RU2813729C1 - Method of inducing spontaneous differentiation of cells of periodontal ligament and periosteum in odontogenic and osteogenic directions by using a decellularized matrix of tooth and human periodontal ligament - Google Patents
Method of inducing spontaneous differentiation of cells of periodontal ligament and periosteum in odontogenic and osteogenic directions by using a decellularized matrix of tooth and human periodontal ligament Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813729C1 RU2813729C1 RU2022124418A RU2022124418A RU2813729C1 RU 2813729 C1 RU2813729 C1 RU 2813729C1 RU 2022124418 A RU2022124418 A RU 2022124418A RU 2022124418 A RU2022124418 A RU 2022124418A RU 2813729 C1 RU2813729 C1 RU 2813729C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- periodontal ligament
- decellularized
- periodontal
- solution
- Prior art date
Links
- 210000002379 periodontal ligament Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 title claims description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 106
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 10
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 9
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 8
- 102100029792 Dentin sialophosphoprotein Human genes 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 claims description 7
- 108010088492 dentin sialophosphoprotein Proteins 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 4
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 4
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 3
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 claims description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 claims description 2
- 239000012109 Alexa Fluor 568 Substances 0.000 claims description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 2
- 239000004568 cement Substances 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 2
- 230000009668 clonal growth Effects 0.000 claims description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007712 rapid solidification Methods 0.000 claims description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims 1
- 210000004523 ligament cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 claims 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 abstract description 30
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 abstract description 28
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 abstract description 28
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 abstract 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 51
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 19
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000012552 review Methods 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- -1 antibodies Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000000250 cementoblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000009442 healing mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000004416 odontoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 2-(4-ethoxyphenyl)-6-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-benzimidazole;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 JABNPSKWVNCGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001798 Nonvital Tooth Diseases 0.000 description 1
- 201000004328 Pulpitis Diseases 0.000 description 1
- 206010037464 Pulpitis dental Diseases 0.000 description 1
- 238000003070 Statistical process control Methods 0.000 description 1
- 208000014151 Stomatognathic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 102220482677 Uncharacterized protein EXOC3-AS1_A61S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003260 anti-sepsis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004763 bicuspid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012309 immunohistochemistry technique Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910001504 inorganic chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229920006273 intrinsic self-healing polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000604 odontoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000004261 periodontium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000025934 tissue morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000246 tooth germ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области тканевой инженерии, а именно к биоинженерным конструкциям, включающим девитализированный и/или децеллюляризированный внеклеточный матрикс (англ. extracellular matrix, ЕСМ), продуцированный и собранный клетками организма, который при культивировании в условиях трехмерного пространства (3D) в полученных от человека и заселивших этот матрикс клетках индуцирует дифференцировку в нужные типы клеток.The invention relates to the field of tissue engineering, namely to bioengineered structures including devitalized and/or decellularized extracellular matrix (ECM), produced and assembled by the cells of the body, which, when cultivated in three-dimensional space (3D) conditions, obtained from humans and the cells populating this matrix induces differentiation into the desired cell types.
Объект настоящего изобретения имеет отношение к дисциплинам тканевой инженерии, регенерации ткани и регенеративной медицины, объединяющей методы биоинженерии с принципами наук о жизни для понимания структурных и функциональных связей в нормальных и патологических тканях млекопитающих. Общая цель этих дисциплин - развитие и конечное применение биологических материалов для восстановления, поддержания или улучшения функций ткани. Таким образом, появляется возможность спроектировать и изготовить биоинженерную конструкцию в лаборатории.The subject matter of the present invention relates to the disciplines of tissue engineering, tissue regeneration and regenerative medicine, combining bioengineering techniques with life science principles to understand the structural and functional relationships in normal and pathological tissues of mammals. The common goal of these disciplines is the development and end-use application of biological materials to restore, maintain, or improve tissue function. Thus, it becomes possible to design and manufacture a bioengineered structure in the laboratory.
Биоинженерная конструкция должна быть функциональной после трансплантации в организм и быть надолго инкорпорирована в организм или постепенно ремоделирована (сделана заново) клетками биоинженерной конструкции или организма реципиента. Выбор носителя/скаффолда является одним из ключевых элементов, от которого во многом зависит конечный успех в реконструкции тканей. Скаффолды обеспечивают не только прикрепление клеток и их рост, но и способствуют формированию необходимой ткани. Выращивание мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на скаффолде, который поддерживает формирование и созревание ткани in vitro, является одним из наиболее бурно развивающихся подходов тканевой инженерии. Традиционно для создания биоинженерных конструкций в стоматологии в качестве клеточного материала применяют МСК - плюрипотентные стволовые клетки, обладающие хондрогенной, остеогенной и адипогенной дифференцировкой. В качестве источника таких прогениторных клеток, дифференцирующихся в остеобласты, цементобласты и фибробласты, наиболее часто рассматривают пульпу зуба, апикальный сосочек, периодонтальную связку и выпадающие молочные зубы (Nishimura et al., 2012; Liu et al., 2015). Однако трудности стимуляции экзогенных МСК и контроль их дифференцировки in vivo затрудняют их широкое использование в клинической практике.The bioengineered structure must be functional after transplantation into the body and be incorporated into the body for a long time or gradually remodeled (made anew) by the cells of the bioengineered structure or the recipient's body. The choice of carrier/scaffold is one of the key elements on which the ultimate success in tissue reconstruction largely depends. Scaffolds not only ensure cell attachment and growth, but also contribute to the formation of the necessary tissue. Growing mesenchymal stem cells (MSCs) on a scaffold that supports tissue formation and maturation in vitro is one of the fastest growing tissue engineering approaches. Traditionally, to create bioengineered structures in dentistry, MSCs are used as cellular material - pluripotent stem cells with chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation. The source of such progenitor cells, which differentiate into osteoblasts, cementoblasts and fibroblasts, is most often considered to be the dental pulp, apical papilla, periodontal ligament and falling out primary teeth (Nishimura et al., 2012; Liu et al., 2015). However, difficulties in stimulating exogenous MSCs and controlling their differentiation in vivo hinder their widespread use in clinical practice.
Перспективной альтернативой клеточным стратегиям является стимуляция или усиление внутренних механизмов самовосстановления пациента для содействия эндогенного восстановления утраченных/поврежденных тканей (Wang et al., 2018). Эти методы тканевой инженерии in vivo часто называют бесклеточными подходами или эндогенной регенеративной технологией, поскольку они не используют экзогенные источники клеток (Chen et al., 2010b). Основные концепции бесклеточной терапии подчеркивают способность биоактивных материалов стимулировать, усиливать или управлять регенерацией эндогенных тканей. При правильных условиях эндогенные нативные клетки могут быть мобилизованы и стимулированы для образования новых тканей с помощью простого подхода, основанного на биоматериалах (Stevens et al., 2005). Поскольку регенерация тканей, по существу, включает увеличение числа тканеобразующих клеток и реконструкцию каркаса ЕСМ, который поддерживает эти клетки (Vasita, Katti, 2006), бесклеточные подходы направлены на использование подходящего скаффолда для усиления врожденной способности тканей к регенерации (Bu et al., 2010). Благодаря рекрутированию и самонаведению эндогенных МСК множество тканей успешно регенерировали после трансплантации хорошо сконструированных тканеспецифических скаффолдов без использования культивирования МСК (Wu et al., 2018). Успешное проникновение эндогенных резидентных клеток и пребывание их в скаффолде регулируются ответами, генерируемыми окружающей биологической микросредой после имплантации биоматериала, и сами эти ответы во многом зависят от свойств поверхности биоматериалов (Wu et al., 2018).A promising alternative to cellular strategies is to stimulate or enhance the patient's intrinsic self-healing mechanisms to promote endogenous repair of lost/damaged tissue (Wang et al., 2018). These in vivo tissue engineering techniques are often referred to as cell-free approaches or endogenous regenerative technology because they do not use exogenous cell sources (Chen et al., 2010b). The basic concepts of acellular therapy emphasize the ability of bioactive materials to stimulate, enhance or control the regeneration of endogenous tissues. Under the right conditions, endogenous native cells can be mobilized and stimulated to form new tissues using a simple biomaterials-based approach (Stevens et al., 2005). Since tissue regeneration essentially involves increasing the number of tissue-forming cells and remodeling the ECM scaffold that supports these cells (Vasita and Katti, 2006), cell-free approaches aim to use a suitable scaffold to enhance the innate ability of tissues to regenerate (Bu et al., 2010). ). Through the recruitment and homing of endogenous MSCs, many tissues have been successfully regenerated after transplantation of well-designed tissue-specific scaffolds without the use of MSC culture (Wu et al., 2018). The successful penetration of endogenous resident cells and their residence in the scaffold are regulated by responses generated by the surrounding biological microenvironment after biomaterial implantation, and these responses themselves largely depend on the surface properties of biomaterials (Wu et al., 2018).
Децеллюляризованный ЕСМ (dECM) представляет собой ЕСМ, изолированный от тканей и лишенный исходных резидентных клеток; многообещающий естественный биоматериал для тканевой инженерии, предназначенный для поддержки, замены или восстановления поврежденных тканей (Yao et al., 2019). dECM, полученные из нативных тканей, таких как кости, хрящи, кожа и зубные зачатки, или из клеток, таких как остеобласты, хондроциты и МСК, дали обнадеживающие результаты в области регенерации тканей периодонта (Mansour et al., 2017). Например, ЕСМ костной ткани действует как резервуар провоспалительных цитокинов, факторов роста семейства TGF-β, включая несколько BMP, и ангиогенных факторов роста, таких как VEGF, которые необходимы для достижения остеоиндуктивности путем регуляции различных фаз регенерации костной ткани (Papadimitropoulos et al., 2015). Результаты нашего недавнего исследования показали, что dECM зуба индуцирует спонтанную остеогенную дифференцировку клеток надкостницы in vitro (Ivanov et al., 2020). Это позволяет предположить, что dECM является резервуаром факторов, регулирующих рекрутирование и дифференцировку МСК хозяина.Decellularized ECM (dECM) is ECM isolated from tissues and devoid of original resident cells; a promising natural biomaterial for tissue engineering to support, replace, or repair damaged tissues ( Yao et al., 2019 ). dECMs derived from native tissues such as bone, cartilage, skin and tooth germs or from cells such as osteoblasts, chondrocytes and MSCs have shown promising results in the field of periodontal tissue regeneration (Mansour et al., 2017). For example, the bone ECM acts as a reservoir of pro-inflammatory cytokines, TGF-β family growth factors including several BMPs, and angiogenic growth factors such as VEGF, which are required to achieve osteoinductivity by regulating the various phases of bone regeneration (Papadimitropoulos et al., 2015 ). The results of our recent study showed that dental dECM induces spontaneous osteogenic differentiation of periosteal cells in vitro (Ivanov et al., 2020). This suggests that the dECM is a reservoir of factors regulating the recruitment and differentiation of host MSCs.
Децеллюляризация определяется как эффективное удаление всего клеточного и ядерного содержимого без отрицательного влияния на состав ЕСМ (Badylak et al., 2009). Сохранение этой наноструктурированной среды и сетчатой структуры из волокнистых и адгезивных белков обеспечивает закрепление клеток и регулирует будущую клеточную активность (Galler et al., 2011). Бесклеточная матрица считается идеальным каркасом для регенерации ткани (Badylak, 2002), а создание бесклеточного каркаса, способного привлекать и поддерживать локальные резидентные клетки, является возможным направлением для инженерии клеточно-дентинной ткани (Galler et al., 2011). Существуют различные подходы к децеллюляризации ЕСМ и, в частности, зуба (Gilpin, Yang, 2017; Porzionato et al., 2018). Продемонстрировано успешное использование децеллюляризированного зуба, а точнее дентальной пульпы, для регенеративной эндодонтии. Третьи моляры были децеллюляризированы тремя различными методами и лучший, по мнению авторов, вариант был рецеллюляризирован стволовыми клетками апикального сосочка с их последующей дифференцировкой в одонтобласто-подобные клетки (Song et al., 2017). В работе Hu с соавторами использовали децеллюляризированный 10% SDS в комбинации с Triton Х-100 матрикс дентальной пульпы свиньи, который был заселен стволовыми клетками пульпы с последующим образованием пульпо-подобной ткани (Ни et al., 2017). Указанный способ децеллюляризации является аналогом и прототипом данного изобретения. Однако dECM в данном изобретении используется не для восстановления тканей пульпы зуба, как в большинстве проводимых работ, а для проспективного восстановления тканей периодонта. Известно изобретение [патент RU 2716594, 13.03.2020], заключающийся в следующем. Корень удаляемого зуба децеллюляризируют путем последовательной обработки раствором 100 мМ ЭДТА-Na2 /10 мМ NaOH в дистиллированной воде в течение суток, 1% водного раствора Triton Х-100 в течение суток, 4.2 мМ раствора хлорида магния, содержащего 20 μg/ml ДНКазы в течение 2-3 часов, промывают эффективным количеством раствора фосфатно-солевого буфера, содержащим смесь антибиотиков - 300 МЕ/мл пенициллина, 300 МЕ/мл стрептомицина и 75 мкг/мл амфотерицина в течение 1 часа. Данное изобретение подразумевает способ децеллюляризации тканей зуба человека, тогда как в представленном изобретении предлагается использовать децеллюляризированные матриксы зуба и периодонтальной связки, полученные схожим способом, для индукции спонтанной дифференцировки клеток периодонтальной связки и надкостницы в одонтогенном и остеогенном направлениях, для чего децеллюляризированные ткани помещают в 3D условия, а именно в коллагеновый гель, имитирующий условия in vivo.Decellularization is defined as the efficient removal of all cellular and nuclear contents without negatively affecting ECM composition (Badylak et al., 2009). Maintaining this nanostructured environment and network structure of fibrous and adhesive proteins ensures cell anchorage and regulates future cellular activity (Galler et al., 2011). An acellular matrix is considered an ideal scaffold for tissue regeneration (Badylak, 2002), and the creation of an acellular scaffold that can attract and support local resident cells is a possible direction for cell-dentin tissue engineering (Galler et al., 2011). There are various approaches to decellularization of the ECM and, in particular, the tooth (Gilpin and Yang, 2017; Porzionato et al., 2018). The successful use of decellularized teeth, or more specifically dental pulp, for regenerative endodontics has been demonstrated. Third molars were decellularized by three different methods, and the best option, according to the authors, was recellularized by apical papilla stem cells with their subsequent differentiation into odontoblast-like cells (Song et al., 2017). Hu et al. used decellularized 10% SDS in combination with Triton X-100 porcine dental pulp matrix, which was populated with pulp stem cells with subsequent formation of pulp-like tissue (Hu et al., 2017). This decellularization method is an analogue and prototype of this invention. However, dECM in this invention is not used for the restoration of dental pulp tissue, as in most ongoing work, but for the prospective restoration of periodontal tissue. The invention is known [patent RU 2716594, 03.13.2020], which consists of the following. The root of the extracted tooth is decellularized by sequential treatment with a solution of 100 mM EDTA-Na 2 /10 mM NaOH in distilled water for 24 hours, 1% aqueous solution of Triton X-100 for 24 hours, 4.2 mM magnesium chloride solution containing 20 μg/ml DNase in for 2-3 hours, washed with an effective amount of phosphate-buffered saline solution containing a mixture of antibiotics - 300 IU/ml penicillin, 300 IU/ml streptomycin and 75 μg/ml amphotericin for 1 hour. This invention involves a method for decellularizing human dental tissues, while the present invention proposes the use of decellularized matrices of the tooth and periodontal ligament, obtained in a similar way, to induce spontaneous differentiation of cells of the periodontal ligament and periosteum in the odontogenic and osteogenic directions, for which the decellularized tissues are placed in 3D conditions , namely in a collagen gel that simulates in vivo conditions.
Из документа Д1 (Садовой М.А., Ларионов П.М., Самохин А.Г., Рожнова О.М. Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы. "Хирургия позвоночника". 2014;(2):79-86. https://doi.org/10.14531/ss2014.2.79-86) известно, что для реконструкции обширных костных дефектов и регенерации кости используют тканеинженерную стратегию, подразумевающую применение клеточных технологий, а именно использование матриц (скаффолдов), заселенных клетками/МСК, тогда как в заявленном изобретении клетки используются в модели in vitro только для доказательства регенеративного потенциала бесклеточного (децеллюляризированного) матрикса и не подразумевает их использование in vivo, т.е. не предполагает экзогенное введение клеток, таким образом речь идет о бесклеточных технологиях, основанных на стимуляции эндогенных механизмов заживления. В основе концепции бесклеточной терапии лежит способность биоактивных материалов стимулировать, усиливать или управлять регенерацией эндогенных тканей. Успешное проникновение эндогенных клеток и их существование в скаффолде регулируется сигналами, генерируемыми микроокружением, формирующимся после имплантации биоматериала, а сами сигналы во многом зависят от свойств поверхности биоматериалов (Wu et al., 2018). Скаффолды, полученные путем децеллюляризации тканей млекопитающих, не проявляют иммунных ответов и по своей природе содержат тканеспецифические факторы, участвующие в росте и дифференцировке клеток (Parmaksiz et al., 2016), они с успехом используются в исследованиях регенеративной стоматологии (Yao et al., 2019). Кроме того, из документа Д1 (обзора литературы) следует, что для изготовления скаффолдов используют коллаген, тогда как в заявленном изобретении коллагеновый гель не используется для создания скаффолдов, и не подразумевается его использование in vivo, а используется только в модели in vitro исключительно для создания условий подобных in vivo, т.е. создания микроокружения сходного с нативными тканями, показывающий в итоге регенеративный потенциал бесклеточного (децеллюляризированного) матрикса.From document D1 (Sadovoy M.A., Larionov P.M., Samokhin A.G., Rozhnova O.M. Cellular matrices (scaffolds) for bone regeneration: the current state of the problem. "Spine Surgery". 2014;(2 ):79-86. https://doi.org/10.14531/ss2014.2.79-86) it is known that for the reconstruction of extensive bone defects and bone regeneration, a tissue engineering strategy is used, which involves the use of cellular technologies, namely the use of matrices (scaffolds), populated by cells/MSCs, whereas in the claimed invention the cells are used in the in vitro model only to prove the regenerative potential of the cell-free (decellularized) matrix and does not imply their use in vivo, i.e. does not involve exogenous introduction of cells, so we are talking about cell-free technologies based on stimulation of endogenous healing mechanisms. The concept of cell-free therapy is based on the ability of bioactive materials to stimulate, enhance or control the regeneration of endogenous tissues. The successful penetration of endogenous cells and their existence in the scaffold is regulated by signals generated by the microenvironment formed after biomaterial implantation, and the signals themselves largely depend on the surface properties of biomaterials (Wu et al., 2018). Scaffolds obtained by decellularization of mammalian tissues do not exhibit immune responses and inherently contain tissue-specific factors involved in cell growth and differentiation (Parmaksiz et al., 2016), they have been successfully used in regenerative dentistry research (Yao et al., 2019 ). In addition, from document D1 (literature review) it follows that collagen is used to make scaffolds, whereas in the claimed invention collagen gel is not used to create scaffolds, and its use in vivo is not implied, but is used only in an in vitro model solely for the creation conditions similar to in vivo, i.e. creating a microenvironment similar to native tissues, ultimately showing the regenerative potential of an acellular (decellularized) matrix.
Из документа Д2 (Кулаков А.А., Гольдштейн Д.В., Кречина Е.К., Волков А.В., Гаджиев А.К. Регенерация пульпы зуба с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток пульпы и обогащенной тромбоцитами плазмы. Стоматология. 2017; 96 (6): 12D16. https://doi.org/10.17116/stomat201796612-16) известно, что авторы для регенерации ткани пульпы в экспериментальной модели частичной резекции пульпы премоляров и моляров миниатюрных свиней использовали аутологичные мультипотентные стромальные клетки пульпы коренных зубов в составе фибриного сгустка (обогащенной тромбоцитами плазмы). В обсуждении авторы, на основании гистологической картины формирование дентиновых мостиков в области регенерации связывают с созреванием функционально активных одонтобластов, не приводя иммуногистохимического подтверждения, тогда как в заявленном изобретении используется специфический маркер одонтобластной дифференцировки - сиалофосфопротеин дентина (DSPP). Кроме того, используемый авторами в документе Д2 способ регенерации in vivo подразумевает использование стволовых/прогениторных клеток (СПК), тогда как в заявленном изобретении клетки используются в модели in vitro только для доказательства регенеративного потенциала бесклеточного (децеллюляризированного) матрикса и не подразумевает их использование in vivo, т.е. не предполагает экзогенное введение клеток, таким образом речь идет о бесклеточных технологиях, основанных на стимуляции эндогенных механизмов заживления. Из литературных данных известно, что наработка СПК ex vivo и их использование in vivo создают большие технические трудности, которые препятствуют клиническому внедрению и коммерческому развитию клеточных технологий (Wang et al., 2018). В связи с этим перспективной альтернативой клеточным технологиям является стимуляция или усиление внутренних механизмов пациента для эндогенного восстановления утраченной/поврежденной кости (Chen et al., 2010а; Wang et al., 2018). Кроме того, из документа Д2 следует, что по данным литературы подкожная трансплантация клеток пульпы, иммобилизованных на скаффолдах и помещенных во фрагмент депульпированного зуба, приводит к формированию ткани схожей с соединительной тканью пульпы, тогда как в заявленном изобретении речь не идет о лечении пульпитов, речь идет о восстановлении периодонтальных (опорных) тканей зуба, т.е. периодонтальной связки, дентина и альвеолярной кости.From document D2 (Kulakov A.A., Goldshtein D.V., Krechina E.K., Volkov A.V., Gadzhiev A.K. Dental pulp regeneration using autologous pulp mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma. Dentistry. 2017; 96 (6): 12D16. https://doi.org/10.17116/stomat201796612-16) it is known that the authors used autologous multipotent stromal cells from the pulp of molars to regenerate pulp tissue in an experimental model of partial resection of the pulp of premolars and molars of miniature pigs as part of a fibrin clot (platelet-rich plasma). In the discussion, the authors, based on the histological picture, associate the formation of dentin bridges in the area of regeneration with the maturation of functionally active odontoblasts, without providing immunohistochemical confirmation, while the claimed invention uses a specific marker of odontoblastic differentiation - dentin sialophosphoprotein (DSPP). In addition, the in vivo regeneration method used by the authors in document D2 implies the use of stem/progenitor cells (SPC), while in the claimed invention the cells are used in an in vitro model only to prove the regenerative potential of an acellular (decellularized) matrix and does not imply their use in vivo , i.e. does not involve exogenous introduction of cells, so we are talking about cell-free technologies based on stimulation of endogenous healing mechanisms. It is known from the literature that the development of SPCs ex vivo and their use in vivo create great technical difficulties that hinder the clinical implementation and commercial development of cell technologies (Wang et al., 2018). In this regard, a promising alternative to cell technologies is to stimulate or enhance the patient's intrinsic mechanisms to endogenously repair lost/damaged bone (Chen et al., 2010a; Wang et al., 2018). In addition, from document D2 it follows that, according to the literature, subcutaneous transplantation of pulp cells immobilized on scaffolds and placed in a fragment of a pulpless tooth leads to the formation of tissue similar to the connective tissue of the pulp, while in the claimed invention we are not talking about the treatment of pulpitis, we are talking is about the restoration of periodontal (supporting) tissues of the tooth, i.e. periodontal ligament, dentin and alveolar bone.
Заболевания периодонта - это хроническое воспалительное состояние тканей периодонта, вызванное преимущественно колонизацией грамотрицательными бактериями. В очаге поражения пародонтитом хроническое воспаление в течение длительного времени приводит к прогрессирующему разрушению опорных тканей зуба, и в конечном итоге пораженные зубы удаляются из-за утраты опорных тканей (Hughes et al., 2010).Periodontal disease is a chronic inflammatory condition of periodontal tissues caused primarily by colonization by gram-negative bacteria. In periodontitis lesions, chronic inflammation over a long period of time leads to progressive destruction of the supporting tissues of the tooth, and eventually the affected teeth are removed due to loss of supporting tissues (Hughes et al., 2010).
Конечной целью лечения заболеваний периодонта является восстановление утраченных тканей периодонта, включая цемент, периодонтальную связку и альвеолярную кость. Для этого требуется формирование цемента и альвеолярной кости, функционально связанных с периодонтальной связкой. Традиционные регенеративные подходы направлены на стимулирование роста и дифференцировки резидентных в ткани клеток-предшественников в фибробласты, цементобласты и остеобласты, предотвращая при этом прорастание эпителиальных тканей в периодонтальный дефект. Этот подход, называемый направленной регенерацией тканей, представляет собой применение барьерных мембран с биоактивными молекулами или без них, таких как производные эмалевого матрикса и рекомбинантные факторы роста (Han et al., 2014). Кроме того, аутогенная кость или заменители кости аллогенного, ксеногенного или аллопластического происхождения могут применяться в качестве скаффолда для роста и миграции клеток. Эти вмешательства доказали свою клиническую эффективность. Однако большая разнородность исследований подтверждает непредсказуемость методов лечения, и ни один из существующих вариантов лечения не обеспечивает полной регенерации периодонта (Yamada et al., 2022). Тем временем концепция биомиметиков была использована при изготовлении тканевых инженерных конструкций для регенерации тканей периодонта. Несмотря на большие различия между исследованиями, большинство концепций проектирования сходятся в воспроизведении иерархической организации нативных тканей периодонта, особенно ЕСМ, структурно и функционально в условиях ex vivo (Yamada et al., 2022). Каркасы, таким образом, служат ядром тканевой инженерии, потому что они обеспечивают 3D структурную поддержку и пространственное направление для клеток.The ultimate goal of treating periodontal disease is to restore lost periodontal tissue, including cementum, periodontal ligament, and alveolar bone. This requires the formation of cementum and alveolar bone, functionally connected to the periodontal ligament. Traditional regenerative approaches aim to stimulate the growth and differentiation of tissue-resident progenitor cells into fibroblasts, cementoblasts and osteoblasts, while preventing epithelial tissue from invading the periodontal defect. This approach, called guided tissue regeneration, is the use of barrier membranes with or without bioactive molecules, such as enamel matrix derivatives and recombinant growth factors (Han et al., 2014). In addition, autogenous bone or bone substitutes of allogeneic, xenogeneic or alloplastic origin can be used as a scaffold for cell growth and migration. These interventions have proven clinical effectiveness. However, the wide heterogeneity of studies confirms the unpredictability of treatment methods, and none of the existing treatment options achieve complete periodontal regeneration (Yamada et al., 2022). Meanwhile, the concept of biomimetics has been used in the fabrication of tissue engineered constructs for periodontal tissue regeneration. Despite large differences between studies, most design concepts converge in reproducing the hierarchical organization of native periodontal tissues, especially the ECM, structurally and functionally in ex vivo settings ( Yamada et al., 2022 ). Scaffolds thus serve as the core of tissue engineering because they provide 3D structural support and spatial guidance to cells.
В большинстве случаев способность к регенерации пораженной ткани довольно слабая, и потерянный/поврежденный периодонт может не восстановиться (Xu et al., 2019). Сверхмасштабный дефект и нарушение регенеративной способности, вызванные старением и другими системными заболеваниями, также дополняют локальное воспалительное микроокружение. Использование эндогенных стволовых клеток для дефектных участков посредством взаимодействия клеток с материалом in vivo является первой целью эндогенной регенеративной медицины. Основываясь на этой концепции, несколько скаффолдов в сочетании с факторами роста, антителами и лекарствами были разработаны и применены для улучшения самонаведения клеток и регенерации тканей (Xu et al., 2019).In most cases, the regeneration ability of the affected tissue is quite weak, and the lost/damaged periodontium may not recover (Xu et al., 2019). The large-scale defect and impairment of regenerative capacity caused by aging and other systemic diseases also complement the local inflammatory microenvironment. The use of endogenous stem cells for defective areas through cell-material interactions in vivo is the first goal of endogenous regenerative medicine. Based on this concept, several scaffolds in combination with growth factors, antibodies, and drugs have been developed and applied to improve cell homing and tissue regeneration (Xu et al., 2019).
Более того, dECM, который сохраняет структурные компоненты нативной ткани и содержит множество разнообразных сигналов и факторов роста, также может рекрутировать эндогенные стволовые клетки в место имплантации/трансплантации и управлять их дифференцировкой (Agmon, Christman, 2016). По сравнению с искусственными материалами нативные матрицы вызывают меньше воспалительных реакций и делают терапию более безопасной и более эффективной (Parmaksiz et al., 2016). Фактически, многие биоматериалы или их модифицированные формы уже проложили путь для клинической регенерации пародонта. Создание более специфических конструкций или включение выбранных факторов самонаведения в значительной степени увеличило бы их способность рекрутировать клетки-хозяева и, таким образом, дополнительно индуцировать регенерацию эндогенной ткани (Xu et al., 2019).Moreover, dECM, which retains the structural components of native tissue and contains a wide variety of signals and growth factors, can also recruit endogenous stem cells to the site of implantation/transplantation and control their differentiation (Agmon and Christman, 2016). Compared to artificial materials, native matrices cause fewer inflammatory reactions and make therapy safer and more effective (Parmaksiz et al., 2016). In fact, many biomaterials or their modified forms have already paved the way for clinical periodontal regeneration. Creation of more specific constructs or inclusion of selected homing factors would greatly enhance their ability to recruit host cells and thus further induce endogenous tissue regeneration (Xu et al., 2019).
Все чаще признается, что микроокружение, которое действует как «почва», оказывает огромное влияние на эндогенные МСК, особенно при патологических состояниях. В патологических условиях микроокружения выживаемость и функции эндогенных МСК нарушаются, что приводит к снижению способности к регенерации. Принимая во внимание этиологическую роль дисфункции МСК, вызванной патологическим микроокружением, в заболеваниях костей и зубов, многообещающей стратегией для облегчения эндогенного восстановления костей и зубов на основе МСК является манипулирование микроокружением стволовых клеток, что является менее дорогим и трудоемким и позволяет избежать хирургической травмы и риска отторжения (Ho-Shui-Ling et al., 2018).It is increasingly recognized that the microenvironment, which acts as a “soil,” has a profound influence on endogenous MSCs, especially under pathological conditions. Under pathological microenvironmental conditions, the survival and functions of endogenous MSCs are impaired, which leads to a decrease in the ability to regenerate. Considering the etiological role of MSC dysfunction caused by pathological microenvironment in bone and dental diseases, a promising strategy to facilitate endogenous MSC-based bone and tooth repair is manipulation of the stem cell microenvironment, which is less expensive and labor intensive and avoids surgical trauma and risk of rejection. (Ho-Shui-Ling et al., 2018).
Монослойная (2D) культура клеток лежит в основе современных научных знаний в области клеточной биологии, молекулярной биологии, дифференцировки стволовых клеток, морфогенеза тканей и других процессов. Однако, в монослойной (2D) культуре невозможно реконструировать то микроокружение клетки, которое существует in vivo, и, таким образом, поддерживать функции дифференцированных клеток. Методы культивирования клеток в 3D условиях способны устранить ограничения, свойственные 2D культурам. 3D системы включают в себя многочисленные, динамично взаимодействующие типы клеток и тканей, механические компоненты среды и биохимическое микроокружение. Каждый тип клеток in vivo находится в различном 3D микроокружении. Ниша стволовых клеток тоже трехмерная, и ее биохимия и топология сильно влияют на процесс дифференцировки клеток. Использование природных биополимеров в создании биоинженерных конструкций позволяет максимально имитировать строение и свойства тканей и органов, а также создавать микроокружение со структурой, близкой к строению природных клеточных ниш. Это позволяет достигать эффективного заселения таких искусственных ниш стволовыми клетками и способствовать их практически полной дифференцировке в нужные типы клеток.Monolayer (2D) cell culture underlies modern scientific knowledge in the field of cell biology, molecular biology, stem cell differentiation, tissue morphogenesis and other processes. However, in a monolayer (2D) culture it is impossible to reconstruct the cell microenvironment that exists in vivo and, thus, maintain the functions of differentiated cells. Methods for culturing cells in 3D conditions can eliminate the limitations inherent in 2D cultures. 3D systems include multiple, dynamically interacting cell and tissue types, mechanical environmental components, and biochemical microenvironments. Each cell type in vivo resides in a different 3D microenvironment. The stem cell niche is also three-dimensional, and its biochemistry and topology strongly influence the process of cell differentiation. The use of natural biopolymers in the creation of bioengineered structures makes it possible to maximally imitate the structure and properties of tissues and organs, as well as create a microenvironment with a structure close to the structure of natural cellular niches. This makes it possible to effectively populate such artificial niches with stem cells and promote their almost complete differentiation into the desired cell types.
Учитывая, что скаффолды действуют как ниши для заселяемых клеток, модификация скаффолдов на основе биоматериалов для воссоздания специфической микросреды рассматривается как перспективный подход для восстановления функций эндогенных стволовых клеток (Ho-Shui-Ling et al., 2018).Given that scaffolds act as niches for colonized cells, biomaterial-based modification of scaffolds to recreate a specific microenvironment is considered a promising approach to restore endogenous stem cell functions (Ho-Shui-Ling et al., 2018).
Для разработки технологии лечения парадонтита заявителями разработан способ использования комплекса децеллюляризированных тканей зуба и периодонтальной связки человека (далее скаффолды) для тестирования in vitro или для трансплантации субъекту с целью восстановления тканей периодонта. Скаффолды из dECM зуба и периодонтальной связки имеет архитектонику, обеспечивающую надежную адгезию стволовых и прогениторных клеток, их пролиферацию и дифференцировку. В биоинженерной конструкции скаффолды в условиях 3D культивирования индуцируют дифференцировку МСК и прогениторных клеток надкостницы и периодонтальной связки.To develop a technology for the treatment of periodontitis, the applicants have developed a method of using a complex of decellularized human tooth tissue and periodontal ligament (hereinafter referred to as scaffolds) for in vitro testing or for transplantation into a subject for the purpose of restoring periodontal tissue. Scaffolds made from dECM of the tooth and periodontal ligament have an architectonics that ensures reliable adhesion of stem and progenitor cells, their proliferation and differentiation. In a bioengineered design, scaffolds under 3D cultivation conditions induce the differentiation of MSCs and progenitor cells of the periosteum and periodontal ligament.
Техническим результатом данного изобретения является создание способа индукции спонтанной дифференцировки клеток периодонтальной связки и надкостницы в одонтогенном и остеогенном направлениях путем использования децеллюляризированного матрикса зуба и периодонтальной связки человека.The technical result of this invention is the creation of a method for inducing spontaneous differentiation of cells of the periodontal ligament and periosteum in the odontogenic and osteogenic directions by using a decellularized matrix of the tooth and human periodontal ligament.
Ниже приводится обоснование для осуществления настоящего изобретения.Below is the rationale for carrying out the present invention.
Скаффолды произведены и самособраны клетками организма человека с учетом особенностей окружающих тканей без необходимости в дополнении экзогенными компонентами ЕСМ. Скаффолды, полученные таким образом, могут использоваться для тестирования in vitro или для трансплантации субъекту.Scaffolds are produced and self-assembled by human cells taking into account the characteristics of surrounding tissues without the need to supplement with exogenous ECM components. Scaffolds obtained in this manner can be used for in vitro testing or for transplantation into a subject.
Изобретение представляет собой биоинженерную конструкцию, включающую эндогенно продуцированные и децеллюляризированные ЕСМ/скаффолды и полученные от человека без химически неопределенных или отличных от человеческих биологических компонентов клетки, заселяющие эти dECM/скаффолды.The invention is a bioengineered construct comprising endogenously produced and decellularized ECM/scaffolds and human-derived cells without chemically unidentified or non-human biological components populating these dECM/scaffolds.
В предпочтительном способе изобретения биоинженерная конструкция из dECM/скаффолдов зуба и периодонтальной связки и культивированных МСК и прогениторных клеток периодонтальной связки и надкостницы помещается в 3D микроокружение из плотного, прозрачного коллагенсодержащего гидрогеля. Стандартные методы иммуногистохимии показали, что клетки в биоинженерной конструкции положительно окрашивается на остеопонтин (OPn), остеокальцин (OCn), а также DSPP. Наличие указанных компонентов в полностью сформированной культивированной биоинженерной конструкции указывает на то, что конструкция обладает структурными и биохимическими особенностями, приближающимися к таковым особенностям нормальных тканей периодонта. В данном способе биоинженерная конструкция, имеющая маркеры, характерные тканям периодонта человека, заселена культивированными МСК и прогениторными клетками периодонтальной связки и надкостницы в условиях, достаточных для индуцирования одонтогенной и остеогенной дифференцировки.In a preferred method of the invention, a bioengineered construct of dECM/tooth and periodontal ligament scaffolds and cultured MSCs and periodontal ligament and periosteum progenitor cells is placed in a 3D microenvironment of a dense, transparent collagen-containing hydrogel. Standard immunohistochemistry techniques showed that cells in the bioengineered construct stained positively for osteopontin (OPn), osteocalcin (OCn), as well as DSPP. The presence of these components in a fully formed cultured bioengineered structure indicates that the structure has structural and biochemical features approaching those of normal periodontal tissues. In this method, a bioengineered structure having markers characteristic of human periodontal tissues is populated with cultured MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum under conditions sufficient to induce odontogenic and osteogenic differentiation.
Таким образом, способ индукции спонтанной одонтогенной и остеогенной дифференцировки МСК и прогениторных клеток периодонтальной связки и надкостницы существующего изобретения включает: (а) децеллюляризацию тканей, содержащих компоненты матриксов, синтезированные эндогенными клетками зуба и периодонтальной связки; (b) культивирование двух типов клеток (МСК и прогениторных клеток надкостницы и периодонтальной связки); (с) использование гидрогеля для создания 3D микроокружения клеткам стадии (b) для их дифференцировки в нужные типы клеток в биоинженерной конструкции, включающей скаффолды и клетки, в котором стадии (а) и (b) могут осуществляться одновременно или последовательно.Thus, the method of inducing spontaneous odontogenic and osteogenic differentiation of MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum of the existing invention includes: (a) decellularization of tissues containing matrix components synthesized by endogenous cells of the tooth and periodontal ligament; (b) cultivation of two types of cells (MSCs and progenitor cells of the periosteum and periodontal ligament); (c) using the hydrogel to create a 3D microenvironment for the cells of stage (b) for their differentiation into the desired cell types in a bioengineered construct including scaffolds and cells, in which stages (a) and (b) can be carried out simultaneously or sequentially.
Осуществление изобретения проиллюстрировано, но не ограничено, следующими примерами.The implementation of the invention is illustrated, but not limited, by the following examples.
Пример 1. Забор и децеллюляризация тканей зуба человека и периодонтальной связки.Example 1. Harvesting and decellularization of human tooth tissue and periodontal ligament.
Удаление зубов пациентов (1-2 моляры) проводили в плановом порядке по медицинским показаниям. С удаленных зубов пациентов, при соблюдении асептики и антисептики, удаляли периодонтальную связку с окружающей ее тканью, скальпельным лезвием нарезали полоски, толщиной 0.5-0.7 мм. У удаленных зубов пациентов удаляли коронку, оставляя фрагменты зубов без эмали, из которых формировали зубную крошку (2-3 мм) для проведения децеллюляризации. Децеллюляризация ЕСМ по изобретению означает удаление клеток из ЕСМ таким образом, что клетки и остатки клеток удаляются из ЕСМ, с целью получения ЕСМ без клеток, которые его произвели. Другими словами, продуцирующие матрикс клетки, которые производят эндогенные компоненты ЕСМ для формирования биоинженерных конструкций удаляются из ЕСМ. После удаления клеток матрикс, эндогенно продуцированный клетками, остается, но не содержит тех клеток, которые его сформировали. В данном способе изобретения для децеллюляризации ЕСМ используется ряд химических воздействий для удаления клеток, остатков клеток и остаточных клеточных ДНК и РНК. Зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки сначала обрабатываются контактированием с эффективным количеством хелатирующего агента, предпочтительно физиологически щелочного для контролируемо ограниченного набухания клеточного матрикса. Хелатирующие агенты усиливают удаление клеток, клеточного детрита и структур базальной мембраны из матрикса, уменьшая концентрацию двухвалентных катионов. Хелатирующий агент, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и его натриевая соль ЭДТА-Na2 представляют собой предпочтительные хелатирующие агенты и могут быть сделаны более щелочными посредством добавления гидроксида натрия (NaOH). Концентрации ЭДТА или ЭДТА-Na2 предпочтительно находятся в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 150 мМ. Предпочтительная концентрация NaOH находится в диапазоне от 0.001 до 0.10 М, наиболее предпочтительно приблизительно 0.01 М. Конечный рН основного хелатирующего раствора должен быть предпочтительно от приблизительно 11.1 до 11.8. В наиболее предпочтительном варианте зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки контактируют с раствором 100 мМ ЭДТА-Na2/10 мМ NaOH в дистиллированной воде. Зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки контактируют с щелочным хелатирующим агентом путем погружения в него, однако более эффективная обработка получается нежным взбалтыванием крошки/фрагментов ткани и раствора вместе в течение эффективного для обработки времени (в течение суток).Extraction of patients' teeth (1-2 molars) was performed routinely for medical reasons. The periodontal ligament with its surrounding tissue was removed from the patients' extracted teeth, observing asepsis and antisepsis, and strips 0.5-0.7 mm thick were cut with a scalpel blade. The crown of the patients' extracted teeth was removed, leaving tooth fragments without enamel, from which dental chips (2-3 mm) were formed for decellularization. Decellularization of the ECM according to the invention means the removal of cells from the ECM in such a way that cells and cell debris are removed from the ECM, with the aim of obtaining ECM without the cells that produced it. In other words, matrix-producing cells that produce endogenous ECM components to form bioengineered constructs are removed from the ECM. After the cells are removed, the matrix endogenously produced by the cells remains but does not contain the cells that formed it. This method of the invention uses a series of chemicals to decellularize the ECM to remove cells, cell debris, and residual cellular DNA and RNA. Dental chips and periodontal ligament fragments are first treated by contacting an effective amount of a chelating agent, preferably physiologically alkaline, to controlably limit swelling of the cell matrix. Chelating agents enhance the removal of cells, cellular debris, and basement membrane structures from the matrix by reducing the concentration of divalent cations. The chelating agent, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its sodium salt EDTA-Na 2 are the preferred chelating agents and can be made more alkaline by the addition of sodium hydroxide (NaOH). Concentrations of EDTA or EDTA-Na 2 preferably range from about 50 to about 150 mM. The preferred concentration of NaOH is in the range of 0.001 to 0.10 M, most preferably about 0.01 M. The final pH of the base chelating solution should preferably be from about 11.1 to 11.8. In the most preferred embodiment, dental chips and periodontal ligament fragments are contacted with a solution of 100 mM EDTA-Na 2 /10 mM NaOH in distilled water. The dental chips and periodontal ligament fragments are brought into contact with the alkaline chelating agent by immersion, but a more effective treatment is achieved by gently shaking the chips/tissue fragments and the solution together for an effective treatment time (24 hours).
Для дополнительного разрушения мембран и солюбилизации мембранных белков и экстракции ДНК используется 1% водный раствор Triton Х-100 в течение суток. Конечный рН раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, должен быть предпочтительно от приблизительно 7.1 до 8.0.For additional destruction of membranes and solubilization of membrane proteins and DNA extraction, a 1% aqueous solution of Triton X-100 is used for 24 hours. The final pH of the surfactant-containing solution should preferably be from about 7.1 to 8.0.
Кроме того, зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки контактируют с эффективным количеством кислого раствора, предпочтительно содержащего соли для удаления нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК. Соли, которые могут использоваться, являются предпочтительно неорганическими хлористыми солями, такими как хлорид натрия (NaCl) или хлорид магния (MgCl2). Предпочтительно хлориды используются в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, наиболее предпочтительно от 3.75 до приблизительно 4.5 мМ. В способе изобретения использован 4.2 мМ хлорид магния (MgCl2), содержащий раствор ДНКазы (20 μg/ml). Зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки контактируют предпочтительно погружением в кислотный/солевой раствор, при этом эффективная обработка достигается при осторожном взбалтывании зубной крошки и фрагментов периодонтальной связки вместе с раствором в течение времени, эффективного для обработки (2-3 часа).In addition, dental chips and periodontal ligament fragments are contacted with an effective amount of an acidic solution, preferably containing salts to remove nucleic acids such as DNA and RNA. The salts that can be used are preferably inorganic chloride salts such as sodium chloride (NaCl) or magnesium chloride (MgCl 2 ). Preferably, the chlorides are used at a concentration of from about 1 to about 5 mM, most preferably from 3.75 to about 4.5 mM. The method of the invention uses 4.2 mM magnesium chloride (MgCl 2 ) containing a DNase solution (20 μg/ml). The dental chips and periodontal ligament fragments are contacted preferably by immersion in an acid/saline solution, with effective treatment being achieved by gently agitating the dental chips and periodontal ligament fragments along with the solution for a time effective for treatment (2-3 hours).
Кроме того, зубная крошка и фрагменты периодонтальной связки промывают эффективным количеством раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), который предпочтительно буферизован до приблизительно физиологического рН. Буферный раствор соли нейтрализует материал, в то же время уменьшая его набухание. Зубную крошку и фрагменты периодонтальной связки погружают в буферный раствор, при этом эффективная обработка достигается при осторожном взбалтывании зубной крошки и фрагмента периодонтальной связки вместе с раствором в течение времени, эффективного для обработки (в течение 1 часа).In addition, dental chips and periodontal ligament fragments are washed with an effective amount of phosphate-buffered saline (PBS) solution, which is preferably buffered to approximately physiological pH. The salt buffer solution neutralizes the material while reducing its swelling. Dental chips and periodontal ligament fragments are immersed in a buffer solution, and effective treatment is achieved by gently shaking the dental chips and periodontal ligament fragments together with the solution for a time effective for treatment (within 1 hour).
После химической очистки ЕСМ зубной крошки и фрагментов периодонтальной связки ополаскиваются ФСБ, содержащим антибиотики (300 МЕ/мл пенициллина +300 МЕ/мл стрептомицина +75 мкг/мл амфотерицина В) в течение 1 часа и хранятся в свежей порции ФСБ с антибиотиками при -70°С.After chemical cleaning, the ECM of dental chips and periodontal ligament fragments are rinsed with PBS containing antibiotics (300 IU/ml penicillin +300 IU/ml streptomycin +75 μg/ml amphotericin B) for 1 hour and stored in a fresh portion of PBS with antibiotics at -70 °C.
Результат децеллюляризации ЕСМ представляет собой эндогенно продуцированные ЕСМ, продуцированные клетками зуба и периодонтальной связки, которые были децеллюляризированы от клеток, которые его произвели.The result of ECM decellularization is endogenously produced ECM produced by dental and periodontal ligament cells that have been decellularized from the cells that produced it.
Для контроля децеллюляризации образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине, декальцинировали 5%-ной трихлоруксусной кислотой в течение 24 ч, заливали в гистомикс, приготавливали на микротоме серийные срезы и окрашивали их гематоксилин-эозином. Как показал анализ гистологических препаратов с помощью светового микроскопа, полученные скаффолды/dECM зуба состояли из дентина, в котором местами были различимы дентинные канальцы, и покрывающего его снаружи слоя цемента с лакунами на месте удаленных клеток. Скаффолды/dECM периодонтальной связки состояли из волокнистой соединительной ткани. Отсутствие клеток или их остатков в скаффолдах свидетельствовало об эффективности децеллюляризации (фиг. 1).To control decellularization, samples were fixed in 10% neutral formalin, decalcified with 5% trichloroacetic acid for 24 hours, embedded in histomix, serial sections were prepared on a microtome and stained with hematoxylin-eosin. As shown by the analysis of histological preparations using a light microscope, the resulting tooth scaffolds/dECM consisted of dentin, in which dentinal tubules were visible in places, and an external layer of cement covering it with lacunae in place of the removed cells. The periodontal ligament scaffolds/dECM were composed of fibrous connective tissue. The absence of cells or their remains in the scaffolds indicated the effectiveness of decellularization (Fig. 1).
Децеллюляризированные скаффолды могут использоваться в таком виде, но они также могут быть дополнительно модифицированы химической обработкой, физической обработкой, добавлением других веществ, таких как лекарства, факторы роста, культивируемые клетки, других компонентов матрикса естественного, биосинтетического или полимерного происхождения. Использование децеллюляризированных матриксов одобрено FDA для клинического использования (Heath, 2019).Decellularized scaffolds can be used as such, but they can also be further modified by chemical treatment, physical treatment, the addition of other substances such as drugs, growth factors, cultured cells, and other matrix components of natural, biosynthetic or polymeric origin. The use of decellularized scaffolds is approved by the FDA for clinical use (Heath, 2019).
Пример 2. Оценка индукции спонтанной одонтогенной и остеогенной дифференцировки МСК и прогениторных клеток периодонтальной связки и надкостницы.Example 2. Assessment of the induction of spontaneous odontogenic and osteogenic differentiation of MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum.
1. Выделение МСК и прогениторных клеток.1. Isolation of MSCs and progenitor cells.
МСК и прогениторные клетки периодонтальной связки выделяли из периодонтальной связки 1-2 моляров, удаленных в рамках планового ортодонтического лечения с соблюдением стерильных условий. Через 1-2 часа после забора биоптат доставляли в лабораторию в транспортной среде и подвергали ферментной обработке в условиях стерильного бокса. Ткань инкубировали в течение 70 мин при 37°С в растворе, содержащем 2 мг/мл коллагеназы I типа (Gibco, США) и 2 мг/мл диспазы (Gibco). После ферментативной обработки суспензию клеток дважды центрифугировали в течение 10 мин при 600 об/мин в культуральной среде (DMEM, Gibco) и высевали в 6-луночные планшеты для культивирования клеток. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM-GlutaMAX (Gibco) с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки (англ. fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2 мМ незаменимых аминокислот (Gibco). По достижении 90-95% конфлуэнтного монослоя клетки снимали 0.25% раствором трипсина в 1 мМ ЭДТА и пересевали в культуральные пластиковые флаконы объемом 25 см2 (Corning) с плотностью 1x105 кл./мл.MSCs and periodontal ligament progenitor cells were isolated from the periodontal ligament of 1-2 molars removed as part of routine orthodontic treatment under sterile conditions. 1-2 hours after collection, the biopsy specimen was delivered to the laboratory in a transport medium and subjected to enzymatic treatment in a sterile box. The tissue was incubated for 70 min at 37°C in a solution containing 2 mg/ml type I collagenase (Gibco, USA) and 2 mg/ml dispase (Gibco). After enzymatic treatment, the cell suspension was centrifuged twice for 10 min at 600 rpm in culture medium (DMEM, Gibco) and seeded into 6-well cell culture plates. Cells were cultured in DMEM-GlutaMAX growth medium (Gibco) supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin and 2 mM essential amino acids (Gibco). Upon reaching 90-95% of the confluent monolayer, the cells were removed with a 0.25% trypsin solution in 1 mM EDTA and subcultured into 25 cm 2 plastic culture flasks (Corning) with a density of 1x10 5 cells/ml.
МСК и прогениторные клетки надкостницы выделяли из ткани надкостницы альвеолярной кости размером 5x5 мм в рамках планового ортодонтического лечения с соблюдением стерильных условий. Через 1-2 ч после забора биоптат доставляли в лабораторию в транспортной среде и подвергали механической и ферментной обработке в условиях стерильного бокса. После 16-20 ч инкубации в растворе коллагеназы II типа (Sigma, США) измельченный тканевой гомогенат центрифугировали (800 об/мин, в течение 5 мин при t от -18 до -20°С), далее осадок ресуспендировали в ростовой среде DMEM-GlutaMAX (Gibco) с добавлением 10% FBS (Gibco) и антибиотика/антимикотика (Gibco) в стандартной концентрации. Полученную суспензию клеток переносили в культуральные пластиковые флаконы объемом 25 см2 (Corning, США) и культивировали в СО2-инкубаторе при 5% СО2 в течение 10-15 дней до формирования субконфлюэнтного монослоя. Для пассирования использовали смесь растворов 0.25% трипсина и 1 мМ ЭДТА.MSCs and periosteal progenitor cells were isolated from 5x5 mm alveolar bone periosteal tissue as part of routine orthodontic treatment under sterile conditions. 1-2 hours after collection, the biopsy specimen was delivered to the laboratory in a transport medium and subjected to mechanical and enzymatic processing in a sterile box. After 16-20 hours of incubation in a solution of collagenase type II (Sigma, USA), the crushed tissue homogenate was centrifuged (800 rpm, for 5 minutes at t -18 to -20°C), then the sediment was resuspended in growth medium DMEM- GlutaMAX (Gibco) supplemented with 10% FBS (Gibco) and standard concentration of antibiotic/antimycotic (Gibco). The resulting cell suspension was transferred into 25 cm 2 plastic culture flasks (Corning, USA) and cultured in a CO 2 incubator at 5% CO 2 for 10-15 days until a subconfluent monolayer was formed. For passaging, a mixture of solutions of 0.25% trypsin and 1 mM EDTA was used.
2. Оценка клоногенной способности2. Assessment of clonogenic capacity
Для оценки способности стромальных клеток к клональному росту, являющейся одной из основных характеристик МСК, использовали первичные культуры клеток надкостницы, посеянных с плотностью 1х106 кл./мл. Через 11-12 сут после посева флаконы с культурами фиксировали 96%-ным спиртом и окрашивали азур-эозином. К этому сроку в культурах присутствовали дискретные макроскопически различимые колонии различной величины, состоящие из фибробластоподобных клеток (фиг. 2). С помощью бинокулярной лупы подсчитывали колонии, содержащие не менее 50 клеток, и определяли эффективность клонирования как число колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) на 1x106 посаженных клеток. При трех независимых повторах эксперимента эффективность клонирования клеток надкостницы составила 16,77±1,13, 13,11±0,89 и 16,00±1,19 КОЕ-Ф на 1 млн. клеток.To assess the ability of stromal cells for clonal growth, which is one of the main characteristics of MSCs, we used primary cultures of periosteal cells seeded at a density of 1x10 6 cells/ml. 11-12 days after sowing, bottles with cultures were fixed with 96% alcohol and stained with azure-eosin. By this time, discrete macroscopically distinguishable colonies of various sizes, consisting of fibroblast-like cells, were present in the cultures (Fig. 2). Using a binocular loupe, colonies containing at least 50 cells were counted, and cloning efficiency was determined as the number of colony-forming units of fibroblasts (CFU-F) per 1x10 6 planted cells. With three independent repetitions of the experiment, the cloning efficiency of periosteum cells was 16.77±1.13, 13.11±0.89 and 16.00±1.19 CFU-F per 1 million cells.
3. Иммунофенотипическая характеристика клеток3. Immunophenotypic characteristics of cells
Для подтверждения принадлежности выделенных клеток к категории МСК была выполнена иммуногистохимическая характеристика поверхностных маркеров CD73, CD90 и CD 105, рекомендуемых Международным обществом клеточной терапии для идентификации МСК (Dominici et al., 2006).To confirm that the isolated cells belonged to the MSC category, immunohistochemical characterization of the surface markers CD73, CD90 and CD 105, recommended by the International Society of Cell Therapy for the identification of MSCs, was performed (Dominici et al., 2006).
Большинство клеток в культурах клеток надкостницы и периодонтальной связки положительно окрашивались при непрямом иммунофлуоресцентным окрашиванием на CD90, на поверхности большинства из них был также выявлен CD73 и CD 105 с использованием вторых антител, меченных флуорохромом Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 568. Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 или DAPI (фиг. 3).Most cells in the periosteal and periodontal ligament cell cultures stained positively for CD90 by indirect immunofluorescence staining; CD73 and CD 105 were also detected on the surface of most of them using second antibodies labeled with the fluorochrome Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 568. Cell nuclei were stained with Hoechst 33342 or DAPI (Fig. 3).
4. Создание биоинженерных конструкций4. Creation of bioengineered structures
Для создания 3D микроокружения клеткам, помещенным в биоинженерную конструкцию, использовали плотные, прозрачные гидрогели, сформированные из коллагена крысы I типа, выделенного из хвостовых сухожилий крысы (Q C11-ACL, ИМТЕК, Россия) по методике описанной ранее (Vorotelyak et al., 2002). Кратко, стерильный 0.34 М раствор NaOH соединяли с 7.5%-ным раствором бикарбоната натрия (Биолот, Россия) (пробирка 1); 10×концентрат питательной среды 199 (Биолот, Россия) соединяли с 3%-ым раствором L-глутамина (Биолот, Россия) (пробирка 2); FBS соединяли с 1 М HEPES (Биолот, Россия) (пробирка 3). В охлажденный раствор коллагена крысы I типа (плотностью 3-5 мг/мл) (пробирка 4), помещенный на лед во избежание быстрого застывания и предотвращения желатинизации, последовательно вносили содержимое пробирок 1, 2 и 3 и перемешивали. В таблице 1 указаны соотношения компонентов для приготовления 2-х мл коллагенового геля, на одну 35-мм чашку Петри (Greiner Bio-One GmbH, Германия). Затем в пробирку 4 последовательно вносили клетки и dECM и тщательно перемешивали. Далее по 1.5 мл гидрогеля с биоинженерной конструкцией переносили в 12-луночные культуральные планшеты (Corning) и помещали в СО2 инкубатор при 37°С.Через 1 ч гель полностью желатинизировался, на следующий день его заливали культуральной средой для МСК (Gibco) и продолжали культивировать в течение 14 сут в СО2 инкубаторе при 37°С со сменой среды через 2-3 сут.To create a 3D microenvironment for cells placed in a bioengineered structure, dense, transparent hydrogels formed from rat type I collagen isolated from rat tail tendons (Q C11-ACL, IMTEK, Russia) were used according to the method described previously (Vorotelyak et al., 2002 ). Briefly, a sterile 0.34 M NaOH solution was combined with a 7.5% sodium bicarbonate solution (Biolot, Russia) (tube 1); 10×nutrient medium concentrate 199 (Biolot, Russia) was combined with a 3% solution of L-glutamine (Biolot, Russia) (test tube 2); FBS was combined with 1 M HEPES (Biolot, Russia) (tube 3). The contents of test tubes 1, 2 and 3 were sequentially added to a cooled solution of rat type I collagen (density 3-5 mg/ml) (test tube 4), placed on ice to avoid rapid solidification and prevent gelatinization. Table 1 shows the ratios of components for preparing 2 ml of collagen gel per 35 mm Petri dish (Greiner Bio-One GmbH, Germany). Then cells and dECM were sequentially added to tube 4 and mixed thoroughly. Next, 1.5 ml of hydrogel with a bioengineered design was transferred into 12-well culture plates (Corning) and placed in a CO 2 incubator at 37°C. After 1 hour, the gel was completely gelatinized, the next day it was filled with culture medium for MSCs (Gibco) and continued Cultivate for 14 days in a CO 2 incubator at 37°C with a change of medium after 2-3 days.
Исследование проводилось отдельно на dECM зубной крошки и периодонтальной связки и при их совместном использовании. Для заселения скаффолдов клетки снимали с флаконов 0.25% раствором трипсина в 1 мМ ЭДТА (Gibco), полученную суспензию клеток подсчитывали, смешивали в соотношении 1 ч клеток периодонтальной связки и 4 ч клеток надкостницы и концентрировали, центрифугируя 5 мин при 1000 об./мин с последующим ресуспендированием осадка в малом количестве среды. На каждый образец скаффолда помещали по 0.5x106 кл. в 100 мкл среды.The study was conducted on dental chip and periodontal ligament dECM separately and using them together. To populate the scaffolds, cells were removed from the flasks with a 0.25% solution of trypsin in 1 mM EDTA (Gibco), the resulting cell suspension was counted, mixed in a ratio of 1 h of periodontal ligament cells and 4 h of periosteum cells and concentrated by centrifuging for 5 min at 1000 rpm with subsequent resuspension of the sediment in a small amount of medium. 0.5x10 6 cells were placed on each scaffold sample. in 100 µl of medium.
5. Гистологический и иммуногистохимический анализ5. Histological and immunohistochemical analysis
Гистологический анализ показал, что МСК и прогениторные клетки периодонтальной связки и надкостницы активно пролиферируют в коллагеновом гидрогеле и контрактируют его (фиг. 4). МСК и прогениторные клетки способны эффективно заселять поверхности скаффолдов, о чем свидетельствует адгезия клеток и образование ими достаточно плотного слоя на их поверхности (фиг. 5 а).Histological analysis showed that MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum actively proliferate in the collagen hydrogel and contract it (Fig. 4). MSCs and progenitor cells are able to effectively populate the surfaces of scaffolds, as evidenced by the adhesion of cells and the formation of a fairly dense layer on their surface (Fig. 5a).
При этом клетки в коллагеновом гидрогеле при контакте со скаффолдами, демонстрировали интенсивную положительную реакцию на OCn, локализованную преимущественно в связи с клетками, в меньшей степени - в межклеточном веществе (фиг. 5 б) и на OPn (фиг. 5 в). Присутствие этих белков, являющихся специфическими маркерами остеобластов и участвующих в минерализации ЕСМ, свидетельствует о спонтанной реализации остеогенных потенций МСК и прогениторных клеток при 3D культивировании в контакте со скаффолдами. Наряду с этим, часть клеток окрашивалась на DSPP (фиг. 5 г), маркер одонтобластов, что свидетельствует о спонтанной дифференцировки МСК и прогениторных клеток надкостницы и периодонтальной связки в одонтогенном направлении. Хотя считается, что среди всех стволовых клеток зубных тканей одонтогенным потенциалом обладают, в основном, стволовые клетки пульпы зуба (Son et al., 2021), созданное 3D микроокружение индуцирует как остеогенную, так и одонтогенную дифференцировку МСК и прогениторных клеток периодонтальной связки и надкостницы.At the same time, cells in the collagen hydrogel, upon contact with the scaffolds, demonstrated an intense positive reaction to OCn, localized mainly in connection with the cells, to a lesser extent in the intercellular substance (Fig. 5 b) and to OPn (Fig. 5 c). The presence of these proteins, which are specific markers of osteoblasts and are involved in ECM mineralization, indicates the spontaneous realization of the osteogenic potential of MSCs and progenitor cells during 3D cultivation in contact with scaffolds. Along with this, some of the cells were stained for DSPP (Fig. 5 d), a marker of odontoblasts, which indicates spontaneous differentiation of MSCs and progenitor cells of the periosteum and periodontal ligament in the odontogenic direction. Although it is believed that among all stem cells of dental tissues, mainly dental pulp stem cells have odontogenic potential (Son et al., 2021), the created 3D microenvironment induces both osteogenic and odontogenic differentiation of MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum.
Таким образом, результаты гистохимического исследования (реакция на OPn, OCn и DSPP) свидетельствуют, что МСК и прогениторные клетки, культивируемые в коллагеновом гидрогеле, содержащем децеллюляризированные скаффолды зуба и периодонтальной связки в течение 14 дней, способны к спонтанной (без индукторов) дифференцировке в остеогенном и одонтогенном направлениях. Следовательно, биоинженерный комплекс, содержащий децеллюляризированные ткани зуба человека и периодонтальной связки способен модифицировать микроокружение и способствовать спонтанной дифференцировке МСК и прогениторных клеток (экзогенных и эндогенных) в остеогенном и одонтогенном направлениях, что позволяет рассматривать его в виде перспективного материала при лечении пародонтита.Thus, the results of a histochemical study (response to OPn, OCn and DSPP) indicate that MSCs and progenitor cells cultured in a collagen hydrogel containing decellularized tooth and periodontal ligament scaffolds for 14 days are capable of spontaneous (without inducers) differentiation in the osteogenic and odontogenic directions. Consequently, a bioengineering complex containing decellularized tissues of a human tooth and periodontal ligament is capable of modifying the microenvironment and promoting spontaneous differentiation of MSCs and progenitor cells (exogenous and endogenous) in the osteogenic and odontogenic directions, which makes it possible to consider it as a promising material for the treatment of periodontitis.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBIBLIOGRAPHY
Кулаков А.А., Гольдштейн Д.В., Кречина Е.К., Волков А.В., Гаджиев А.К. 2017. Регенерация пульпы зуба с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток пульпы и обогащенной тромбоцитами плазмы. Стоматология. №96, Т. 6. С. 12-16. https://doi.org/10.17116/stomat201796612-16.Kulakov A.A., Goldshtein D.V., Krechina E.K., Volkov A.V., Gadzhiev A.K. 2017. Dental pulp regeneration using autologous pulp mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma. Dentistry. No. 96, T. 6. P. 12-16. https://doi.org/10.17116/stomat201796612-16.
Пат. 2716594 Российская Федерация, МПК А61С 13/00; C12N 1/00 Способ восстановления резорбированной альвеолярной костной ткани биоинженерной конструкцией из децеллюляризированных тканей зуба человека / Иванов А.А., Данилова Т.И., Попова О.П., Латышев А.В.; патентообладатель ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России-№2019120140; Заявлено 27.06.2019; Опубл. 13.03.2020, Бюл. №8 -15 с: 5 ил., 1 табл., 2 пр.Pat. 2716594 Russian Federation, MPK A61S 13/00; C12N 1/00 Method for restoring resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure from decellularized human tooth tissue / Ivanov A.A., Danilova T.I., Popova O.P., Latyshev A.V.; patent holder of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education MGMSU named after. A.I. Evdokimov Ministry of Health of Russia - No. 2019120140; Declared 06/27/2019; Publ. 03/13/2020, Bulletin. No. 8 -15 p.: 5 ill., 1 tab., 2 pr.
Садовой М.А., Ларионов П.М., Самохин А.Г., Рожнова О.М. 2014. Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы. Хирургия позвоночника. №2. С. 79-86. https://doi.Org/10.14531/ss2014.2.79-86.Sadovaya M.A., Larionov P.M., Samokhin A.G., Rozhnova O.M. 2014. Cellular matrices (scaffolds) for bone regeneration: current state of the problem. Spine surgery. No. 2. pp. 79-86. https://doi.Org/10.14531/ss2014.2.79-86.
Agmon G., Christman K.L. 2016. Controlling stem cell behavior with decellularized extracellular matrix scaffolds. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. V. 20. P. 193. 10.1016/j.cossms.2016.02.001.Agmon G., Christman K.L. 2016. Controlling stem cell behavior with decellularized extracellular matrix scaffolds. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. V. 20. P. 193. 10.1016/j.cossms.2016.02.001.
Badylak S.F. 2002. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin. Cell Dev. Biol. V. 13. P. 377. 10.1016/S1084952102000940.Badylak S.F. 2002. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin. Cell Dev. Biol. V. 13. P. 377. 10.1016/S1084952102000940.
Badylak S.F., Freytes D.O., Gilbert T. W. 2009. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. V. 5. P. 1. 10.1016/j.actbio.2008.09.013.Badylak S.F., Freytes D.O., Gilbert T.W. 2009. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. V. 5. P. 1. 10.1016/j.actbio.2008.09.013.
Bu X., Yan Y., Zhang Z., Gu X., Wang M., Gong A., Sun X., Сиг Y., Zeng Y. 2010. Properties of extracellular matrix-like scaffolds for the growth and differentiation of endothelial progenitor cells. J. Surg. Res. V. 164. P. 50. 10.1016/j jss.2009.03.018.Bu X., Yan Y., Zhang Z., Gu X., Wang M., Gong A., Sun X., Xig Y., Zeng Y. 2010. Properties of extracellular matrix-like scaffolds for the growth and differentiation of endothelial progenitor cells. J. Surg. Res. V. 164. P. 50. 10.1016/j jss.2009.03.018.
Chen F.M., Zhang J., Zhang M., An Y., Chen F., Wu Z.F. 2010a. A review on endogenous regenerative technology in periodontal regenerative medicine. Biomaterials. V. 31. P. 7892. 10.1016/j.biomaterials.2010.07.019.Chen F.M., Zhang J., Zhang M., An Y., Chen F., Wu Z.F. 2010a. A review on endogenous regenerative technology in periodontal regenerative medicine. Biomaterials. V. 31. P. 7892. 10.1016/j.biomaterials.2010.07.019.
Chen F.M., Zhang M., Wu Z.F. 2010b. Toward delivery of multiple growth factors in tissue engineering. Biomaterials. V. 31. P. 6279. 10.1016/j.biomaterials.2010.04.053.Chen F.M., Zhang M., Wu Z.F. 2010b. Toward delivery of multiple growth factors in tissue engineering. Biomaterials. V. 31. P. 6279. 10.1016/j.biomaterials.2010.04.053.
Galler K.M., D'Souza R.N., Federlin M., Cavender A.C., Hartgerink J.D., Hecker S., Schmalz G. 2011. Dentin conditioning codetermines cell fate in regenerative endodontics. J. Endod. V. 37. P. 1536. 10.1016/j.joen.2011.08.027.Galler K.M., D'Souza R.N., Federlin M., Cavender A.C., Hartgerink J.D., Hecker S., Schmalz G. 2011. Dentin conditioning codetermines cell fate in regenerative endodontics. J. Endod. V. 37. P. 1536. 10.1016/j.joen.2011.08.027.
Gilpin A., Yang Y. 2017. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Res. Int. V. 2017. P. 1. 10.1155/2017/9831534.Gilpin A., Yang Y. 2017. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Res. Int. V. 2017. P. 1. 10.1155/2017/9831534.
Han J., Menicanin D., Gronthos S., Bartold P. 2014. Stem cells, tissue engineering and periodontal regeneration. Aust. Dent. J. V. 59. P. 117. 10.1111/adj.12100.Han J., Menicanin D., Gronthos S., Bartold P. 2014. Stem cells, tissue engineering and periodontal regeneration. Aust. Dent. J. V. 59. P. 117. 10.1111/adj.12100.
Heath D.E. 2019. A Review of Decellularized Extracellular Matrix Biomaterials for Regenerative Engineering Applications. Regen. Eng. Transl. Med. V. 5. P. 155. 10.1007/s40883-018-0080-0.Heath D.E. 2019. A Review of Decellularized Extracellular Matrix Biomaterials for Regenerative Engineering Applications. Regen. Eng. Transl. Med. V. 5. P. 155. 10.1007/s40883-018-0080-0.
Ho-Shui-Ling A., Bolander J., Rustom L.E., Johnson A.W., Luyten F.P., Picart C. 2018. Bone regeneration strategies: Engineered scaffolds, bioactive molecules and stem cells current stage and future perspectives. Biomaterials. V. 180. P. 143. 10.1016/j.biomaterials.2018.07.017.Ho-Shui-Ling A., Bolander J., Rustom L.E., Johnson A.W., Luyten F.P., Picart C. 2018. Bone regeneration strategies: Engineered scaffolds, bioactive molecules and stem cells current stage and future perspectives. Biomaterials. V. 180. P. 143. 10.1016/j.biomaterials.2018.07.017.
Hu L., Gao Z, Xu J., Zhu Z., Fan Z., Zhang C., Wang J., Wang S. 2017. Decellularized swine dental pulp as a bioscaffold for pulp regeneration. Biomed Res. Int. V. 2017. P. 1. 10.1155/2017/9342714.Hu L., Gao Z., Xu J., Zhu Z., Fan Z., Zhang C., Wang J., Wang S. 2017. Decellularized swine dental pulp as a bioscaffold for pulp regeneration. Biomed Res. Int. V. 2017. P. 1. 10.1155/2017/9342714.
Hughes F.J., Ghuman M., Talal A. 2010. Periodontal regeneration: A challenge for the tissue engineer? Proc. Inst. Mech. Eng. Part H J. Eng. Med. V. 224. P. 1345. 10.1243/09544119JEIM820.Hughes F.J., Ghuman M., Talal A. 2010. Periodontal regeneration: A challenge for the tissue engineer? Proc. Inst. Mech. Eng. Part H J. Eng. Med. V. 224. P. 1345. 10.1243/09544119JEIM820.
Ivanov A.A., Latyshev A.V., Butorina N.N., Domoratskaya E.I., Danilova T.I., Popova O.P. 2020. Osteogenic Potential of Decellularized Tooth Matrix. Bull. Exp.Biol. Med. V. 169. P. 512. 10.1007/s 10517-020-04920-8.Ivanov A.A., Latyshev A.V., Butorina N.N., Domoratskaya E.I., Danilova T.I., Popova O.P. 2020. Osteogenic Potential of Decellularized Tooth Matrix. Bull. Exp Biol. Med. V. 169. P. 512. 10.1007/s 10517-020-04920-8.
Liu J., Yu F., Sun Y., Jiang В., Zhang W., Yang J., Xu G.-T., Liang A., Liu S. 2015. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. V. 33. P. 627. 10.1002/stem.l909.Liu J., Yu F., Sun Y., Jiang W., Zhang W., Yang J., Xu G.-T., Liang A., Liu S. 2015. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. V. 33. P. 627. 10.1002/stem.l909.
Mansour A., Mezour M.A., Badran Z., Tamimi F. 2017. Extracellular matrices for bone regeneration: A literature review. Tissue Eng. - Part A. V. 23. P. 1436. 10.1089/ten.tea.2017.0026.Mansour A., Mezour M.A., Badran Z., Tamimi F. 2017. Extracellular matrices for bone regeneration: A literature review. Tissue Eng. - Part A. V. 23. P. 1436. 10.1089/ten.tea.2017.0026.
Nishimura M., Takase K., Suehiro F., Murata H. 2012. Candidates cell sources to regenerate alveolar bone from oral tissue. Int. J. Dent. V. 2012. P. 1. 10.1155/2012/857192.Nishimura M., Takase K., Suehiro F., Murata H. 2012. Candidates cell sources to regenerate alveolar bone from oral tissue. Int. J.Dent. V. 2012. P. 1. 10.1155/2012/857192.
Papadimitropoulos A., Scotti C., Bourgine P., Scherberich A., Martin I. 2015. Engineered Decellularized Matrices to Instruct Bone Regeneration Processes. Bone. V. 70. P. 66. 10.1016/j.bone.2014.09.007.Papadimitropoulos A., Scotti C., Bourgine P., Scherberich A., Martin I. 2015. Engineered Decellularized Matrices to Instruct Bone Regeneration Processes. Bone. V. 70. P. 66. 10.1016/j.bone.2014.09.007.
Parmaksiz M., Dogan A., Odabas S., Elgin A.E., Elgin Y.M. 2016. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomed. Mater. V. 11.. 10.1088/1748-6041/11/2/022003.Parmaksiz M., Dogan A., Odabas S., Elgin A.E., Elgin Y.M. 2016. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomed. Mater. V. 11.. 10.1088/1748-6041/11/2/022003.
Porzionato A., Stocco E., Barbon S., Grandi F., Macchi V., De Caro R. 2018. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int. J. Mol. Sci. V. 19.. 10.3390/ijmsl9124117.Porzionato A., Stocco E., Barbon S., Grandi F., Macchi V., De Caro R. 2018. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int. J. Mol. Sci. V. 19.. 10.3390/ijmsl9124117.
Son Y.-B., Rang Y.-K., Lee H.-J., JangS.-J., Bharti D., Lee S.-L., Jeon B.-G., ParkB.-W., Rho G.-J. 2021. Evaluation of odonto/osteogenic differentiation potential from different regions derived dental tissue stem cells and effect of 17p-estradiol on efficiency. BMC Oral Health. V. 21. P. 15. 10.1186/sl2903-020-01366-2.Son Y.-B., Rang Y.-K., Lee H.-J., Jang S.-J., Bharti D., Lee S.-L., Jeon B.-G., Park B.-W. , Rho G.-J. 2021. Evaluation of odonto/osteogenic differentiation potential from different regions derived dental tissue stem cells and effect of 17p-estradiol on efficiency. BMC Oral Health. V. 21. P. 15. 10.1186/sl2903-020-01366-2.
Song J.S., Takimoto K., Jeon M., Vadakekalam J., Ruparel N.B., Diogenes A. 2017. Decellularized human dental pulp as a scaffold for regenerative endodontics. J. Dent. Res. V. 96. P. 640. 10.1177/0022034517693606.Song J.S., Takimoto K., Jeon M., Vadakekalam J., Ruparel N.B., Diogenes A. 2017. Decellularized human dental pulp as a scaffold for regenerative endodontics. J.Dent. Res. V. 96. P. 640. 10.1177/0022034517693606.
Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Longer R., Shastri V.P. 2005. In vivo engineering of organs: The bone bioreactor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. V. 102. P. 11450. 10.1073/pnas.0504705102.Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Longer R., Shastri V.P. 2005. In vivo engineering of organs: The bone bioreactor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.V. 102. P. 11450. 10.1073/pnas.0504705102.
Vasita R., Katti D.S. 2006. Growth factor-delivery systems for tissue engineering: A materials perspective. Expert Rev. Med. Devices. V. 3. P. 29. 10.1586/17434440.3.1.29.Vasita R., Katti D.S. 2006. Growth factor-delivery systems for tissue engineering: A materials perspective. Expert Rev. Med. Devices. V. 3. P. 29. 10.1586/17434440.3.1.29.
Vorotelyak E.A., Shikhverdieva A.S., Vasiliev A. V., Terskikh V. V. 2002. Simulation of migration of human epidermal keratinocytes over three-dimensional collagen gel. Biol. Bull. Russ. Acad. Sci. V. 29. P. 24. 10.1023/A:1013233617151.Vorotelyak E.A., Shikhverdieva A.S., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. 2002. Simulation of migration of human epidermal keratinocytes over three-dimensional collagen gel. Biol. Bull. Russ. Acad. Sci. V. 29. P. 24. 10.1023/A:1013233617151.
Wang X., Wang G., Zingales S., Zhao B. 2018. Biomaterials enabled cell-free strategies for endogenous bone regeneration. Tissue Eng. - Part В Rev. V. 24. P. 463. 10.1089/ten.teb.2018.0012.Wang X., Wang G., Zingales S., Zhao B. 2018. Biomaterials enabled cell-free strategies for endogenous bone regeneration. Tissue Eng. - Part B Rev. V. 24. P. 463. 10.1089/ten.teb.2018.0012.
Wu R.X., Xu X.Y, Wang J., He X.T., Sun H.H., Chen F.M. 2018. Biomaterials for Endogenous Regenerative Medicine: Coaxing Stem Cell Homing and Beyond. Appl. Mater. Today. V. 11. P. 144. 10.1016/j.apmt.2018.02.004.Wu R.X., Xu X.Y., Wang J., He X.T., Sun H.H., Chen F.M. 2018. Biomaterials for Endogenous Regenerative Medicine: Coaxing Stem Cell Homing and Beyond. Appl. Mater. Today. V. 11. P. 144. 10.1016/j.apmt.2018.02.004.
Xu X.Y, Li X., Wang J., He X.T., Sun H.H, Chen F.M. 2019. Concise Review: Periodontal Tissue Regeneration Using Stem Cells: Strategies and Translational Considerations. Stem Cells Transl. Med. V. 8. P. 392. 10.1002/sctm.l8-0181.Xu X.Y., Li X., Wang J., He X.T., Sun H.H., Chen F.M. 2019. Concise Review: Periodontal Tissue Regeneration Using Stem Cells: Strategies and Translational Considerations. Stem Cells Transl. Med. V. 8. P. 392. 10.1002/sctm.l8-0181.
Yamada S., Shanbhag S., Mustafa K. 2022. Scaffolds in periodontal regenerative treatment. Dent. Clin.North Am. V. 66. P. 111. 10.1016/j.cden.2021.06.004.Yamada S., Shanbhag S., Mustafa K. 2022. Scaffolds in periodontal regenerative treatment. Dent. Clin.North Am. V. 66. P. 111. 10.1016/j.cden.2021.06.004.
Yao Q., Zheng Y. W., Lan Q.H, Kou L., Xu H.L., Zhao Y.Z. 2019. Recent Development and Biomedical Applications of Decellularized Extracellular Matrix Biomaterials. Mater. Sci. Eng. С.V. 104. P. 109942. 10.1016/j.msec.2019.109942.Yao Q., Zheng Y. W., Lan Q. H., Kou L., Xu H. L., Zhao Y. Z. 2019. Recent Development and Biomedical Applications of Decellularized Extracellular Matrix Biomaterials. Mater. Sci. Eng. S.V. 104. P. 109942. 10.1016/j.msec.2019.109942.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1. Контроль эффективности децеллюляризации периодонтальной связки (а) и тканей зуба (б). Окраска ядерным красителем DAPI.Fig. 1. Monitoring the effectiveness of decellularization of the periodontal ligament (a) and dental tissues (b). Staining with nuclear dye DAPI.
Фиг. 2. Колонии стромальных клеток в первичной культуре надкостницы на 11 сут культивирования, а - общий вид культуры, 6 - фрагмент колонии, масштабное увеличение х100. Окрашивание азур-эозином.Fig. Fig. 2. Colonies of stromal cells in the primary culture of the periosteum on the 11th day of cultivation, a - general view of the culture, 6 - fragment of the colony, scale magnification x100. Azur-eosin staining.
Фиг. 3. Поверхностные антигены CD90 (а, б) и CD73 (в, г) в культуре клеток надкостницы 3-го пассажа. Непрямое иммунофлуоресцентное мечение с применением флуорохромов Alexa 568 (а, б) и Alexa 488 (в, г), а'', б'', в'', г'' - совмещение изображений результата иммуномечения и ядер клеток, окрашенных DAPI (а', б', в', г').Fig. 3. Surface antigens CD90 (a, b) and CD73 (c, d) in the culture of periosteal cells of the 3rd passage. Indirect immunofluorescent labeling using fluorochromes Alexa 568 (a, b) and Alexa 488 (c, d), a'', b'', c'', d'' - combination of images of the result of immunolabeling and cell nuclei stained with DAPI (a ', b', c', d').
Фиг. 4. Контракция коллагенового гидрогеля МСК и прогениторными клетками периодонтальной связки и надкостницы на 3 сут культивирования (а, в) и 10 сут культивирования (б), фазовый контраст (в, г), масштабное увеличение х40 (в), х100 (г) на 3 сут культивирования.Fig. Fig. 4. Contraction of collagen hydrogel by MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum on the 3rd day of cultivation (a, c) and 10 days of cultivation (b), phase contrast (c, d), scale magnification x40 (c), x100 (d) on 3 days of cultivation.
Фиг. 5. Гистологический и иммуногистохимический анализ МСК и прогениторных клеток периодонтальной связки и надкостницы в коллагеновом гидрогеле. МСК и прогениторные клетки периодонтальной связки и надкостницы на поверхности скаффолдов (а). Окрашивание гематоксилин-эозином, масштабное увеличение х200; Иммунопероксидазная реакция на остеокальцин (б), остеопонтин (в) и сиалофосфопротеин десмина (г), масштабное увеличение х200.Fig. 5. Histological and immunohistochemical analysis of MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum in collagen hydrogel. MSCs and progenitor cells of the periodontal ligament and periosteum on the surface of the scaffolds (a). Hematoxylin-eosin staining, magnification x200; Immunoperoxidase reaction to osteocalcin (b), osteopontin (c) and desmin sialophosphoprotein (d), magnification x200.
Claims (15)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813729C1 true RU2813729C1 (en) | 2024-02-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110616190A (en) * | 2019-02-19 | 2019-12-27 | 中国人民解放军第四军医大学 | Method for regulating and controlling osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells based on extracellular matrix |
| RU2716594C1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-03-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) | Method for recovering resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure of decellularized human dental tissues |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110616190A (en) * | 2019-02-19 | 2019-12-27 | 中国人民解放军第四军医大学 | Method for regulating and controlling osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells based on extracellular matrix |
| RU2716594C1 (en) * | 2019-06-27 | 2020-03-13 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) | Method for recovering resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure of decellularized human dental tissues |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TRIVEDI S. et al., Hydroxyapatite-collagen augments osteogenic differentiation of dental pulp stem cells, Odontology, 2020, vol. 108, N. 2, pp. 251-259. * |
| КУЛАКОВ А.А. и др. Регенерация пульпы зуба с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток пульпы и обогащенной тромбоцитами плазмы, СТОМАТОЛОГИЯ, 2017, 96(6), с.12-16. САДОВОЙ М.А. и др. Клеточные матрицы (скаффолды) для целей регенерации кости: современное состояние проблемы, ХИРУРГИЯ ПОЗВОНОЧНИКА, 2/2014, с. 79-86. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Panduwawala et al. | In vivo periodontal tissue regeneration by periodontal ligament stem cells and endothelial cells in three‐dimensional cell sheet constructs | |
| Zhang et al. | Composite cell sheet for periodontal regeneration: crosstalk between different types of MSCs in cell sheet facilitates complex periodontal-like tissue regeneration | |
| Wei et al. | Functional tooth restoration by allogeneic mesenchymal stem cell-based bio-root regeneration in swine | |
| Sordi et al. | Three-dimensional bioactive hydrogel-based scaffolds for bone regeneration in implant dentistry | |
| US20180325958A1 (en) | Osteogenic graft forming unit | |
| Zhou et al. | Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model | |
| Li et al. | Coculture of peripheral blood CD34+ cell and mesenchymal stem cell sheets increase the formation of bone in calvarial critical-size defects in rabbits | |
| Fu et al. | Laminin-modified dental pulp extracellular matrix for dental pulp regeneration | |
| Yang et al. | Tooth Germ‐Like Construct Transplantation for Whole‐Tooth Regeneration: An In Vivo Study in the Miniature Pig | |
| JP2009509512A (en) | Methods for differentiating stem cells and their use in the treatment of dental pathologies | |
| Almela et al. | Characterization of multilayered tissue-engineered human alveolar bone and gingival mucosa | |
| Iacobazzi et al. | Thymus-derived mesenchymal stem cells for tissue engineering clinical-grade cardiovascular grafts | |
| Choi et al. | Prochondrogenic effect of decellularized extracellular matrix secreted from human induced pluripotent stem cell-derived chondrocytes | |
| Zhu et al. | Insights into the use of genetically modified decellularized biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine | |
| RU2813729C1 (en) | Method of inducing spontaneous differentiation of cells of periodontal ligament and periosteum in odontogenic and osteogenic directions by using a decellularized matrix of tooth and human periodontal ligament | |
| Kukreja et al. | Regeneration of periodontal ligament fibers around mini dental implants and their attachment to the bone in an animal model: A radiographic and histological study | |
| RU2716594C1 (en) | Method for recovering resorbed alveolar bone tissue with a bioengineered structure of decellularized human dental tissues | |
| Feng et al. | Periodontal ligament‐like tissue regeneration with drilled porous decalcified dentin matrix sheet composite | |
| Wu et al. | Genipin-crosslinked, immunogen-reduced decellularized porcine liver scaffold for bioengineered hepatic tissue | |
| JP7321152B2 (en) | Elastin reduction to allow recellularization of cartilage grafts | |
| CN114870088B (en) | Preparation method and application of Wnt signal activated bone cell acellular matrix and bone repair stent lined by Wnt signal activated bone cell acellular matrix | |
| US20180200302A1 (en) | Bone marrow stromal cell derived extracellular matrix protein extract and uses thereof | |
| CN104306958A (en) | Application of insulin-like growth factor binding protein 5 in promotion of periodontal tissue regeneration | |
| Guo et al. | Human periodontal ligament cells reaction on a novel hydroxyapatite–collagen scaffold | |
| Remya et al. | Bone marrow derived cell-seeded extracellular matrix: A novel biomaterial in the field of wound management. |