RU2815532C1 - Diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus and identifying subtype of hemagglutinating viral agent in hemagglutination inhibition reaction - Google Patents
Diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus and identifying subtype of hemagglutinating viral agent in hemagglutination inhibition reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815532C1 RU2815532C1 RU2023116310A RU2023116310A RU2815532C1 RU 2815532 C1 RU2815532 C1 RU 2815532C1 RU 2023116310 A RU2023116310 A RU 2023116310A RU 2023116310 A RU2023116310 A RU 2023116310A RU 2815532 C1 RU2815532 C1 RU 2815532C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- avian influenza
- influenza virus
- subtype
- vladimir
- virus
- Prior art date
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 136
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 title claims abstract description 40
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 75
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 72
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims abstract description 72
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims abstract description 40
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims abstract description 8
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 19
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 21
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 20
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 20
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 18
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 18
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 18
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 18
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 18
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 16
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 8
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 7
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 3
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 3
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000004370 retrospective diagnosis Methods 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000252864 H7N2 subtype Species 0.000 description 2
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 description 2
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 2
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000252843 H5N2 subtype Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004712 air sac Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000002048 axillary vein Anatomy 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002310 elbow joint Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000002976 pectoralis muscle Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002061 vacuum sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации при разработке и производстве средств диагностики.The invention relates to veterinary virology and biotechnology, in particular to the creation of a diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of the viral agent in the hemagglutination inhibition reaction in the development and production of diagnostic tools.
Грипп птиц - высококонтагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпизоотии и панзоотии с различным уровнем смертности в зависимости от степени патогенности возбудителей. Вирусы гриппа птиц (ВГП) типа А циркулируют среди диких водоплавающих птиц, преимущественно из отряда гусеобразных, которые являются природным резервуаром данного патогена [1].Avian influenza is a highly contagious viral disease that causes seasonal epizootics and panzootics with varying mortality rates depending on the degree of pathogenicity of the pathogens. Avian influenza viruses (AIV) type A circulate among wild waterfowl, mainly from the order Anseriformes, which are the natural reservoir of this pathogen [1].
Возбудитель гриппа птиц - РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae) роду Alphainfluenzavirus, к виду Influenza A virus (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). По внешнему виду вирион представляет из себя спиральный нуклеокапсид, заключенный в липопротеидную оболочку. Вирусная РНК имеет сегментированное строение, что способствует высокой степени реассортации данного вируса. Такой процесс называется антигенный сдвиг (antigenic shift) и является основной причиной появления новых подтипов данного вируса [2, 3].The causative agent of avian influenza is an RNA-containing virus belonging to the Orthomyxoviridae family, genus Alphainfluenzavirus, species Influenza A virus (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). In appearance, the virion is a helical nucleocapsid enclosed in a lipoprotein shell. Viral RNA has a segmented structure, which contributes to a high degree of reassortment of this virus.This process is called antigenic shift and is the main reason for the emergence of new subtypes of this virus [2, 3].
Классификация вирусов гриппа основана на антигенных свойствах поверхностных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На данный момент у диких и домашних птиц выделено шестнадцать подтипов НА (Н1-Н16) и девять подтипов NA (N1-N9). Репликация вируса в основном происходит в желудочно-кишечном тракте, что приводит к выделению фекалий, содержащих вирионы, поэтому фекально-оральный способ считается основным путем передачи инфекции среди диких птиц [2].The classification of influenza viruses is based on the antigenic properties of surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Currently, sixteen HA subtypes (H1-H16) and nine NA subtypes (N1-N9) have been identified in wild and domestic birds. Virus replication primarily occurs in the gastrointestinal tract, resulting in the excretion of feces containing virions, and the fecal-oral route is considered the main route of transmission among wild birds [2].
Инфекционный процесс у диких водоплавающих птиц в основном протекает в бессимптомной форме, это объясняется тем, что данная форма течения заболевания вызвана низкопатогенными вирусами гриппа птиц. Однако вирусы гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 могут эволюционировать в высокопатогенные формы данного вируса, который, при попадании в частные или коммерческие птицеводческие хозяйства, может привести к 100% смертности всего поголовья. Случаи выявления данных подтипов подлежат обязательному уведомлению во Всемирную организацию здравоохранения животных (ВОЗЖ) [4].The infectious process in wild waterfowl is mainly asymptomatic, this is explained by the fact that this form of the disease is caused by low-pathogenic avian influenza viruses. However, avian influenza viruses of subtypes H5 and H7 can evolve into highly pathogenic forms of this virus, which, if released into private or commercial poultry farms, can lead to 100% mortality of the entire flock. Cases of detection of these subtypes are subject to mandatory notification to the World Organization for Animal Health (OIE) [4].
В настоящее время на территории Евразии наблюдается распространение высокопатогенного гриппа птиц, вызванного вирусом типа А, подтипа H5N8, предком которого принято считать штамм A/Goose/Guangdong/1/96, выделенный в Китае в 1996 году. Впоследствии, распространившись по всей территории Евразии, этот штамм положил начало «Азиатской генетической линии вирусов высокопатогенного гриппа птиц». Считается, что этот подтип является одним из наиболее опасных, так как вызывает огромные экономические потери в птицеводческих хозяйств [1, 3, 6, 7].Currently, in Eurasia there is a spread of highly pathogenic avian influenza caused by a virus type A, subtype H5N8, the ancestor of which is considered to be the strain A/Goose/Guangdong/1/96, isolated in China in 1996. Subsequently, spreading throughout Eurasia, this strain marked the beginning of the “Asian genetic line of highly pathogenic avian influenza viruses.” It is believed that this subtype is one of the most dangerous, as it causes huge economic losses in poultry farms [1, 3, 6, 7].
За последние 15 лет в странах Азии, Европы и Северной Америке было зафиксировано более 100 вспышек высокопатогенного гриппа птиц, вызванного вирусом гриппа птиц подтипа Н7. Несмотря на то, что большая часть из них была зафиксирована в Северной Америке, вирусы H7N9 и H7N7 стали причиной гибели более 2,5 млн. птиц в странах Европы и Азии. Эти факты указывают на то, что вирусы Н7 активно циркулируют в природе и продолжают представлять угрозу для мировой птицеводческой отрасли [5].Over the past 15 years, more than 100 outbreaks of highly pathogenic avian influenza caused by the H7 avian influenza virus have been recorded in Asia, Europe and North America. Although most of them were recorded in North America, the H7N9 and H7N7 viruses caused the death of more than 2.5 million birds in Europe and Asia. These facts indicate that H7 viruses are actively circulating in nature and continue to pose a threat to the global poultry industry [5].
Способность данных вирусов обмениваться генетическим материалом повышает вероятность эволюции и появления вирусов с неизвестными свойствами, возможно, с высоким пандемическим потенциалом.The ability of these viruses to exchange genetic material increases the likelihood of the evolution and emergence of viruses with unknown properties, possibly with high pandemic potential.
В связи с высокими экономическими потерями, а также возможностью инфицирования людей вирусом гриппа птиц подтипа Н5 и Н7, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) уделяет этому пристальное внимание, проводит работу по антигенной и генетической характеристике вируса для разработки новых средств специфической лабораторной диагностики [8].Due to high economic losses, as well as the possibility of human infection with the avian influenza virus of subtypes H5 and H7, the World Health Organization (WHO) pays close attention to this and is working on the antigenic and genetic characterization of the virus to develop new means of specific laboratory diagnostics [8].
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) является «золотым стандартом» серологической диагностики гриппа птиц. Данный метод обладает высокой чувствительностью и позволяет как определить уровень антител в сыворотке крови, так и идентифицировать подтип гемагглютинирующего вирусного агента. Кроме того, реакция требует минимального количества оборудования и может быть проведена в полевых условиях [5].The hemagglutination inhibition test (HIT) is the “gold standard” for the serological diagnosis of avian influenza. This method is highly sensitive and allows both to determine the level of antibodies in blood serum and to identify the subtype of the hemagglutinating viral agent. In addition, the reaction requires a minimal amount of equipment and can be carried out in the field [5].
В Российской Федерации в настоящее время известны наборы для серологической диагностики гриппа птиц.In the Russian Federation, kits for serological diagnosis of avian influenza are currently available.
Известен набор для выявления антител к вирусу гриппа типа А иммуноферментным методом «ГРИПП А СЕРОТЕСТ» [9]. Способ заключается в связывании специфических антител к вирусу гриппа с вирусным антигеном, сорбированным на дне лунок полистиролового планшета, последующим выявлением количества связавшихся антител с использованием конъюгата - антивидовых антител и ферментной метки. Данный метод характеризуется очень высокой чувствительность, что негативно сказывается на специфичности.There is a known kit for detecting antibodies to the influenza A virus using the enzyme immunoassay method “FLU A SEROTEST” [9]. The method consists of binding specific antibodies to the influenza virus with a viral antigen sorbed at the bottom of the wells of a polystyrene plate, followed by identifying the amount of bound antibodies using a conjugate - anti-species antibodies and an enzyme label. This method is characterized by very high sensitivity, which negatively affects specificity.
Известен способ выявления антител к гемагглютинину вируса гриппа А, позволяет обеспечить возможность детекции антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц у разных видов птиц и животных с использованием методов инструментального учета реакции [10].A known method for detecting antibodies to the hemagglutinin of the influenza A virus makes it possible to detect antibodies to the hemagglutinin of the avian influenza virus in different species of birds and animals using instrumental reaction methods [10].
Известна диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 при проведении иммуноферментного анализа (ИФА), на твердофазном носителе с использованием пероксидазного конъюгата [11].A known diagnostic test system for detecting the avian influenza A/H5N1 virus during enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on a solid-phase carrier using a peroxidase conjugate [11].
К недостаткам можно отнести необходимость наличия дорогостоящего оборудования (ИФА-анализатор) и строгую специфичность используемого конъюгата, из за чего в реакции тестируются только сыворотки от определенных видов птиц.Disadvantages include the need for expensive equipment (ELISA analyzer) and the strict specificity of the conjugate used, which is why only sera from certain species of birds are tested in the reaction.
Известен набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации, производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов», с помощью которого можно исследовать сыворотки крови птиц на 15 подтипов по гемагглютинину. В его состав входят:There is a known set of antigens and sera for diagnosing avian influenza in the hemagglutination inhibition reaction, produced by OJSC Pokrovsky Biological Products Plant, with which it is possible to examine avian blood serum for 15 subtypes of hemagglutinin. It includes:
- инактивированные референтные штаммы вируса гриппа птиц с подтипами гемагглютинина HI-HI 5;- inactivated reference strains of avian influenza virus with hemagglutinin subtypes HI-HI 5;
- моноспецифические гипериммунные сыворотки к 15 серологическим вариантам вируса гриппа птиц (HI-HI5);- monospecific hyperimmune sera to 15 serological variants of the avian influenza virus (HI-HI5);
- нормальная сыворотка, не содержащая антител к вирусу гриппа птиц [12].- normal serum that does not contain antibodies to the avian influenza virus [12].
Несмотря на большое разнообразия подтипов гемагглютинина и нейраминидазы, представленных в данном наборе, для производства используются штаммы ВГП полученные до 2010 года.Despite the wide variety of hemagglutinin and neuraminidase subtypes presented in this set, AIV strains obtained before 2010 are used for production.
Известен набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации (организация-производитель: ФГБУ «ВНИИЗЖ»), который содержит иммуноспецифические и неспецифические компоненты [13].There is a known kit for detecting antibodies to the avian influenza virus subtype H5 in the hemagglutination inhibition reaction (manufacturer: FGBU "ARRIAH"), which contains immunospecific and nonspecific components [13].
Известен Набор диагностический «РТГА-ВПГ-СтавБио», для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации, производства ФКП «Ставропольская биофабрика». Набор предназначен для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации при осуществлении серологического мониторинга распространения вируса в популяциях, для оценки эффективности иммунизации поголовья, с целью ретроспективной диагностики гриппа птиц у всех видов птиц [14].Known is the diagnostic kit "RTGA-HSV-StavBio", for the detection of antibodies to the avian influenza virus of subtype H5 in the hemagglutination inhibition reaction, produced by the FKP "Stavropol Biofactory". The kit is designed to detect antibodies to the H5 avian influenza virus in the hemagglutination inhibition reaction when carrying out serological monitoring of the spread of the virus in populations, to assess the effectiveness of immunization of livestock, for the purpose of retrospective diagnosis of avian influenza in all bird species [14].
Недостатком наборов является возможность выявлять антитела к вирусу гриппа птиц только подтипа Н5, а также использование неактуального штамма при производстве набора.The disadvantage of the kits is the ability to detect antibodies to the avian influenza virus only of the H5 subtype, as well as the use of an irrelevant strain in the production of the kit.
Известен Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации. Недостаток данного набора в том, что он выявляет антитела только к вирусу гриппу птиц подтипа Н9 [15].Known Diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus subtype H9 in the hemagglutination inhibition reaction. The disadvantage of this kit is that it detects antibodies only to the H9 subtype avian influenza virus [15].
Известна Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПНР), производства ООО «Ветбиохим». Тест-система предназначена для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах сывороток крови и патологического материала от птиц и млекопитающих и в инфицированных культурах клеток [16].A well-known test system for the detection and differentiation of influenza A virus subtypes H5 and H7 using the polymerase chain reaction (PCR) method, produced by Vetbiohim LLC. The test system is designed for the detection and differentiation of influenza A virus subtypes H5 and H7 by polymerase chain reaction (PCR) in samples of blood serum and pathological material from birds and mammals and in infected cell cultures [16].
Известен Набор для выявления вируса гриппа птиц А с типированием «Н5 - Н7 - Н9 - ИДС» (Influenza virus а), производства компании IDS™. Позволяет выявлять и дифференцировать РНК вируса гриппа птиц А субтипов Н5, Н7, Н9 в биологических пробах методом ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной схемой детекции в присутствии внутреннего контрольного образца этапа выделения [17].Known is the Kit for identifying avian influenza virus A with typing “H5 - H7 - H9 - IDS” (Influenza virus a), produced by IDS™. Allows you to detect and differentiate RNA of the avian influenza A virus subtypes H5, H7, H9 in biological samples using real-time PCR with a fluorescent detection scheme in the presence of an internal control sample at the isolation stage [17].
Известна Тест-система ПЦР РВ Грипп А-Н5/Н7/Н9 - ЩБК, для выявления РНК вируса гриппа А субтипов Н5/Н7/Н9 в биологическом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени [18].The RT PCR test system Influenza A-H5/H7/H9 - ShBK is known for detecting RNA of the influenza A virus of subtypes H5/H7/H9 in biological material by reverse transcription and polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time [18].
Известен набор реагентов, предназначенный для качественного определения и дифференциации подтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А (Influenza virus А) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» - «АмплиПрайм® Грипп Н5 / Н7 / Н9», производства «НекстБио». Набор предназначен для качественного определения и дифференциации подтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа A (Influenza virus А) в биологическом материале, полученном от птиц (помет, мазки из клоаки, ротоглотки, носоглотки и трахеи, тканевой (аутопсийный) материал трахеи и легких, селезенки, головного мозга, воздухоносных мешков, кишечника, сердца, почек, яйца, аллантоисная жидкость эмбрионов кур), в пробах мяса, продуктах переработки, субпродуктах, мазках с поверхности мяса и субпродуктов, кормах методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» [19].There is a known set of reagents intended for the qualitative determination and differentiation of subtypes H5, H7 and H9 of the influenza virus A (Influenza virus A) using the RT-PCR method with hybridization-fluorescent detection of amplification products in real time - “AmpliPrime® Influenza H5 / H7 / N9", produced by NextBio. The kit is intended for qualitative determination and differentiation of subtypes H5, H7 and H9 of influenza virus A (Influenza virus A) in biological material obtained from birds (droppings, smears from the cloaca, oropharynx, nasopharynx and trachea, tissue (autopsy) material of the trachea and lungs, spleen, brain, air sacs, intestines, heart, kidneys, eggs, allantoic fluid of chicken embryos), in meat samples, processed products, offal, swabs from the surface of meat and offal, feed using RT-PCR with hybridization-fluorescence detection of amplification products in real time [19].
Недостатком является необходимость наличия дорогостоящего оборудования и высокая квалификация специалистов при постановке ПЦР.The disadvantage is the need for expensive equipment and highly qualified specialists when performing PCR.
Наиболее близким по технической сущности и по совокупности существенных признаков к заявляемому и взятым за прототип является набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, который разработан в ФГБУ «ВНИИЗЖ». Недостаток данного набора заключается в том, что в прилагаемых документах не прописаны наименования штаммов, на которые получены специфические компоненты [20].The closest in technical essence and in terms of the totality of essential features to the claimed one and taken as a prototype is a kit for detecting antibodies to the avian influenza virus of subtypes H5 and H7, which was developed at the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH". The disadvantage of this kit is that the attached documents do not indicate the names of the strains for which specific components were obtained [20].
Как представлено выше, существует множество наборов для выявления антител к вирусу гриппа птиц, для типирования изолятов, выделенных при вспышках заболевания гриппа птиц. Учитывая высокую генетическую изменчивость вирусов гриппа птиц, для диагностики данного заболевания необходимо использовать более актуальные штаммы.As presented above, there are many kits available to detect antibodies to avian influenza virus for typing isolates isolated from avian influenza outbreaks. Given the high genetic variability of avian influenza viruses, it is necessary to use more current strains to diagnose this disease.
Целью изобретения является разработка диагностического набора на основе актуальных штаммов вируса гриппа птиц, позволяющего выявлять антитела к НА вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 и идентифицировать подтип гемагглютинина выделенного вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации.The purpose of the invention is to develop a diagnostic kit based on current strains of the avian influenza virus, which makes it possible to detect antibodies to the HA of the avian influenza virus subtypes H5 and H7 and to identify the hemagglutinin subtype of the isolated viral agent in the hemagglutination inhibition reaction.
Поставленная цель достигается тем, что используемые в диагностическом наборе специфические антигены вируса гриппа птиц получены из штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Специфические гомологичные сыворотки получены на штаммы вируса гриппа птиц «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Реакция торможения гемагглютинации основана на том, что при контакте иммунной сыворотки с гомологичным вирусом и специфической гипериммунной сыворотки с антигеном выделенного вируса образуется комплекс антиген-антитело, в результате чего, вирус теряет способность гемагглютинировать эритроциты крови.This goal is achieved by the fact that the specific antigens of the avian influenza virus used in the diagnostic kit are obtained from the strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of subtype H5 and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of subtype H7. Specific homologous sera were obtained for avian influenza virus strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” subtype H5 and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” subtype H7. The hemagglutination inhibition reaction is based on the fact that upon contact of immune serum with a homologous virus and specific hyperimmune serum with the antigen of the isolated virus, an antigen-antibody complex is formed, as a result of which the virus loses its ability to hemagglutinate red blood cells.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современного, высокоспецифичного диагностического набора, предназначенного для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации с применением штаммов вируса гриппа птиц «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7.The technical result of the invention is the development of a modern, highly specific diagnostic kit designed to detect antibodies to the avian influenza virus and identify the subtype of the hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction using strains of the avian influenza virus "A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2" subtype H5 and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” subtype H7.
В состав предлагаемого набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации входят:The proposed kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of the hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction includes:
1. Инактивированный антиген штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5, лиофилизированный, объем 2,0 см3 - 8 флаконов;1. Inactivated antigen of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus of subtype H5, lyophilized, volume 2.0 cm 3 - 8 bottles;
2. Инактивированный антиген штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7, лиофилизированный, объем 2,0 см3 - 8 флаконов;2. Inactivated antigen of the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus of subtype H7, lyophilized, volume 2.0 cm 3 - 8 bottles;
3. Гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 (положительный контроль Н5), лиофилизированная, объем 1,0 см3 - 2 флакона;3. Hyperimmune blood serum of chickens to the avian influenza virus subtype H5 (positive control H5), lyophilized, volume 1.0 cm 3 - 2 bottles;
4. Гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу гриппа птиц подтипа Н7 (положительный контроль Н7), лиофилизированная, объем 1,0 см3 - 2 флакона;4. Hyperimmune blood serum of chickens to the avian influenza virus subtype H7 (positive control H7), lyophilized, volume 1.0 cm 3 - 2 bottles;
5. Сыворотка крови кур нормальная (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу гриппа птиц, лиофилизированная, объем 1,0 см3 - 4 флакона.5. Normal chicken blood serum (negative control), not containing antibodies to the avian influenza virus, lyophilized, volume 1.0 cm 3 - 4 bottles.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях.The essence of the invention is reflected in graphic images.
Фиг. 1 - Схема РТГА.Fig. 1 - RTGA diagram.
Фиг. 2 - Интерпретация результатов реакции.Fig. 2 - Interpretation of reaction results.
Фиг. 3 - Дендрограмма, видовая принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» методом секвенирования.Fig. 3 - Dendrogram, species identification of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” by sequencing method.
Фиг. 4 - Дендрограмма, видовая принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» методом секвенирования.Fig. 4 - Dendrogram, species identification of the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” by sequencing method.
Разработанный диагностический набор на основе актуальных штаммов вируса гриппа птиц («А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2») подтипа Н5 и («А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2») подтипа Н7, позволяющего выявлять и определять титр антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 и идентифицировать изоляты вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации основан на специфическом взаимодействии антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови птиц, с антигеном вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7, что приводит к потере его агглютинирующих свойств и визуально проявляется оседанием или склеиванием эритроцитов. Схема РТГА представлена на фиг. 1.A developed diagnostic kit based on current strains of the avian influenza virus (“A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2”) subtype H5 and (“A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2”) subtype H7, which allows the detection and determination of antibody titer to the hemagglutinin of the avian influenza virus subtypes H5 and H7 and to identify avian influenza virus isolates in the hemagglutination inhibition reaction is based on the specific interaction of antibodies contained in the test avian blood serum with the antigen of the avian influenza virus subtypes H5 and H7, which leads to the loss of its agglutinating properties and visually manifested by sedimentation or gluing of red blood cells. The RTGA diagram is shown in Fig. 1.
РТГА для выявления антител проводят в три этапа:RTGA to detect antibodies is carried out in three stages:
- определение гемагглютинирующих титров антигенов в реакции гемагглютинации;- determination of hemagglutinating antigen titers in the hemagglutination reaction;
- подготовка рабочей дозы антигенов;- preparation of a working dose of antigens;
- выявление специфических антител в пробах сыворотки крови.- detection of specific antibodies in blood serum samples.
РТГА для идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента проводят аналогичным образом, за исключением того, что в качестве антигена выступает выделенный изолят вируса, чьи поверхностные белки обладают гемагглютинирующими свойствами.To identify the subtype of a hemagglutinating viral agent, RTGA is carried out in a similar way, except that the antigen is an isolated virus isolate whose surface proteins have hemagglutinating properties.
Сущность реакции гемагглютинации заключается в специфических свойствах гемагглютинина склеивать эритроциты чувствительного животного. Реакцию оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде «зонтика», отрицательно - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле. За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ). Гемагглютинирующая активность представленных антигенов должна быть не ниже 1:128. Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в отрицательном контроле.The essence of the hemagglutination reaction lies in the specific properties of hemagglutinin to glue the red blood cells of a sensitive animal. The reaction is assessed positively when erythrocytes settle in the form of an “umbrella”, negatively - in the form of a “button” in the absence of spontaneous agglutination in the control. The antigen titer is taken to be its highest dilution, which gives a clearly defined agglutination of erythrocytes in the form of an “umbrella”, which corresponds to 1 hemagglutinating unit (1 HAU). The hemagglutinating activity of the presented antigens must be at least 1:128. The reaction is taken into account after the sedimentation of erythrocytes in the negative control.
Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и рабочей дозы вируса (антигена) и после экспозиции (30-60 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного. Рабочую дозу антигена (4 ГАЕ) готовят из гемагглютинирующего титра, установленного в реакции гемагглютинации. Если рабочая доза подготовлена правильно, то при постановки реакции гемагглютинации, как для выявления антител, так и для типирования изолятов вируса гриппа птиц, результаты должны быть следующими:The principle of RTGA is that equal volumes of blood serum and a working dose of the virus (antigen) are mixed in a test tube (well) and, after exposure (30-60 minutes), red blood cells of the corresponding animal species are added. A working dose of antigen (4 HAU) is prepared from the hemagglutinating titer established in the hemagglutination reaction. If the working dose is prepared correctly, then when performing a hemagglutination reaction, both for detecting antibodies and for typing avian influenza virus isolates, the results should be as follows:
1) В первой и второй лунках должна быть полная агглютинация («зонтик»);1) In the first and second wells there must be complete agglutination (“umbrella”);
2) В третьей лунке, содержащей 1/2 ГАЕ - частичная («несформировавшаяся пуговка»);2) In the third hole, containing 1/2 GAE - partial (“unformed button”);
3) В четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка») (Фиг. 2).3) In the fourth - absence of agglutination (“button”) (Fig. 2).
Рабочую дозу антигенов готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят путем добавления антигена или фосфатно-буферного раствора (ФБР) с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.The working dose of antigens is prepared directly on the day of the reaction with mandatory control of 4 GAU. Adjustment of the working dose (increase or decrease) is carried out by adding antigen or phosphate-buffered solution (PBS) with mandatory repeated monitoring of 4 GAU.
Для выявления специфических антител в пробах сыворотки крови от птиц во все лунки планшета полимерного для иммунологических реакций (круглодонного) вносят ФБР в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3. Затем в первую лунку горизонтального ряда добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096.To detect specific antibodies in blood serum samples from birds, PBS in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 is added to all wells of a polymer plate for immunological reactions (round bottom). Then an equal volume of test serum is added to the first well of the horizontal row, pipetted three times and a series of successive two-fold dilutions from 1:2 to 1:4096 are prepared.
После этого во все лунки вносят рабочее разведение антигена в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3, осторожно встряхивают и после 30 минут контакта при температуре 18-25°С в каждую лунку добавляют 0,025 см3 или 0,050 см3 1% суспензии эритроцитов. Планшеты аккуратно встряхивают и оставляют при температуре 18-25°С на 30-60 минут.After this, a working dilution of the antigen in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 is added to all wells, gently shaken, and after 30 minutes of contact at a temperature of 18-25 ° C, 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of a 1% suspension of erythrocytes is added to each well. The tablets are gently shaken and left at a temperature of 18-25°C for 30-60 minutes.
Одновременно ставят контроли реакции:At the same time, reaction controls are set:
- на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов и определение времени учета реакции. В две-три лунки планшета с объемом ФБР 0,025 см3 или 0,050 см3 добавить по 0,025 см3 или 0,050 см3 1% суспензии эритроцитов. Спонтанная агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.- for the absence of spontaneous agglutination of erythrocytes and determination of the time for recording the reaction. Add 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of 1% red blood cell suspension to two or three wells of a plate with an PBS volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 . There should be no spontaneous agglutination of red blood cells.
- на отсутствие изоагглютинации сыворотки. В лунку планшета вносят 0,025 см3 или 0,050 см3 ФБР, добавляют равный объем сыворотки и 1% суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. В случае проявления изоагглютинации к 0,050 см3 сыворотки добавить 0,025 см3 осадка отмытых эритроцитов, тщательно встряхивают и выдерживают не менее 30 минут при 18-25°С. Затем эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин (800 g) в течение 3-5 минут. При данном исходе реакции необходимо отобрать сыворотку и использовать для повторной постановки реакции.- the absence of serum isoagglutination. 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of PBS is added to the well of the tablet, an equal volume of serum and 1% erythrocyte suspension are added. There should be no agglutination of red blood cells. In case of isoagglutination, add 0.025 cm 3 of washed erythrocyte sediment to 0.050 cm 3 of serum, shake thoroughly and incubate for at least 30 minutes at 18-25 ° C. The red blood cells are then pelleted by centrifugation at 1500 rpm (800 g) for 3-5 minutes. With this outcome of the reaction, it is necessary to select the serum and use it to repeat the reaction.
- контроль активности положительной и отрицательной сывороток крови. В лунки одного ряда планшета вносят по 0,025 см3 или 0,050 см3 ФБР. Затем в первые лунки добавляют равные объемы специфической и нормальной сыворотки, трижды пипетируют и готовят последовательные двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. После этого в лунки вносят рабочую дозу антигена в выбранном объеме для постановки реакции, осторожно встряхивают и оставляют для контакта в течение 30 минут при температуре 18-25°С, после чего в каждую лунку добавляют по 0,025 см3 или 0,050 см3 1%-ной суспензии эритроцитов. Контрольная положительная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре 1:128 плюс или минус одно разведение. Нормальная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре, меньшем, чем 1:4.- control of the activity of positive and negative blood serum. 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of PBS is added to the wells of one row of the tablet. Then equal volumes of specific and normal serum are added to the first wells, pipetted three times and serial two-fold dilutions from 1:2 to 1:4096 are prepared. After this, a working dose of the antigen is added to the wells in the selected volume for setting up the reaction, gently shaken and left for contact for 30 minutes at a temperature of 18-25 ° C, after which 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of 1% is added to each well. ny suspension of erythrocytes. The control positive serum should inhibit the hemagglutinating activity of the 4 HAE antigen at a titer of 1:128 plus or minus one dilution. Normal serum should inhibit the hemagglutinating activity of 4 HAE antigen in a titer less than 1:4.
Учет результатов реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде «пуговки»). Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса гриппа птиц.The reaction results are recorded visually after complete sedimentation of red blood cells in the control wells (in the form of a “button”). The serum titer is considered to be its highest dilution, in which agglutination of red blood cells by the avian influenza virus antigen is completely absent.
Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 или Н7 антитела в титре 1:16 (4,0 log2) и выше.The test serum is assessed positively if it contains antibodies specific to the avian influenza virus of subtype H5 or H7 in a titer of 1:16 (4.0 log 2 ) or higher.
При идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в РТГА реакция считается качественной и не учитывает титры антител. Изолят вируса гриппа птиц относят к подтипу Н5 или Н7 при визуальной оценке результатов - полная агглютинация, эритроциты выпадают на дно лунки в виде «пуговки».When identifying the subtype of a hemagglutinating viral agent in the RTGA, the reaction is considered qualitative and does not take into account antibody titers. The avian influenza virus isolate is classified as subtype H5 or H7 upon visual assessment of the results - complete agglutination, red blood cells fall out to the bottom of the well in the form of a “button”.
Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации предназначен для:A diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus and identifying the subtype of hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction is intended for:
- контроля за распространением гриппа птиц в популяциях сельскохозяйственных, синантропных, диких и экзотических птиц;- control over the spread of avian influenza in populations of agricultural, synanthropic, wild and exotic birds;
- оценки эффективности иммунизации поголовья птиц против данного заболевания;- assessing the effectiveness of immunization of poultry against this disease;
- ретроспективной диагностики гриппа птиц по приросту уровня специфических антител;- retrospective diagnosis of avian influenza based on the increase in the level of specific antibodies;
- типирования изолятов вируса гриппа птиц.- typing of avian influenza virus isolates.
С использованием данного диагностического набора проведены исследования референтных и испытуемых полевых сывороток крови, отобранных от диких и домашних сельскохозяйственных птиц; проведено типирование полевых изолятов вируса гриппа птиц, выделенных из патологического материала от больной птицы: A/chicken/Ryazan/1245-1/22, A/chicken/Krasnodar/208/22, A/shelduck/Kalmykia/1814/21.Using this diagnostic kit, studies were carried out on reference and test field blood sera collected from wild and domestic poultry; Typing of field isolates of avian influenza virus isolated from pathological material from sick birds was carried out: A/chicken/Ryazan/1245-1/22, A/chicken/Krasnodar/208/22, A/shelduck/Kalmykia/1814/21.
Исследование активности и специфичности компонентов набора с сыворотками крови кур, содержащими антитела к вирусу гриппа птиц типа А, подтипов Н5 и Н7, и антиген вируса гриппа птиц типа А, подтипов Н5 и Н7 показало положительный результат. Исследовании с гетерологичными и нормальными сыворотками показали отрицательные результаты.A study of the activity and specificity of the kit components with chicken blood sera containing antibodies to avian influenza virus type A, subtypes H5 and H7, and the antigen of avian influenza virus type A, subtypes H5 and H7 showed a positive result. Studies with heterologous and normal sera showed negative results.
Проверка стабильности компонентов набора (по воспроизводимости результатов исследований, проведенных в двух повторностях) показала воспроизводимость полученных результатов.Checking the stability of the kit components (based on the reproducibility of the results of studies carried out in duplicate) showed the reproducibility of the results obtained.
Диагностический набор рассчитан на проведение 1600 исследований сывороток крови и изолятов вируса гриппа птиц. Срок годности набора 12 месяцев от даты производства при хранении и транспортировании в защищенном от света месте при температуре от 2°С до 8°С.The diagnostic kit is designed to conduct 1600 tests of blood sera and avian influenza virus isolates. The shelf life of the kit is 12 months from the date of production when stored and transported in a dark place at a temperature of 2°C to 8°C.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» подтипа Н5 вируса гриппа птиц, был выделен от дикой утки, убитой в окрестностях коммуны Леньяро, Италия. Депонирован в 2021 году во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №343 - деп / 21-4 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».The viral isolate that served as the source for obtaining the strain “A/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2” of the H5 subtype of avian influenza virus was isolated from a wild duck killed in the vicinity of Legnaro, Italy. Deposited in 2021 in the All-Russian State Collection of Exotic Types of Foot and Mouth Disease Virus and other Animal Pathogens (FMDV) of the FGBU "ARRIAH" under registration number: No. 343 - dep / 21-4 - GKSHM FGBU "ARRIAH".
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 вируса гриппа птиц, был выделен от курицы, убитой в окрестностях коммуны Леньяро, Италия. Депонирован в 2021 г. во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №345 - деп /21-6 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».The viral isolate that served as the source for the “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” strain of the H7 subtype of avian influenza virus was isolated from a chicken killed in the vicinity of Legnaro, Italy. Deposited in 2021 in the All-Russian State Collection of Exotic Types of Foot and Mouth Disease Virus and other Animal Pathogens of the FGBU "ARRIAH" under registration number: No. 345 - dep / 21-6 - GKSHM FGBU "ARRIAH".
Морфологические признакиMorphological characteristics
Штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 являются возбудителями гриппа птиц Influenza A virus, относящиеся к роду Alphainfluenzavirus, семейству Orthomyxoviridae. Принадлежность штаммов вируса гриппа к роду определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.Strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of subtype H5 and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of subtype H7 are causative agents of avian influenza Influenza A virus, belonging to the genus Alphainfluenzavirus, family Orthomyxoviridae. The belonging of influenza virus strains to a genus is determined by conservative genome elements that determine the antigenic characteristics of nucleocapsids.
Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 80-120 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.Influenza virus virions are enveloped and pleomorphic. The diameter of the sphere-like particles is about 80-120 nm; thread-like particles about 17 nm in diameter, 250 nm or more in length. On the surface of the virion there are spike-like protrusions (up to 14 nm) formed by HA homotrimers. In the spaces between the HA clusters in type A viruses, NA molecules are located.
Вирусная РНК состоит из 8 сегментов и кодирует 11 белков вируса. Вирусная РНК упакована белком нуклеопротеином (NP) в нуклеокапсид.Viral RNA consists of 8 segments and encodes 11 viral proteins. Viral RNA is packaged by the protein nucleoprotein (NP) into a nucleocapsid.
Видовая принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» к вирусу гриппа птиц подтипа Н7 была подтверждена методами серологической (реакцией торможения гемагглютинации (РТГА) и реакцией торможения нейраминидазной активности (РТНА)) и молекулярно-биологической диагностики (ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирование).The species affiliation of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” to the avian influenza virus of subtype H5 and the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” to the avian influenza virus of subtype H7 was confirmed by serological methods (hemagglutination inhibition reaction ( RTGA) and the reaction of inhibition of neuraminidase activity (RTNA)) and molecular biological diagnostics (RT-PCR-RT, RT-PCR and sequencing).
Антигенные свойстваAntigenic properties
По своим антигенным свойствам штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H5N2, а «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» к подтипу H7N2.According to its antigenic properties, the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus belongs to the family Orthomyxoviridae, genus Alphainfluenzavirus, species Influenza A virus, type A, subtype H5N2, and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2" to the H7N2 subtype.
Гемагглютинирующая активность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подавляется специфическими сыворотками к вирусу гриппа птиц подтипов H5N1, H5N2, H5N3 («IZSVe», Италия), а также H5N2 («GD» Нидерланды), что подтверждает принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н5. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц к подтипу H5N2.The hemagglutination activity of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” is suppressed by specific sera to the avian influenza virus of the subtypes H5N1, H5N2, H5N3 (IZSVe, Italy), as well as H5N2 (GD, the Netherlands), which confirms the identity of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” avian influenza virus to subtype H5. The neuraminidase activity of the strain is suppressed by specific serum for the avian influenza virus of the H9N2 subtype (IZSVe, Italy), which confirms that the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus belongs to the H5N2 subtype.
Гемагглютинирующая активность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подавляется специфическими сыворотками к вирусу гриппа птиц подтипов H7N1, H7N7 («IZSVe», Италия), а также Н7 («GD» Нидерланды), что подтверждает принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н7. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц к подтипу H7N2.The hemagglutinating activity of the “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” strain is suppressed by specific sera to the avian influenza virus subtypes H7N1, H7N7 (“IZSVe”, Italy), as well as H7 (“GD” the Netherlands), which confirms the identity of the “A” strain /chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2" avian influenza virus to the H7 subtype. The neuraminidase activity of the strain is suppressed by specific serum for the avian influenza virus of the H9N2 subtype (IZSVe, Italy), which confirms that the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus belongs to the H7N2 subtype.
В результате проведения филогенетического анализа полученной нуклеотидной последовательности (848-1096 н.о.) фрагмента гена НА методом секвенирования было определено, что исследуемый штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц типа А принадлежит к генетической линии низкопатогенных штаммов вируса гриппа птиц подтипа Н5 (Фиг. 3.). В результате проведения филогенетического анализа полученной нуклеотидной последовательности (960-1114 н.о.) фрагмента гена НА методом секвенирования было определено, что исследуемый штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц типа А принадлежит к генетической линии низкопатогенных штаммов ВГП подтипа Н7 (Фиг. 4).As a result of a phylogenetic analysis of the obtained nucleotide sequence (848-1096 bp) of the HA gene fragment using the sequencing method, it was determined that the studied strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of avian influenza virus type A belongs to the genetic line of low pathogenic strains of avian influenza virus subtype H5 (Fig. 3). As a result of phylogenetic analysis of the obtained nucleotide sequence (960-1114 bp) of the HA gene fragment using the sequencing method, it was determined that the studied strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of avian influenza virus type A belongs to the genetic line of low pathogenic AIV strains of subtype H7 (Fig. 4).
В результате испытаний с применением методов ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ было установлено, что штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа А не контаминированы вирусами ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, инфекционного ларинготрахеита птиц, инфекционной бурсальной болезни, реовирусом птиц и штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» содержит в своем составе только геном вируса гриппа А подтипа Н5, а штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» -только геном вируса гриппа А подтипа Н7. Подтверждение отсутствия контаминации бактериями и грибами проводили в соответствии с ГОСТ 28085 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Подтверждение отсутствия контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222.As a result of tests using the RT-PCR and RT-PCR methods, it was established that the “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” strains of influenza A virus are not contaminated viruses of Newcastle disease, infectious bronchitis of chickens, infectious laryngotracheitis of birds, infectious bursal disease, avian reovirus and the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” contains only the genome of the influenza A virus subtype H5, and the strain “A/chicken” /Vladimir/1138/2021 H7N2" - only the genome of the influenza A virus of the H7 subtype. Confirmation of the absence of contamination by bacteria and fungi was carried out in accordance with GOST 28085 “Biological medicinal products for veterinary use. Method of bacteriological control of sterility". Confirmation of the absence of contamination with mycoplasmas was carried out in accordance with the requirements of the Global Fund XIV, volume 1, p. 1201-1222.
В результате контроля было установлено, что штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» не контаминированы посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами.As a result of the control, it was established that the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” are not contaminated with foreign viruses, bacteria, fungi and mycoplasmas.
Биологические характеристики.Biological characteristics.
Штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц способен к размножению в куриных эмбрионах (КЭ) без предварительной адаптации и показывает высокую гемагглютинирующую (титр в РГА составил 1:128 (7,0 log2)) и инфекционную активность при десятикратном титровании в СПФ-куриных эмбрионах (титр инфекционной активности при десятикратном титровании в СПФ куриных эмбрионах составил 8,88±0,27 lg ЭИД50/см3).The strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus is capable of reproduction in chicken embryos (CE) without prior adaptation and shows high hemagglutination (the titer in the RGA was 1:128 (7.0 log 2 )) and infectious activity with tenfold titration in SPF chicken embryos (the titer of infectious activity with tenfold titration in SPF chicken embryos was 8.88±0.27 lg EID 50 /cm 3 ).
Штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц способен к размножению в куриных эмбрионах без предварительной адаптации и показывает высокую гемагглютинирующую (титр в РГА составил 1:128 (7,0 log2)) и инфекционную активность при десятикратном титровании в СПФ-куриных эмбрионах (титр инфекционный активности вируса составил более 8,13±0,36 lg ЭИД50/см3).The strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus is capable of reproduction in chicken embryos without prior adaptation and shows high hemagglutination (the titer in the RGA was 1:128 (7.0 log 2 )) and infectious activity with a tenfold titration in SPF chicken embryos (the titer of infectious activity of the virus was more than 8.13±0.36 lg EID 50 /cm 3 ).
Штамм «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/113 8/2021 H7N2» вируса гриппа птиц сохраняют инфекционную и антигенную активность в лиофилизированном виде, репродуцируются в СПФ-КЭ в течение 4-5 суток инкубирования и накапливаются в титре 8,88±0,27 и 8,13±0,36 lg ЭИД50/см3, соответственно. Данные титрования представлены в таблице 1 и 2.The strain “A/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2” and the strain “A/chicken/Vladimir/113 8/2021 H7N2” of the avian influenza virus retain infectious and antigenic activity in lyophilized form and are reproduced in SPF-CE within 4- 5 days of incubation and accumulate in a titer of 8.88±0.27 and 8.13±0.36 lg EID 50 /cm 3 , respectively. Titration data are presented in Tables 1 and 2.
Биотехнологические свойства.Biotechnological properties.
Оба штамма вируса индуцируют антитела, выявляемые методами РТГА и иммуноферментным анализом.Both strains of the virus induce antibodies detected by RTGA and enzyme immunoassay.
Устойчивость к внешним факторам.Resistance to external factors.
Штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц чувствительны к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируются при прогревании 56°С, ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.The strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus are sensitive to detergents, formaldehyde, beta-propiolactone, aziridine derivatives, and are quickly inactivated when heated to 56°C , ultraviolet irradiation and at pH below 5.0.
В результате проведения последовательных пассажей в 11 суточных СПФ-КЭ были получены штаммы «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц, имеющие стабильные биотехнологические и антигенные свойства и пригодные для изготовления и получения антигенов и сывороток для диагностики вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7.As a result of successive passages in 11 daily SPF-CE, strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus were obtained, having stable biotechnological and antigenic properties and suitable for the manufacture and production of antigens and sera for the diagnosis of avian influenza virus subtypes H5 and H7.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the proposed invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Получение антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7.Example 1. Obtaining antigens of avian influenza virus subtypes H5 and H7.
Для изготовления антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 использовали лиофилизированный штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», и подтипа Н7 - лиофилизированный штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» и 10-11 суточные свободные от патогенной микрофлоры куриные эмбрионы. Перед проведением работ куриные эмбрионы овоскопировали, с целью отбора жизнеспособных подвижных эмбрионов с развитой сосудистой системой, а также отметки воздушной границы хориоаллантоисной полости. Посевной вирус разводили стерильным фосфатно-буферным раствором рН (7,2-7,4) в объеме, необходимым для заражения партии 11-суточных куриных эмбрионов, из расчета 0,1 см3 на эмбрион. К рабочему разведению вируса добавляли антибиотики (смесь: пенициллин 1000-2000 ед/см3, стрептомицин 50-100 мг/см3, амфотерицин В 1000-2000 ед/см3). Вирус инокулировали в аллантоисную полость эмбриона, используя стерильный одноразовый инсулиновый шприц. Далее, куриные эмбрионы инкубировали при температуре 37±1°С и относительной влажности 60-70% в течение 72 часов. Ежесуточно эмбрионы овоскопировали и проверяли их состояние. Все эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после инокуляции браковали и утилизировали. Эмбрионы, погибшие через (48-72) ч, и оставшиеся живые эмбрионы выдерживали в течение 12 ч при температуре 4±2°С. Отбор экстраэмбриональной жидкости проводили с использованием пластиковой одноразовой стерильной пипетки и резиновой груши.To produce antigens of the avian influenza virus of subtype H5, the lyophilized strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” was used, and for subtype H7, the lyophilized strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” and 10-11 days free from pathogenic microflora of chicken embryos. Before carrying out the work, chicken embryos were ovoscoped in order to select viable motile embryos with a developed vascular system, as well as to mark the air boundary of the chorioallantoic cavity. The seed virus was diluted with a sterile phosphate-buffered solution pH (7.2-7.4) in the volume necessary to infect a batch of 11-day-old chicken embryos, at the rate of 0.1 cm 3 per embryo. Antibiotics were added to the working dilution of the virus (mixture: penicillin 1000-2000 units/cm 3 , streptomycin 50-100 mg/cm 3 , amphotericin B 1000-2000 units/cm 3 ). The virus was inoculated into the allantoic cavity of the embryo using a sterile disposable insulin syringe. Next, chicken embryos were incubated at a temperature of 37±1°C and a relative humidity of 60-70% for 72 hours. The embryos were ovoscoped daily and their condition was checked. All embryos that died within 24 hours after inoculation were rejected and discarded. Embryos that died after (48-72) hours and the remaining living embryos were kept for 12 hours at a temperature of 4±2°C. Extraembryonic fluid was collected using a plastic disposable sterile pipette and a rubber bulb.
Инактивацию вируса проводили с использование рабочего разведения бета-пропиолактона с конечной концентрацией 0,1%. Инактивированную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 5000 об/мин (4000 g) в течении 25 минут при температуре +4°С. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали стерильной пипеткой с грушей в стерильный пластиковый флакон. Полученную надосадочную жидкость, содержащую очищенный антиген, хранили при температуре +4°С до лиофилизации.Virus inactivation was carried out using a working dilution of beta-propiolactone with a final concentration of 0.1%. The inactivated virus-containing suspension was centrifuged at 5000 rpm (4000 g) for 25 minutes at a temperature of +4°C. The supernatant liquid was carefully collected with a sterile bulb pipette into a sterile plastic bottle. The resulting supernatant containing the purified antigen was stored at +4°C until lyophilization.
Для определения гемагглютинирующей активности полученных вирусных препаратов проводили реакцию гемагглютинации. Для дальнейших работ титр гемагглютинирующей активности должен быть не ниже 1:128 (7,0 log2).To determine the hemagglutinating activity of the resulting viral preparations, a hemagglutination reaction was performed. For further work, the titer of hemagglutinating activity must be at least 1:128 (7.0 log 2 ).
В очищенную инактивированную вируссодержащую суспензию добавляли стабилизаторы (20% гидролизат лактальбумина, 30% сахарозы и 5% желатина) и антибиотики (смесь: пенициллин 1000-2000 ед/см3, стрептомицин 50-100 мг/см3, амфотерицин В 1000-2000 ед/см3), а затем разливали в стеклянные флаконы по 2 см3 и замораживали при температуре минус 60-70°С не менее 6 часов. Высушивание проводили в аппаратах для лиофилизации фирмы Labconco (США). Титр антигенов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и Н7 после лиофилизации должен быть не менее 1:128 (7,0 log2).Stabilizers (20% lactalbumin hydrolyzate, 30% sucrose and 5% gelatin) and antibiotics (mixture: penicillin 1000-2000 units/ cm3 , streptomycin 50-100 mg/ cm3 , amphotericin B 1000-2000 units) were added to the purified inactivated virus-containing suspension /cm 3 ), and then poured into glass bottles of 2 cm 3 and frozen at a temperature of minus 60-70°C for at least 6 hours. Drying was carried out in lyophilization apparatus from Labconco (USA). The titer of avian influenza virus subtypes H5 and H7 after lyophilization should be at least 1:128 (7.0 log 2 ).
Гемагглютинирующая активность антигенов для серии набора составила 1:128 (7,0 log2). Специфичность препаратов антигена штаммов вируса гриппа птиц: штамма «А/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2» и антигена штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» после лиофилизации проверяли в РТГА с референтными гомо- и гетерологичными сыворотками крови птиц. Результаты представлены в таблице 3. Лиофилизированный препарат антигена из штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» реагировал только со специфической сывороткой крови, содержащей антитела к ВГП подтипа Н5 (IZSVe, Италия), а лиофилизированный препарат антигена из штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» реагировал только со специфической сывороткой крови, содержащей антитела к ВГП подтипа Н7 (IZSVe, Италия). Эти результаты показывают специфичность приготовленных антигенов.The hemagglutinating activity of the antigens for the kit series was 1:128 (7.0 log 2 ). The specificity of antigen preparations of avian influenza virus strains: strain “A/duck/Vladimir/l 121/21 H5N2” and antigen of strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” after lyophilization was tested in an RTGA with reference homo- and heterologous blood sera birds. The results are presented in Table 3. The lyophilized antigen preparation from the A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2 strain reacted only with specific blood serum containing antibodies to AIV subtype H5 (IZSVe, Italy), and the lyophilized antigen preparation from the A strain /chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2" reacted only with specific blood serum containing antibodies to AIV subtype H7 (IZSVe, Italy). These results show the specificity of the prepared antigens.
Пример 2. Получение гипериммунных положительной и отрицательной сывороток крови.Example 2. Obtaining hyperimmune positive and negative blood sera.
Для получения гипериммунных положительных и нормальных (отрицательных) сывороток крови кур использовали 40-60 суточных цыплят, у которых отсутствовали антитела к вирусу гриппа птиц.To obtain hyperimmune positive and normal (negative) chicken blood sera, 40-60 day old chickens that did not have antibodies to the avian influenza virus were used.
Для иммунизации использовали очищенную инактивированную экстраэмбриональную жидкость, полученную от 11-суточных куриных эмбрионов, зараженных штаммом «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2», эмульгированную с равным объемом адъюванта ISA-70, производства SEPPIC (Франция). Иммунизацию проводили в область бедренной или грудных мышц в объеме 1,0 см3 методом двукратного введения препарата с интервалом 14 суток. Через 10 суток после второй иммунизации у цыплят отбирали образцы крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности в РТГА. Если активность полученной сыворотки была ниже 1:64 (6,0 log2), проводили дополнительную иммунизацию.For immunization, we used purified inactivated extraembryonic fluid obtained from 11-day-old chicken embryos infected with the A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2 strain, emulsified with an equal volume of ISA-70 adjuvant, produced by SEPPIC (France). Immunization was carried out in the area of the femoral or pectoral muscles in a volume of 1.0 cm 3 using the method of double injection of the drug with an interval of 14 days. 10 days after the second immunization, blood samples were taken from the chickens from the axillary vein to determine specific activity in the RTGA. If the activity of the resulting serum was below 1:64 (6.0 log 2 ), additional immunization was performed.
Для приготовления гипериммунной сыворотки крови цыплят обескровливали, и выдерживали полученную кровь в пробирках при температуре 37±1°С в течение 30-60 минут, а затем при 4±2°С 24 часа. Спустя 24 часа образовавшуюся на поверхности пробирки сыворотку крови аккуратно отбирали в стерильные пробирки. Далее сыворотку инактивировали в термостате при температуре 57±1°С в течение 30 минут.To prepare hyperimmune blood serum, chickens were bled, and the resulting blood was kept in test tubes at a temperature of 37±1°C for 30-60 minutes, and then at 4±2°C for 24 hours. After 24 hours, the blood serum formed on the surface of the tube was carefully collected into sterile tubes. Next, the serum was inactivated in a thermostat at a temperature of 57±1°C for 30 minutes.
Аналогичным методом получена положительная гипериммунная сыворотка, содержащая антитела к вирусу гриппа птиц штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2».A positive hyperimmune serum containing antibodies to the avian influenza virus strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” was obtained using a similar method.
Активность полученной гипериммунной положительной сыворотки в РТГА со специфическим антигеном вируса гриппа птиц штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» должна быть не ниже 1:64 (6,0 log2) (положительный контроль). Результаты исследования гемагглютинирующей активности и специфичности контрольных сывороток крови в РТГА представлены в таблице 4. В результате реакции сыворотка против вируса гриппа птиц штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» сработала с гомологичным антигеном в титре 1:512, что указывает на высокую активность предлагаемых сывороток. Сыворотки прореагировали только с антигеном гомологичного подтипа, что говорит о их высокой специфичности.The activity of the resulting hyperimmune positive serum in the RTGA with the specific antigen of the avian influenza virus strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” should be no lower than 1:64 (6, 0 log 2 ) (positive control). The results of the study of hemagglutinating activity and specificity of control blood sera in the RTGA are presented in Table 4. As a result of the reaction, the serum against the avian influenza virus strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” "worked with a homologous antigen at a titer of 1:512, which indicates the high activity of the proposed sera. The sera reacted only with the antigen of the homologous subtype, which indicates their high specificity.
Нормальную отрицательную сыворотку кур получали путем обескровливания здоровой птицы, не имеющей антител к вирусу гриппа птиц. Готовили методом, описанным выше. Проверку отрицательной сыворотки крови на активность и специфичность проводили в РТГА с использованием референтных антигенов и сывороток к вирусу гриппа птиц подтипов HI-HI6, к вирусу болезни Ньюкасла, синдрома снижения яйценоскости-76 и Mycoplasma gallisepticum (табл. 4). Для использования в наборе была необходима такая сыворотка крови, чтобы активность в РТГА с гетерологичными антигенами не превышала фоновый уровень 1:4 (2,0 log2) (реакция с не иммунной сывороткой). Как представлено в таблице 4 активность отрицательной сыворотки крови не превышала фоновый уровень 1:4 и показана специфичность реакции взаимодействия антигенов с отрицательной сывороткой.Normal negative chicken serum was obtained by bleeding healthy birds that did not have antibodies to the avian influenza virus. Prepared using the method described above. Testing of negative blood serum for activity and specificity was carried out in the RTGA using reference antigens and sera for the avian influenza virus of subtypes HI-HI6, Newcastle disease virus, reduced egg production syndrome-76 and Mycoplasma gallisepticum (Table 4). For use in the kit, a blood serum was required so that the activity in the RTGA with heterologous antigens did not exceed the background level of 1:4 (2.0 log 2 ) (reaction with non-immune serum). As presented in Table 4, the activity of negative blood serum did not exceed the background level of 1:4 and the specificity of the reaction of interaction of antigens with negative serum is shown.
Для лиофилизации сывороток к ним добавляли стабилизирующую среду, состоящую из 20% гидролизат лактальбумина, 30% сахарозы и 5% желатина. Сушку проводили в сублимационном вакуумном аппарате фирмы LABCONCO (США).To lyophilize the sera, a stabilizing medium consisting of 20% lactalbumin hydrolyzate, 30% sucrose and 5% gelatin was added to them. Drying was carried out in a vacuum sublimation apparatus from LABCONCO (USA).
Пример 3. Постановка реакции торможения гемагглютинации для выявления антител к вирусу гриппа птиц с применение диагностического набора (предлагаемое изобретение).Example 3. Setting up a hemagglutination inhibition reaction to detect antibodies to the avian influenza virus using a diagnostic kit (the proposed invention).
Для получения сывороток крови от птиц кровь берут из вены внутренней стороны крыла над локтевым сочленением путем прокола или путем скарификации гребня в объеме (1,0 - 2,0) см3 в стерильные пробирки. Через некоторое время в пробирке образуется сгусток, который отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при температуре 37°С в термостате в течение 60 минут. Затем пробирку с кровью помещают в холодильную камеру на 8-10 часов при температуре от 2 до 8°С. Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку прогревают на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. Подготовленные сыворотки используют для постановки РТГА. При необходимости хранения сывороток более трех суток до начала исследований их замораживают при температуре не выше минус 15°С.To obtain blood serum from birds, blood is taken from a vein on the inside of the wing above the elbow joint by puncture or by scarification of the crest in a volume of (1.0 - 2.0) cm 3 into sterile tubes. After some time, a clot forms in the test tube, which is separated from the walls with a thin metal rod or Pasteur pipette and kept at a temperature of 37°C in a thermostat for 60 minutes. Then the test tube with blood is placed in the refrigerator for 8-10 hours at a temperature of 2 to 8°C. The settled serum is poured into clean test tubes. To remove heat-labile inhibitors, the whey is heated in a water bath at 56°C for 30 minutes. Prepared sera are used to perform X-ray analysis. If it is necessary to store sera for more than three days before the start of research, they are frozen at a temperature not exceeding minus 15°C.
Определение гемагглютинирующего титра антигенов. Для постановки реакции гемагглютинации готовили двукратные разведения антигена используемых штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц, от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество (0,025 см3 или 0,050 см3) фосфатно-буферного раствора. В две первые лунки горизонтального ряда добавляли равный объем подготовленного антигена вируса гриппа птиц, полученного из штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», трехкратно пипетировали и переносили по 0,025 см3 или 0,050 см3 во вторые лунки и так далее. Из последних лунок вертикального ряда (1:4096) удаляли 0,025 см3 или 0,050 см3 антигена.Determination of hemagglutinating titer of antigens. To perform the hemagglutination reaction, twofold dilutions of the antigen of the used strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus were prepared, from 1:2 to 1:4096. To do this, an equal amount (0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 ) of phosphate buffer solution was added to all wells of a polymer round-bottom plate for serological reactions. An equal volume of the prepared avian influenza virus antigen obtained from the strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” was added to the first two wells of the horizontal row, pipetted three times and transferred at 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 in the second holes and so on. From the last wells of the vertical row (1:4096), 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of antigen was removed.
После титрования антигенов в лунки планшета с образцами вносили заранее подготовленную 1%-ю суспензию эритроцитов в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3 (в зависимости от исходного объема внесенного фосфатно-буферного раствора). Планшет аккуратно встряхивали и оставляли при температуре 18-26°С на 30-40 минут.After titration of the antigens, a previously prepared 1% suspension of erythrocytes in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 (depending on the initial volume of the added phosphate buffer solution) was added to the wells of the plate with the samples. The tablet was gently shaken and left at a temperature of 18-26°C for 30-40 minutes.
Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учета реакции в две-три лунки планшета с двойным объемом забуференного физиологического раствора (0,100 см3 или 0,050 см3) добавляли по 0,050 см3 или 0,025 см3 1%-ной суспензии эритроцитов. Учет реакции проводили после оседания эритроцитов в виде «пуговицы» в контрольных лунках.To control erythrocytes for the absence of spontaneous agglutination and determine the reaction time, 0.050 cm 3 or 0.025 cm 3 of a 1% suspension of erythrocytes was added to two or three wells of a plate with a double volume of buffered saline solution (0.100 cm 3 or 0.050 cm 3 ). The reaction was recorded after the sedimentation of erythrocytes in the form of a “button” in the control wells.
Реакция считается положительной, если при оседание эритроцитов в лунке планшета образовался ярко выраженный «зонтик», отрицательной образовалась «пуговка», при этом в отрицательном контроле должна отсутствовать спонтанная агглютинация.The reaction is considered positive if, during the sedimentation of erythrocytes, a pronounced “umbrella” is formed in the well of the tablet; a negative “button” is formed, while in the negative control there should be no spontaneous agglutination.
Титр антигена должен соответствовать значению, указанному на этикетке флакона с антигеном плюс или минус одно разведение. За титр антигена принимали его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ).The antigen titer must correspond to the value indicated on the antigen vial label plus or minus one dilution. The antigen titer was taken to be its highest dilution, which gives a clearly defined agglutination of erythrocytes in the form of an “umbrella”, which corresponds to 1 hemagglutinating unit (1 HAU).
Подготовка рабочей дозы инактивированных антигенов штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7. Для постановки РТГА необходимо приготовить рабочую дозу антигена (4 ГАЕ), исходя из его титра, установленного в реакции гемагглютинации. Необходимый объем высчитывали в зависимости от сывороток, которые необходимо исследовать. Также требуется учесть необходимые контроли реакции. Рабочую дозу антигена готовили непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.Preparation of a working dose of inactivated antigens of the “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” strain of the H5 subtype and the “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” strain of the H7 subtype. To perform an RTHA, it is necessary to prepare a working dose of the antigen (4 HAU), based on its titer established in the hemagglutination reaction. The required volume was calculated depending on the sera that needed to be examined. The necessary reaction controls must also be taken into account. The working dose of the antigen was prepared directly on the day of the reaction with mandatory control of 4 HAE.
Для этого в первую лунку планшета с выбранным объемом фосфатно-буферного раствора вносили равный объем антигенов и титровали до 4 лунки в ряде.To do this, an equal volume of antigens was added to the first well of the plate with a selected volume of phosphate buffer solution and titrated to 4 wells in a row.
Для контроля времени реакции в две-три лунки планшета добавляли двойной объем фосфатно-буферного раствора (0,050 см3 или 0,100 см3), а затем - 0,025 см3 или 0,050 см3 1%-ной суспензии эритроцитов.To control the reaction time, a double volume of phosphate buffer solution (0.050 cm 3 or 0.100 cm 3 ) was added to two or three wells of the plate, and then 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of a 1% suspension of erythrocytes.
Учет реакции проводили после оседания эритроцитов в контроле времени реакции. При правильном определении рабочей дозы антигенов в первой и второй лунках с титрованным антигеном должна быть полная агглютинация («зонтик»), в третьей лунке, содержащей 1/2 ГАЕ - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка»). Если результат реакции не соответствует требуемым условиям, необходимо корректирование рабочей дозы путем добавления антигена или фосфатно-буферного раствора с обязательным контролем 4 ГАЕ.The reaction was taken into account after the sedimentation of erythrocytes to control the reaction time. When correctly determining the working dose of antigens, there should be complete agglutination (“umbrella”) in the first and second wells with titrated antigen, partial agglutination in the third well containing 1/2 HAE, and no agglutination (“button”) in the fourth well. If the result of the reaction does not meet the required conditions, it is necessary to adjust the working dose by adding an antigen or a phosphate-buffered solution with the obligatory control of 4 HAE.
Выявление специфических антител в исследуемых и контрольных пробах сыворотки крови от птиц. Во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество фосфатно-буферного раствора в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3. Затем в первую лунку горизонтального ряда добавляли такой же объем исследуемой сыворотки, пипетировали и готовили ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096.Detection of specific antibodies in test and control samples of blood serum from birds. An equal amount of phosphate buffer solution in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 was added to all wells of a polymer round-bottom plate for serological reactions. Then the same volume of test serum was added to the first well of the horizontal row, pipetted, and a series of successive two-fold dilutions from 1:2 to 1:4096 were prepared.
Далее, во все лунки с титрованной сывороткой вносили подготовленную заранее рабочую дозу антигена, в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3, аккуратно встряхивали и оставляли на 30 - 60 минут при температуре 18-26°С. После инкубации в лунки с исследуемыми образцами добавляли 0,025 см3 или 0,050 см3 1%-ной суспензии эритроцитов. Планшеты осторожно встряхивали и оставляли при температуре 18-26°С до полного оседания контроля.Next, a previously prepared working dose of antigen in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 was added to all wells with titrated serum, gently shaken and left for 30 - 60 minutes at a temperature of 18-26 ° C. After incubation, 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of a 1% suspension of erythrocytes was added to the wells with the test samples. The plates were gently shaken and left at a temperature of 18-26°C until the control completely settled.
Одновременно ставили контроли реакции:At the same time, reaction controls were set:
- На отсутствие изоагглютинации сывороток. В одну лунку планшета вносили 0,025 см3 или 0,050 см3 фосфатно-буферного раствора, добавляли равный объем испытуемой сыворотки и такой же объем 1%-ной суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать (в лунке образовалась «пуговка»).- For the absence of isoagglutination of sera. 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of phosphate buffer solution was added to one well of the tablet, an equal volume of test serum and the same volume of a 1% suspension of erythrocytes were added. There should be no agglutination of red blood cells (a “button” has formed in the hole).
- На спонтанную агглютинацию эритроцитов. В лунку планшета вносили двойной объем фосфатно-буферного раствора (0,050 см3 или 0,100 см3) и добавляли 0,025 см3 или 0,050 см3 1%-ной суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать (в лунке образовалась «пуговка»).- For spontaneous agglutination of red blood cells. A double volume of phosphate buffer solution (0.050 cm 3 or 0.100 cm 3 ) was added to the well of the plate and 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of a 1% suspension of erythrocytes was added. There should be no agglutination of red blood cells (a “button” has formed in the hole).
- Контроль активности положительных и отрицательной сывороток крови. В лунки трех рядов планшета вносили по 0,025 см3 или 0,050 см3 фосфатно-буферного раствора. Затем в первые лунки каждого из двух рядов добавляли равные объемы специфической гипериммунной сыворотки против штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц (положительный контроль), а в первую лунку третьего ряда - равный объем отрицательной сыворотки (отрицательный контроль), пипетировали и готовили последовательные двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. Далее, в лунки вносили заранее подготовленную рабочую дозу соответствующего антигена в аналогичном с предыдущими компонентами объеме (0,025 см3 или 0,050 см3), осторожно встряхивали и оставляли на 30-60 минут при температуре 18-26°С, после чего в лунки добавляли равный объем 1%-ной суспензии. эритроцитов. Контрольные гипериммунные положительные сыворотки (положительный контроль) должны тормозить гемагглютинирующую активность рабочего разведения антигена в титре, указанном на этикетке флакона (допускается погрешность±одно разведение). Отрицательная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность рабочего разведения антигена в титре, меньшем, чем 1:4.- Monitoring the activity of positive and negative blood serum. 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 of phosphate buffer solution was added to the wells of three rows of the plate. Then, equal volumes of specific hyperimmune serum against the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus (positive control) were added to the first wells of each of the two rows. and into the first well of the third row - an equal volume of negative serum (negative control), pipetted and successive two-fold dilutions were prepared from 1:2 to 1:4096. Next, a pre-prepared working dose of the corresponding antigen was added to the wells in a volume similar to the previous components (0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 ), carefully shaken and left for 30-60 minutes at a temperature of 18-26 ° C, after which an equal amount was added to the wells volume of 1% suspension. red blood cells Control hyperimmune positive sera (positive control) should inhibit the hemagglutinating activity of the working dilution of the antigen in the titer indicated on the bottle label (error ± one dilution is allowed). Negative serum should inhibit the hemagglutinating activity of the working dilution of the antigen in a titer less than 1:4.
Учет результатов реакции проводили визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (образование «пуговки»). Результатом считали наибольшее разведение сыворотки, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов (сыворотка полностью подавила гемагглютинирующие свойства антигена вируса гриппа птиц).The reaction results were recorded visually after complete sedimentation of erythrocytes in the control wells (formation of a “button”). The result was considered to be the highest dilution of the serum, in which agglutination of erythrocytes is completely absent (the serum completely suppressed the hemagglutinating properties of the avian influenza virus antigen).
Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 или Н7 антитела в титре 1:16 (4,0 log2) и выше.The test serum is assessed positively if it contains antibodies specific to the avian influenza virus of subtype H5 or H7 in a titer of 1:16 (4.0 log 2 ) or higher.
Пример 4. Постановка реакции торможения гемагглютинации для определения подтипа гемагглютинирующего вирусного агента с применение диагностического набора (предлагаемое изобретение).Example 4. Setting up a hemagglutination inhibition reaction to determine the subtype of a hemagglutinating viral agent using a diagnostic kit (the proposed invention).
Для определении подтипа гемагглютинирующего вирусного агента, необходимо определить его гемагглютинирующую активность в РГА. Для этого готовили двукратные разведения исследуемого вируса гриппа птиц, от 1:2 до 1:4096, применяя метод, описанный в примере 2. Для повышении точности (достоверности) идентификации подтипа гемагглютинина вируса гриппа птиц, титр вируса в РГА должен быть не менее 1:16. Более низкие значения могут затруднить процесс приготовления рабочего разведения вируса.To determine the subtype of a hemagglutinating viral agent, it is necessary to determine its hemagglutinating activity in the RHA. To do this, two-fold dilutions of the avian influenza virus under study were prepared, from 1:2 to 1:4096, using the method described in example 2. To increase the accuracy (reliability) of identifying the hemagglutinin subtype of the avian influenza virus, the titer of the virus in the RGA should be at least 1: 16. Lower values may make it difficult to prepare a working dilution of the virus.
Подготовка рабочей дозы исследуемого вируса. Для постановки РТГА требуется подготовить рабочую дозу исследуемого вируса, исходя из его титра, установленного в реакции гемагглютинации. Способ подготовки рабочей дозы вируса для идентификации гемагглютинина соответствует способу, описанному в примере 2.Preparation of a working dose of the test virus. To perform an RTGA, it is necessary to prepare a working dose of the test virus based on its titer established in the hemagglutination reaction. The method for preparing a working dose of the virus for identifying hemagglutinin corresponds to the method described in example 2.
Определение подтипа гемагглютинирующего вирусного агента. Во все лунки полимерного круглодонного планшета для серологических реакций вносили равное количество фосфатно-буферного раствора в объеме 0,025 см3 или 0,050 см3. Затем в первые лунки горизонтального ряда добавляли такие же объемы сывороток крови против штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» и штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2», пипетировали и готовили ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:4096. Затем, в каждую лунку с титрованными сыворотками добавляли равный объем рабочей дозы исследуемого вируса, осторожно встряхивали и оставляли на 30-60 минут при температуре 18-26°С, после чего в лунки добавляли равный объем 1%-ной суспензии эритроцитов. Параллельно ставили необходимые контроли, аналогично примеру 2.Determination of the subtype of hemagglutinating viral agent. An equal amount of phosphate buffer solution in a volume of 0.025 cm 3 or 0.050 cm 3 was added to all wells of a polymer round-bottom plate for serological reactions. Then, the same volumes of blood sera against the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” and the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” were added to the first wells of the horizontal row, pipetted, and a series of serial two-fold dilutions with 1 :2 to 1:4096. Then, an equal volume of a working dose of the test virus was added to each well with titrated sera, gently shaken and left for 30-60 minutes at a temperature of 18-26°C, after which an equal volume of a 1% suspension of erythrocytes was added to the wells. At the same time, the necessary controls were set, similar to example 2.
Учет результатов реакции проводили визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (образование «пуговки»). Подтип гемагглютинина исследуемого вируса соответствовал сыворотке, с которой реакция показала положительный результат.The reaction results were recorded visually after complete sedimentation of erythrocytes in the control wells (formation of a “button”). The hemagglutinin subtype of the virus under study corresponded to the serum with which the reaction showed a positive result.
Пример 5. Определение специфичности диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинацииExample 5. Determination of the specificity of a diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus and identifying the subtype of hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction
Для определения специфичности представленного набора (предлагаемое изобретение) исследовали сыворотки крови от нескольких свободных от патогенной микрофлоры цыплят 21-дневного возраста в РТГА, предварительно тестированные тем же методом с использованием референтных антигенов производства Голландской академии Девентера (GD, Нидерланды) и Итальянского Института Зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Результаты представлены в таблице 5.To determine the specificity of the presented set (the proposed invention), blood sera from several 21-day-old chickens free from pathogenic microflora were examined in the RTGA, previously tested by the same method using reference antigens produced by the Dutch Academy of Deventer (GD, the Netherlands) and the Italian Institute of Zoological Prevention (IZSVe , Italy). The results are presented in Table 5.
Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации (предлагаемое изобретение) показал 100% специфичность со всеми испытуемыми антигенами и сыворотками.A diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of the hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction (the proposed invention) showed 100% specificity with all tested antigens and sera.
Для подтверждения специфичности данного набора также использовали специфические сыворотки крови к гемагглютинирующим вирусам болезни Ньюкасла, гриппа птиц подтипов HI-HI 6, и микоплазмам производства Голландской академии Девентера (GD, Нидерланды) и Итальянского института зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Результаты представлены в таблице 6.To confirm the specificity of this kit, specific blood sera were also used for hemagglutinating viruses of Newcastle disease, avian influenza subtypes HI-HI 6, and mycoplasmas produced by the Dutch Academy of Deventer (GD, the Netherlands) and the Italian Institute of Zoological Prevention (IZSVe, Italy). The results are presented in Table 6.
Активность используемого антигена штамма «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5, из разработанного набора с гомологичными сыворотками подтипа Н5, различных производителей (пробы 5-6) составила 1:256 (8 log2) и 1:512 (9 log2), соответственно. Активность используемого антигена штамма «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7, из разработанного набора с гомологичными сыворотками подтипа Н7, различных производителей (пробы 8-9) составила 1:1024 (10 log2). Активность обоих антигенов (представленных в предлагаемом наборе) из используемых штаммов в РТГА с гетерологичными сыворотками не превышала фоновый уровень и составила менее 1:4, что соответствует результатам реакции с не иммунной (нормальной) сывороткой.The activity of the used antigen of the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus of the H5 subtype, from a developed set with homologous sera of the H5 subtype, from various manufacturers (samples 5-6) was 1:256 (8 log 2 ) and 1 :512 (9 log 2 ), respectively. The activity of the used antigen of the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus of the H7 subtype, from a developed set with homologous sera of the H7 subtype, from various manufacturers (samples 8-9) was 1:1024 (10 log 2 ). The activity of both antigens (presented in the proposed set) from the strains used in the RTGA with heterologous sera did not exceed the background level and was less than 1:4, which corresponds to the results of the reaction with non-immune (normal) serum.
Для определения специфичности набора для идентификации гемагглютинирующего вирусного агента гриппа птиц при его выделении из патологического материала, применяли референтные антигены ВГП подтипов H1-H16 производства Итальянского института зоопрофилактики (IZSVe, Италия). Данные реакции представлены в таблице 7. Результат учитывается качественно - при выпадении «зонтика» на дне лунки. Так полученная гипериммунная сыворотка на штамм «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» вируса гриппа птиц подтипа Н5 и на штамм «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» вируса гриппа птиц подтипа Н7 показали четкую специфичность, реагируя только с антигенами H5N1, H5N3 и H7N1, H7N3, соответственно.To determine the specificity of the kit for identifying the hemagglutinating viral agent of avian influenza when it is isolated from pathological material, reference antigens of AIV subtypes H1-H16 produced by the Italian Institute of Zoological Prevention (IZSVe, Italy) were used. These reactions are presented in Table 7. The result is taken into account qualitatively - when the “umbrella” falls out at the bottom of the hole. The resulting hyperimmune serum for the strain “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” of the avian influenza virus of the H5 subtype and for the strain “A/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2” of the avian influenza virus of the H7 subtype showed clear specificity, reacting only with antigens H5N1, H5N3 and H7N1, H7N3, respectively.
Пример 6. Определение диагностической чувствительности диагностического набораExample 6: Determination of diagnostic sensitivity of a diagnostic kit
Для сравнения результатов выявления антител к вирусу гриппа птиц в РТГА с помощью разработанного диагностического набора (предлагаемое изобретение) и наборов антигенов других производителей - IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), было исследовано 20 сывороток крови от цыплят, иммунизированных вакцинами с использованием различных изолятов вируса гриппа птиц подтипа Н5 и 20 проб сывороток иммунизированных изолятами подтипа Н7. Сыворотки были отобраны спустя 30 суток после иммунизации. Пробы предварительно были исследованы в иммуноферментном анализе с использованием набора производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты представлены в таблицах 8 и 9.To compare the results of detecting antibodies to the avian influenza virus in the RTGA using the developed diagnostic kit (the proposed invention) and sets of antigens from other manufacturers - IZSVe (Italy) and GD (Netherlands), 20 blood sera from chickens immunized with vaccines using various isolates were examined avian influenza virus subtype H5 and 20 serum samples immunized with isolates of subtype H7. Sera were collected 30 days after immunization. The samples were previously examined in an enzyme immunoassay using a kit produced by the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH". The results are presented in Tables 8 and 9.
Исходя из данных таблиц 8 и 9 можно сделать вывод, что при постановке реакции торможения гемагглютинации с применением антигенов, входящих в разработанный диагностический набор все сыворотки показали положительный результат.Реакция с использованием наборов IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), и при использовании тест-системы ИФА (производства ВНИИЗЖ) показала схожие результаты, из чего можно сделать вывод, что предлагаемый набор не уступает в диагностической чувствительности своим аналогам.Based on the data in Tables 8 and 9, we can conclude that when performing a hemagglutination inhibition reaction using antigens included in the developed diagnostic kit, all sera showed a positive result. The reaction using the IZSVe (Italy) and GD (Netherlands) kits, and when using the test -ELISA system (manufactured by ARRIAH) showed similar results, from which we can conclude that the proposed kit is not inferior in diagnostic sensitivity to its analogues.
Выявили, что данные (n=20), полученные с помощью разработанного диагностического набора (предлагаемое изобретение), коррелировали с данными полученными при постановке РТГА наборов IZSVe (Италия) и GD (Нидерланды), и при использовании тест-системы ИФА (производства ВНИИЗЖ).It was revealed that the data (n=20) obtained using the developed diagnostic kit (the proposed invention) correlated with the data obtained when performing the RTGA kits IZSVe (Italy) and GD (Netherlands), and using the ELISA test system (produced by ARRIAH) .
Чувствительность и специфичность РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц в сыворотках крови кур при использовании антигенов разных производителей представлены в таблице 10.The sensitivity and specificity of RTGA for detecting antibodies to the avian influenza virus in chicken blood serum when using antigens from different manufacturers are presented in Table 10.
Чувствительность и специфичность РТГА для идентификации подтипа гемагглютинирующего агента вируса гриппа птиц при использовании сывороток разных производителей представлены в таблице 11.The sensitivity and specificity of RTGA for identifying the subtype of the hemagglutinating agent of the avian influenza virus when using sera from different manufacturers are presented in Table 11.
В результате проведенных испытаний разработанный диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации, показал 100%-ую специфичность и чувствительность; высокую воспроизводимость (коэффициент вариации не выше 10% между разными сериями анализа) и правильность. Высокая точность выявления антител (100%) позволяет использовать его как эффективный инструмент для ретроспективной диагностики гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 и контроля поствакцинального иммунитета поголовья птиц.As a result of the tests, the developed diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of the hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction showed 100% specificity and sensitivity; high reproducibility (coefficient of variation not exceeding 10% between different series of analysis) and accuracy. The high accuracy of antibody detection (100%) allows it to be used as an effective tool for retrospective diagnosis of avian influenza subtypes H5 and H7 and monitoring post-vaccination immunity of poultry population.
Аналогичные показатели чувствительности и специфичности разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации установлены при определения подтипа гемагглютинина выделенных изолятов вируса гриппа птиц.Similar indicators of sensitivity and specificity of the developed diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of the hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction were established when determining the hemagglutinin subtype of isolated avian influenza virus isolates.
Таким образом, предлагаемый «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации» на основе актуальных штаммов «А/duck/Vladimir/1121/21 H5N2» подтипа Н5 и «А/chicken/Vladimir/1138/2021 H7N2» подтипа Н7 вируса гриппа птиц, является чувствительной и специфичной диагностической системой. Диагностический набор отвечает современным требованиям серологической диагностики и может быть внедрен в практику ветеринарных лабораторий для контроля эпизоотической ситуации по гриппу птиц типа А подтипов Н5 и Н7 на территории Российской Федерации, для дифференциации выявляемых антител против гриппа птиц и выделенных изолятов вируса гриппа птиц.Thus, the proposed “Diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction” based on the current strains “A/duck/Vladimir/1121/21 H5N2” subtype H5 and “A/chicken/Vladimir” /1138/2021 H7N2" subtype H7 avian influenza virus, is a sensitive and specific diagnostic system. The diagnostic kit meets modern requirements for serological diagnostics and can be introduced into the practice of veterinary laboratories to monitor the epizootic situation of avian influenza type A of subtypes H5 and H7 on the territory of the Russian Federation, to differentiate detected antibodies against avian influenza and isolated isolates of the avian influenza virus.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации»:Sources of information taken into account when compiling a description of the invention for the application for a RF patent for the invention “Diagnostic kit for detecting antibodies to the avian influenza virus and identifying the subtype of hemagglutinating viral agent in the hemagglutination inhibition reaction”:
1. Ducatez MF, dinger CM, Owoade AA, Tarnagda Z, Tahita MC, Sow A, et al. Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in western Africa. J Gen Virol. 2007;88:2297-306. 10.1099/vir.0.82939-01. Ducatez MF, dinger CM, Owoade AA, Tarnagda Z, Tahita MC, Sow A, et al. Molecular and antigenic evolution and geographical spread of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses in western Africa. J Gen Virol. 2007;88:2297-306. 10.1099/vir.0.82939-0
2. Smith GJD, Donis RO; World Health Organization/World Organisation for Animal Health/Food and Agriculture Organization (WHO/OIE/FAO) H5 Evolution Working Group.Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5) virus clades 2.1.3.2a, 2.2.1, and 2.3.4 during 2013-2014. Influenza Other Respir Viruses. 2015; 9:271-6. 10.1111/irv. 12324.2. Smith GJD, Donis RO; World Health Organization/World Organization for Animal Health/Food and Agriculture Organization (WHO/OIE/FAO) H5 Evolution Working Group.Nomenclature updates resulting from the evolution of avian influenza A(H5) virus clades 2.1.3.2a, 2.2.1, and 2.3.4 during 2013-2014. Influenza Other Respiratory Viruses. 2015; 9:271-6. 10.1111/irv. 12324.
3. Isoda N, Onuma M, Hiono T, Sobolev I, Lim HY, Nabeshima K, Honjyo H, Yokoyama M, Shestopalov A, Sakoda Y. Detection of New H5N1 High Pathogenicity Avian Influenza Viruses in Winter 2021-2022 in the Far East, Which Are Genetically Close to Those in Europe. Viruses. 2022 Sep 30; 14(10):2168. doi: 10.3390/V14102168.3. Isoda N, Onuma M, Hiono T, Sobolev I, Lim HY, Nabeshima K, Honjyo H, Yokoyama M, Shestopalov A, Sakoda Y. Detection of New H5N1 High Pathogenicity Avian Influenza Viruses in Winter 2021-2022 in the Far East , Which Are Genetically Close to Those in Europe. Viruses. 2022 Sep 30; 14(10):2168. doi: 10.3390/V14102168.
4. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pd (Дата запроса: 30.01.2023).4. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pd (Request date: 01/30/2023).
5. Molesti E, Milani A, Terregino C, Cattoli G, Temperton NJ. Comparative serological assays for the study of h5 and h7 avian influenza viruses. Influenza Res Treat. 2013; 2013:286158. doi: 10.1155/2013/286158. Epub 2013 Sep 15. PMID: 24163763; PMCID: PMC3791816.5. Molesti E, Milani A, Terregino C, Cattoli G, Temperton NJ. Comparative serological assays for the study of h5 and h7 avian influenza viruses. Influenza Res Treat. 2013; 2013:286158. doi: 10.1155/2013/286158. Epub 2013 Sep 15. PMID: 24163763; PMCID: PMC3791816.
6. Shi J, Zeng X, Cui P, Yan C, Chen H. Alarming situation of emerging H5 and H7 avian influenza and effective control strategies. Emerg Microbes Infect. 2023 Dec; 12(1):2155072. doi: 10.1080/22221751.2022.2155072. PMID: 36458831; PMCID: PMC9754034.6. Shi J, Zeng X, Cui P, Yan C, Chen H. Alarming situation of emerging H5 and H7 avian influenza and effective control strategies. Emerging Microbes Infect. Dec 2023; 12(1):2155072. doi: 10.1080/22221751.2022.2155072. PMID: 36458831; PMCID: PMC9754034.
7. Gu W, Shi J, Cui P, et al.. Novel H5N6 reassortants bearing the clade 2.3.4.4b HA gene of H5N8 virus have been detected in poultry and caused multiple human infections in China. Emerg Microbes Infect. 2022; 11(1):1174-1185.7. Gu W, Shi J, Cui P, et al.. Novel H5N6 reassortants bearing the clade 2.3.4.4b HA gene of H5N8 virus have been detected in poultry and caused multiple human infections in China. Emerging Microbes Infect. 2022; 11(1):1174-1185.
8. Dhingra MS, Artois J, Dellicour S, Lemey P, Dauphin G, Von Dobschuetz S, Van Boeckel TP, Castellan DM, Morzaria S, Gilbert M. Geographical and Historical Patterns in the Emergences of Novel Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5 and H7 Viruses in Poultry. Front Vet Sci. 2018 Jun 5; 5:84. doi: 10.3389/fvets.2018.00084. PMID: 29922681; PMCID: PMC5996087.8. Dhingra MS, Artois J, Dellicour S, Lemey P, Dauphin G, Von Dobschuetz S, Van Boeckel TP, Castellan DM, Morzaria S, Gilbert M. Geographical and Historical Patterns in the Emergences of Novel Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5 and H7 Viruses in Poultry. Front Vet Sci. 2018 Jun 5; 5:84. doi: 10.3389/fvets.2018.00084. PMID: 29922681; PMCID: PMC5996087.
9. Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа типа А иммуноферментным методом «ГРИПП А СЕРОТЕСТ» https://vetbio.ru/upload/shop_3/2/9/9/item_299/shop_property_file_299_160.pdf (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 11.01.2022)9. Instructions for using the kit for detecting antibodies to the influenza A virus using the enzyme immunoassay method “FLU A SEROTEST” https://vetbio.ru/upload/shop_3/2/9/9/item_299/shop_property_file_299_160.pdf (link to instructions. Date request: 01/11/2022)
10. Патент РФ №2423145 от 12.08.2009 г.10. RF Patent No. 2423145 dated 08/12/2009
11. Патент РФ №2339694 от 15.11.2006 г.11. RF Patent No. 2339694 dated November 15, 2006
12. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) 12. INSTRUCTIONS for the use of a set of antigens and sera for the diagnosis of avian influenza in the hemagglutination inhibition test (HAI)
13. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации https://shop.amah.ru/upload/iblock/lee/leec3f9d0bf60a2673dd2b609ecc65fc.pdf (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 11.01.2022).13. INSTRUCTIONS for using the kit for detecting antibodies to the avian influenza virus subtype H5 in the hemagglutination inhibition reaction https://shop.amah.ru/upload/iblock/lee/leec3f9d0bf60a2673dd2b609ecc65fc.pdf (link to instructions. Request date: 01/11/2022) .
14. Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации «РТГА-ВГП-СтавБио», https://www.stavbio.ru/products/rtga-vpg-set/. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023)14. Instructions for using the kit for detecting antibodies to the avian influenza virus subtype H5 in the hemagglutination inhibition reaction “RTGA-VGP-StavBio”, https://www.stavbio.ru/products/rtga-vpg-set/. (link to instructions. Request date: 03/09/2023)
15. Патент РФ №2738900 от 27.04.2020 г.15. RF Patent No. 2738900 dated April 27, 2020
16. Инструкция по применению Тест-системы для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), https://vetbio.ru/catalog/birds/test-sistems-PCR/gripp-a-H5-H7/?ysclid=lfflu7vg6dr142660245. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).16. Instructions for use of the Test system for the detection and differentiation of influenza A virus subtypes H5 and H7 by polymerase chain reaction (PCR), https://vetbio.ru/catalog/birds/test-sistems-PCR/gripp-a-H5 -H7/?ysclid=lfflu7vg6dr142660245. (link to instructions. Request date: 03/09/2023).
17. Набор для выявления вируса гриппа птиц А с типированием «Н5-Н7-Н9-ИДС» (Influenza virus а), для применения в ветеринарии и научно-исследовательских целях, производитель: ИДС™, https://ids-lab.ru/catalog/pcr-nabory/bolezni-ptits/test-sistema-pga-gen/?ysclid=lf0u7jygrr183226209. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).17. Kit for identifying avian influenza virus A with typing “H5-N7-N9-IDS” (Influenza virus a), for use in veterinary medicine and research purposes, manufacturer: IDS™, https://ids-lab.ru /catalog/pcr-nabory/bolezni-ptits/test-sistema-pga-gen/?ysclid=lf0u7jygrr183226209. (link to instructions. Request date: 03/09/2023).
18. Тест-система ПЦР РВ Грипп А-Н5/Н7/Н9 - ЩБК, https://biocombinat.ru/catalog/16/5733/?ysclid=lf0vfxytwc192642016. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).18. RT-PCR test system Influenza A-N5/N7/N9 - ShchBK, https://biocombinat.ru/catalog/16/5733/?ysclid=lf0vfxytwc192642016. (link to instructions. Request date: 03/09/2023).
19. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ Набор реагентов для выявления и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5, Н7, Н9 методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® Грипп Н5/Н7/Н9», https://nextbio.ru/include/DownloadFiles.php?file=/upload/iblock/6a6/6a61bc6ac33bb9d8881747dbfa8a9101.pdf&name=%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%82%D1%80%D1%83%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D0%9F%D1%80%D0%B0%D0%B9%D0%BC%C2%AE_H5_H7_H9_%D0%B2.15.12.21-4.pdf. (ссылка на инструкцию. Дата запроса: 09.03.2023).19. INSTRUCTIONS FOR USE A set of reagents for the detection and differentiation of influenza A virus subtypes H5, H7, H9 using multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in real time “AmpliPrime® Influenza H5/H7/H9”, https://nextbio.ru/include/DownloadFiles.php?file=/upload/iblock/6a6/6a61bc6ac33bb9d8881747dbfa8a9101.pdf&name=%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%82%D1%80%D1% 83%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F%D0%90%D0%BC%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D0%9F%D1%80%D0%B0% D0%B9%D0%BC%C2%AE_H5_H7_H9_%D0%B2.15.12.21-4.pdf. (link to instructions. Request date: 03/09/2023).
20. https://vetandlife.ru/sobytiya/uchenye-vniizzh-razrabotali-nabor-dlya-vyyavleniya-antitel-k-virusu-grippa-ptic/?ysclid=lcu5tc4w8h434442487.20. https://vetandlife.ru/sobytiya/uchenye-vniizzh-razrabotali-nabor-dlya-vyyavleniya-antitel-k-virusu-grippa-ptic/?ysclid=lcu5tc4w8h434442487.
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815532C1 true RU2815532C1 (en) | 2024-03-18 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7959929B2 (en) * | 2005-04-21 | 2011-06-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
| CA2626489C (en) * | 2005-10-19 | 2020-10-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
| RU2738900C1 (en) * | 2020-04-27 | 2020-12-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Diagnostic set for detecting antibodies to avian influenza virus subtype h9 in hemagglutination inhibition reaction |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7959929B2 (en) * | 2005-04-21 | 2011-06-14 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
| CA2626489C (en) * | 2005-10-19 | 2020-10-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc | Materials and methods for respiratory disease control in canines |
| RU2738900C1 (en) * | 2020-04-27 | 2020-12-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Diagnostic set for detecting antibodies to avian influenza virus subtype h9 in hemagglutination inhibition reaction |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pantin-Jackwood M. J. et al. Infectivity, transmission and pathogenicity of H5 highly pathogenic avian influenza clade 2.3. 4.4 (H5N8 and H5N2) United States index viruses in Pekin ducks and Chinese geese // Veterinary Research, 2017, 48, p. 1-14. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brown et al. | Isolation of an influenza A virus of unusual subtype (H1N7) from pigs in England, and the subsequent experimental transmission from pig to pig | |
| Alexander et al. | Characterization of viruses which represent further distinct serotypes (PMV-8 and PMV-9) of avian paramyxoviruses | |
| JP2525734B2 (en) | Influenza vaccine | |
| Chua et al. | Performance evaluation of five detection tests for avian influenza antigen with various avian samples | |
| Vasfi et al. | Isolation of H9N2 subtype of avian influenza viruses during an outbreak in chickens in Iran | |
| Mohammed et al. | Conventional and molecular detection of Newcastle disease and infectious Bursal disease in chickens | |
| RU2815532C1 (en) | Diagnostic kit for detecting antibodies to avian influenza virus and identifying subtype of hemagglutinating viral agent in hemagglutination inhibition reaction | |
| Al-Ebshahy et al. | First report of seroprevalence and genetic characterization of avian orthoreovirus in Egypt | |
| RU2738900C1 (en) | Diagnostic set for detecting antibodies to avian influenza virus subtype h9 in hemagglutination inhibition reaction | |
| Marandi et al. | Isolation of H9N2 subtype of avian influenza viruses during an outbreak in chickens in Iran | |
| Mahmood et al. | Trypsin-induced hemagglutination assay for the detection of infectious bronchitis virus | |
| Ali et al. | Interaction between Newcastle disease and infectious bursal disease vaccines commonly used in Sudan | |
| RU2736788C1 (en) | Strain a/chiken/kostroma/3175/17 h5n2 of avian influenza virus subtype h5n2 infuenza a virus of genus alphainfluenzavirus to control antigenic and immunogenic activity of avian influenza vaccines and for making antigen-containing diagnosticums | |
| Ongarbayeva et al. | Isolation and characteristics of influenza viruses circulating among swine populations in Kazakhstan during 2018–2019 | |
| CN110438093A (en) | A kind of infectious bronchitis of chicken HI antigen and preparation method thereof | |
| Abtin et al. | Two Novel Avian Influenza Virus Subtypes Isolated from Domestic Ducks in North of Iran | |
| Hemida | Detection and molecular characterization of group D avian rotavirus in Kafrelsheikh and Gharbia Governorates. | |
| Lang et al. | A new subtype of type A influenzavirus isolated from turkeys | |
| RU2821028C1 (en) | Newcastle disease virus "vniizzh g7" strain for production of biopreparations for diagnosis and specific prevention of newcastle disease of birds | |
| Azizah et al. | Isolation and identification of Newcastle disease virus from ducks sold at traditional livestock market center in Indonesia | |
| Ozaki et al. | Changing patterns of h6 influenza viruses in Hong Kong poultry markets | |
| RU2482184C2 (en) | Newcastle disease virus strain used in serum diagnosis of newcastle disease in hemagglutination inhibition test | |
| Meseko et al. | Serosurvey of antibody to highly pathogenic avian influenza (H5N1) in pigs, north central Nigeria | |
| Saleem et al. | Antigenic characterization of avian influenza H9 subtype isolated from desi and zoo birds | |
| Yamamoto et al. | Isolation of influenza A virus from budgerigars and its serological characterization |