RU2822737C9 - Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus - bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 16s rrna - Google Patents
Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus - bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 16s rrna Download PDFInfo
- Publication number
- RU2822737C9 RU2822737C9 RU2023117808A RU2023117808A RU2822737C9 RU 2822737 C9 RU2822737 C9 RU 2822737C9 RU 2023117808 A RU2023117808 A RU 2023117808A RU 2023117808 A RU2023117808 A RU 2023117808A RU 2822737 C9 RU2822737 C9 RU 2822737C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacillus
- megaterium
- subtilis
- bacteria
- thuringiensis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims abstract description 31
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 title claims abstract description 29
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title abstract description 3
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 28
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Zymo research Chemical compound 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 241000385736 bacterium B Species 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021022 fresh fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов - наиболее значимых бактерий рода Bacillus: В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis и может быть использовано при определении этих бактерий в составе коммерческих биопрепаратов.The invention relates to the field of molecular genetic methods for identifying microorganisms - the most significant bacteria of the genus Bacillus: B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis and can be used to determine these bacteria in the composition of commercial biopreparations.
Бактерии рода Bacillus, в особенности В. subtilis, часто используются в животноводстве в качестве пробиотиков. Также бактерии этого рода используются для обработки растений, поскольку некоторые виды бактерий, такие как В. subtilis и В. megaterium обладают свойствами антагониста патогенной микрофлоры почв, улучшают биодоступность питательных веществ, а бактерия В. thuringiensis обладает инсектицидным действием. Ввиду того, что эти виды бактерий обладают различными хозяйственными свойствами важно корректно их идентифицировать.Bacteria of the genus Bacillus, especially B. subtilis, are often used in animal husbandry as probiotics. Bacteria of this genus are also used to treat plants, since some species of bacteria, such as B. subtilis and B. megaterium, have antagonist properties against soil pathogenic microflora, improve the bioavailability of nutrients, and the bacterium B. thuringiensis has an insecticidal effect. Due to the fact that these species of bacteria have different economic properties, it is important to correctly identify them.
Идентифицировать эти бактерии морфологически крайне сложно, необходим более эффективный и быстрый метод дифференциации этих трех видов бактерий для верификации состава коммерчески доступных микробиологических биопрепаратов. Для этого был разработан метод дифференциации данных бактерий на основе ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Для анализа использовался участок, который амплифицируют праймеры 337F (SEQ ID NO: 1) и 1100R (SEQ ID NO: 2). Первоначально был проведен биоинформатический анализ коммерчески доступных рестриктаз, способных формировать фрагменты, специфичные для каждого из трех видов бактерий: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis.Identification of these bacteria morphologically is extremely difficult, a more effective and rapid method of differentiation of these three bacterial species is needed to verify the composition of commercially available microbiological biopreparations. For this purpose, a method for differentiation of these bacteria based on PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) was developed. The region amplified by primers 337F (SEQ ID NO: 1) and 1100R (SEQ ID NO: 2) was used for the analysis. Initially, a bioinformatic analysis of commercially available restriction enzymes capable of forming fragments specific for each of the three bacterial species was carried out: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis.
Известен молекулярно-генетический способ идентификации прокариотических организмов на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция) к участку hin-региона и последующего сравнения получившихся продуктов в гель-электрофорезе (патент 2486251, МПК C12Q 1/68 (2006.01)). На этапе ПЦР используются последовательности олигонуклеотидных праймеров: прямой праймер: GGAAGAGGGGTTCGACT; обратный праймер: AGAATGAAAATCTGGTG. Анализ результатов осуществляют методом горизонтального электрофореза. Данный метод используется для дифференциации Rizobium и других родов бактерий. Этот способ не позволяет проводить дифференциацию бактерий рода Bacillus.A molecular genetic method for identifying prokaryotic organisms is known based on PCR (polymerase chain reaction) to the hin region and subsequent comparison of the resulting products in gel electrophoresis (patent 2486251, IPC C12Q 1/68 (2006.01)). At the PCR stage, the following oligonucleotide primer sequences are used: forward primer: GGAAGAGGGGTTCGACT; reverse primer: AGAATGAAAATCTGGTG. The results are analyzed by horizontal electrophoresis. This method is used to differentiate Rhizobium and other bacterial genera. This method does not allow differentiation of Bacillus bacteria.
Известен способ идентификации бактерий В. anthracis (патент 2204607, МПК C12Q 1/04 (2000.01), C12N 1/20 (2000.01)). Способ заключается в оценки культуральных свойств бактерии В. anthracis. Недостатком способа является невозможность идентификации трех видов бактерий рода Bacillus: В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensisA method for identifying B. anthracis bacteria is known (patent 2204607, IPC C12Q 1/04 (2000.01), C12N 1/20 (2000.01)). The method involves assessing the cultural properties of B. anthracis bacteria. The disadvantage of the method is the impossibility of identifying three types of bacteria of the genus Bacillus: B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis.
Известен способ идентификации бактерий В. thuringiensis (патент 2750913, МПК C12Q 1/04 (2006.01), G01N 33/50 (2006.01), C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/07 (2006.01)). Способ заключается в проведении лизиса бактериальных клеток с последующим проведением электрофореза белков. Недостатком способа является невозможность идентификации двух других видов бактерий: В. subtilis и В. megaterium.A method for identifying B. thuringiensis bacteria is known (patent 2750913, IPC C12Q 1/04 (2006.01), G01N 33/50 (2006.01), C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/07 (2006.01)). The method involves lysis of bacterial cells followed by protein electrophoresis. A disadvantage of the method is the impossibility of identifying two other types of bacteria: B. subtilis and B. megaterium.
В качестве прототипа взят способ идентификации В. thuringiensis с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к генам, кодирующими определенные токсины [Frederiksen, K., Rosenquist, H., Jorgensen, K., & Wilcks, Α. (2006). Occurrence of Natural Bacillus thuringiensis Contaminants and Residues of Bacillus thuringiensis-Based Insecticides on Fresh Fruits and Vegetables. Applied and Environmental Microbiology, 72(5), 3435-3440. doi:10.1128/aem.72.5.3435-3440.200]. Способ включал в себя выделение геномной ДНК, RAPD-анализ, проведение электрофореза в агарозном геле. Способ позволяет различать многие серотипы и некоторые штаммы В. thuringiensis, однако идентификация двух других видов бактерий: В. subtilis и В. megaterium при использовании данного способа не возможна.The prototype is a method for identifying B. thuringiensis using polymerase chain reaction with primers specific to genes encoding certain toxins [Frederiksen, K., Rosenquist, H., Jorgensen, K., & Wilcks, A. (2006). Occurrence of Natural Bacillus thuringiensis Contaminants and Residues of Bacillus thuringiensis-Based Insecticides on Fresh Fruits and Vegetables. Applied and Environmental Microbiology, 72(5), 3435-3440. doi:10.1128/aem.72.5.3435-3440.200]. The method included the extraction of genomic DNA, RAPD analysis, and electrophoresis in an agarose gel. The method allows distinguishing many serotypes and some strains of B. thuringiensis, however, identification of two other bacterial species: B. subtilis and B. megaterium is not possible using this method.
Задачей настоящего изобретения является разработка молекулярно-генетического метода идентификации бактерий рода Bacillus: В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis, который ускорит и упростит идентификацию бактерий по сравнению с традиционными рутинными методами высевания на питательные среды, а также будет являться достоверным и точным, не требующим знаний морфологии бактерий. Данный молекулярно-генетический метод позволит проводить идентификацию бактерий в любой молекулярно-генетической лаборатории.The objective of the present invention is to develop a molecular genetic method for identifying bacteria of the genus Bacillus: B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis, which will accelerate and simplify the identification of bacteria compared to traditional routine methods of sowing on nutrient media, and will also be reliable and accurate, not requiring knowledge of the morphology of bacteria. This molecular genetic method will allow the identification of bacteria in any molecular genetic laboratory.
Существенным преимуществом заявляемого молекулярно-генетического метода идентификации бактерий является быстрота и точность определения. Предварительно был проведен анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации данных видов бактерий на основе рестриционного анализа гена 16S рРНК с использованием рестриктазы Alu I.A significant advantage of the claimed molecular genetic method of bacterial identification is the speed and accuracy of determination. A preliminary analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene was carried out. Differences in the nucleotide sequence between B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis were established, which make it possible to develop a method for express identification of these bacterial species based on restriction analysis of the 16S rRNA gene using Alu I restrictase.
Идентификация бактерий в описываемом способе осуществляется на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного гена 16S рРНК.Identification of bacteria in the described method is carried out on the basis of restriction analysis of the pre-amplified 16S rRNA gene.
Технический результат - проведение идентификации бактерий видов В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis без привлечения специалистов в области микробиологии стандартизированными методами молекулярной генетики, с возможностью проведения идентификационных процедур в течение 4,5-6 часов.The technical result is the identification of bacteria of the species B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis without the involvement of specialists in the field of microbiology using standardized methods of molecular genetics, with the possibility of carrying out identification procedures within 4.5-6 hours.
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации бактерий рода Bacillus - В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis на основе рестрикционного анализа гена 16S рРНК, включающем выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение ПЦР, проведение электрофореза в агарозном геле, согласно изобретению, проводят ПЦР участка гена 16S рРНК с помощью праймеров: прямой 337F GACTCCTACGGGAGGCWGCAG, SEQ ID NO: 1 и обратный 1100R GGGTTGCGCTCGTTG, SEQ ID NO: 2 согласно Перечню последовательностей; затем осуществляют рестрикцию продуктов ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликона с помощью электрофореза, при рестрикционном анализе для идентификации используют рестриктазу Alu I, образующую уникальные фрагменты рестрикции для трех наиболее значимых бактерий рода Bacillus - В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis, где наличие фрагмента ДНК длиной 430 п.н. указывает на принадлежность к виду бактерий В. subtilis, длиной 526 п.н. - на принадлежность к виду бактерий В. megaterium, длиной 598 п.н. - на принадлежность к виду бактерий - В. thuringiensis.The technical result is achieved in that in the method for identifying bacteria of the genus Bacillus - B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis based on restriction analysis of the 16S rRNA gene, including isolating DNA from pre-collected biological material, then conducting PCR, conducting electrophoresis in an agarose gel, according to the invention, PCR of a region of the 16S rRNA gene is carried out using primers: forward 337F GACTCCTACGGGAGGCWGCAG, SEQ ID NO: 1 and reverse 1100R GGGTTGCGCTCGTTG, SEQ ID NO: 2 according to the Sequence Listing; then, restriction of the PCR products is carried out, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the amplicon is performed using electrophoresis, during restriction analysis for identification, Alu I restriction enzyme is used, which forms unique restriction fragments for the three most significant bacteria of the genus Bacillus - B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis, where the presence of a DNA fragment 430 bp long indicates belonging to the bacterial species B. subtilis, 526 bp long - to belonging to the bacterial species B. megaterium, 598 bp long - to belonging to the bacterial species B. thuringiensis.
Способ идентификации бактерий рода В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis на основе рестрикционного анализа предварительно амплифициро-ванного гена 16S рРНК реализуется следующим образом:The method for identifying bacteria of the genus B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis based on restriction analysis of the pre-amplified 16S rRNA gene is implemented as follows:
1. Отбирают нуждающиеся в идентификации микробиологические монопрепараты, содержащие предположительно бактерии рода Bacillus.1. Microbiological monopreparations that require identification and presumably contain bacteria of the genus Bacillus are selected.
2. Производится выделение ДНК из полученных образцов, выделение ДНК можно проводить как с помощью коммерческих наборов отечественных и зарубежных производителей ("ДНК-технологии", "Синтол", "Zymo research", БиоСилика и др.), так и общепринятыми методами (фенол-хлороформная экстракция, ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид)-метод).2. DNA is isolated from the obtained samples; DNA isolation can be performed using commercial kits from domestic and foreign manufacturers (DNA-technologies, Synthol, Zymo research, BioSilica, etc.), as well as by generally accepted methods (phenol-chloroform extraction, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) method).
3. Проводится ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 95°С 2 мин, далее 30 циклов вида: 95°С 30 сек - денатурация, 54°С 30 сек - отжиг праймеров, 72°С 45 сек - элонгация. После чего проводят инкубирование смеси - 72°С в течение 5 мин. В качестве праймеров для амплификации используются: прямой 337F (SEQ ID NO: 1) GACTCCTACGGGAGGCWGCAG, обратный (SEQ ID NO: 2) 1100R GGGTTGCGCTCGTTG.3. PCR is performed. The following temperature cycles are used: 95°C for 2 min, then 30 cycles of the following type: 95°C for 30 sec - denaturation, 54°C for 30 sec - primer annealing, 72°C for 45 sec - elongation. After which the mixture is incubated at 72°C for 5 min. The following primers are used for amplification: forward 337F (SEQ ID NO: 1) GACTCCTACGGGAGGCWGCAG, reverse (SEQ ID NO: 2) 1100R GGGTTGCGCTCGTTG.
4. Продукты ПЦР подвергают рестрикции по следующей схеме: в пробирке на 0,2 мл смешивают 10 мкл ПЦР продукта, 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, 10 ед. рестриктазы. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Смесь инкубируют в течение 2 часов при 37°С, после чего фермент инактивируют нагревом до 65°С в течение 20 мин. После чего проводят анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликона. Результаты рестрикционного анализа фиксируются с помощью метода электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве рестриктазы используют Alu I. Фермент рестрикции образует уникальные фрагменты для трех представителей рода Bacillus - В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis (фиг. 2).4. The PCR products are subjected to restriction according to the following scheme: 10 μl of the PCR product, 1.5 μl of 10X reaction buffer, and 10 units of restriction enzyme are mixed in a 0.2 ml test tube. The volume is brought to 15 μl with deionized water. The mixture is incubated for 2 hours at 37°C, after which the enzyme is inactivated by heating to 65°C for 20 min. After that, the amplicon restriction fragment length polymorphism (RFLP) is analyzed. The results of the restriction analysis are recorded using electrophoresis in 2% agarose gel. Alu I is used as the restriction enzyme. The restriction enzyme forms unique fragments for three representatives of the genus Bacillus - B. subtilis, B. megaterium, and B. thuringiensis (Fig. 2).
На фиг. 1 приведена электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР гена 16 рРНК; на фиг. 2 представлены длины ожидаемых фрагментов (п.н.) при расщеплении предварительно амплифицированной последовательности 16S рРНК рестриктазой Alu I.Fig. 1 shows an electropherogram of the PCR restriction products of the 16S rRNA gene; Fig. 2 shows the lengths of the expected fragments (bp) upon cleavage of the pre-amplified 16S rRNA sequence with the Alu I restriction enzyme.
Пример 1.Example 1.
На электрофореграмме: M - маркер длин фрагментов ДНК, значения выражены в пар нуклеотидов (п.н.); ВМ - участок гена 16S рРНК бактерии В. megaterium из биопрепарата №1; BS - участок гена 16S рРНК бактерии В. subtilis из биопрепарата №2; ВТ - участок гена 16S рРНК бактерии В. thuringiensis из биопрепарата №3; К - продукт ПЦР до рестрикции; Alu I - продукт ПЦР после рестрикции с использованием фермента рестрикции Alu I.On the electropherogram: M is a marker of DNA fragment lengths, values are expressed in nucleotide pairs (bp); BM is a region of the 16S rRNA gene of the B. megaterium bacterium from biopreparation No. 1; BS is a region of the 16S rRNA gene of the B. subtilis bacterium from biopreparation No. 2; BT is a region of the 16S rRNA gene of the B. thuringiensis bacterium from biopreparation No. 3; K is the PCR product before restriction; Alu I is the PCR product after restriction using the Alu I restriction enzyme.
При обработке рестриктазой Alu I продукта ПЦР образцов ДНК ВМ (В. megaterium), ВТ (В. thuringiensis) и BS (В. subtilis) образовались крупные фрагменты длиной 526 п. н., 430 п.н. и 598 п.н. для В. megaterium, В. subtilis и В. thuringiensis соответственно. Следовательно, в биопрепарате №1 содержатся бактерии В. megaterium, биопрепарате №2 - бактерии В. subtilis, биопрепарате №3 - бактерии В. thuringiensis.When treating the PCR product of the DNA samples of BM (B. megaterium), BT (B. thuringiensis) and BS (B. subtilis) with Alu I restriction enzyme, large fragments of 526 bp, 430 bp and 598 bp in length were formed for B. megaterium, B. subtilis and B. thuringiensis, respectively. Consequently, biopreparation No. 1 contains B. megaterium bacteria, biopreparation No. 2 contains B. subtilis bacteria, and biopreparation No. 3 contains B. thuringiensis bacteria.
Предлагаемый способ идентификации значимых для сельского хозяйства представителей рода Bacillus - В. subtilis, В. megaterium и В. thuringiensis на основе рестрикционного анализа гена 16S рРНК является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым, универсальным для хозяйственно значимых бактерий рода Bacillus и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.The proposed method for identifying agriculturally significant representatives of the genus Bacillus - B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis based on restriction analysis of the 16S rRNA gene is highly sensitive, well reproducible, universal for economically significant bacteria of the genus Bacillus and cost-effective. Depending on the method of DNA extraction from biological samples, the analysis takes from 4.5 to 6 hours. The analysis can be carried out in laboratories with a thermal cycler, centrifuge, electrophoresis chamber and associated reagents and consumables.
--->--->
Перечень последовательностейList of sequences
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Method
идентификации значимых для сельского хозяйства представителей рода identification of representatives of the genus significant for agriculture
Bacillus – B. subtilis, B. megaterium и B. thuringiensis на основе Bacillus – B. subtilis, B. megaterium and B. thuringiensis based on
рестрикционного анализа гена 16S рРНК.xml" softwareName="WIPO restriction analysis of the 16S rRNA gene.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-07-03">Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-07-03">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-03</FilingDate> <FilingDate>2023-07-03</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>16/23</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>16/23</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification> <EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-03</FilingDate> <FilingDate>2023-07-03</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification> </EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal State
бюджетное образовательное учреждение высшего образования budgetary educational institution of higher education
"Воронежский государственный университет"</ApplicantName>"Voronezh State University"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal'noe gosudarstvennoe byudjetnoe <ApplicantNameLatin>Federal'noe gosudarstvennoe byudjetnoe
obrazovatel'noe uchrejdenie vysshego obrazovaniya educational development of higher education
"Voronejskii gosudarstvennyi "Voronejskii gosudarstvennyi
universitet"</ApplicantNameLatin>universitet</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ идентификации значимых для <InventionTitle languageCode="en">A method for identifying significant
сельского хозяйства представителей рода Bacillus – B. subtilis, B. agriculture of representatives of the genus Bacillus – B. subtilis, B.
megaterium и B. thuringiensis на основе рестрикционного анализа гена megaterium and B. thuringiensis based on restriction analysis of the gene
16S рРНК</InventionTitle>16S rRNA</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus spp.</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus spp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gactcctacgggaggcwgcag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gactcctacgggaggcwgcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus spp.</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus spp.</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gggttgcgctcgttg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gggttgcgctcgttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (1)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2822737C1 RU2822737C1 (en) | 2024-07-12 |
| RU2822737C9 true RU2822737C9 (en) | 2024-10-09 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101993953A (en) * | 2010-04-23 | 2011-03-30 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Method for analyzing polymerase chain reaction (PCR)-restricted fragment length polymorphism (RFLP) fingerprint maps of 16s ribosomal deoxyribose nucleic acid (rDNA) of 9 bacillus bacteria in animal fur |
| AU2014202721A1 (en) * | 2007-08-10 | 2014-06-12 | Genomatica, Inc. | Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid |
| RU2021101505A (en) * | 2018-06-26 | 2022-07-26 | Массачусеттс Институт Оф Технолоджи | AMPLIFICATION METHODS, SYSTEMS AND DIAGNOSIS METHODS BASED ON THE CRISPR EFFECTOR SYSTEM |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2014202721A1 (en) * | 2007-08-10 | 2014-06-12 | Genomatica, Inc. | Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid |
| CN101993953A (en) * | 2010-04-23 | 2011-03-30 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Method for analyzing polymerase chain reaction (PCR)-restricted fragment length polymorphism (RFLP) fingerprint maps of 16s ribosomal deoxyribose nucleic acid (rDNA) of 9 bacillus bacteria in animal fur |
| RU2021101505A (en) * | 2018-06-26 | 2022-07-26 | Массачусеттс Институт Оф Технолоджи | AMPLIFICATION METHODS, SYSTEMS AND DIAGNOSIS METHODS BASED ON THE CRISPR EFFECTOR SYSTEM |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5574145A (en) | Isolated nucleic acid molecules targeted to the region intermidiate to the 16S and 23S rRNA genes useful as probes for determining bacteria | |
| Torriani et al. | Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis | |
| Pinto et al. | Identification and typing of food-borne Staphylococcus aureus by PCR-based techniques | |
| Bhide et al. | IS900-PCR-based detection and characterization of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from buffy coat of cattle and sheep | |
| Saxena et al. | RAPD-PCR and 16S rDNA phylogenetic analysis of alkaline protease producing bacteria isolated from soil of India: Identification and detection of genetic variability | |
| KR101869832B1 (en) | A Novel Enterococcus species specific primer, a method for isolating and identifying specific Enterococcus strain by using the same and a composition therefor | |
| Rivas et al. | Rapid identification of Clavibacter michiganensis subspecies sepedonicus using two primers random amplified polymorphic DNA (TP-RAPD) fingerprints | |
| RU2822737C9 (en) | Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus - bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 16s rrna | |
| RU2822737C1 (en) | Method for identification of significant for agriculture representatives of genus bacillus-bacillus subtilis, bacillus megaterium and bacillus thuringiensis based on restriction analysis of gene 165s rrna | |
| JP3525259B2 (en) | Detection of Pectinatus spp. | |
| Swaminathan et al. | Detection of Aeromonas hydrophila by polymerase chain reaction | |
| CN108048586A (en) | A kind of detection method of ox kind Brucella sp attenuated vaccine strain S19 | |
| KR20010072357A (en) | Genes for detecting bacteria and detection method by using the same | |
| RU2642313C1 (en) | Set of primers and method for dickeya solani bacteria determination | |
| Goudarzi et al. | Loop-mediated isothermal amplification: a rapid molecular technique for early diagnosis of Pseudomonas syringae pv. syringae of stone fruits | |
| RU2822738C1 (en) | Method for identifying important for agriculture fungi of the genus trichoderma-trichoderma harzianum, trichoderma viride and trichoderma atroviride based on pcr-rflp | |
| Sadeghi et al. | Design of multiplex PCR for simultaneous detection of rope‐forming Bacillus strains in Iranian bread dough | |
| KR20150143347A (en) | Primer set for high sensitive real-time multiplex loop-mediated isothermal amplification reaction for determining type of shiga toxin genes of Enterohemorrhagic Escherichia coli, and method for determining type of shiga toxin genes of Enterohemorrhagic Escherichia coli using the same | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| KR102655121B1 (en) | A Primer set for specifically detecting Lactobacillus sakei K040706 and uses thereof | |
| JP2003250557A (en) | Method for discriminating of beer by lactobacillus brevis by using gyrase gene | |
| Klaubauf et al. | Research Tools and Methods for the Analysis of Microbiota in Dairy Products | |
| JP3448639B2 (en) | Oligonucleotides and method for identifying lactic acid bacteria using them | |
| US20060110729A1 (en) | Method of dna testing for mycobacterium paratuberculosis strains | |
| KR20250000989A (en) | Primer Pairs for Identification of Bacillus licheniformis K12 and Usage Thereof |