RU2818176C1 - Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients - Google Patents
Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818176C1 RU2818176C1 RU2023119297A RU2023119297A RU2818176C1 RU 2818176 C1 RU2818176 C1 RU 2818176C1 RU 2023119297 A RU2023119297 A RU 2023119297A RU 2023119297 A RU2023119297 A RU 2023119297A RU 2818176 C1 RU2818176 C1 RU 2818176C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- periosteum
- tissue
- collagen membrane
- engineered
- spheroids
- Prior art date
Links
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 title claims abstract description 90
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 title claims abstract description 90
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 59
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 59
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 53
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 32
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002520 cambial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 22
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 9
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 9
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 9
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 9
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 6
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 4
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 4
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 2
- 210000002758 humerus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101001093100 Drosophila melanogaster Scaffold protein salvador Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 1
- 239000002251 absorbable suture material Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 235000001705 insufficient nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000032631 intramembranous ossification Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000824 sesamoid bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L sodium glycerol 2-phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OCC(CO)OP([O-])([O-])=O AVPCPPOOQICIRJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, отоларингологии, пластической и восстановительной хирургии.The invention relates to the field of medicine, namely to tissue engineering, regenerative medicine, orthobiology, traumatology and orthopedics, otolaryngology, plastic and reconstructive surgery.
Надкостница представляет собой тонкую соединительнотканную пластинку мезенхимного происхождения, покрывающую все поверхности костей, кроме суставных, сухожильных прикреплений и поверхностей сесамовидных костей. Прочное крепление надкостницы к подлежащей кости обеспечивается коллагеновыми волокнами Шарпея, которые доходят до внешних периферических и интерстициальных пластинок кости. За небольшой толщиной надкостницы скрывается ее сложное строение, которое обеспечивает выполнение множества функций, включая механическую защиту кости, механосенсорику, функции резервуара биохимических молекул для инициации каскадной передачи сигналов, формирование ниши остеогенных клеток для роста, физиологической и репаративной регенерации кости, а также питание костной ткани многочисленными сосудами надкостницы и иннервация надкостницы и прилежащей костной ткани многочисленными нервными волокнами. Следует отметить, что нервная система является важным регулятором костного метаболизма, в том числе посредством центрального контроля активности остеогенных клеток надкостницы.The periosteum is a thin connective tissue plate of mesenchymal origin that covers all surfaces of the bones, except for the articular, tendon attachments and the surfaces of the sesamoid bones. The strong attachment of the periosteum to the underlying bone is provided by Sharpei's collagen fibers, which extend to the outer peripheral and interstitial plates of the bone. The thin thickness of the periosteum conceals its complex structure, which provides multiple functions, including mechanical protection of bone, mechanosensing, functions as a reservoir of biochemical molecules to initiate cascade signaling, formation of an osteogenic cell niche for growth, physiological and reparative bone regeneration, and nutrition of bone tissue. numerous vessels of the periosteum and innervation of the periosteum and adjacent bone tissue by numerous nerve fibers. It should be noted that the nervous system is an important regulator of bone metabolism, including through central control of the activity of osteogenic cells of the periosteum.
Надкостница важна не только для остеогенеза, но при определенных искусственных условиях надкостница может обеспечить репаративный хондрогенез, что существенно расширяет спектр возможностей регенеративных технологий с использованием надкостницы или ее живого эквивалента.The periosteum is important not only for osteogenesis, but under certain artificial conditions the periosteum can provide reparative chondrogenesis, which significantly expands the range of possibilities of regenerative technologies using periosteum or its living equivalent.
Определенные клетки надкостницы (Periosteum-derived cells (PDCs)) обладают свойствами стволовых клеток, для них характерны самообновление (отсутствие признаков старения до 80 удвоения популяции) и мультипотентность (дифференцируются в фибробласты, остеобласты, хондроциты, адипоциты и скелетные миоциты). Внутренний слой камбия богат клетками и состоит в основном из остеогенных клеток на различных стадиях развития (покоящихся, пролиферирующих, дифференцирующихся предшественников) и остеобластов, которые окружены гораздо более тонким коллагеновом матриксом по сравнению с внешним фиброзным слоем [Li, Chunyi, and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea. "Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w].Certain periosteum-derived cells (PDCs) have the properties of stem cells, they are characterized by self-renewal (no signs of aging until 80 population doublings) and multipotency (differentiate into fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and skeletal myocytes). The inner layer of the cambium is rich in cells and consists mainly of osteogenic cells at various stages of development (resting, proliferating, differentiating precursors) and osteoblasts, which are surrounded by a much thinner collagen matrix compared to the outer fibrous layer [Li, Chunyi, and Peter Fennessy. "The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea." Biology direct vol. 16.1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w].
Многие проблемы травматологии и ортопедии, стоматологии и пластической хирургии, связанные с костными и хрящевыми посттравматическими дефектами, превышающими размеры критических дефектов, могут быть эффективно решены за счет изготовления биоискусственной персонифицированной надкостницы, исследуются варианты изготовления из различных типов клеток, материалов с разными свойствами, предназначенные для различных методик трансплантации того или иного полученного конструкта. Крайне важно отметить, что сразу после повреждения костей, например диафиза длинной трубчатой кости, его кортикального слоя, травмированная надкостница претерпевает ряд изменений, которые инициируют как эндохондральное, так и внутримембранозное образование кости в месте повреждения.Many problems in traumatology and orthopedics, dentistry and plastic surgery associated with bone and cartilage post-traumatic defects exceeding the size of critical defects can be effectively solved through the production of bioartificial personalized periosteum; manufacturing options from various types of cells, materials with different properties, intended for various methods of transplantation of one or another resulting construct. It is extremely important to note that immediately after damage to bones, for example the diaphysis of a long tubular bone, its cortical layer, the injured periosteum undergoes a number of changes that initiate both endochondral and intramembranous bone formation at the site of injury.
Быстро развивающаяся область биотехнологий, включая тканевую инженерию надкостницы, направлена на синтез биоискусственной или бионической надкостниц, способных обеспечить, как саму возможность заживлений костных дефектов, так и ускорения этих процессов. Материалы биоискусственной надкостницы могут стремиться к достижению параметров натуральной надкостницы как по структуре, так и по функциям, что позволяет надеяться на хороший терапевтический и регенеративный потенциалы разрабатываемых тканеинженерных конструктов. Индукция регенерации тканей надкостницы и кости с помощью биомиметической тканеинженерной надкостницы, по мнению ряда авторов, является идеальным целевым процессом для восстановления кости (Zhang W, Wang N, Yang M, Sun T, Zhang J, Zhao Y, Huo N, Li Z. Periosteum and development of the tissue-engineered periosteum for guided bone regeneration. J Orthop Translat. 2022 Feb 16; 33: 41-54. doi: 10.1016/j.jot.2022.01.002. PMID: 35228996; PMCID: PMC8858911).The rapidly developing field of biotechnology, including tissue engineering of the periosteum, is aimed at the synthesis of bioartificial or bionic periosteum that can provide both the possibility of healing bone defects and the acceleration of these processes. Bioartificial periosteum materials can strive to achieve the parameters of natural periosteum both in structure and function, which allows us to hope for good therapeutic and regenerative potential of the tissue-engineered constructs being developed. Induction of periosteum and bone tissue regeneration using biomimetic tissue-engineered periosteum, according to some authors, is an ideal target process for bone restoration (Zhang W, Wang N, Yang M, Sun T, Zhang J, Zhao Y, Huo N, Li Z. Periosteum and development of tissue-engineered bone regeneration. J Orthop Translat. 2022 Feb 16; 33: 41-54. doi: 10.1016/j.jot.2022.01.002.
Известна группа изобретений, в которой предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов из культивируемых клеток надкостницы и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Сфероиды в этих изобретениях предназначены для заполнения посттравматических дефектов скелетных тканей и стимуляции костной, в первую очередь трансплантационной регенерации (Патент №2744664 С1 Российская Федерация, МПК C12N 5/077, A61F 2/30. Способ производства сфероидов из культивируемых клеток надкостницы для обеспечения репаративного остеогенеза).A group of inventions is known, which proposes a method for obtaining a graft based on cell spheroids from cultured periosteum cells and a graft for restoring skeletal connective tissues of a subject obtained by this method. The spheroids in these inventions are intended to fill post-traumatic defects in skeletal tissues and stimulate bone, primarily transplantation regeneration (Patent No. 2744664 C1 Russian Federation, IPC C12N 5/077, A61F 2/30. Method for producing spheroids from cultured periosteal cells to ensure reparative osteogenesis ).
Чжао и соавторами разработали конструкцию тканеинженерной надкостницы, которая по данным авторов играет роль в остеогенезе и ангиогенезе при лечении экспериментальных костных дефектов. Их тканеинженерная надкостница представляет собой гибкую конструкцию, созданную путем объединения остеогенно-индуцированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга кролика с бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи. Третий пассаж МСК был выбран для остеогенной дифференцировки. МСК индуцировали в течение 3 недель в DMEM (Invitrogen), содержащей 10% FBS (FBS, Thermo FS) с добавлением 50 мг/л аскорбата натрия, 10 ммоль/л β-глицеролфосфата натрия и 10 нм/л дексаметазона (все от Sigma-Aldrich). при 37°С во влажной камере с 5% СО2. Листы бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи расстилали на дно культуральных чашек, а затем дезинфицировали ультрафиолетовым светом в течение более чем 1 часа. Чистую фетальную бычью сыворотку добавляли к предварительно смоченным листам бесклеточных каркасов подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи более чем на 12 часов. Затем на предварительно смоченную поверхность этих листов добавляли 500 мкл суспензии остеогенно-индуцированных МСК с плотностью 1×106 клеток/мл и инкубировали в течение 4 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток. К клеткам добавляли дополнительную среду DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки, и культуру инкубировали при 37°С в среде с 5% СО2 и влажностью 95% в течение 10-15 дней для образования биоактивного тканеинженерного конструкта. Среду меняли каждые 2-3 дня (Zhao L, Zhao J, Tuo Z, Ren G. Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model. J Mater Sci Mater Med. 2021; 32(9): 105. Published 2021 Aug 21. doi: 10.1007/s10856-021-06579-7).Zhao et al developed a tissue-engineered periosteum design that, according to the authors, plays a role in osteogenesis and angiogenesis in the treatment of experimental bone defects. Their tissue-engineered periosteum is a flexible construct created by combining osteogenically induced mesenchymal stem cells (MSCs) from rabbit bone marrow with an acellular scaffold of porcine small intestinal submucosa. The third passage of MSCs was selected for osteogenic differentiation. MSCs were induced for 3 weeks in DMEM (Invitrogen) containing 10% FBS (FBS, Thermo FS) supplemented with 50 mg/L sodium ascorbate, 10 mmol/L sodium β-glycerol phosphate, and 10 nm/L dexamethasone (all from Sigma- Aldrich). at 37°C in a humid chamber with 5% CO 2 . Sheets of acellular porcine small intestinal submucosal scaffolds were spread on the bottom of culture dishes and then disinfected with ultraviolet light for more than 1 hour. Pure fetal bovine serum was added to pre-wetted sheets of porcine small intestinal submucosal acellular scaffolds for over 12 hours. Then, 500 μl of a suspension of osteogenic-induced MSCs at a density of 1×10 6 cells/ml was added to the pre-wetted surface of these sheets and incubated for 4 hours to ensure cell attachment. Additional DMEM with 10% fetal bovine serum was added to the cells, and the culture was incubated at 37°C in an environment with 5% CO 2 and 95% humidity for 10-15 days to form a bioactive tissue engineered construct. The medium was changed every 2-3 days (Zhao L, Zhao J, Tuo Z, Ren G. Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model. J Mater Sci Mater Med. 2021; 32(9 ): 105. Published 2021 Aug 21. doi: 10.1007/s10856-021-06579-7).
Однако известная тканеинженерная надкостница имеет следующие недостатки: мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, несмотря на общее эмбриональное происхождение с камбиальными клетками надкостницы не являются тканеспецифичным типом клеток для этой соединительнотканной пластинки в живом организме. Известно, что PDCs демонстрируют гораздо более высокую скорость пролиферации, чем мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга, и эти клетки надкостницы поддерживают линейный рост в течение более чем 30 удвоений популяции, демонстрируя длинные теломеры без признаков старения примерно до 80 удвоений популяции, что существенно лучше аналогичных показателей, характерных для МСК костного мозга. В целом в постнатальном периоде PDCs проявляют большую клоногенность, способность к росту и дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлениях, чем мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (Li, Chunyi, and Peter Fennessy. «The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea». Biology direct vol. 16,1 17. 18 Oct. 2021, doi: 10.1186/s13062-021-00310-w).However, the known tissue-engineered periosteum has the following disadvantages: bone marrow mesenchymal stem cells, despite their common embryonic origin with the cambial cells of the periosteum, are not a tissue-specific cell type for this connective tissue plate in a living organism. PDCs are known to exhibit a much higher proliferation rate than bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and these periosteal cells maintain linear growth for more than 30 population doublings, exhibiting long telomeres with no signs of aging until approximately 80 population doublings, which is significant better than similar indicators characteristic of bone marrow MSCs. In general, in the postnatal period, PDCs exhibit greater clonogenicity, growth, and differentiation in osteogenic and chondrogenic directions than bone marrow mesenchymal stem cells (Li, Chunyi, and Peter Fennessy. “The periosteum: a simple tissue with many faces, with special reference to the antler-lineage periostea".
В конструкции используется ксеногенный материал - бесклеточным каркасом подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, что несет все риски, связанные с любыми ксеногенными материалами.The design uses xenogeneic material - an acellular framework of the submucosa of the small intestine of a pig, which carries all the risks associated with any xenogeneic materials.
Используемые клетки пред дифференцированы, подобное состояние снижает пластичность клеток, одновременным снижая пролиферативный и регенеративный потенциал клеток, что отрицательно сказывается на кинетике наращивания клеточной биомассы, уменьшается ее выход при остальных равных условиях культивировании. Использование в питательной среде фетальной бычьей сыворотки уменьшает эффективность культивирования из-за известных проблем со стандартизацией этого типа ксеногенных продуктов и ее ускоряющего влияния на старение культур клеток мезенхимного происхождения этой сыворотки.The cells used are pre-differentiated; this condition reduces the plasticity of the cells, while simultaneously reducing the proliferative and regenerative potential of the cells, which negatively affects the kinetics of cell biomass growth, and its yield decreases under other equal cultivation conditions. The use of fetal bovine serum in the nutrient medium reduces the efficiency of cultivation due to known problems with the standardization of this type of xenogeneic products and its accelerating effect on the aging of cell cultures of mesenchymal origin of this serum.
Таким образом, несмотря на известные конструкции тканеинженерной надкостницы, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, в том числе, связанных с приживлением, участием в тканеспецифической полноценной репаративной регенерации скелетных тканей, недостаточным кровоснабжением конструктов, недостаточным питанием и клеточным дыханием пересаженных клеток в тканеинженерных конструктах на этапе приживления, а также малой эффективности индукции костной регенерации в живом организме на месте костного дефекта, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.Thus, despite the known designs of tissue-engineered periosteum, they are all characterized by a number of disadvantages and limitations, and many obstacles remain, including those associated with engraftment, participation in tissue-specific full reparative regeneration of skeletal tissues, insufficient blood supply to the constructs, insufficient nutrition and cellular respiration transplanted cells in tissue-engineered constructs at the engraftment stage, as well as the low efficiency of inducing bone regeneration in a living organism at the site of a bone defect, therefore there remains a need to develop and create new methods and approaches to solving these problems.
Задачей изобретения является создание способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов.The objective of the invention is to create a method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids to restore bone defects in patients.
Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов, характеризующийся тем, что коллагеновую мембрану размещают на дне культурального сосуда с боковой крышкой и пропитывают коллагеновую мембрану культуральной питательной средой, далее размещают на коллагеновой мембране сверху прямоугольную выполненную из титана раму с размером сечения 4×4 при высоте рамы 0,5 мм, рамой прижимают края коллагеновой мембраны к дну флакона, сверху на коллагеновую мембрану, ограниченную внутренними стенками рамы, укладывают горизонтальный слой клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надкостницы, в один ряд, культивируют сфероиды на поверхности коллагеновой мембраны в процессе созревания тканеинженерной конструкции в питательной среде: ДМЕМ или ДМЕМ/Ф12 450 мл, L-глутамина 292 мг, тромболизата 50 мл, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина 100 мкг/мл при 100% влажности и 5% содержанием СО2 в воздушной смеси над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в течении 6-7 суток с заменой культуральной питательной среды не менее 2 раз. При этом используют гомосфероиды из культивированных адгезивных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточные гетеросфероиды из адгезивных культивированных клеток надкостницы и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид. При этом используют в качестве культуральной питательной среды среду на основе ксеногенных фетальных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенных сывороток человека, среду на основе тромболизатов крови человека, бессывороточную синтетическую среду, бессывороточную синтетическую среду с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки. При этом коллагеновая мембрана представляет собой стерильную децеллюляризованную надкостницу - ксеногенные быка, овцы, кролика или аллогенную надкостницу человека. При этом используют сфероиды с размером от 250 до 500 мкм.The technical result in the implementation of the invention is achieved by the fact that a method is proposed for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for the restoration of bone defects of patients, characterized by the fact that the collagen membrane is placed at the bottom of a culture vessel with a side lid and the collagen membrane is impregnated with a culture nutrient medium, then placed on the collagen membrane on top of a rectangular frame made of titanium with a section size of 4×4 with a frame height of 0.5 mm, with the frame the edges of the collagen membrane are pressed to the bottom of the bottle, on top of the collagen membrane limited by the inner walls of the frame, a horizontal layer of cell spheroids consisting of aggregated cultured autologous periosteum cells, in one row, the spheroids are cultured on the surface of the collagen membrane during the maturation of the tissue-engineered construct in a nutrient medium: DMEM or DMEM/F12 450 ml, L-glutamine 292 mg, thrombolysate 50 ml, penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg /ml at 100% humidity and 5% CO 2 in the air mixture above the layer of nutrient medium inside the culture flask, for 6-7 days with replacement of the culture nutrient medium at least 2 times. In this case, homospheroids from cultured adhesive cultured cells of the cambial layer of the periosteum are used in the amount of 6000 cells per spheroid or cellular heterospheroids from adhesive cultured cells of the periosteum and multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow in a 2:1 ratio in the amount of 6000-8000 cells per spheroid. In this case, a medium based on xenogeneic fetal animal sera, a medium based on autologous and allogeneic human sera, a medium based on human blood thrombolysates, a serum-free synthetic medium, a serum-free synthetic medium with the addition of inducers of osteogenic differentiation are used as a cultural nutrient medium. In this case, the collagen membrane is a sterile decellularized periosteum - xenogeneic bovine, sheep, rabbit or allogeneic human periosteum. In this case, spheroids with a size from 250 to 500 microns are used.
Тканеинженерная надкостница выполнена в виде эластичной тонкой пластины коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов. Клеточные сфероиды получены из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших, слившихся между собой и частично распластанных, проникших в межволоконные пространства коллагеновой мембраны с образованием единого объединяющего тканеинженерную конструкцию коллагенового остова. В состав трансплантата входит альгинатный гель (полученный путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2 в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отвердевал в течение 1 мин и имел модуль Юнга 0,17 МПа. Факторы роста TGF-β1 и FGF-2 были включены в состав геля в концентрации 10 нг/мл. Альгинатный гель готовится известным способом (Stevens М.М., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Langer R., Shastri V.P. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9; 102(32): 11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMCID: PMC 1183576). Гель способствует реализации регенеративных потенций конструкта в живом организме и удерживал форму тканеинженерной надкостницы, заполняя свободное пространство в месте костного дефекта. Устройство позволяет обеспечить регенерацию костной ткани при костных дефектах, превышающих критический дефект, восстановить форму поврежденной кости.The tissue-engineered periosteum is made in the form of an elastic thin plate of collagen membrane and cell spheroids. Cellular spheroids were obtained from autologous cultured periosteal cells, adherent, fused with each other and partially spread out, penetrating into the interfiber spaces of the collagen membrane to form a single collagen skeleton that unites the tissue-engineered structure. The graft contains an alginate gel (prepared by mixing 2% (w/v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl with an equal volume of a solution containing 75 mM CaCl 2 in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl, using a sterile Y-mixer, the gel solidified within 1 min and had a Young's modulus of 0.17 MPa. The growth factors TGF-β1 and FGF-2 were included in the gel at concentrations. 10 ng/ml. Alginate gel is prepared in a known manner (Stevens M.M., Marini RP, Schaefer D., Aronson J., Langer R., Shastri VP In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9; 102(32): 11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMC 1183576). non-engineered periosteum , filling the free space at the site of a bone defect. The device allows for the regeneration of bone tissue in case of bone defects exceeding a critical defect, and restores the shape of the damaged bone.
Технический результат достигается тем, что тканеинженерная надкостница в ходе хирургической операции подшивается к интактной надкостнице, окружающей костный дефект, альгинатный гель с цитокинами TGF-β1 и FGF-2 заполняет пространство между тканеинженерной надкостницей и краями травмированной и восстанавливаемой кости. Место костного дефекта с установленной тканеинженерной надкостницей фиксируют (иммобилизуют) с целью правильного сращения костей, костные отломки должны быть сопоставлены и зафиксированные с помощью медицинских устройств, в том числе чрескостных компрессионно-дистракционных аппаратов до полной регенерации костной ткани. Проводится послойное ушивание раны.The technical result is achieved by the fact that during a surgical operation the tissue-engineered periosteum is sutured to the intact periosteum surrounding the bone defect; alginate gel with the cytokines TGF-β1 and FGF-2 fills the space between the tissue-engineered periosteum and the edges of the injured and restored bone. The site of the bone defect with the installed tissue-engineered periosteum is fixed (immobilized) for the purpose of proper bone fusion; bone fragments must be compared and fixed using medical devices, including transosseous compression-distraction devices until complete regeneration of bone tissue. The wound is sutured layer by layer.
Сущность предложенного способа получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов поясняется рисунком, где на фиг. 1 показан продольный срез тканеинженерной надкостницы на основе клеточных сфероидов для восстановления костей, свернутая в форме трубы и подшитая к интактной надкостнице опилов костей по краям посттравматического костного дефекта: 1 - клеточный сфероид; 2 - коллагеновая мембрана; 3 - альгинатный гель с цитокинами; 4 - хирургический шов для соединения тканеинженерной надкостницы с интактной надкостницей костных опилов; 5 - компактное костное вещество диафиза длинной трубчатой кости; 6 - костномозговой канал, заполненный костным мозгом; 7 - интактная надкостница опила кости.The essence of the proposed method for obtaining tissue-engineered periosteum from cell spheroids for restoring bone defects of patients is illustrated by the figure, where in FIG. Figure 1 shows a longitudinal section of tissue-engineered periosteum based on cell spheroids for bone restoration, rolled up in the shape of a tube and sutured to the intact periosteum of bone cuts along the edges of a post-traumatic bone defect: 1 - cell spheroid; 2 - collagen membrane; 3 - alginate gel with cytokines; 4 - surgical suture for connecting the tissue-engineered periosteum with the intact periosteum of bone filings; 5 - compact bone substance of the diaphysis of a long tubular bone; 6 - medullary canal filled with bone marrow; 7 - intact periosteum of the bone sawdust.
Сборка тканеинженерной надкостницы из агрегатов аутологичных культивированных клеток надкостницы - клеточных сфероидов, объединенных с коллагеновой мембраной и альгинатного геля с цитокинами, обладающего остео- и хондрогенным регенеративными потенциалами включает следующие этапы:The assembly of tissue-engineered periosteum from aggregates of autologous cultured periosteum cells - cell spheroids combined with a collagen membrane and alginate gel with cytokines, which has osteo- and chondrogenic regenerative potentials, includes the following steps:
а) размещение на дне культурального сосуда с боковой крышкой коллагеновой мембраны и ее пропитывание культуральной питательной средой:a) placing a collagen membrane at the bottom of a culture vessel with a side lid and soaking it in a culture nutrient medium:
б) установка титановой рамы (размер сечения бруска рамы - боковая сторона - 0,5 мм ширина - 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом) сверху на коллагеновую мембрану, мембрана расправляется и рамой прижимается ко дну культурального флакона, во флакон вносится культуральная питательная среда, размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны;b) installation of a titanium frame (sectional size of the frame bar - side - 0.5 mm width - 4 mm, fastened to each other at right angles) on top of the collagen membrane, the membrane is straightened and the frame is pressed to the bottom of the culture bottle, the culture nutrient is added to the bottle environment, the size of the titanium frame corresponds to the size of the collagen membrane;
в) в пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы, проводится укладка одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, для чего клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора наносятся на коллагеновую мембрану, сфероиды осаждаются под собственным весом, распределяются титановой полоской длина которой соответствует размерам раны по поверхности мембраны до полного заполнения слоя в 1 сфероид по высоте по всей площади мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов полоска перемещается по верхней поверхности ребер рамы;c) into the space formed by the collagen membrane and the inner lateral edges of the titanium frame, one row of cell spheroids from autologous cultured periosteum cells is laid, for which cell spheroids in suspension are applied to the collagen membrane using an applicator, the spheroids are deposited under their own weight, distributed with a titanium strip the length of which corresponds to the size of the wound along the surface of the membrane until a layer of 1 spheroid is completely filled in height over the entire area of the membrane limited by the inner edges of the frame; to level the layer of spheroids, the strip moves along the upper surface of the frame ribs;
г) 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны проводиться в течении 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата, пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5% СО2 в воздушной газовой смеси), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 суток;d) 3D cultivation of spheroids on the surface of a collagen membrane is carried out for 5 days in a nutrient medium with the following composition: DMEM (or DMEM/F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, 50 ml of thrombolysate, penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg/ ml (at 100% humidity above the layer of nutrient medium inside the culture flask and 5% CO 2 in the air gas mixture), the nutrient medium in the vial is replaced at least once every 3 days;
д) края коллагеновой мембраны прошиваются хирургическими рассасывающимися нитями для последующего крепления к свободным краям надкостницы реципиента вокруг костного дефекта при трансплантации этой тканеинженерной конструкции, слой сфероидов располагается снаружи, коллагеновая мембрана обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполняется с помощью шприца гелем, который получен путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2. в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя, гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 Мпа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый.e) the edges of the collagen membrane are sutured with surgical absorbable threads for subsequent attachment to the free edges of the recipient's periosteum around the bone defect during transplantation of this tissue-engineered structure, the layer of spheroids is located outside, the collagen membrane faces the center of the bone defect, the internal space limited by the collagen membrane and the surfaces of the bone defect is filled with using a gel syringe that was prepared by mixing 2% (w/v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl with an equal volume of a solution containing 75 mM CaCl2. in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl, using a sterile Y-mixer, the gel cures within 1 min and has a Young's modulus of 0.17 MPa, the gel contains growth factors TGF-β1 and FGF-2 in an amount of 10 ng/ml each.
Использование сфероидов, позволяет усилить регенеративный потенциал конструкции за счет преимуществ, присущих сфероидам по сравнению с разрозненными клетками в составах суспензий, а именно: увеличение жизнеспособности клеток в сфероидах; микросреды внутри сфероидов, приближенной к ин виво; высокой клеточной емкости для реконструкции и инициации регенерации; большая биосовместимость; способность к механотрансдукции; способность к биоинтеграции и органотипичной клеточной дифференцировке. Ассоциация сфероидов со скаффолдами - это новейший подход в тканевой инженерии. Каркасы в этом случае должны предоставлять внеклеточный матрикс, в котором клетки сфероидов могут прикрепляться, пролиферировать и дифференцироваться, при этом каркас обеспечивает механическую прочность конструкции и ее гибкость, а сфероиды оптимизируют внутриклеточную передачу сигналов, улучшая процесс дифференцировки, что, в свою очередь, позволяет клеткам организовываться в более сходную структуру тканей in vivo. В данном изобретении тканеинженерная надкостница предназначена для инициации костной регенерации по типу поднадкостничной регенерации, описанной в экспериментальной модели при изучении костеобразовательных возможностей надкостницы диафиза трубчатых костей (Студитский А. Н. Восстановление органов и тканей животного организма (биологическая теория регенерации): стенограмма публичной лекции, прочитанной в Центральном лектории Общества в Москве. - М.: Знание, 1952. - 40 с. (Всесоюзное общество по распространению политических и научных знаний. Серия 2. 1952. №58). Условиями костной регенерации в этой модели являлись: вылущивание кости с сохранением хрящей и надкостницы; надкостница и суставные хрящи оставляются на своем прежнем месте; экспериментально удаляли («вылущивание из-под надкостницы») плечевых, бедренных, берцовых костей кроликов, собак, кур; формируется «грубая модель будущей кости», которая состоит в значительной мере из хряща; при дальнейшем наблюдении под влиянием определенной мышечной нагрузки - движений - из грубой костно-хрящевой модели возникает сформированная плечевая, бедренная или берцовая кость со всеми особенностями строения.The use of spheroids makes it possible to enhance the regenerative potential of the structure due to the advantages inherent in spheroids compared to scattered cells in suspension compositions, namely: increasing the viability of cells in spheroids; microenvironment inside spheroids, close to in vivo; high cellular capacity for reconstruction and initiation of regeneration; high biocompatibility; ability for mechanotransduction; ability for biointegration and organotypic cell differentiation. The association of spheroids with scaffolds is a novel approach in tissue engineering. The scaffolds in this case must provide an extracellular matrix in which spheroid cells can attach, proliferate and differentiate, while the scaffold provides mechanical strength and flexibility to the structure, and the spheroids optimize intracellular signaling, improving the differentiation process, which in turn allows cells organize into more similar tissue structures in vivo. In this invention, the tissue-engineered periosteum is intended to initiate bone regeneration according to the type of subperiosteal regeneration described in the experimental model when studying the bone-forming capabilities of the periosteum of the diaphysis of tubular bones (Studitsky A. N. Restoration of organs and tissues of the animal body (biological theory of regeneration): transcript of a public lecture given in the Central Lecture Hall of the Society in Moscow. - M.: Knowledge, 1952. - 40 p. (All-Union Society for the Dissemination of Political and Scientific Knowledge. Series 2. 1952. No. 58) The conditions for bone regeneration in this model were: bone desquamation with preservation. cartilages and periosteum; the periosteum and articular cartilages are left in their original place; the humerus, femur, and tibia bones of rabbits, dogs, and chickens are experimentally removed (“husking from under the periosteum”); a “rough model of the future bone” is formed, which largely consists of from cartilage; upon further observation, under the influence of a certain muscular load - movements - a formed humerus, femur or tibia with all the structural features appears from a rough osteochondral model.
Разработанная тканеинженерная конструкция надкостницы позволяет реализовать биомиметический подход в тканевой инженерии, когда продукт при трансплантации инициирует костную регенерацию по сценарию поднадкостничной остеорегенерации, и представляет собой частный вариант тканевой инженерии вторичного развития.The developed tissue-engineered structure of the periosteum makes it possible to implement a biomimetic approach in tissue engineering, when the product during transplantation initiates bone regeneration according to the scenario of subperiosteal osteoregeneration, and represents a particular version of tissue engineering of secondary development.
Реализация предложенного способа получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов иллюстрируется следующими примерами.The implementation of the proposed method for obtaining tissue-engineered periosteum from cell spheroids for the restoration of bone defects in patients is illustrated by the following examples.
Пример 1. У кроликов-самцов калифорнийской породы массой 1 кг в ходе экспериментальной операции иссекли лоскут надкостницы с передней поверхности большеберцовой кости. Из надкостницы выделили клеточную культуру адгезивных клеток. Клеточные сфероиды стандартного размера получили с использованием трехмерного культивирования клеток надкостницы в агарозных лунках (MicroTissues Inc.®). В качестве скаффолда использовали коллагеновую мембрану ТМО «ЛИОПЛАСТ-С», которую извлекли из стерильной упаковки и разместили на дне культурального флакона (матраса для клеточных культур) с поддающейся повторной герметизации боковой крышкой. Такой флакон позволил производить любые манипуляции с тканеинженерной конструкцией в стерильных условиях внутри ламинарного шкафа. Для удержания коллагеновой мембраны в правильном положении проводили размещение титановой рамы сверху на коллагеновую мембрану, мембрану расправили прижатием рамой ко дну культурального флакона, причем размер титановой рамы соответствует размеру коллагеновой мембраны таким образом, чтобы под рамой оказывалась лишь узкая полоска по краям мембраны. Пространство, образуемое коллагеновой мембраной и внутренними боковыми краями титановой рамы использовали для внесения сфероидов. Проводили укладку одного ряда клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, клеточные сфероиды в суспензии с помощью аппликатора нанесли сверху на коллагеновую мембрану, сфероиды осадили под собственным весом, сфероиды распредели по поверхности коллагеновой мембраны титановой полоской, длина которой соответствует размерам рамы. По поверхности мембраны провели полное заполнение слоя сфероидов в 1 сфероид по высоте по всей площади верхней поверхности мембраны, ограниченной внутренними краями рамы, для выравнивания слоя сфероидов титановую полоску переместили по верхней поверхности ребер рамы несколько раз до равномерного распределения сфероидов. Для закрепления сфероидов и их частичного проникновения внутрь коллагеновой мембраны провели 3D культивирование сфероидов на поверхности коллагеновой мембраны. При этом происходит тканевое слияние сфероидов с объединением коллагенового остова сфероидов между собой в единый пласт. Этот этап 3D культивирования провели в течение 5 суток в питательной среде состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата (в качестве тромболизата у 3 животных использовали тромболизат кроликов, а у 3 кроликов - тромболизат тромбоцитов человека (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и 5% CO2 в воздушной газовой смеси. Замену питательной среды во флаконе проводили не менее 1 раз в 3 суток. Смену среды осуществляли путем аккуратной аспирации питательной среды с помощью пипеток для сохранения положения сфероидов на поверхности мембраны. Края коллагеновой мембраны, свободные от слоя сфероидов, которые были под титановой рамкой, прошили хирургическими рассасывающимися нитями для возможности последующего крепления тканеинженерной конструкции к свободным краям надкостницы реципиентного ложа вокруг костного дефекта при трансплантации созданной тканеинженерной конструкции в живой организм. Слой сфероидов расположили снаружи, вне зависимости, в трубчатую конструкцию сворачивали коллагеновую мембрану, либо если использовали в виде заплатки. Коллагеновая мембрана всегда обращена к центру костного дефекта, внутреннее пространство ограниченное коллагеновой мембраной и поверхностями костного дефекта заполнили с помощью шприца гелем, который получили путем смешивания 2% (масса/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl2. в 10 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с помощью стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 Мпа, в составе геля присутствуют факторы роста TGF-β1 и FGF-2 в количестве 10 нг/мл каждый. Этот гель необходим для заполнения пространства костного дефекта и поддержания тканеинженерной конструкции в расправленном состоянии. Фактически гель необходим для реализации остеогенных потенций тканеинженерной конструкции, свободное пространство под мембраной или между мембраной и костной тканью восстанавливаемой кости, заполненное альгинатным гелем, является по сути in vivo биореактором, внутри которого протекает репаративный остеогенез. После созревания тканеинженерная надкостница представляет собой трансплантат -биоискусственную надкостницу в виде эластичной тонкой пластины из коллагеновой мембраны и клеточных сфероидов из аутологичных культивированных клеток надкостницы, прилипших к мембране, слившихся между собой (тканевое слияние) и частично распластанных, клетки сфероидов проникают в межволоконные пространства коллагеновой мембраны, продуцируют в том числе коллагеновые волокна, преимущественно 1 типа, с образованием единого, объединяющего тканеинженерную конструкцию, коллагенового остова.Example 1. During an experimental operation, a periosteal flap was excised from the anterior surface of the tibia from male Californian rabbits weighing 1 kg. A cell culture of adhesive cells was isolated from the periosteum. Standard-sized cell spheroids were prepared using three-dimensional culture of periosteal cells in agarose wells (MicroTissues Inc.®). The collagen membrane TMO “LIOPLAST-S” was used as a scaffold, which was removed from the sterile packaging and placed at the bottom of a culture flask (mattress for cell cultures) with a re-sealable side lid. Such a bottle made it possible to carry out any manipulations with the tissue-engineered structure under sterile conditions inside a laminar flow hood. To hold the collagen membrane in the correct position, a titanium frame was placed on top of the collagen membrane, the membrane was straightened by pressing the frame to the bottom of the culture flask, and the size of the titanium frame corresponds to the size of the collagen membrane so that only a narrow strip along the edges of the membrane appears under the frame. The space formed by the collagen membrane and the inner lateral edges of the titanium frame was used to introduce spheroids. One row of cell spheroids was laid from autologous cultured periosteum cells, cell spheroids in suspension were applied on top of the collagen membrane using an applicator, the spheroids were deposited under their own weight, the spheroids were distributed over the surface of the collagen membrane with a titanium strip, the length of which corresponds to the dimensions of the frame. On the surface of the membrane, a layer of spheroids was completely filled into 1 spheroid in height over the entire area of the upper surface of the membrane, limited by the inner edges of the frame; to level the layer of spheroids, the titanium strip was moved along the upper surface of the ribs of the frame several times until the spheroids were evenly distributed. To secure the spheroids and their partial penetration into the collagen membrane, 3D cultivation of spheroids was carried out on the surface of the collagen membrane. In this case, tissue fusion of the spheroids occurs with the unification of the collagen skeleton of the spheroids with each other into a single layer. This stage of 3D cultivation was carried out for 5 days in a nutrient medium with the composition: DMEM (or DMEM/F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, 50 ml of thrombolysate (rabbit thrombolysate was used as a thrombolysate in 3 animals, and thrombolysate was used in 3 rabbits human platelets (PLTGold® Human Platelet Lysate Merck), penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg/ml (at 100% humidity above the layer of nutrient medium inside the culture vial and 5% CO2 in the air gas mixture. The nutrient medium in the vial was replaced at least once every 3 days. The medium was changed by carefully aspirating the nutrient medium using pipettes to maintain the position of the spheroids on the surface of the membrane. The edges of the collagen membrane, free from the layer of spheroids, which were under the titanium frame, were stitched with surgical absorbable threads for subsequent attachment. tissue-engineered structure to the free edges of the periosteum of the recipient bed around the bone defect during transplantation of the created tissue-engineered structure into a living organism. A layer of spheroids was placed on the outside, regardless of whether the collagen membrane was rolled into a tubular structure or used as a patch. The collagen membrane always faces the center of the bone defect, the internal space limited by the collagen membrane and the surfaces of the bone defect was filled using a syringe with a gel, which was prepared by mixing 2% (w/v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl, with an equal volume of solution containing 75 mM CaCl2. in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl using a sterile Y-mixer. The gel cures within 1 min and has a Young's modulus of 0.17 MPa; the gel contains the growth factors TGF-β1 and FGF-2 in an amount of 10 ng/ml each. This gel is necessary to fill the space of the bone defect and maintain the tissue-engineered structure in a straightened state. In fact, the gel is necessary to realize the osteogenic potential of the tissue-engineered structure; the free space under the membrane or between the membrane and the bone tissue of the restored bone, filled with alginate gel, is essentially an in vivo bioreactor within which reparative osteogenesis occurs. After maturation, the tissue-engineered periosteum is a transplant - bioartificial periosteum in the form of an elastic thin plate of collagen membrane and cell spheroids from autologous cultured periosteum cells, adhered to the membrane, fused with each other (tissue fusion) and partially spread, spheroid cells penetrate into the interfiber spaces of the collagen membrane , produce, among other things, collagen fibers, mainly type 1, with the formation of a single collagen skeleton that unites the tissue-engineered structure.
Для исследований остеогенных свойств тканеинженерной надкостницы, надкостница сворачивали в трубочку, заполняли альгинатным гелем и помещали в диффузную камеру. Камеры позволяют пассивно диффундировать нутриентам и сигнальным молекулам реципиента, но не вызывают иммунного ответа. Фильтры также предотвращают прямое взаимодействие между клетками донора и реципиента. Камеры были изготовлены по известной технологии (Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May; 20(3): 263-72. doi: 10.1111/j.1365-2184.1987.tb01309.x. PMID: 3690622).To study the osteogenic properties of tissue-engineered periosteum, the periosteum was rolled into a tube, filled with alginate gel and placed in a diffusion chamber. The chambers allow nutrients and signaling molecules to diffuse passively into the recipient, but do not trigger an immune response. Filters also prevent direct interaction between donor and recipient cells. The chambers were manufactured using well-known technology (Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987 May; 20(3): 263-72. doi: 10.1111 /j.1365-2184.1987.tb01309.x. PMID: 3690622).
Камеры трансплантировали в организм кроликов, причем тканеинженерная надкостница содержала для каждого кролика аутологичный клеточный материал. Камеры пересаживали кроликам в бедро в область межмышечных фасций (межмышечных перегородок) по 1 камере одному животному. Через 75 суток при гистологическом исследовании тканей внутри диффузной камеры обнаружили косно-хрящевой регенерат.The chambers were transplanted into the body of rabbits, and the tissue-engineered periosteum contained autologous cellular material for each rabbit. The chambers were transplanted into the rabbits' thighs in the area of the intermuscular fascia (intermuscular septa), 1 chamber per animal. After 75 days, a histological examination of the tissue inside the diffuse chamber revealed an osseous-cartilaginous regenerate.
Пример 2. У кроликов под общим наркозом в условиях операционной производили хирургический доступ к большеберцовой кости кролика. Иссекли лоскут надкостницы, которую в культуральной питательной среде с антибиотиками передали в лабораторию клеточных технологий.Example 2. In rabbits under general anesthesia in an operating room, surgical access to the tibia of a rabbit was made. A flap of periosteum was excised and transferred to the cell technology laboratory in a culture medium with antibiotics.
В лабораторных условиях производили тканеинженерную надкостницу описанным выше способом, но клеточные сфероиды, собранные в агарозных лунках, состояли из смеси аутологичных культивированных клеток камбиального слоя надкостницы и культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000 клеток на сфероид. При готовности тканеинженерной надкостнице к пересадке начинали второй этап эксперимента. У того же кролика под общим наркозом в условиях операционной с помощью хирургической проволочной пилы Джильи выпиливали в нижней трети диафиза большеберцовой кости часть (сегмент) длиной 3 см, сформировали костный дефект, превышающий критический размер. Наложили аппарат внешней фиксации (типа аппарата Илизарова). В области костного дефекта тканеинженерную надкостницу, сложенную в форме трубы с прошитыми шовным рассасывающимся материалом двумя смыкающимися краями подшили к краям интактной надкостницы костных опилов по типу конец в конец. Образуемое тканеинженерной надкостницей внутреннее пространство заполнили описанным выше альгинатным гелем с цитокинами инъекционным путем через прокол тканеинженерной надкостницы иглой заполненного гелем шприца. При надавливании на поршень шприца пространство, ограниченное тканеинженерной надкостницей, медленно заполнили гелем, способствуя расправлению мембраны тканеинженерной надкостницы и сохранения внутреннего пространства, ограниченного коллагеновой мембраной со сфероидами. Произвели послойное ушивание раны с наложением асептической повязки. Животное выводили из наркоза и содержали в виварии в отдельной клетке.Tissue-engineered periosteum was produced in vitro as described above, but the cell spheroids collected in agarose wells consisted of a mixture of autologous cultured periosteal cambial cells and cultured multipotent bone marrow mesenchymal stromal cells in a 2:1 ratio at 6000 cells per spheroid. When the tissue-engineered periosteum was ready for transplantation, the second stage of the experiment began. In the same rabbit, under general anesthesia, in the operating room, using a Gigli surgical wire saw, a part (segment) 3 cm long was cut out in the lower third of the diaphysis of the tibia, and a bone defect exceeding the critical size was formed. An external fixation device (Ilizarov type) was applied. In the area of the bone defect, the tissue-engineered periosteum, folded in the shape of a tube with two intersecting edges stitched with absorbable suture material, was sutured to the edges of the intact periosteum of bone saws in an end-to-end manner. The internal space formed by the tissue-engineered periosteum was filled with the above-described alginate gel with cytokines by injection through a puncture of the tissue-engineered periosteum with a needle of a gel-filled syringe. When pressing on the syringe plunger, the space limited by the tissue-engineered periosteum was slowly filled with gel, helping to straighten the membrane of the tissue-engineered periosteum and preserve the internal space limited by the collagen membrane with spheroids. The wound was sutured in layers and an aseptic dressing was applied. The animal was taken out of anesthesia and kept in a vivarium in a separate cage.
Обнаружено формирование регенерата скелетных тканей под тканеинженерной надкостницей между костными отломками с их объединением в единый орган. Контроль роста регенерата проводили в динамике в течение 6 месяцев с помощью компьютерной томографии, гистологических и иммуногистохимических исследований.The formation of regenerated skeletal tissues under the tissue-engineered periosteum between bone fragments with their unification into a single organ was discovered. The growth of the regenerate was monitored over a period of 6 months using computed tomography, histological and immunohistochemical studies.
Пример 3. Кролику с хирургическим моделированием посттравматической потери окружности большеберцовой кости на 55% и длиной 3 см подшили тканеинженерную надкостницу к интактной надкостнице в виде заплатки. Под заплаткой внутреннее свободное пространство заполнили альгинатным гелем с цитокинами инъекционным путем через прокол тканеинженерной надкостницы иглой шприца. Заплаткой восстанавливили целостность соединительнотканного чехла надкостницы окружающей кость. Провели послойное ушивание раны. Животное выводили из наркоза и содержали в виварии в отдельной клетке, фиксирующие аппараты не накладывали. В эксперименте использовали 6 кроликов опытной группы с установкой тканеинженерной надкостницей и 6 кроликов контрольной группы, в которой только формировали костный дефект.Example 3. A rabbit with surgical simulation of a post-traumatic loss of tibial circumference by 55% and a length of 3 cm was sutured with tissue-engineered periosteum to the intact periosteum in the form of a patch. Under the patch, the internal free space was filled with alginate gel with cytokines by injection through a puncture of the tissue-engineered periosteum with a syringe needle. The patch restored the integrity of the connective tissue cover of the periosteum surrounding the bone. The wound was sutured in layers. The animal was taken out of anesthesia and kept in a vivarium in a separate cage; no fixation devices were applied. The experiment used 6 rabbits from the experimental group with the installation of tissue-engineered periosteum and 6 rabbits from the control group, in which only the bone defect was formed.
Обнаружили формирование регенерата скелетных тканей под тканеинженерной надкостницей. Контроль формирования регенерата проводили в динамике в течение 9 месяцев с помощью компьютерной томографии, гистологических и иммуногистохимических исследований.The formation of regenerated skeletal tissue under the tissue-engineered periosteum was discovered. The formation of the regenerate was monitored over a period of 9 months using computed tomography, histological and immunohistochemical studies.
Claims (5)
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2022117576A Division RU2819284C2 (en) | 2022-06-29 | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818176C1 true RU2818176C1 (en) | 2024-04-25 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7335508B2 (en) * | 2004-07-22 | 2008-02-26 | Prochon Biotech Ltd. | Porous plasma protein matrices and methods for preparation thereof |
| US20090181007A1 (en) * | 2006-04-14 | 2009-07-16 | Luisa Gennero | Culture medium and pharmaceutical composition for regenerating cartilage tissue, a method, uses and products related thereto |
| US8328876B2 (en) * | 2003-12-31 | 2012-12-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
| RU2744664C1 (en) * | 2020-03-02 | 2021-03-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for the production of spheroids from cultured cells of the periosteum to ensure reparative osteogenesis |
| RU2744756C1 (en) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size |
| RU2747087C1 (en) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration |
| RU2759491C1 (en) * | 2021-04-01 | 2021-11-15 | Сергей Сергеевич Иванов | Method for surgical reconstruction in the elimination of defects in the maxillary sinus mucosa larger than 10 mm and total mucosal defects when performing sinus lifting with implantation |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8328876B2 (en) * | 2003-12-31 | 2012-12-11 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Bone matrix compositions and methods |
| US7335508B2 (en) * | 2004-07-22 | 2008-02-26 | Prochon Biotech Ltd. | Porous plasma protein matrices and methods for preparation thereof |
| US20090181007A1 (en) * | 2006-04-14 | 2009-07-16 | Luisa Gennero | Culture medium and pharmaceutical composition for regenerating cartilage tissue, a method, uses and products related thereto |
| RU2744664C1 (en) * | 2020-03-02 | 2021-03-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for the production of spheroids from cultured cells of the periosteum to ensure reparative osteogenesis |
| RU2744756C1 (en) * | 2020-06-01 | 2021-03-15 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size |
| RU2747087C1 (en) * | 2020-08-31 | 2021-04-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for production of biocomposite spheroids for bone restoration |
| RU2759491C1 (en) * | 2021-04-01 | 2021-11-15 | Сергей Сергеевич Иванов | Method for surgical reconstruction in the elimination of defects in the maxillary sinus mucosa larger than 10 mm and total mucosal defects when performing sinus lifting with implantation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2441994C (en) | Composition and methods for the production of biological tissues and tissue constructs | |
| Yamada et al. | Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold | |
| ES2367694T3 (en) | PARTICULATED CARTRIDGE SYSTEM. | |
| ES2775977T3 (en) | Prosthetic bone-like implants | |
| ES2546734T3 (en) | Rapid preparation and use of tissues and structures obtained by tissue engineering as individual implants | |
| Zhao et al. | Comparative study between tissue‐engineered periosteum and structural allograft in rabbit critical‐sized radial defect model | |
| AU2002306835A1 (en) | Composition and Methods for the Production of Biological Tissues and Tissue Constructs | |
| JP4279233B2 (en) | Sheet for inducing mesenchymal tissue regeneration and method for producing the same | |
| RU2818176C1 (en) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients | |
| Martin et al. | Producing prefabricated tissues and organs via tissue engineering | |
| RU2545993C2 (en) | Method for repairing long bone defects of critical size | |
| Tan et al. | The promotion of the vascularization of decalcified bone matrix in vivo by rabbit bone marrow mononuclear cell-derived endothelial cells | |
| US8367059B2 (en) | Materials and methods for cryopreserved bone constructs | |
| KR20110032433A (en) | The method of manufacturing the transplantable spheroids of mixed cellular complexes for cell transplantation and the usage of the same | |
| RU2819284C2 (en) | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject | |
| RU2645963C2 (en) | Method of increasing the volume of bone tissue of the crest of alveolar process of the jaw | |
| RU2240135C1 (en) | Cell culture comprising precursor cells of osteogenesis, implant based on thereof and its applying for recovery bone integrity | |
| RU2744756C1 (en) | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size | |
| RU2750021C1 (en) | Method for restoration of diaphysis of long tubular bones using cellular technologies | |
| RU2800991C2 (en) | Method of biofabrication of a transplant in the form of cell spheroids for regenerative technologies for restoring a subject's cartilage based on the subject's own costal cartilage perichondrium and multipotent mesenchymal stromal bone marrow cells of the same subject | |
| RU2744732C1 (en) | Biocomposite spheroid for bone repair and method of its preparation | |
| KR20060107897A (en) | Cartilage composition for grafting | |
| RU2807692C2 (en) | Method for obtaining tissue-engineered perichondrium transplant based on cell spheroids | |
| Ueda | Applied Tissue Engineering | |
| RU2685148C1 (en) | Composite material for bone defect replacement |