RU2826580C1 - Method for gas chromatographic determination of methyl esters of fatty acids in human blood - Google Patents
Method for gas chromatographic determination of methyl esters of fatty acids in human blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2826580C1 RU2826580C1 RU2023114906A RU2023114906A RU2826580C1 RU 2826580 C1 RU2826580 C1 RU 2826580C1 RU 2023114906 A RU2023114906 A RU 2023114906A RU 2023114906 A RU2023114906 A RU 2023114906A RU 2826580 C1 RU2826580 C1 RU 2826580C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fatty acids
- minutes
- gas chromatographic
- methyl esters
- blood
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 title claims abstract description 18
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 title description 9
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 48
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 48
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 claims abstract description 4
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N chloroform;ethanol Chemical compound CCO.ClC(Cl)Cl UXTMROKLAAOEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- SJIWUNNSRFWATG-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OCCOCCOC(=O)CCC(O)=O SJIWUNNSRFWATG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 2
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- QABCGOSYZHCPGN-UHFFFAOYSA-N chloro(dimethyl)silicon Chemical compound C[Si](C)Cl QABCGOSYZHCPGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 235000020665 omega-6 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940033080 omega-6 fatty acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, биохимии, в частности, способ предназначен для газохроматографического исследования по определению состава насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот в крови человека методом внутренней нормализации.The invention relates to medicine, biochemistry, in particular, the method is intended for gas chromatographic research to determine the composition of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids in human blood using the internal normalization method.
Уникальная роль липидов осуществляется на уровне клеточных мембран. В связи с этим о тяжести липидных нарушений, имеющих патогенетическое значение в развитии различных заболеваний, дает представление изучение липидного матрикса клетки. Структурную основу мембран клеток составляют фосфолипиды и входящие в их состав жирные кислоты (Антонюк М.В., Шестопалов Е.Ю., Горборукова Т.В. Методологические и методические подходы оценки состояния липидного обмена при заболеваниях внутренних органов // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2006. - №. 23. - С. 59-61). По данным ряда авторов, содержание жирных кислот в крови свидетельствует о состоянии жирового обмена у человека в норме и при различных патологических состояниях, которые могут служить биомаркероми, ранних стадий развития различных патологий (Эндакова Э.А., Новгородцева Т.П., Светашев В.И. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях. - Владивосток: Дальнаука, 2002. 296 с.; Астафьева О.В. и др. Современные представления о роли жирных кислот в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний (обзор) // Сибирский научный медицинский журнал. - 2021. - Т. 41. - №. 4. - С. 1-11). Расширение диапазона определяемых жирных кислот в крови человека позволяет не только изучить многообразные метаболические пути жирных кислот, обеспечивающие развитие патологических состояний, но и имеет большое теоретическое и практическое значение, так как позволяет выявить механизмы развития патологии и способствовать обоснованности и эффективности лечебно-диагностических и профилактических мероприятий.The unique role of lipids is carried out at the level of cell membranes. In this regard, the study of the lipid matrix of the cell gives an idea of the severity of lipid disorders that have pathogenetic significance in the development of various diseases. The structural basis of cell membranes is made up of phospholipids and the fatty acids that comprise them (Antonyuk M.V., Shestopalov E.Yu., Gorborukova T.V. Methodological and methodical approaches to assessing the state of lipid metabolism in diseases of internal organs // Bulletin of Physiology and Pathology of Respiration. - 2006. - No. 23. - P. 59-61). According to a number of authors, the content of fatty acids in the blood indicates the state of lipid metabolism in humans under normal conditions and in various pathological conditions, which can serve as biomarkers of the early stages of the development of various pathologies (Endakova E.A., Novgorodtseva T.P., Svetashev V.I. Modification of the composition of blood fatty acids in cardiovascular diseases. - Vladivostok: Dalnauka, 2002. 296 p.; Astafieva O.V. et al. Modern concepts of the role of fatty acids in the diagnosis of cardiovascular diseases (review) // Siberian Scientific Medical Journal. - 2021. - Vol. 41. - No. 4. - P. 1-11). Expanding the range of detectable fatty acids in human blood allows not only to study the diverse metabolic pathways of fatty acids that ensure the development of pathological conditions, but also has great theoretical and practical significance, since it allows to identify the mechanisms of pathology development and to contribute to the validity and effectiveness of therapeutic, diagnostic and preventive measures.
Для определения жирных кислот был предложен способ газохроматографического исследования липидов крови (Синяк К.М., Оргель М.Я., Крук В.И. Метод приготовления липидов крови для газохроматографического исследования // Лабораторное дело. - 1976. - №1. - С. 37-41), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов на водяной бане при 80°С в течение 20 минут, последующего проведения газохроматографического анализа полученных метиловых эфиров жирных кислот на газовом хроматографе "Цвет-110" с пламенно-ионизационным детектором. Анализ проводится на стеклянной колонке с неполярной неподвижной фазой 1% SE-30 на хромосорбе DMCS при температуре термостата колонки с программированием от 120 до 240°С.To determine fatty acids, a method for gas chromatographic analysis of blood lipids was proposed (Sinyak K.M., Orgel M.Ya., Kruk V.I. Method of preparing blood lipids for gas chromatographic analysis // Laboratory work. - 1976. - No. 1. - Pp. 37-41), including extraction of lipids with a chloroform-methanol mixture, hydrolysis and methylation of lipids in a water bath at 80 ° C for 20 minutes, followed by gas chromatographic analysis of the obtained methyl esters of fatty acids on a Tsvet-110 gas chromatograph with a flame ionization detector. The analysis is carried out on a glass column with a non-polar stationary phase of 1% SE-30 on Chromosorb DMCS at a column thermostat temperature with programming from 120 to 240 ° C.
Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования, и недостаточно информативный перечень определяемых жирных кислот (не более 9 наименований с недостаточным разделением С 18:2), трудности в их количественном подсчете.The main disadvantages of this analogue are: the complexity and relatively long duration of the study, and the insufficiently informative list of fatty acids to be determined (no more than 9 names with insufficient separation of C 18:2), difficulties in their quantitative calculation.
Известен способ определения жирных кислот по методу: Машковской С.В., Котловского Ю.В., Гехман А.Г., Котловского М.Ю., Машковского Д.В., Гребенниковой В.В. (Патент РФ №2237245, опубл. 27.09.2004 г.), включающий обработку крови хлороформ-метанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим растворителем в течение 30 мин в присутствии гексана и дистиллированной воды, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического разделения жирных кислот с помощью неподвижной полярной фазы 20% диэтиленгликольсукцината на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С.A method for determining fatty acids is known according to the method of: Mashkovskaya S.V., Kotlovsky Yu.V., Gekhman A.G., Kotlovsky M.Yu., Mashkovsky D.V., Grebennikova V.V. (Patent of the Russian Federation No. 2237245, published on September 27, 2004), including the treatment of blood with a chloroform-methanol mixture in a ratio of 2:1, hydrolysis and methylation of lipids in a humid chamber for 6 hours in a solution of sulfuric acid and methanol at 80°C, cooling, treatment of the methylated sample with a hexane-containing solvent for 30 min in the presence of hexane and distilled water, drying in a stream of nitrogen and performing gas chromatographic separation of fatty acids using a stationary polar phase of 20% diethylene glycol succinate on Chromaton N-AW-DMCS at a glass column thermostat temperature of 180°C.
Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (не менее 7 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 16).The main disadvantages of this analogue are: the complexity and relatively long duration of the study (at least 7 hours) and an insufficiently informative list of names of the fatty acids determined (no more than 16).
Также известен способ Машковской С.В., Новицкого В.В., Карпова Р.С., Котловского М.Ю., Чикун Н.В.., Васильевой И.В., Котловского Ю.В. (Патент РФ 2298793, опубл. 10.05.2007 г.), включающий обработку крови смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1, проведение гидролиза и метилирования липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С в течение 3 часов, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, сушку в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе 20% диэтиленгликольсукцинатом, покрывающей поверхность колонки длиной 50 м с внешним диаметром 0,32 мм, при температуре колонок в хроматографическом шкафу 140°С.The method of Mashkovskaya S.V., Novitsky V.V., Karpov R.S., Kotlovsky M.Yu., Chikun N.V., Vasilyeva I.V., Kotlovsky Yu.V. is also known. (Patent of the Russian Federation 2298793, published on 10.05.2007), including the treatment of blood with a mixture of chloroform and methanol in a ratio of 2:1, hydrolysis and methylation of lipids in a solution of sulfuric acid and methanol at 80°C for 3 hours, cooling, treatment of the methylated sample with a hexane-containing solution, drying in a stream of nitrogen and gas chromatographic determination and separation of fatty acids on a polar liquid phase of 20% diethylene glycol succinate, covering the surface of a 50 m long column with an external diameter of 0.32 mm, at a column temperature in a chromatographic cabinet of 140°C.
Основными недостатками данного аналога являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (не менее 5 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 16).The main disadvantages of this analogue are: the complexity and relatively long duration of the study (at least 5 hours) and an insufficiently informative list of names of the fatty acids determined (no more than 16).
Аналогом-прототипом является способ, описанный Филоновым В.П. («Методика газохрохроматографического определения жирных кислот и холестерина в продуктах питания и сыворотке крови» Республика Беларусь МВИ.МН 1364-2000), основанный на выделении липидов продуктов питания и сыворотки крови экстракцией органическими растворителями, растворении отфильтрованного сухого липидного экстракта в 5-10 мл гексана и выпаривании на ротационном испарителе при температуре 40°С, метанолизе метиловых эфиров в 2 мл гексанового раствора со стандартами метиловых эфиров жирных кислот, высушивании материала в сушильном шкафу при температуре 102±2°С в течении одного часа и гидролизе, с последующим встряхиванием полученной смеси с целью разделения гексанового слоя, хроматографировании 5 мкл верхнего гексанового слоя и количественном определении методом внутреннего стандарта с использованием градуировочного графика, выражающего зависимость отношений площадей пиков метиловых эфиров жирных кислот к внутреннему стандарту от концентрации соответствующих жирных кислот.The prototype analogue is the method described by V.P. Filonov. ("Methodology for gas chromatographic determination of fatty acids and cholesterol in food products and blood serum" Republic of Belarus MVI.MN 1364-2000), based on the isolation of lipids from food products and blood serum by extraction with organic solvents, dissolution of the filtered dry lipid extract in 5-10 ml of hexane and evaporation on a rotary evaporator at a temperature of 40 ° C, methanolysis of methyl esters in 2 ml of hexane solution with standards of methyl esters of fatty acids, drying of the material in a drying oven at a temperature of 102 ± 2 ° C for one hour and hydrolysis, followed by shaking of the resulting mixture in order to separate the hexane layer, chromatography of 5 μl of the upper hexane layer and quantitative determination by the internal standard method using a calibration graph expressing the dependence of the ratios of the peak areas of methyl esters of fatty acids to internal standard from the concentration of the corresponding fatty acids.
Основными недостатками прототипа являются сложность и сравнительно большая продолжительность процедуры приготовления нескольких градуировочных смесей и внутренних стандартов с добавлением образцов исследуемой сыворотки, проведения калибровки хроматографа градуировочными смесями жирных кислот, общей продолжительностью всех процедур исследования (не менее 7 часов); недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (не более 10); трудоемкость процесса повторной калибровки хроматографа при проведении процедуры внутрилабораторного оперативного контроля каждой стандартной смесью метиловых эфиров жирных кислот.The main disadvantages of the prototype are the complexity and relatively long duration of the procedure for preparing several calibration mixtures and internal standards with the addition of samples of the serum being studied, calibrating the chromatograph with calibration mixtures of fatty acids, the total duration of all research procedures (at least 7 hours); an insufficiently informative list of names of the fatty acids being determined (no more than 10); the labor intensity of the process of re-calibrating the chromatograph when performing the procedure of in-laboratory operational control with each standard mixture of fatty acid methyl esters.
Эти недостатки не дают возможности получения конкретного технического результата - повышение эффективности способа.These shortcomings do not provide the possibility of obtaining a specific technical result - increasing the efficiency of the method.
Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что основными недостатками известных способов являются: сложность и сравнительно большая продолжительность исследования (от 5 до 8 часов) и недостаточно информативный перечень наименований определяемых жирных кислот (от 9 до 16), трудоемкость процесса калибровки хроматографа каждой стандартной смесью метиловых эфиров жирных кислот от С4:0 до С24:1.The conducted analysis of patent and scientific literature showed that the main disadvantages of the known methods are: the complexity and relatively long duration of the study (from 5 to 8 hours) and an insufficiently informative list of names of the fatty acids to be determined (from 9 to 16), the laboriousness of the process of calibrating the chromatograph with each standard mixture of methyl esters of fatty acids from C 4:0 to C 24:1 .
Технический результат заявленного способа достигается тем, что пробу плазмы или сыворотки крови предварительно обезвоживают однократно в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С в течение 20 минут, затем сушат в сушильном шкафу в течении 20 минут, высушенную жировую пленку растворяют в 2 мл гексана и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут, после 15 минутного отстаивания проводят газохроматографическое исследование 1 мл супернатанта образца на 100 метровой капиллярной кварцевой колонке с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME, после этого определяют массовую долю индивидуальных жирных кислот методом внутренней нормализации.The technical result of the claimed method is achieved by the fact that a sample of blood plasma or serum is preliminarily dehydrated once in a vacuum in a water bath of a rotary evaporator at a temperature of 75-79°C for 20 minutes, then dried in a drying cabinet for 20 minutes, the dried fatty film is dissolved in 2 ml of hexane and centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes, after 15 minutes of settling, a gas chromatographic study of 1 ml of the sample supernatant is carried out on a 100 meter capillary quartz column with a highly polar stationary phase CR-Sil 88 FAME, after which the mass fraction of individual fatty acids is determined by the internal normalization method.
Предлагаемое изобретение направлено на повышение эффективности, заключающееся в сокращении сроков проведения процедур и этапов исследования (не более 3 часов), снижении затрат на приобретение всего одной стандартной смеси метиловых эфиров, ускорении по времени процесса калибровки хроматографа методом внутренней нормализации и повышении информативности определяемых жирных кислот (не менее 20 наименований). Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.The proposed invention is aimed at increasing efficiency, consisting in reducing the time of procedures and stages of research (no more than 3 hours), reducing the costs of purchasing only one standard mixture of methyl esters, accelerating the time of the chromatograph calibration process by the internal normalization method and increasing the information content of the fatty acids determined (at least 20 names). The essence of the invention is expressed by a set of essential features sufficient for the technical result provided by the invention.
Все результаты количественного определения жирных кислот в крови человека заявленным способом всегда были индивидуальными и колебались от 23 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колебалось от 1 до 14 наименований жирных кислот.All results of quantitative determination of fatty acids in human blood by the declared method were always individual and fluctuated from 23 to 37 names in one sample in the range from 0.03 to 50%. The amount of fatty acids in one blood sample less than the range of 0.03% fluctuated from 1 to 14 names of fatty acids.
Данный способ апробировали на 70 образцах крови человека (26 мужчин, 44 женщины), определяли достоверность полученных результатов каждого образца и проводили их сравнение с количественными референсными значениями (табл. 1, фиг. 1, 2). В ходе исследования рассчитывали индекс соотношений омега-6 к омега-3 жирных кислот, и был равен отношению суммы всех жирных кислот омега-6 к сумме всех жирных кислот омега-3 (табл. 2). Одним из этапов разработки способа явился подбор условий выполнения процедур экстрагирования, метанолиза и гидролиза. This method was tested on 70 human blood samples (26 men, 44 women), the reliability of the results obtained for each sample was determined and they were compared with quantitative reference values (Table 1, Figs. 1, 2). During the study, the index of the ratio of omega-6 to omega-3 fatty acids was calculated and was equal to the ratio of the sum of all omega-6 fatty acids to the sum of all omega-3 fatty acids (Table 2). One of the stages of the method development was the selection of conditions for performing the extraction, methanolysis and hydrolysis procedures.
Ниже приводятся примеры апробации способа.Below are examples of testing the method.
Пример 1. Газохроматографическое определение метиловых эфиров жирных кислот проводят в плазме и сыворотке крови человека. Для исследования взвешивают 2,0 г с точностью до 0,01 г анализируемого вещества (сыворотки крови из пробирок с активатором свертывания и разделительным гелем, плазмы - из пробирок с этилендиаминуксусной кислотой) и гомогенизируют в фарфоровой ступке с 30 - 35 г безводного сернокислого натрия в течение 15 минут. Из полученной смеси экстрагируют общие липиды крови 30 мл бинарной смеси хлороформ - этанол в соотношении 2:1. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр, оставшуюся в колбе пробу повторно экстрагируют 30 мл экстракционной смеси растворителей также 15 минут и снова отфильтровывают в колбу с первой порцией фильтрата. Таким образом операцию экстракции повторяют 3 раза. Затем пробу упаривают досуха на водяной бане ротационного испарителя при температуре 45°С в течение 20 минут. После упаривания всего экстракта остаток в колбе сушат в сушильном шкафу при температуре 102±2°С в течении часа. Колбу охлаждают до комнатной температуры и растворяют сухой липидный экстракт в 1,9 мл гексана с добавлением 0,1 мл метанольного раствора 2 моль/дм3 метилата натрия. Полученную смесь подвергают гидролизации на шейкере, после чего отбирают верхний гексановый слой. Выделенный экстракт метиловых эфиров жирных кислот крови вводят дозирующим устройством (1-3 мкл) в испаритель газового хроматографа «Хроматэк-Кристалл-5000.2» с пламенно - ионизационным детектором, применяя установленную в термостат хроматографа 100 метровую капиллярную кварцевую колонку с высокополярной неподвижной фазой CR-Sil 88 FAME (70% - цианопропилполисилфенилен - силоксаном 100 м*0,25 мм*0,25 мкм), для разделения полиненасыщенных, мононенасыщенных и насыщенных жирных кислот. Количественное определение массовой доли индивидуальных жирных кислот (37 наименований) проводят методом внутренней нормализации (площади всех 37 пиков жирных кислот принимаем за 100%) с применением сертифицированного стандартного образца (смеси) с указанием метрологической прослеживаемости результатов исследования.Example 1. Gas chromatographic determination of fatty acid methyl esters is carried out in human blood plasma and serum. For the study, 2.0 g of the analyzed substance (blood serum from test tubes with a coagulation activator and a separating gel, plasma from test tubes with ethylenediamineacetic acid) are weighed to the nearest 0.01 g and homogenized in a porcelain mortar with 30-35 g of anhydrous sodium sulfate for 15 minutes. Total blood lipids are extracted from the resulting mixture with 30 ml of a binary mixture of chloroform - ethanol in a ratio of 2:1. The extract is filtered through a paper filter, the sample remaining in the flask is re-extracted with 30 ml of the extraction mixture of solvents also for 15 minutes and again filtered into the flask with the first portion of the filtrate. Thus, the extraction operation is repeated 3 times. The sample is then evaporated to dryness in a rotary evaporator water bath at 45°C for 20 minutes. After the entire extract has evaporated, the residue in the flask is dried in a drying cabinet at 102±2°C for an hour. The flask is cooled to room temperature and the dry lipid extract is dissolved in 1.9 ml of hexane with the addition of 0.1 ml of a methanol solution of 2 mol/ dm3 of sodium methylate. The resulting mixture is hydrolyzed on a shaker, after which the upper hexane layer is collected. The isolated extract of methyl esters of blood fatty acids is introduced with a dosing device (1-3 μl) into the evaporator of the gas chromatograph "Chromatec-Crystal-5000.2" with a flame ionization detector, using a 100 m capillary quartz column with a highly polar stationary phase CR-Sil 88 FAME (70% - cyanopropylpolysilphenylene - siloxane 100 m * 0.25 mm * 0.25 μm) installed in the chromatograph thermostat, for the separation of polyunsaturated, monounsaturated and saturated fatty acids. Quantitative determination of the mass fraction of individual fatty acids (37 names) is carried out by the internal normalization method (the areas of all 37 peaks of fatty acids are taken as 100%) using a certified standard sample (mixture) with an indication of the metrological traceability of the study results.
В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 13 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 24 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2). При анализе жирных кислот в крови, определяемых не менее 3 раз в одном образце расхождение определяемых компонентов при хроматографировании параллельных проб, отличалось более чем на 2-5%, что является не допустимым.As a result of determination of fatty acids in blood of 26 men and 44 women, aged from 35 to 75 years, the amount of fatty acids is always individual and fluctuates from 13 to 37 names in one sample in the range from 0.03 to 50%. The amount of fatty acids in one blood sample less than the range of 0.03% fluctuates from 1 to 24 names of fatty acids (Table 1 and Table 2). When analyzing fatty acids in blood, determined at least 3 times in one sample, the discrepancy of the components determined during chromatography of parallel samples differed by more than 2-5%, which is unacceptable.
Пример 2. Условия эксперимента как в примере 1, только после гомогенизации экстракцию общих липидов крови из полученной смеси проводят 90 мл бинарной смеси хлороформ - этанол в соотношении 2:1. Экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр и упаривают пробу в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75°С в течение 20 минут. В сушильном шкафу остаток в колбе сушат 20 минут при температуре 102±2°С. Колбу охлаждают до комнатной температуры и растворяют сухой липидный экстракт в 1,9 мл гексана, после добавляют 0,1 мл метанольного раствора 2 моль/дм3 метилата натрия и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. Исключают этап гидролизации, полученную смесь отстаивают 15 минут и хроматографируют верхний гексановый слой.Example 2. The experimental conditions are the same as in Example 1, but after homogenization, the extraction of total blood lipids from the resulting mixture is carried out with 90 ml of a binary mixture of chloroform - ethanol in a ratio of 2:1. The extract is filtered through a paper filter and the sample is evaporated in a vacuum in a water bath of a rotary evaporator at a temperature of 75 ° C for 20 minutes. In a drying oven, the residue in the flask is dried for 20 minutes at a temperature of 102 ± 2 ° C. The flask is cooled to room temperature and the dry lipid extract is dissolved in 1.9 ml of hexane, then 0.1 ml of a methanol solution of 2 mol / dm 3 sodium methylate is added and the mixture is centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. The hydrolysis stage is excluded, the resulting mixture is settled for 15 minutes and the upper hexane layer is chromatographed.
В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 20 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 17 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2). При определении метиловых эфиров жирных кислот в 3-х параллельных пробах одного образца расхождение определяемых компонентов при хроматографировании не отличалось более чем на 1%, следовательно, было достоверным.As a result of determination of fatty acids in blood of 26 men and 44 women, aged from 35 to 75 years, the amount of fatty acids is always individual and fluctuates from 20 to 37 names in one sample in the range from 0.03 to 50%. The amount of fatty acids in one blood sample less than the range of 0.03% fluctuates from 1 to 17 names of fatty acids (Table 1 and Table 2). When determining methyl esters of fatty acids in 3 parallel samples of one sample, the discrepancy of the components determined during chromatography did not differ by more than 1%, therefore, it was reliable.
Пример 3. Условия эксперимента как в примере 2, только этап обезвоживания в вакууме на водяной бане ротационного испарителя проводили при температуре 79°С.Example 3. The experimental conditions were the same as in example 2, except that the dehydration stage in a vacuum on a water bath of a rotary evaporator was carried out at a temperature of 79°C.
В результате определения жирных кислот в крови 26 мужчин и 44 женщин, в возрасте от 35 до 75 лет, количество жирных кислот всегда индивидуальное и колеблется от 23 до 37 наименований в одном образце в диапазоне от 0,03 до 50%. Количество жирных кислот в одном образце крови менее диапазона 0,03% колеблется от 1 до 14 наименований жирных кислот (табл. 1 и табл. 2, фиг. 1 и 2). При анализе достоверности определения метиловых эфиров жирных кислот в 3-х параллельных пробах одного образца отмечалось допустимое расхождение определяемых компонентов не более чем на 0,5%.As a result of determination of fatty acids in blood of 26 men and 44 women, aged from 35 to 75 years, the amount of fatty acids is always individual and fluctuates from 23 to 37 names in one sample in the range from 0.03 to 50%. The amount of fatty acids in one blood sample less than the range of 0.03% fluctuates from 1 to 14 names of fatty acids (Table 1 and Table 2, Figs. 1 and 2). When analyzing the reliability of determination of methyl esters of fatty acids in 3 parallel samples of one sample, an acceptable discrepancy of the components determined by no more than 0.5% was noted.
Анализ приведенных примеров показывает, что наиболее стабильные результаты достигаются при условиях экстракции общих липидов крови из полученной смеси 90 мл бинарной смеси хлороформ - этанол, обезвоживания в вакууме на водяной бане ротационного испарителя при температуре 75-79°С, выдерживания пробы в сушильном шкафу в течении 20 минут и центрифугирования после метанолиза (примеры 2, 3). В примерах 2 и 3 исключают этап гидролизации полученной смеси, заменяя его отстаиванием пробы в течение 15 минут перед хроматографированием верхнего гексанового слоя. Результаты этих двух примеров идентичны и достоверны.Analysis of the given examples shows that the most stable results are achieved under the conditions of extraction of total blood lipids from the resulting mixture of 90 ml of a binary mixture of chloroform - ethanol, dehydration in a vacuum on a water bath of a rotary evaporator at a temperature of 75-79 ° C, keeping the sample in a drying cabinet for 20 minutes and centrifugation after methanolysis (examples 2, 3). In examples 2 and 3, the stage of hydrolysis of the resulting mixture is excluded, replacing it with settling the sample for 15 minutes before chromatography of the upper hexane layer. The results of these two examples are identical and reliable.
Таким образом, предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности способа, а именно: позволяет значительно сократить сроки проведения подготовки пробы и свести к минимуму затраты на используемое оборудование путем изменения процедур экстрагирования и метанолиза; расширение нижнего диапазона чувствительности до 0,03% и общего спектра выхода жирных кислот до 37 наименований индивидуальных жирных кислот за счет использования одной стандартной смеси жирных кислот; упрощение исследования благодаря исключению этапа гидролиза и проведения калибровки хроматографа методом внутренней нормализации.Thus, the proposed invention solves the main problem - increasing the efficiency of the method, namely: it allows to significantly reduce the time of sample preparation and minimize the costs of the equipment used by changing the extraction and methanolysis procedures; expanding the lower sensitivity range to 0.03% and the total spectrum of fatty acid yield to 37 types of individual fatty acids due to the use of one standard mixture of fatty acids; simplifying the study due to the exclusion of the hydrolysis stage and the calibration of the chromatograph using the internal normalization method.
Авторами предложен новый, никем ранее незаявленный способ при сочетании нескольких приемов для экстрагирования жирных кислот крови человека, а именно: изменение процедур экстрагирования и метанолиза; использование эталона в виде стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот из 37 компонентов, исключение этапа гидролиза и проведения калибровки хроматографа методом внутренней нормализации, что является существенным отличием в подходе к определению метиловых эфиров жирных кислот в крови человека, и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде значительного упрощения и сокращения сроков определения жирных кислот в пробе венозной крови, а также расширения спектра выхода жирных кислот до 37 наименований и чувствительности определения их в анализируемом объеме крови.The authors proposed a new, previously undeclared method combining several techniques for extracting fatty acids from human blood, namely: changing the extraction and methanolysis procedures; using a standard in the form of a standard mixture of methyl esters of fatty acids from 37 components, eliminating the hydrolysis stage and calibrating the chromatograph using the internal normalization method, which is a significant difference in the approach to determining methyl esters of fatty acids in human blood, and it is this difference that made it possible to obtain a positive effect in the form of a significant simplification and reduction in the time required to determine fatty acids in a venous blood sample, as well as expanding the range of fatty acid yields to 37 names and the sensitivity of their determination in the analyzed blood volume.
Предлагаемый способ также может быть рекомендован для использования в научных и клиническо-диагностических лабораториях системы здравоохранения.The proposed method can also be recommended for use in scientific and clinical diagnostic laboratories of the healthcare system.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2826580C1 true RU2826580C1 (en) | 2024-09-12 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2145511C1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-02-20 | НИФ "Ультрасан" | Method of separating mixture of fatty acid c2-c7-fraction by liquid chromatography technique |
| RU2237245C2 (en) * | 2002-07-29 | 2004-09-27 | Красноярская государственная медицинская академия | Method for evaluation of fatty acids spectrum |
| RU2298793C1 (en) * | 2005-11-24 | 2007-05-10 | ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию | Method for determining and separating fatty acids |
| DE102009021678A1 (en) * | 2009-05-18 | 2009-09-24 | Omegametrix Gmbh | Omega-three fatty acid e.g. docosahexaenoic acid, detecting method for diagnosis of patient having cardiovascular disease, involves quantitatively detecting fatty acid in sample using mathematic-statistic method by flame ionization detector |
| CN103616465A (en) * | 2013-10-28 | 2014-03-05 | 浙江大学 | Method for establishing blood correlated fatty acid spectrum |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2145511C1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-02-20 | НИФ "Ультрасан" | Method of separating mixture of fatty acid c2-c7-fraction by liquid chromatography technique |
| RU2237245C2 (en) * | 2002-07-29 | 2004-09-27 | Красноярская государственная медицинская академия | Method for evaluation of fatty acids spectrum |
| RU2298793C1 (en) * | 2005-11-24 | 2007-05-10 | ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию | Method for determining and separating fatty acids |
| DE102009021678A1 (en) * | 2009-05-18 | 2009-09-24 | Omegametrix Gmbh | Omega-three fatty acid e.g. docosahexaenoic acid, detecting method for diagnosis of patient having cardiovascular disease, involves quantitatively detecting fatty acid in sample using mathematic-statistic method by flame ionization detector |
| CN103616465A (en) * | 2013-10-28 | 2014-03-05 | 浙江大学 | Method for establishing blood correlated fatty acid spectrum |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Орлова Т.И. и др. Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием //Аналитика и контроль, 2015, 19(2), с. 183-188. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101858199B1 (en) | Detection method | |
| Audano et al. | Gender-related metabolomics and lipidomics: From experimental animal models to clinical evidence | |
| JPS6135356A (en) | Analyzing method of fatty acid in blood lipid | |
| Antonelli et al. | New insights in hemp chemical composition: a comprehensive polar lipidome characterization by combining solid phase enrichment, high-resolution mass spectrometry, and cheminformatics | |
| Géhin et al. | No skin off your back: the sampling and extraction of sebum for metabolomics | |
| RU2826580C1 (en) | Method for gas chromatographic determination of methyl esters of fatty acids in human blood | |
| RU2423704C1 (en) | Laboratory diagnostic technique for sepsis | |
| Tomášová et al. | Minor lipids profiling in subcutaneous and epicardial fat tissue using LC/MS with an optimized preanalytical phase | |
| RU2758932C1 (en) | Method for measuring mass concentration of methyl esters of fatty acids in biological media by gas-liquid chromatography method | |
| RU2713661C1 (en) | Method of sample preparation for gas-chromatographic determination of organochlorine compounds in biomaterial | |
| RU2398239C1 (en) | Method of predicting course of coronary heart disease | |
| Nielsen et al. | Accumulation of triglycerides in the proximal tubule of the kidney in diabetic coma | |
| Sachs et al. | Thin Layer Chromatography of Blood Lipids. | |
| Jansen et al. | A spectrophotofluorometric micromethod for the determination of cortisol (hydrocortisone) in plasma and tissue obtained by needle biopsies | |
| RU2530620C1 (en) | Method of determining simultaneously present fat-soluble vitamins a, d2, e and ?-carotene by thin-layer chromatography | |
| RU2439582C1 (en) | Method of predicting ischemic heart disease course | |
| Heyl et al. | A chromatographic study of skin lipids in lipoid proteinosis | |
| RU2413227C2 (en) | Method of preparing biological tissue of corpse organ for chemiluminiscent analysis | |
| RU2298793C1 (en) | Method for determining and separating fatty acids | |
| Bowers et al. | A rapid, reliable procedure for the determination of total fecal lipids, with observations on the composition of the lipids excreted by human subjects in normal and pathological states | |
| RU2402016C1 (en) | Method of predicting course of coronary heart disease | |
| RU2521277C1 (en) | Method for measuring blood 2,4-dichlorphenol by gas chromatography analysis | |
| CN116602977A (en) | Active component with antioxidant, anti-saccharification and anti-inflammatory effects and preparation method and application thereof | |
| Pinault et al. | Development of a novel HPTLC-based method for the simultaneous quantification of clinically relevant lipids from cells and tissue extracts | |
| Vavrušová | Chromatographic and mass-spectrometric analysis of lipids of vernix caseosa |