здесь предложена конструкция, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент или вариант фермента SHC/HAC, как описано здесь. «Конструкция», как здесь используется данный термин, представляет собой искусственно созданный отрезок нуклеиновой кислоты, который подлежит трансфекции в клетку-мишень. Конструкция может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент или вариант фермента SHC/HAC и контролер экспрессии (например промотор).
Здесь дополнительно предложен вектор, содержащий конструкцию, как описано здесь. Термин «вектор», как он здесь используется, представляет собой молекулу ДНК, которая используется в качестве носителя для того, чтобы искусственно переносить чужеродный генетический материал в клетку, где он может реплицироваться и/или экспрессироваться. Вектор может представлять собой, например, плазмиду, вирусный вектор, космиду или искусственную хромосому.
Термины «конструкция» и «вектор» могут перекрываться, например, когда конструкция представляет собой плазмиду.
В частности, здесь предложена нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.
В частности, здесь предложена нуклеиновая кислота, имеющая последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, которая, например, может содержаться в конструкции или в векторе, как описано здесь.
Термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты», как он здесь используется, будет конкретно относиться к полинуклеотидам по изобретению, которые могут представлять собой ДНК, кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК или РНК и могут представлять собой двухцепочечную или одноцепочечную, смысловую и/или антисмысловую нить. Термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» будет конкретно применяться к полинуклеотиду(дам), как они здесь используются, например к полноразмерной нуклеотидной последовательности или ее фрагментами или частям, которые кодируют полипептид с ферментативной активностью, например фермент метаболического пути или его фрагменты или части соответственно.
Данный термин также включает отдельную молекулу, такую как кДНК, где соответствующая геномная ДНК имеет интроны и, следовательно, другую последовательность; геномный фрагмент, у которого отсутствует по меньшей мере один из фланкирующих генов; фрагмент кДНК или геномной ДНК, полученный посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и у которого отсутствует по меньшей мере один из фланкирующих генов; рестрикционный фрагмент, у которого отсутствует по меньшей мере один из фланкирующих генов; ДНК, кодирующую белок, не встречающийся в природе, такой как слитый белок (например His метка), мутеин, или фрагмент данного белка; и нуклеиновую кислоту, которая является вырожденным вариантом кДНК или встречающейся в природе нуклеиновой кислотой. Кроме того, он включает рекомбинантную нуклеотидную последовательность, которая является частью гибридного гена, т.е. гена, кодирующего слитый белок, не встречающийся в природе. В слитых белках к белку может быть добавлена одна или более аминокислот (такая как гистидин (His), но не ограничиваясь им), обычно на N-конце белка, но также на С-конце, или слитая в пределах областей белка. Такие слитые белки или слитые векторы, кодирующие такие белки, обычно служат трем целям: (1) увеличение продукции рекомбинантных белок; (2) увеличение растворимости рекомбинантного белка; и (3) помощь в очистке рекомбинантного белка путем предоставления лиганда для аффинной очистки.
Термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» также включает кодон-оптимизированные последовательности, подходящие для экспрессии в конкретной микробной клетке-хозяине (например клетке-хозяине Е. coli). Термин «кодон-оптимизированный», как он здесь используется, означает кодирующую белок последовательность нуклеиновой кислоты, которая была адаптирована для экспрессии в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, в частности в бактериальных клетках-хозяевах, таких как клетки-хозяева Е. coli, посредством замены одного или более, или предпочтительно значительного числа кодонов кодонами, которые чаще используются в генах бактериальных клеток-хозяев (например Е. coli).
При этом нуклеотидная последовательность, кодирующая эталонную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 10) и ее варианты/производные, может представлять собой исходную последовательность в том виде, в котором она находится в источнике (например SEQ ID NO: 1, находящаяся в AacSHC), или ген может быть кодон-оптимизированным для выбранных организмов-хозяев, таких как, например, Е. coli.
Молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК) может продуцироваться посредством транскрипции in vitro. Отрезки молекул ДНК также рассматриваются в рамках объема данного раскрытия и могут быть получены посредством, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР) или образованы посредством обработки одной или более рестрикционными эндонуклеазами. Отрезки молекулы нуклеиновой кислоты могут называться ДНК-фрагментами гена, в частности те, которые представляют собой частичные гены. Фрагмент также может содержать несколько открытых рамок считывания (ORF): либо повторы той же самой ORF, либо разные ORF. Данный термин будет конкретно относиться к кодирующим нуклеотидным последовательностям, но также будет включать нуклеотидные последовательности, которые являются некодирующими, например нетранскрибируемые или нетранслируемые последовательности, или кодирующие полипептиды, целиком или частично. Гены, как они здесь используются, например, для сборки, диверсификации или рекомбинации, могут представлять собой некодирующие последовательности или последовательности, кодирующие полипептиды, или кодирующие белок последовательности, или их части или фрагменты, имеющие достаточную длину последовательности для успешных рекомбинационных событий. Более конкретно, указанные гены имеют минимальную длину 3 п.н., предпочтительно по меньшей мере 100 п.н., более предпочтительно по меньшей мере 300 п.н. Из вышеизложенного очевидно, что ссылка на выделенную ДНК не означает ДНК, присутствующую среди сотен-миллионов других молекул ДНК, например, в пределах библиотек кДНК или геномных ДНК, или рестрикционных расщеплений геномной ДНК, например в реакционной смеси рестрикционного расщепления или в куске электрофоретического геля. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению охватывает отрезки, которые не находятся как таковые в естественном состоянии.
Термин «выделенная ДНК», как он здесь используется, может относиться к (1) ДНК, которая содержит последовательность, неидентичную любой встречающейся в природе последовательности, к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте, которые не встречаются в природе (например получены посредством искусственного комбинирования (например искусственной манипуляцией с выделенными отрезками нуклеиновых кислот, например посредством методов генной инженерии) двух в противном случае отдельных отрезков последовательностей с вмешательством человека) или (2) в контексте ДНК со встречающейся в природе последовательностью (например кДНК или геномной ДНК), к ДНК, не содержащей по меньшей мере один из генов, которые фланкируют ген, содержащий интересующую ДНК, в геноме организма, в котором ген, содержащий интересующую ДНК, встречается в природе.
Термин «выделенная ДНК», как он здесь используется, в частности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот, также может относиться к нуклеиновым кислотам или полинуклеотидам, продуцированным с помощью методов рекомбинантной ДНК, например к ДНК-конструкции, содержащей полинуклеотид, гетерологичный по отношению к клетке-хозяину, который возможно включают в клетку-хозяина. Химерная нуклеотидная последовательность, в частности, может быть получена в виде рекомбинантной молекулы. Термин «рекомбинация» будет конкретно применяться к сборке полинуклеотидов, связыванию друг с другом таких полинуклеотидов или их частей, с рекомбинацией или без рекомбинации, с достижением кроссинговера или генной мозаики. Например, ее осуществляют для соединения отрезков нуклеиновых кислот с желательными функциями для образования желательной комбинации функций. Рекомбинантный ген, кодирующий описанный здесь полипептид, может включать кодирующую последовательность для данного полипептида, связанную функциональным образом, в смысловой ориентации, с одной или более регуляторными областями, подходящими для экспрессии данного полипептида. Поскольку многие микроорганизмы способны экспрессировать многие генные продукты с полицистронной мРНК, многие полипептиды могут экспрессироваться под контролем одной регуляторной области для данных микроорганизмов, если это желательно. Считается, что кодирующая последовательность и регуляторная область являются связанными функциональным образом, когда регуляторная область и кодирующая последовательность располагаются таким образом, что регуляторная область является эффективной для регуляции транскрипции или трансляции данной последовательности.
Термин «рекомбинантный», как он здесь используется, в частности в отношении ферментов, будет относиться к ферментам, полученным при помощи методов генной инженерии, т.е. полученным из клеток, трансформированных экзогенной ДНК-конструкцией, кодирующей нужный фермент.«Синтетические» ферменты представляют собой ферменты, полученные при помощи химического синтеза. Химерный фермент может, в частности, быть получен в виде рекомбинантной молекулы. Термин «рекомбинантная ДНК», следовательно, включает рекомбинантную ДНК, включенную в вектор в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота (или в геном гомологичной клетки в другое положение, чем природное расположение в хромосомное).
В другом аспекте молекула(лы) нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию функционально связана(ны) с последовательностями контроля экспрессии, обеспечивающими экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах. Термин «связанный функциональным образом», как он здесь используется, означает включенный в генетическую конструкцию таким образом, что последовательности контроля экспрессии эффективно контролируют экспрессию интересующей кодирующей последовательности. Транскрипционные/трансляционные регуляторные элементы, упоминаемые выше, включают индуцибельные и неиндуцибельные, конститутивные, регулируемые клеточным циклом, метаболически регулируемые промоторы, энхансеры, операторы, сайленсеры, репрессоры и другие элементы, которые известны специалистам в данной области, и которые управляют или иным образом регулируют экспрессию генов, но не ограничиваются ими. Такие регуляторные элементы включают регуляторные элементы, управляющие конститутивной экспрессией, или которые обеспечивают индуцибельную экспрессию, подобные, например, промотору CUP-1, tet-репрессору, используемому, например, в системах tet-on или tet-off, системе lac, регуляторных элементах системы trp, но не ограничиваются ими. В качестве примера, изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) представляет собой эффективный индуктор экспрессии генов в диапазоне концентрации от 100 мкМ до 1,0 мМ. Данное соединение представляет собой молекулярный имитатор аллолактозы, метаболита лактозы, который запускает транскрипцию оперона lac и, следовательно, используется для индукции экспрессии гена, когда данный ген находится под контролем оператора lac. Другим примером регуляторного элемента, который индуцирует экспрессию генов, является лактоза.
Аналогично, молекула(ы) нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению може(гу)т образовать часть гибридного гена, кодирующего дополнительные полипептидные последовательности, например последовательность, которая функционирует в качестве маркера или репортера. Примеры маркерных и репортерных генов включают гены бета-лактамазы, хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), аденозиндезаминазы (ADA), аминогликозидфосфотрансферазыдигидрофолатредуктазы (DHFR),
гигромицин-В-фосфотрансферазы (НРН), тимидинкиназы (ТК), lacZ (кодирующий бета-галактозидазу) и ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (XGPRT). Как и со многими стандартными методиками, ассоциированными с практическим осуществлением данного раскрытия, специалистам будут известны дополнительные полезные реактивы, например дополнительные последовательности, которые могут выполнять функцию маркера или репортера.
В некоторых воплощениях согласно настоящему раскрытию предложен рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий фермент SHC/HAC или его вариант, который может быть встроен в вектор для экспрессии и возможной очистки. Одним типом вектора является плазмида, представляющая собой кольцевую двухцепочечную петлю ДНК, в которую лигированы дополнительные отрезки ДНК. Некоторые векторы могут контролировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Данные векторы называются «экспрессионные векторы». Обычно экспрессионные векторы, подходящие для методов генной инженерии, принадлежат к плазмидному типу. Обычно, экспрессионный вектор содержит ген, такой как фермент SHC/HAC или его вариант, как описано здесь. В настоящем описании термины «плазмида» и «вектор» могут быть использованы взаимозаменяемо, так как плазмида представляет собой тип чаще всего используемого вектора. Такие векторы могут включать последовательности ДНК, которые включают, без ограничения ими, последовательности ДНК, которые не присутствуют в природе в клетке-хозяине, последовательности ДНК, которые обычно не транскрибируются в РНК или не транслируются в белок («экспрессируются»), и другие гены или последовательности ДНК, которые желательно ввести в нерекомбинантного хозяина. Будет понятно то, что обычно геном описанного здесь рекомбинантного хозяина увеличивается посредством стабильного введения одного или более рекомбинантных генов. Однако в пределах объема данного раскрытия также можно использовать автономные или репликативные плазмиды или векторы. Кроме того, настоящее раскрытие может быть воплощено на практике с использованием плазмиды или вектора с малым числом копий, например с одной копией, или с большим числом копий (как здесь проиллюстрировано примерами).
В предпочтительном воплощении вектор по настоящему раскрытию включает плазмиды, фагмиды, фаги, космиды, искусственные бактериальные и искусственные дрожжевые хромосомы, нокаутированные или нокинные конструкции, синтетические последовательности нуклеиновых кислот или кассеты, и подмножества могут быть получены в виде линейных полинуклеотидов, плазмид, мегаплазмид, синтетических или искусственных хромосом, таких как искусственные хромосомы растений, бактерий, млекопитающих или дрожжей.
Предпочтительно, чтобы белки, кодируемые введенным полинуклеотидом, экспрессировались в клетке при введении вектора. В плазмиды можно включать разные генные субстраты. Плазмиды часто представляют собой стандартные клонирующие векторы, например бактериальные плазмиды с большим числом копий. Субстраты могут быть включены в ту же самую или в разные плазмиды. Часто используют по меньшей мере два разных типа плазмид, имеющих разные типы селектируемых маркеров для обеспечения селекции клеток, содержащих по меньшей мере два типа векторов.
Обычно бактериальные или дрожжевые клетки могут быть трансформированы любой одной или более нуклеотидными последовательностями, как хорошо известно в данной области. Для рекомбинации in vivo используется ген, подлежащий рекомбинации с геномом или другими генами, с трансформацией хозяина с использованием стандартных методик осуществления трансформации. В подходящем воплощении в данную конструкцию включается ДНК, предоставляющая точку начала репликации. Начало репликации может быть подходящим образом выбрано специалистом. В зависимости от природы генов, дополнительное начало репликации может не требоваться, если последовательности уже присутствуют с генами или геномом, которые сами функционируют в качестве начало репликации.
КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМБРОКСА И ОКСИДА АМБРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ
Здесь кроме того предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, или конструкцию, или вектор, как описано здесь. Здесь кроме того предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая продуцирует фермент или вариант фермента SHC/HAC, как описано здесь.
Описанные здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, могут включать культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, как описано здесь. Термин «культивирование», как он здесь используется, относится к способу получения живых клеток, таким образом, что они продуцируют фермент или вариант фермента SHC/HAC, как описано здесь, который может использоваться в способе получения (-)-амброкса или оксида амбры, как описано здесь. Нет необходимости в том, чтобы данные клетки сами делились и реплицировались, хотя это не исключается.
Бактериальная или дрожжевая клетка может быть трансформирована экзогенной или гетерологичной ДНК, когда такая ДНК введена внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть или не быть интегрированной, т.е. быть ковалентно связанной в геноме клетки. У прокариотов и дрожжей, например, трансформирующая ДНК может поддерживаться на эписомном элементе, таком как плазмида. В отношении эукариотических клеток стабильно трансфицированная клетка представляет собой клетку, в которой трансфицированная ДНК стала интегированной в хромосому таким образом, что она наследуется дочерними клетками посредством репликации хромосом. Эта стабильность демонстрируется способностью эукариотической клетки основывать линии клеток или клоны, составляющие популяцию дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК.
В общем случае, введенная ДНК не является исходно резидентной у хозяина, который является реципиентом ДНК, но в пределах объема данного раскрытия находится выделение отрезка ДНК из данного хозяина и последующее введение одной или более дополнительных копии данной ДНК в того же самого хозяина, например для увеличения продуцирования продукта гена или изменения картины экспрессии гена. В некоторых случаях введенная ДНК будет модифицировать или даже заменять эндогенный ген или последовательность ДНК, например посредством гомологичной рекомбинации или сайтнаправленного мутагенеза. Подходящие рекомбинантные хозяева включают микроорганизмы, растительные клетки и растения.
В настоящем раскрытии также описываются рекомбинантные хозяева. Термин «рекомбинантный хозяин», также упоминаемый как «генетически модифицированная клетка-хозяин» или «трансгенная клетка», означает клетку-хозяина, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту или геном которой был увеличен по меньшей мере на одну включенную последовательность ДНК. Клетка-хозяин по настоящему раскрытию может быть генетически модифицирована полинуклеотидом или вектором, как описано выше.
Клетки-хозяева, которые можно использовать в целях данного изобретения, включают, без ограничения ими, прокариотические клетки, такие как бактерии (например Е. coli и В. subtilis), которые, например, могут быть трансформированы, например, ДНК рекомбинантного бактериофага, плазмидной ДНК, бактериальной искусственной хромосомой или экспрессионными векторами космидной ДНК, содержащими молекулы полинуклеотидов по изобретению; простые эукариотические клетки, подобные дрожжевым (например Saccharomyces и Pichia), которые, например, могут быть трансфоримрованы, например, рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами, содержащими молекулу полинуклеотида по данному раскрытию. В зависимости от клетки-хозяина и соответствующего вектора, используемого для введения полинуклеотида по данному раскрытию, полинуклеотид может интегрировать, например, в хромосому или митохондриальную ДНК, или может сохраняться вне хромосомы, например эписомно, или может лишь временно содержаться в клетках.
Термин «клетка», как он здесь используется, в частности, со ссылкой на генную инженерию и введение одного или более генов или собранного кластера генов в клетку, или продуцирующую клетку, следует понимать как относящийся к любой прокариотической или эукариотической клетке. Для применения согласно данному раскрытию рассматриваются и прокариотические, и эукариотические клетки-хозяева, включая бактериальные клетки-хозяева, подобные Е. coli или Bacillus sp., дрожжевые клетки-хозяева, такие как S. cerevisiae, клетки-хозяева насекомых, такие как Spodoptora frugiperda, или человеческие клетки-хозяева, такие как HeLa и Jurkat.
В частности, клетка представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку гриба, млекопитающего или растения, или прокариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки, например, включают, без ограничения, клетки млекопитающих, дрожжевые клетки или клетки насекомых (включая Sf9), клетки амфибий (включая клетки меланофоры) или клетки червей, включая клетки Caenorhabditis (включая Caenorhabditis elegans). Подходящие клетки млекопитающих, например, включают, без ограничения, клетки COS (клетки почки обезьяны) (включая Cos-1 и Cos-7), клетки СНО (клетки яичника китайского хомяка), клетки HEK293 (клетки человеческой эмбриональной почки 293), клетки HEK293T, клетки HEK293 Т-RexTM или другие линии трансфицируемых эукариотических клеток. Подходящие бактериальные клетки включают, без ограничения, Е. coli.
Предпочтительно можно использовать прокариотов, таких как Е. coli, Bacillus, Streptomyces, или клетки млекопитающих, подобные клеткам HeLa или клеткам Jurkat, или растительные клетки, подобные Arabidopsis.
Клетка, например, может быть выбрана из прокариотических, дрожжевых, растительных клеток-хозяев и/или клеток-хозяев насекомых.
Предпочтительно клетка представляет собой клетку Aspergillus sp.или грибковую клетку, предпочтительно она может быть выбрана из группы, состоящей из клеток родов Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Pichia и Aspergillus.
Предпочтительно данная клетка представляет собой бактериальные клетки, например, относящиеся к роду, выбранному из Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus и Lactococcus. Например, бактерия может представлять собой Е. coli.
Предпочтительно клетка-хозяин Е. coli представляет собой клетку-хозяина Е. coli, которая признана промышленностью и регулирующими органами (включая клетку-хозяина Е. coli K12 или клетку-хозяина Е. coli BL21, но не ограничиваясь ими).
Одной предпочтительной клеткой-хозяином для применения в настоящем изобретении является Е. coli, которая может быть получена рекомбинантно, как описано здесь. Таким образом, рекомбинантный хозяин может представлять собой рекомбинантную клетку-хозяина Е. coli. Имеются библиотеки мутантов, плазмиды, подробные компьютерные модели метаболизма и другая доступная для Е. coli информация, обеспечивающая рациональный дизайн разных модулей для увеличения выхода продукта. Для получения рекомбинантных микроорганизмов Е. coli можно использовать способы, аналогичные способам, описанным выше для Saccharomyces.
В одном воплощении рекомбинантный микроорганизм Е. coli содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие гены фермента или варианта фермента SHC/HAC.
Предпочтительно, рекомбинантный микроорганизм Е. coli содержит векторную конструкцию, как описано здесь. В другом предпочтительном воплощении рекомбинантный микроорганизм Е. coli содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие раскрытые здесь ферменты и варианты ферментов SHC/HAC.
Другой предпочтительной клеткой-хозяином для применения в настоящем раскрытии является S. cerevisiae, который представляет собой широко используемый ходовой организм в синтетической биологии. Таким образом, рекомбинантный хозяин может представлять собой S. cerevisiae. Имеются библиотеки мутантов, плазмиды, подробные компьютерные модели метаболизма и другая доступная для S. cerevisiae информация, обеспечивающая рациональный дизайн разных модулей для увеличения выхода продукта. Известны способы получения рекомбинантных микроорганизмов S. cerevisiae.
Культивирование клеток может осуществляться удобным способом. Культуральная среда может содержать источник углерода, по меньшей мере один источник азота и неорганические соли, и в нее добавляют витамины. Компоненты данной среды могут представлять собой компоненты, которые традиционно используют для культивирования рассматриваемого вида микроорганизма. Источники углерода для применения в настоящем способе включают любую молекулу, которая может метаболизироваться рекомбинантной клеткой-хозяином для облегчения роста и/или продуцирования (-)-амброкса или оксида амбры. Примеры подходящих источников углерода включают сахарозу (например, в том виде, в котором она находится в мелассе), фруктозу, ксилозу, глицерин, глюкозу, целлюлозу, крахмал, целлобиозу или другой глюкозосодержащий полимер, но не ограничиваются ими.
В воплощениях с применением дрожжей в качестве хозяина, например, подходящими являются такие источники углерода, как сахароза, фруктоза, ксилоза, этанол, глицерин и глюкоза. Источник углерода может предоставляться организму-хозяину на всем протяжении периода культивирования или, в качестве альтернативы, данный организм можно выращивать в течение некоторого периода времени в присутствии другого источника энергии, например белка, и затем предоставлять ему источник углерода только во время фазы подпитки.
Пригодность микроорганизма рекомбинантной клетки-хозяина для применения в способах по настоящему изобретению может быть определены простыми методами анализа с использованием хорошо известных способов. Например, микроорганизм, подлежащий анализу, можно размножать в обогащенной среде (например среде LB, среде на основе дрожжевого экстракта бакто-триптона, питательной среде и тому подобное) при рН, температуре и в условиях реакции, обычно используемых для размножения данного микроорганизма. Как только рекомбинантные микроорганизмы (т.е. рекомбинантные клетки-хозяева), которые продуцируют желательные продукты биопревращения, выбраны, данные продукты обычно продуцируют при помощи линии продуцирующих клеток-хозяев в большом масштабе посредством подходящих экспрессионных систем и ферментаций, например посредством микробного продуцирования в культуре клеток. В одном воплощении настоящего раскрытия для культивирования клеток используют определенную минимальную среду, такую как М9А.
Компоненты среды М9А включают: 14 г/л KH2PO4, 16 г/л K2HPO4, 1 г/л Nа3цитрат.2H2O, 7,5 г/л (NH4)2SO4, 0,25 г/л MgSO4.7H2O, 0,015 г/л CaCl2.2H2O, 5 г/л глюкозы и 1,25 г/л дрожжевого экстракта).
В другом воплощении настоящего раскрытия использовали обогащенную питательными веществами среду, такую как LB. Компоненты среды LB включают: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl. Другие примеры минеральной среды и минеральной среды М9 раскрыты, например, в US 6524831 В2 и US 2003/0092143 А1.
Другой пример минеральной среды может быть получен следующим образом: на 350 мл культуры: в 35 мл маточного раствора лимонной кислоты/фосфата (133 г/л KH2PO4, 40 г/л (NH4)2HPO4, 17 г/л лимонная кислота. H2O с рН, доведенным до 6,3) добавляли 307 мл H2O, рН доводили до 6,8 с помощью 32% NaOH по необходимости. После автоклавирования добавляли 0,850 мл 50% MgSO4, 0,035 мл раствора микроэлементов (см. ниже), 0,035 мл раствора тиамина и 7 мл 20%-ной глюкозы.
Раствор микроэлементов: 50 г/л Na2EDTA.2H2O, 20 г/л FeSO4.7H2O, 3 г/л Н3ВО3, 0,9 г/л MnSO4.2H2O, 1,1 г/л CoCl2, 80 г/л CuCl2, 240 г/л NiSO4.7H2O, 100 г/л KI, 1,4 г/л (NH4)6Mo7O24.4H2O, 1 г/л ZnSO4.7H2O в деионизированной воде.
Раствор тиамина; 2,25 г/л тиаминаНСЛ в деионизированной воде.
Раствор MgSO4: 50% (масс./об.) MgSO4⋅7H2O в деионизированной воде.
Рекомбинантный микроорганизм можно выращивать в периодическом, с подпиткой или в непрерывном процессе или их комбинациях. Обычно рекомбинантный микроорганизм выращивают в ферментере при определенной(ных) температуре(рах) в присутствии подходящего источника азота, например источника углерода, в течение желательного периода времени с получением достаточного количества фермента для превращения гомофарнезола в амброкс или для превращения бисгомофарнезола в оксид амбры и для получения желательного количества амброкса, включая (-)-амброкс, или желательного количества оксида амбры формулы (X). Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать любым подходящим способом, например посредством периодического культивирования или культивирования с подпиткой. Термин «периодическое культивирование», как он здесь используется, представляет собой способ культивирования, в котором культуральная среда и/или питательные вещества ни добавляют, ни отбирают во время культивирования.
Термин «культивирование с подпиткой», как он здесь используется, означает способ культивирования, в котором культуральная среда и/или питательные вещества добавляют во время культивирования, но культуральную среду не отбирают.
Согласно одному воплощению настоящего раскрытия предложен способ получения амброкса или оксида амбры в клеточной системе, включающий продуцирование ферментов или вариантов ферментов SHC/HAC в клеточной системе в подходящих условиях, добавление в клеточную систему гомофарнезола или бисгомофарнезола, превращение гомофарнезола в амброкс или превращение бисгомофарнезола в оксид амбры с использованием ферментов или вариантов ферментов SHC/HAC, продуцированных с использованием клеточной системы, отбор амброкса или оксида амбры из клеточной системы и возможно выделение веществ (-)-амброкса или оксида амбры формулы (X) из системы. Экспрессия других нуклеотидных последовательностей может служить для улучшения данного способа. Способ биопревращения может включать дополнительную экспрессию других нуклеотидных последовательностей в клеточной системе. Экспрессия других нуклеотидных последовательностей может улучшать путь биопревращения для получения (-)-амброкса или оксида амбры. Другим воплощением настоящего раскрытия является способ биопревращения для получения (-)-амброкса или оксида амбры, включающий выращивание клеток-хозяев, содержащих гены фермента или варианта фермента SHC/HAC, продуцирующих ферменты или варианты ферментов SHC/HAC в клетках-хозяевах, подпитку данных клеток-хозяев гомофарнезолом (например ЕЕН) или бисгомофарнезолом (например bisEEH), инкубирование клеток-хозяев в условиях рН, температуры и солюбилизатора, подходящих для стимуляции превращения гомофарнезола в амброкс или превращения бисгомофарнезола в оксид амбры, и сбор (-)-амброкса или оксида амбры формулы (X). Продуцирование ферментов или вариантов ферментов SHC/HAC в клетках-хозяевах обеспечивает способ получения (-)-амброкса или оксида амбры формулы (X) при добавлении гомофарнезола или бисгомофарнезола к клеткам-хозяевам при подходящих условиях реакции. Достигаемое превращение может быть увеличено посредством добавления в реакционную смесь большего количества биокатализатора и SDS.
Клетки-хозяева рекомбинантного микроорганизма можно культивировать целым рядом способов для того, чтобы в подходящих количествах предоставлять клетки, продуцирующие ферменты или варианты ферментов SHC/HAC для последующей стадии биопревращения. Поскольку микроорганизмы, применимые для стадии биопревращения, широко варьируют (например дрожжи, бактерии и грибки), условия культивирования, естественно, корректируют для конкретных потребностей каждого вида, и данные условия хорошо известны и задокументированы. Для получения клеток, применимых на следующей стадии биопревращения по настоящему раскрытию, можно использовать любые известные в данной области способы выращивания клеток-хозяев рекомбинантных микроорганизмов. Обычно клетки выращивают до конкретной плотности (измеряемой как оптическая плотность (OD)) с получением достаточной биомассы для реакции биопревращения.
Выбранные условия культивирования влияют не только на количество полученных клеток (биомассу), но качество условий культивирования также влияет на то, как биомасса становится биокатализатором. Клетки-хозяева рекомбинантного микроорганизма, экспрессирующие ген фермента или варианта фермента SHC/HAC и продуцирующие фермент или вариант фермента SHC/HAC, называются биокатализатором, который подходит для применения в реакции биопревращения. В некоторых воплощениях биокатализатор представляет собой целую рекомбинантную клетку, продуцирующую ферменты или варианты ферментов SHC/HAC, или он может находиться в суспензии или в иммобилизованном формате. В других воплощениях биокатализатор представляет собой мембранную фракцию или жидкую фракцию, полученную из целой рекомбинантной клетки, продуцирующей фермент или вариант фермента SHC/HAC (например, как раскрыто в Seitz et al 2012, указанном выше). Рекомбинантный био катализатор, продуцирующий ферменты или варианты ферментов SHC/HAC, включает целые клетки, отобранные из ферментера (для реакции биопревращения) или клетки в ферментере (которые затем используются в реакции, проводимой в одном реакционном сосуде). Рекомбинантный биокатализатор, продуцирующий ферменты или варианты ферментов SHC/HAC, может включать интактную рекомбинантную целую клетку и/или клеточные обломки. В любом случае фермент или вариант фермента SHC/HAC некоторым образом ассоциирован с мембраной (такой как клеточная мембрана) для того, чтобы получать и/или взаимодействовать с субстратом (например гомофарнезолом или бисгомофарнезолом), причем данная мембрана (такая как клеточная мембрана) может быть частью целой клетки или включать целую клетку (например рекомбинантную целую клетку). Ферменты или варианты ферментов SHC/HAC также могут находиться в иммобилизованной форме (например ассоциированными с носителем фермента), что обеспечивает взаимодействие ферментов или вариантов ферментов SHC/HAC с субстратом (например гомофарнезолом или бисгомофарнезолом). Ферменты или варианты ферментов SHC/HAC также могут использоваться в растворимой форме.
В одном воплощении биокатализатор продуцируют в достаточных количествах (для создания достаточной биомасс.ы), отбирают и промывают (и возможно хранят (например охлажденным, замороженным или лиофилизированным)) до начала стадии биопревращения.
В другом воплощении клетки продуцируют в достаточных количествах (для создания достаточного количества биокатализатора), и условия реакции затем корректируют без необходимости в отборе и промывке биокатализатора для реакции биопревращения. Этот одноэтапный (или «в одном реакционном сосуде») способ имеет преимущества, так как он упрощает процесс при одновременном возможном снижении затрат. Культуральная среда, используемая для выращивания клеток, также подходит для применения в реакции биопревращения, при условии, что условия реакции корректируют для облегчения реакции биопревращения.
Оптимальный рН для выращивания клеток находится в диапазоне 6,0-7,0. Оптимальный рН для реакции биопревращения зависит от типа фермента или варианта фермента SHC/HAC, используемого в реакции биопревращения. рН регулируют с использованием методик, которые хорошо известны специалисту.
В то время как термины «смесь» или «реакционная смесь» могут использоваться в настоящем раскрытии взаимозаменяемо с термином «среда» (особенно когда он относится к реакции «в одном реакционном сосуде»), следует отметить, что выращивание клеток с созданием достаточной биомасс.ы требует среды для культивирования/ферментации клеток, но среда не требуется для стадии биопревращения, так как будет достаточно реакционного буфера с подходящим рН.
Способы биопревращения по настоящему раскрытию проводят в условиях времени, температуры, рН и солюбилизатора, обеспечивающих превращения сырья в виде гомофарнезола или бисгомофарнезола (например содержащего ЕЕН или bisEEH) в (-)-амброкс или оксид амбры.
рН реакционной смеси может находиться в диапазоне 4-8, предпочтительно от 5 до 6,5, более предпочтительно 4,8-6,0 для вариантов фермента SHC/HAC и в диапазоне от примерно рН 5,0 до примерно рН 7,0 для ферментов SHC/HAC дикого типа и может поддерживаться добавлением в реакционную смесь буферов. Типичные буферы для данной цели включают буфер на основе лимонной кислоты, фосфатный буфер, буфер на основе уксусной кислоты и/или буфер на основе янтарной кислоты, но не ограничиваются ими.
Предпочтительная температура составляет от примерно 15°С до примерно 60°С, например от примерно 15°С до примерно 50°С, или от примерно 15°С до примерно 45°С, или от примерно 30°С до примерно 60°С, или от примерно 40°С до примерно 50°С. Температура может поддерживаться постоянной или может изменяться во время процесса биопревращения.
Заявитель продемонстрировал то, что может быть полезным включение в реакцию биопревращения солюбилизатора (например поверхностно-активного вещества, детергента, усилителя растворимости, смешивающегося с водой органического растворителя и тому подобного).
Термин «поверхностно-активное вещество», как он здесь используется, означает компонент, который снижает поверхностное натяжение (или межфазное натяжение) между двумя жидкостями или между жидкостью и твердым веществом. Поверхностно-активные вещества могут действовать в качестве детергентов, увлажнителей, эмульгаторов, пенообразователей и диспергентов. Примеры поверхностно-активных веществ включают Triton Х-100, Tween 80, тауродезоксихолат, натрия тауродезоксихолат, додецилсульфат натрия (SDS) и/или лаурилсульфат натрия (SLS).
В то время как Triton Х-100 можно использовать для частичной очистки фермента или варианта фермента SHC/HAC (в растворимой или мембранной фракции/ суспензионной форме), его также можно использовать в реакции биопревращения (см., например, раскрытие в Seitz (2012 PhD диссертация, как указано выше), а также раскрытие в Neumann и Simon (1986 - как указано выше) и JP2009060799. Однако неожиданно заявитель выбрал и идентифицировал SDS как особенно полезный солюбилизатора из длинного списка других менее полезных солюбилизаторов. В частности, заявитель идентифицировал SDS в качестве значительно лучшего солюбилизатора, чем, например, Triton Х-100 в показателях скорости реакции и выхода для реакции биопревращения гомофарнезола в (-)-амброкс (при использовании ЕЕН как при 4 г/л, так и при 125 г/л). Для по меньшей мере одного производного фермента SHC/HAC эта максимальная активность биопревращения гомофарнезола в (-)-амброкс с Triton Х-100 (в диапазоне концентрации от примерно 0,005% до 0,48%) в реакции может составлять только примерно 20% активности, полученной с SDS (в концентрации примерно 0,07%) с ЕЕН в концентрации 4 г/л и клетками при OD650нм 10.
Не желая быть связанными теорией, применение SDS с рекомбинантными микробными клетками-хозяевами может иметь преимущество, так как SDS может преимущественно взаимодействовать с мембраной клетки-хозяина для того, чтобы сделать фермент или вариант фермента SHC/HAC (который является мембраносвязанным ферментом) более доступным для субстрата гомофарнезола. Кроме того, включение SDS в реакционную смесь на подходящем уровне может улучшать свойства эмульсии (гомофарнезола в воде) и/или улучшать доступ субстрата гомофарнезола к ферменту SHC в клетке-хозяине, в то же самое время предупреждая разрушение (например денатурацию фермента SHC (WT или варианта SHC/HAC)). На концентрацию солюбилизирующего агента (например SDS), используемого в реакции биопревращения, влияет количество биомасс.ы и концентрация субстрата (ЕЕН). То есть, имеется степень взаимозависимости между концентрацией солюбилизатора (например SDS), количеством биомасс.ы и концентрацией субстрата (ЕЕН). В качестве примера, по мере увеличения концентрации субстрата гомофарнезола, для прохождения эффективной реакции биопревращения требуются достаточные количества биокатализатора и солюбилизатора (например SDS). Если, например, концентрация солюбилизатора (например SDS) является слишком низкой, может наблюдаться субоптимальное превращение гомофарнезола. С другой стороны, если, например, концентрация солюбилизатора (например SDS) является слишком высокой, тогда может быть риск того, что на биокатализатор оказывается влияние либо посредством разрушения интактной микробной клетки, и/либо денатурации/инактивации фермента или варианта фермента SHC/HAC. Выбор подходящей концентрации SDS в контексте количества биомасс.ы и концентрации субстрата (ЕЕН) находится в пределах знаний специалиста. В качестве примера, специалистом может быть разработана прогностическая модель для определения подходящих концентраций SDS, субстрата (ЕЕН) и биомасс.ы. При использовании 4 г/л ЕЕН и биокатализатора с доведением до OD 10,0 (650 нм) может быть подходящим SDS в диапазоне 0,010-0,075%. При использовании 125 г/л ЕЕН с 2-кратной сырой масс.ой биомасс.ы может быть подходящей скорректированная концентрация SDS (1,3%). Однако исследование процента превращения ЕЕН в (-)-амброкс с использованием разных значений отношения SDS/клетки показало, что правильный выбор соотношения биокатализатора, субстрата гомофарнезола и солюбилизатора (например SDS) облегчает разработку надежной системы реакции биопревращения, которая демонстрирует некоторую степень устойчивости к диапазону концентраций SDS и диапазонам рН.
Температура реакции биопревращения для фермента SHC WT (например AacSHS) может составлять от примерно 30°С до примерно 60°С, например от примерно 45°С до примерно 60°С, например от примерно 50°С до примерно 60°С, например примерно 55°С.
Диапазон рН реакции биопревращения для фермента SHC WT (например AacSHS) может составлять от примерно 5,0 до 7,0, более предпочтительно от примерно 5,6 до примерно 6,2, еще более предпочтительно примерно 6,0.
Температура реакции биопревращения для варианта фермента SHC/HAC может составлять от примерно 30°С до примерно 55°С, например от примерно 40°С до примерно 50°С, например примерно 45°С.
рН реакции биопревращения для варианта фермента SHC/HAC может составлять примерно 4,8-6,4, предпочтительно примерно 5,2-6,0.
Предпочтительно солюбилизатором, используемым в реакции биопревращения, является SDS. Концентрация SDS, используемого в реакции биопревращения для фермента SHS WT (например AacSHC) может находиться в диапазоне примерно 0,010-0,075%, предпочтительно примерно 0,030%, при использовании концентрации ЕЕН примерно 4 г/л и клеток при OD650нм 10.
Концентрация SDS, используемого в реакции биопревращения для варианта фермента SHC/HAC может находиться в диапазоне примерно 0,0025-0,090%, предпочтительно примерно 0,050%, при использовании концентрации ЕЕН примерно 4 г/л и клеок при OD650нм 10.
Биокатализатор может быть загружен в реакционную смесь до OD примерно 10,0 (650 нм) при загрузке в реакционную смесь гомофарнезола в концентрации ЕЕН примерно 4 г/л.
Отношение [SDS]/[клетки] может находиться в диапазоне примерно 10:1-20:1, предпочтительно примерно 15:1 - 18:1, предпочтительно примерно 16:1 при отношении биокатализатора к гомофарнезолу ЕЕН в реакции биопревращения примерно 2:1.
Концентрация SDS в реакции биопревращения для варианта фермента SHC может находиться в диапазоне примерно 1-2%, предпочтительно в диапазоне примерно 1,4-1,7%, еще более предпочтительно примерно 1,5%, при концентрации гомофарнезола примерно 125 г/л ЕЕН и концентрации биокатализатора 250 г/л (что соответствует OD примерно 175 (650 нм)).
Отношение биокатализатора к субстрату гомофарнезолу ЕЕН может находиться в диапазоне примерно 0,5:1-2:1, в некоторых воплощениях 2:1, предпочтительно примерно 1:1 или 0,5:1.
Оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC, например, может быть равной или больше чем примерно 35°С. Например, оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC может находиться в диапазоне от примерно 40°С до примерно 50°С, например от примерно 42°С до примерно 48°С или от примерно 44°С до примерно 46°С. Например, оптимальная температура для вариантов фермента SHC/HAC может составлять примерно 45°С. Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальной температуре варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальный рН для вариантов фермента SHC/HAC, например, может быть равен или более чем примерно 5,4. Например, оптимальный рН для вариантов фермента SHC/HAC может находиться в диапазоне от примерно 5,2 до примерно 6,0, например от примерно 5,4 до примерно 5,8, например от примерно 5,6 до примерно 5,8. Например, оптимальный рН вариантов фермента SHC/HAC может составлять примерно 5,6 или примерно 5,8. Раскрытый здесь способ получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить при оптимальном рН для варианта фермента SHC/HAC.
Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде раскрытого здесь способа получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 0,010% (масс./масс.) до примерно 0,10% (масс./масс.). Например, оптимальная концентрация SDS может составлять от примерно 0,040% (масс./масс.) до примерно 0,080% (масс./масс.), например примерно 0,050% (масс./масс.) при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 4 г/л с клетками, доведенными до OD650нм 10. Раскрытый здесь способ получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить с использованием оптимальной концентрации SDS, описанной здесь. Оптимальная концентрация додецилсульфата натрия (SDS) в реакционной среде раскрытых здесь способов получения (-)-амброкса или оксида амбры, например, может составлять от примерно 1,0% (масс./масс.) до примерно 1,5% (масс./масс.) при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток. Например, оптимальная концентрация SDS может составлять от примерно 1,2% (масс./масс.) до примерно 1,4% (масс./масс.), например примерно 1,3% (масс./масс.), при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л с 250 г/л клеток или примерно 0,65% (масс./масс.) при использовании субстрата (например ЕЕН или BisEEH) в концентрации 125 г/л со 125 г/л клеток.
Раскрытые здесь способы получения (-)-амброкса или оксида амбры можно проводить в пределах оптимального диапазона температуры или при оптимальной температуре, и/или в пределах оптимального диапазона рН или при оптимальном рН, и/или в пределах оптимального диапазона концентрации SDS или при оптимальной концентрации SDS для конкретного используемого фермента, как изложено ниже в Таблице 7, или 9, или 11 в разделе Примеры.
В некоторых воплощениях амброкс получают с использованием биокатализатора, к которому добавляют субстрат гомофарнезол.
В некоторых воплощениях оксид амбры получают с использованием биокатализатора, к которому добавляют субстрат бисгомофарнезол.
Возможно добавление субстрата посредством подпитки с использованием известных способов (например перистальтического насоса, инфузионного шприца и тому подобных). Гомофарнезол и бисгомофарнезол могут представлять собой растворимые в масле соединения и могут быть предоставлены в формате масла. При условии, что биокатализатор (микробные клетки, такие как интактная рекомбинантная целая клетка, и/или клеточные обломки, и/или иммобилизованный фермент) присутствует в водной фазе, реакция биопревращения может рассматриваться как трехфазная система (содержащая водную фазу, твердую фазу и масляную фазу) при добавлении гомофарнезола или бисгомофарнезола в реакционную смесь для биопревращения. Это так, даже когда присутствует SDS. В качестве пояснения, при использовании в качестве биокатализатора растворимого SHC WT или варианта фермента SHC/HAC, это считается двухфазной системой.
Ферментер можно использовать для выращивания рекомбинантных клеток-хозяев, экспрессирующих ген фермента или варианта фермента SHC/HAC и продуцирующих активные ферменты или варианты ферментов SHC/HAC, до достаточной концентрации биомасс.ы, подходящей для применения в качестве биокатализатора в том же самом ферментационном сосуде, который используется для превращения источника гомофарнезола в (-)-амброкс, например в смеси с одним или более побочными продуктами (II), (IV) и/или (III), или источника бисгомофарнезола в оксид амбры, например в смести с одним или более побочными продуктами (XI), (XII) и/или (XIII).
Квалифицированному специалисту будет понятно, что более высокие совокупные продукционные титры могут быть достигнуты посредством осуществления непрерывного способа, такого как удаление продукта, подпитка субстрата и добавление или (частичная) замена биомассы. Предпочтительно, биопревращение ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры в присутствии рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей фермент или вариант фермента SHC/HAC, генерирует выход амброкса или оксида амбры 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, приведенный в мольных процентах и основанный на молях использованного ЕЕН или BisEEH; особенно предпочтительно, выход составляет от 5 до 100, от 10 до 100, и 100, от 25 до 100, от 30 до 100, от 35 до 100, в частности от 40 до 100, от 45 до 100, от 50 до 100, от 60 до 100, от 70 до 100 мольных процентов.
Активность фермента или варианта фермента SHC/HAC определяется посредством скорости реакции (количество продукта/(количество продукта + количество остающегося исходного вещества)) × 100) в мольных процентах. Предпочтительно биопревращение ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры в присутствии фермента или варианта фермента SHC/HAC обеспечивает выход (-)-амброкса или оксида амбры 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, приведенный в мольных процентах и основанный на молях использованного ЕЕН или BisEEH; особенно предпочтительно, выход составляет от 5 до 100, от 10 до 100, от 20 до 100, от 25 до 100, от 30 до 100, от 35 до 100, в частности, от 40 до 100, от 45 до 100, от 50 до 100, от 60 до 100, от 70 до 100.
В предпочтительном воплощении данного изобретения выход и/или скорость реакции определяются за определенный период времени, например 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 или 48 часов, во время которого ЕЕН превращается в (-)-амброкс или BisEEH превращается в оксид амбры рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент или вариант фермента SHC/HAC. В другом варианте реакцию проводят при точно определенных условиях, например 25°С, 30°С, 40°С, 50°С или 60°С. В частности, выход и/или скорость реакции определяют путем проведения реакции превращения ЕЕН в (-)-амброкс или BisEEH в оксид амбры ферментами или вариантами ферментов SHC/HAC согласно изобретению при 35°С в течение периода 24-72 часов.
В другом воплощении настоящего изобретения рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант фермента SHC/HAC, отличается тем, что она демонстрирует 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21-, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31-, 32-, 33-, 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39-, 40-, 41-, 42-, 43-, 44-, 45-, 46-, 47-, 48-, 49-, 50-, 51-, 52-, 53-, 54-, 55-, 56-, 57-, 58-, 59-, 60-, 61-, 62-, 63-, 64-, 65-, 66-, 67-, 68-, 69-, 70-, 71-, 72-, 73-, 74-, 75-, 76-, 77-, 78-, 79-, 80-, 81-, 82-, 83-, 84-, 85-, 86-, 87-, 88-, 89-, 90-, 91-, 92-, 93-, 94-, 95-, 96-, 97-, 98-, 99-, 100-, 200-, 500-, 1000-кратный или более выход и/или скорости реакции в реакции гомофарнезола с образованием (-)-амброкса или в реакции бисгомофарнезола с образованием оксида амбры по сравнению с SHC WT или производным фермента SHC/HAC при таких же условиях. Здесь термин «условие» относится к таким условиям реакции, как концентрация субстрата, концентрация фермента, период реакции и/или температура. Успешная разработка способа биопревращения для получения (-)-амброкса из гомофарнезола в рекомбинантном штамме Е. coli, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую WT/эталонный SHC или производное SHC/HAC, может предложить дешевый и экономичный с точки зрения промышленного производства способ получения (-)- амброкса.
Успешная разработка способа биопревращения для получения оксида амбры из бисгомофарнезола в рекомбинантном штамме Е. coli, содержащем нуклеотидную последовательность, кодирующую WT/эталонный SHC или производное SHC/HAC, может предложить дешевый и экономичный с точки зрения промышленного производства способ получения оксида амбры.
Во всем данном описании изобретения и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, следует понимать, что слово «содержать» и такие вариации, как «содержит» и «содержащий», подразумевает включение указанного целого, или стадии, или группы целых или стадий, но не исключение любого другого целого, или стадии, или группы целых или стадий. Термин «содержащий» также означает «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-нибудь дополнительное, например X плюс Y. Также необходимо отметить, что формы единственного числа, как они используются в данном описании изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, включают объекты ссылок во множественном числе, если контекст явно не диктует иное. В качестве примера, ссылка на «ген» или «фермент» представляет собой ссылку на «один или более чем один ген» или «один или более чем один фермент».
Следует понимать, что данное раскрытие не ограничивается конкретными описанными здесь методологией, протоколами и реактивами, так как они могут варьировать. Также следует понимать то, что используемая здесь терминология служит лишь для цели описания конкретным воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего раскрытия, который будет ограничиваться только приложенной формулой изобретения. Если не определено иное, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области. Согласно настоящему раскрытию, могут использоваться традиционные методики молекулярной биологии, микробиологии и генной инженерии, которые находятся в пределах квалификации специалиста в данной области.
Данное раскрытие не ограничивается в его применении подробностям конструкции и организацией компонентов, изложенных в следующем описании или проиллюстрированным в графических материалах. Данное раскрытие допускает другие воплощения и осуществление на практике или проводится разными способами. Также используемая здесь фразеология и терминология служит для описания и не должна рассматриваться как ограничивающая. Предпочтительно, используемые здесь термины определены, как описано в «А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).
В тексте данного описания изобретения указаны несколько документов. Каждый из указанных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации изготовителей, инструкции, представления номеров доступа последовательностей в GenBank), независимо от того, указаны они выше или ниже, включены в данное описание изобретения посредством ссылки во всей его полноте.
Маточные растворы веществ для применения в реакциях биопревращения (125 г/л или более) были приготовлены либо в г/л (например суспензия биокатализатора), либо в % (масс./масс.) (например SDS). Реакции биопревращения проводили, добавляя по массе требующиеся количества индивидуальных компонентов (например маточные растворы субстрата, суспензию биокатализатора, раствор SDS, реакционный буфер), как описано, например, в Примере 4. По этой причине фактический объем реакционной смеси выражается в единицах массы, а не в единицах объема (см., например, Пример 4). Поскольку используемым субстратом является маслом (плотность менее 1), общую массу реакционной смеси, например 150 г (как, например, в Примере 4) не переводят в объем реакционной смеси 150 мл. Тем не менее, концентрации индивидуальных компонентов в реакционных смесях для биопревращения указаны в массе на объем (например г/л или % (масс./об.)) и, таким образом, не учитывают, что общая масса реакционной смеси, например 150 г (как, например, в Примере 4) не соответствует точно реакционному объему 150 мл (как, например, в Примере 4).
Во избежание сомнений, все ссылки на ЕЕН в Примерах, фигурах и легендах к фигурам представляют собой ссылку на EE-изомер гомофарнезола. Используемый ЕЕН берут из маточного раствора гомофарнезола, содержащего смесь изомеров EE:EZ в массовом соотношении 80:20.
Описанные здесь примеры иллюстрируют настоящее раскрытие и не предназначены для его ограничения. Согласно настоящему раскрытию, описаны разные воплощения настоящего раскрытия. В отношении описанных и проиллюстрированных здесь методик могут быть сделаны многие модификации и изменения без отступления от сущности и объема данного раскрытия. Соответственно, следует понимать, что примеры являются лишь иллюстративными и не ограничивают объем данного раскрытия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - получение и анализ новых вариантов фермента SHC/HAC
Получение плазмиды SHC
Ген, кодирующий фермент скваленгопенциклазу (SHC) дикого типа или ее вариант вставляли в плазмиду рЕТ-28а(+), где он находится под контролем IPTG-индуцибельного промотора Т7 для продуцирования белка в Escherichia coli. Плазмиду трансформировали в штамм Е. coli BL21(DE3) с использованием стандартного протокола трансформации тепловым шоком.
Приготовление среды
Минимальную среду, выбранную по умолчанию, готовили следующим образом для 350 мл культуры: в 35 мл маточного раствора лимонной кислоты/фосфата (133 г/л КН2РО4, 40 г/л (NH4)2HPO4, 17 г/л лимонная кислота-H2O с рН, доведенным до 6,3) добавляли 307 мл H2O, рН доводили до 6,8 с помощью 32% NaOH по мере необходимости. После автоклавирования добавляли 0,850 мл 50% MgSO4, 0,035 мл раствора микроэлементов (см. ниже), 0,035 мл раствора тиамина и 7 мл 20%-ной глюкозы.
Раствор микроэлементов: 50 г/л Na2EDTA.2H2O, 20 г/л FeSO4.7H2O, 3 г/л Н3ВО3, 0,9 г/л MnSO4.2H2O, 1,1 г/л CoCl2, 80 г/л CuCl2, 240 г/л NiSO4.7H2O, 100 г/л KI, 1,4 г/л (NH4)6Mo7o24.4H2O, 1 г/л ZnSO4.7H2O в деионизированной воде.
Раствор тиамина: 2,25 г/л тиамина⋅HCl в деионизированной воде.
Раствор MgSO4: 50% (масс./об.) MgSO4⋅7H2O в деионизированной воде.
Получение биокатализатора (фермент SHC/HAC дикого типа или вариант фермента) в малом масштабе
350 мл культуры (среда, дополненная 50 мкг/мл канамицина) инокулировали из предкультуры штамма Е. coli BL21(DE3), содержащего плазмиду, продуцирующую SHC. Клетки выращивали до оптической плотности примерно 0,5 (OD650нм) при 37°С постоянным перемешиванием (250 об/мин).
Затем индуцировали продукцию белка посредством добавления IPTG до концентрации 300 мкМ, с последующей инкубацией в течение еще 5-6 часов с постоянным встряхиванием. Образующуюся биомассу наконец собирали центрифугированием и промывали, например, 50 мМ буфером Tris-HCl, рН 7,5. Клетки хранили в виде осадков при 4°С или -20°С до дальнейшего применения. В общем случае, из 1 литра культуры получали от 2,5 до 4 граммов клеток (сырой вес), независимо от используемой среды.
Получение биокатализатора в ферментерах
Ферментации готовили и проводили в 750 мл реакторах InforsHT. В ферментационный сосуд добавляли 168 мл деионизированной воды. Реакционный сосуд был оснащен всеми необходимыми зондами (pO2, рН, для отбора проб, антипенным), подпиткой С+N и бутылями с гидроксидом натрия и автоклавирован. После автоклавирования в данный реактор добавляют:
20 мл 10× буфера фосфат/лимонная кислота
14 мл 50%-ной глюкозы
0,53 мл раствора MgSO4
2 мл раствора (NH4)2MgSO4
0,020 мл раствора микроэлементов
0,400 мл раствора тиамина
0,200 мл маточного раствора канамицина.
Были установлены следующие рабочие параметры: рН=6,95, pO2=40%, Т=30°С, перемешивание при 300 об/мин. Каскад: установка об/мин на 300, минимум 300, максимум 1000, установка потока (л/мин) 0,1, минимум 0, максимум 0,6. Противопенный контроль: 1:9.
Ферментер инокулировали из посевной культуры до СD650нм 0,4-0,5. Данную посевную культуру выращивали в среде LB (плюс канамицин) при 37°С, 220 об/мин в течение 8 ч. Ферментацию сначала проводили в периодическом режиме в течение 11,5 ч, после чего начинали подпитку С+N подпиточным раствором (стерилизованный раствор глюкозы (143 мл Н2О+35 г глюкозы), в который после стерилизации были добавлены: 17,5 мл раствора (NH4)2SO4, 1,8 мл раствора MgSO4, 0,018 мл раствора микроэлементов, 0,360 мл раствора тиамина, 0,180 мл маточного раствора канамицина. Подпитку проводили при постоянной скорости тока примерно 4,2 мл/ч. Измерения глюкозы и NH4 + осуществляли извне для оценки доступности источников С и N в культуре. Обычно уровни глюкозы оставались очень низкими.
Культуры выращивали суммарно в течение примерно 25 часов, когда они обычно достигали OD650нм 40-45. Затем начинали продуцирование SHC путем добавления IPTG до концентрации в ферментере примерно 1 мМ (в виде импулься IPTG или на протяжении периода 3-4 часов с использованием инфузионного шприца), устанавливая температуру 40°С и рО2 20%. Индукция продуцирования SHC длилась в течение 16 ч при 40°С. В конце индукции клетки отбирали центрифугированием, промывали 0,1 М буфером на основе лимонной кислоты/цитрата натрия, рН 5,4, и хранили в виде осадков при 4°С или -20°С до дальнейшего применения.
Получение и отбор новых вариантов фермента SHC/HAC
Программу эволюции фермента проводили с использованием гена варианта SHC 215G2 (SHC 215G2) Alicyclobacillus acidocaldarius, описанного ранее в WO 2016/170099, в качестве матрицы. Получали библиотеку из примерно 9950 вариантов SHC и подвергали скринингу на варианты, демонстрирующие повышенную способность к циклизации Е,Е-гомофарнезола (ЕЕН). Скрининг (постановка в планшете для микротитрования) проводили в 50 мМ буфере на основе янтарной кислоты/NaOH, рН 5,2 (0,200 мл), содержащем 34 г/л ЕЕН и 0,075% додецилсульфата натрия (SDS). Реакции проводили в течение 24 часов при 35°С при постоянном перемешивании (орбитальное встряхивание, 210 об/мин).
Были отобраны примерно 495 вариантов для подтверждения при одинаковых установках реакции. Из этих 495 вариантов были отобраны для подтверждения 48 в объеме реакционных смесей 0,500 мл (одинаковые условия) со свежеполученным биокатализатором (2 мл культуры).
Наконец, 16 из предыдущих 48 вариантов, демонстрирующих улучшенную активность на ЕЕН, использовали для проведения превращений ЕЕН при 34, 68 или 136 г/л в 50 мМ буфере на основе янтарной кислоты/NaOH, рН 5,2, содержащем субстрат ЕЕН, 0,1% SDS и клетки, которые продуцировали варианты SHC до OD650нм 40,0. Конечный объем составлял 1 мл, реакционные смеси инкубировали при 35°С и энергично перемешивали на магнитной мешалке. Из реакционных смесей отбирали образцы с течением времени, экстрагировали растворителем и анализировали посредством газовой хроматографии для определения превращения ЕЕН в (-)-амброкс (см. аналитические способы ниже).
Из этого отбирали 3 варианта с улучшенной активностью циклизации ЕЕН (90С7, 110 В8 и 115А7). У этих 3 вариантов всего было идентифицировано 7 мутаций. Из этих 3 вариантов получали биокатализатор, и биопревращения ЕЕН проводили при 100 г/л ЕЕН и 250 г/л клеток в 100 мМ буфере на основе уксусной кислоты/ацетата натрия, рН 4,7, в присутствии 0,975% SDS. Реакцию (объем 2 мл) инкубировали в течение 72 часов при 35°С при постоянном встряхивании (магнитная мешалка) и отбирали образцы с течением времени для анализа посредством ГХ.
Затем осуществляли исследование мутаций для определения того, какие из идентифицированных одиночных мутаций или комбинаций мутаций были полезными для циклизации ЕЕН в (-)-амброкс. Конструировали 15 дополнительных вариантов и получали их биокатализатор. Активность данных вариантов анализировали в реакционных смесях, содержащих либо 34 г/л ЕЕН, 77 г/л клеток и 0,4% SDS, либо 34 г/л ЕЕН, 155 г/л клеток и 0,7% SDS, либо 34 г/л ЕЕН, 250 г/л клеток и 1,0% SDS в 50 мМ буфере на основе янтарной кислоты/NaOH, рН 4,7-5,2. Реакционные смеси (объем 1 мл) инкубировали при 35°С при постоянном перемешивании (магнитная мешалка), отбирали образцы с течением времени и экстрагировали для анализа посредством ГХ.
ГХ аналитические методы
Образцы экстрагировали подходящим объемом трет-бутилметилового эфира (MBTE/tBME) для количественного измерения их содержания в субстрате и продуктах реакции. Фракцию растворителя отделяли от водной фазы центрифугированием перед анализом посредством газовой хроматографии. 1 мкл фазы растворителя инъецировали (деление потока 10) на 30 м × 0,32 мм × 0,25 мкм колонку Zebron ZB-5. С колонкой работали при постоянном потоке (4 мл/мин H2) с градиентом температуры: 100°С, 15°С/мин до 200°С, 120°С/мин до 240°С, 4 мин при 240°С. Температура на входе: 250°С, температура детектора: 250°С. Это приводило к разделению ЕЕН и EZH, и пиков, соответствующих (-)-амброксу и 3 другим продуктам реакции, возникающим в результате циклизации гомофарнезола. Это также приводило к разделению Bis-EEH, Bis-EZH и пиков, соответствующих оксиду амбры и 3 другим продуктам реакции, возникающим в результате циклизации бисгомофарнезола.
Превращение ЕЕН рассчитывали из площадей пиков, возникающих в результате циклизации ЕЕН, и ЕЕН с использованием следующей формулы:
Превращение ЕЕН (%)=100 × (ПлощадьПики продуктов из ЕЕН/(ПлощадьПики продуктов из ЕЕН+ПлОщадьПикЕЕН))
Превращение BisEEH рассчитывали таким же способом из площадей пиков, возникающих в результате циклизации BisEEH, и BisEEH таким же способом, как и для превращения ЕЕН.
Результаты
Из 15 оцененных вариантов 6 вариантов, перечисленных ниже в Таблице 6, продемонстрировали наилучшую активность. В Таблице 6 перечислены новые мутации, идентифицированные в данных вариантах.
Новые мутации, идентифицированные в созданных вариантах SHC, не находятся поблизости от активного сайта фермента, как наблюдалось ранее при осуществлении эволюции SHC дикого типа Alicyclobacillus acidocaldarius до SHC 215G2. Большинство новых идентифицированных мутаций вновь локализуются в домене 2 кристаллической структуры фермента (Т90А, А172Т, М277К и H431L). Две локализованы в домене 1 (А557Т и R613S), и 1 - на поверхности раздела между 2 доменами (Y81H).
Пример 2 - оптимизация условий реакции для новых вариантов фермента SHC/HAC
Исследованные параметры реакции: температура, концентрация SDS и рН.
Условия реакции для вариантов SHC, перечисленных в Таблице 6 выше в связи с Примером 1, были индивидуально оптимизированы в отношении температуры, рН и концентрации SDS.
Биокатализатор получали из разных вариантов посредством путем ферментации, как описано выше, с использованием клеток Е. coli, трансформированных соответствующей плазмидой. Клетки отбирали центрифугированием и хранили при -20°С до дальнейшего применения. Полученные биокатализаторы демонстрировали очень похожее содержание SHC. Следовательно, можно было заключить, что наблюдаемые различия в активности были обусловлены введенными мутациями.
Результаты
Реакции объемом 2-5 мл с 4 г/л ЕЕН и биокатализатором, загруженным при OD650нм 10,0, проводили в 0,1 М буфере на основе лимонной кислоты/фосфата натрия, рН 5,0-6,8, в присутствии 0,0125-0,125% SDS при температурах в диапазоне от 28 до 50° и при постоянном перемешивании (прибор Heidolph synthesis 1 Liquid, 900 об/мин).
Условия, приведенные ниже в Таблице 7, по-видимому, являются индивидуальными оптимальными условиями. Они были подтверждены в реакциях, проведенных в 0,1 М буфере на основе янтарной кислоты/NaOH при рН около рН, который был ранее определен как оптимальный.
Было отмечено некоторое отклонение от родительского фермента SHC 215G2. Только лишь с одним исключением введение новых мутаций сдвигало оптимальную температуру на 10°С, от 35°С до примерно 45°С.
Пример 3 - Анализ активности новых вариантов фермента SHC/HAC в исходных и оптимизированных условиях реакции
Для сравнения активности вариантов SHC получали биокатализаторы посредством ферментации из клеток Е. coli, трансформированных подходящей плазмидой. Образующиеся клетки использовали для проведения анализа превращения ЕЕН при концентрации 4 г/л ЕЕН с био катализатором, загруженным до OD650нм 10,0, либо при исходных условиях (35°С, рН 5,4, 0,070% SDS), либо при Т, рН и [SDS], установленных на значения, определенные как оптимальные для каждого из вариантов (см. Таблицу 7 в Примере 2 выше). Образец реакционной смеси загружали на гель SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) для анализа содержания SHC в реакционных смесях. Данный анализ подтвердил то, что все реакционные смеси содержали одинаковые количества фермента SHC.
На Фиг. 1 показаны относительные активности вариантов SHC в исходных условиях (рН 5,4, 35°С, 0,065% SDS, клетки, доведенные до OD650нм 10,0), которые ранее были определены как оптимальные условия реакции для активности SHC 215G2, и в индивидуально оптимизированных условиях реакции (варьирующие значения рН, Т и [SDS]).
На Фиг. 2 показаны относительные активности вариантов SHC в оптимизированных условиях по сравнению с родительским ферментом SHC 215G2. Был сделан вывод, что введение лишь немногих мутаций в SHC 215G2 приводило к вариантам с улучшенной или значительно улучшенной активностью (циклизация ЕЕН в (-)-амброкс).
Пример 4 - относительная эффективность вариантов SHC при биопревращении 125 г/л ЕЕН
В биопревращениях 125 г/л ЕЕН использовали биокатализаторы, полученные путем ферментации из штаммов Е. coli, трансформированных плазмидой, несущей ген, кодирующий выбранные новые варианты SHC или родительский SHC 215G2.
Типичную реакцию (общий объем 150 г) осуществляли в 0,75-литровых ферментерах Infors следующим образом. Реакционный сосуд загружали подходящим количеством гомофарнезола, соответствующим 18,75 г ЕЕН. Добавляли 1,95 г SDS из 31%-ного (масс./масс.) раствора, приготовленного в деионизированной воде. Суспензию клеток готовят из клеток E.coli, которые продуцировали интересующий вариант SHC, путем суспендирования клеток в 0,1 М буфере на основе янтарной кислоты/NaOH, рН 5,1. После определения сырой массы клеток, концентрирования данной суспензии клеток центрифугированием в течение 10 мин при 10°С и 17210 g, подходящий объем клеток добавляли в реакционный сосуд для того, чтобы ввести 37,5 г клеток в реакционную смесь. Объем реакционной смеси доводили до 150 г необходимым количеством реакционного буфера, рН 5,1. Реакцию проводили с каждым вариантом SHC при температуре, определенной как оптимальная для его активности, и при постоянном перемешивании при 700 об/мин. рН устанавливали на значении, определенном как оптимальное для каждого варианта SHC или родительского SHC 215G2, с использованием 85% Н3РО4. Регуляцию рН осуществляли вручную с использованием 85%-ной фосфорной кислоты по мере необходимости. Из реакционной смеси отбирали образцы с течением времени (1 мл), экстрагировали 5 объемами MTBE/tBME (5 мл). Содержание гомофарнезола и (-)-амброкса в данной реакционной смеси определяли анализом посредством ГХ после осветления фазы растворителя центрифугированием (настольная центрифуга, 13000 об/мин, 2 мин) и 10-20-кратного разбавления в MTBE/tBME.
На Фиг. 3 показано превращение ЕЕН в (-)-амброкс вариантами SHC и SHC 215G2 (родительский фермент) при биопревращениях, проведенных при 125 г/л ЕЕН с 250 г/л клеток, и осуществляемых с каждым ферментом SHC в оптимальных условиях рН и температуры.
На Фиг. 4 показано относительное улучшение для 4 наилучших вариантов SHC в виде %-ного увеличения превращения ЕЕН по сравнению с превращением, полученным с родительским ферментом SHC 215G2. Наблюдалось значительное увеличение исходной скорости реакции, т.е. превращения ЕЕН, достигаемого за первые 6-8 часов реакции. Предполагается, что дополнительные корректировки используемых условий реакции при превращении 125 г/л ЕЕН с SHC №65 обеспечат дальнейшее увеличение активности данного варианта по сравнению с активностью родительского SHC 215G2 и достижение полного превращения, как и с другими вариантами SHC.
Данные демонстрируют то, что эволюция фермента с использованием SHC 215G2 в качестве родительского фермента продуцировала ферменты SHC с улучшенными свойствами биопревращения ЕЕН. Введение лишь немногих аминокислотных мутаций существенно увеличивает биопревращение ЕЕН. Этим способом время превращения ЕЕН может быть уменьшено примерно на 1/3 или 1/2, при этом завершение реакции происходит примерно через 24 ч вместо 72 ч, в зависимости от использованного варианта SHC.
Пример 5 - циклизация Е,Е-бисгомофарнезола в оксид амбры
Синтез бисгомофарнезола
Бисгомофарнезол получали в виде смеси двух изомеров, как описано на Фиг. 10.
Стадия 1:
Соединение 1 на Фиг. 10 (Е-неролидол) (700,0 г, 3,148 моль, 1,0 экв.), этилвиниловый эфир (703,7 г, 9,758 моль, 3,1 экв.) и фенилфосфорную кислоту (2,1 г, 0,0132 моль, 0,004 экв.) загружали в автоклав, и смесь нагревали до 180°С в течение 2,5 ч. (Примечание: внутреннее давление было повышено до 14 бар (1,4×106 Па). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выгружали из автоклава и концентрировали при пониженном давлении для удаления избытка этилвинилового эфира. Неочищенный продукт разбавляли МТВЕ (1400 мл), промывали 2,0 М НС1 (2 × 700 мл), водой (500 мл) и рассолом (500 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт пропускали через пробку диоксида кремния и затем перегоняли с получением соединения 2 с Фиг. 10 (желтая жидкость, 483,0 г, 61,7%).
Стадия 2:
Соединение 2 (420,0 г, 1,6907 моль, 1,0 экв.) в THF (5 об.) добавляли к перемешиваемому раствору красного А1 (283,26 г, 0,980 моль, 0,58 экв., 70% в толуоле) при 0°С в течение периода 2,0 ч. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и отслеживали при помощи ТСХ (тонкослойная хроматография). После завершения реакцию медленно гасили, используя 10%-ный раствор NaOH (670,0 мл) с температурой 0°С, перемешиваемый при RT (комнатная температура) в течение 1 ч. Затем реакционную смесь разбавляли ледяной водой (2 л) и экстрагировали МТВЕ (2 × 3 л). Объединенный органический слой промывали водой (1 × 2 л) и рассолом (1 × 2 л), и сушили над сульфатом натрия. Органический слой концентрировали под вакуумом с получением неочищенного соединения, которое очищали перегонкой под вакуумом с получением Е,E/Z-бисгомофарнезола (бледно-желтая жидкость, 280,0 г, 66,1%).
Бисгомофарнезол получали в виде смеси изомеров с соотношением E,E:E,Z примерно 80:20.
Циклизация Е,Е-бисгомофарнезола в оксид амбры
Новые полученные варианты SHC использовали в биопревращении бисгомофарнезола (смесь Е,Е- и E,Z-бисгомофарнезола) в оксид амбры. Были идентифицированы продукты реакции на Фиг. 11:
Циклизация при 4 г/л Е,Е-бисгомофарнезола
Активность вариантов анализировали в условиях реакции, индивидуально определенных как оптимальные, и как изложено в Таблице 7 выше (температура, рН, концентрация SDS). Реакционные смеси (объем 5 мл) содержали 4 г/л Е,Е-бисгомофарнезола в качестве субстрата. Клетки, которые продуцировали варианты SHC, добавляли до OD650нм 10,0 для начала реакции. Реакционные смеси инкубировали на приборе Heidolph Synthesis 1 Liquid 16 при постоянном перемешивании (900 об/мин).
Биопрееращение при 125 г/л Е,Е-бисгомофарнезола
Типичную реакцию (общий объем 150 г) проводили в 0,75-литровых ферментерах bifors, как показано в Примере 4, но загружая реакционные смеси 125 г/л Е,Е-бисгомофарнезола вместо Е,Е-гомофарнезола. Реакции проводили при 35°С при постоянном перемешивании (700 об/мин) и рН 5,4 в 0,1 М буфере на основе янтарной кислоты/NaOH со всеми вариантами SHC.
Результаты - циклизация при 4 г/л Е/Е-бисгомофарнезола
Наблюдали значительное увеличение активности с вариантами фермента SHC/HAC №65, №66 и №110 В8 по сравнению с активностью родительского варианта фермента SHC/HAC 215G2. Результаты показаны на Фиг. 5.
Результаты - биопревращение при 125 г/л Е,Е-бисгомофарнезола
Превращение Е,Е-бисгомофарнезола показано на Фиг. 6. Увеличение превращения отмечали с каждым из проанализированных вариантов. В 72 часа реакции со всеми вариантами SHC превращение Е,Е-BisHF составляло 95% или выше. С вариантами SHC №66 или SHC 110 В8 95%-ное превращение получали за примерно 48 часов реакции, т.е. требовалось только 2/3 времени, необходимого для проведения биопревращения с родительским ферментом SHC 215G2.
Реакционную смесь экстрагировали 5 раз 100 мл МТВЕ посредством энергичного встряхивания, с последующим разделением фаз посредством центрифугирования (6000 g, 10 мин, комнатная температура). Это обеспечивало почти полную экстракцию продукта реакции, судя по анализу ГХ выделенных фаз растворителя.
Варианты, проанализированные с Е,Е-бисгомофарнезолом, демонстрировали улучшенную активность по сравнению с родительским ферментом SHC 215G2, хотя и не были установлены условия реакции в отношении рН и температуры, определенные как оптимальные для новых вариантов SHC. Предполагается, что наблюдается дальнейшее увеличение активности при установке значений рН и температуры, определенных как оптимальные с индивидуальными вариантами, как изложено в Примере выше.
Результаты - идентичность продуктов реакции
Соединение X - оксид амбры
1Н ЯМР (ядерный магнитный резонанс) (400 МГц, CDCl3) δ 3.71-3.59 (m, 2Н), 1.76 (dt, J=11,7, 3,8 Гц, 1Н), 1.71-1.57 (m, 6Н), 1.46-1.24 (m, 6Н), 1.26 (s, 3H), 1.15 (td, J=13,2, 4,2 Гц, 1H) 0.97 (dd, J=13,2, 4,2 Гц, 1Н), 0.89-0.85 (m, 1H) 0.88 (s, 3 Н), 0.81 (s, 3 Н), 0.76 (s, 3 Н). 13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ млн-1 74.67, 60.89, 57.81, 56.43, 42.10, 41.96, 38.97, 36.88, 33.36, 33.29, 27.68, 21.36, 19.94, 19.91, 18.60, 18.15, 15.60
Соединение XI
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ млн-1 3.61 - 3.57 (m, 2 Н), 2.09 (td, J=12,84, 4,40 Гц, 1 Н), 1.82 (dt, J=12,23, 3,91 Гц, 1 Н), 1.70 - 1.62 (m, 2 Н), 1.60 - 1.33 (m, 7 Н), 1.39 (br s, 3H), 1.31 - 1.19 (m, 2 Н), 1.15-0.99 (m, 3 Н), 1.12 (br s, 3H), 0.87 (s, 3 Н), 0.80 (s, 3 Н). 13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ млн-1 75.56, 60.27, 54.60, 46.99, 42.51, 38.32, 36.62, 33.45, 33.34, 31.74, 30.92, 26.64, 24.99, 21.91, 21.78, 20.96, 18.91
Соединение XII
1Н ЯМР (600 МГц, БЕНЗОЛ-d6) δ млн-1 4.94 (s, 1 Н), 4.64 (s, 1 Н), 3.38 (br t, J=5,6 Гц, 2 Н), 2.37 (br d, J=12,4 Гц, 1 Н), 1.94 (td, J=12,8, 4,1 Гц, 1 Н), 1.72 - 1.57 (m, 3 Н), 1.56 - 1.46 (m, 3 Н), 1.44 - 1.33 (m, 3 Н), 1.33 - 1.24 (m, 2 Н), 1.13 (td, J=13,4, 3,4 Гц, 1 Н), 0.96 (br d, J=12,8 Гц, 1 Н), 0.89 (td, J=13,4, 2,6 Гц, 1 Н), 0.85 (s, 3 Н), 0.80 (s, 3 Н), 0.72 (s, 3 Н), 0.62 (br s, ОН). 13С ЯМР (151 МГц, БЕНЗОЛ-d6) δ млн-1 148.70, 106.52, 62.78, 56.57, 55.25, 42.11, 39.90, 38.92, 38.34, 33.70, 33.44, 32.03, 24.38, 21.58, 19.64, 19.55, 14.27
Соединение XIII
1H ЯМР (600 МГц, БЕНЗОЛ-d6) δ млн-1 5.15 (br dd, J=10,5, 4,9 Гц, 1 Н), 3.32 (td, J=13,2, 3,4 Гц, 1 Н), 3.25 - 3.21 (m, 1 Н), 3.14 - 3.09 (m, 1 Н), 2.79 (qd, J=12,3, 4,9 Гц, 1 Н), 1.87 - 1.80 (m, 2 Н), 1.72 (s, 3 Н), 1.72 - 1.62 (m, 6 Н), 1.51 - 1.44 (m, 1 Н), 1.39 - 1.22 (m, 5 Н), 1.27 (s, 3 Н), 1.03 (td, J=13,2, 3,0 Гц, 1 Н), 0.93 (s, 3 Н), 0.77 (s, 3 Н). 13С ЯМР (151 МГц, БЕНЗОЛ-d6) δ млн-1 137.10, 123.6, 78.0, 56.79, 43.05, 42.11, 37.74, 35.0 33.46, 29.20, 27.29, 24.57, 24.29, 23.48, 22.59, 22.33, 20.27
Пример 6 - превращение ЕЕН в (-)-амброкс с использованием ферментов SHC дикого типа
Ферменты SHC дикого типа, перечисленные в Таблице 8 ниже, были выбраны для анализа их способности превращать E,Е-гомофарнезол в (-)-амброкс.
Биокатализатор получали из штаммов Е. coli, трансформированных рЕТ-28а(+), несущей ген продуцирования фермента дикого типа, как описано в Примере 1 выше (получение биокатализатора в малом масштабе).
С каждым из полученных биокатализаторов грубо исследовали влияние условий рН, температуры и концентрации поверхностно-активного вещества. На первой стадии осуществляли оптимизацию рН, с последующей оптимизацией [SDS] и температуры. Подтверждение оптимизированных условий реакции осуществляли в дополнительном наборе реакций (разные рН, температура и концентрация SDS) с использованием 0,1 М буферов на основе янтарной кислоты/NaOH около значения рН, определенного как оптимальное:
* оптимизация рН: 4 г/л ЕЕН с 0,075% SDS, клетки при OD650нм 10, в буфере на основе лимонной кислоты/фосфате натрия, рН от 5,0 до 7,0 (общий объем 1 мл, 40°С, 900 об/мин, Heidolph Synthesis 1).
* оптимизация [SDS] и температуры: 4 г/л ЕЕН, клетки при OD650нм 10, в буфере на основе лимонной кислоты/фосфате Na (общий объем 1 мл, 900 об/мин, Heidolph Synthesis 1), варьирующие [SDS] и температура при оптимальном рН.
* подтверждение условий реакции: 4 г/л ЕЕН, клетки при OD650нм 10, в буфере на основе лимонной кислоты/фосфате Na (общий объем 1 мл, 900 об/мин, Heidolph Synthesis 1), [SDS], температура и рН согласно необходимости.
Реакции проводили в течение 24 часов, отбирали образце с течением времени (t равно 0, t равно 3 ч и t равно 22 ч), экстрагировали и анализировали на содержание в них субстрата и продукта, и превращение ЕЕН рассчитывали, как описано выше. Это обеспечивало грубую оценку исходной скорости превращения ЕЕН с каждым из ферментов SHC дикого типа, а также превращение, полученное после 22 часов реакции. Реакции проводили с 4 г/л ЕЕН и биокатализатором, заруженным до OD650нм 10,0, при варьирующих рН, температуре и концентрации SDS.
Результаты
В Таблице 9 ниже обобщены условия, определенные как оптимальные для каждого из проанализированных ферментов SHC дикого типа, а также превращение ЕЕН, полученное в 22 часа реакции при использовании исходных (35°С, рН 5,4, 0,070% SDS) или индивидуально оптимизированных условий реакции. Превращение ЕЕН в (-)-амброкс наблюдали со всеми из этих ферментов, хотя и на значительно варьирующих уровнях. Превращение ЕЕН было наивысшим при продукции клетками Е. coli, В. japonicum SHC и Zymomonas mobilis SHC1. Очень интересно, что превращение ЕЕН также было получено с использованием Zymomonas mobilis SHC2, для которого в других местах сообщалось, что данный фермент не циклизирует ЕЕН.
Превращение ЕЕН, полученное в реакциях, проведенных при 4 г/л ЕЕН и с биокатализатором, заруженным до OD650нм 10,0, с использованием индивидуально оптимизированных (Т, рН, [SDS]) условий реакции.
Пример 7 - выравнивание последовательности SHC дикого типа
Последовательности разных SHC дикого типа выравнивали с использованием параметров, уточненных ниже (с использованием программы Clone Manager 9). Результаты показаны в Таблице 10 ниже и на Фиг. 8.
Выравнивание: глобальное выравнивание белка против эталонной молекулы
Параметры: матрица замен: BLOSUM 62
Эталонная молекула: SHC Аас, область 1-631
Общая длина выравниваемых последовательностей с пробелами: 838 ак (аминокислоты)
Пример 8 - оптимальные условия реакции с вариантами SHC
Способы
В SHC 215G2 вводили дополнительные мутации, продуцируя варианты [215G2+V174I], [215G2+V174I+F601], [215G2+L37Q] и [215G2+L37Q+V174I]. Выравнивание последовательности данных вариантов показано на Фиг. 8.
Оптимальные условия реакции для этих вариантов исследовали, как описано в Примерах выше. Их эффективность в циклизации ЕЕН затем анализировали при 4 г/л субстрата с клетками, загруженными в реакционную смесь при OD650нм 10,0.
Результаты
Условия реакции (температура, рН, концентрация SDS), перечисленные в Таблице 11 ниже, по-видимому, являются индивидуальными оптимальными условиями реакции для активности циклизации упомянутых выше вариантов. Варианты с новыми мутациями демонстрировали приблизительно такую же активность, что и SHC 215G2, или повышенную активность, которая может коррелировать с повышенными уровнями продуцирования SHC.
Пример 9 - продукты реакции
Способы
Реакции в объеме 5 мл проводили с 4 г/л ЕЕН и биокатализатором, загруженным до OD650нм 10,0, при рН, температуре и концентрации SDS, определенных как оптимальные для каждого фермента и при постоянном перемешивании (прибор Heidolph synthesis 1 Liquid, 900 об/мин).
Результаты
В Таблице 12 проиллюстрировано превращение ЕЕН через 20 ч с каждым ферментом и полученное распределение продуктов реакции. Соединения формул (I) ((-)-амброкс) и (IV) образуются в результате циклизации ЕЕН, соединения формул (II) (макроцикл) и (III) (9b-эпи-амброкс) образуются в результате циклизации EZH. Используемый гомофарнезол представлял собой смесь изомеров (EEH:EZH 80:20).
Наблюдается то, что все ферменты SHC WT и, в частности WT ZmoSHCl, BjaSHC, GmoSHC, ApaSHCl, при уровнях превращения 9% или выше демонстрируют более высокую селективность в отношении ЕЕН по сравнению с WT ApaSHC. Это привело к большей доле соединений (I) и (IV) по сравнению с соединениями (II) и (III) в реакционном продукте и также превратилось в более высокое отношение превращения EEH:EZH.
Пример 10 - Объемная продуктивность
Новые варианты SHC Alicyclobacillus acidocaldarius использовали для улучшения циклизации Е,Е-гомофарнезола в (-)-амброкс в биопревращениях, проводимых при 125 г/л Е,Е-гомофарнезола и с 250 г/л клеток, как изложено в Примере 4. Рассматривалось уменьшение времени реакции для полного превращения ЕЕН в биопревращениях, проводимых при 125 г/л с 250 г/л клеток.
Способы
Биокатализаторы получали, как описано в Примере 1 (ферментация). Биопревращения проводили, как изложено в Примере 4, используя условия температуры и рН, индивидуально оптимизированные для каждого варианта и, как изложено в Примере 2, с единственным исключением, что со всеми вариантами была установлена концентрация SDS 1,3% (масс./об.) (отношение [SDS]:[клетки] 0,052).
Результаты
В зависимости от рассматриваемого варианта SHC/HAC, время, требующееся для полного превращения 125 г/л Е,Е-гомофарнезола в (-)-амброкс с 250 г/л клеток, могло быть уменьшено на 1/3 или 2/3, причем полное превращение достигалось примерно в 48 или 24 часа вместо примерно 72 часов с эталонным биокатализатором SHC 215G2 (Фиг. 12).
Исходная скорость реакции с новыми вариантами SHC увеличивалась в 1,4-1,8 раз по сравнению с эталонным биокатализатором SHC 215G2.
Объемная продуктивность, определенная как амброкс, продуцируемый на литр и в час, или амброкс, продуцированный на литр, в час и на грамм биокатализатора, возрастала в 1,4-2,6 раза по сравнению с эталонным биопревращением, проводимым с биокатализатором SHC 215G2 (Таблица 13).
Пример 11 - Объемная продуктивность
Новые варианты SHC Alicyclobacillus acidocaldarius использовали для улучшения циклизации Е,Е-гомофарнезола в (-)-амброкс в биопревращениях, проводимых при 125 г/л Е,Е-гомофарнезола и с 250 г/л клеток, как изложено в Примере 4. Рассматривали уменьшение загрузки биокатализатора для полного превращения ЕЕН в биопревращениях, проводимых при 125 г/л субстрата.
Способы
Биокатализаторы получали, как описано в Примере 1 (ферментация). Биопревращения проводили, как изложено в Примере 4, применяя условия температуры и рН, индивидуально оптимизированные для каждого варианта и, как изложено в Примере 2, с единственным исключением, что со всеми вариантами была установлена концентрация клеток 125 г/л и концентрация SDS 0,65% (масс./об.) (отношение [SDS]: [клетки] 0,052).
Результаты
С биокатализаторами, продуцирующими новый вариант SHC/HAC SHC№49 и SHC№65, было возможным снижение концентрации клеток в 2 раза с 250 до 125 г/л клеток для полного превращения ЕЕН за 72 часа времени (Фиг. 13). Превращение ЕЕН эталонным биокатализатором SHC 215G2 составляло только примерно 67% в то же самое время.
Объемная продуктивность, определенная как (-)-амброкс, продуцированный на литр и в час, или как (-)-амброкс, продуцированный на литр, в час и на грамм биокатализатора, возрастала примерно в 1,5 раза по сравнению с таким же биопревращением, проводимым с биокатализатором SHC 215G2 в качестве эталона (Таблица 14). Если взять биопревращение, проводимое со 125 г/л и 250 г/л клеток с эталонным биокатализатором SHC 215G2, объемная продуктивность увеличивалась примерно в 2 раза (Таблица 14).
Пример 12 - Объемная продуктивность
Новые варианты SHC Alicyclobacillus acidocaldarius использовали для улучшения циклизации Е,Е-гомофарнезола в (-)-амброкс в биопревращениях, проводимых при 125 г/л Е,Е-гомофарнезола и с 250 г/л клеток, как изложено в Примере 4. Рассматривалось увеличение концентрации ЕЕН в биопревращениях.
Способы
Биокатализатор получали, как описано в Примере 1 (ферментация). Биопревращения проводили, как изложено в Примере 4, но с соотношением ЕЕН к биокатализатору 1:1 и при постоянном отношении [SDS]: [клетки] 0,052. Условия оптимизированной температуры и рН были определены как оптимальные для биокатализатора SHC№65 (Пример 2).
Результаты
С новым вариантом SHC/HAC SHC№65 было возможным полное превращение вплоть до 300 г/л ЕЕН с 300 г/л биокатализатора в 48 ч (Фиг. 14).
Объемная продуктивность, определенная как амброкс, продуцированный на литр и в час, увеличивалась в 2,3-3,4 раза. Объемная продуктивность, определенная как амброкс, продуцированный на литр, в час и на грамм биокатализатора, возрастала в 2,8-2,9 раза. Кратность увеличения относится к реакции, проводимой при 125 г/л ЕЕН с 250 г/л клеток с использованием биокатализатора SHC 215G2 (Таблица 15).
Пример 13 - Циклизация ЕЕН ферментами SHC wt
Способы
Биокатализаторы - ферменты SHC дикого типа - AacSHC (SHC Alicyclobacillus acidocaldarius, SEQ ID NO:1), GmoSHC (SHC Gluconobacter morbifer, SEQ ID NO: 14), BjpSHC (SHC Bradyrhizobium japonicum, SEQ ID NO: 13), ApaSHCl и ApaSHCA (SHC1 и SHCA Acetobacter pasteurianus, SEQ ID NO: 20 и 30 соответственно), ZmoSHCl и ZmoSHC2 (SHC1 и SHC2 Zymomonas mobilis, SEQ ID NO: 11 и 12 соответственно), SalSHC (SHC Streptomyces albolongus, SEQ ID NO: 29), TelSHC (Thermosynechococcus elongates, SEQ ID NO: 19) и BmeSHC (SHC Bacillus megaterium, SEQ ID NO: 28) были получены в ферментациях, как описано в Примере 1.
Эти ферменты SHC дикого типа (также перечисленные в Таблице 16 ниже) были выбраны для анализа их способности превращать Е,Е-гомофарнезол в (-)-амброкс.
Оптимальные условия реакции исследовали с биокатализатором BmeSHC, как изложено в Примере 6 для других ферментов SHC. Оптимальные условия реакции были определены как 45°С, рН 5,6 и с 0,0025% (масс./об.) SDS для загрузки клеток, соответствующей OD650нм 10, в реакционной смеси.
Оптимальные условия реакции с SalSHC представляли собой 30°С, рН 7,0 без добавления поверхностно-активного вещества в реакционную смесь (Liu et al. (2020): A Novel Soluble Squalene-Hopene Cyclase and Its Application in Efficient Synthesis of Hopene, Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol 8, article 426, https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00426).
Активность полученных в результате биокатализаторов анализировали при 4 г/л ЕЕН и при 125 г/л ЕЕН с единственным исключением для SalSHC, где использовали 1 г/л ЕЕН вместо 4 г/л ЕЕН.
Анализ активности с 4 г/л ЕЕН (SalSHC: 1 г/л ЕЕН) содержал клетки при OD650нм 10 (биокатализатор SalSHC: OD650нм 40), и в иных отношения его проводили, как изложено в Примере 6, используя индивидуально оптимизированные условия температуры и рН для каждого фермента SHC.
Биопревращения при 125 г/л ЕЕН проводили с 250 г/л клеток, как изложено в Примере 4, используя индивидуально оптимизированные условия температуры и рН для каждого фермента SHC, и как изложено в Примере 6. Реакционные смеси содержали 1,3% (масс./об.) SDS с AccSHC, 0,16% (масс./об.) с BjpSHC, ZmoSHCl, ApaSHCl, 0,10% (масс./об.) с BmeSHC и 0,14% (масс./об.) с GmoSHC. Не проводили биопревращения при 125 г/л ЕЕН с биокатализаторами ApaSHCA, TelSHC, SalSHC и ZmoSHC2.
Результаты
Циклизацию ЕЕН в (-)-амброкс наблюдали со всеми проанализированными биокатализаторами SHC при низкой концентрации субстрата (1 или 4 г/л). С биокатализаторами SHC дикого типа, проанализированными при 125 г/л ЕЕН, превращение ЕЕН составляло от примерно 15% до примерно 75% (Фиг. 15).
Пример 14 - Выравнивание последовательности ферментов SHC дикого типа
Идентичность последовательности ферментов SHC относительно AacSHC WT определяли либо с использованием программы Clone Manager 9 с параметрами, определенными ниже, либо с использованием blastp, используя параметры по умолчанию. Результаты обобщены в Таблицах 17А и 17Б соответственно.
Выравнивание: глобальное выравнивание белка против эталонной молекулы
Параметры: матрица замен: BLOSUM 62
Эталонная молекула: SHC Аас, область 1-631
Общая длина выровненных последовательностей с пробелами: 838 ак
Пример 15 - Выравнивание последовательности SHC дикого типа
Последовательности SHC дикого типа, раскрытые в Таблицах 16-18, выравнивали с использованием Clustal О (1.2.4). Множественные выравнивания последовательностей приведены на Фиг. 9А и 9Б, и процент идентичности данных последовательностей (определенный с использованием blastp) приведен в Таблице 19.
Пример 16 - Влияние условий культивирования на удельную активность биокатализатора
Способы
В качестве альтернативы способам получения биокатализатора, описанным в Примере 1 (культивирование и ферментация во встряхиваемой колбе) анализировали получение био катализатор а с использованием автоиндуцирующей среды (AIM). Данную среду получали с использованием основы бульона AIM-ТВ, включающей микроэлементы (Formedium). 25 мл AIM-ТВ в 100 мл встряхиваемой колбе с перегородками обогащали 1% глицерином. Культуру инокулировали при OD650нм 2Е-07; культивирование длилось в течение 18 плюс/минус 1 ч при 37°С при постоянном встряхивании (220 об/мин).
Активность собранных биокатализаторов анализировали в стандартном анализе активности при 4 г/л E,E-гомофарнезола, с клетками, доведенными до OD650нм 10, как изложено в Примере 2, и используя в иных отношениях оптимальные температуру, рН и [SDS], как описано в Примерах 2 и 6, в зависимости от рассматриваемого фермента SHC.
Результаты
Активность рассматриваемого биокатализатора SHC сильно варьировала, в зависимости от среды культивирования и условий получения биокатализатора (Таблица 19). Аналогично, ожидается, что получение биокатализатора с использованием альтернативных или модифицированных протоколов ферментации будет приводить к биокатализаторам с меньшей или большей удельной активностью, чем при получении с использованием протокола ферментации, описанного в Примере 1.
Пример 17 - Влияние отношения [SDS]:[клетки] на превращение ЕЕН
Способы
Биокатализатор получали, как описано в Примере 1 (ферментация) из штамма Е. coli, продуцирующего вариант фермента SHC SHC№65. Биопревращения ЕЕН проводили, как изложено в Примере 4, но со 125 г/л ЕЕН и 150 г/л клеток. Реакции проводили при рН 5,6 и 45°С, определенных как оптимальные для SHC№65. Содержание SDS в реакционных смесях варьировало от 0,060, 0,066, 0,072, 0,078, 0,084 и 0,090%, приводя к отношению [SDS]:[клетки]: 0,040, 0,044, 0,048, 0,052, 0,056 и 0,060 соответственно.
Результаты
Превращение ЕЕН во всех реакциях составляло более 85%, причем максимальное превращение было получено при соотношении [SDS]:[клетки] в диапазоне от 0,044 до 0,056. При отношении [SDS]:[клетки] 0,040 и 0,060 превращение было немного меньше (Фиг. 16).
Приведенное выше описание широко описывает определенные воплощения настоящего изобретения без ограничения. Предполагается, что вариации и модификации, которые будут совершенно очевидными для специалистов в данной области, входят в объем настоящего изобретения, как определено в и посредством прилагаемой формулы изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> GIVAUDAN SA
<120> ВАРИАНТЫ СКВАЛЕНГОПЕНЦИКЛАЗЫ (SHC)
<130> 31050
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 631
<212> PRT
<213> Alicyclobacillus acidocaldarius
<400> 1
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Met Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Ala
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Ile
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 2
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №49 фермента SHC/HAС
<400> 2
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Thr Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 3
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №65 фермента SHC/HAC
<400> 3
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Thr Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Ser His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 4
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №66 фермента SHC/HAC
<400> 4
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
His Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Thr Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Ser His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 5
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №110В8 фермента SHC/HAC
<400> 5
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
His Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn Leu Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Thr Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 6
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №49 фермента SHC/HAC
<400> 6
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac ctcaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacgac ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 7
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №65 фермента SHC/HAC
<400> 7
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacgac ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtacagcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 8
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №66 фермента SHC/HAC
<400> 8
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
cacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacgac ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtacagcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 9
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант №110В8 фермента SHC/HAC
<400> 9
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
cacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac ctcaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacgac ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 10
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2
<400> 10
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 11
<211> 608
<212> PRT
<213> Zymomonas mobilis
<400> 11
Met Gly Ile Asp Arg Met Asn Ser Leu Ser Arg Leu Leu Met Lys Lys
1 5 10 15
Ile Phe Gly Ala Glu Lys Thr Ser Tyr Lys Pro Ala Ser Asp Thr Ile
20 25 30
Ile Gly Thr Asp Thr Leu Lys Arg Pro Asn Arg Arg Pro Glu Pro Thr
35 40 45
Ala Lys Val Asp Lys Thr Ile Phe Lys Thr Met Gly Asn Ser Leu Asn
50 55 60
Asn Thr Leu Val Ser Ala Cys Asp Trp Leu Ile Gly Gln Gln Lys Pro
65 70 75 80
Asp Gly His Trp Val Gly Ala Val Glu Ser Asn Ala Ser Met Glu Ala
85 90 95
Glu Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Leu Glu Asp His Pro Leu
100 105 110
Arg Pro Arg Leu Gly Asn Ala Leu Leu Glu Met Gln Arg Glu Asp Gly
115 120 125
Ser Trp Gly Val Tyr Phe Gly Ala Gly Asn Gly Asp Ile Asn Ala Thr
130 135 140
Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Asn
145 150 155 160
Pro Val Leu Lys Lys Ala Ala Ala Trp Ile Ala Glu Lys Gly Gly Leu
165 170 175
Lys Asn Ile Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu
180 185 190
Trp Pro Trp Glu Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro Glu Ile Ile Trp Phe
195 200 205
Pro Asp Asn Phe Val Phe Ser Ile Tyr Asn Phe Ala Gln Trp Ala Arg
210 215 220
Ala Thr Met Val Pro Ile Ala Ile Leu Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg
225 230 235 240
Pro Leu Arg Pro Gln Asp Arg Leu Asp Glu Leu Phe Pro Glu Gly Arg
245 250 255
Ala Arg Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Lys Lys Glu Gly Ile Asp Leu Trp
260 265 270
Ser Gln Phe Phe Arg Thr Thr Asp Arg Gly Leu His Trp Val Gln Ser
275 280 285
Asn Leu Leu Lys Arg Asn Ser Leu Arg Glu Ala Ala Ile Arg His Val
290 295 300
Leu Glu Trp Ile Ile Arg His Gln Asp Ala Asp Gly Gly Trp Gly Gly
305 310 315 320
Ile Gln Pro Pro Trp Val Tyr Gly Leu Met Ala Leu His Gly Glu Gly
325 330 335
Tyr Gln Leu Tyr His Pro Val Met Ala Lys Ala Leu Ser Ala Leu Asp
340 345 350
Asp Pro Gly Trp Arg His Asp Arg Gly Glu Ser Ser Trp Ile Gln Ala
355 360 365
Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Leu Lys
370 375 380
Asp Ala Lys Ala Glu Asp Arg Phe Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Ala
385 390 395 400
Asp Trp Leu Leu Ala Arg Gln Val Lys Val Lys Gly Asp Trp Ser Ile
405 410 415
Lys Leu Pro Asp Val Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn
420 425 430
Asp Arg Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Leu
435 440 445
Ser Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Glu Trp Gln Lys Lys Gly Val Glu Asp
450 455 460
Ala Ile Thr Arg Gly Val Asn Trp Leu Ile Ala Met Gln Ser Glu Cys
465 470 475 480
Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Arg Ser Ile Leu Ser
485 490 495
Lys Ile Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ser Ile Asp Pro Pro Ser Val
500 505 510
Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly Thr Leu Gly Leu Ser
515 520 525
Arg Asp Met Pro Val Ile Gln Lys Ala Ile Asp Tyr Val Arg Ser Glu
530 535 540
Gln Glu Ala Glu Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Ile
545 550 555 560
Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Ile Gly Glu Asp
565 570 575
Met Thr Gln Pro Tyr Ile Thr Lys Ala Cys Asp Trp Leu Val Ala His
580 585 590
Gln Gln Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ser Ser Tyr Met Glu
595 600 605
<210> 12
<211> 658
<212> PRT
<213> Zymomonas mobilis
<400> 12
Met Thr Val Ser Thr Ser Ser Ala Phe His His Ser Pro Leu Ser Asp
1 5 10 15
Asp Val Glu Pro Ile Ile Gln Lys Ala Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys
20 25 30
Gln Gln Gln Asp Gly His Trp Val Phe Glu Leu Glu Ala Asp Ala Thr
35 40 45
Ile Pro Ala Glu Tyr Ile Leu Leu Lys His Tyr Leu Gly Glu Pro Glu
50 55 60
Asp Leu Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Arg Tyr Leu Arg Arg Ile Gln
65 70 75 80
Gly Glu His Gly Gly Trp Ser Leu Phe Tyr Gly Gly Asp Leu Asp Leu
85 90 95
Ser Ala Thr Val Lys Ala Tyr Phe Ala Leu Lys Met Ile Gly Asp Ser
100 105 110
Pro Asp Ala Pro His Met Leu Arg Ala Arg Asn Glu Ile Leu Ala Arg
115 120 125
Gly Gly Ala Met Arg Ala Asn Val Phe Thr Arg Ile Gln Leu Ala Leu
130 135 140
Phe Gly Ala Met Ser Trp Glu His Val Pro Gln Met Pro Val Glu Leu
145 150 155 160
Met Leu Met Pro Glu Trp Phe Pro Val His Ile Asn Lys Met Ala Tyr
165 170 175
Trp Ala Arg Thr Val Leu Val Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Leu Lys
180 185 190
Pro Val Ala Arg Asn Arg Arg Gly Ile Leu Val Asp Glu Leu Phe Val
195 200 205
Pro Asp Val Leu Pro Thr Leu Gln Glu Ser Gly Asp Pro Ile Trp Arg
210 215 220
Arg Phe Phe Ser Ala Leu Asp Lys Val Leu His Lys Val Glu Pro Tyr
225 230 235 240
Trp Pro Lys Asn Met Arg Ala Lys Ala Ile His Ser Cys Val His Phe
245 250 255
Val Thr Glu Arg Leu Asn Gly Glu Asp Gly Leu Gly Ala Ile Tyr Pro
260 265 270
Ala Ile Ala Asn Ser Val Met Met Tyr Asp Ala Leu Gly Tyr Pro Glu
275 280 285
Asn His Pro Glu Arg Ala Ile Ala Arg Arg Ala Val Glu Lys Leu Met
290 295 300
Val Leu Asp Gly Thr Glu Asp Gln Gly Asp Lys Glu Val Tyr Cys Gln
305 310 315 320
Pro Cys Leu Ser Pro Ile Trp Asp Thr Ala Leu Val Ala His Ala Met
325 330 335
Leu Glu Val Gly Gly Asp Glu Ala Glu Lys Ser Ala Ile Ser Ala Leu
340 345 350
Ser Trp Leu Lys Pro Gln Gln Ile Leu Asp Val Lys Gly Asp Trp Ala
355 360 365
Trp Arg Arg Pro Asp Leu Arg Pro Gly Gly Trp Ala Phe Gln Tyr Arg
370 375 380
Asn Asp Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Thr Met Ala
385 390 395 400
Met Asp Arg Ala Ala Lys Leu Ser Asp Leu His Asp Asp Phe Glu Glu
405 410 415
Ser Lys Ala Arg Ala Met Glu Trp Thr Ile Gly Met Gln Ser Asp Asn
420 425 430
Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Ala Asn Asn Ser Tyr Thr Tyr Leu Asn
435 440 445
Asn Ile Pro Phe Ala Asp His Gly Ala Leu Leu Asp Pro Pro Thr Val
450 455 460
Asp Val Ser Ala Arg Cys Val Ser Met Met Ala Gln Ala Gly Ile Ser
465 470 475 480
Ile Thr Asp Pro Lys Met Lys Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Lys Glu
485 490 495
Gln Glu Glu Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Ile
500 505 510
Tyr Gly Thr Trp Ser Ala Leu Cys Ala Leu Asn Val Ala Ala Leu Pro
515 520 525
His Asp His Leu Ala Val Gln Lys Ala Val Ala Trp Leu Lys Thr Ile
530 535 540
Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asn Cys Asp Ser Tyr Ala Leu
545 550 555 560
Asp Tyr Ser Gly Tyr Glu Pro Met Asp Ser Thr Ala Ser Gln Thr Ala
565 570 575
Trp Ala Leu Leu Gly Leu Met Ala Val Gly Glu Ala Asn Ser Glu Ala
580 585 590
Val Thr Lys Gly Ile Asn Trp Leu Ala Gln Asn Gln Asp Glu Glu Gly
595 600 605
Leu Trp Lys Glu Asp Tyr Tyr Ser Gly Gly Gly Phe Pro Arg Val Phe
610 615 620
Tyr Leu Arg Tyr His Gly Tyr Ser Lys Tyr Phe Pro Leu Trp Ala Leu
625 630 635 640
Ala Arg Tyr Arg Asn Leu Lys Lys Ala Asn Gln Pro Ile Val His Tyr
645 650 655
Gly Met
<210> 13
<211> 684
<212> PRT
<213> Bradyrhizobium japonicum
<400> 13
Met Thr Val Thr Ser Ser Ala Ser Ala Arg Ala Thr Arg Asp Pro Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Gln Thr Ala Leu Gln Ser Thr Val Arg Ala Ala Ala Asp Trp
20 25 30
Leu Ile Ala Asn Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val Gly Arg Ala Glu
35 40 45
Ser Asn Ala Cys Met Glu Ala Gln Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Met
50 55 60
Gly Leu Glu Asp His Pro Leu Arg Lys Arg Leu Gly Gln Ser Leu Leu
65 70 75 80
Asp Ser Gln Arg Pro Asp Gly Ala Trp Gln Val Tyr Phe Gly Ala Pro
85 90 95
Asn Gly Asp Ile Asn Ala Thr Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser
100 105 110
Leu Gly Phe Arg Asp Asp Glu Pro Ala Val Arg Arg Ala Arg Glu Trp
115 120 125
Ile Glu Ala Lys Gly Gly Leu Arg Asn Ile Arg Val Phe Thr Arg Tyr
130 135 140
Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Glu Lys Thr Pro Asn Ile
145 150 155 160
Pro Pro Glu Val Ile Trp Phe Pro Leu Trp Phe Pro Phe Ser Ile Tyr
165 170 175
Asn Phe Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Leu Met Pro Ile Ala Val Leu
180 185 190
Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Pro Pro Glu Asn Arg Leu Asp
195 200 205
Ala Leu Phe Pro His Gly Arg Lys Ala Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val
210 215 220
Lys Ala Gly Ala Gly Gly Trp Asp Arg Phe Phe Arg Gly Ala Asp Lys
225 230 235 240
Val Leu His Lys Leu Gln Asn Leu Gly Asn Arg Leu Asn Leu Gly Leu
245 250 255
Phe Arg Pro Ala Ala Thr Ser Arg Val Leu Glu Trp Met Ile Arg His
260 265 270
Gln Asp Phe Asp Gly Ala Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Ile Tyr
275 280 285
Gly Leu Met Ala Leu Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Leu Asn His Pro Val
290 295 300
Leu Ala Lys Gly Leu Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Asp Ala Thr Tyr Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp
325 330 335
Thr Ile Leu Thr Leu Leu Ala Phe Asp Asp Ala Gly Val Leu Gly Asp
340 345 350
Tyr Pro Glu Ala Val Asp Lys Ala Val Asp Trp Val Leu Gln Arg Gln
355 360 365
Val Arg Val Pro Gly Asp Trp Ser Met Lys Leu Pro His Val Lys Pro
370 375 380
Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn Asn Tyr Tyr Pro Asp Thr Asp
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Leu Ala Pro Leu Arg His Asp Pro
405 410 415
Lys Trp Lys Ala Lys Gly Ile Asp Glu Ala Ile Gln Leu Gly Val Asp
420 425 430
Trp Leu Ile Gly Met Gln Ser Gln Gly Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp
435 440 445
Lys Asp Asn Asn Gln Lys Ile Leu Thr Lys Ile Pro Phe Cys Asp Tyr
450 455 460
Gly Glu Ala Leu Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His Ile Ile
465 470 475 480
Glu Ala Phe Gly Lys Leu Gly Ile Ser Arg Asn His Pro Ser Met Val
485 490 495
Gln Ala Leu Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Gln Glu Pro Ser Gly Pro Trp
500 505 510
Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Val Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu
515 520 525
Pro Ala Leu Ala Ala Ile Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr Ile Gly
530 535 540
Arg Ala Cys Asp Trp Leu Val Ala His Gln Gln Ala Asp Gly Gly Trp
545 550 555 560
Gly Glu Ser Cys Ala Ser Tyr Met Asp Val Ser Ala Val Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Thr Thr Ala Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Met Ala Leu Leu Ala
580 585 590
Ala Asn Arg Pro Gln Asp Lys Asp Ala Ile Glu Arg Gly Cys Met Trp
595 600 605
Leu Val Glu Arg Gln Ser Ala Gly Thr Trp Asp Glu Pro Glu Phe Thr
610 615 620
Gly Thr Gly Phe Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Thr Ile Lys Leu Asn
625 630 635 640
Asp Pro Ala Leu Ser Gln Arg Leu Met Gln Gly Pro Glu Leu Ser Arg
645 650 655
Ala Phe Met Leu Arg Tyr Gly Met Tyr Arg His Tyr Phe Pro Leu Met
660 665 670
Ala Leu Gly Arg Ala Leu Arg Pro Gln Ser His Ser
675 680
<210> 14
<211> 685
<212> PRT
<213> Gluconobacter morbifer
<400> 14
Met Ser Pro Ala Asp Ile Ser Thr Lys Ser Ser Ser Phe Gln Arg Leu
1 5 10 15
Asp Asn Met Leu Pro Glu Ala Val Ser Ser Ala Cys Asp Trp Leu Ile
20 25 30
Asp Gln Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val Gly Pro Val Glu Ser Asn
35 40 45
Ala Cys Met Glu Ala Gln Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Gln
50 55 60
Glu Asp His Pro Leu Arg Pro Arg Leu Ala Gln Ala Leu Leu Glu Met
65 70 75 80
Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Tyr Val Gly Ala Asp His Gly
85 90 95
Asp Ile Asn Thr Thr Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Met Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Met Pro Ile Met Ala Lys Ser Ala Ala Trp Ile Gln
115 120 125
Gln Lys Gly Gly Leu Arg Asn Val Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu
130 135 140
Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Asp Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro
145 150 155 160
Glu Ile Ile Trp Leu Pro Asp Asn Phe Ile Phe Ser Ile Tyr Asn Phe
165 170 175
Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Met Met Pro Leu Thr Ile Leu Ser Ala
180 185 190
Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Asn Arg Leu Asp Gly Leu
195 200 205
Phe Pro Glu Gly Arg Glu Asn Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val Lys Gly
210 215 220
Glu Glu Asp Leu Trp Gly Arg Phe Phe Arg Ala Ala Asp Lys Gly Leu
225 230 235 240
His Ser Leu Gln Ser Phe Pro Val Arg Arg Phe Val Pro Arg Glu Ala
245 250 255
Ala Ile Arg His Val Ile Glu Trp Ile Ile Arg His Gln Asp Ala Asp
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Ile Tyr Gly Leu Met Ala
275 280 285
Leu Ser Val Glu Gly Tyr Pro Leu His His Pro Val Leu Ala Lys Ala
290 295 300
Met Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg Arg Asp Lys Gly Asp Ala
305 310 315 320
Ser Trp Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala
325 330 335
Val Leu Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Glu Asp Arg Tyr Ser Pro Gln
340 345 350
Met Asp Lys Ala Ile Gly Trp Leu Leu Asp Arg Gln Val Arg Val Lys
355 360 365
Gly Asp Trp Ser Ile Lys Leu Pro Asp Thr Glu Pro Gly Gly Trp Ala
370 375 380
Phe Glu Tyr Ala Asn Asp Lys Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val
385 390 395 400
Ala Leu Ile Ala Leu Ala Gly Cys Arg His Arg Pro Glu Trp Arg Glu
405 410 415
Arg Asp Ile Glu Gly Ala Ile Ser Arg Gly Val Asn Trp Leu Leu Ala
420 425 430
Met Gln Ser Ser Ser Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn
435 440 445
Arg Ser Ile Leu Thr Lys Ile Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ala Leu
450 455 460
Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly
465 470 475 480
Leu Leu Gly Ile Ser Arg Asn His Pro Ser Val Gln Lys Ala Leu Ala
485 490 495
Tyr Ile Arg Ser Glu Gln Glu Arg Asn Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp
500 505 510
Gly Val Asn Tyr Val Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ile Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr Ile Val Arg Ala Cys Asp
530 535 540
Trp Leu Met Ser Val Gln Gln Glu Asn Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys
545 550 555 560
Ala Ser Tyr Met Asp Ile Asn Ala Val Gly His Gly Val Ala Thr Ala
565 570 575
Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ala Lys Arg Pro
580 585 590
Lys Asp Arg Glu Ala Ile Ala Arg Gly Cys Gln Phe Leu Ile Glu Arg
595 600 605
Gln Glu Asp Gly Ser Trp Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Gly Phe
610 615 620
Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Ala Ile Lys Leu Asp Asp Pro Ser Leu
625 630 635 640
Pro Asp Arg Leu Leu Gln Gly Ala Glu Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu
645 650 655
Arg Tyr Asp Leu Tyr Arg Gln Tyr Phe Pro Val Met Ala Leu Ser Arg
660 665 670
Ala Arg Arg Met Met Lys Glu Asp Ala Ser Ala Ala Ala
675 680 685
<210> 15
<211> 1896
<212> DNA
<213> Alicyclobacillus acidocaldarius
<400> 15
atggctgagc agttggtgga agcgccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggatgtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg cgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacatcccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacggc ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 16
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2
<400> 16
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacggc ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 17
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC №90C7
<400> 17
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Ala Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Ser His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 18
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC №115A7
<400> 18
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Thr Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Lys Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 19
<211> 642
<212> PRT
<213> Thermosynechococcus elongatus
<400> 19
Met Pro Thr Ser Leu Ala Thr Ala Ile Asp Pro Lys Gln Leu Gln Gln
1 5 10 15
Ala Ile Arg Ala Ser Gln Asp Phe Leu Phe Ser Gln Gln Tyr Ala Glu
20 25 30
Gly Tyr Trp Trp Ala Glu Leu Glu Ser Asn Val Thr Met Thr Ala Glu
35 40 45
Val Ile Leu Leu His Lys Ile Trp Gly Thr Glu Gln Arg Leu Pro Leu
50 55 60
Ala Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Arg Asn His Gln Arg Asp His Gly Gly
65 70 75 80
Trp Glu Leu Phe Tyr Gly Asp Gly Gly Asp Leu Ser Thr Ser Val Glu
85 90 95
Ala Tyr Met Gly Leu Arg Leu Leu Gly Val Pro Glu Thr Asp Pro Ala
100 105 110
Leu Val Lys Ala Arg Gln Phe Ile Leu Ala Arg Gly Gly Ile Ser Lys
115 120 125
Thr Arg Ile Phe Thr Lys Leu His Leu Ala Leu Ile Gly Cys Tyr Asp
130 135 140
Trp Arg Gly Ile Pro Ser Leu Pro Pro Trp Ile Met Leu Leu Pro Glu
145 150 155 160
Gly Ser Pro Phe Thr Ile Tyr Glu Met Ser Ser Trp Ala Arg Ser Ser
165 170 175
Thr Val Pro Leu Leu Ile Val Met Asp Arg Lys Pro Val Tyr Gly Met
180 185 190
Asp Pro Pro Ile Thr Leu Asp Glu Leu Tyr Ser Glu Gly Arg Ala Asn
195 200 205
Val Val Trp Glu Leu Pro Arg Gln Gly Asp Trp Arg Asp Val Phe Ile
210 215 220
Gly Leu Asp Arg Val Phe Lys Leu Phe Glu Thr Leu Asn Ile His Pro
225 230 235 240
Leu Arg Glu Gln Gly Leu Lys Ala Ala Glu Glu Trp Val Leu Glu Arg
245 250 255
Gln Glu Ala Ser Gly Asp Trp Gly Gly Ile Ile Pro Ala Met Leu Asn
260 265 270
Ser Leu Leu Ala Leu Arg Ala Leu Asp Tyr Ala Val Asp Asp Pro Ile
275 280 285
Val Gln Arg Gly Met Ala Ala Val Asp Arg Phe Ala Ile Glu Thr Glu
290 295 300
Thr Glu Tyr Arg Val Gln Pro Cys Val Ser Pro Val Trp Asp Thr Ala
305 310 315 320
Leu Val Met Arg Ala Met Val Asp Ser Gly Val Ala Pro Asp His Pro
325 330 335
Ala Leu Val Lys Ala Gly Glu Trp Leu Leu Ser Lys Gln Ile Leu Asp
340 345 350
Tyr Gly Asp Trp His Ile Lys Asn Lys Lys Gly Arg Pro Gly Gly Trp
355 360 365
Ala Phe Glu Phe Glu Asn Arg Phe Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala
370 375 380
Val Val Val Met Ala Leu His Ala Val Thr Leu Pro Asn Glu Asn Leu
385 390 395 400
Lys Arg Arg Ala Ile Glu Arg Ala Val Ala Trp Ile Ala Ser Met Gln
405 410 415
Cys Arg Pro Gly Gly Trp Ala Ala Phe Asp Val Asp Asn Asp Gln Asp
420 425 430
Trp Leu Asn Gly Ile Pro Tyr Gly Asp Leu Lys Ala Met Ile Asp Pro
435 440 445
Asn Thr Ala Asp Val Thr Ala Arg Val Leu Glu Met Val Gly Arg Cys
450 455 460
Gln Leu Ala Phe Asp Arg Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Arg Asn Glu Gln Glu Pro Glu Gly Cys Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val
485 490 495
Asn Tyr Leu Tyr Gly Thr Ser Gly Val Leu Thr Ala Leu Ser Leu Val
500 505 510
Ala Pro Arg Tyr Asp Arg Trp Arg Ile Arg Arg Ala Ala Glu Trp Leu
515 520 525
Met Gln Cys Gln Asn Ala Asp Gly Gly Trp Gly Glu Thr Cys Trp Ser
530 535 540
Tyr His Asp Pro Ser Leu Lys Gly Lys Gly Asp Ser Thr Ala Ser Gln
545 550 555 560
Thr Ala Trp Ala Ile Ile Gly Leu Leu Ala Ala Gly Asp Ala Thr Gly
565 570 575
Asp Tyr Ala Thr Glu Ala Ile Glu Arg Gly Ile Ala Tyr Leu Leu Glu
580 585 590
Thr Gln Arg Pro Asp Gly Thr Trp His Glu Asp Tyr Phe Thr Gly Thr
595 600 605
Gly Phe Pro Cys His Phe Tyr Leu Lys Tyr His Tyr Tyr Gln Gln His
610 615 620
Phe Pro Leu Thr Ala Leu Gly Arg Tyr Ala Arg Trp Arg Asn Leu Leu
625 630 635 640
Ala Thr
<210> 20
<211> 720
<212> PRT
<213> Acetobacter pasteurianus
<400> 20
Met Asn Met Ala Ser Arg Phe Ser Leu Lys Lys Ile Leu Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ser Asp Thr Gln Gly Thr Asn Val Asn Thr Leu Ile Gln Ser Gly Thr
20 25 30
Ser Asp Ile Val Arg Gln Lys Pro Ala Pro Gln Glu Pro Ala Asp Leu
35 40 45
Ser Ala Leu Lys Ala Met Gly Asn Ser Leu Thr His Thr Leu Ser Ser
50 55 60
Ala Cys Glu Trp Leu Met Lys Gln Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val
65 70 75 80
Gly Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Met Glu Ala Glu Trp Cys Leu Ala
85 90 95
Leu Trp Phe Leu Gly Leu Glu Asp His Pro Leu Arg Pro Arg Leu Gly
100 105 110
Lys Ala Leu Leu Glu Met Gln Arg Pro Asp Gly Ser Trp Gly Thr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Ala Gly Ser Gly Asp Ile Asn Ala Thr Val Glu Ser Tyr Ala
130 135 140
Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ala Glu Asp Asp Pro Ala Val Ser Lys
145 150 155 160
Ala Ala Ala Trp Ile Ile Ser Lys Gly Gly Leu Lys Asn Val Arg Val
165 170 175
Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Glu Lys
180 185 190
Thr Pro Asn Leu Pro Pro Glu Ile Ile Trp Phe Pro Asp Asn Phe Val
195 200 205
Phe Ser Ile Tyr Asn Phe Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Met Met Pro
210 215 220
Leu Ala Ile Leu Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Arg Pro Gln
225 230 235 240
Asp Arg Leu Asp Ala Leu Phe Pro Gly Gly Arg Ala Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Glu Leu Pro Thr Lys Glu Gly Arg Asp Val Ile Ala Asp Phe Phe Arg
260 265 270
Leu Ala Asp Lys Gly Leu His Trp Leu Gln Ser Ser Phe Leu Lys Arg
275 280 285
Ala Pro Ser Arg Glu Ala Ala Ile Lys Tyr Val Leu Glu Trp Ile Ile
290 295 300
Trp His Gln Asp Ala Asp Gly Gly Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp
305 310 315 320
Val Tyr Gly Leu Met Ala Leu His Gly Glu Gly Tyr Gln Phe His His
325 330 335
Pro Val Met Ala Lys Ala Leu Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg
340 345 350
His Asp Lys Gly Asp Ala Ser Trp Ile Gln Ala Thr Asn Ser Pro Val
355 360 365
Trp Asp Thr Met Leu Ser Leu Met Ala Leu His Asp Ala Asn Ala Glu
370 375 380
Glu Arg Phe Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Leu Asp Trp Leu Leu Ser
385 390 395 400
Arg Gln Val Arg Val Lys Gly Asp Trp Ser Val Lys Leu Pro Asn Thr
405 410 415
Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn Asp Arg Tyr Pro Asp
420 425 430
Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Ile Ala Ser Cys Arg Asn
435 440 445
Arg Pro Glu Trp Gln Ala Lys Gly Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Gly
450 455 460
Val Arg Trp Leu Val Ala Met Gln Ser Ser Cys Gly Gly Trp Gly Ala
465 470 475 480
Phe Asp Lys Asp Asn Asn Lys Ser Ile Leu Ala Lys Ile Pro Phe Cys
485 490 495
Asp Phe Gly Glu Ala Leu Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His
500 505 510
Val Leu Glu Ala Phe Gly Leu Leu Gly Leu Pro Arg Asp Leu Pro Cys
515 520 525
Ile Gln Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Arg Lys Glu Gln Asp Pro Thr Gly
530 535 540
Pro Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly Thr Gly Ala
545 550 555 560
Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Leu Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr
565 570 575
Ile Ser Lys Ala Cys Asp Trp Leu Ile Asn Cys Gln Gln Glu Asn Gly
580 585 590
Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ala Ser Tyr Met Glu Val Ser Ser Ile Gly
595 600 605
His Gly Ala Thr Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Met Gly Leu
610 615 620
Ile Ala Ala Asn Arg Pro Gln Asp Tyr Glu Ala Ile Ala Lys Gly Cys
625 630 635 640
Arg Tyr Leu Ile Asp Leu Gln Glu Glu Asp Gly Ser Trp Asn Glu Glu
645 650 655
Glu Phe Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Thr Ile
660 665 670
Lys Leu Asp Asp Pro Ala Ile Ser Lys Arg Leu Met Gln Gly Ala Glu
675 680 685
Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu Arg Tyr Asp Leu Tyr Arg Gln Leu Phe
690 695 700
Pro Ile Ile Ala Leu Ser Arg Ala Ser Arg Leu Ile Lys Leu Gly Asn
705 710 715 720
<210> 21
<211> 685
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант GmoSHC
<400> 21
Met Ser Pro Ala Asp Ile Ser Thr Lys Ser Ser Ser Phe Gln Arg Leu
1 5 10 15
Asp Asn Met Leu Pro Glu Ala Val Ser Ser Ala Cys Asp Trp Leu Ile
20 25 30
Asp Gln Gln Lys Pro Asp Gly His Trp Val Gly Pro Leu Glu Ser Asn
35 40 45
Ala Cys Met Glu Ala Glu Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Gln
50 55 60
Glu Asp His Pro Leu Arg Pro Arg Leu Ala Gln Ala Leu Leu Glu Met
65 70 75 80
Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Tyr Val Gly Ala Asp His Gly
85 90 95
Asp Ile Asn Thr Thr Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Met Gly
100 105 110
Tyr Ala Ala Asp Met Pro Ile Met Ala Lys Ser Ala Ala Trp Ile Gln
115 120 125
Gln Lys Gly Gly Leu Arg Asn Val Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu
130 135 140
Ala Leu Ile Gly Glu Trp Pro Trp Asp Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro
145 150 155 160
Glu Ile Ile Trp Leu Pro Asp Asn Phe Ile Phe Ser Ile Tyr Asn Phe
165 170 175
Ala Gln Trp Ala Arg Ala Thr Ile Met Pro Leu Thr Ile Leu Ser Ala
180 185 190
Arg Arg Pro Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Asn Arg Leu Asp Gly Leu
195 200 205
Phe Pro Glu Gly Arg Glu Asn Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Val Lys Gly
210 215 220
Glu Glu Asp Leu Trp Gly Arg Phe Phe Arg Ala Ala Asp Lys Gly Leu
225 230 235 240
His Ser Leu Gln Ser Phe Pro Val Arg Arg Phe Val Pro Arg Glu Ala
245 250 255
Ala Ile Arg His Val Ile Glu Trp Ile Ile Arg His Gln Asp Ala Asp
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Ile Tyr Gly Leu Met Ala
275 280 285
Leu Ser Val Glu Gly Tyr Pro Leu His His Pro Val Leu Ala Lys Ala
290 295 300
Met Asp Ala Leu Asn Asp Pro Gly Trp Arg Arg Asp Lys Gly Asp Ala
305 310 315 320
Ser Trp Ile Gln Ala Ser Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala
325 330 335
Val Leu Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Glu Asp Arg Tyr Ser Pro Gln
340 345 350
Met Asp Lys Ala Ile Gly Trp Leu Leu Asp Arg Gln Val Arg Val Lys
355 360 365
Gly Asp Trp Ser Ile Lys Leu Pro Asp Thr Glu Pro Gly Gly Trp Ala
370 375 380
Phe Glu Tyr Ala Asn Asp Lys Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val
385 390 395 400
Ala Leu Ile Ala Leu Ala Gly Cys Arg His Arg Pro Glu Trp Arg Glu
405 410 415
Arg Asp Ile Glu Gly Ala Ile Ser Arg Gly Val Asn Trp Leu Leu Ala
420 425 430
Met Gln Ser Ser Ser Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn
435 440 445
Arg Ser Ile Leu Thr Lys Ile Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ala Leu
450 455 460
Asp Pro Pro Ser Val Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly
465 470 475 480
Leu Leu Gly Ile Ser Arg Asn His Pro Ser Val Gln Lys Ala Leu Ala
485 490 495
Tyr Ile Arg Ser Glu Gln Glu Arg Asn Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp
500 505 510
Gly Val Asn Tyr Val Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ile Gly Glu Asp Met Thr Gln Pro Tyr Ile Val Arg Ala Cys Asp
530 535 540
Trp Leu Met Ser Val Gln Gln Glu Asn Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys
545 550 555 560
Ala Ser Tyr Met Asp Ile Asn Ala Val Gly His Gly Val Ala Thr Ala
565 570 575
Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ala Lys Arg Pro
580 585 590
Lys Asp Arg Glu Ala Ile Ala Arg Gly Cys Gln Phe Leu Ile Glu Arg
595 600 605
Gln Glu Asp Gly Ser Trp Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Gly Tyr
610 615 620
Pro Gly Tyr Gly Val Gly Gln Ala Ile Lys Leu Asp Asp Pro Ser Leu
625 630 635 640
Pro Asp Arg Leu Leu Gln Gly Ala Glu Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu
645 650 655
Arg Tyr Asp Leu Tyr Arg Gln Tyr Phe Pro Val Met Ala Leu Ser Arg
660 665 670
Ala Arg Arg Met Met Lys Glu Asp Ala Ser Ala Ala Ala
675 680 685
<210> 22
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC №90C7
<400> 22
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacgcg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cgggcgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacat gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacggc ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtacagcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 23
<211> 1896
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC №115A7
<400> 23
atggctgagc agttggtgga agctccggcc tacgcgcgga cgctggatcg cgcggtggag 60
tatctcctct cctgccaaaa ggacgaaggc tactggtggg ggccgcttct gagcaacgtc 120
acgatggaag cggagtacgt cctcttgtgc cacattctcg atcgcgtcga tcgggatcgc 180
atggagaaga tccggcggta cctgttgcac gagcagcgcg aggacggcac gtgggccctg 240
tacccgggtg ggccgccgga cctcgacacg accatcgagg cgtacgtcgc gctcaagtat 300
atcggcatgt cgcgcgacga ggagccgatg cagaaggcgc tccggttcat tcagagccag 360
ggcgggatcg agtcgtcgcg cgtgttcacg cggaggtggc tggcgctggt gggagaatat 420
ccgtgggaga aggtgcccat ggtcccgccg gagatcatgt tcctcggcaa gcgcatgccg 480
ctcaacatct acgagtttgg ctcgtgggct cggacgaccg tcgtggcgct ctcgattgtg 540
atgagccgcc agccggtgtt cccgctgccc gagcgggcgc gcgtgcccga gctgtacgag 600
accgacgtgc ctccgcgccg gcgcggtgcc aagggagggg gtgggtggat cttcgacgcg 660
ctcgaccggg tgctgcacgg gtatcagaag ctgtcggtgc acccgttccg ccgcgcggcc 720
gagatccgcg ccttggactg gttgctcgag cgccaggccg gagacggcag ctggggcggg 780
attcagccgc cttggtttta cgcgctcatc gcgctcaaga ttctcgacaa gacgcagcat 840
ccggcgttca tcaagggctg ggaaggtcta gagctgtacg gcgtggagct ggattacgga 900
ggatggatgt ttcaggcttc catctcgccg gtgtgggaca cgggcctcgc cgtgctcgcg 960
ctgcgcgctg cggggcttcc ggccgatcac gaccgcttgg tcaaggcggg cgagtggctg 1020
ttggaccggc agatcacggt tccgggcgac tgggcggtga agcgcccgaa cctcaagccg 1080
ggcgggttcg cgttccagtt cgacaacgtg tactacccgg acgtggacga cacggccgtc 1140
gtggtgtggg cgctcaacac cctgcgcttg ccggacgagc gccgcaggcg ggacgccatg 1200
acgaagggat tccgctggat tgtcggcatg cagagctcga acggcggttg gggcgcctac 1260
gacgtcgaca acacgagcga tctcccgaac cacaccccgt tctgcgactt cggcgaagtg 1320
accgatccgc cgtcagagga cgtcaccgcc cacgtgctcg agtgtttcgg cagcttcggg 1380
tacgatgacg cctggaaggt catccggcgc gcggtggaat atctcaagcg ggagcagaag 1440
ccggacggca gctggttcgg tcgttggggc gtcaattacc tctacggcac gggcgcggtg 1500
gtgtcggcgc tgaaggcggt cgggatcgac acgcgcgagc cgtacattca aaaggcgctc 1560
gactgggtcg agcagcatca gaacccggac ggcggctggg gcgaggactg ccgctcgtac 1620
gaggatccgg cgtacgcggg taagggcgcg agcaccccgt cgcagacggc ctgggcgctg 1680
atggcgctca tcgcgggcgg cagggcggag tccgaggccg cgcgccgcgg cgtgcaatac 1740
ctcgtggaga cgcagcgccc ggacggcggc tgggatgagc cgtactacac cggcacgggc 1800
ttcccagggg atttctacct cggctacacc atgtaccgcc acgtgtttcc gacgctcgcg 1860
ctcggccgct acaagcaagc catcgagcgc aggtga 1896
<210> 24
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2 + мутация L37Q
<400> 24
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Gln Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 25
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2 + мутация V174I
<400> 25
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Ile Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 26
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2 + мутации V174I + F601Y
<400> 26
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Leu Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Ile Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Tyr Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 27
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Вариант фермента SHC/HAC 215G2 + мутации L37Q + V174I + F601Y
<400> 27
Met Ala Glu Gln Leu Val Glu Ala Pro Ala Tyr Ala Arg Thr Leu Asp
1 5 10 15
Arg Ala Val Glu Tyr Leu Leu Ser Cys Gln Lys Asp Glu Gly Tyr Trp
20 25 30
Trp Gly Pro Leu Gln Ser Asn Val Thr Met Glu Ala Glu Tyr Val Leu
35 40 45
Leu Cys His Ile Leu Asp Arg Val Asp Arg Asp Arg Met Glu Lys Ile
50 55 60
Arg Arg Tyr Leu Leu His Glu Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Pro Gly Gly Pro Pro Asp Leu Asp Thr Thr Ile Glu Ala Tyr Val
85 90 95
Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Glu Pro Met Gln Lys
100 105 110
Ala Leu Arg Phe Ile Gln Ser Gln Gly Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val
115 120 125
Phe Thr Arg Arg Trp Leu Ala Leu Val Gly Glu Tyr Pro Trp Glu Lys
130 135 140
Val Pro Met Val Pro Pro Glu Ile Met Phe Leu Gly Lys Arg Met Pro
145 150 155 160
Leu Asn Ile Tyr Glu Phe Gly Ser Trp Ala Arg Ala Thr Ile Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ile Val Met Ser Arg Gln Pro Val Phe Pro Leu Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Arg Val Pro Glu Leu Tyr Glu Thr Asp Val Pro Pro Arg Arg Arg
195 200 205
Gly Ala Lys Gly Gly Gly Gly Trp Ile Phe Asp Ala Leu Asp Arg Val
210 215 220
Leu His Gly Tyr Gln Lys Leu Ser Val His Pro Phe Arg Arg Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Arg Ala Leu Asp Trp Leu Leu Glu Arg Gln Ala Gly Asp Gly
245 250 255
Ser Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Trp Phe Tyr Ala Leu Ile Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Leu Asp Met Thr Gln His Pro Ala Phe Ile Lys Gly Trp Glu
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Tyr Gly Val Glu Leu Asp Tyr Gly Gly Trp Met Phe
290 295 300
Gln Ala Ser Ile Ser Pro Val Trp Asp Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala
305 310 315 320
Leu Arg Ala Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Asp Arg Leu Val Lys Ala
325 330 335
Gly Glu Trp Leu Leu Asp Arg Gln Ile Thr Val Pro Gly Asp Trp Ala
340 345 350
Val Lys Arg Pro Asn Leu Lys Pro Gly Gly Phe Ala Phe Gln Phe Asp
355 360 365
Asn Val Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val Val Val Trp Ala
370 375 380
Leu Asn Thr Leu Arg Leu Pro Asp Glu Arg Arg Arg Arg Asp Ala Met
385 390 395 400
Thr Lys Gly Phe Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Ser Asn Gly Gly
405 410 415
Trp Gly Ala Tyr Asp Val Asp Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn His Thr
420 425 430
Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Thr Asp Pro Pro Ser Glu Asp Val
435 440 445
Thr Ala His Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Phe Gly Tyr Asp Asp Ala
450 455 460
Trp Lys Val Ile Arg Arg Ala Val Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Gln Lys
465 470 475 480
Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Leu Tyr Gly
485 490 495
Thr Gly Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Ala Val Gly Ile Asp Thr Arg
500 505 510
Glu Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Leu Asp Trp Val Glu Gln His Gln Asn
515 520 525
Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Cys Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ala
530 535 540
Tyr Ala Gly Lys Gly Ala Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu
545 550 555 560
Met Ala Leu Ile Ala Gly Gly Arg Ala Glu Ser Glu Ala Ala Arg Arg
565 570 575
Gly Val Gln Tyr Leu Val Glu Thr Gln Arg Pro Asp Gly Gly Trp Asp
580 585 590
Glu Pro Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Tyr Pro Gly Asp Phe Tyr Leu Gly
595 600 605
Tyr Thr Met Tyr Arg His Val Phe Pro Thr Leu Ala Leu Gly Arg Tyr
610 615 620
Lys Gln Ala Ile Glu Arg Arg
625 630
<210> 28
<211> 625
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Bacillus megaterium
<400> 28
Met Ile Ile Leu Leu Lys Glu Val Gln Leu Glu Ile Gln Arg Arg Ile
1 5 10 15
Ala Tyr Leu Arg Pro Thr Gln Lys Asn Asp Gly Ser Phe Arg Tyr Cys
20 25 30
Phe Glu Thr Gly Val Met Pro Asp Ala Phe Leu Ile Met Leu Leu Arg
35 40 45
Thr Phe Asp Leu Asp Lys Glu Val Leu Ile Lys Gln Leu Thr Glu Arg
50 55 60
Ile Val Ser Leu Gln Asn Glu Asp Gly Leu Trp Thr Leu Phe Asp Asp
65 70 75 80
Glu Glu His Asn Leu Ser Ala Thr Ile Gln Ala Tyr Thr Ala Leu Leu
85 90 95
Tyr Ser Gly Tyr Tyr Gln Lys Asn Asp Arg Ile Leu Arg Lys Ala Glu
100 105 110
Arg Tyr Ile Ile Asp Ser Gly Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Leu Thr
115 120 125
Arg Trp Met Leu Ser Val Asn Gly Leu Tyr Glu Trp Pro Lys Leu Phe
130 135 140
Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Leu Leu Val Pro Thr Tyr Val Pro Leu Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Glu Leu Ser Thr Tyr Ala Arg Ile His Phe Val Pro Met Met
165 170 175
Val Ala Gly Asn Lys Lys Phe Ser Leu Thr Ser Arg His Thr Pro Ser
180 185 190
Leu Ser His Leu Asp Val Arg Glu Gln Lys Gln Glu Ser Glu Glu Thr
195 200 205
Thr Gln Glu Ser Arg Ala Ser Ile Phe Leu Val Asp His Leu Lys Gln
210 215 220
Leu Ala Ser Leu Pro Ser Tyr Ile His Lys Leu Gly Tyr Gln Ala Ala
225 230 235 240
Glu Arg Tyr Met Leu Glu Arg Ile Glu Lys Asp Gly Thr Leu Tyr Ser
245 250 255
Tyr Ala Thr Ser Thr Phe Phe Met Ile Tyr Gly Leu Leu Ala Leu Gly
260 265 270
Tyr Lys Lys Asp Ser Phe Val Ile Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile Cys
275 280 285
Ser Leu Leu Ser Thr Cys Ser Gly His Val His Val Glu Asn Ser Thr
290 295 300
Ser Thr Val Trp Asp Thr Ala Leu Leu Ser Tyr Ala Leu Gln Glu Ala
305 310 315 320
Gly Val Pro Gln Gln Asp Pro Met Ile Lys Gly Thr Thr Arg Tyr Leu
325 330 335
Lys Lys Arg Gln His Thr Lys Leu Gly Asp Trp Gln Phe His Asn Pro
340 345 350
Asn Thr Ala Pro Gly Gly Trp Gly Phe Ser Asp Ile Asn Thr Asn Asn
355 360 365
Pro Asp Leu Asp Asp Thr Ser Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ser Arg Arg
370 375 380
Ala Gln Thr Asp Thr Asp Tyr Leu Glu Ser Trp Gln Arg Gly Ile Asn
385 390 395 400
Trp Leu Leu Ser Met Gln Asn Lys Asp Gly Gly Phe Ala Ala Phe Glu
405 410 415
Lys Asn Thr Asp Ser Ile Leu Phe Thr Tyr Leu Pro Leu Glu Asn Ala
420 425 430
Lys Asp Ala Ala Thr Asp Pro Ala Thr Ala Asp Leu Thr Gly Arg Val
435 440 445
Leu Glu Cys Leu Gly Asn Phe Ala Gly Met Asn Lys Ser His Pro Ser
450 455 460
Ile Lys Ala Ala Val Lys Trp Leu Phe Asp His Gln Leu Asp Asn Gly
465 470 475 480
Ser Trp Tyr Gly Arg Trp Gly Val Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Trp Ala
485 490 495
Ala Ile Thr Gly Leu Arg Ala Val Gly Val Ser Ala Ser Asp Pro Arg
500 505 510
Ile Ile Lys Ala Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ile Gln Gln Glu Asp Gly
515 520 525
Gly Phe Gly Glu Ser Cys Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Val Pro
530 535 540
Leu Ser Phe Ser Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala Leu Asp Ala Leu
545 550 555 560
Met Thr Ile Cys Pro Leu Lys Asp Gln Ser Val Glu Lys Gly Ile Lys
565 570 575
Phe Leu Leu Asn Pro Asn Leu Thr Glu Gln Gln Thr His Tyr Pro Thr
580 585 590
Gly Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Tyr Ile Gln Tyr His Ser Tyr Asn
595 600 605
Asp Ile Phe Pro Leu Leu Ala Leu Ala His Tyr Ala Lys Lys His Ser
610 615 620
Ser
625
<210> 29
<211> 691
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Streptomyces albolongus
<400> 29
Val Thr Ala Thr Ala Asp Gly Arg Leu Asp Pro Glu Tyr Asp Pro Glu
1 5 10 15
Pro Ala Ala Val Gly Glu Arg Pro Pro Val Thr Asp Arg Leu Thr Gly
20 25 30
Arg Gln Thr Thr Val Ala Thr Ala Pro Ala Pro Gly Ala Gly Arg Arg
35 40 45
Gln Ala Glu Gly Pro Glu Arg Ser Gly Pro Leu Asp Pro Ala Gln Ala
50 55 60
Leu Ala Arg Ala Thr Ala Glu Leu Leu Ser Arg Gln Ser Pro Asp Gly
65 70 75 80
Trp Trp Lys Gly Asp Leu Glu Thr Asn Val Thr Met Asp Ala Glu Asp
85 90 95
Leu Leu Leu Arg Gln Phe Leu Gly Ile Arg Glu Pro Glu Gln Thr Ala
100 105 110
Ala Thr Ala Ala Trp Ile Arg Ser Gln Gln Arg Glu Asp Gly Thr Trp
115 120 125
Ser Thr Phe Tyr Gly Gly Pro Pro Glu Leu Ser Thr Thr Val Glu Ala
130 135 140
Tyr Val Ala Leu Lys Leu Ala Gly Asp Asp Pro Gly Ala Pro His Met
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Arg Tyr Val Arg Glu Arg Gly Gly Ile Ala Ala Ser
165 170 175
Arg Val Phe Thr Arg Ile Trp Leu Ala Leu Phe Gly Trp Trp Pro Trp
180 185 190
Glu Arg Leu Pro Glu Met Pro Pro Glu Ile Ile Phe Leu Pro Arg Trp
195 200 205
Leu Pro Leu Asn Ile Tyr Ala Phe Gly Cys Trp Ala Arg Gln Thr Ile
210 215 220
Val Pro Leu Thr Val Val Ser Ala His Arg Pro Val Arg Pro Ala Pro
225 230 235 240
Phe Asp Leu Thr Glu Leu His Thr Asp Pro Ala Asp Pro Tyr Pro Leu
245 250 255
Arg Pro Leu Ala Pro Pro Thr Gly Trp Asp Gly Val Phe Glu Arg Leu
260 265 270
Asp Leu Val Leu His Ala Tyr His Lys Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg
275 280 285
Arg Ala Ala Leu Ala Gln Ala Gly Arg Trp Ile Val Glu Arg Gln Glu
290 295 300
Ala Asp Gly Cys Trp Gly Gly Ile Gln Pro Pro Ala Val Tyr Ser Leu
305 310 315 320
Ile Ala Leu His Leu Leu Gly Tyr Asp Leu Glu His Pro Val Met Arg
325 330 335
Ala Gly Leu Ala Ala Phe Asp Arg Phe Thr Val His Thr Glu Asp Gly
340 345 350
Arg Arg Trp Leu Glu Ala Cys Gln Ser Pro Val Trp Asp Thr Cys Leu
355 360 365
Ala Thr Ile Ala Leu Arg Asp Ala Gly Leu Pro Ala Asp His Pro Ala
370 375 380
Leu Val Ser Ala Ala Asp Trp Met Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Pro
385 390 395 400
Gly Asp Trp Ser Val Gln Arg Pro Arg Leu Ala Pro Gly Gly Trp Ala
405 410 415
Phe Glu Phe Glu Asn Asp Asn Tyr Pro Asp Ile Asp Asp Thr Ala Glu
420 425 430
Val Val Leu Ala Leu Lys Arg Val Ala His Pro Asp Arg Ala Arg Ile
435 440 445
Asp Gly Ala Val Arg Arg Gly Val Glu Trp Asn Leu Gly Met Gln Ser
450 455 460
Arg Asn Gly Ala Trp Gly Ala Phe Asp Val Asp Asn Thr Ser Thr Leu
465 470 475 480
Pro Asn Lys Leu Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Val Val Asp Pro Pro
485 490 495
Ser Ala Asp Val Thr Ala His Val Val Glu Met Leu Ala Glu Thr Gly
500 505 510
Leu Ala Gly Asp Arg Arg Thr Arg Arg Gly Ile Asp Trp Leu Leu Lys
515 520 525
Asn Gln Glu Pro Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Thr Asn Tyr
530 535 540
Ile Tyr Gly Thr Gly Ser Val Leu Pro Ala Leu Val Ala Ala Gly Ile
545 550 555 560
Pro Gly Ser His Pro Ala Val Arg Arg Ala Val Asp Trp Leu Ala Asp
565 570 575
Arg Gln Asn Pro Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Met Arg Ser Tyr Glu
580 585 590
Asp Pro Val Arg Trp Ser Gly Arg Gly Asp Ser Thr Ala Ser Gln Thr
595 600 605
Ala Trp Ala Leu Met Ala Leu Leu Ala Ala Gly Glu Gly Pro Asp Gly
610 615 620
Ala Arg Ser Glu Val Val Glu Arg Gly Val Gln Trp Leu Cys Arg Thr
625 630 635 640
Gln Leu Pro Ser Gly Ser Trp Asp Glu Pro Gln Phe Thr Gly Thr Gly
645 650 655
Phe Pro Trp Asp Phe Ser Ile Asn Tyr His Leu Tyr Arg Leu Val Phe
660 665 670
Pro Val Thr Ala Leu Gly Arg Tyr Leu His Gly Ser Pro Leu Thr Gly
675 680 685
Gly Gly Ala
690
<210> 30
<211> 656
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Acetobacter pasteurianus
<400> 30
Met Ala Ala Asp Gly Ser Ala Leu Ser Glu Ser Arg Leu Ser Ser Glu
1 5 10 15
Ala Leu Asp Arg Ala Val Leu Ser Ala His Thr Ala Leu Ser Gln Ala
20 25 30
Gln Gln Asp Asp Gly His Trp Val Tyr Glu Leu Glu Ala Asp Ala Thr
35 40 45
Ile Pro Ala Glu Tyr Ile Leu Leu Glu His Phe Met Asp Arg Ile Asp
50 55 60
Asp Ala Leu Glu Gln Lys Ile Ala Ile Tyr Leu Arg Arg Ile Gln Ser
65 70 75 80
Glu Glu His Gly Gly Trp Pro Leu Tyr His Asn Gly Lys Phe Asp Leu
85 90 95
Ser Ala Thr Val Lys Ala Tyr Phe Ala Leu Lys Ala Val Gly Asp Asp
100 105 110
Ile Asn Ala Pro His Met Gln Arg Ala Arg Glu Ala Ile Leu Asp His
115 120 125
Gly Gly Ala Glu Arg Ser Asn Val Phe Thr Arg Ser Gln Leu Ala Leu
130 135 140
Phe Gly Glu Val Pro Trp Arg Ala Thr Pro Val Met Pro Val Glu Leu
145 150 155 160
Met Leu Leu Pro Ala Lys Ala Phe Phe Ser Val Trp Asn Met Ser Tyr
165 170 175
Trp Ser Arg Thr Val Ile Ala Pro Leu Leu Val Leu Ala Ala Leu Arg
180 185 190
Pro Val Ala Ala Asn Pro Arg Gln Val His Val Arg Glu Leu Phe Val
195 200 205
Thr Pro Pro Glu Lys Val Gln Asp Trp Ile Arg Gly Pro Tyr Arg Ser
210 215 220
Ala Trp Gly Tyr Val Phe Lys Gly Leu Asp Ser Val Leu Arg Pro Val
225 230 235 240
Val Pro Phe Ile Pro Glu Lys Thr His Lys Lys Ala Ile Gln Ala Ala
245 250 255
Leu Asp Phe Ile Glu Pro Arg Leu Asn Gly Lys Asp Gly Leu Gly Ala
260 265 270
Ile Tyr Pro Ala Met Ala Asn Val Val Met Met Tyr Arg Ala Met Gly
275 280 285
Val Pro Asp Glu Asp Pro Arg Ala Lys Thr Ala Trp Glu Ala Val Gln
290 295 300
Ala Leu Ile Val Glu Lys Asp Asp Glu Ala Tyr Cys Gln Pro Cys Val
305 310 315 320
Ser Pro Ile Trp Asp Thr Gly Leu Ser Gly His Ala Met Ile Glu Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Pro Asn Gly Ile Ala Pro Glu Lys Thr Val Ala Glu Leu
340 345 350
Lys Lys Ala Ser Ala Trp Leu Arg Ser Lys Gln Ile Leu Asn Val Lys
355 360 365
Gly Asp Trp Ala Val Arg Asn Pro Asn Leu Ala Pro Gly Gly Trp Ala
370 375 380
Phe Gln Tyr Gly Asn Asp Tyr Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Val
385 390 395 400
Val Gly Met Leu Leu His Arg Glu Gly Asp Pro Thr Asn Ala Glu Ala
405 410 415
Ile Glu Arg Ala Arg Thr Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Thr Asp Gly
420 425 430
Gly Trp Gly Ala Phe Asp Ile Asp Asn Asn Lys Asp Val Leu Asn His
435 440 445
Ile Pro Phe Ala Asp His Gly Ala Leu Leu Asp Pro Pro Thr Ala Asp
450 455 460
Val Thr Ala Arg Cys Ile Ser Phe Leu Ala Gln Leu Arg Asn Pro Glu
465 470 475 480
Asp Glu Pro Val Ile Gln Arg Gly Leu Glu Tyr Leu Arg Lys Glu Gln
485 490 495
Glu Lys Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Thr Asn Tyr Ile Tyr
500 505 510
Gly Thr Trp Ser Ala Leu Cys Ala Leu Asn Ala Ala Gly Val Ser His
515 520 525
Asp Asp Pro Ala Val Val Lys Ala Val Glu Trp Leu Arg Ser Val Gln
530 535 540
Arg Ala Asp Gly Gly Trp Gly Glu Gly Cys Glu Ser Tyr Glu Gly Gly
545 550 555 560
Pro His Gly Thr Tyr Gly Glu Ser Leu Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ala
565 570 575
Val Leu Gly Leu Met Ala Ala Gly Arg Arg Asp Asp Pro Ala Val Thr
580 585 590
Arg Gly Ile Ala Trp Leu Ala Asp Gln Gln Asp Ala Asn Gly Glu Trp
595 600 605
His Glu Asp Pro Tyr Asn Ala Val Gly Phe Pro Lys Val Phe Tyr Leu
610 615 620
Arg Tyr His Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Pro Leu Met Ala Leu Ala Arg
625 630 635 640
Tyr Arg Asn Leu Glu Ser Ser Asn Thr Arg Arg Val Ser Phe Gly Phe
645 650 655
<---
Claims (59)
1. Способ получения (-)-амброкса в изомерно чистой форме формулы (I)
или в смеси с одной или более следующих молекул формул (II), (III) и/или (IV),
включающий ферментативное превращение (3E, 7E)-гомофарнезола (ЕЕН) или смеси изомеров гомофарнезола, содержащей ЕЕН, в (-)-амброкс в изомерно чистой форме формулы (I) или в смеси с одной или более указанных молекул формул (II), (III) и/или (IV), с использованием варианта фермента SHC(сквален-гопен-циклаза)/НАС(гомофарнезол-амброкс-циклаза),
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1,
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1,
где одна или более аминокислотных модификаций в положениях 81, 431, 557 или 613 представляют собой замены, предпочтительно неконсервативные замены,
где аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на основную аминокислоту, предпочтительно гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на гидрофобную аминокислоту, предпочтительно лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно серин.
2. Способ получения оксида амбры в изомерно чистой форме формулы (X)
или в смеси с одной или более чем одной из следующих молекул формул (XI), (XII) и/или (XIII)
включающий ферментативное превращение (Е,E)-бисгомофарнезола (BisEEH) или смеси изомеров бисгомофарнезола, содержащей BisEEH, в оксид амбры в изомерно чистой форме формулы (X) или в смеси с одной или более чем одной из указанных молекул формулы (XI), (XII) и/или (XIII), с использованием варианта фермента SHC/HAC,
где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1,
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно, и
где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1,
где одна или более аминокислотных модификаций в положениях 81, 431, 557 или 613 представляют собой замены, предпочтительно неконсервативные замены,
где аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на основную аминокислоту, предпочтительно гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на гидрофобную аминокислоту, предпочтительно лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно серин.
3. Способ по п. 1 или 2, где вариант фермента SHC/HAC имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
5. Способ по любому из пп. 1-3, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
6. Способ по п. 4 или 5, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет дополнительную аминокислотную модификацию относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
7. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4-6, где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 2 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 132, 224, 432, 557 и 431: M132R, A224V, I432T, A557T и H431L;
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 132, 224, 432, 557 и 613: M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S;
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 4 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 81, 132, 224, 432, 557 и 613: Y81H, M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S; или
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 5 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 81, 132, 224, 432, 557 и 431: Y81H, M132R, A224V, I432T, А557Т и H431L, и где положения 81, 132, 224, 431, 432, 557, 613 соответствуют положениям SEQ ID NO: 1.
8. Способ по п. 7, где вариант фермента SHC/HAC имеет следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, предпочтительно SEQ ID NO: 3.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где ферментативное превращение происходит при температуре в диапазоне от 30°С до 50°С, например от 40°С до 50°С, и/или при рН в диапазоне от 5 до 6.
10. Способ по любому из пп. 1-9, который включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, которая продуцирует указанный вариант фермента SHC/HAC.
11. Способ по п. 10, где рекомбинантные клетки-хозяева содержат последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
12. Способ по любому из пп. 1 или 3-11, где (-)-амброкс получают в смеси с по меньшей мере одной из молекул формул (II), (III) и (IV)
13. Способ по любому из пп. 1-12, где вариант фермента SHC/HAC имеет повышенную ферментативную активность относительно SEQ ID NO: 1 или где вариант фермента SHC/HAC обеспечивает повышенную скорость превращения ЕЕН в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов реакции по сравнению с SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 10.
14. Вариант фермента SHC/HAC, который сохраняет активность SHC/HAC, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1,
где аминокислотная последовательность указанного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 132, 224 и 432 в SEQ ID NO: 1, которые представляют собой M132R, A224V и I432T соответственно, и
где аминокислотная последовательность указанного варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере в одном положении, соответствующем положению 81, 431 или 613 в SEQ ID NO: 1;
где одна или более аминокислотных модификаций в положениях 81, 431, 557 или 613 представляют собой замены, предпочтительно неконсервативные замены,
где аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 557 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно треонин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на основную аминокислоту, предпочтительно гистидин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 431 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на гидрофобную аминокислоту, предпочтительно лейцин; и/или
аминокислотная модификация в положении, соответствующем положению 613 в SEQ ID NO: 1, заменяет данную аминокислоту в SEQ ID NO: 1 на нейтральную гидрофильную аминокислоту, предпочтительно серин.
15. Вариант фермента SHC/HAC по п. 14, который имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 1.
16. Вариант фермента SHC/HAC по п. 14 или 15, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 557 и 431 в SEQ ID NO: 1.
17. Вариант фермента SHC/HAC по любому из пп. 14 или 15, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет аминокислотные модификации относительно SEQ ID NO: 1 в положениях, соответствующих положениям 557 и 613 в SEQ ID NO: 1.
18. Вариант фермента SHC/HAC по п. 16 или 17, где аминокислотная последовательность варианта фермента SHC/HAC имеет дополнительную аминокислотную модификацию относительно SEQ ID NO: 1 в положении, соответствующем положению 81 в SEQ ID NO: 1.
19. Вариант фермента SHC/HAC по любому из пп. 14 или 16-18, где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 2 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 132, 224, 432, 557 и 431: M132R, A224V, I432T, А557Т и H431L;
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 3 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 132, 224, 432, 557 и 613: M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S;
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 4 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 81, 132, 224, 432, 557 и 613: Y81H, M132R, A224V, I432T, А557Т и R613S; или
где вариант фермента имеет по меньшей мере 90,0%-ную идентичность с SEQ ID NO: 5 и имеет следующие аминокислотные модификации в положениях 81, 132, 224, 432, 557 и 431: Y81H, M132R, A224V, I432T, А557Т и H431L, и где положения 81, 132, 224, 431, 432, 557, 613 соответствуют положениям SEQ ID NO: 1.
20. Вариант фермента SHC/HAC по п. 19, который имеет следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, предпочтительно SEQ ID NO: 3.
21. Вариант фермента SHC/HAC по любому из пп. 14-20, который имеет повышенную ферментативную активность относительно SEQ ID NO: 1 или обеспечивает повышенную скорость превращения ЕЕН в течение первых 6 часов, или в течение первых 8 часов, или в течение первых 12 часов реакции по сравнению с SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 10.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1917688.2 | 2019-12-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2024127556A Division RU2024127556A (ru) | 2019-12-04 | 2020-12-03 | Варианты скваленгопенциклазы (SHC) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2829857C1 RU2829857C1 (ru) | 2024-11-07 |
| RU2829857C9 true RU2829857C9 (ru) | 2024-12-23 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139719A2 (de) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Basf Se | Biokatalytische herstellung von ambroxan |
| WO2016170099A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Givaudan Sa | Enzymes and applications thereof |
| WO2018157021A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | International Flavors & Fragrances Inc. | Squalene hopene cyclase and use thereof for producing ambroxan |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010139719A2 (de) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Basf Se | Biokatalytische herstellung von ambroxan |
| WO2016170099A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Givaudan Sa | Enzymes and applications thereof |
| RU2017134449A (ru) * | 2015-04-24 | 2019-05-24 | Живодан Са | Ферменты и их применение |
| WO2018157021A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | International Flavors & Fragrances Inc. | Squalene hopene cyclase and use thereof for producing ambroxan |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7603041B2 (ja) | 酵素およびその適用 | |
| US20230175027A1 (en) | Enzyme-mediated process for making amberketal and amberketal homologues | |
| US11965195B2 (en) | Enzyme mediated process | |
| US20230021613A1 (en) | Squalene hopene cyclase (shc) variants | |
| EP4493685A1 (en) | Shc enzymes and enzyme variants | |
| RU2829857C1 (ru) | Варианты скваленгопенциклазы (shc) | |
| RU2829857C9 (ru) | Варианты скваленгопенциклазы (shc) | |
| BR122023025399A2 (pt) | Enzimas de esqualeno hopeno ciclase (sch) e suas variantes, produtos de conversão enzimática, seus processos de preparação e produtos derivados | |
| WO2022017389A1 (en) | Method for the production of musk fragrance ingredient |