[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2820162C2 - Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента - Google Patents

Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента Download PDF

Info

Publication number
RU2820162C2
RU2820162C2 RU2020119543A RU2020119543A RU2820162C2 RU 2820162 C2 RU2820162 C2 RU 2820162C2 RU 2020119543 A RU2020119543 A RU 2020119543A RU 2020119543 A RU2020119543 A RU 2020119543A RU 2820162 C2 RU2820162 C2 RU 2820162C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
val
variant
pro
ser
lys
Prior art date
Application number
RU2020119543A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020119543A (ru
Inventor
Гарри МЕАДЕ
Селин МОННЕ
Филипп МОНДОН
Original Assignee
Ксл Инновейшн Пти Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1762217A external-priority patent/FR3075200B1/fr
Application filed by Ксл Инновейшн Пти Лтд filed Critical Ксл Инновейшн Пти Лтд
Publication of RU2020119543A publication Critical patent/RU2020119543A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2820162C2 publication Critical patent/RU2820162C2/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к вариантам Fc-фрагментов и способам их рекомбинантного получения в молоке трансгенных животных, и может быть использовано в медицине в лечении воспалительных и аутоиммунных патологий. Предложен вариант Fc-фрагмента IgG1, обладающий повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору Fc (FcR) по сравнению с таковой у референсного Fc-фрагмента IgG1, который включает: мутации 334N, 352S, 378, 397M и 434Y или мутации 296W, 334N, 352S, 378, 397M и 434Y, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat. Изобретение обеспечивает получение вариантов Fc-фрагментов с улучшенной активностью, в частности с улучшенной аффинностью связывания с FcRn, благодаря чему они позволяют повысить эффективность терапевтических продуктов, которые их содержат. Кроме этого предложенные Fc-фрагменты позволяют более эффективно блокировать рецептор FcRn и, таким образом, быстрее устранять аутоантитела, а также имеют лучшее ингибирование комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), чем IVIG, что позволяет снизить токсичность патогенных аутоантител, таких как те, которые участвуют в воспалительных и/или аутоиммунных заболеваниях. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 табл., 7 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептиду (также называемому вариантом), включающему мутированную Fc-область и имеющему повышенную аффинность к рецептору FcRn, а также повышенную аффинность, по меньшей мере, к одному рецептору Fc (FcR) относительно исходного полипептида.
Антитело состоит из тетрамера из тяжелых и легких цепей. Две легкие цепи идентичны друг другу, в то время как две тяжелые цепи идентичны и связаны дисульфидными мостиками. Существует пять типов тяжелых цепей (альфа, гамма, дельта, эпсилон, мю), которые определяют классы иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Группа легких цепей включает два подтипа, лямбда и каппа.
IgG представляют собой растворимые антитела, которые могут быть найдены в крови и других жидкостях организма. IgG представляет собой Y-образный гликопротеин с приблизительной молекулярной массой 150 кДа, состоящий из двух тяжелых и двух легких цепей. Каждая цепь отличается константной областью и вариабельной областью. Два карбоксиконцевых домена тяжелых цепей образуют Fc-фрагмент, в то время как аминоконцевые домены тяжелой и легкой цепей распознают антиген и называются фрагментом Fab.
Гибридные белки с Fc создаются комбинацией Fc-фрагмента антитела с доменом белка, который обеспечивает специфичность к данной терапевтической мишени. Примерами являются комбинации Fc-фрагмента с терапевтическими белками любого типа или их фрагментами.
Fc-полипептиды, в частности Fc-фрагменты, терапевтические антитела и Fc-гибридные белки, используются в настоящее время для лечения различных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз и многие формы рака. Терапевтические антитела могут быть моноклональными или поликлональными антителами. Моноклональные антитела получают из одной линии антителопродуцирующих клеток, которая демонстрирует идентичную специфичность к одному антигену. Терапевтические Fc-гибридные белки используются или разрабатываются в качестве лекарственных средств против аутоиммунных заболеваний и/или воспалительных компонентов, таких как этанерцепт (Enbrel от Amgen, который является Fc-связанным TNF-рецептором) или алефацепт (Amevive от Biogen Idec, который является LFA-3, связанным с Fc-частью IgG1 человека).
Fc-полипептиды, такие как Fc-фрагменты, Fc-антитела и гибридные белки, обладают, в частности, активностью, зависящей от связывания их Fc-части с их рецепторами, т.е. FcRn и рецепторами Fc-фрагмента (FcR), такими как рецепторы FcгRI (CD64), FcгRIIIa (CD16a) и FcгRIla (CD32a).
Одним из желательных эффектов в терапии, включающей взаимодействия Fc-полипептида с рецепторами Fc-фрагмента (FcR), является ингибирование активации иммунной системы путем связывания с Fc-рецепторами на поверхности эффекторных клеток. В частности, в контексте лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, где вовлечены аутоантитела и/или цитокины, терапия на основе Fc может действовать путем блокирования Fc-рецепторов и, таким образом, путем конкуренции с аутоантителами за доступ к этим рецепторам. Это приводит к ингибированию прямой активности, обычно опосредуемой аутоантителами (например, антителозависимой клеточной цитотоксичности, комплемент-зависимой цитотоксичности или антителозависимого клеточного фагоцитоза), и снижению активации иммунной системы, включая высвобождение цитокинов. Кроме того, поскольку рецептор FcRn участвует в рециркуляции антител, блокирование их полипептидами Fc позволяет быстрее устранять аутоантитела, тем самым уменьшая их период полужизни. Вот почему лечение на основе Fc-фрагментов особенно подходит для аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, вызванных неконтролируемой стимуляцией клеток иммунной системы, в частности аутоантителами и/или цитокинами.
Основной терапией, предлагаемой для лечения этих заболеваний, является внутривенная терапия иммуноглобулинами (IVIG или IVIg), которая заключается во внутривенном введении пациентам иммуноглобулинов (чаще всего IgG) из пулов донорной плазмы человека. Общепринято, что эти IgG действуют, в частности, блокируя Fc-рецепторы и, следовательно, конкурируют с аутоантителами за доступ к этим рецепторам. Совсем недавно были разработаны Fc-фрагменты с целью модификации их свойств связывания с Fc-рецептором. Тем не менее, их эффективность еще предстоит продемонстрировать.
По-прежнему существует потребность в оптимизации этих Fc-фрагментов, в частности для увеличения их периода полужизни и/или их терапевтической эффективности.
Заявитель в настоящее время разработал особые Fc-фрагменты, проявляющие улучшенную активность, в частности, благодаря улучшенной аффинности связывания с FcRn. Эти Fc-фрагменты можно использовать в терапии, и они особенно подходят для лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, чтобы повысить эффективность продукта, который их содержит.
В частности, эти фрагменты могут демонстрировать более эффективную блокаду Fc-рецепторов, присутствующих в клетках иммунной системы, которые затем становятся менее или вообще недоступными для связывания аутоантител, активность которых затем ингибируется.
Кроме того, Fc-фрагменты позволяют более эффективно блокировать рецептор FcRn и, таким образом, быстрее устранять аутоантитела.
Кроме того, некоторые из этих конкретных Fc-фрагментов, как продемонстрировано в примерах, имеют лучшее ингибирование комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), чем IVIG. Следовательно, они позволяют снизить токсичность патогенных аутоантител, таких как те, которые участвуют в воспалительных и/или аутоиммунных заболеваниях.
Таким образом, настоящее изобретение относится к варианту исходного полипептида, имеющему оптимизированные свойства, относящиеся к функциональной активности, опосредованной Fc-областью.
Таким образом, настоящее изобретение относится к варианту исходного полипептида, содержащему Fc-фрагмент, причем указанный вариант обладает повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному Fc-рецептору (FcR), выбранному из рецепторов FcгRI. (CD64), FcгRIIIa (CD16a) и FcгRIla (CD32a), относительно такового у исходного полипептида, который отличается тем, что включает:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M; и
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из числа 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K;
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
Согласно одному воплощению вариант по изобретению дополнительно включает, по меньшей мере, одну мутацию (iii) в Fc-фрагменте, выбранную из числа Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T26060, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K29902 , E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, R01A, R01A, R3A, Y300I, Y300I, Y300I R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R и V305S,
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
Такой вариант называется «вариант по изобретению», «мутант по изобретению» или «полипептид по изобретению».
Предпочтительно вариант в соответствии с изобретением обладает как повышенной аффинностью к рецептору FcRn, так и повышенной аффинностью ко всем рецепторам FcгRI (CD64), FcгRIIIa (CD16a) и FcгRIla (CD32a).
Предпочтительно, кроме того, вариант по изобретению способен ингибировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), обусловленную модификацией связывания с белками комплемента, в частности C1q. Это ингибирование значительно улучшено по сравнению с тем, которое дает IVIG.
Предпочтительно вариант по изобретению отличается от варианта, состоящего из Fc-фрагмента, в частности IgG1, имеющего пять мутаций N434Y, K334N, P352S, V397M и A378V и продуцируемого в клетках HEK293, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat. Таким образом, предпочтительно вариант в соответствии с изобретением отличается от Fc-фрагмента, в частности IgG1, N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V, продуцируемых в клетках HEK293, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
В данной заявке нумерация остатков в Fc-области соответствует нумерации тяжелой цепи иммуноглобулина в соответствии с индексом EU или эквиваленту в Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991). Термин «индекс EU или эквивалент в Kabat» относится к нумерации US остатков человеческих антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Это показано на веб-сайте IMGT (http://www.imat.ora/IMGTScientificChart/Numberina/Hu IGHGnber.html).
Под «полипептидом» или «белком» подразумевается последовательность, включающая, по меньшей мере, 100 ковалентно связанных аминокислот.
Под «аминокислотой» подразумевается одна из 20 встречающихся в природе аминокислот или неприродных аналогов.
Термин «положение» означает положение в последовательности полипептида. Для Fc-области положения нумеруются в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat.
Термин «антитела» используется в повседневном смысле. Термин соответствует тетрамеру, который включает, по меньшей мере, одну Fc-область и две вариабельные области. Антитела включают, без ограничения указанным, полноразмерные иммуноглобулины, моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и полностью человеческие антитела. Аминоконцевая часть каждой тяжелой цепи включает вариабельную область примерно от 100 до 110 аминокислот, ответственных за распознавание антигена. В каждой вариабельной области три петли объединяются для образования сайта связывания антигена. Каждая из петель называется областью, определяющей комплементарность (далее называемой «CDR»). Карбоксильная концевая часть каждой тяжелой цепи определяет константную область, которая в первую очередь отвечает за эффекторную функцию.
IgG имеют несколько подклассов, в частности, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Подклассами IgM являются, в частности, IgM1 и IgM2. Таким образом, под «изотипом» подразумевается один из подклассов иммуноглобулинов, определяемый химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известными изотипами иммуноглобулинов человека являются IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE.
Полноразмерные IgG представляют собой тетрамеры и состоят из двух идентичных пар из двух цепей иммуноглобулина, каждая из которых имеет легкую цепь и тяжелую цепь, где каждая легкая цепь включает домены VL и CL, и каждая тяжелая цепь включает домены VH, Cг1 (также называемый CH1), Cг2 (также называемый CH2) и Cг3 (также называемый CH3). В контексте IgG1 человека, «CH1» относится к положениям с 118 по 215, «CH2» относится к положениям с 231 по 340, и «CH3» относится к положениям с 341 по 447 в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat. Тяжелая цепь IgG также включает N-концевой гибкий шарнирный домен, который относится к положениям 216-230 в случае IgG1. Нижний диапазон петель относится к положениям 226-230 в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat.
Под «вариабельной областью» подразумевается область иммуноглобулина, которая включает один или несколько Ig-доменов, в основном кодируемых любым из генов VK, Vл и/или VH, которые составляют тяжелые цепи каппа, лямбда и иммуноглобулина, соответственно. Вариабельные области включают области, определяющие комплементарность (CDR), и каркасные области (FR).
Термин «Fc» или «Fc-область» относится к константной области антитела, исключая первый домен константной области иммуноглобулина (CH1). Таким образом, Fc относится к двум последним доменам (CH2 и CH3) константной области IgG1 и к гибкому N-концевому шарниру этих доменов. Для IgG1 человека Fc-область соответствует остатку С226 на его карбоксиконцевом конце, то есть остаткам в положении 226-447, где нумерация соответствует индексу EU или эквиваленту в Kabat. Используемая Fc-область может дополнительно содержать часть верхней шарнирной области, расположенную между положениями 216-226 в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat; в этом случае используемая Fc-область соответствует остаткам положений с 216 по 447, с 217 по 447, с 218 по 447, с 219 по 447, с 220 по 447, с 221 по 447, с 222 по 447, с 223 по 447, с 224 по 447 или с 225 по 447, где нумерация соответствует индексу EU или эквиваленту в Kabat. Предпочтительно в этом случае используемая Fc-область соответствует остаткам положений с 216 по 447, где нумерация соответствует индексу EU или эквиваленту в Kabat.
Предпочтительно, используемую Fc-область выбирают из последовательностей SEQ ID NO: 1-10 и 14.
Под «исходным полипептидом» подразумевается референсный полипептид. Указанный исходный полипептид может быть природного или синтетического происхождения. В контексте настоящего изобретения родительский полипептид включает Fc-область, называемую «исходной Fc-областью». Эта Fc-область может быть выбрана из группы Fc-областей дикого типа, их фрагментов и мутантов. Предпочтительно исходный полипептид содержит Fc-фрагмент человека, предпочтительно Fc-фрагмент IgG1 человека или IgG2 человека. Исходный полипептид может включать ранее существовавшие аминокислотные модификации в Fc-области (например, мутант Fc) относительно Fc-областей дикого типа.
Преимущественно, родительский полипептид может представлять собой выделенную Fc-область (то есть Fc-фрагмент как таковой), последовательность, полученную из выделенной Fc-области, антитело, фрагмент антитела, содержащий Fc-область, гибридный белок, содержащий Fc-область, или Fc-конъюгат, при этом этот список не является ограничивающим.
Под «последовательностью, полученной из выделенной Fc-области», подразумевается последовательность, содержащая, по меньшей мере, две выделенные Fc-области, связанные вместе, такие как scFc (одноцепочечный Fc) или мультимерный Fc. Под «гибридным белком, включающим Fc-область» подразумевается полипептидная последовательность, объединенная с Fc-областью, причем указанная полипептидная последовательность предпочтительно выбрана из вариабельных областей любого антитела, последовательности, связывающие рецептор с его лигандом, молекулами адгезии, лигандами, ферментами, цитокинами и хемокинами. Под «Fc-конъюгатом» подразумевается соединение, которое является результатом химического связывания Fc-области с партнером по конъюгации. Партнер конъюгации может быть белковым или небелковым. Реакция связывания обычно использует функциональные группы в Fc-области и партнера по конъюгации. В предшествующем уровне техники известны различные связывающие группы, подходящие для синтеза конъюгата; например, гомо- или гетеробифункциональные связующие вещества хорошо известны (см. каталог Pierce Chemical Company, 2005-2006, технический раздел по сшивающим агентам, стр. 321-350). Подходящие партнеры конъюгации включают терапевтические белки, метки, цитотоксические агенты, такие как химиотерапевтические агенты, токсины и их активные фрагменты. Подходящие токсины и их фрагменты включают токсин дифтерии, экзотоксин A, рицин, абрин, сапорин, гелонин, калихеолин, ауристатин E и F и мертанзин.
Преимущественно исходный полипептид - и, следовательно, полипептид по изобретению - состоит из Fc-области.
Преимущественно, исходный полипептид - и, следовательно, полипептид по изобретению - представляет собой антитело.
Под «мутацией» подразумевается изменение, по меньшей мере, одной аминокислоты в последовательности полипептида, включая изменение, по меньшей мере, одной аминокислоты в Fc-области исходного полипептида. Полученный таким образом мутированный полипептид представляет собой вариант полипептида; это полипептид по изобретению. Такой полипептид включает мутированную Fc-область относительно исходного полипептида. Предпочтительно мутация представляет собой замену, вставку или делецию, по меньшей мере, одной аминокислоты.
Под «заменой» подразумевается замена аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена N434S относится к варианту полипептида, в данном случае к варианту, для которого аспарагин в положении 434 заменен серином.
Под «аминокислотной вставкой» или «вставкой» подразумевается добавление аминокислоты в определенном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, вставка G> 235-236 относится к вставке глицина между положениями 235 и 236.
Под «делецией аминокислоты» или «делецией» подразумевается делеция аминокислоты в конкретном положении в последовательности исходного полипептида. Например, E294del относится к удалению глутаминовой кислоты в положении 294.
Предпочтительно используется следующая метка мутации: «434S» или «N434S» и означает, что родительский полипептид содержит аспарагин в положении 434, который в варианте заменен серином. В случае комбинации замен предпочтительным форматом является «259I/315D/434Y» или «V259I/N315D/N434Y». Это означает, что в варианте имеются три замены в положениях 259, 315 и 434 и что аминокислота в положении 259 исходного полипептида, т.е. валин, заменена изолейцином, а аминокислота в положении 315 исходного полипептид, аспарагин, заменена аспарагиновой кислотой, а аминокислота в положении 434 исходного полипептида, аспарагина, заменена тирозином.
Используемый в данном документе термин «FcRn» или «неонатальный Fc-рецептор» означает белок, который связывается с Fc-областью IgG и кодируется, по меньшей мере, частично геном FcRn. Как известно в данной области, функциональный белок FcRn включает два полипептида, которые часто называют тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, тогда как тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если не указано иное, белок FcRn или FcRn относится к комплексу б-цепи с бета-2-микроглобулином. У человека ген, кодирующий FcRn, называется FCGRT.
Предпочтительно вариант в соответствии с изобретением имеет повышенную аффинность к рецептору FcRn по сравнению с аффинностью исходного полипептида с отношением, по меньшей мере, равным 2, предпочтительно более 5, более предпочтительно более 10, еще более предпочтительно более 15, особенно предпочтительно более 20, еще более предпочтительно более 25, наиболее предпочтительно более 30.
Предпочтительно вариант по изобретению имеет увеличенный период полужизни по сравнению с вариантом исходного полипептида. Предпочтительно вариант в соответствии с изобретением имеет увеличенный период полужизни по сравнению с периодом полужизни исходного полипептида с отношением, по меньшей мере, равным 2, предпочтительно более 5, более предпочтительно более 10, еще более предпочтительно более 15, особенно предпочтительно более 20, еще более особенно предпочтительно более 25, наиболее предпочтительно более 30.
Одна из основных функций FcRn известна как рециркуляция IgG. Он состоит из извлечения IgG из пути эндотелиального катаболизма белков плазмы с целью восстановления их интактными для кровообращения. Это повторное использование объясняет их период полужизни в нормальных физиологических условиях (три недели для IgG), в то же время поддерживая высокие концентрации в плазме. Трансцитоз IgG от одного полюса к другому эпителия или эндотелия является второй основной функцией FcRn, обеспечивающей их биораспределение в организме.
Предпочтительно вариант по изобретению обладает повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному рецептору Fc-фрагмента (FcR), выбранному из рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16b) и FcγRIIa (CD32b), по сравнению с таковым у родительского полипептида с соотношением, по меньшей мере, равным 2, предпочтительно более 5, более предпочтительно более 10, еще более предпочтительно более 15, особенно предпочтительно более 20, еще более особенно предпочтительно более 25, наиболее предпочтительно более 30.
Рецептор FcгRI (CD64) участвует в фагоцитозе и активации клеток. Рецептор FcгRIIIa (CD16a) также участвует в Fc-зависимой активности, включая ADCC и фагоцитоз; он имеет полиморфизм V/F в положении 158. Рецептор FcгRIIa (CD32a), в свою очередь, участвует в активации тромбоцитов и фагоцитозе; он имеет H/R-полиморфизм в положении 131.
Предпочтительно вариант по изобретению обладает как повышенной аффинностью к рецептору FcRn, так и повышенной аффинностью ко всем рецепторам FcгRI (CD64), FcгRIIIa (CD16б) и FcгRIla (CD32б).
Аффинность полипептида, содержащего Fc-область к FcR, можно оценить способами, хорошо известными из уровня техники. Например, специалисты в данной области могут определить аффинность (Kd), используя поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В ином случае специалисты в данной области могут выполнить соответствующий тест ELISA. Соответствующий анализ ELISA сравнивает силы связывания исходного Fc и мутированного Fc. Специфические обнаруженные сигналы для мутированного Fc и исходного Fc сравниваются. Аффинность связывания может быть независимо определена путем оценки целых полипептидов или оценки их выделенных Fc-областей. В ином случае специалисты в данной области могут выполнить соответствующий конкурентный анализ. Соответствующий конкурентный анализ используется для определения способности мутированного Fc ингибировать связывание меченого лиганда FcR, когда они инкубируются одновременно с клетками, экспрессирующими эти рецепторы. Связывание меченого лиганда с FcR можно оценить, например, с помощью проточной цитометрии. Аффинность связывания Fc, мутированного при FcR, затем определяют путем оценки изменчивости средней интенсивности флуоресценции, испускаемой меченым лигандом, связанным с FcR.
Предпочтительно мутированная Fc-область полипептида по изобретению содержит от 3 до 20 мутаций относительно исходного полипептида, предпочтительно от 4 до 20 мутаций. Под «от 3 до 20 аминокислотных модификаций» подразумеваются 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 аминокислотных мутаций. Предпочтительно она включает от 4 до 15 мутаций, более предпочтительно от 4 до 10 мутаций относительно исходного полипептида.
Еще более предпочтительно, мутированная Fc-область полипептида по изобретению может включать, по меньшей мере, одну комбинацию из 5 мутаций, причем указанная комбинация включает четыре мутации (i), как описано выше, и, по меньшей мере, одну мутацию (ii), как описано выше, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквивалентной в Kabat.
Еще более предпочтительно, мутированная Fc-область полипептида по изобретению включает комбинацию из 6 мутаций, причем указанная комбинация включает четыре мутации (i), как описано выше, по меньшей мере, одну мутацию (ii), как описано выше, и, по меньшей мере, одну мутацию (iii), как описано выше, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
Предпочтительно, мутированная Fc-область полипептида по изобретению включает следующие мутации:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M;
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из числа 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K; и
когда присутствует мутация (iii), она выбрана из K290G и Y296W, где нумерация соответствует индексу EU или эквиваленту в Kabat.
Предпочтительно, мутированная Fc-область полипептида по изобретению включает следующие мутации:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M;
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K; и
(iii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из K290G и Y296W,
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
Предпочтительно, мутированная Fc-область полипептида по изобретению включает комбинацию мутаций, выбранных из комбинаций: N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V и N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W.
Предпочтительно полипептид по изобретению продуцируется в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком.
Предпочтительно полипептид по изобретению продуцируется у трансгенных животных, не являющихся человеком, предпочтительно у трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, более предпочтительно в их эпителиальных клетках молочной железы.
Под «трансгенным млекопитающим, не являющимся человеком» подразумевается млекопитающее, выбранное, в частности, из крупного рогатого скота, свиней, коз, овец и грызунов, предпочтительно из козы, мыши, свиньи, кролика, овцы и коровы. Предпочтительно трансгенное животное, не являющееся человеком, или трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, представляет собой трансгенную козу.
Предпочтительно, вариант по изобретению включает, по меньшей мере, пять мутаций N434Y, K334N, P352S, V397M и A378V в его Fc-фрагменте и продуцируется в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, или у трансгенных животных, не являющихся человеком, предпочтительно у трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, таких как коза. Такой вариант обладает как повышенной аффинностью к рецептору FcRn, так и повышенной аффинностью ко всем рецепторам FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIa (CD32a).
Таким образом, предпочтительно, вариант по изобретению представляет собой вариант Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V, полученный в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком. В ином случае предпочтительно, вариант по изобретению представляет собой вариант Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V, полученный у трансгенных животных, не являющихся человеком, предпочтительно у трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, таких как коза. Такой вариант обладает как повышенной аффинностью к рецептору FcRn, так и повышенной аффинностью ко всем рецепторам FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16b) и FcγRIIa (CD32b). Предпочтительно, вариант по изобретению включает последовательность SEQ ID NO: 11 или последовательность SEQ ID NO: 15.
В ином случае предпочтительно, вариант по изобретению представляет собой вариант Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W, продуцируемый в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком. В ином случае предпочтительно, вариант по изобретению представляет собой вариант Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W, полученный у трансгенных животных, не являющихся человеком, предпочтительно у трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, таких как коза. Такой вариант обладает как повышенной аффинностью к рецептору FcRn, так и повышенной аффинностью ко всем рецепторам FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16b) и FcγRIIa (CD32b).
Предпочтительно способ получения варианта по изобретению включает экспрессию указанного варианта в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения варианта исходного полипептида, содержащего Fc-фрагмент, причем указанный вариант обладает повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из числа рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIla (CD32a) относительно такового у исходного полипептида, причем указанный вариант включает:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M; и
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K; и
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat,
указанный способ включает экспрессию указанного варианта в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком.
Предпочтительно, указанный вариант дополнительно включает, по меньшей мере, одну мутацию (iii) в Fc-фрагменте, выбранном из Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242I, L242I, L242I, L242 L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T2602, T260S, T2605 V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, E292, E293, R293G, R293G E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R3010, R30330, R3013, R30330, R3303, V30330 , V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R и V305S, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
В частности, такой способ включает следующие стадии:
а) получения последовательности ДНК, содержащей последовательность, кодирующую вариант, последовательность, кодирующую промотор казеина млекопитающего или промотор сыворотки млекопитающего, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта;
b) введения последовательности ДНК, полученной в а), в эмбрион млекопитающего, не являющегося человеком, для получения трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, экспрессирующего вариант, кодируемый указанной последовательностью ДНК, полученной в а), в молочной железе; и
c) извлечения варианта в молоке, продуцированном трансгенным млекопитающим, не являющимся человеком, полученным в b).
Стадия а), таким образом, включает получение последовательности ДНК, содержащей последовательность, кодирующую вариант, последовательность, кодирующую промотор казеина млекопитающего или промотор сыворотки млекопитающего, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид, позволяющий осуществить секрецию указанного варианта. Такая стадия проиллюстрирована на Фигуре 1.
Последовательность, кодирующая вариант, представляет собой последовательность ДНК, кодирующую вариант по изобретению.
Например, этот вариант имеет последовательность SEQ ID NO: 11. С сигнальным пептидом соответствующая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO: 13.
В другом примере этот вариант имеет последовательность SEQ ID NO: 15. С сигнальным пептидом соответствующая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO: 16.
Кодирующая последовательность для промотора казеина млекопитающего или промотора сыворотки млекопитающего позволяет экспрессировать вариант в молоке. Специалисты в данной области техники знают, как выбрать такой промотор.
В контексте настоящей заявки сигнальный пептид представляет собой аминокислотную последовательность, предпочтительно от 2 до 30 аминокислот, расположенную на N-конце варианта Fc-полипептида, служащую для данного пептида направления в молоко млекопитающего. Предпочтительно кодирующая последовательность для сигнального пептида находится между последовательностью, кодирующей вариант, и промотором. Без такой последовательности вариант останется в ткани молочной железы, где очистка будет затруднена и потребует убийства животного-хозяина. Сигнальный пептид может быть отщеплен при секреции. Кодирующая последовательность для пептидного сигнала может представлять собой последовательность, которая естественным образом связана с исходным полипептидом по изобретению. В ином случае кодирующая последовательность для сигнального пептида может быть последовательностью молочного белка, из которого получен промотор, т.е. когда ген молочного белка переваривается для выделения промотора, выбирается фрагмент ДНК, содержащий как промотор, так и кодирующий последовательность сигнального пептида непосредственно ниже промотора. Другой альтернативой является применение сигнальной последовательности, полученной из другого секретируемого белка, который не является ни молочным белком, обычно экспрессируемым с промотора, ни полипептидом по изобретению.
Предпочтительно, сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 12.
Используемая последовательность ДНК может включать оптимизированные кодоны.
Целью оптимизации кодонов является замена природных кодонов кодонами, у которых транспортная РНК (тРНК), несущая аминокислоты, является наиболее распространенной в рассматриваемом типе клеток. Мобилизация часто встречающихся тРНК имеет главное преимущество в увеличении скорости трансляции мессенджерных РНК (мРНК) и, следовательно, в увеличении конечного титра (Carton, J.M. et al., Protein Expr Purif, 2007). Оптимизация последовательности также играет роль в прогнозировании вторичных структур мРНК, которые могут замедлять считывание рибосомным комплексом. Оптимизация последовательности также оказывает влияние на процент G/C, который напрямую связан с периодом полужизни мРНК и, следовательно, с их потенциалом для трансляции (Chechetkin, J. of Thetical Biology 242, 2006, 922-934).
Оптимизация кодонов может осуществляться путем замены природных кодонов с использованием таблиц частот кодонов (Таблица использования кодонов) для млекопитающих и, более конкретно, для Homo sapiens. Существуют алгоритмы, доступные в интернете, и предоставляемые поставщиками синтетических генов (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript), которые делают возможной такую оптимизацию последовательности.
Предпочтительно стадия а) включает следующие стадии:
(а1) получения последовательности ДНК, содержащей последовательность, кодирующую вариант в соответствии с изобретением, непосредственно слитый на своем N-конце с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта;
(а2) введения последовательности ДНК, полученной в (а1), в вектор, включающий последовательность, кодирующую промотор казеина млекопитающего или промотор сыворотки млекопитающего;
(а3) гидролиза указанного вектора, полученного в (а2), для получения последовательности ДНК, включающей последовательность, кодирующую промотор казеина млекопитающего или промотор сыворотки млекопитающего, и последовательность ДНК, содержащую последовательность, кодирующую вариант изобретения, непосредственно слитую с N-концом кодирующей последовательности сигнального пептида.
Другими словами, предпочтительно, в конце стадии а), мы получаем последовательность ДНК, содержащую от N- до С-конца кодирующую последовательность для промотора казеина млекопитающего или промотора молочной сыворотки млекопитающего, объединенную с кодирующей последовательностью сигнального пептида, которая в свою очередь объединена с кодирующей последовательностью варианта по изобретению.
Затем способ по изобретению включает стадию b) введения последовательности ДНК, полученной на стадии а), в эмбрион млекопитающего, не являющегося человеком, для получения трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, экспрессирующего вариант, кодируемый указанной последовательностью, полученной ДНК в а), в молочной железе.
Наконец, способ в соответствии с изобретением включает стадию с) выделения варианта в молоке, продуцируемого трансгенным млекопитающим, не являющимся человеком, полученным на стадии b).
Стадии b) и c) известны из уровня техники, в частности патента EP0264166.
Предпочтительно такой способ включает, после стадии с), стадию очистки d) извлеченного молока. Стадия очистки d) может быть осуществлена любым известным способом предшествующего уровня техники, в частности очисткой на протеине А. И опять-таки, подобная стадия описана, в частности, в патенте ЕР 0264166.
Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, содержащей ген, кодирующий вариант исходного полипептида, включающего Fc-фрагмент, причем указанный вариант обладает повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному выбранному фрагменту рецептора Fc (FcR) из числа рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16b) и FcγRIIa (CD32b) относительно такового у исходного полипептида, причем указанный вариант включает:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M; и
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K;
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat,
причем указанный ген находится под контролем транскрипционного промотора казеина или сыворотки млекопитающего, который естественным образом не контролирует транскрипцию указанного гена, причем указанная последовательность ДНК дополнительно включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта, расположенную между последовательностью, кодирующей вариант и промотер.
В конкретном воплощении указанный вариант дополнительно включает, по меньшей мере, одну мутацию (iii) в Fc-фрагменте, выбранную из числа Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R и V305S где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, включающей ген, кодирующий вариант исходного полипептида, содержащего Fc-фрагмент, причем указанный вариант обладает повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному фрагменту рецептора Fc (FcR), выбранному из числа рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16b) и FcγRIIa (CD32b) относительно такового у исходного полипептида, причем указанный вариант включает:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M; и
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K;
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat,
указанная последовательность ДНК необязательно включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта.
В конкретном воплощении указанный вариант дополнительно включает, по меньшей мере, одну мутацию (iii) в Fc-фрагменте, выбранную из числа Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R и V305S, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
В ином случае полипептид по изобретению может быть продуцирован в культивируемых клетках млекопитающих. Предпочтительными клетками являются линия крыс YB2/0, линия хомяка CHO, в частности линии CHO dhfr- и CHO Lec13, клетки PER C6™ (Crucell), клетки NSO, SP2/0, HeLa, BHK или COS, клетки HEK293. Предпочтительно используется линия хомяка СНО.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения варианта исходного полипептида, содержащего Fc-фрагмент, причем указанный вариант обладает повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью, по меньшей мере, к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из числа рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIla (CD32a) относительно такового у исходного полипептида, причем указанный вариант включает:
(i) четыре мутации 334N, 352S, 378V и 397M; и
(ii) по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T и 389K; и
где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat, а указанный способ включает экспрессию указанного варианта в клетках млекопитающих в культуре.
В конкретном воплощении указанный вариант дополнительно включает, по меньшей мере, одну мутацию (iii) в Fc-фрагменте, выбранную из числа Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291G, P291Q, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R и V305S, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
В частности, такой способ включает следующие стадии:
а) получения последовательности ДНК, кодирующей вариант;
b) введения последовательности ДНК, полученной в а), в клетки млекопитающих в культуре. Введение может проводиться транзиторно или стабильно (то есть интеграция последовательности ДНК, полученной в а), в геном клеток); и
с) экспрессии варианта из клеток, полученных в b), затем
d) возможно, извлечения варианта в культуральной среде.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей (i) полипептид по изобретению и (ii), по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель.
Задачей настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, включающая (i) вариант, состоящий из Fc-фрагмента, в частности IgG1, демонстрирующего пять мутаций N434Y, K334N, P352S, V397M и A378V, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat и (ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению включает (i) вариант, состоящий из Fc-фрагмента, в частности IgG1, имеющего шесть мутаций N434Y, K334N, P352S, V397M и A378V, Y296W, нумерация которых соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat и (ii) по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель.
Задачей настоящего изобретения также является полипептид по изобретению или композиция, как описано выше, для его применения в качестве лекарственного средства.
Задачей настоящего изобретения также является применение варианта, состоящего из Fc-фрагмента, в частности IgG1, демонстрирующего пять мутаций N434Y, K334N, P352S, V397M и A378V, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat (т.е. варианта N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V) в качестве лекарственного средства. В конкретном воплощении задачей настоящего изобретения также является применение варианта, состоящего из Fc-фрагмента, в частности IgG1, демонстрирующего шесть мутаций N434Y, Y296W, K334N, P352S, V397M, A378V и Y296W, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat (т.е. варианта N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W) в качестве лекарственного средства.
Как указано выше, преимущественно, родительский полипептид - и, следовательно, полипептид по изобретению - представляет собой антитело. В этом случае антитело может быть направлено против антигена, выбранного из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, грибного антигена, токсина, мембранного или циркулирующего цитокина и мембранного рецептора.
Когда антитело направлено против опухолевого антигена, его применение особенно подходит для лечения рака. Под «раком» подразумевается любое физиологическое состояние, характеризующееся аномальной пролиферацией клеток. Примеры рака включают карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы (включая липосаркомы), нейроэндокринные опухоли, мезотелиомы, менингиомы, аденокарциномы, меланомы, лейкозы и лимфоидные злокачественные новообразования, причем этот список не является исчерпывающим.
Когда антитело направлено против вирусного антигена, его применение особенно полезно при лечении вирусных инфекций. Вирусные инфекции включают инфекции, вызванные HIV, ретровирусом, вирусом Коксаки, вирусом оспы, гриппом, желтой лихорадкой, лихорадкой Западного Нила, цитомегаловирусом, ротавирусом или гепатитом В или С, причем этот список не является исчерпывающим.
Когда антитело направлено против токсина, его применение особенно полезно при лечении бактериальных инфекций, например, инфекций столбнячным токсином, дифтерийным токсином, токсинами сибирской язвы Bacillus anthracis или при лечении инфекций ботулиническими токсинами, риксиновыми токсинами, шигатоксинами, причем этот список не является исчерпывающим.
Когда антитело направлено против цитокина, его применение особенно подходит для лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний. Воспалительные и/или аутоиммунные заболевания включают тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), отторжение трансплантата и органа, болезнь трансплантат против хозяина, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, различные виды склероза, синдром первичного Шегрена (или синдром Гугерота-Сьюгена), аутоиммунный синдром, полиневропатии, такие как рассеянный склероз, диабет I типа, аутоиммунный гепатит, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, подагрический артрит, целиакию, болезнь Крона, хронический тиреоидит Хашимото (гипотиреоз), болезнь Адиссона, аутоиммунный гепатит, Базедову болезнь (гипертиреоз), язвенный колит, васкулит и системный васкулит, связанные с ANCA (анти-цитоплазматические антитела к нейтрофилам), аутоиммунную цитопению и другие гематологические осложнения у взрослых и детей, такие как острая или хроническая аутоиммунная тромбоцитопения, аутоиммунные гемолитические анемии, гемолитическая болезнь новорожденных (MHN), болезнь холодовых агглютининов, аутоиммунную гемофилию; синдром Гудпасчера, экстрамембранозные нефропатии, аутоиммунные буллезные кожные заболевания, рефрактерную миастению, смешанную криоглобулинемию, псориаз, ювенильный хронический артрит, воспалительный миозит, дерматомиозит и системные аутоиммунные нарушения у ребенка, включая антифосфолипидный синдром, заболевание соединительной ткани, легочное аутоиммунное воспаление, синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию (PDCI), аутоиммунный тиреоидит, меллит, миастению, воспалительное аутоиммунное заболевание глаза, нейромиелит зрительного нерва (болезнь Девика), склеродермию, пузырчатку, инсулинорезистентный диабет, полимиозит, анемия Бирмера, гломерулонефрит, болезнь Вегенера, Хортон, узловой периартрит и синдром Чёрга-Страусс, Болезнь Стилла, атрофический полихондрит, болезнь Бехчета, моноклональную гаммопатию, гранулематоз Вегенера, волчанку, язвенный колит, псориатический артрит, саркоидоз, коллагенозный колит, герпетиформный дерматит, семейную средиземноморскую лихорадку, гломерулонефрит IgA, миастенический синдром Ламберта-Итона, симпатическую офтальмию, синдром Фиссингера-Леруа-Рейтера и увео-менингоэнцефалический синдром.
Также включены другие воспалительные заболевания, такие как острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), острый септический артрит, адъювантный артрит, аллергический энцефаломиелит, аллергический ринит, аллергический васкулит, аллергия, астма, атеросклероз, хроническое воспаление вследствие хронических бактериальных или вирусных инфекций, хронические обструктивная болезнь легких (COPD), ишемическая болезнь сердца, энцефалит, воспалительное заболевание кишечника, воспалительный остеолиз, воспаление, связанное с реакциями острой и замедленной гиперчувствительности, воспаление, связанное с опухолями, повреждение периферических нервов или демиелинизирующие заболевания, воспаление, связанное с травмой ткани, такой как ожоги и ишемия, воспаление вследствие менингита, синдром полиорганной недостаточности (синдром полиорганной дисфункции, MODS), легочный фиброз, сепсис и септический шок, синдром Стивенса-Джонсона, недифференцированный артрит и недифференцированные спондилоартропатии. В конкретном воплощении изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой идиопатическую тромботическую пурпуру (ITP) и хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию (CIDP).
Предпочтительно, аутоиммунная или воспалительная патология выбрана из иммунологической тромбоцитопенической пурпуры (также называемой идиопатической тромбоцитопенической пурпурой или ITP), нейромиелита зрительного нерва или девиантного заболевания (NMO) и рассеянного склероза. Рассеянный склероз и, в частности, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) изучается благодаря модели.
Последовательности, описанные в этой заявке, могут быть обобщены следующим образом:
SEQ ID NO: Белок Последовательность
1 Fc-область IgG1 человека G1m1,17 (остатки 226-447 по индексу EU или эквиваленту в Kabat) без N-концевой области верхнего шарнира CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2 Fc-область IgG2 человека без N-концевой области верхнего шарнира CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3 Fc-область человеческого IgG3 без N-концевой области верхнего шарнира CPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
4 Fc-область человеческого IgG4 без N-концевой области верхнего шарнира CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
5 Fc-область IgG1 человека G1m3 без N-концевой области верхнего шарнира CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6 Fc-область человеческого d’IgG1 G1m1,17 с N-концевой областью верхнего шарнира (остатки 216-447 в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat) EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7 Fc-область IgG2 человека с N-концевой областью верхнего шарнира ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8 Fc-область человеческого IgG3 с N-концевой областью верхнего шарнира ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
9 Fc-область человеческого IgG4 с N-концевой областью верхнего шарнира ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
10 Fc-область IgG1 человека G1m3 с N-концевой областью верхнего шарнира EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11 Вариант Fc A3A-184AY DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
12 Сигнальный пептид MRWSWIFLLLLSITSANA
13 Вариант Fc A3A-184AY с сигнальным пептидом
(то есть объединение SEQ ID NO: 12 с SEQ ID NO: 11)		 MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
14 Fc-область IgG1 человека G1m1,17 с остатками 221-447 в соответствии с индексом EU или эквивалентом в Kabat DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 Вариант Fc A3A-184EY DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
16 Вариант Fc A3A-184EY с сигнальным пептидом
(т.е. объединение SEQ ID NO: 12 с SEQ ID NO: 15)		 MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
Настоящее изобретение будет лучше понято при прочтении следующих примеров.
Ниже приведены подписи к чертежам:
Фигура 1. Получение варианта A3A-184AY в козьем молоке и мыши с использованием вектора Bc451
A) Вектор бета-казеина, Bc451, гидролизовали с помощью XhoI.
В векторе Bc451 фрагмент NotI-NotI является прокариотическим фрагментом. NotI-фрагмент (15730) - XhoI представляет собой 3'-геномную последовательность, которая содержит сигнал polyA. Фрагмент BamHI - XhoI является промоторной областью бета-казеина.
B) Фрагмент SalI, содержащий вариантную кодирующую Fc-область A3A-184AY (то есть FC3179 A3A-184AY 884 п.н.), вставляли в вектор для создания генной конструкции BC3180 FC A3A-184AY (C).
D) Затем выделяли из прокариотического вектора фрагмент ДНК для микроинъекции. Для этого BC3180 гидролизовали NotI и NruI. Фрагмент размером 16,4 т.п.н., содержащий ген Fc (кодирующий вариант A3A-184AY) под контролем промотора бета-казеина, затем очищали гель-элюцией.
Фигура 2. Результаты тестов на модельном артрите, вызванном переносом сыворотки мыши K/BxN
Заболевание вызывали путем внутривенного введения 10 мл мышиной сыворотки K/BxN мышам D0 C57/BI/6J. Тестируемые молекулы вводили однократно внутрибрюшинно в D0, 2 ч до введения мышиной сыворотки K/BxN.
Клинический балл получали путем суммирования индекса четырех ног:
0 = нормальный, 1 = отек сустава, 2 = отек более чем одного сустава и 3 = сильный отек всего сустава (произвольные единицы).
Фигура 3. Результаты испытаний на терапевтической модели артрита, вызванного переносом мышиной сыворотки K/BxN
Заболевание вызывали путем внутривенного введения 10 мл мышиной сыворотки K/BxN мышам D0 C57/BI/6J. Тестируемые молекулы вводили однократно внутрибрюшинно в D0, через 72 часа после инъекции мышиной сыворотки K/BxN (показано пунктирными линиями).
Клинический балл получали путем суммирования индекса четырех ног:
0 = нормальный, 1 = отек сустава, 2 = отек более чем одного сустава и 3 = сильный отек всего сустава (произвольные единицы).
Фигура 4. Результаты испытаний связывания Fc и IqlV с санитарными клетками
Варианты Ig1V или Fc по изобретению, меченные Alexa, инкубировали при 65 нМ (10 мкг/мл для Fc в 2% CSF PBS) с клетками-мишенями в течение 20 минут на льду. После 2 промывок в 2% CSF клетки суспендировали в 500 мл Isoflow перед анализом методом проточной цитометрии.
Результаты приведены ниже:
А) В-клетки, меченные анти-CD19 («% положительных В-клеток»);
B) NK-клетки, меченные анти-CD56 («% положительных NK-клеток»);
C) моноциты, меченные анти-CD14, в присутствии IglV («% положительных клеток + IglV»);
D) моноциты CD16+, меченные анти-CD14 и анти-CD16 3G8 антителом, в присутствии Ig1V («% положительных клеток + IglV»);
E) нейтрофилы, меченные анти-CD15, в присутствии IglV («% положительных клеток + IglV»);
F) NK-клетки, меченные анти-CD56, в присутствии IgG или Fc WT («% положительных клеток»).
Фигура 5. Результаты тестов ADCC, активация клеток Jurkat CD64 и CDC
А) Ингибирование активации клеток Jurkat CD64:
Клетки Raji (50 мл при 5 Ч 106 клеток/мл) смешивали с ритуксаном (от 50 мл до 2 Ч 9/мл), клетками Jurkat, экспрессирующими CD64 человека (Jurkat-H-CD64) (25 мл при 5 Ч 106 клеток/мл), PMA (50 мл до 40 нг/мл), затем инкубировали с IgV или вариантом по изобретению (RFC A3A-184AY) при 1950 нМ.
После ночи инкубации планшеты центрифугировали (125 g в течение 1 минуты) и IL2, содержащийся в надосадочной жидкости, оценивали с помощью ELISA.
Результаты выражали в процентах по отношению к IglV в соответствии со следующей формулой: (IL-2 IglV/IL-2 образца) X100.
B) Ингибирование ADCC:
Эффекторные клетки (мононуклеарные клетки) (25 мл при 8 Ч 107 клеток/мл) и резус-положительные эритроциты (25 мл при 4 Ч 107 клеток/мл в конечном итоге) инкубировали с различными концентрациями (от 0 до 75 нг/мл) анти-Rh-антитела D с соотношением эффектор/мишень 2/1. После 16 часов инкубации лизис оценивали путем количественного определения гемоглобина, высвобождаемого в надосадочную жидкость, с использованием специфического субстрата (DAF).
Результаты выражены в процентах от специфического лизиса как функции количества антитела. Ингибирование ADCC индуцировали вариантом IgG или Fc по изобретению (RFC A3A-184AY), добавленными при 33 нМ.
Результаты выражены в процентах, где 100% и 0% представляют собой значения, полученные с IglV при 650 нМ и 0 нМ, соответственно, согласно следующей формуле:
[(ADCC с 33 нМ образцом - ADCC без IVIg)/(ADCC с IglV при 33 нМ - ADCC без IVIg) x100].
В) Ингибирующая активность CDC:
Клетки Raji инкубировали в течение 30 минут с конечной концентрацией 50 нг/мл ритуксимаба. Добавляли раствор молодой кроличьей сыворотки, разведенной на 1/10 и предварительно инкубированной с вариантом Fc по изобретению (rFc A3A-184AY) или IgV (объем/объем) в течение 1 часа при 37°C. После 1 часа инкубации при 37°C планшеты центрифугировали (125 г в течение 1 минуты) и оценивали CDC путем измерения внутриклеточного LDH, высвобождаемого в культуральную среду. Результаты выражали в процентах ингибирования и сравнивали с IgG и отрицательным контролем (Fc без функции Fc, т.е. rFc neg), 100% соответствовали полному ингибированию литической активности и 0% соответствовали контрольному значению, полученному без Fc или IglV.
Фигура 6. Результаты тестов на связывание клеток
Варианты IglV, Fc-Rec (Fc дикого типа), Fc MST-HN или Fc по изобретению (A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO), меченные Alexa-Fluor®, инкубировали при 65 нМ (10 мкг/мл) для Fc в 2% CSF (колониестимулирующий фактор) PBS с клетками-мишенями в течение 20 минут на льду. После 2 промывок в 2% CSF PBS клетки суспендировали в 500 мкл Isoflow перед анализом проточной цитометрией. Испытания проводили на следующих клетках-мишенях:
- клетки-естественные киллеры (NK), меченные анти-CD56;
- моноциты, меченные анти-CD14;
- моноциты CD16+, меченные антителом анти-CD14 и анти-CD16 3G8;
- нейтрофилы, меченные анти-CD15.
Фигура 7. Результаты испытаний на модели идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) in vivo
Заболевание индуцировали у мышей, экспрессирующих гуманизированный FcRn, путем внутривенного введения анти-тромбоцитарного антитела 6A6-hlgG1 (0,3 пг/г массы тела) для истощения кровяных пластинок, также называемых тромбоцитами, у мышей. Отрицательный контроль («CTL PBS»), IglV (1000 мг/кг), Fc-Rec (Fc-wild) фрагмент (380 и 750 мг/кг), Fc MST-HN фрагмент (190 мг/кг) и вариант Fc A3A-184AY по изобретению (190 мг/кг и 380 мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 2 часа до истощения тромбоцитов. Количество тромбоцитов определяли с помощью гематологической системы Advia (Bayer). Количество тромбоцитов до введения антител принимали за 100% уровень.
Примеры
Пример 1. Получение вариантов (мутированных Fc-фрагментов) по изобретению, полученных в молоке трансгенных животных, и исследование указанных вариантов.
I. Материалы и методы
Основные положения:
Fc-фрагмент по изобретению может быть получен в молоке трансгенных животных путем помещения кодирующей последовательности Fc-фрагмента в специфичный вектор для экспрессии в молоко. Вектор может быть введен в геном трансгенной мыши или козы путем микроинъекции. После скрининга и идентификации животного с трансгеном самок размножали. После родов доение самок позволяет извлечь их молоко, в котором Fc может секретироваться после экспрессии специфического промотора молока.
Белковая последовательность варианта Fc A3A-184AY (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)
Сигнальный пептид (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO: 12) связывается с N-концом последовательности белка, и таким образом получается последовательность SEQ ID NO: 13. Это делает возможной секрецию белка в молоке, после его экспрессии.
Оптимизация нуклеотидной последовательности:
Нуклеотидная последовательность была оптимизирована для экспрессии в молочной железе козы. Для этого последовательность была оптимизирована для видов Bos taurus по алгоритму поставщика синтетических генов (такого как GeneArt).
Экспрессирующий вектор:
Экспрессирующий вектор бета-казеина козы (Bc451) использовали для получения варианта A3A-184AY в мышином и козьем молоке (см. фигуру 1).
Вектор бета-казеина, Bc451, гидролизовали с помощью XhoI (фигура 1А). Фрагмент SalI, содержащий вариантную кодирующую Fc-область A3A-184AY, вставляли для создания генной конструкции BC3180 FC A3A-184AY (фигуры 1B и 1C).
Затем фрагмент ДНК для микроинъекции выделяли из прокариотического вектора.
BC3180 гидролизовали NotI и NruI (фигура 1D). Высвобожденный фрагмент размером 16,4 т.п.н., содержащий ген Fc под контролем промотора бета-казеина, затем очищали гель-элюцией. Эту ДНК затем использовали на стадии микроинъекции.
Продуцирование в мыши:
Фрагмент ДНК вставляли путем микроинъекции в предимплантационные эмбрионы мыши. Затем эмбрионы имплантировали псевдобеременным самкам. Родившиеся потомки подвергали скринингу на наличие трансгена с помощью анализа ПЦР.
Экспрессия в козах:
Фрагмент ДНК, полученный для микроинъекции, также можно использовать для получения варианта Fc A3A-184AY в козьем молоке.
Пример 2. Получение вариантов (мутированных Fc-фрагментов) по изобретению, полученных в клетках HEK, и исследование указанных вариантов.
I. Материалы и методы для продуцирования
Каждую представляющую интерес мутацию в Fc-фрагменте последовательности SEQ ID NO: 14 вставляли с помощью ПЦР с перекрытием, используя два набора праймеров, адаптированных для интеграции целевой мутации (мутаций) с кодоном (кодонами), кодирующим искомую аминокислоту. Преимущественно, когда вставляемые мутации близки к последовательности Fc, они добавляются через один и тот же олигонуклеотид. Фрагменты, полученные таким образом с помощью ПЦР, объединяли и полученный фрагмент амплифицировали с помощью ПЦР с использованием стандартных протоколов. Продукт ПЦР очищали на 1% (масс./об.) агарозном геле, гидролизовали соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали.
Рекомбинантный Fc-фрагмент получали путем временной трансфекции (липофекции) в клетках HEK293 (клетки 293-F, InvitroGen freestyle) в среде F17, дополненной L-глутамином, с использованием вектора pCEP4. Через 8 дней культивирования надосадочную жидкость осветляли центрифугированием и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Fc-фрагмент затем очищали на Hi-Trap протеине A и элюировали с помощью 25 мМ цитратного буфера pH = 3,0, нейтрализовали и диализовали в PBS перед стерилизацией фильтрацией (0,2 ч).
11. Тесты связывания Octet® (технология BLI «Bio-Layer Interferometry», прибор: Byte RED96, Fortebio, Pall)
Протоколы:
Связывание FcRn человека (hFcRn):
Биотинилированный рецептор hFcRn иммобилизовали на биосенсорах стрептавидина, разбавляли до 0,7 мкг/мл в рабочем буфере (0,1 М фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, рН 6). Варианты в соответствии с изобретением, WT и IgV, тестировали при 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 и 0 нМ в рабочем буфере (200 нМ = 10 мкг/мл для Fc).
- Дизайн теста:
Исходный уровень 1 х 120 с в подвижном буфере
Загрузка 300 с: приемник загружали на биосенсоры
Исходный уровень 2 x 60 с в подвижном буфере
Ассоциация 60 с: образцы (Fc или IVIg) добавляли к биосенсорам, загруженным в hFcRn
Диссоциация 30 с в подвижном буфере
Регенерация в течение 120 с в регенерационном буфере (0,1 М фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, рН 7,8).
- Интерпретация результатов:
Кривые ассоциации и диссоциации (первые 10 с) использовали для расчета кинетических констант ассоциации (kon) и диссоциации (koff) с использованием модели ассоциации 1/1. Затем рассчитывали KD (нМ) (kon/koff).
Связывание с приемниками hCD16aV и hCD32aH:
Рецептор HisTag hCD16aV (R & D System) или hCD32aH (PX Therapeutics) иммобилизовали на биосенсорах анти-Penta-HIS (HIS 1K), разбавляли до 1 мкг/мл в кинетическом буфере (Pall). Варианты Fc по изобретению, WT и IgV, тестировали при 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15 и 0 нМ в кинетическом буфере.
- Загрузка перед каждым образцом
- Дизайн теста: все стадии реализовали в кинетическом буфере (Pall)
Исходный уровень 1 х 60 с
Загрузка 400 с
Исходный уровень 2 х 60 с
Ассоциация 60 с
Диссоциация 30 с
Регенерация 5 с в регенерирующем буфере (глицин 10 мМ, рН 1,5/нейтрализация: PBS).
- Интерпретация результатов:
Кривые ассоциации и диссоциации (первые 5 с) использовали для расчета кинетических констант ассоциации (kon) и диссоциации (koff) с использованием модели ассоциации 1/1. Затем рассчитывали KD (нМ) (kon/koff).
Результаты:
Результаты показаны в таблице 1 ниже:
Таблица 1
Молекула hCD16aV SD hFcRn SD hCD32aH SD
IVIg 653,8 4 34,4 1,94 438,2 114,3
Fc-WT (HEK) 504,3 75,0 36,5 8,2 659,3 203,1
A3A-184AY (HEK) 132,0 14,1 7,8 0 313,0 29,7
SD = стандартное отклонение
Результаты показывают, что вариант Fc A3A 184AY (HEK) по изобретению проявляет как повышенную аффинность к рецептору hFcRn, так и повышенную аффинность к рецепторам FcгRIIIa (CD16a) и FcгRIla (CD32a), и это по сравнению как с исходным немутированным Fc (Fc-WT), так и по сравнению с IVIG.
III. Анализы на модели артрита, индуцированного переносом сыворотки мыши K/BxN
Протокол:
Модель K/BxN получали путем скрещивания трансгенных мышей по Т-клеточному рецептору KRN со штаммом мыши NOD. Мыши K/BxN F1 спонтанно заболевали в возрасте от 3 до 5 недель и имели множество клинических признаков ревматоидного артрита человека.
Заболевание вызывали путем внутривенного введения 10 мл мышиной сыворотки K/BxN мышам D0 C57/BI/6J. Тестируемые молекулы вводили однократно внутрибрюшинно в D0, за 2 часа до или через 72 часа после инъекции мышиной сыворотки K/BxN.
Мышей ежедневно проверяли на наличие признаков и симптомов артрита, чтобы оценить частоту и степень тяжести путем добавления индекса четырех ног:
0 = нормально, 1 = отек сустава, 2 = отек более чем одного сустава и 3 = тяжелый отек всего сустава.
Результаты:
У мышей, получавших сыворотку K/BxN, развился артрит в суставе. Заболевание характеризовалось увеличением размера голеностопного сустава, что приводило к увеличению клинического балла. Эти мыши показали значительное увеличение клинического балла и толщины лодыжки по сравнению с контрольными мышами, получавшими физиологический раствор.
1 - Превентивная модель:
При введении за 2 ч до инъекции мышиной сыворотки K/BxN обработка 750 мг/кг Fc-фрагмента дикого типа (Fc WT) значительно снижала клинический балл по сравнению с сывороточной группой мышей K/BxN.
Обработка Fc-вариантом A3A-184AY (HEK) по изобретению значительно снижала клинический балл способом, подобным фрагменту Fc WT, но в дозе, в 15 раз меньшей (50 мг/кг) (фигура 2).
2 - Терапевтическая модель:
Через 72 часа после инъекции мышиной сыворотки K/BxN, IgG, введенный в дозе 2 г/кг, не снижал значимо клинический балл по сравнению с группой, получавшей мышиную сыворотку K/BxN.
Однако обработка фрагментом Fc WT в дозе 750 мг/кг (молекулярная доза, эквивалентная 2 г/кг IVIG) значительно снижала клинический балл по сравнению с группой, получавшей мышиную сыворотку K/BxN. Кроме того, обработка вариантом Fc A3A-184AY (HEK) по изобретению значительно снижала клинический балл, аналогично фрагменту Fc-WT, но при дозе, в 4 раза меньшей (190 мг/кг) (фигура 3).
IV. Клеточные тесты in vitro
Протоколы:
Оценка связывания Fc-фрагментов и Ig IV с клетками крови:
Варианты Ig1V или Fc по изобретению, меченные Alexa, инкубировали при 65 нМ (10 мкг/мл для Fc в 2% CSF PBS) с клетками-мишенями в течение 20 минут на льду. После 2 промывок в 2% CSF клетки суспендировали в 500 мл Isoflow перед анализом методом проточной цитометрии. В-клетки, NK-клетки, моноциты и нейтрофилы были специфически помечены анти-CD19, анти-CD56, анти-CD14 и анти-CD15, соответственно. Рецептор FcгRIII (CD16) выявляли с помощью анти-CD16 3G8 антитела.
Ингибирование ADCC:
Чтобы имитировать лизис эритроцитов, наблюдаемый при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (ITP), с участием аутоантител у пациента с ITP, оценивали лизис эритроцитарных клеток, опосредованный эффекторными клетками, в присутствии моноклонального анти-резус-D антитела (RhD) и способность различных количеств поливалентных иммуноглобулинов (IVIg) или мутантных или немутантных рекомбинантных Fc-фрагментов ингибировать этот лизис, например, путем конкуренции с анти-RhD за фиксацию Fc-рецепторов на поверхности эффекторной клетки.
Цитотоксичность анти-RhD-антител изучали по методу ADCC. Вкратце, эффекторные клетки (мононуклеарные клетки) (от 25 до 8 Ч 107 клеток/мл) и резус-положительные эритроциты (от 25 до 4 Ч 107 клеток/мл в конечном итоге) инкубировали с различными концентрациями (от 0 до 75 нг/мл) анти-RhD антитела с отношением эффектор/мишень 2/1. После 16 часов инкубации лизис оценивали путем количественного определения гемоглобина, высвобождаемого в надосадочную жидкость, с использованием специфического субстрата (DAF).
Результаты выражены в процентах от специфического лизиса как функции количества антитела. Оценивали ингибирование ADCC, индуцированного IgV или вариантом Fc по изобретению (RFC A3A-184AY), добавленным к 33 нМ.
Результаты выражены в процентах, где 100% и 0% представляют собой значения, полученные с IglV при 650 нМ и 0 нМ, соответственно, согласно следующей формуле:
[(ADCC с 33 нМ образца - ADCC без IVIg)/(ADCC с IglV при 33 нМ - ADCC без IVIg) x100].
Ингибирование активации клеток Jurkat CD64:
Этот тест оценивает способность Fc-вариантов по изобретению или IVIG (общий IgG) ингибировать секрецию IL2 клетками Jurkat, экспрессирующими CD64 человека (Jurkat-H-CD64), индуцированную клеточной линией Raji с ритуксаном.
Вкратце, клетки Raji (50 мл при 5 Ч 106 клеток/мл) смешивали с ритуксаном (50 мл при 2 мг/мл), клетками Jurkat H-CD64 (25 мл при 5 Ч 106 клеток/мл, сложным эфиром форбола (PMA, 50 мл при 40 мл). нг/мл), затем инкубировали с IglV или Fc-вариантом по изобретению при 1950 нМ.
После ночи инкубации планшеты центрифугировали (125 г в течение 1 минуты) и NL2, содержащийся в надосадочной жидкости, оценивали с помощью ELISA.
Результаты выражали в процентах по отношению к IgLV в соответствии со следующей формулой:
(IL-2 IglV/IL-2 образца) X100.
Ингибирующая активность CDC:
Этот анализ оценивает способность Fc-варианта по изобретению или IVIG ингибировать опосредованную ритуксимабом активность CDC на клеточной линии Raji в присутствии сыворотки кролика в качестве источника комплемента. Вкратце, клетки Raji инкубировали в течение 30 минут с конечной концентрацией 50 нг/мл ритуксимаба. Добавляли раствор сыворотки молодого кролика, разведенный на 1/10 и предварительно инкубированный с вариантом по изобретению или IgV (об./об.) в течение 1 ч при 37°С. После 1 часа инкубации при 37°C планшеты центрифугировали (125 г в течение 1 минуты) и оценивали CDC путем измерения внутриклеточного LDH, высвобождаемого в культуральную среду.
Результаты выражали в процентах ингибирования и сравнивали с IVIG и отрицательным контролем (Fc без функции Fc), 100% соответствовали полному ингибированию литической активности и 0% соответствовали контрольному значению, полученному без Fc или IVIG.
Результаты:
Результаты показаны на фигурах 4 и 5.
Как показано на фигуре 5, Fc-вариант по изобретению (A3A-184AY (HEK)) имеет лучшее ингибирование активности клеток Jurkat, экспрессирующих CD64, ADCC и CDC, по сравнению с IVIg. Эти результаты показывают, что вариант по изобретению, такой как A3A-184AY, может быть эффективным для лечения патологий, включающих аутоантитела пациента, в частности, путем блокирования рецепторов Fc на эффекторных клетках пациента (см. фигуру 4).
Пример 3. Получение вариантов (мутированных Fc-фрагментов) по изобретению, продуцируемых в клетках СНО.
Рекомбинантный Fc-фрагмент может быть получен из SEQ ID NO: 14 таким же образом, который описан в Примере 2. Этот мутантный Fc-фрагмент может продуцироваться путем трансфекции в клетки CHO-S с помощью липофекции, например, с помощью реагента Freestyle Max (Thermofisher), с использованием вектора, оптимизированного для экспрессии в этой клеточной линии. Клетки CHO-S культивировали в среде CD FortiCHO + 8 мМ глутамина в условиях перемешивания при 135 об/мин в контролируемой атмосфере (8% CO2) при 37°C. За день до дня трансфекции клетки высевали с плотностью 6,105 клеток/мл.
В день трансфекции линеаризованную ДНК (50 мкг) и 50 мкл трансфекционного агента (ТА) предварительно инкубировали отдельно в среде Opti-Pro SFM, а затем перемешивали и инкубировали в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса ДНК/TA. Затем добавляли целое к клеточному препарату 1,106 клеток/мл в объеме 30 мл. После 48 часов инкубации в клетки добавляли трансфекционные агенты (неомицин 1 г/л и метотрексат 200 нМ). Плотность и жизнеспособность клеток определяли каждые 3-4 дня, а объемы культур адаптировали для поддержания плотности клеток более 6,105 клеток/мл. Когда жизнеспособность превышает 90%, полученные стабильные пулы сохраняли путем криостатического замораживания, и продуцирование в перемешиваемых условиях осуществляли в режиме с подпиткой в течение 10 дней с добавлением 4 г/л или 6 г/л глюкозы в течение продуцирования. В конце продуцирования клетки и надосадочную жидкость разделяли центрифугированием. Клетки удаляли, а надосадочную жидкость собирали, концентрировали и фильтровали при 0,22 мкм.
Затем Fc-фрагмент очищали аффинной хроматографией на смоле с протеином А (HiTrap protein A, GE Healthcare). После захвата на сбалансированной буфером PBS смоле, Fc-фрагмент элюировали 25 мМ цитратным буфером pH = 3,0, после чего проводили быструю нейтрализацию pH с помощью 1М Трис, а затем диализовали в буфере PBS перед стерилизацией фильтрованием (0,2 пм).
Пример 4. Тесты на связывание вариантов FcRn, CD16aH, CD16aV, CD64 и CD32a, продуцируемых в клетках СНО и в трансгенном козьем молоке
Анализы связывания Fc-рецепторов проводили со следующими молекулами:
- Варианты изобретения A3A-184AY CHO (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO (Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), полученные в клетках CHO, согласно способу, приведенному в примере 3, А3, приведенном в примере 3, -184AY_TGg, продуцируемом в трансгенной козе в соответствии со способом, описанным в примере 1;
- Fc-фрагмент MST-HN, содержащий мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, описанный в литературе как имеющий оптимизированное связывание только с рецептором FcRn (Ulrichts et al., JCI, 2018), получали в клетках HEK-293 (Клетки 293-F, InvitroGen freestyle);
- фрагмент Fc-WT дикого типа или Fc-Rec, полученный путем расщепления папаином IgG1, продуцируемого в трансгенном козьем молоке;
- lVIG
Связывание FcRn человека (hFcRn):
Связывание FcRn изучали конкурентным анализом с использованием меченного A488 ритуксана (Rituxan-A488) и клеток Jurkat, экспрессирующих рецептор FcRn (Jurkat-FcRn).
Клетки Jurkat-FcRn высевали в 96-луночный планшет (с V-образным дном) в концентрации 2,105 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С с тестируемыми молекулами, разведенными в буфере, в следующих конечных концентрациях: 167 мкг/мл; 83 мкг/мл; 42 мкг/мл; 21 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0 мкг/мл и одновременно с 25 мкг/мл Ритуксана-А488.
Затем клетки промывали путем добавления 100 мкл PBS при рН 6 и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 3 минут при 4°С. Надосадочную жидкость затем удаляли и добавляли 300 мкл холодного PBS с pH 6.
Связывание Rituxan-A488 с FcRn, экспрессируемым клетками Jurkat-FcRn, оценивали с помощью проточной цитометрии. Наблюдаемая средняя интенсивность флуоресценции (MFI) выражается в процентах, где 100% представляет собой значение, полученное только с ритуксаном-A488, и 0% - значение в отсутствие ритуксана-A488. Молекулярные концентрации, необходимые для индукции 50% ингибирования связывания ритуксана-A488 с FcRn клеток Jurkat-FcRn, рассчитывают с использованием «Prism Software».
Результаты показаны в таблице 2 ниже.
Таблица 2
A3A-184AY_CHO A3A-184EY_CHO A3A-184AY_TGg MST-HN Fc-WT IVIG
Ингибирование связывания с FcRn (IC 50%, нМ) 13 15 12 14 476 1356
Результаты показывают, что варианты Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO и A3A-184AY-TGg демонстрируют повышенное ингибирование связывания ритуксана-A488 (х100 по сравнению с IVIG). Варианты изобретения демонстрируют аффинность связывания FcRn, эквивалентную таковой, наблюдаемой для Fc-фрагмента MST-HN, описанного в литературе, как оптимизированного только для FcRn (Ulrichts et al., JCI, 2018).
Связывание с hCD64 и рецепторами hCD16aH, hCD16aV, hCD32aH, hCD32aR:
• Связывание с CD64 человека (hCD64)
Связывание с CD64 человека изучали конкурентным анализом с использованием клеток Rituxan-A488 и Jurkat, экспрессирующих рецептор CD64 (Jurkat-CD64).
Клетки Jurkat-CD64 высевали в 96-луночный планшет (с V-образным дном) в концентрации 2,105 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С с тестируемыми молекулами, разведенными в буфере с конечными концентрациями: 167 пг/мл; 83 мкг/мл; 42 мкг/мл; 21 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0 мкг/мл и одновременно с 25 мкг/мл Ритуксана-А488.
Затем клетки промывали путем добавления 1 мкл PBS при рН 6 и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 3 минут при 4°С. Надосадочную жидкость затем удаляли и добавляли 300 мкл холодного PBS с pH 6.
Связывание ритуксана-A488 с CD64, экспрессируемого клетками Jurkat-CD64, оценивали с помощью проточной цитометрии. Наблюдаемые средние интенсивности флуоресценции (MFI) выражены в процентах, где 100% - это значение, полученное только с ритуксаном-A488, и 0% - это значение в отсутствие ритуксана-A488. Молекулярные концентрации, необходимые для индукции 50% ингибирования связывания ритуксана-A488 с CD64 клеток Jurkat-CD64, рассчитывали с использованием «Prism Software».
• Связывание с CD32aH и CD32aR
Связывание рецептора CD32 человека изучали с помощью конкурентного анализа с использованием клеток Rituxan-A488 и HEK, трансфицированных рецепторами CD32aH и CD32aR (HEK-CD32).
Клетки HEK-CD32 высевали в 96-луночный планшет (с V-образным дном) в концентрации 2,105 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С с тестируемыми молекулами, разведенными в буфере, в следующих конечных концентрациях: 333 мкг/мл; 167 мкг/мл, 83 мкг/мл; 42 мкг/мл; 21 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0 мкг/мл и одновременно с 30 мкг/мл Ритуксана-А488.
Затем клетки промывали путем добавления 100 мкл PBS при рН 6 и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 3 минут при 4°С. Надосадочную жидкость затем удаляли и добавляли 300 мкл холодного PBS с pH 6.
Связывание Rituxan-A488 с CD32aH и CD32aR, экспрессируемыми клетками HEK-CD32, оценивали с помощью проточной цитометрии. [Наблюдаемые средние интенсивности флуоресценции (MFI) выражены в процентах, где 100% - это значение, полученное только с ритуксаном-A488, и 0% - это значение в отсутствие ритуксана-A488. Молекулярные концентрации, необходимые для индукции 50% ингибирования связывания ритуксана-A488 с CD32aH и CD32aR клеток HEK-CD32, рассчитывали с использованием «Prism Software».
• Связывание с hCD16aH
Связывание с человеческим CD16aH изучали с помощью конкурентного анализа с использованием мышиного анти-CD16 3G8-антитела, меченного фикоэритрином (3G8-PE), и клеток Jurkat, трансфицированных человеческим рецептором CD16aH (Jurkat-CD16aH).
Клетки Jurkat-CD16aH высевали в 96-луночный планшет (с V-образным дном) в концентрации 2,105 клеток на лунку. Затем клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С с тестируемыми молекулами, разведенными в буфере, в следующих конечных концентрациях: 83 мкг/мл; 42 мкг/мл; 21 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл; 0 мкг/мл и одновременно с 0,5 мкг/мл mAb 3G8-PE.
Затем клетки промывали путем добавления 1 мкл PBS при рН 6 и центрифугировали при 1700 об/мин в течение 3 минут при 4°С. Надосадочную жидкость затем удаляли и добавляли 300 мкл холодного PBS с pH 6.
Связывание mAb 3G8-PE с CD16aH, экспрессируемым клетками Jurkat-CD16aH, оценивали с помощью проточной цитометрии. Наблюдаемые средние интенсивности флуоресценции (MFI) выражены в процентах, где 100% - это значение, полученное только с mAb 3G8-PE, а 0% - это значение в отсутствие mAb 3G8-PE. Молекулярные концентрации, необходимые для индукции 50% ингибирования связывания mAb 3G8-PE с CD16aH клеток Jurkat-CD16aH, рассчитывали с использованием «Prism Software».
Результаты показаны в таблице 3 ниже.
Таблица 3
A3A-184AY_CHO A3A-184EY_CHO A3A-184AY_TGg MST-HN Fc-WT IVIG
Ингибирование связывания с CD16a-F (IC 50%, нМ) 262 123 105 >2170 282 1684
Ингибирование связывания с CD32a-H (IC 50%, нМ) 135 147 170 >2170 >2170 671
Ингибирование связывания с CD32a-R (IC 50%, нМ) 176 132 не определено >2170 >2170 1308
Ингибирование связывания с CD32b (IC 50%, нМ) 57 55 59 >2170 >2170 761
Ингибирование связывания с CD64 (IC 50%, нМ) 84 70 87 494 176 880
Результаты показывают, что варианты A3A-184AY CHO Fc, A3A-184EY CHO Fc и A3A-184AY_TGg обладают повышенной аффинностью к рецепторам FcгRIIIa (CD16a), FcгRI (CD64) и FcгRIla (CD32a) по сравнению с немутантными Fc (Fc-WT), но также по сравнению с IVIG.
Мутанты по изобретению демонстрируют очень повышенную аффинность к рецепторам FcгRIIIa (CD16a), FcгRI (CD64) и FcгRIla (CD32a) по сравнению с MST-HN.
• Связывание с CD16aV человека:
Рецептор HisTag hCD16aV (R & D System) иммобилизовали на биосенсорах анти-Penta-HIS (HIS 1K), разведенных до 1 мкг/мл в кинетическом буфере (Pall). Молекулы тестировали в концентрациях 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31, 25, 15 и 0 нМ в кинетическом буфере.
- Загрузка перед каждым образцом
- Дизайн теста: все стадии реализованы в кинетическом буфере (Pall)
Исходный уровень 1 х 60 с
Загрузка 400 с
Исходный уровень 2 х 60 с
Ассоциация 60 с
Диссоциация 30 с
Регенерация 5 с в регенерационном буфере (глицин 10 мМ, рН 1,5/нейтрализация: PBS).
- Интерпретация результатов:
Кривые ассоциации и диссоциации (первые 5 с) использовали для расчета кинетических констант ассоциации (kon) и диссоциации (koff) с использованием модели ассоциации 1/1. Затем рассчитывали KD (нМ) (kon/koff).
Результаты показаны в таблице 4 ниже.
Таблица 4
Молекула КД hCD16aV (нМ) SD
A3A-184AY_CHO 80,3 18,1
A3A-184EY_CHO 59,3 7,7
A3A-184AY_TGg 51.2 10.7
MST-HN 268,2 83,6
Fc-WT 314,1 72,7
ВВИГ 339,0 103,9
SD: стандартное отклонение
Результаты показали, что варианты Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO и A3A-184AY_TGg демонстрируют увеличение связывания с человеческим рецептором FcгRIIIa-V (CD16a-V), и это по сравнению с немутантным Fc (Fc-WT), но также по сравнению с IgM и Fc-фрагментом MST-HN, содержащим мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
Пример 5. Тесты ингибирования ADCC и активации клеток Jurkat вариантами, продуцируемыми в клетках CHO и в трансгенном козьем молоке.
Тесты ингибирования ADCC и активации клеток Jurkat выполняли со следующими молекулами:
- Варианты изобретения A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO (Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), полученные в клетках СНО в соответствии со способом, приведенным в Примере 3,
- Fc-фрагмент MST-HN, содержащий мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, описанный в литературе как имеющий связывание, оптимизированное только для рецептора FcRn (Ulrichts et al., JCI, 2018), получали в клетках HEK-293 (Клетки 293-F, Freestyle InvitroGen),
- Fc-фрагмент дикого типа «Fc-Rec» или «Fc-WT», полученный путем расщепления папаином IgG1, продуцируемого в трансгенном козьем молоке,
- IglV
• Тест ингибирования ADCC:
Чтобы имитировать лизис эритроцитов, наблюдаемый при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (ITP), с участием аутоантител у пациента с ITP, оценивали лизис эритроцитарных клеток, опосредованный эффекторными клетками, в присутствии моноклонального анти-резус-D антитела (RhD) был и способность различных количеств поливалентных иммуноглобулинов (IgMV) или мутированных или немутантных рекомбинантных Fc-фрагментов ингибировать этот лизис, например, путем конкуренции с анти-RhD за фиксацию Fc-рецепторов на поверхности эффекторных клеток.
Цитотоксичность анти-RhD-антител изучали по методу ADCC. Вкратце, эффекторные клетки (мононуклеарные клетки) (от 25 до 8 Ч 107 клеток/мл) и резус-положительные эритроциты (от 25 до 4 Ч 107 клеток/мл в конечном итоге) инкубировали с различными концентрациями (от 0 до 75 нг/мл) анти-RhD антитела с отношением эффектор/мишень 2/1. После 16 часов инкубации лизис оценивали путем количественного определения гемоглобина, высвобождаемого в надосадочную жидкость, с использованием специфического субстрата (DAF).
Результаты выражены в процентах от специфического лизиса как функции количества антитела. Ингибирование ADCC индуцируется тестируемыми молекулами (IgM, MST-HN, Fc-WT A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) в концентрациях 500, 50, 5, 0,5 мкг/мл. для MST-HN, Fc-WT A3A-184AY_CHO, A3A-184EY_CHO и 1500, 150, 15, 1,5 мкг/мл для IglV. Концентрации молекул для индукции 25% или 50% ингибирования рассчитывали с помощью «Prism Software».
Результаты показаны в таблице 5 ниже.
Таблица 5
A3A-184AY_CHO A3A-184EY_CHO MST-HN Fc-WT IVIg
Ингибирование лизиса эритроцитов, опосредуемого анти-D AD1 (IC 25%, нМ) 13,5 7,6 190,2 82 59,6
Ингибирование лизиса эритроцитов, опосредуемого анти-D AD1 (IC 50%, нМ) 97 56 441 1500 351
Результаты показали, что варианты Fc, A3A-184AY CHO и A3A-184EY CHO, демонстрируют ингибирование лизиса эритроцитов повышенным анти-резус-D антителом по сравнению с немутантным Fc (Fc-WT), а также по сравнению с IVIG.
Кроме того, ингибирование CH3 A3A-184AY или CHO A3A-184EY значительно увеличивается по сравнению с Fc-фрагментом, MST-HN, содержащим мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
• Ингибирование активации клеток Jurkat CD64:
Этот тест оценивает способность Fc-вариантов по изобретению или IVIG (общего IgG) ингибировать секрецию IL2 клетками Jurkat, экспрессирующими CD64 человека (Jurkat-H-CD64), индуцированную клеточной линией Raji с ритуксаном.
Вкратце, клетки Raji (50 мл при 5 Ч 106 клеток/мл) смешивали с ритуксаном (50 мл при 2 мг/мл) и клетками Jurkat H-CD64 (25 мл при 5 Ч 106 клеток/мл), форболовым эфиром (PMA, 50 мл при 40 нг/мл), затем инкубировали с вариантом IGVI или Fc по изобретению при 1950 нМ.
После ночи инкубации планшеты центрифугировали (125 г в течение 1 минуты) и NL2, содержащийся в надосадочной жидкости, оценивали с помощью ELISA.
Ингибирование секреции IL2 индуцировали вариантами IVIG, Fc-WT, MST-HN или Fc по изобретению (A3A-184AY CHO или A3A-184EY CHO), добавленными в дозах 50 и 100 мкг/мл. для фрагментов Fc-WT, MST-HN или вариантов Fc по изобретению (A3A-184AY CHO или A3A-184EY CHO) и 150 и 300 мкг/мл для IGVI.
Концентрации молекулы, вызывающие 25% или 50% ингибирования, рассчитывали с помощью «Prism Software».
Результаты показаны в таблице 6 ниже.
Таблица 6
A3A-184AY_CHO A3A-184EY_CHO MST-HN Fc-WT IVIG
Ингибирование секреции IL-2 клетками Jurkat, трансфицированными CD64 (IC 25%, нМ) 448 442 1455 926 1106
Ингибирование секреции IL-2 клетками Jurkat, трансфицированными CD64 (IC 50%, нМ) 600 600 <1950 <1950 <1950
Результаты показали, что варианты Fc A3A-184AY-CHO и A3A-184EY-CHO демонстрируют повышенное ингибирование секреции IL2 по сравнению с немутантным Fc (Fc-WT), а также по сравнению с IVIG.
Кроме того, ингибирование RFC A3A-184AY CHO или A3A-184EY CHO значительно увеличивается по сравнению с Fc-фрагментом MST-HN, включающим мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
Пример 6. Испытания связывания Fc-варианта с клетками крови
Тесты на связывание клеток крови выполняются со следующими молекулами:
- Варианты изобретения A3A-184AY CHO (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO (Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), полученные в клетках CHO, согласно способу, приведенному в примере 3, A3A-184AY_TGg, продуцируемые в трансгенной козе в соответствии со способом, описанным в примере 1,
- Fc-фрагмент MST-HN, включающий мутации M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, описанный в литературе как имеющий оптимизированное связывание только с рецептором FcRn (Ulrichts et al., JCI, 2018), продуцировали в клетках HEK-293 (Клетки 293-F, Freestyle InvitroGen),
- Fc-фрагмент дикого типа «Fc-Rec» или «Fc-WT», полученный путем расщепления папаином IgG1, продуцируемый в трансгенном козьем молоке,
- IglV
Молекулы, меченные маркером Alexa Fluor® (высокофлуоресцентный белковый маркер), инкубировали при 65 нМ (10 мкг/мл для Fc в 2% CSF PBS) с клетками-мишенями в течение 20 минут на льду.
После 2 промывок в 2% CSF клетки суспендировали в 500 мл Isoflow перед анализом методом проточной цитометрии. Тесты проводили на следующих клетках:
- клетки-естественные киллеры (NK), меченные анти-CD56 («% положительных NK-клеток»);
- моноциты, меченные анти-CD14 («% положительных клеток»);
- моноциты CD16+, меченные анти-CD14 и анти-CD16 3G8 антителом («% положительных клеток»);
- нейтрофилы, меченные анти-CD15 («% положительных клеток»)
Рецептор FcгRIII (CD16) выявляли с помощью анти-CD16 3G8 антитела.
Результаты показывают, что варианты Fc A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO и A3A-184AY_TGg, независимо от способа продуцирования, обеспечивают повышенное связывание по сравнению с немутантным Fc (Fc-Rec), но также по сравнению с IglV. Кроме того, связывание A3A-184AY или A3A-184EY значительно увеличено по сравнению с фрагментом MST-HN для NK-клеток, CD16 + моноцитов и нейтрофилов (см. фигуру 6).
Пример 7. In vivo модельные тесты идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP)
Болезнь была вызвана у мышей, экспрессирующих гуманизированный FcRn (фон гетерозиготного гена B6 mFcRn -/- hFcRnTg 276 (The Jackson Laboratory), путем внутривенного введения антитела против тромбоцитов 6A6-hlgG1 (0,3 пг/г массы тела) для истощения тромбоцитов у мыши. Анализ крови проводился (количество тромбоцитов) за 24 часа до инъекции 6A6-hlgG1, через 4 часа после индукции заболевания. IglV (1000 мг/кг), Fc-Rec (380 и 750 мг/кг), Fc MST-HN (190 мг/кг) и Fc A3A-184AY CHO (190 мг/кг и 380 мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 2 часа до истощения тромбоцитов.
Количество тромбоцитов определяли с помощью гематологической системы Advia (Bayer). Количество тромбоцитов до введения антител устанавливали на уровне 100%.
Антитело против тромбоцитов 6A6-hlgG1 (0,3 мкг/г) позволяет истощить 90% тромбоцитов.
Введение кандидатов-лекарственных средств за 2 часа до истощения тромбоцитов может восстановить (фигура 7):
• 100% тромбоцитов для A3A 184AY CHO в дозе 380 мг/кг;
• 106% тромбоцитов для A3A-184AY CHO в дозе 190 мг/кг;
• 90% тромбоцитов для IglV в дозе 1000 мг/кг;
• 64% тромбоцитов для Fc-WT в дозе 750 г/кг;
• 75% тромбоцитов для Fc-WT в дозе 380 мг/кг;
• 61% тромбоцитов для варианта MST-HN в дозе 190 мг/кг.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> LFB
<120> Variants with an Fc fragment having an increased affinity for
FcRn and
an increased affinity for at least one Fc fragment receptor
<130> BEX18P0761
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG1 G1m1,17 (residues 226-447 according
to
the EU index or equivalent in Kabat) without the N-terminus upper
hinge region
<400> 1
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG2 without the N-terminus
upper hinge region
<400> 2
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 3
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG3 without the N-terminus
upper hinge region
<400> 3
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 4
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG4 without the N-terminus
upper hinge region
<400> 4
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 5
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG1 G1m3 without the N-terminus
upper hinge region
<400> 5
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 6
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG1 G1m1,17 with the N-terminus upper
hinge region
(residues 216-447 according to the EU index or equivalent in Kabat)
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 7
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG2 with the N-terminus
upper hinge region
<400> 7
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 8
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG3 with the N-terminus
upper hinge region
<400> 8
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 9
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG4 with the N-terminus
upper hinge region
<400> 9
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG1 G1m3 with the N-terminus
upper hinge region
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant Fc A3A_184AY
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> signal peptide
<400> 12
Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ser Ala
1 5 10 15
Asn Ala
<210> 13
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant Fc A3A_184AY with signal peptide
<400> 13
Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ser Ala
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
20 25 30
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
35 40 45
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
50 55 60
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
85 90 95
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
100 105 110
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
115 120 125
Pro Ile Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
130 135 140
Gln Val Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
145 150 155 160
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val
165 170 175
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
180 185 190
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
210 215 220
Val Met His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region of the human IgG1 G1m1,17 with residues 221-447
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant Fc A3A-184EY
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Trp Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 16
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variant Fc A3A-184EY with signal peptide
<400> 16
Met Arg Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ile Thr Ser Ala
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
20 25 30
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
35 40 45
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
50 55 60
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Trp Asn Ser
85 90 95
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
100 105 110
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
115 120 125
Pro Ile Glu Asn Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
130 135 140
Gln Val Tyr Thr Leu Ser Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
145 150 155 160
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val
165 170 175
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
180 185 190
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
210 215 220
Val Met His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Pro Gly Lys
245
<---

Claims (25)

1. Вариант Fc-фрагмента IgG1, обладающий повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIa (CD32a), по сравнению с таковой у референсного Fc-фрагмента IgG1, который включает: мутации 334N, 352S, 378, 397M и 434Y или мутации 296W, 334N, 352S, 378, 397M и 434Y, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
2. Вариант по п. 1, имеющий повышенную аффинность к рецептору FcRn по сравнению с аффинностью референсного Fc-фрагмента IgG1 с отношением по меньшей мере равным 2, предпочтительно более 5, более предпочтительно более 10, еще более предпочтительно более 15, особенно предпочтительно более 20, еще даже более предпочтительно более 25, наиболее предпочтительно более 30.
3. Вариант по п. 1, имеющий повышенную аффинность по меньшей мере к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIa (CD32a), по сравнению с таковой у референсного Fc-фрагмента IgG1 с отношением по меньшей мере равным 2, предпочтительно более 5, более предпочтительно более 10, еще более предпочтительно более 15, особенно предпочтительно более 20, еще даже более предпочтительно более 25, наиболее предпочтительно более 30.
4. Вариант по п. 1, который продуцируется в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком.
5. Вариант по п. 1, который продуцируется в трансгенных животных, отличных от человека, предпочтительно у трансгенных млекопитающих, отличных от человека.
6. Вариант по п. 5, где трансгенное животное, отличное от человека, представляет собой трансгенную козу.
7. Вариант по п. 1, где референсный Fc-фрагмент IgG1 является Fc-фрагментом IgG1 человека и предпочтительно выбирается из последовательностей SEQ ID NO: 14 или 15.
8. Вариант по п. 1, который выбран из последовательности выделенного Fc-фрагмента IgG1, последовательности, полученной из выделенного IgG1, фрагмента антитела, включающего Fc-фрагмент IgG1, и гибридного белка, включающего Fc-фрагмент IgG1.
9. Применение варианта Fc-фрагмента IgG1 по любому из пп. 1-11 в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунной патологии.
10. Применение по п. 9, где патология представляет собой иммунологическую тромбоцитопеническую пурпуру, невромиелит зрительного нерва или болезнь Девика и рассеянный склероз.
11. Применение варианта Fc-фрагмента IgG1 по любому из пп. 1-8 в качестве лекарственного средства для лечения воспалительной патологии.
12. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунной патологии, содержащая вариант по одному из пп. 1-8 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
13. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительной патологии, содержащая вариант по одному из пп. 1-8 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
14. Способ получения варианта Fc-фрагмента IgG1, обладающего повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIa (CD32a), по сравнению с таковой референсного Fc-фрагмента IgG1, который включает: мутации 334N, 352S, 378, 397M и 434Y или мутации 296W, 334N, 352S, 378, 397M и 434Y, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat, причем указанный способ включает экспрессию указанного варианта в эпителиальных клетках молочной железы трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, или указанный способ включает экспрессию указанного варианта в клетках млекопитающих в культуре.
15. Способ по п. 14, включающий стадии: а) получения последовательности ДНК, содержащей последовательность, кодирующую вариант, последовательность, кодирующую промотор казеина млекопитающего или промотор сыворотки млекопитающего, и последовательность, кодирующую сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта;
b) введения последовательности ДНК, полученной в а), в эмбрион млекопитающего, не являющегося человеком, для получения трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, экспрессирующего вариант, кодируемый указанной последовательностью ДНК, полученной в а), в молочной железе; и
в) извлечения варианта из молока, продуцированного трансгенным млекопитающим, не являющимся человеком, полученным на b).
16. Способ по любому из пп. 14, 15, в котором трансгенное млекопитающее, отличное от человека, выбрано из крупного рогатого скота, свиней, коз, овец и грызунов, предпочтительно из козы, мыши, свиньи, кролика, овцы и коровы.
17. Способ по п. 14, включающий стадии:
а) получения последовательности ДНК, кодирующей вариант;
b) введения последовательности ДНК, полученной на а), в клетки млекопитающих в транзиторной или стабильной культуре;
c) экспрессии варианта клетками, полученными на b), и
d) извлечения варианта из культуральной среды.
18. Ген, кодирующий вариант Fc-фрагмента IgG1, обладающий повышенной аффинностью к рецептору FcRn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору Fc (FcR), выбранному из рецепторов FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIa (CD32a), относительно таковой у референсного Fc-фрагмента IgG1 , который включает: мутации 334N, 352S, 378, 397M и 434Y или мутации 296W, 334N, 352S, 378, 397M и 434Y, где нумерация соответствует нумерации индекса EU или эквиваленту в Kabat.
19. Ген по п. 18, дополнительно включающий последовательность, кодирующую сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию указанного варианта.
RU2020119543A 2017-12-15 2018-12-14 Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента RU2820162C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1762217A FR3075200B1 (fr) 2017-12-15 2017-12-15 Variants avec fragment fc ayant une affinite augmentee pour fcrn et une affinite augmentee pour au moins un recepteur du fragment fc
FR1762217 2017-12-15
PCT/EP2018/084970 WO2019115773A1 (fr) 2017-12-15 2018-12-14 Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2020119543A RU2020119543A (ru) 2021-12-13
RU2820162C2 true RU2820162C2 (ru) 2024-05-30

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2517621C2 (ru) * 2007-10-31 2014-05-27 Ксенкор, Инк. Fc-ВАРИАНТЫ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С FcRn
WO2017207628A1 (fr) * 2016-05-31 2017-12-07 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps pour le traitement de cancers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2517621C2 (ru) * 2007-10-31 2014-05-27 Ксенкор, Инк. Fc-ВАРИАНТЫ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С FcRn
WO2017207628A1 (fr) * 2016-05-31 2017-12-07 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps pour le traitement de cancers

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EL‐AMINE M. et al., In vivo induction of tolerance by an Ig peptide is not affected by the deletion of FcR or a mutated IgG Fc fragment, International immunology, 2002, v. 14, n. 7, p.761-766, JONNALAGADDA M. et al., Chimeric antigen receptors with mutated IgG4 Fc spacer avoid fc receptor binding and improve T cell persistence and antitumor efficacy, Molecular Therapy, 2015, v. 23, n. 4, p.757-768, SAZINSKY S. L. et al., Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, v.105, n. 51, p.20167-20172, BOWEN A. et al., Revisiting the immunoglobulin intramolecular signaling hypothesis, Trends in immunology, 2016, v. 37, n. 11, p.721-723, TORRES M. et al., The immunoglobulin constant region contributes to affinity and specificity, Trends in immunology, 2008, v. 29, n. 2, p.91-97, MULLER S. et al., Spliceosomal peptide P140 for immunotherapy of systemic lupus erythematosus: results of an early phase II *
KONTERMANN R. E. et al., Bispecific antibodies, Drug Discovery Today, 2015, v. 7, n. 20, p.838-847. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210301028A1 (en) Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
RU2764559C2 (ru) МУТАНТНЫЕ ВАРИАНТЫ Fc IgG1, ЛИШЕННЫЕ ЭФФЕКТОРНЫХ ФУНКЦИЙ
JP7102496B2 (ja) 免疫療法における改変Ｆｃ断片の使用
CN111601821B (zh) 具有对FcRn的亲和力提高以及对至少一个Fc片段受体的亲和力提高的Fc片段的变体
JP6097690B2 (ja) 抗ｃｘｃｌ１３抗体およびそれを用いる方法
KR102613528B1 (ko) RGMa 결합 단백질 및 그 사용
TW201843179A (zh) 用於治療或預防認知障礙之人類化抗體、用於製備其之方法及用於使用其來治療或預防認知障礙之藥劑
US20200392226A1 (en) Enzymatic modification of anti-aqp4 autoantibody for modulating neuromyelitis optica
JP2017522040A (ja) シアリル化が改善されたＦｃを有するバリアントを作製するための方法
JP2024503212A (ja) ネコ科動物抗体の定常領域における変異
JP7576844B2 (ja) ＩＶＩＧの代替のための多量体ハイブリッドＦｃ蛋白質
CN111133007A (zh) 与胞外酶结合的重链抗体
US20200247903A1 (en) Method
RU2820162C2 (ru) Варианты с fc-фрагментом, обладающие повышенной аффинностью к fcrn и повышенной аффинностью по меньшей мере к одному рецептору fc-фрагмента
RU2809500C2 (ru) СВЯЗЫВАЮЩИЙ RGMa БЕЛОК И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
EP4041398A1 (en) Hybrid antibody