[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2800991C2 - Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта - Google Patents

Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта Download PDF

Info

Publication number
RU2800991C2
RU2800991C2 RU2022101391A RU2022101391A RU2800991C2 RU 2800991 C2 RU2800991 C2 RU 2800991C2 RU 2022101391 A RU2022101391 A RU 2022101391A RU 2022101391 A RU2022101391 A RU 2022101391A RU 2800991 C2 RU2800991 C2 RU 2800991C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
cartilage
subject
perichondrium
spheroids
Prior art date
Application number
RU2022101391A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2800991C9 (ru
RU2022101391A (ru
Inventor
Алексей Вячеславович Ковалев
Original Assignee
Алексей Вячеславович Ковалев
Filing date
Publication date
Application filed by Алексей Вячеславович Ковалев filed Critical Алексей Вячеславович Ковалев
Publication of RU2022101391A publication Critical patent/RU2022101391A/ru
Publication of RU2800991C2 publication Critical patent/RU2800991C2/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2800991C9 publication Critical patent/RU2800991C9/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к области регенеративной медицины и раскрывает способ получения трансплантата в виде клеточных сфероидов для восстановления хряща субъекта, который включает в себя выделение клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток собственного костного мозга субъекта, раздельное культивирование выделенных клеток в 2D-системах на дне культуральных флаконов, перенесение клеток в пластиковые микропланшеты из расчета 8000 клеток на 1 лунку, причем клетки двух клеточных культур смешиваются в соотношении клеток 1:1, и их последующее 3D-культивирование в лунках с образованием клеточных сфероидов. Изобретение позволяет получать трансплантат с выраженным регенерационным потенциалом, эффектом стимуляции регенерации окружающего хряща и антимикробной активностью, для эффективного восстановления хряща, в частности суставного хряща, возможно использование полученных сфероидов для биопечати. 6 з.п. ф-лы, 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, трансплантологии, регенеративной медицине, травматологии и ортопедии, пластической хирургии и стоматологии.
Уровень техники
Гиалиновая хрящевая ткань - это наиболее распространенный вид хрящевых скелетных тканей в организме человека, которая образует скелет у плода (образует временный эмбриональный скелет, который постепенно заменяется костью), дыхательные пути и т.д., в постнатальном периоде развития человека гиалиновая хрящевая ткань представлена в реберных хрящах, хрящах носа, гортани (частично), трахеи и крупных бронхов, покрывает все суставные поверхности костей, хрящевые пластинки роста в трубчатых костях. Способность к репаративной регенерации гиалинового хряща связана с наличием надхрящницы, в тех органах, где она покрывает хрящ. Надхрящница представляет собой плотную богатую сосудами соединительнотканную оболочку, присутствует на растущей кости (на этапе энхондрального остеогенеза при внутриутробном развитии), реберного хряща, хрящей гортани и дыхательных путей и т.д. Надхрящница является источником камбиальных клеток, служит для роста и регенерации хрящевой ткани. Полноценная регенерация гиалинового хряща после травматических повреждений возможна, в случаях повреждений хрящей, покрытых надхрящницей и при обязательном сохранении последней после разрушения хряща. Прехондробласты надхрящницы активируются при повреждениях, делятся и дифференцируются в хондробласты, которые способны вырабатывать тканеспецифическое межклеточное вещество хряща, заполняя хрящевым регенератом свободное пространство посттравматического дефекта. Однако, тканеспецифическая регенерация хряща под надхрящницей не всегда возможна из-за опережающего развития другого регенерата из окружающей молодой волокнистой соединительной ткани, которая быстрее замещает пространство дефекта хряща, со временем превращаясь из рыхлой волокнистой соединительной ткани в атипичный регенерат - соединительнотканный рубец. Условием органотипичной регенерации хряща под надхрящницей является сохранение ее целостности, эта соединительнотканная пластинка должна быть сомкнута, а все ее повреждения ушиты. Этот атипичный регенерат имеет иные прочностные характеристики, слабо связан с волоконным остовом интактного окружающего хряща, часто повреждается и нарушает функции хрящевой ткани суставов.
Суставной хрящ лишен надхрящницы. Поэтому по-прежнему преобладает точка зрения, что организм взрослого человека не способен производить новую гиалиновую хрящевую ткань после травматических дефектов или при остеоартрите на суставных поверхностях костей, в том числе после повреждений хрящевой ткани отдельно или вместе с формирующих суставную поверхность костной тканью. Суставной хрящ имеет сниженный регенеративный потенциал в постнатальном периоде развития, так как в этой ткани не много скелетных стволовых клеток, которые можно было бы активировать, они не могут эффективно противодействовать кумулятивным повреждениям, таким как повышенные нагрузки на суставы, а также травмам, которые приводят к разрушению хряща и развитию остеоартрита. В суставном хряще обнаружены различные клетки, претендующие на роль стволовых клеток/ клеток-предшественников хрящевого происхождения (cartilage-derived stem/progenitor cells (CSPCs), articular cartilage-derived progenitor cells (ACPCs) находящиеся в зрелом хряще, а также прогениторные клетки в бороздке Ранвье хряща и других внутрисуставных тканях, которые потенциально способны участвовать в регенерации хряща. Взрослый суставной хрящ имеет ограниченную способность к восстановлению, хондроциты связаны лакунами и не могут мигрировать в поврежденные участки, деление клеток внутри хряща происходит очень медленно, дефекты хряща часто прогрессируют до остеоартрита.
Потенциал для восстановления гиалинового хряща ограничен отсутствием сосудов и нервов в хряще, невозможностью поступления клеток-эффекторов воспаления и клеток-предшественников с током крови, а также относительно небольшим количеством и низкими митогенными характеристиками хондроцитов, расположенных в плотном внеклеточном матриксе. Хрящевых клеток в суставном хряще не более 5%. Остальное пространство занимает внеклеточный матрикс, богатый коллагеном и протеогликанами.
Исторически регенеративная способность суставного хряща и в целом гиалиновых хрящей после окончания внутриутробного периода развития подвергалась сомнению, в том числе, из-за медленной скорости обновления хрящевого матрикса, особенно волоконного остова - коллагена хрящей. Период полураспада белков матрикса суставного хряща (коллагенов), очень велик (более 20 лет), что свидетельствует о низкой интенсивности обновления хрящевого матрикса. Однако, установлено, что физиологическая регенерация хряща у людей продолжается после наступления половой зрелости и прекращения роста на протяжении всей жизни человека. В разных частях тела физиологическая регенерация хрящей идет с разной скоростью. Например, в голеностопном суставе эта ткань обновлялась намного быстрее, чем в коленном, а в тазобедренном суставе более медленно (Ming-Feng Hsueh, Patrik Onnerfjord, Michael P. Bolognesi, Mark E. Easley, Virginia B. Kraus. Analysis of "old" proteins unmasks dynamic gradient of cartilage turnover in human limbs. Science Advances, 2019; 5 (10): eaax3203 DOI: 10.1126/sciadv.aax3203).
Регенеративная способность неповрежденного суставного хряща у человека была продемонстрирована клиническими исследованиями, при дистракции сустава у взрослых пациентов наблюдающими очевидное увеличение ширины суставной щели и толщины хряща на рентгенограммах (Interna F., Van Roermund P. M., Marijnissen А. С.A., Cotofana S., Eckstein F., Castelein R. M., Bijlsma J. W. J., Mastbergen S. C, Lafeber F. P. J. G., Tissue structure modification in knee osteoarthritis by use of joint distraction: An open 1-year pilot study. Ann. Rheum. Dis. 70, 1441-1446 (2011)).
С 1994 года в клинической практике применяются двухэтапные процедуры, известные как имплантация аутологичных хондроцитов (autologous chondrocytes transplantation), которые, как было показано в различных рандомизированных исследованиях, обеспечивают стойкое клиническое улучшение у пациентов с дефектами суставного хряща. Известны три поколения этой методики. В третьем поколении хондроциты культивировали в 3D условиях без использования каких-либо каркасных материалов (3D-ACI, three-dimensional autologous chondrocyte implantation), предлагая полную аутологичность трехмерной (3D) трансплантации, которая сама по себе может быть осуществлена более щадящим способом - артроскопически. Для этого клетки культивировали в высокой плотности, где хондроциты образуют так называемые сфероиды - клеточные агломераты округлой формы (хондросферы), которые состоят только из собственных хондроцитов пациента и образуемой ими внеклеточной матрицы, которая синтезируется самими хондроцитами в 3D культуре, является важной и неотъемлемой частью хондросфер.
Недостатками всех этих поколений технологии имплантации аутологичных хондроцитов является необходимость проведения двух последовательных операций на суставе. Первая операция связана с забором кусочков здоровой части хряща с не нагружаемой поверхности для выделения клеток и наращивания их количества в лабораторных условиях для последующей аутологичной трансплантации. Известно, что стойкое повреждение структурной организации суставного хряща (дефект на месте забора не восстанавливается спонтанно) приводит к изменению распределения сил и потере механической прочности, подобный забор может иметь определенные отрицательные последствия. Вторая операция включает трансплантацию клеточного материала для замещения дефектов хряща. Пациент обречен на два послеоперационных периода, требуются вспомогательные устройства для передвижений, длительная реабилитация. Используются собственные хондроциты хряща, пролиферативный потенциал которых ограничен и эти клетки частично теряют свою тканеспецифичность при культивировании. Известно, что экспансия (размножение) хондроцитов ограничена после удвоения популяции в культуре, так как эти клетки имеют тенденцию приобретать фибробластоподобный вид и терять свой хрящевой фенотип, прежде чем стать стареющими.
Разрабатываются новые варианты этой техники, совсем недавно предложен вариант с использованием биопсии хряща носа, чтобы обойти необходимость предварительного забора аутологичного хряща в коленном суставе. К недостаткам технологии относят строгие правила государственной регистрации, дополнительная травма носа, небольшое количество биоптата для экспансии, что требует большего количества митозов, высокие затраты и сложная логистика, связанные с расширением ex vivo для последующей имплантации человеку, которые ограничивают широкую доступность и этого вида аутологичной клеточной имплантации (хондроцитов).
Известна группа изобретений (патент RU 2731314 «Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей») позволяющая получать аутологичный трансплантат в виде клеточных сфероидов из надхрящницы ребра субъекта, обладающих выраженным регенерационным потенциалом, для восстановления суставного хряща. Способ включает в себя выделение клеток из надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, культивирование выделенных клеток, перенесение клеток в агарозные планшеты из расчета 20000 клеток на 1 лунку агарозного планшета и их последующее культивирование с образованием клеточных сфероидов. Способ позволяет исключить дополнительную травматизацию сустава, забрать достаточное количество клеточного материала для экспансии и не связан с травмой хрящей носа. Камбиальные клетки надхрящницы имеют некоторые сходные со стволовыми клетками свойства, такие как клональная экспансия, экстенсивная пролиферация и потенциал дифференцировки в хондрогенный и адипогенные клоны.
Предпринимались многочисленные попытки использовать мезенхимальных стромальных клеток для восстановления суставного хряща, проводились клинические исследования. Несмотря на способность генерировать хрящевую ткань, МСК имеют тенденцию к дифференцировке в гипертрофические хондроциты и инициировать последующую нежелательную эндохондральную оссификацию. Эффективных и признанных врачебным сообществом медицинских регенеративных технологий заместительного восстановления хряща этими клетками не существует.
Согласно современным представлениям культивированные МСК после аутологичной трансплантации не функционируют в организме как предшественники тканей ни в нормальном стационарном состоянии, ни в условиях болезни или травмы; они не являются стволовыми клетками. Согласно концепции медицинских сигнальных клеток (Medicinal Signaling Cells), после трансплантации (In vivo) МСК являются источниками трофических факторов, которые они секретируют, модулирующих иммунную систему и индуцирующих собственные стволовые клетки, тканеспецифические клетки-предшественники (ответственные за регенерацию поврежденной ткани) для восстановления поврежденных тканей, продолжительность жизни трансплантированных клеток даже при аутологичной трансплантации составляет несколько суток (Caplan AI. Mesenchymal Stem Cells: Time to Change the Name! Stem Cells Transl Med. 2017 Jun;6(6):1445-1451. doi: 10.1002/sctm.17-0051. Epub 2017 Apr 28. PMID: 28452204; PMCID: PMC5689741).
Установлено, что МСК обладают хондро-индуктивными эффектами в сочетании с пересадкой аутологичных хондронов для лечения очаговых дефектов хряща (de Windt TS, Vonk LA, Slaper-Cortenbach ICM, Nizak R, van Rijen МНР, Saris DBF. Allogeneic MSCs and Recycled Autologous Chondrons Mixed in a One-Stage Cartilage Cell Transplantion: A First-in-Man Trial in 35 Patients. Stem Cells. 2017 Aug;35(8):1984-1993. doi: 10.1002/stem.2657. Epub 2017 Jun 23. PMID: 28600828). В этом известном способе операцию выполняли через миниартротомию коленного сустава. Дефекты хряща зачищали, удаляя кальцифицированный слой хряща и создавая ровные края интактного окружающего суставного хряща. Операционная рана временно закрывалась стерильной повязкой. Полученная очищенная хрящевая ткань была переработана с использованием протокола быстрого ферментативного выделения для получения 100 000-400 000 хондронов (хондроцитов с их перицеллюлярным матриксом) в лабораторных условиях для последующей ретрансплантации. Аллогенные МСК были выделены из костного мозга двух здоровых доноров (возраст 2 и 5 лет) и размножены в адгезивной культуре. До момента применения эти клетки находились в криоконсервированном состоянии. После оттаивания МСК промывали раствором 0,9% хлорида натрия с 10% сывороточного альбумина человека с концентрацией оставшегося после криоконсервации МСК диметилсульфоксида <0,001% в конечном продукте. Перед применением аутологичные хондроны и аллогенные МСК объединялись в соотношении 10:90 (стандартный выход) или 20:80 (высокий выход), в зависимости от количества выделенных от пациента хондронов.
Клетки суспендировали в фибриновом клее (Beriplast, CSL Behring, США), используя 1,5-2 миллиона клеток на миллилитр клея. Примерно через 90 минут клеточный материал доставлялся в операционную, с раны колена снимали покрытие-повязку, и клетки имплантировали в сустав с использованием носителя из фибринового клея. Было имплантировано приблизительно 0,9 мл клеточного продукта (клетки + фибриновый клей) на квадратный сантиметр дефекта, продукт должен плотно прилежать ко дну и краям дефекта хряща. Авторы обращают внимание, что в предыдущих исследованиях in vitro и in vivo им удалось показать преимущество использования комбинации хондронов и МСК по сравнению с хондрами или МСК по отдельности, что делает маловероятным достижение тех же результатов с ограниченным количеством доступных изолированных аутологичных хондр. Вышеописанный способ основан на предварительном заборе относительно небольшого количества хряща вокруг дефекта суставного хряща для выделения хондр, поэтому возможности восстановления хряща в этом случае ограничены небольшими размерами закрываемых хрящевых дефектов. Свеже размороженные аллогенные клетки обладают слабой жизнеспособностью при пересадке в живой организм, им необходимо время до трансплантации для внутриклеточной регенерации криоповреждений в благоприятных условиях ин витро (этот этап такой технологией не предусмотрен), замороженные клетки также обладают всеми характерными и известными недостатками аллогенного материала. Использование донорского материала оставшегося от пересадки костного мозга детей может затруднить широкое внедрение способа в практическое здравоохранение.
Важно отметить, что 3D-агрегаты - сфероиды из МСК считаются более физиологическими для клеточных культур за счет усиления межклеточных взаимодействий и взаимодействий с матриксом, накапливаемым в составе сфероида. Сами клетки (МСК), культивированные в сфероидах, по сравнению с 2D адгезивными культурами обладают усиленным противовоспалительным и тканевым репаративным/регенеративным действием с улучшенной выживаемостью клеток после трансплантации (Cesarz Z, Tamama K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2016; 2016:9176357. doi: 10.1155/2016/9176357. Epub 2015 Nov 16)
Недавно установлено, что в лабораторных условиях МСК жировой ткани могут инициировать образование хряща неонатальными хондроцитами при смешивании и совместном культивировании в биомиметических гидрогелях с определенными свойствами. Технология не предназначена для клинического применения (Wang Т. et al. Modulating stem cellchondrocyte interactions for cartilage repair using combinatorial extracellular matrix-containing hydrogels// J. Mater. Chem. B, 2016, 4, p.7641-7650, DOI: 10.1039/c6tb01583b).
Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления хрящей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанной проблемы.
Задачей изобретения является создание способа биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта.
Техническим результатом данного изобретения является получение улучшенного аутологичного трансплантата на основе клеточных сфероидов, обладающих не только выраженным регенеративным потенциалом, но и способностью активировать репаративную регенерацию локально, как местных тканей, так и клеток надхрящницы сфероида-трансплантата, а также улучшить интеграцию регенерата растущего из клеточных сфероидов с частично регенерирующими окружающей хрящевой тканью реципиентной области для эффективного восстановления хряща, в частности, суставного хряща, а также снизить риск инфекционных осложнений за счет синтеза антимикробных пептидов (индолеамин-2,3-диоксигеназа (IDO), кателицидин LL-37, гепсидин) МСК, которые входят в составе трансплантата-сфероида. Требуется только одна артроскопическая операция для заполнения хрящевого дефекта, сама операция более быстрая, так как исключен этап ожидания во время которого происходит подготовки забранного клеточного материала для трансплантации в дефект. Полученный сфероид обладает более высоким регенеративным потенциалом, по сравнению со сфероидами только из клеток надхрящницы.
Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из надхрящницы реберного хряща и МСК костного мозга быстрее и большего объема, по сравнению со сфероидами на основе только клеток надхрящницы, так как одновременно используются 2 клеточные культуры, материал готовится персонифицировано, этап криоконсервации исключен. Следует отметить, что забор и надхрящницы и забор костного мозга в объемах необходимых для реализации этого способа производятся в амбулаторных условиях под местной анестезией. Забор костного мозга производится из гребней подвздошных костей с помощью игл для аспирации костного мозга. Более высокие адгезивные свойства и способность к взаимному слиянию таких сфероидов позволяют использовать сфероиды меньшего размера, что улучшает жизнеспособность клеток в центральной части сфероида при 3D культивировании и выживаемость клеток сфероида при приживлении. МСК создает благоприятную локальную среду для регенерации хряща из камбиальных клеток надхрящницы, в составе сфероида обладают усиленным противовоспалительным и тканевым репаративным/регенеративным действием, включающим препятствующий рубцеванию, препятствующий апоптозу и стимулирующим клеточное деление эффектами.
Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления гиалиновых хрящей субъекта на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и МСК костного мозга субъекта, включающего следующие этапы:
а) выделение адгезивных клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща субъекта;
б) выделение адгезивных стромальных клеток из собственного костного мозга субъекта;
в) раздельное культивирование выделенных на стадии а) и б) клеток в адгезивных 2D культурах раздельно без хондрогенной дифференцировочной среды с добавлением 10% тромболизата (PLTGold® Human Platelet Lysate, Merck);
г) перенесение клеток, полученных на стадии в), в NanoCulture® плиты для 3D-культивирования (Corning® 1536-луночный микропланшет для сфероидов с круглым дном и сверхнизким прикреплением, с крышкой, стерильный (Corning® 1536-well Black/Clear Round Bottom Ultra-low Attachment Spheroid Microplate, with Lid, Sterile) и последующее 3D культивирование с образованием клеточных сфероидов, причем на этом этапе производиться смешанное культивирование клеток надхрящницы и МСК в соотношении 1:1. В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека. В частных вариантах воплощения изобретения хрящ представляет собой суставной хрящ, хрящи носа, гортани, трахеи и бронхов, ушной раковины или хрящ межпозвоночных дисков. В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии в) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии в) осуществляется из расчета 8000 клеток двух выращенных клеточных культур на 1 лунку микропланшета в соотношении 1:1.
В частных вариантах слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляется в лунках пластикового микропланшета, где они пребывают 5 суток (допустимо 3D культивирование не дольше 8 суток). В частных вариантах воплощения изобретения слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляется через 5-8 дней.
Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления хряща субъекта, включающему клеточные сфероиды на основе клеток камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща и собственного костного мозга субъекта и полученному способом по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения хрящ представляет собой суставной хрящ, хрящи носа, гортани, трахеи и бронхов, ушной раковины или хрящ межпозвоночных дисков.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.
Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет применения клеток камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща и МСК костного мозга субъекта в соотношении 1:1 для получения трансплантата в виде клеточных сфероидов диаметром 420-460 мкм. Следует подчеркнуть важность присутствия в составе питательной среды тромболизата, поскольку тромболизат эффективно поддерживает пролиферативную способность культивируемых клеток хрящевого дифферона, более того тромболизат поддерживает тканеспецифичность клеток в культуре (De Angelis Е. et al. Platelet lysate reduces the chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion: Implications for cartilage tissue engineering// Res Vet Sci. 2020 Dec; 133:98-105. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.08.017. Epub 2020 Sep 6.).
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
В описании данного изобретения термин надхрящница (перихондр) - соединительнотканная оболочка хряща (за исключением хряща суставных поверхностей костей); состоит из двух слоев: внешний (фиброзный), более плотный, слой переходит без резких границ в окружающую соединительную ткань, внутренний (хондрогенный) слой содержит клетки, способные превращаться в хондробласты, обеспечивающие рост хряща.
В описании данного изобретения термин биофабрикация - это процесс искусственного конструирования и выращивания вне организма человека живых, функциональных тканей или органов для последующей трансплантации пациенту с целью замены или стимуляции регенерации поврежденных органов или тканей, чаще всего с использованием технологии биопечати.
В описании данного изобретения термин строма костного мозга - соединительная ткань, представленная всеми типами клеток, которые локализованы между наружной поверхностью сосудов костного мозга и поверхностью кости, которая служит окружением для гемопоэтических (кроветворных) клеток.
В описании данного изобретения термин сфероиды - плотно упакованные клеточные агрегаты шарообразной формы, сформированные путем трехмерного культивирования, важным свойством которых является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента; тканевые сфероиды имеют тканеподобное строение, их часто называют трехмерными микротканями, созданными в искусственных условиях, максимизирующих межклеточные взаимодействия.
В описании данного изобретения термин адгезивные культуры - монослойные культуры клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться культуральному пластику или стеклу, при наличии определенных условий эти клетки будут прикрепляться к субстрату и в норме будут делиться и распространяться таким способом. У таких клеток есть зависимость от подложки - прикрепление к субстрату является необходимой предпосылкой для клеточной пролиферации.
В описании данного изобретения термин рубцевание - это процесс созревания грануляционной ткани, заканчивающийся образованием атипичного регенерата - рубца, морфологически характеризуется уменьшением числа сосудов и клеточных элементов, образованием фиброцитов и характерно уложенных коллагеновых волокон.
В описании данного изобретения термин биопечать органов - это роботическое послойное создание органных конструкций из тканевых сфероидов или клеток согласно цифровой модели.
Хондрификация (также известная как хондрогенез) представляет собой процесс образования хряща из уплотненной мезенхимной ткани. Во время формирования хряща недифференцированные МСК обладают высокой пролиферацией и образуют плотные скопления хондрогенных клеток в центре хондрификации. Эти кондрогенные клетки затем дифференцируются в хондробласты, которые затем синтезируют внеклеточный матрикс хряща.
В описании данного изобретения термин мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) - гетерогенная популяция клеток стромы костного мозга и некоторых иных источников, способная к дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение: адипоциты, хондроциты и остеоциты.
В описании данного изобретения термин трансплантационная регенерация - регенерация по трансплантату, стимуляция регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления путем трансплантации тканей, которые в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, создают модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию. Метод трансплантации используют для стимуляции регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления.
Субкультивирование - процесс переноса некоторых или всех клеток из предыдущей культуры в свежую питательную среду, часто в новый сосуд для культивирования.
Используемый в данной заявке термин «хондрогенная среда» означает среду, необходимую для дифференцировки клеток в хондрогенном направлении.
В описании данного изобретения PLT Gold®- коммерческий продукт немецкой фармацевтической, химической и биологической компании Мерк - добавка для культивирования клеток, свободной от животных белков, которая по мнению производителя, является альтернативой эмбриональной бычьей сыворотке, имеющей ряд существенных преимуществ, представляет собой нефракционированный продукт, лизат, полученный из тромбоцитов человека, не требующий добавления гепарина.
В описании данного изобретения хондрон - группа хрящевых клеток единого происхождения в комплексе с прилежащим к ним межклеточным веществом, являются истинной морфологической единицей суставного хряща. Долгое время считалось, что хондры (множественное число «хондрон») функционируют как первичные метаболические единицы гиалинового хряща.
Подробное раскрытие изобретение
Технический результат достигается тем, что в качестве источника хондропрогениторных клеток для производства сфероидов используется камбиальный слой надхрящницы, являющийся для хряща клеточным источником полноценной регенерации, предложенные сфероиды имеют более высокие показатели регенеративного потенциала за счет введения в состав сфероида МСК (в пропорции 1:1 или 1:2 к клеткам камбиального слоя надхрящницы). МСК обладают известными хондроиндуктивными, противовоспалительными эффектами, стимулирующими трансплантационную регенерацию, облегчающую приживление регенерата, тканевое взаимное слияние сфероидов, а также к адгезии сфероидов к элементам внеклеточного матрикса. Важный антимикробный эффект таких сфероидов обусловлен продукцией МСК, которые в составе сфероидов, антимикробных пептидов, что снижает риск послеоперационных инфекционных осложнений.
Выделение клеток из камбиального слоя надхрящницы происходит путем его механического соскабливания под визуальным контролем с помощью операционного микроскопа, с последующей ферментативной диссоциацией извлеченного слоя надхрящницы в 0,1% растворе коллагеназы II (Sigma-Aldrich, USA) в питательной среде DMEM (Gibco, USA) с добавлением 2 мМ L-глутамина (ООО «ПанЭко», Россия) и пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (100-кратного раствора) (ООО «ПанЭко», Россия), инкубировали фрагменты тканей в течение 24 часов при температуре 37°С.
Для получения первичной культуры из камбиального слоя, клетки, выделенные из надхрящницы, высевают в пластиковые флаконы для культивирования клеток, для работ с прикрепляемыми культурами, используется культуральная питательная среда следующего состава: DMEM (или DMEM /F12) 450 мл (ООО «ПанЭко», Россия), L-глутамин 292 мг, тромболизат (PLTGold®) 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, газовая смесь с 5% содержанием СО2.
Для получения первичной культуры клеток из костного мозга, забирался из подвздошных костей аспират костного мозга, мононуклеарные клетки выделяли на градиенте плотности при центрифугировании (фиколла раствор), методом проточной цитофлуориметрии было установлено, что фибробластоподобные клетки, полученные в результате культивирования мононуклеарной фракции аспирата костного мозга, обладали следующим фенотипом: CD13+, CD34-, CD44+, CD45-, CD49b+, CD54+, CD90+, CD105+,CD106+-, CD117+-, HLA- ABC+-, HLA-DR-. Клетки переносились в пластиковые культуральные флаконы с обработанной поверхностью, используется культуральная питательная среда следующего состава: DMEM (или DMEM/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, тромболизат (PLTGold®) -50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, газовая смесь с 5% содержанием СО2 в воздушной газовой смеси.
Субкультивирование монослойной адгезивной культуры клеток камбиального слоя надхрящницы осуществляют до второго-третьего пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня. После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов раствором трипсина-ЭДТА 0,05% с солями Хенкса. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды DMEM с 10% бычьей сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в количестве 4000 клеток надхрящницы и 4000 МСК в каждую лунку микропланшета. Внутри лунок из необработанного культурального пластика из культивируемых клеток формируются клеточные агрегаты округлой формы - сфероиды. Таким образом, формирование микротканей - клеточных сфероидов происходит в бесскаффолдной 3D культуре клеток с использованием лунок микропланшета из полистирола с необработанной поверхностью.
Для трансплантации сфероидов в живой организм их извлекают из лунок микропланшетов в стерильный лоток и переносят в пробирку (все время поддерживается температура раствора - носителя сфероидов в 37°С), где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. Сфероиды отмываются от культуральной питательной среды. После этого суспензию сфероидов в среде F-12, без глутамина, помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через аппликатор, диаметром не менее 1 мм2, артроскопически, при температуре среды 37°С, возможно добавление фибринового клея. Сфероиды слипаются между собой прилипают к реципиентной поверхности через 20-30 минут при поддержании температуры в области трансплантации не ниже 37°С. Проводится иммобилизация конечности на сутки. Данные сфероиды могут быть использованы для биопечати хряща, как ин виво биопечати, так и тканеинженерных конструкций в лабораторных условиях.
Осуществление изобретения
Пример 1
Взятие надхрящницы осуществляли с реберного хряща овец. Осуществлялся хирургический доступ к реберному хрящу. Для отделения надхрящницы от нижележащего хряща под нее вводили с помощью иглы шприца стерильную питательную среду F12. Отсеченную надхрящницу погружали в стерильную чашку Петри с теплой питательной средой F12 (37°С). При постоянном смачивании надхрящницу натягивали на стерильный деревянный брусок, вверх камбиальным слоем. Под контролем операционного микроскопа соскабливали этот слой с помощью лезвия скальпеля. С помощью пипетки кусочки надхрящницы переносились в емкость для ферментативной диссоциации. Использовали 0,1% растворе коллагеназы II (Sigma-Aldrich, USA) в питательной среде DMEM (Gibco, USA) с добавлением 2 мМ L-глутамина (ООО «ПанЭко», Россия) и пенициллин-стрептомицин, 100-кратный раствор, рабочая концентрация 10 мл/л (100-кратного раствора) (ООО «ПанЭко», Россия), инкубировали фрагменты тканей в среде с коллагеназой в инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37°С.
Для получения первичной культуры из камбиального слоя, клетки, выделенные из надхрящницы, высевают в специальные пластиковые флаконы для культивирования клеток, предназначенные для работ с адгезивными (прикрепляемыми) клеточными культурами. Для экспансии клеток используется культуральная питательная среда следующего состава: DMEM (или DMEM /F12) 450 мл (ООО «ПанЭко», Россия), L-глутамин 292 мг, тромболизат (PLTGold®) 25 мл (возможно увеличить до 50 мл), пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 370°С, газовая смесь с 5% содержанием CO2.
Для получения первичной культуры клеток из костного мозга, костный мозг в виде аспирата забирался из подвздошных костей, мононуклеарные клетки выделяли на градиенте плотности при центрифугировании (фиколла раствор) общеизвестным способом. Методом проточной цитофлуориметрии было установлено, что фибробластоподобные клетки, полученные в результате культивирования мононуклеарной фракции аспирата костного мозга, обладали следующим фенотипом: CD13+, CD34-, CD44+, CD45-, CD49b+, CD54+, CD90+, CD105+, CD106+-, CD117+-, HLA- ABC+-, HLA-DR-, характерным для МСК. Клетки переносились в пластиковые культуральные флаконы с обработанной поверхностью, используется для 2D культивирования питательная среда следующего состава: DMEM (или DMEM/F12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, тромболизат (PLTGold®) - 25 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, газовая смесь с 5% содержанием СО2 в воздушной газовой смеси внутри флакона.
Субкультивирование монослойной адгезивной культуры клеток камбиального слоя надхрящницы осуществляют до второго-третьего пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня. После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов раствором трипсина-ЭДТА 0,05% с солями Хенкса. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды DMEM с 5% бычьей сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в количестве 4000 клеток надхрящницы и 4000 МСК в каждую лунку микропланшета (8000 клеток на 1 лунку). Внутри лунок из необработанного культурального пластика из культивируемых клеток формируются клеточные агрегаты округлой формы - сфероиды. Таким образом, формирование микротканей - клеточных сфероидов происходит в 3D культуре клеток с использованием лунок микропланшета из полистирола с необработанной (неадгезивной) поверхностью. Полученная тканеинженерная конструкция относится к бесскаффолдному типу, внутри сфероида клетки формируют собственный внеклеточный матрикс, улучшающий жизнеспособность клеток.
Для трансплантации сфероидов в живой организм их извлекают из лунок микропланшетов в стерильный лоток и переносят в пробирку (все время поддерживается температура раствора - носителя сфероидов в 37°С). Внутри пробирки сфероиды осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. Сфероиды отмываются от культуральной питательной среды. После этого суспензию сфероидов в среде F-12, без глутамина, помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через аппликатор, диаметром не менее 1 мм2, артроскопически, при температуре среды 37°С, возможно добавление в состав трансплантата фибринового клея или геля, на основе гиалуроновой кислоты, полученного известным способом (Stevens М.М., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Langer R, Shastri V.P. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9; 102 (32): 11450-5). Сфероиды слипаются между собой прилипают к реципиентной поверхности через 20-30 минут при поддержании температуры в области трансплантации не ниже 37°С. Проводится иммобилизация конечности. Данные сфероиды могут быть использованы для ин виво биопечати хряща или фабрикации тканеинженерных конструкций в лабораторных условиях.
Полученные сфероиды из клеток овцы, кроликов и человека обладают высоким регенеративным потенциалом, проявляемым как ин виво, так и в органных моделях хрящевых дефектов.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
1. Ming-Feng Hsueh, Patrik Önnerfjord, Michael P. Bolognesi, Mark E. Easley, Virginia B. Kraus. Analysis of "old" proteins unmasks dynamic gradient of cartilage turnover in human limbs. Science Advances, 2019; 5 (10): eaax3203 DOI: 10.1126/sciadv.aax3203
2. Interna F., Van Roermund P. M., Marijnissen A. C. A., Cotofana S., Eckstein F., Castelein R. M., Bijlsma J. W. J., Mastbergen S. C, Lafeber F. P. J. G., Tissue structure modification in knee osteoarthritis by use of joint distraction: An open 1-year pilot study. Ann. Rheum. Dis. 70, 1441 -1446 (2011)
3. Caplan AI. Mesenchymal Stem Cells: Time to Change the Name! Stem Cells Transl Med. 2017 Jun; 6(6): 1445-1451. doi: 10.1002/sctm. 17-0051. Epub 2017 Apr 28. PMID: 28452204; PMCID: PMC5689741
4. de Windt TS, Vonk LA, Slaper-Cortenbach ICM, Nizak R, van Rijen МНР, Saris DBF. Allogeneic MSCs and Recycled Autologous Chondrons Mixed in a One-Stage Cartilage Cell Transplantion: A First-in-Man Trial in 35 Patients. Stem Cells. 2017 Aug; 35(8):1984-1993. doi: 10.1002/stem.2657. Epub 2017 Jun 23. PMID: 28600828
5. De Angelis E. et al. Platelet lysate reduces the chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion: Implications for cartilage tissue engineering// Res Vet Sci. 2020 Dec; 133:98-105. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.08.017. Epub 2020 Sep 6.
6. Cesarz Z, Tamama K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2016; 2016:9176357. doi: 10.1155/2016/9176357. Epub 2015 Nov 16
7. Wang T. et al. Modulating stem cell-chondrocyte interactions for cartilage repair using combinatorial extracellular matrix-containing hydrogels// J. Mater. Chem. B, 2016, 4, p. 7641-7650, DOI: 10.1039/c6tb01583b
8. Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D., Aronson J., Langer R, Shastri V.P. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9; 102 (32):11450-5.

Claims (7)

1. Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта, характеризующийся тем, что выделяют адгезивные клетки из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, выделяют адгезивные стромальные клетки из собственного костного мозга субъекта, осуществляют раздельное культивирование выделенных клеток в адгезивных 2D-культурах без хондрогенной дифференцировочной среды, при этом для получения первичной культуры выделенные клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: DMEM или DMEM /F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, тромболизат PLTGold® Human Platelet Lysate, Merck - 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, газовая смесь с 5% содержанием СО2, переносят полученные клетки в NanoCulture® плиты для 3D-культивирования Corning® 1536-луночный микропланшет для сфероидов с круглым дном и сверхнизким прикреплением, с крышкой, стерильный Corning® 1536-well Black/Clear Round Bottom Ultra-low Attachment Spheroid Microplate, with Lid, Sterile и последующее 3D культивирование с образованием клеточных сфероидов, при этом производят смешанное культивирование клеток надхрящницы и МСК в соотношении 1:1 в количестве 8000 клеток на лунку.
2. Способ по п. 1, в котором субъект представляет собой человека.
3. Способ по п. 1, в котором хрящ представляет собой суставной хрящ, хрящ носа, гортани, трахеи, бронхов, ушной раковины или межпозвоночных дисков.
4. Способ по п. 1, в котором культивирование адгезивных стромальных клеток из собственного костного мозга субъекта, а также раздельное культивирование выделенных адгезивных клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща субъекта осуществляют в течение 20-30 дней.
5. Способ по п. 1, в котором перенесение клеток на стадии раздельного культивирования выделенных клеток осуществляют из расчета 8000 клеток надхрящницы и МСК в соотношении 1:1 на 1 лунку агарозного планшета.
6. Способ по п. 1, в котором слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляют в лунках пластикового микропланшета, где клетки пребывают до 6 дня.
7. Способ по п. 1, в котором размер сфероидов составляет 420-450 мкм.
RU2022101391A 2022-01-21 Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта RU2800991C9 (ru)

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2022101391A RU2022101391A (ru) 2023-07-21
RU2800991C2 true RU2800991C2 (ru) 2023-08-01
RU2800991C9 RU2800991C9 (ru) 2023-09-08

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2731314C1 (ru) * 2019-10-30 2020-09-01 Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2731314C1 (ru) * 2019-10-30 2020-09-01 Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
De Windt TS et al., Allogeneic MSCs and Recycled Autologous Chondrons Mixed in a One-Stage Cartilage Cell Transplantion: A First-in-Man Trial in 35 Patients, Stem Cells, 2017, 35 (8), pp. 1984-1993. CAPLAN AI., Mesenchymal Stem Cells: Time to Change the Name!, Stem Cells Transl Med., 2017, 6 (6), pp. 1445-1451. CESARZ Z. et al., Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells, Stem Cells Int., 2016, 9176357. ZHANG S. et al., MSC exosomes mediate cartilage repair by enhancing proliferation, attenuating apoptosis and modulating immune reactivity, Biomaterials, 2018, vol. 156, pp. 16-27. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sterodimas et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applications
US5197985A (en) Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells
JP3808900B2 (ja) 結合組織細胞に部分的又は完全に分化した骨髄幹細胞の有効培養物及びヒアルロン酸誘導体より成る三次元の生体親和性で且つ生分解性のマトリックスから構成される生物学的物質
US5226914A (en) Method for treating connective tissue disorders
Shen et al. Implications of adipose-derived stromal cells in a 3D culture system for osteogenic differentiation: an in vitro and in vivo investigation
US20080286241A1 (en) Transplantation of Differentiated Immature Adipocytes and Biodegradable Scaffold for Tissue Augmentation
CA2386506C (en) Isolation of precursor cells and their use for tissue repair
Danišovič et al. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering
EP2977448B1 (en) Method for preparing chondrocytes
WO2013099273A1 (ja) 骨軟骨再生のためのスキャフォールドフリー自己組織化三次元人工組織と人工骨複合体
KR102479530B1 (ko) 인간 유도 만능 줄기세포로부터 연골세포의 펠렛을 제조하는 방법 및 이의 용도
KR102223043B1 (ko) 활액막 유래 중간엽 줄기세포 및 그의 용도
KR20160036031A (ko) 연골 재생용 세포 치료제
JP2017051160A (ja) 細胞包埋ビーズ及びその製造方法
US9434923B2 (en) Preparation of parental cell bank from foetal tissue
RU2800991C2 (ru) Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта
RU2800991C9 (ru) Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта
WO2011037416A2 (ko) 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법
JP6785516B2 (ja) ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から骨芽細胞の製造を目的としたアクチン重合阻害剤による分化誘導技術
RU2818176C1 (ru) Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов пациентов
RU2819284C2 (ru) Способ получения тканеинженерной надкостницы из клеточных сфероидов для восстановления костных дефектов субъекта
TWI622649B (zh) 從胎兒組織製備親代細胞庫
CA3079500A1 (en) Pluripotent stem cells inducing osteochondral repair
Lopes Bonelike®= Bonelike associated to stem cells for the regeneration of the bone tissue
da Costa Lopes Bonelike® Associated to Stem Cells for the Regeneration of the Bone Tissue