RU2721128C2 - Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные антигены капсульного сахарида, наборы, содержащие эти композиции, и их применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к набору для индуцирования иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae. Набор содержит: (а) первую иммуногенную композицию, содержащую гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B, 22F, 33F, 12F, 10А, 11А, 8, причем указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM197 (перекрестно-реагирующий материал 197); и (б) вторую иммуногенную композицию, содержащую гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, и где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM197, для сопутствующего, параллельного или последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций, где гликоконъюгаты представляют собой капсульные полисахариды указанных серотипов, конъюгированные с CRM197. Изобретение может быть использовано для вакцинации субъектов-людей, в частности младенцев и пожилых людей, против пневмококковых инфекций. 11 з.п. ф-лы, 16 ил., 35 табл., 21 пр.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым иммуногенным композициям, содержащим конъюгированные антигены капсульных сахаридов (гликоконъюгаты), к наборам, содержащим указанные иммуногенные композиции, и к их применениям. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению, как правило, будут содержать гликоконъюгаты, где сахариды имеют происхождение из различных серотипов Streptococcus pneumoniae. Изобретение также относится к вакцинации субъектов-людей, в частности младенцев и пожилых людей, против пневмококковых инфекций с применением указанных новых иммуногенных композиций и наборов.

Предшествующий уровень техники

Инфекции, вызываемые пневмококками, являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Наиболее частыми проявлениями инвазионного пневмококкового заболевания являются пневмония, фебрильная бактериемия и менингит; при этом распространение бактерий внутри дыхательных путей может приводить к инфекции среднего уха, синуситу или рецидивирующему бронхиту. По сравнению с инвазионным заболеванием неинвазионные проявления обычно являются менее тяжелыми, но встречаются значительно чаще.

В Европе и Соединенных Штатах Америки чаще всего встречающейся внебольничной бактериальной пневмонией является пневмококковая пневмония, по оценкам поражающая приблизительно 100 на 100000 взрослых людей ежегодно. Соответствующие показатели для фебрильной бактериемии и менингита составляют 15-19 на 100000 и 1-2 на 100000, соответственно. Риск развития одного или более из этих проявлений значительно выше у младенцев и пожилых людей, а также людей любого возраста с нарушенным иммунитетом. Даже в экономически развитых регионах инвазионное пневмококковое заболевание ведет к высокой смертности; для взрослых с пневмококковой пневмонией частота смертности в среднем составляет 10%-20%, хотя в группах высокого риска она может превышать 50%. Во всем мире пневмония до сих пор является наиболее распространенной причиной смерти от пневмококковых заболеваний.

Возбудитель пневмококковых заболеваний Streptococcus pneumoniae (пневмококк) представляет собой грамположительный инкапсулированный кокк, окруженный полисахаридной капсулой. Различия в составе этой капсулы позволяют проводить серологическую дифференциацию между приблизительно 91 капсульным типом, и некоторые из них чаще, а другие реже ассоциированы с пневмококковым заболеванием. Инвазионные пневмококковые инфекции включают пневмонию, менингит и фебрильную бактериемию; среди неинвазионных проявлений распространены средний отит, синусит и бронхит.

Конъюгированные пневмококковые вакцины (PCV) представляют собой пневмококковые вакцины, применяемые для защиты от заболевания, вызванного S. pneumoniae (пневмококком). В настоящее время на мировом рынке представлены три вакцины PCV: ПРЕВНАР^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР^®) (семивалентная вакцина), СИНФЛОРИКС^® (десятивалентная вакцина) и ПРЕВНАР 13^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР 13^®) (тринадцативалентная вакцина).

Развитие в последнее время широко распространенной устойчивости микроорганизмов к основным антибиотикам и увеличение числа людей с нарушенным иммунитетом подчеркивают необходимость в пневмококковых вакцинах с еще более широким спектром защиты.

В частности, существует необходимость в разрешении сохраняющейся неудовлетворенной потребности медицины в охвате пневмококкового заболевания, вызываемого не представленными в ПРЕВНАР 13^® серотипами и имеющими потенциал к возникновению серотипами, не представленными в ПРЕВНАР 13®. Конкретные серотипы, вызывающие заболевание, помимо 13 в ПРЕВНАР 13^®, изменяются в зависимости от региона, популяции и могут изменяться со временем за счет приобретения резистентности к антибиотикам, введения пневмококковой вакцины и долговременных тенденций неизвестного происхождения. Существует необходимость в иммуногенных композициях, которые можно применять для индуцрования иммунного ответа против дополнительных серотипов Streptococcus pneumoniae у людей и, в частности, у детей в возрасте младше 2-х лет.

Задача разработки новых иммуногенных композиций по настоящему изобретению состоит в обеспечении надлежащей защиты от S. pneumoniae серотипов, не представленных в ПРЕВНАР 13^®. В одном аспекте задача разработки иммуногенных композиций по настоящему изобретению состоит в обеспечении надлежащей защиты от S. pneumoniae серотипов, не представленных в ПРЕВНАР^® (семивалентная вакцина), СИНФЛОРИКС^® и/или ПРЕВНАР 13^®, с сохранением иммунного ответа на серотипы, в настоящее время уже охваченные указанными вакцинами.

Явление антигенной конкуренции (или интерференции) осложняет разработку поливалентных вакцин. Антигенная интерференция относится к наблюдаемому явлению, состоящему в том, введения множества антигенов может привести к сниженному ответу на некоторые антигены относительно иммунного ответа, наблюдаемого при введении таких антигенов по отдельности. Его возникновение при создании новых комбинаций антигенов непредсказуемо.

Задача разработки иммуногенных композиций, наборов и схем введения по настоящему изобретению состоит в обеспечении надлежащей защиты от S. pneumoniae серотипов, не представленных в ПРЕВНАР 13^®, при сохранении иммунного ответа на серотипы, в настоящее время охваченные указанной вакциной, и сведении к минимуму риска иммунной интерференции.

Краткое изложение сущности изобретения

Для удовлетворения этих и других потребностей настоящее изобретение относится к новым иммуногенным композициям, наборам, содержащим эти композиции, и их применению. В приведенных ниже параграфах описаны некоторые аспекты и воплощения изобретения.

Один аспект изобретения относится к иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 15В, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 12F, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 10А, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 11А и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 8, где указанная композиция представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

В одном аспекте в изобретении предложен набор, содержащий: (а) первую иммуногенную композицию, включающую в себя указанную иммуногенную композицию; и (б) вторую иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

В другом аспекте в изобретении предложена указанная иммуногенная композиция для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения.

В одном аспекте в изобретении предложена указанная иммуногенная композиция для применения в схеме вакцинации. В одном воплощении изобретения схема вакцинации представляет собой схему применения однократной дозы. В другом воплощении изобретения схема вакцинации представляет собой схему применения многократных доз.

В одном аспекте указанный набор предназначен для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций.

В другом аспекте изобретения предложены указанная иммуногенная композиция или указанный набор для применения в качестве лекарственного средства.

В одном аспекте изобретения указанная иммуногенная композиция или указанный набор предназначены для применения в качестве вакцины.

В другом аспекте изобретения предложены указанная иммуногенная композиция или указанный набор для применения в способе профилактики, лечения или улучшения состояния при бактериальной инфекции, заболевании или состоянии у субъекта.

В другом аспекте изобретения указанная иммуногенная композиция или указанный набор предназначены для применения в способе профилактики бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта.

В одном аспекте изобретения предложены указанная иммуногенная композиция или указанный набор для применения в способе защиты или лечения человека, подверженного пневмококковой инфекции, посредством введения указанных иммуногенных композиций системным или мукозальным путем.

Графические материалы

На Фиг. 1 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 8 (Pn-8).

На Фиг. 2 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А (Pn-10А).

На Фиг. 3 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 11А (Pn-11А).

На Фиг. 4 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 12F (Pn-12F).

На Фиг. 5 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В (Pn-15В).

На Фиг. 6 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F (Pn-22F).

На Фиг. 7 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 33F (Pn-33F).

На Фиг. 8 показана блок-схема репрезентативного способа для процессов активации (А) и конъюгирования (Б), которые можно применять для приготовления гликоконъюгата Pn-33F.

На Фиг. 9 показано влияние изменения количества NCS (N-хлорсукцинимид) в реакции окисления ТЕМРО(2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси)/NCS на DO (степень окисления).

На Фиг. 10 показана оценка стабильности гликоконъюгатов Pn-12F.

Фиг. 11. Перекрестно-функциональные ответы ОРА (анализ опсонофагоцитарной активности). Подгруппу из 59 образцов сыворотки крови от взрослых людей, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгатной вакциной (исследование США 6115А1-004; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00427895) оценивали в ОРА на предмет присутствия функциональных антител к серотипам 9V, 9А, 9L и 9N. Над каждой группой указана процентная доля образцов с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8). Под каждой группой на оси X приведены геометрические средние титры (GMT).

Фиг. 12. Перекрестно-функциональные ответы ОРА шестидесяти шести соответствующих образцов сыворотки крови до/после вакцинации. Подгруппу из 66 соответствующих образцов сыворотки крови от взрослых людей, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгатной вакциной (исследование США 6115А1-3005; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00546572) оценивали в ОРА на предмет присутствия функциональных антител к серотипам 9V, 9А, 9L и 9N. Над каждой группой указана процентная доля образцов с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8). Под каждой группой на оси X приведены геометрические средние титры (GMT).

Фиг. 13. Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9V (Pn9V).

Обратные кумулятивные кривые распределения титров ОРА к серотипу 9V панели соответствующих образцов сыворотки крови до и после вакцинации (N равно 66) субъектов, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгатной вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00546572). На графиках представлена процентная доля образцов сыворотки крови с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8).

Фиг. 14. Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9А (Pn9А).

Обратные кумулятивные кривые распределения титров ОРА к серотипу 9А панели соответствующих образцов сыворотки крови до и после вакцинации (N равно 66) субъектов, вакцинированных 13-валентной конъюгированной пневмококковой вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00546572). На графиках представлена процентная доля образцов сыворотки крови с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8).

Фиг. 15. Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9L (Pn9L).

Обратные кумулятивные кривые распределения титров ОРА к серотипу 9L панели соответствующих образцов сыворотки крови до и после вакцинации (N равно 66) субъектов, вакцинированных 13-валентной конъюгированной пневмококковой вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00546572). На графиках представлена процентная доля образцов сыворотки крови с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8).

Фиг. 16. Обратные кумулятивные кривые распределения (RCDC) до и после иммунизации - пневмококковый серотип 9N (Pn9N).

Обратные кумулятивные кривые распределения титров ОРА к серотипу 9N панели соответствующих образцов сыворотки крови до и после вакцинации (N равно 66) субъектов, вакцинированных 13-валентной конъюгированной пневмококковой вакциной (исследование 6115А1-3005; идентификатор ClinicalTrials.gov:NCT00546572). На графиках представлена процентная доля образцов сыворотки крови с положительным титром ОРА (то есть не менее 1:8).

1. Гликоконъюгаты по изобретению

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению, как правило, будут содержать конъюгированные антигены капсульного сахарида (также называемые гликоконъюгатами), в которых сахариды имеют происхождение из различных серотипов S. pneumoniae.

Если для 2 или более сахаридов в композиции белок-носитель один и тот же, сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (молекулами носителя, с которыми конъюгированы 2 или более различных сахаридов) [см., например, WO 2004/083251].

Тем не менее, в предпочтительном воплощении изобретения каждый сахарид индивидуально конъюгирован с различными молекулами белка-носителя (с каждой молекулой белка-носителя конъюгирован только один тип сахарида). В указанном воплощении заявлено, что капсульные сахариды индивидуально конъюгируют с белком-носителем.

Для задач изобретения термин «гликоконъюгат» обозначает капсульный сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем. В одном воплощении изобретения капсульный сахарид связан непосредственно с белком-носителем. Во втором воплощении изобретения бактериальный сахарид связан с белком посредством спейсера/линкера.

1.1. Белок-носитель по изобретению

Компонентом гликоконъюгата по изобретению является белок-носитель, с которым конъюгирован сахарид. Термины «белковый носитель» или «белок-носитель» или «носитель» в настоящем документе могут использоваться взаимозаменяемо. Белки-носители должны быть применимы к стандартным методикам конъюгирования.

В предпочтительном воплощении изобретения белок-носитель гликоконъюгатов выбран из группы, состоящей из: DT (дифтерийный токсин), ТТ (столбнячный анатоксин) или фрагмента С ТТ, CRM₁₉₇ (перекрестно-реагирующий материал 197) (нетоксичный, но антигенно идентичный вариант дифтерийного токсина), других мутантов DT (таких как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844), CRM9, CRM102, CRM103 или CRM107; и других мутаций, описанных авторами Nicholls и Youle в публикации Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992); делеции или мутации Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на GIy и других мутаций, раскрытых в патентах США №№4709017 и 4950740; мутации по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и других мутаций, раскрытых в патентах США №№5917017 и 6455673; или фрагмента, раскрытого в патенте США №5843711, пневмококкового пневмолизина (ply) (Kuo et al. (1995) Infect lmmun 63:2706-2713), в том числе ply, обезвреженного каким-либо способом, например dPLY-GMBS(N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимид) (WO 2004/081515, WO 2006/032499) или dPLY-формол, PhtX (белки полигистидинового триадного семейства), в том числе PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE раскрыты в WO 00/37105 и WO 00/39299) и слитых белков Pht, например слитых белков PhtDE, слитых белков PhtBE, Pht А-Е (WO 01/98334, WO 03/054007, WO 2009/000826), OMPC (белок наружной мембраны менингококка), который обычно экстрагируют из Neisseria meningitidis серогруппы В (ЕР 0372501), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae; см., например, ЕР 0594610 В) или их иммунологически функциональных эквивалентов, синтетических пептидов (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белков теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшных белков (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокинов, лимфокинов, факторов роста или гормонов (WO 91/01146), искусственных белков, содержащих множественные функциональные CD4+ Т-клеточные эпитопы человека из антигенов, имеющих происхождение от различных патогенов (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824), таких как белок N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect lmmun 72:4884-4887) пневмококкового поверхностного белка PspA (WO 02/091998), белков захвата железа (WO 01/72337), токсина А или В Clostridium difficile (WO 00/61761), трансферрин-связывающих белков, пневмококкового адгезивного белка (PsaA), рекомбинантного экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa (в частности, его нетоксичных мутантов (таких как экзотоксин А, несущий замену глутаминовой кислоты 553 (Douglas et al. (1987) J. Bacteriol. 169(11):4967-4971)). Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное белковое производное туберкулина (PPD), также можно использовать в качестве белков-носителей. Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный анатоксин (например, как описано в WO 2004/083251), Escherichia coli LT (термолабильный), Е. coli ST (термостабильный) и экзотоксин А из P. aeruginosa.

В предпочтительном воплощении изобретения белок-носитель гликоконъюгатов независимо выбран из группы, состоящей из ТТ, DT, мутантов DT (таких как CRM₁₉₇), белка D Н. influenzae, PhtX, PhtD, слитых белков PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/054007), обезвреженного пневмолизина, PorВ, белка N19, PspA, ОМРС, токсина А или В С.difficile и PsaA.

В одном воплощении изобретения белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой DT (дифтерийный анатоксин). В другом воплощении изобретения белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой ТТ (столбнячный анатоксин).

В другом воплощении изобретения белок-носитель гликоконъюгатов по изобретению представляет собой PD (белок D Н. influenzae; см., например, ЕР 0594610 В).

В предпочтительном воплощении изобретения капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически неотличим от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцирует Corynebacterium diphtheriae, инфицированная нетоксигенным фагом β197^tox-, созданным путем нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного коринефага бета (Uchida et al. (1971) Nature New Biology 233:8-11). Белок CRM₁₉₇ имеет такую же молекулярную массу, как дифтерийный токсин, но отличается от него единственной заменой основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Эта единственная замена основания вызывает замену аминокислоты (глутаминовой кислоты на глицин) в зрелом белке и устраняет токсические свойства дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным, зависимым от Т-клеток носителем для сахаридов. Дополнительные подробные сведения о CRM₁₉₇ и его получении можно найти, например, в патенте США №5614382.

В одном воплощении изобретения капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с белком CRM₁₉₇ или с А-цепью CRM₁₉₇ (см. CN 103495161). В одном воплощении изобретения капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с А-цепью CRM₁₉₇, полученной посредством экспрессии генетически рекомбинантной Е. coli (см. CN 103495161). В одном воплощении изобретения все капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении изобретения все капсульные сахариды по изобретению конъюгированы с А-цепью CRM₁₉₇.

Соответственно, в частых воплощениях изобретения гликоконъюгаты по изобретению содержат CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, где капсульный полисахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.

1.2. Капсульный сахарид по изобретению

Термин «сахарид» на протяжении всего данного описания может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает в себя оба термина. В частых воплощениях изобретения сахарид представляет собой полисахарид, в частности капсульный полисахарид S. pneumoniae.

Капсульные полисахариды получают стандартными методиками, известными обычным специалистам в данной области техники.

В настоящем изобретении капсульные полисахариды могут быть получены, например, из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae. Обычно капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на соевой основе), а затем получают полисахариды из культуры бактерий. Штаммы бактерии S. pneumoniae, используемые для получения соответствующих полисахаридов, которые используют в гликоконъюгатах по изобретению, могут быть получены из установленных коллекций культур или клинических образцов.

Популяцию организма (каждого серотипа S. pneumoniae) часто масштабируют от посевного флакона до посевных бутылей и осуществляют пассажи через один или более чем один посевной ферментер увеличенного объема до достижения объемов ферментации промышленного масштаба. По окончании цикла выращивания клетки подвергают лизису, а затем лизатный бульон собирают для дальнейшей обработки (очистки) (см., например, WO 2006/110381, WO 2008/118752 и публикации заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838).

Отдельные полисахариды обычно очищают посредством центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и/или колоночной хроматографии (см., например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752).

Очищенные полисахариды могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы придать им способность к взаимодействию (например, со спейсером еТЕС ((2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматный)) и впоследствии включать в гликоконъюгаты по изобретению, как дополнительно описано ниже в данном документе.

Капсульные полисахариды S. pneumoniae содержат повторяющиеся олигосахаридные звенья, которые могут содержать вплоть до 8 остатков сахара.

В одном воплощении изобретения капсульный сахарид по изобретению может представлять собой одно олигосахаридное звено или быть короче, чем сахаридная цепь из повторяющихся олигосахаридных звеньев нативной длины. В одном воплощении изобретения капсульный сахарид по изобретению представляет собой одно повторяющееся олигосахаридное звено релевантного серотипа.

В одном воплощении изобретения капсульный сахарид по изобретению может представлять собой олигосахариды. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся звеньев (обычно 5-15 повторяющихся звеньев) и, как правило, получены синтетически или путем гидролиза полисахаридов.

Все же предпочтительно, чтобы все капсульные сахариды по настоящему изобретению и в иммуногенных композициях по настоящему изобретению представляли собой полисахариды. Капсульные полисахариды с высокой молекулярной массой способны индуцировать определенные иммунные ответы антител за счет эпитопов, присутствующих на антигенной поверхности. Для применения в конъюгатах, композициях и способах по настоящему изобретению предпочтительно рассматривают выделение и очистку капсульных полисахаридов с высокой молекулярной массой.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2250 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2250 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера Может быть использовано механическое или химическое изменение размера. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. Механическое изменение размера можно выполнять за счет срезания при гомогенизации высокого давления. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации).

В предпочтительном воплощении изобретения очищенные полисахариды представляют собой капсульные полисахариды из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F S. pneumoniae, где капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, попадающую в пределы одного из диапазонов молекулярной массы, описанных в настоящем документе выше.

Используемый в настоящем документе термин «молекулярная масса» полисахарида или конъюгата белок-носитель - полисахарид относится к молекулярной массе, рассчитанной с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), объединенной с многоугловым детектором рассеяния лазерного света (MALLS).

В некоторых воплощениях изобретения пневмококковые сахариды серотипов 9V, 18С, 11А, 15В, 22F и/или 33F по изобретению О-ацетилированы. В некоторых воплощениях изобретения пневмококковые сахариды серотипов 9V, 11А, 15В, 22F и/или 33F по изобретению О-ацетилированы.

Описанные в настоящем документе очищенные полисахариды активируют химическим путем с получением сахаридов, способных к взаимодействию с белком-носителем. Эти пневмококковые конъюгаты получают с помощью отдельных процессов и включают в одну дозированную лекарственную форму, как описано ниже.

1.2.1. Пневмококковый полисахарид из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные сахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F могут быть получены стандартными методиками, известными обычным специалистам в данной области техники (см., например, WO 2006/110381). Капсульные полисахариды могут быть получены путем выращивания S. pneumoniae каждого серотипа в среде; по окончании цикла выращивания клетки подвергают лизису, а затем лизатный бульон собирают для дальнейшей обработки (очистки). Отдельные полисахариды обычно очищают посредством центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и/или колоночной хроматографии (см., например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752). Очищенные полисахариды можно подвергать дальнейшей обработке, как дополнительно описано в настоящем документе, с получением гликоконъюгатов по изобретению.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и/или 23F до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 4000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 4000 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа или от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 3500 кДа; от 50 кДа до 3000 кДа; от 50 кДа до 2500 кДа; от 50 кДа до 2000 кДа; от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 4000 кДа; от 100 кДа до 3500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 3000 кДа; от 100 кДа до 2500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 4000 кДа; от 200 кДа до 3500 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

В некоторых воплощениях изобретения пневмококковые сахариды серотипов 9V и/или 18С по изобретению О-ацетилированы. В некоторых воплощениях изобретения пневмококковый сахарид серотипа 9V по изобретению О-ацетилирован, а пневмококковый сахарид серотипа 18С по изобретению де-О-ацетилирован.

1.2.2. Пневмококковый полисахарид серотипа 8

Повторяющееся звено полисахарида серотипа 8 состоит из линейного тетрасахаридного звена с одной молекулой глюкуроновой кислоты (GlcpA), двумя молекулами глюкопиранозы (Glcp) и одной молекулой галактопиранозы (Galp) (Jones et al. (1957) The Journal of the American Chemical Society 79 (11): 2787-2793). Все четыре моносахарида связаны посредством 1,4-связей, как показано на Фиг. 1.

Сахариды серотипа 8 могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Дополнительно они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы серотипа 8 S. pneumoniae могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 8 до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

1.2.3. Пневмококковый полисахарид серотипа 10А

Повторяющееся звено полисахарида серотипа 10А состоит из разветвленного гексасахаридного повторяющегося звена с двумя молекулами галактофуранозы (Gal_ƒ), тремя молекулами галактопиранозы (Gal_p), одной молекулой N-ацетилгалактозамина (Gal_pNAc) и каркаса фосфорибита (Jones, С. (2005) Carbohydrate Research 269(1):175-181). У группировки β-GalpNAc находится два разветвляющихся моносахарида (β-3-Galp и β-6-Galƒ), как показано на Фиг. 2.

Сахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Дополнительно они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы серотипа 10А S. pneumoniae могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 10А до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

1.2.4. Пневмококковый полисахарид серотипа 11А

Повторяющееся звено полисахарида серотипа 11А состоит из линейного тетрасахаридного каркаса (двух молекул галактопиранозы (Gal_p) и двух молекул глюкопиранозы (Glc_p)) и боковой группировки фосфоглицерина (Richards et al. (1988) Adv. Exp. Med. Biol. 228:595-597), как показано на Фиг. 3. Этот полисахарид О-ацетилирован в множественных положениях, и на основании данных, опубликованных в литературе (Calix et al. (2011) J Bacteriol. 193 (19): 5271-5278), общее количество O-ацетилирований в полисахариде 11А составляет приблизительно 2,6 О-ацетильных групп на одно повторяющееся звено полисахарида.

Сахариды серотипа 11А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Дополнительно они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы серотипа 11А S. pneumoniae могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 11А, полученный путем очистки полисахарида серотипа 11А из лизата S. pneumoniae и возможно подвергнутый изменению размера очищенного полисахарида, может характеризоваться различными свойствами, включающими, например, молекулярную массу (MW) и число мМ ацетата на один мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 11А.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 11А до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа.

В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

В одном воплощении изобретения размер очищенного полисахарида серотипа 11А уменьшают с помощью гомогенизации высокого давления. При гомогенизации высокого давления высокие скорости срезания достигаются за счет прокачки технологического потока через проточный канал достаточно малых размеров. Скорость срезания увеличивают за счет приложения более высокого давления гомогенизации, а время воздействия можно увеличить путем многократной циркуляции потока поступающего материала через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации высокого давления особенно целесообразен для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 11А, поскольку при этом сохраняются структурные признаки полисахарида, такие как присутствие О-ацетильных групп.

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 11А или в конъюгате полисахарида серотипа 11А с белком-носителем выражают в виде числа мМ ацетата на один мМ указанного полисахарида или в виде числа О-ацетильных групп на одно повторяющееся сахаридное звено.

В предпочтительном воплощении изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 11А имеют по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6 мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 11А.

1.2.5. Пневмококковый полисахарид серотипа 12F

Повторяющееся звено полисахарида серотипа 12F состоит из линейного трисахаридного каркаса (одной молекулы N-ацетилфукозамина (Fuc_pNAc), одной молекулы N-ацетилгалактозамина (Gal_pNAc) и одной молекулы N-ацетилманнуроновой кислоты (Man_pNAcA)) с двумя ветвями: боковой группировкой α-галактопиранозы (Gal_p), присоединенной при С3 Fuc_pNAc, и дисахаридной ветвью α-Glc_p-(1→2)-α-Glc_p, присоединенной при С3 Man_pNAcA (Leontein et al. (1983) Carbohydrate Research 114(2):257-266), как показано на Фиг. 4.

Штаммы серотипа 12F S. pneumoniae могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

Капсульные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 12F получают стандартными методиками, известными обычным специалистам в данной области техники. Обычно капсульные полисахариды получают путем выращивания каждого серотипа S. pneumoniae в среде (например, в среде на соевой основе), а затем получают полисахариды из культуры бактерий. Популяцию организма (S. pneumoniae серотипа 12F) масштабируют от посевного флакона до посевных бутылей и осуществляют пассажи через один или более чем один посевной ферментер увеличенного объема до достижения объемов ферментации промышленного масштаба. По окончании цикла выращивания клетки подвергают лизису, а затем лизатный бульон собирают для дальнейшей обработки (очистки) (см., например, WO 2006/110381 и WO 2008/118752, публикации заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и US 2008/0286838). Полисахариды обычно очищают посредством центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и/или колоночной хроматографии (см., например, WO 2006/110352 и WO 2008/118752).

Очищенные полисахариды серотипа 12F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы придать им способность к взаимодействию и впоследствии включать в гликоконъюгаты по изобретению, как дополнительно описано в данном документе.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 12F до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 300 кДа. В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 90 кДа до 250 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 100 кДа; от 70 кДа до 110 кДа; от 70 кДа до 120 кДа; от 70 кДа до 130 кДа; от 70 кДа до 140 кДа; от 70 кДа до 150 кДа; от 70 кДа до 160 кДа; от 80 кДа до 110 кДа; от 80 кДа до 120 кДа; от 80 кДа до 130 кДа; от 80 кДа до 140 кДа; от 80 кДа до 150 кДа; от 80 кДа до 160 кДа; от 90 кДа до 110 кДа; от 90 кДа до 120 кДа; от 90 кДа до 130 кДа; от 90 кДа до 140 кДа; от 90 кДа до 150 кДа; от 90 кДа до 160 кДа; от 100 кДа до 120 кДа; от 100 кДа до 130 кДа; от 100 кДа до 140 кДа; от 100 кДа до 150 кДа; от 100 кДа до 160 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

1.2.6. Пневмококковый полисахарид серотипа 15В

Как показано на Фиг. 5, повторяющееся звено полисахарида серотипа 15В состоит из разветвленного трисахаридного каркаса (одной молекулы N-ацетилглюкозамина (Glc_pNAc), одной молекулы галактопиранозы (Gal_p) и одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p)) с одной ветвью дисахарида αGal_p-βGal_p, присоединенной к С4-гидроксильной группе Glc_pNAc. Фосфоглицерин присоединен к С3-гидроксильной группе остатка βGal_p в дисахаридной ветви (Jones et al. (2005) Carbohydrate Research 340(3):403-409). Капсульный полисахарид из серотипа 15С имеет каркасную структуру, идентичную серотипу 15В, но О-ацетилирование отсутствует.

Полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Они могут быть также получены с использованием протоколов синтеза, известных специалистам в данной области техники.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 15В могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Американская коллекция типовых культур (АТСС, г. Манассас, штат Вирджиния, США) (например, штамм под депозитным номером АТСС10354)) или Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США) или из клинических образцов.

Бактериальные клетки выращивают в среде, предпочтительно в среде на соевой основе. После ферментации бактериальных клеток, продуцирующих капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипа 15В, бактериальные клетки подвергают лизису с получением клеточного лизата. Затем полисахарид серотипа 15В может быть выделен из клеточного лизата с использованием известных в данной области техники методик очистки, в том числе центрифугирования, глубинного фильтрования, осаждения, ультрафильтрации, обработки активированным углем, диафильтрации и/или колоночной хроматографии (см., например, публикации заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Затем очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В можно использовать для приготовления иммуногенных конъюгатов.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В, полученный путем очистки полисахарида серотипа 15В из лизата S. pneumoniae и возможно подвергнутый изменению размера очищенного полисахарида, может характеризоваться различными показателями, включающими, например, молекулярную массу (MW), число мМ ацетата на один мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и число мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

Предпочтительно для создания конъюгатов 15В с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами перед конъюгированием с белком-носителем выполняют изменение размера полисахарида до целевого диапазона молекулярной массы. Преимущественно размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают, при этом сохраняя критические признаки структуры полисахарида, такие как, например, присутствие О-ацетильных групп. П размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают с помощью механической гомогенизации.

В предпочтительном воплощении изобретения размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают с помощью гомогенизации высокого давления. При гомогенизации высокого давления высокие скорости срезания достигаются за счет прокачки технологического потока через проточный канал достаточно малых размеров. Скорость срезания увеличивают за счет приложения более высокого давления гомогенизации, а время воздействия можно увеличить путем многократной циркуляции потока поступающего материала через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации высокого давления особенно целесообразен для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 15В, поскольку при этом сохраняются структурные признаки полисахарида, такие как присутствие О-ацетильных групп.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450 кДа, от 100 кДа до 400 кДа и от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15B имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа. В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

Полисахарид серотипа 15В О-ацетилирован, и общее количество О-ацетилирований составляет приблизительно 0,8-0,9 О-ацетильных групп на одно повторяющееся звено полисахарида. Степень О-ацетилирования полисахарида можно определить любым способом, известным в данной области техники, например с помощью протонного ядерного магнитного резонанса (NMR) (см., например, Lemercinier et al. (1996) Carbohydrate Research 296: 83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30: 1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в публикации Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180: 249-261. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 15B или в конъюгате полисахарида серотипа 15В с белком-носителем выражают в виде числа мМ ацетата на один мМ указанного полисахарида или в виде числа О-ацетильных групп на одно повторяющееся сахаридное звено.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15B.

Присутствие глицерофосфатных боковых цепей определяют путем измерения глицерина с использованием высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим выявлением (HPAEC-PAD) после его высвобождения посредством обработки полисахарида фтористоводородной кислотой (HF). Присутствие глицерина в очищенном, выделенном или активированном полисахариде серотипа 15В или в конъюгате полисахарида серотипа 15В с белком-носителем выражают в виде числа мМ глицерина на один мМ полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 300 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 150 кДа до 350 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

1.2.7. Пневмококковый полисахарид серотипа 22F

Как показано на Фиг. 6, повторяющееся звено полисахарида серотипа 22F состоит из разветвленного пентасахаридного каркаса (одной молекулы глюкуроновой кислоты (Glс_pA), одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p), одной молекулы галактофуранозы (Gal_ƒ) и двух молекул рамнопиранозы (Rha_p)) с ветвью αGlc_p, присоединенной к С3-гидроксильной группе βRha_p (Richards et al. (1989) Canadian Journal of Chemistry 67(6): 1038-1050). Приблизительно 80% С2-гидроксильных групп остатка βRha_p в повторяющемся звене полисахарида О-ацетилированы.

Полисахариды серотипа 22F могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Дополнительно они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы S. pneumoniae серотипа 22F могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 22F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 22F из лизата S. pneumoniae и возможно подвергнутый изменению размера очищенного полисахарида, может характеризоваться различными показателями, включающими, например, молекулярную массу (MW) и число мМ ацетата на один мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

Предпочтительно для создания конъюгатов серотипа 22F с преимущественными характеристиками фильтруемости и/или выходами перед конъюгированием с белком-носителем выполняют изменение размера полисахарида до целевого диапазона молекулярной массы. Преимущественно размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают, при этом сохраняя критические признаки структуры полисахарида, такие как, например, присутствие О-ацетильной группы. Предпочтительно размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают путем механической гомогенизации.

В предпочтительном воплощении изобретения размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают путем гомогенизации высокого давления. При гомогенизации высокого давления высокие скорости срезания достигаются за счет прокачки технологического потока через проточный канал достаточно малых размеров. Скорость срезания увеличивают за счет приложения более высокого давления гомогенизации, а время воздействия можно увеличить путем многократной циркуляции потока поступающего материала через гомогенизатор.

Процесс гомогенизации высокого давления особенно целесообразен для уменьшения размера очищенного полисахарида серотипа 22F, поскольку при этом сохраняются структурные признаки полисахарида, такие как присутствие О-ацетильных групп.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 22F до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 400 кДа до 700 кДа.

В следующих воплощениях изобретения капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа; и подобные желаемые диапазоны молекулярной массы. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе выше, перед конъюгированием полисахарид 22F можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

Степень О-ацетилирования полисахарида можно определить любым способом, известным в данной области техники, например с помощью протонного NMR (Lemercinier et al. (1996) Carbohydrate Research 296:83-96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical и Biomedical Analysis 30:1233-1247; WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в публикации Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 22F или в конъюгате полисахарида серотипа 22F с белком-носителем выражают в виде числа мМ ацетата на один мМ указанного полисахарида или в виде числа О-ацетильных групп на одно повторяющееся звено полисахарида.

В предпочтительном воплощении изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 22F имеют по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6 мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

1.2.8. Пневмококковый полисахарид серотипа 33F

Как показано на Фиг. 7, повторяющееся звено полисахарида серотипа 33F состоит из разветвленного пентасахаридного каркаса (двух молекул галактопиранозы (Gal_p), двух молекул галактофуранозы (Gal_ƒ) и одной молекулы глюкопиранозы (Glc_p) с концевой группировкой αGal_p, присоединенной к С2-гидроксильной группе остатка αGal_p внутри каркаса (Lemercinier et al. (2006) Carbohydrate Research 341(1):68-74). В литературе описано, что С2-гидроксильная группа остатка 3-β-Gal_ƒ каркаса О-ацетилирована.

Полисахариды серотипа 33F могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Дополнительно они могут быть получены с использованием протоколов синтеза.

Штаммы серотипа 33F S. pneumoniae могут быть получены из установленных коллекций культур (таких как, например, Референтная лаборатория стрептококковых инфекций (Streptococcal Reference Laboratory) (Центры контроля и профилактики заболеваний, г. Атланта, штат Джорджия, США)) или клинических образцов.

Очищенные полисахариды серотипа 33F могут быть активированы (например, химически активированы), чтобы придать им способность к взаимодействию и впоследствии включать в гликоконъюгаты по изобретению, как дополнительно описано в данном документе.

Выделенный капсульный полисахарид серотипа 33F, полученный путем очистки полисахарида серотипа 33F из лизата S. pneumoniae и возможно подвергнутый изменению размера очищенного полисахарида, может характеризоваться различными показателями, включающими, например, молекулярную массу и число мМ ацетата на один мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

В некоторых воплощениях изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 33F до конъюгирования имеют молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В ходе обычных процедур очистки размер полисахарида может слегка уменьшиться. Дополнительно, как описано в настоящем документе, перед конъюгированием полисахарид можно подвергать методикам изменения размера. Указанные выше диапазоны молекулярной массы относятся к очищенным полисахаридам до конъюгирования (например, до активации) после конечной стадии изменения размера.

Присутствие О-ацетила в очищенном, выделенном или активированном капсульном полисахариде серотипа 33F или в конъюгате полисахарида серотипа 33F с белком-носителем выражают в виде числа мМ ацетата на один мМ указанного полисахарида или в виде числа О-ацетильных групп на одно повторяющееся звено полисахарида.

В предпочтительном воплощении изобретения очищенные полисахариды из S. pneumoniae серотипа 33F имеют по меньшей мере 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 или 1,6 мкмоль ацетата на мкмоль указанного капсульного полисахарида серотипа 33F.

1.3. Гликоконъюгаты по изобретению

Очищенные сахариды активируют химически с получением сахаридов, способных к взаимодействию с белком-носителем (то есть активированных сахаридов). После активации каждый капсульный сахарид индивидуально конъюгируют с белком-носителем с образованием гликоконъюгата. В одном воплощении изобретения каждый капсульный сахарид конъюгируют с одним и тем же белком-носителем. Химическая активация сахаридов и последующее конъюгирование с белком-носителем могут быть достигнуты способами активации и конъюгирования, раскрытыми в настоящем документе.

1.3.1. Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F

Капсульные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F получают стандартными методиками, известными обычным специалистам в данной области техники (см., например, WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352 и публикации заявок на патенты США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2008/0102498 и 2008/0286838).

В одном воплощении изобретения полисахариды активируют 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDАР) с образованием цианатного сложного эфира. Затем активированный полисахарид подвергают сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе (предпочтительно CRM₁₉₇). Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с белком-носителем, активированным малеимидом (например, с использованием сложного эфира N-[γ-малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS)), или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, N-сукцинимидилбромацетата (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB), сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоата (сульфо-SIAB), N-сукцинимидилйодацетата (SIA) или сукцинимидил-3-[бромацетамидо]пропионата (SBAP)). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇), с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид) или EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид)) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках конъюгирования используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS (сульфо-N-гидроксисульфосукцинимид), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид), TSTU (N,N,N',N'-тетраметил-O-(N-сукцинимидил)урония тетрафторборат). Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218: 509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере один из капсульных полисахаридов из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования (как описано в публикациях заявок на патенты США №№2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 и 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653 и WO 2008/143709). В предпочтительном воплощении изобретения все капсульные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.

Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата. Перед окислением полисахарид возможно подвергают гидролизу. Можно применять механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. В стадии окисления может быть задействовано взаимодействие с перйодатом. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия).

В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид из S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F или 23F окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии перйодата натрия (NaIO₄). В другом воплощении изобретения капсульные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида полисахарид считают активированным и далее в настоящем документе обозначают как «активированный полисахарид». Активированный полисахарид и белок-носитель можно лиофилизировать (высушить сублимационной сушкой) либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо.

В одном воплощении изобретения лиофилизацию выполняют в присутствии невосстанавливающего сахара, и возможные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, раффинозу, стахиозу, мелезитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования состоит в восстановлении активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (так называемом восстановительном аминировании) с использованием восстанавливающего агента. Подходящие восстанавливающие агенты включают цианоборгидриды, такие как цианоборгидрид натрия, боран-пиридин или боргидридная ионообменная смола. В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом воплощении изобретения реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в растворителе, представляющем собой DMSO (диметилсульфоксид) или DMF (диметилформамид). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно кэпировать с использованием подходящего кэпирующего агента. В одном воплощении изобретения этот кэпирующий агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄). После конъюгирования (реакции восстановления и возможно кэпирования) гликоконъюгаты можно очищать. Гликоконъюгаты можно очищать путем диафильтраии и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты очищают путем диафильтраии и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты стерилизуют фильтрованием.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 9V и/или 18С содержат сахарид, имеющий степень О-ацетилирования от 10% до 100%, от 20% до 100%, от 30% до 100%, от 40% до 100%, от 50% до 100%, от 60% до 100%, от 70% до 100%, от 75% до 100%, от 80% до 100%, от 90% до 100%, от 50% до 90%, от 60% до 90%, от 70% до 90% или от 80% до 90%. В других воплощениях изобретения степень О-ацетилирования составляет не менее 10%, не менее 20%, не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90%, либо приблизительно 100%.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 9V и/или 18С по изобретению О-ацетилирован. В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 9V О-ацетилирован, а гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С де-О-ацетилирован.

1.3.2 Гликоконъюгаты из S. pneumoniae серотипа 22F

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 22F получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDАР) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDАР) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 22F по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя (например, CRM₁₉₇) с образованием конъюгата.

Предпочтительно до окисления выполняют изменение размера полисахарида серотипа 22F до целевой молекулярной массы (MW). Преимущественно размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают, при этом сохраняя критические признаки структуры полисахарида, такие как, например, присутствие О-ацетильных групп. Предпочтительно размер очищенного полисахарида серотипа 22F уменьшают с помощью механической гомогенизации (см. раздел 1.2.7 выше).

В одном воплощении изобретения полисахарид данного серотипа активируют (окисляют) способом, включающим стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 22F с окисляющим агентом; и

(б) гашение реакции окисления добавлением гасящего агента с получением в результате активированного полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой перйодат. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия). В предпочтительном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой перйодат натрия. В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой метаперйодат. В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 22F, представляет собой метаперйодат натрия.

В одном воплощении изобретения гасящий агент выбран из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глутатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном воплощении изобретения гасящий агент выбран из натриевых и калиевых солей сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких воплощениях изобретения указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина и гистидина.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой соединение, содержащие две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

где каждый из R¹ и R² независимо выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол или аскорбиновую кислоту. В предпочтительном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный полисахарид серотипа 22F активируют способом, включающим стадии:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 22F с перйодатом; и

(б) гашение реакции окисления добавлением бутан-2,3-диола с получением в результате активированного полисахарида серотипа 22F.

После стадии окисления полисахарида этот полисахарид считают активированным и далее в настоящем документе обозначают как «активированный полисахарид».

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F подвергают очистке. Активированный полисахарид серотипа 22F подвергают очистке в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, такими как гельпроникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный полисахарид серотипа 22F очищают путем концентрирования и диафильтрации, используя устройство для диафильтрации.

В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30 или от 20 до 25. В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного полисахарида серотипа 22F составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22 или от 18 до 20.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 25 кДа до 1000 кДа, от 100 кДа до 1000 кДа, от 300 кДа до 800 кДа, от 300 кДа до 700 кДа, от 300 кДа до 600 кДа, от 400 кДа до 1000 кДа, от 400 кДа до 800 кДа, от 400 кДа до 700 кДа или от 400 кДа до 600 кДа. В одном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 300 кДа до 800 кДа. В одном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа и степень окисления от 10 до 25, от 10 до 20, от 12 до 20 или от 14 до 18. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 600 кДа и степень окисления от 10 до 20.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7, или приблизительно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 800 кДа, степень окисления от 12 до 20 и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель можно лиофилизировать (высушить сублимационной сушкой) либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация).

В одном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 22F лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. В одном воплощении изобретения лиофилизированный активированный полисахарид впоследствии объединяют с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В таких воплощениях изобретения активированный полисахарид серотипа 22F объединяют с белком-носителем и лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель можно впоследствии ресуспендировать в растворе и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования состоит в восстановлении активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительном аминировании) с использованием восстанавливающего агента.

Активированный полисахарид серотипа 22F можно конъюгировать с белком-носителем способом, включающим стадии:

(в) объединение активированного полисахарида серотипа 22F с белком-носителем; и

(г) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 22F и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарида серотипа 22F и белка-носителя.

В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в водном растворителе. В другом воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в апротонном растворителе. В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в растворителе, представляющем собой DMSO (диметилсульфоксид) или DMF (диметилформамид). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

Конъюгирование активированного полисахарида серотипа 22F с белком-носителем путем восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (DMSO) является подходящим для сохранения содержания О-ацетила полисахарида по сравнению, например, с восстановительным аминированием в водной фазе, где уровень О-ацетилирования полисахарида может быть значительно снижен. Поэтому в предпочтительном воплощении изобретения стадию (в) и стадию (г) проводят в DMSO.

В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия, боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминбораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeⁱPrN-ВН₃, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридинборан (РЕМВ). В предпочтительном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно кэпировать с использованием подходящего кэпирующего агента. В одном воплощении изобретения этот кэпирующий агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 22F с белком-носителем гликоконъюгат можно подвергать очистке (обогащению в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) с помощью ряда методик, известных специалистам в данной области техники. Эти методики включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование с тангенциальным потоком, осаждение/элюцию, колоночную хроматографию (DEAE (на диэтиламиноэтилцеллюлозе) или гидрофобную хроматографию) и глубинное фильтрование.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 22F по настоящему изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 800 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 200 кДа до 600 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300 кДа; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 22F получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F по изобретению имеет молекулярную массу от 400 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 8000 кДа; или от 3000 кДа до 5000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. Еще в других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В дополнительных воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа, от 3000 кДа до 10000 кДа, от 3000 кДа до 7500 кДа, от 3000 кДа до 5000 кДа, от 4000 кДа до 20000 кДа, от 4000 кДа до 15000 кДа, от 4000 кДа до 12500 кДа, от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа.

В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа, от 5000 кДа до 15000 кДа, от 5000 кДа до 10000 кДа, от 5000 кДа до 7500 кДа, от 6000 кДа до 20000 кДа, от 6000 кДа до 15000 кДа, от 6000 кДа до 12500 кДа, от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют посредством SEC-MALLS. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7, или приблизительно 0,8 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 22F.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

Другим путем характеризации гликоконъюгатов серотипа 22F по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования). Доказательство модификации лизина белка-носителя за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование приводит к уменьшению числа восстановленных остатков лизина по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, используемым для получения материалов конъюгата. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 22F по изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 22F по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 22F по изобретению составляет от 4 до 7. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 22F по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях изобретения отношение полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В других воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В дополнительных воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 22F и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 40% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 25% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 15% свободного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 22F.

Гликоконъюгаты серотипа 22F могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B). Для профилирования распределения молекулярного размера конъюгатов используют эксклюзионную хроматографию (SEC) на колонках с подачей самотеком. Большие молекулы, вытесняемые из пор в средах, элюируют быстрее, чем малые молекулы. Для сбора элюата с колонки используют коллекторы фракций. Фракции тестируют колориметрически посредством анализа сахаридов. Для определения K_d колонки калибруют, чтобы установить фракцию (V₀), в которой молекулы полностью вытесняются (K_d равно 0), и фракцию (V_i), в которой представлено максимальное удерживание (K_d равно 1). Фракцию (V_e), в которой достигается заданное свойство образца, соотносят с K_d согласно уравнению K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 30% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 40% гликоконъюгата характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 80% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 65% до 80% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

1.3.3. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 33F

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 33F получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDАР) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 33F по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. В таком воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 33F по изобретению могут быть получены с использованием восстановительного аминирования в водной фазе (RAC/водная фаза). Восстановительное аминирование в водной фазе успешно применяли для получения конъюгированной пневмококковой вакцины (см., например, WO 2006/110381). Правда, при использовании восстановительного аминирования предпочтительно получать гликоконъюгаты серотипа 33F посредством восстановительного аминирования в DMSO (RAC/DMSO). В свете проблем, связанных с сохранением О-ацетильной функциональной группы при использовании процесса RAC/водная фаза, предпочтительно восстановительное аминирование в DMSO. RAC/DMSO успешно применяли для получения пневмококковой конъюгатной вакцины (см., например, WO 2006/110381).

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 33F по изобретению получают, используя конъюгирование еТЕС (далее в настоящем документе «еТЕС-связанные гликоконъюгаты серотипа 33F»), как описано в примерах 1, 2 и 3 и в WO 2014/027302. Указанные гликоконъюгаты 33F содержат сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем посредством одного или более спейсеров еТЕС, где сахарид ковалентно конъюгирован со спейсером еТЕС посредством карбаматной связи и где белок-носитель ковалентно конъюгирован со спейсером еТЕС посредством амидной связи. еТЕС-связанные гликоконъюгаты по изобретению могут быть представлены общей формулой (III):

где атомы, составляющие спейсер еТЕС, находятся в прямоугольнике в центре.

Спейсер еТЕС включает семь линейных атомов (то есть -C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(O)-) и обеспечивает стабильные тиоэфирные и амидные связи между сахаридом и белком-носителем. Синтез еТЕС-связанного гликоконъюгата включает взаимодействие активированной гидроксильной группы сахарида с аминогруппой тиоалкиламинного реагента, например цистамин или цистеинамин или его соль, с образованием карбаматной связи с сахаридом с получением тиолированного сахарида. Образование одной или более свободных сульфгидрильных групп выполняют путем взаимодействия с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида. В результате взаимодействия свободных сульфгидрильных групп активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, имеющим одну или более α-галогенацетамидных групп на аминсодержащих остатках образует тиоэфирную связь с образованием конъюгата, где белок-носитель присоединяется к еТЕС-спейсеру посредством амидной связи.

В гликоконъюгатах серотипа 33F по изобретению сахарид может представлять собой полисахарид или олигосахарид. Белок-носитель может быть выбран из любого подходящего носителя, описанного в настоящем документе или известного специалистам в данной области техники. В частых воплощениях изобретения сахарид представляет собой полисахарид. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких воплощениях еТЕС-связанный гликоконъюгат содержит капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 33F.

В особенно предпочтительных воплощениях изобретения еТЕС-связанный гликоконъюгат содержит капсульный полисахарид Pn-33F, ковалентно конъюгированный с CRM₁₉₇ посредством еТЕС-спейсера (еТЕС-связанные гликоконъюгаты серотипа 33F).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 33F по настоящему изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F по изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; от 2000 кДа до 3000 кДа; от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа; от 3000 кДа до 12500 кДа; от 3000 кДа до 10000 кДа; от 3000 кДа до 9000 кДа; от 3000 кДа до 8000 кДа; от 3000 кДа до 7000 кДа; от 3000 кДа до 6000 кДа; от 3000 кДа до 5000 кДа или от 3000 кДа до 4000 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

Другим способом характеризации гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования).

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 33F по изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 33F по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или приблизительно 20. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 33F по изобретению составляет от 4 до 16. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В предпочтительном воплощении изобретения белок-носитель включает CRM₁₉₇, содержащий 39 остатков лизина. В некоторых таких воплощениях CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от приблизительно 10% до приблизительно 41% остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком воплощении CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого показателя состоит в том, что от приблизительно 5% до приблизительно 50% остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых таких воплощениях CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15 или приблизительно 16 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом.

В частых воплощениях изобретения белок-носитель ковалентно конъюгирован с еТЕС-спейсером посредством амидной связи с одной или более ε-аминогрупп остатков лизина на белке-носителе. В некоторых таких воплощениях белок-носитель содержит от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких воплощениях белок-носитель содержит от 4 до 16 остатков лизина, ковалентно конъюгированных с сахаридом.

Гликоконъюгаты серотипа 33F по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 1,0 до 2,5. В следующих воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,4 до 1,7. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Частота присоединения цепи сахарида к остатку лизина на белке-носителе является другим параметром для характеризации гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению. Например, в некоторых воплощениях изобретения по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается через каждые 4 повторяющихся сахаридных звена полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 15 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В следующем воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

В частых воплощениях изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇ и ковалентная связь через спейсер еТЕС между CRM₁₉₇ и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

В других воплощениях изобретения конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-9 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-15 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-6 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-20 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-25 повторяющихся сахаридных звеньев или на каждые 2-25 повторяющихся сахаридных звеньев. В частых воплощениях изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом воплощении изобретения по меньшей мере одна связь между белком-носителем и сахаридом встречается на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В одном воплощении изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

Важным аспектом в отношении конъюгирования является разработка условий, позволяющих сохранять потенциально чувствительные несахаридные функциональные группы заместителей отдельных компонентов, такие как О-ацильные, фосфатные или глицерофосфатные боковые цепи, которые могут входить в состав сахаридного эпитопа.

В одном воплощении изобретении гликоконъюгаты серотипа 33F по изобретению содержат сахарид, имеющий степень О-ацетилирования от 10% до 100%. В некоторых таких воплощениях изобретения сахарид имеет степень О-ацетилирования от 50% до 100%. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%. В дополнительных воплощениях изобретения сахарид имеет степень О-ацетилирования, большую или равную 70% (не менее 70%).

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 33F по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7, или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9.

Гликоконъюгаты серотипа 33F и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. Предпочтительно гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее чем приблизительно 25% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее чем приблизительно 15% свободного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 33F.

В некоторых предпочтительных воплощениях в изобретении предложен гликоконъюгат серотипа 33F, обладающий одним или более чем одним из следующих признаков, отдельно или в комбинации: полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа; гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа; белок-носитель содержит от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом; отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0; гликоконъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида; сахарид имеет степень О-ацетилирования от 75% до 100%; конъюгат содержит менее чем приблизительно 15% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида; белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 33F могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата, как упомянуто выше, можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B).

В одном воплощении изобретения по меньшей мере 15% гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4В. В воплощении изобретения по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% гликоконъюгатов серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 35% гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительных воплощениях изобретения по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 70%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В одном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В одном воплощении изобретения по меньшей мере 70% гликоконъюгатов серотипа 33F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

1.3.4. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 15В

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 15В получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или гало генацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254: 2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218: 509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 15В по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

Предпочтительно до окисления выполняют изменение размера полисахарида серотипа 15В до целевой молекулярной массы (MW). Преимущественно размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают, при этом сохраняя критические признаки структуры полисахарида, такие как, например, присутствие О-ацетильных групп. Предпочтительно размер очищенного полисахарида серотипа 15В уменьшают путем механической гомогенизации (см. раздел 1.2.6 выше).

В стадии окисления может быть задействовано взаимодействие с перйодатом. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия). В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой метаперйодат. В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления капсульного полисахарида серотипа 15В, представляет собой метаперйодат натрия.

В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с 0,01-10,0, 0,05-5,0, 0,1-1,0, 0,5-1,0, 0,7-0,8, 0,05-0,5, 0,1-0,3 молярных эквивалентов окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 молярных эквивалентов окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с приблизительно 0,15 молярного эквивалента окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с приблизительно 0,25 молярного эквивалента окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с приблизительно 0,5 молярного эквивалента окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с приблизительно 0,6 молярного эквивалента окисляющего агента. В предпочтительном воплощении изобретения полисахарид подвергают взаимодействию с приблизительно 0,7 молярного эквивалента окисляющего агента.

В предпочтительном воплощении изобретения продолжительность взаимодействия составляет от 1 часа до 50 часов, от 10 часов до 30 часов, от 15 часов до 20 часов, от 15 часов до 17 часов или приблизительно 16 часов.

В предпочтительном воплощении изобретения температуру реакции поддерживают от 15°С до 45°С, от 15°С до 30°С, от 20°С до 25°С. В предпочтительном воплощении изобретения поддерживают температуру реакции приблизительно 23°С.

В предпочтительном воплощении изобретения реакцию окисления проводят в буфере, выбранном из фосфата натрия, фосфата калия, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) или бис-трис. В предпочтительном воплощении изобретения буфер представляет собой фосфат калия.

В предпочтительном воплощении изобретения буфер имеет концентрацию от 1 мМ до 500 мМ; от 1 мМ до 300 мМ или от 50 мМ до 200 мМ. В предпочтительном воплощении изобретения буфер имеет концентрацию приблизительно 100 мМ.

В предпочтительном воплощении изобретения реакцию окисления проводят при рН от 4,0 до 8,0, от 5,0 до 7,0 или от 5,5 до 6,5. В предпочтительном воплощении изобретения рН составляет приблизительно 6,0.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В получают путем взаимодействия от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл изолированного капсульного полисахарида серотипа 15В с 0,2-0,3 молярного эквивалента перйодата при температуре от 20°С до 25°С.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В подвергают очистке. Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В подвергают очистке в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, такими как гельпроникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный капсульный полисахарид очищают путем концентрирования и диафильтрации, используя устройство для диафильтрации.

В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15В составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 20, от 10 до 15 или от 15 до 20. В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного капсульного полисахарида серотипа 15 В составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 12, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18 или от 18 до 20.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 5 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 500 кДа, от 50 кДа до 450 кДа, от 100 кДа до 400 кДа, от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 350 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 300 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В имеет молекулярную массу от 100 кДа до 250 кДа и содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В и по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ указанного капсульного полисахарида серотипа 15В.

В одном воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. Лиофилизированный активированный капсульный полисахарид можно впоследствии объединять с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом воплощении изобретения активированный капсульный полисахарид серотипа 15В объединяют с белком-носителем и лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель можно впоследствии ресуспендировать в растворе и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Активированный капсульный полисахарид серотипа 15В можно конъюгировать с белком-носителем способом, включающим стадии:

(а) объединение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем; и

(б) взаимодействие смеси активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя.

Конъюгирование активированного капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем путем восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде (DMSO) является подходящим для сохранения содержания О-ацетила полисахарида по сравнению, например, с восстановительным аминированием в водном растворе, где уровень О-ацетилирования полисахарида значительно снижается. В предпочтительном воплощении изобретения стадию (а) и стадию (б) проводят в DMSO.

В предпочтительном воплощении изобретения стадия (а) включает растворение лиофилизированного капсульного полисахарида серотипа 15В в растворе, содержащем белок-носитель и DMSO. В предпочтительном воплощении изобретения стадия (а) включает растворение совместно лиофилизированных капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя в DMSO.

При выполнении стадий (а) и (б) в водном растворе стадии (а) и (б) проводят в буфере, предпочтительно выбранном из забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), MES, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), Bis-tris, ADA (N-(2-ацетамидо)иминодиуксусная кислота), PIPES (1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота), MOPSO (3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновая кислота), BES (N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), DIPSO (3-(N,N-бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновая кислота), MOBS (4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота), HEPPSO (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пиперазин-N,N'-бис(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), TEA (триэтиламин), EPPS (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновая кислота), бицина или НЕРВ (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфоновая кислота)), с рН от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,0 до 7,5. В предпочтительном воплощении изобретения буфер представляет собой PBS. В предпочтительном воплощении изобретения рН составляет приблизительно 7,3.

В предпочтительном воплощении изобретения концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (б) составляет от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, от 0,5 мг/мл до 5 мг/мл или от 0,5 мг/мл до 2 мг/мл. В предпочтительном воплощении изобретения концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа 15В на стадии (б) составляет приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мг/мл.

В предпочтительном воплощении изобретения исходное вводимое соотношение (масс./масс.) активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1 или от 0,6:1 до 1:1.

В предпочтительном воплощении изобретения исходное вводимое соотношение (масс/масс.) активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя составляет от приблизительно 0,6:1 до 1:1. В другом предпочтительном воплощении изобретения исходное вводимое соотношение (масс./масс.) активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя составляет от приблизительно 0,6:1 до 1,5:1. Такое исходное вводимое отношение является особенно подходящим для получения низких уровней свободного полисахарида в гликоконъюгате.

В предпочтительном воплощении изобретения исходное вводимое соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя составляет приблизительно 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 или 2:1.

В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия, боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминбораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН3, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридинборан (РЕМВ). В предпочтительном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия. В предпочтительном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой 2-пиколинборан натрия.

В предпочтительном воплощении изобретения количество восстанавливающего агента, используемого на стадии (б), составляет от приблизительно 0,1 до 10,0 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов или от 1,0 до 2,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном воплощении изобретения количество восстанавливающего агента, используемого на стадии (б), составляет приблизительно 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 молярных эквивалента.

В предпочтительном воплощении изобретения продолжительность стадии (б) составляет от 1 часа до 60 часов, от 10 часов до 50 часов, от 40 часов до 50 часов или от 42 до 46 часов. В предпочтительном воплощении изобретения продолжительность стадии (б) составляет приблизительно 44 часов.

В предпочтительном воплощении изобретения температуру реакции на стадии (б) поддерживают от 10°С до 40°С, от 15°С до 30°С или от 20°С до 26°С. В предпочтительном воплощении изобретения на стадии (б) поддерживают температуру реакции приблизительно 23°С.

В предпочтительном воплощении изобретения способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно включает стадию (стадию (в)) кэпирования (гашения) непрореагировавшего альдегида посредством добавления NaBH₄.

В предпочтительном воплощении изобретения количество NaBH₄, используемого на стадии (в), составляет от 0,1 до 10 молярных эквивалентов, от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов или от 1,0 до 3,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном воплощении изобретения количество NaBH₄, используемого на стадии (в), составляет приблизительно 2,0 молярных эквивалента.

В предпочтительном воплощении изобретения продолжительность стадии (в) составляет от 0,1 часа до 10 часов, от 0,5 часа до 5 часов или от 2 до 4 часов. В предпочтительном воплощении изобретения продолжительность стадии (в) составляет приблизительно 3 часа.

В предпочтительном воплощении изобретения температуру реакции на стадии (в) поддерживают от 15°С до 45°С, от 15°С до 30°С или от 20°С до 26°С. В предпочтительном воплощении изобретения поддерживают температуру реакции на стадии (в) приблизительно 23°С.

В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования составляет более 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования (стадии (б)) составляет более 60%. В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования (стадии (б)) составляет более 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате ×100/количество активированного полисахарида, используемое на стадии конъюгирования.

В предпочтительном воплощении изобретения способ получения гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с белком-носителем, включает стадии:

(а) изменение размера очищенного полисахарида серотипа 15В путем гомогенизации высокого давления;

(б) взаимодействие полисахарида серотипа 15В измененного размера с окисляющим агентом;

(в) объединение активированного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем;

(г) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарида серотипа 15В и белка-носителя; и

(д) кэпирование (гашение) непрореагировавшего альдегида добавлением NaBH₄.

В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования (стадии (г)) описанного выше способа составляет более 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%. В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования (стадии (г)) составляет более 60%. В предпочтительном воплощении изобретения выход стадии конъюгирования (стадии (г)) составляет более 70%. Выход представляет собой количество полисахарида серотипа 15В в конъюгате ×100/количество активированного полисахарида, используемое на стадии конъюгирования.

После конъюгирования капсульного полисахарида серотипа 15В с белком-носителем конъюгат полисахарида с белком-носителем можно подвергать очистке (обогащению в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) с помощью ряда методик, известных специалистам в данной области техники. Эти методики включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование с тангенциальным потоком, осаждение/элюцию, колоночную хроматографию (DEAE или гидрофобную хроматографию) и глубинное фильтрование.

В одном воплощении изобретения белок-носитель является таким, как определено в разделе 1.1. В одном воплощении изобретения белок-носитель выбран из группы, состоящей из: DT (дифтерийного токсина), ТТ (столбнячного анатоксина), CRM₁₉₇, других мутантов DT, PD (белок D Haemophilus influenzae) или их иммунологически функциональных эквивалентов. В одном воплощении изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 15В по настоящему изобретению конъюгированы с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 5 кДа до 1500 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 1500 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 250 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 250 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; от 200 кДа до 500 кДа или от 200 кДа до 400 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения. В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа, от 5000 кДа до 10000 кДа, от 5000 кДа до 20000 кДа, от 8000 кДа до 20000 кДа, от 8000 кДа до 16000 кДа или от 10000 кДа до 16000 кДа.

В других таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению имеет молекулярную массу приблизительно 1000 кДа; приблизительно 1500 кДа, приблизительно 2000 кДа; приблизительно 2500 кДа, приблизительно 3000 кДа, приблизительно 3500 кДа, приблизительно 4000 кДа, приблизительно 4500 кДа, приблизительно 5000 кДа, приблизительно 5500 кДа, приблизительно 6000 кДа, приблизительно 6500 кДа, приблизительно 7000 кДа, приблизительно 7500 кДа, приблизительно 8000 кДа, приблизительно 8500 кДа, приблизительно 9000 кДа, приблизительно 9500 кДа, приблизительно 10000 кДа, приблизительно 10500 кДа, приблизительно 11000 кДа, приблизительно 11500 кДа, приблизительно 12000 кДа, приблизительно 12500 кДа, приблизительно 13000 кДа, приблизительно 13500 кДа, приблизительно 14000 кДа, приблизительно 14500 кДа, приблизительно 15000 кДа, приблизительно 15500 кДа, приблизительно 16000 кДа, приблизительно 16500 кДа, приблизительно 17000 кДа, приблизительно 17500 кДа, приблизительно 18000 кДа, приблизительно 18500 кДа, приблизительно 19000 кДа, приблизительно 19500 кДа или приблизительно 20000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 3000 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа, от 3000 кДа до 10000 кДа, от 3000 кДа до 7500 кДа, от 3000 кДа до 5000 кДа, от 3000 кДа до 4000 кДа, от 4000 кДа до 20000 кДа, от 4000 кДа до 15000 кДа, от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа, от 5000 кДа до 15000 кДа, от 5000 кДа до 10000 кДа, от 5000 кДа до 7500 кДа, от 6000 кДа до 20000 кДа, от 6000 кДа до 15000 кДа, от 6000 кДа до 12500 кДа, от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют посредством SEC-MALLS. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения. В одном воплощении изобретения указанные гликоконъюгаты серотипа 15В получают с использованием восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 15В по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,4 до 2. В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5, от 1,0 до 2,0. В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 15В к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,7 до 0,9.

Гликоконъюгаты серотипа 15В и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15 В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит менее чем приблизительно 25% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит менее чем приблизительно 20% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 15В по изобретению содержат менее чем приблизительно 15% свободного капсульного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В.

Гликоконъюгаты серотипа 15В могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата, как упомянуто выше, можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 20% гликоконъюгатов серотипа 15В по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 30% иммуногенного конъюгата характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 40% гликоконъюгатов серотипа 15В по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 15В характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгатов серотипа 15В по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 70% гликоконъюгатов серотипа 15В по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 15В характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 15В характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 15В характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит по меньшей мере 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит по меньшей мере 0,6 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 15В по изобретению содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

Другим способом характеризации гликоконъюгатов серотипа 15В по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования). Доказательство модификации лизина белка-носителя за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование приводит к уменьшению числа восстановленных остатков лизина по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, используемым для получения материалов конъюгата.

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 15В по изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 15В по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 15В по изобретению составляет от 2 до 5.

1.3.5. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F

В гликоконъюгатах S. pneumoniae серотипа 12F по настоящему изобретению сахарид выбран из группы, состоящей из полисахарида и олигосахарида, а белок-носитель выбран из любого приемлемого носителя, описанного в настоящем документе или известного специалистам в данной области техники. В некоторых предпочтительных воплощениях изобретения сахарид представляет собой полисахарид S. pneumoniae серотипа 12F.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F получают, используя CDAP. Полисахариды активируют 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Затем активированный полисахарид подвергают сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе (предпочтительно CRM₁₉₇). Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе.

В других методиках конъюгирования используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В одном воплощении изобретения капсульные полисахариды из S. pneumoniae серотипов 12F конъюгируют с белком-носителем посредством восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

До окисления полисахарид серотипа 12F возможно подвергают гидролизу (изменение размера). Можно использовать механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты.

В одном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой перйодат. Термин «перйодат» включает в себя как перйодат, так и перйодную кислоту (см. ниже).

В предпочтительном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой свободный радикал 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимид (NCS) в качестве соокислителя. В таком воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F получают, используя свободный радикал 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) для окисления первичных спиртов сахарида до альдегидов, используя N-хлорсукцинимид (NCS) в качестве соокислителя (далее в настоящем документе «окисление ТЕМРО/NCS») так, как описано в примере 7 и в WO 2014/097099. Таким образом, в одном аспекте гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F могут быть получены способом, включающим стадии: (а) взаимодействия сахарида 12F с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе с получением активированного сахарида; и (б) взаимодействия активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогрупп (далее в настоящем документе «ТЕМРО/NCS-восстановительное аминирование»). В одном аспекте гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F получают указанным способом. В одном воплощении изобретения степень окисления активированного сахарида 12F находится в диапазоне от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 5, от 3 до 40, от 3 до 30, от 3 до 20, от 3 до 10, от 4 до 40, от 4 до 30, от 4 до 20, от 4 до 10, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 10, от 6 до 50, от 6 до 40, от 6 до 30, от 6 до 20, от 6 до 15, от 6 до 14, от 6 до 13, от 6 до 12, от 6 до 11, от 6 до 10, от 7 до 40, от 7 до 30, от 7 до 20, от 7 до 15, от 7 до 14, от 7 до 13, от 7 до 12, от 7 до 11, от 7 до 10, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 20, от 8 до 15, от 8 до 14, от 8 до 13, от 8 до 12, от 8 до 11, от 8 до 10, от 9 до 40, от 9 до 30, от 9 до 20, от 9 до 15, от 10 до 40, от 10 до 30, от 10 до 20 или от 10 до 15. В следующем аспекте степень окисления активированного сахарида составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39 или 40. Предпочтительно белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения до стадии (а) сахарид 12F претерпевает гидролиз до молекулярной массы в диапазоне от 100 кДа до 400 кДа. Например, в одном аспекте изобретения молекулярная масса находится в диапазоне от 100 кДа до 350 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа, от 100 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 150 кДа, от 200 кДа до 400 кДа, от 200 кДа до 350 кДа, от 200 кДа до 300 кДа, от 200 кДа до 250 кДа, от 300 кДа до 400 кДа или от 300 кДа до 350 кДа.

В следующем аспекте изобретения способ дополнительно включает стадию очистки активированного полисахарида до стадии (б). В следующем аспекте изобретения способы дополнительно включают стадию добавления восстанавливающего агента после стадии (б). В одном аспекте изобретения восстанавливающий агент представляет собой NaCNBH₃. В следующем аспекте изобретения способы дополнительно включают стадию добавления NaBH₄ после добавления NaCNBH₃. В следующем аспекте изобретения способ включает стадию очистки после добавления NaBH₄.

В другом аспекте в настоящем описании предложен гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F, который получен или может быть получен любым из описанных выше способов. Например, в одном аспекте настоящего описания предложен гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем, который получен или может быть получен способом, включающим стадии: (а) взаимодействие сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в водном растворителе с получением активированного сахарида; и (б) взаимодействие активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогрупп.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F по настоящему изобретению имеет молекулярную массу от приблизительно 50 кДа до приблизительно 20000 кДа. В другом воплощении изобретения гликоконъюгат имеет молекулярную массу от приблизительно 200 кДа до приблизительно 10000 кДа. В другом воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 500 кДа до приблизительно 5000 кДа. В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 3000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F имеет молекулярную массу от приблизительно 600 кДа до приблизительно 2800 кДа, от приблизительно 700 кДа до приблизительно 2700 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 2000 кДа, от приблизительно 1800 кДа до приблизительно 2500 кДа, от приблизительно 1100 кДа до приблизительно 2200 кДа, от приблизительно 1900 кДа до приблизительно 2700 кДа, от приблизительно 1200 кДа до приблизительно 2400 кДа, от приблизительно 1700 кДа до приблизительно 2600 кДа; от приблизительно 1300 кДа до приблизительно 2600 кДа; от приблизительно 1600 кДа до приблизительно 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F по изобретению имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 3000 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа или от 2000 кДа до 3000 кДа. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Другим путем характеризации гликоконъюгатов серотипа 12F по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования).

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 12F по изобретению составляет от 2 до 20, от 4 до 16, от 4 до 15, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 12F по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или приблизительно 20.

Число остатков лизина в белке-носителе, конъюгированных с сахаридом, может быть также выражено в виде молярного отношения. Например, в гликоконъюгате, где от 4 до 15 остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связано с сахаридом, молярное отношение конъюгированных остатков лизина с CRM₁₉₇ в гликоконъюгате составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 40:1. В иммуногенной композиции, где от 2 до 20 остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связано с сахаридом, молярное отношение конъюгированных остатков лизина с CRM₁₉₇ в гликоконъюгате составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1. В одном воплощении изобретения в гликоконъюгате S. pneumoniae серотипа 12F по настоящему изобретению молярное отношение конъюгированных остатков лизина к белку-носителю составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 25:1. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых воплощениях изобретения CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

В одном воплощении изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) в гликоконъюгате S. pneumoniae серотипа 12F составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В другом воплощении изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) в гликоконъюгате S. pneumoniae серотипа 12F составляет от 1,1 до 1,7. В других воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,8 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7 или приблизительно 1,8). В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Частота присоединения цепи сахарида к остатку лизина на белке-носителе является другим показателем для характеризации гликоконъюгатов серотипа 12F по изобретению. Например, в одном воплощении изобретения присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 100 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В одном воплощении изобретения присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 50 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В одном воплощении изобретения присутствует по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В следующем воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 15 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В частых воплощениях изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇, и ковалентная связь между CRM₁₉₇ и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

В других воплощениях изобретения конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-9 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-15 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-6 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-20 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-25 повторяющихся сахаридных звеньев или на каждые 2-25 повторяющихся сахаридных звеньев. В частых воплощениях изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом воплощении изобретения по меньшей мере одна связь между CRM₁₉₇ и сахаридом встречается на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F по изобретению содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В следующем воплощении изобретения ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 15 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 12F и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 12F содержат менее чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем приблизительно 50% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем приблизительно 45% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом воплощении изобретения гликоконъюгат содержит менее чем приблизительно 30% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем приблизительно 20% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В дополнительном воплощении изобретения гликоконъюгат содержит менее чем приблизительно 10% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В другом воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F содержит менее чем приблизительно 5% свободного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством полисахарида серотипа 12F. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F по настоящему изобретению содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 12F конъюгируют с белком-носителем посредством TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 12F могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата, как упомянуто выше, можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 35% гликоконъюгатов серотипа 12F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительных воплощениях изобретения по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 70%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 12F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгатов серотипа 12F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4В. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 70% гликоконъюгатов серотипа 12F по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 12F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 12F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 12F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

1.3.6. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 10А

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 10А получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 10А по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

До окисления полисахарид серотипа 10А возможно подвергают гидролизу (изменение размера). Можно использовать механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты.

В одном воплощении изобретения полисахарид данного серотипа активируют (окисляют) способом, включающим стадию:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А с окисляющим агентом; и

(б) гашение реакции окисления добавлением гасящего агента с получением в результате активированного полисахарида серотипа 10А.

В предпочтительном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой перйодат. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия). В предпочтительном воплощении изобретения окисляющий агент представляет собой перйодат натрия. В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 10А, представляет собой метаперйодат. В предпочтительном воплощении изобретения перйодат, используемый для окисления полисахарида серотипа 10А, представляет собой метаперйодат натрия.

В одном воплощении изобретения гасящий агент выбран из вицинальных диолов, 1,2-аминоспиртов, аминокислот, глутатиона, сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой 1,2-аминоспирты формулы (I):

где R¹ выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В одном воплощении изобретения гасящий агент выбран из натриевых и калиевых солей сульфита, бисульфата, дитионита, метабисульфита, тиосульфата, фосфитов, гипофосфитов или фосфорной кислоты.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой аминокислоту. В таких воплощениях изобретения указанная аминокислота может быть выбрана из серина, треонина, цистеина, цистина, метионина, пролина, гидроксипролина, триптофана, тирозина и гистидина.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой сульфит, такой как бисульфат, дитионит, метабисульфит, тиосульфат.

В одном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой соединение, содержащие две вицинальные гидроксильные группы (вицинальные диолы), то есть гидроксильные группы, ковалентно связанные с двумя соседними атомами углерода.

Предпочтительно гасящий агент представляет собой соединение формулы (II):

где каждый из R¹ и R² независимо выбран из Н, метила, этила, пропила или изопропила.

В предпочтительном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой глицерин, этиленгликоль, пропан-1,2-диол, бутан-1,2-диол или бутан-2,3-диол, аскорбиновую кислоту. В предпочтительном воплощении изобретения гасящий агент представляет собой бутан-2,3-диол.

В предпочтительном воплощении изобретения выделенный полисахарид серотипа 10А активируют способом, включающим стадию:

(а) взаимодействие выделенного полисахарида серотипа 10А с перйодатом; и

(б) гашение реакции окисления добавлением бутан-2,3-диола с получением в результате активированного полисахарида серотипа 10А.

После стадии окисления полисахарида полисахарид считают активированным и далее в настоящем документе обозначают как «активированный полисахарид».

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А подвергают очистке. Активированный полисахарид серотипа 10А подвергают очистке в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, такими как гельпроникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный капсульный полисахарид 10А очищают путем концентрирования и диафильтрации, используя устройство для ультрафильтрации.

В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 5, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 30, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 20 до 30 или от 20 до 25. В предпочтительном воплощении изобретения степень окисления активированного полисахарида серотипа 10А составляет от 2 до 10, от 4 до 8, от 4 до 6, от 6 до 8, от 6 до 12, от 8 до 14, от 9 до 11, от 10 до 16, от 12 до 16, от 14 до 18, от 16 до 20, от 16 до 18, от 18 до 22 или от 18 до 20.

В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 400 кДа, от 50 кДа до 350 кДа, от 50 кДа до 300 кДа, от 50 кДа до 250 кДа, от 50 кДа до 200 кДа, от 100 кДа до 300 кДа, от 100 кДа до 250 кДа или от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 300 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисления от 5 до 20, от 5 до 15, от 8 до 14, от 8 до 12 или от 9 до 11. В предпочтительном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А имеет молекулярную массу от 100 кДа до 200 кДа и степень окисления от 9 до 11.

Активированный полисахарид и/или белок-носитель можно лиофилизировать (высушить сублимационной сушкой), либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация).

В одном воплощении изобретения активированный полисахарид серотипа 10А лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. В одном воплощении изобретения лиофилизированный активированный полисахарид впоследствии объединяют с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В таких воплощениях изобретения активированный полисахарид серотипа 10А объединяют с белком-носителем и лиофилизируют, возможно в присутствии сахарида. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид выбран из сахарозы, трегалозы, раффинозы, стахиозы, мелезитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном воплощении изобретения сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель можно впоследствии ресуспендировать в растворе и подвергать взаимодействию с восстанавливающим агентом.

Вторая стадия процесса конъюгирования состоит в восстановлении активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительном аминировании) с использованием восстанавливающего агента.

Активированный полисахарид серотипа 10А можно конъюгировать с белком-носителем способом, включающим стадии:

(в) объединение активированного полисахарида серотипа 10А с белком-носителем;

и

(г) взаимодействие смеси активированного полисахарида серотипа 10А и белка-носителя с восстанавливающим агентом с образованием конъюгата полисахарида серотипа 10А и белка-носителя.

В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом воплощении изобретения реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в растворителе, представляющем собой DMSO (диметилсульфоксид) или DMF (диметилформамид). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия, боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминбораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, t-BuMeiPrN-ВН3, бензиламин-ВН₃ или 5-этил-2-метилпиридинборан (РЕМВ). В предпочтительном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно кэпировать с использованием подходящего кэпирующего агента. В одном воплощении изобретения этот кэпирующий агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄).

После конъюгирования полисахарида серотипа 10А с белком-носителем гликоконъюгат можно подвергать очистке (обогащению в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) с помощью ряда методик, известных специалистам в данной области техники. Эти методики включают диализ, операции концентрирования/диафильтрации, фильтрование с тангенциальным потоком, осаждение/элюцию, колоночную хроматографию (DEAE или гидрофобную хроматографию) и глубинное фильтрование.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 10А по настоящему изобретению содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В некоторых таких воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 10А получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа или от 3000 кДа до 8000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа. Еще в других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 кДа до 7000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа, от 3000 кДа до 10000 кДа, от 3000 кДа до 7500 кДа, от 3000 кДа до 5000 кДа, от 4000 кДа до 20000 кДа, от 4000 кДа до 15000 кДа, от 4000 кДа до 12500 кДа, от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 10А по изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа или от 8000 кДа до 10000 кДа.

Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения. Молекулярную массу гликоконъюгата измеряют посредством SEC-MALLS.

Другим путем характеризации гликоконъюгатов серотипа 10А по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования). Доказательство модификации лизина белка-носителя за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование приводит к уменьшению числа восстановленных остатков лизина по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, используемым для получения материалов конъюгата.

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 10А составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 10А составляет от 6 до 8. В предпочтительном воплощении изобретения белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 10А по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3,0 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В предпочтительном воплощении изобретения отношение сахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5, от 1,0 до 2,0. В предпочтительном воплощении изобретения отношение полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,4. В предпочтительном воплощении изобретения отношение капсульного полисахарида серотипа 10А к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,8 до 1,2 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1 или приблизительно 1,2). В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 10А и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 10А по изобретению содержат менее чем приблизительно 50% свободного сахарида, менее чем приблизительно 45% свободного сахарида, менее чем приблизительно 40% свободного сахарида, менее чем приблизительно 35% свободного сахарида, менее чем приблизительно 30% свободного сахарида, менее чем приблизительно 25% свободного сахарида, менее чем приблизительно 20% свободного сахарида, менее чем приблизительно 15% свободного сахарида, менее чем приблизительно 10% свободного сахарида или менее чем приблизительно 5% свободного сахарида относительно общего количества сахарида 10А. Предпочтительно гликоконъюгат серотипа 10А содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида.

Гликоконъюгаты серотипа 10А могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата, как упомянуто выше, можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 30% гликоконъюгатов серотипа 10А по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 40% гликоконъюгатов серотипа 10А по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 10А характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгата серотипа 10А характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 80% гликоконъюгатов серотипа 10А по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

1.3.7. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 11А

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 11А получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDАР) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979). Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 11А по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

До окисления полисахарид серотипа 11А возможно подвергают гидролизу, чтобы уменьшить его вязкость. Можно использовать механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты. Механическое изменение размера можно выполнять за счет сдвигающего усилия при гомогенизации высокого давления.

В стадии окисления может быть задействовано взаимодействие с перйодатом. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия). В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид из S. pneumoniae серотипа 11А окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии перйодата натрия (NaIO₄). В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид серотипа 11А окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида полисахарид считают активированным и далее в настоящем документе обозначают как «активированный полисахарид». Активированный полисахарид может быть очищен и лиофилизирован (высушен сублимационной сушкой).

Активированный полисахарид и белок-носитель можно лиофилизировать (высушить сублимационной сушкой), либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо.

В одном воплощении изобретения лиофилизацию выполняют в присутствии невосстанавливающего сахара, и возможные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, раффинозу, стахиозу, мелезитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования состоит в восстановлении активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительном аминировании) с использованием восстанавливающего агента. Подходящие восстанавливающие агенты включают цианоборгидриды, такие как цианоборгидрид натрия, боран-пиридин или боргидридная ионообменная смола. В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом воплощении изобретения реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в растворителе, представляющем собой DMSO (диметилсульфоксид) или DMF (диметилформамид). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном воплощении изобретения в реакции восстановления используют от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 2,0 или от 0,5 до 1,5 молярных эквивалентов цианоборгидрида натрия. В одном воплощении изобретения в реакции восстановления используют приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов цианоборгидрида натрия.

В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой триацетоксиборгидрид натрия. В следующем воплощении изобретения в реакции восстановления используют от 1,0 до 6,0 молярных эквивалентов, от 2,0 до 5,0 молярных эквивалентов или приблизительно 3,0 молярных эквивалентов триацетоксиборгидрида натрия.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы. Эти группы можно кэпировать, используя приемлемый кэпирующий реагент. В одном воплощении изобретения этот кэпирующий агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄). В одном воплощении изобретения кэпирование достигается путем смешивания реакционной смеси восстановления с NaBH₄ в количестве от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов, например приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 или 3,0 молярных эквивалентов.

После конъюгирования (реакции восстановления и возможно кэпирования) гликоконъюгаты можно очищать. Гликоконъюгаты можно очищать путем диафильтраии и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты очищают путем диафильтраии или ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты стерилизуют фильтрованием.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 11А по настоящему изобретению конъюгированы с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 50 кДа до 400 кДа; от 50 кДа до 300 кДа; от 50 кДа до 200 кДа; от 50 кДа до 100 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 100 кДа до 200 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа или от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа или от 200 кДа до 300 кДа.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. Еще в других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 17500 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 17500 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 700 кДа до 20000 кДа; от 700 кДа до 17500 кДа; от 700 кДа до 15000 кДа; от 700 кДа до 12500 кДа; от 700 кДа до 10000 кДа; от 700 кДа до 7500 кДа; от 700 кДа до 6000 кДа; от 700 кДа до 5000 кДа; от 700 кДа до 4500 кДа; от 700 кДа до 4000 кДа; от 700 кДа до 3500 кДа; от 700 кДа до 3000 кДа; от 700 кДа до 2000 кДа; от 700 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 20000 кДа; от 1000 кДа до 17500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 20000 кДа; от 2000 кДа до 17500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 17500 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа, от 3000 кДа до 10000 кДа, от 3000 кДа до 7500 кДа, от 3000 кДа до 5000 кДа, от 4000 кДа до 20000 кДа, от 4000 кДа до 17500 кДа, от 4000 кДа до 15000 кДа, от 4000 кДа до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 17500 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа; или от 5000 кДа до 7500 кДа.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 11А получают с использованием восстановительного аминирования.

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,3, 0,5, 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2, 4,6 или 5,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 1,8, 2,2 или 2,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В воплощении изобретения гликоконъюгат содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6, 3,0, 3,4, 3,8, 4,2, 4,6 и менее чем приблизительно 5,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6 или 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А и менее чем приблизительно 3,4 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. В одном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,6, 1,0, 1,4, 1,8, 2,2, 2,6 или приблизительно 3,0 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А и менее чем приблизительно 3,3 мМ ацетата на мМ полисахарида серотипа 11А. Любое из указанных выше чисел рассматривают как воплощение изобретения.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9 или 0,95. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,7. В предпочтительном воплощении изобретения отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,9. В предпочтительном воплощении присутствие О-ацетильных групп определяют путем анализа ионной HPLC.

В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 0,2, 0,3 или 0,4 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и менее чем приблизительно 1,0 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. В предпочтительном воплощении изобретения гликоконъюгат серотипа 11А по изобретению содержит по меньшей мере 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А и менее чем приблизительно 0,8 мМ глицерина на мМ полисахарида серотипа 11А. Любое из указанных выше чисел рассматривают как воплощение изобретения.

Другим способом характеризации гликоконъюгатов серотипа 11А по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования).

Доказательство модификации лизина белка-носителя за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области техники. Конъюгирование приводит к уменьшению числа восстановленных остатков лизина по сравнению с исходным материалом белка CRM₁₉₇, используемым для получения материалов конъюгата.

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 11А по изобретению составляет от 1 до 15, от 1 до 13, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 11А по изобретению составляет приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 11А по изобретению составляет от 1 до 6 или от 2 до 5. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты серотипа 11А по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5, от 0,8 до 2,0, от 0,8 до 1,5, от 0,7 до 1,5, от 0,7 до 1,4, от 0,8 до 1,4, от 0,7 до 1,45 или от 0,8 до 1,45. В следующих воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,6 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5 или приблизительно 1,6). В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 11А получают с использованием восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 11А и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 11A по изобретению содержат менее чем приблизительно 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 11A по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 11А, менее чем приблизительно 45% свободного сахарида, менее чем приблизительно 40% свободного сахарида, менее чем приблизительно 35% свободного сахарида, менее чем приблизительно 30% свободного сахарида, менее чем приблизительно 25% свободного сахарида, менее чем приблизительно 20% свободного сахарида, менее чем приблизительно 15% свободного сахарида, менее чем приблизительно 10% свободного сахарида или менее чем приблизительно 5% свободного капсульного полисахарида серотипа 11A. Предпочтительно гликоконъюгат серотипа 11A содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида.

Гликоконъюгаты серотипа 11A могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата, как упомянуто выше, можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 30% гликоконъюгатов серотипа 11A по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 11A характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгатов серотипа 11A по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 65% гликоконъюгатов серотипа 11A по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

1.3.8. Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 8

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного сложного эфира. Активированный полисахарид можно подвергать сочетанию, непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы, с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который можно подвергать сочетанию посредством тиоэфирной связи, полученной после взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP). Предпочтительно цианатный сложный эфир (возможно, полученный с помощью химии CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-производное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной химии (например, EDAC или EDC) посредством карбоксильной группы на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/129094.

В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент WO 98/42721. В конъюгировании может быть задействован карбонильный линкер, который может быть образован в результате взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al. (1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr.218:509-518) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. При этом может быть задействовано восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/удаление защиты первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке.

В предпочтительных воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает две стадии: (1) окисление полисахарида с получением альдегидных функциональных групп из вицинальных диолов в отдельном гексасахаридном звене и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата.

До окисления полисахарид серотипа 8 возможно подвергают гидролизу, чтобы уменьшить его вязкость. Можно использовать механический или химический гидролиз. Химический гидролиз можно проводить с использованием уксусной кислоты.

В стадии окисления может быть задействовано взаимодействие с перйодатом. Для задач настоящего изобретения термин «перйодат» включает как перйодат, так и перйодную кислоту; этот термин также включает метаперйодат (IO₄ ^-) и ортоперйодат (IO₆ ^5-) и различные соли перйодата (например, перйодат натрия и перйодат калия). В одном воплощении изобретения капсульный полисахарид из S. pneumoniae серотипа 8 окисляют в присутствии метаперйодата, предпочтительно в присутствии перйодата натрия (NaIO₄). В другом воплощении изобретения капсульный полисахарид серотипа 8 окисляют в присутствии ортоперйодата, предпочтительно в присутствии перйодной кислоты.

После стадии окисления полисахарида полисахарид считают активированным и далее в настоящем документе обозначают как «активированный полисахарид». Активированный полисахарид может быть очищен и лиофилизирован (высушен сублимационной сушкой).

Активированный полисахарид и белок-носитель можно лиофилизировать (высушить сублимационной сушкой), либо независимо (дискретная лиофилизация), либо вместе (совместная лиофилизация). В одном воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют совместно. В другом воплощении изобретения активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизируют независимо.

В одном воплощении изобретения лиофилизацию выполняют в присутствии невосстанавливающего сахара, и возможные невосстанавливающие сахара включают сахарозу, трегалозу, раффинозу, стахиозу, мелезитозу, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Вторая стадия процесса конъюгирования состоит в восстановлении активированного полисахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (восстановительном аминировании) с использованием восстанавливающего агента. Подходящие восстанавливающие агенты включают цианоборгидриды, такие как цианоборгидрид натрия, боран-пиридин или боргидридная ионообменная смола. В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой цианоборгидрид натрия.

В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в водном растворителе, в другом воплощении изобретения реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном воплощении изобретения реакцию восстановления проводят в растворителе, представляющем собой DMSO (диметилсульфоксид) или DMF (диметилформамид). Растворитель DMSO или DMF можно использовать для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизированы.

В одном воплощении изобретения в реакции восстановления используют от 0,1 до 3,0, от 0,15 до 2,0, от 0,2 до 1,0 или от 0,25 до 0,5 молярных эквивалентов цианоборгидрида натрия. В одном воплощении изобретения в реакции восстановления используют приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 молярных эквивалентов цианоборгидрида натрия.

В одном воплощении изобретения восстанавливающий агент представляет собой триацетоксиборгидрид натрия. В следующем воплощении изобретения в реакции восстановления используют от 0,1 до 6,0 молярных эквивалентов или приблизительно 3,0 молярных эквивалентов триацетоксиборгидрида натрия.

По окончании реакции восстановления в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые можно кэпировать с использованием подходящего кэпирующего агента. В одном воплощении изобретения этот кэпирующий агент представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄). В одном воплощении изобретения кэпирование достигается путем смешивания реакционной смеси восстановления с NaBH₄ в количестве от 0,5 до 5,0 молярных эквивалентов, например, приблизительно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 или 3,0 молярных эквивалентов.

После конъюгирования (реакции восстановления и, возможно, кэпирования) гликоконъюгаты можно очищать. Гликоконъюгаты можно очищать путем диафильтраии и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты очищают путем диафильтраии и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты стерилизуют фильтрованием.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 по настоящему изобретению конъюгированы с белком-носителем (например, CRM₁₉₇) и содержат сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения полисахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях изобретения сахарид имеет молекулярную массу от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа; или от 200 кДа до 400 кДа. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 15000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 200 кДа до 10000 кДа. Еще в других воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа или от 2000 кДа до 8000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа; от 3000 кДа до 15000 кДа, от 3000 кДа до 10000 кДа, от 3000 кДа до 7500 кДа, от 3000 кДа до 5000 кДа, от 4000 кДа до 20000 кДа, от 4000 кДа до 15000 кДа, от 4000 кДа до 12500 кДа, от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 кДа до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа или от 4000 кДа до 5000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 5000 кДа до 20000 кДа; от 5000 кДа до 15000 кДа; от 5000 кДа до 10000 кДа или от 5000 кДа до 7500 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 7000 кДа до 20000 кДа; от 7000 кДа до 15000 кДа; от 7000 кДа до 10000 кДа или от 7000 кДа до 8000 кДа. В следующих воплощениях изобретения гликоконъюгат серотипа 8 по изобретению имеет молекулярную массу от 8000 кДа до 20000 кДа; от 8000 кДа до 15000 кДа или от 8000 кДа до 10000 кДа.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

Другим путем характеризации гликоконъюгатов серотипа 8 по изобретению является характеризация по числу остатков лизина в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), который стал конъюгированным с сахаридом, которое можно охарактеризовать как диапазон конъюгированных остатков лизина (степень конъюгирования).

Доказательство модификации лизина белка-носителя за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с использованием стандартных методов, известных специалистам в данной области техники. В частых воплощениях изобретения белок-носитель ковалентно конъюгирован с активированным полисахаридом посредством амидной связи с одной или более е-аминогрупп остатков лизина на белке-носителе. В некоторых таких воплощениях белок-носитель содержит от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких воплощениях белок-носитель содержит от 4 до 16 или от 6 до 14 остатков, ковалентно конъюгированных с сахаридом.

В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 8 по изобретению составляет от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 8 по изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном воплощении изобретения степень конъюгирования гликоконъюгата серотипа 8 по изобретению составляет от 4 до 16 или от 6 до 14. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В предпочтительном воплощении изобретения белок-носитель включает CRM₁₉₇, содержащий 39 остатков лизина. В некоторых таких воплощениях CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 или от 6 до 14 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от приблизительно 10% до приблизительно 41% или от приблизительно 15% до приблизительно 36% остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В другом таком воплощении CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от приблизительно 5% до приблизительно 50% остатков лизина CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В некоторых таких воплощениях изобретения CRM₁₉₇ может содержать приблизительно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 остатков лизина из 39 ковалентно связанных с сахаридом.

Гликоконъюгаты серотипа 8 по изобретению могут быть также охарактеризованы отношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4,0 (например, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,2, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9 или приблизительно 4,0). В других воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,7 до 2,5. В следующих воплощениях изобретения отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,5 (например, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4 или приблизительно 1,5). В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

Гликоконъюгаты серотипа 8 и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который ковалентно не конъюгирован с белком-носителем, но, тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно ассоциирован с гликоконъюгатом (то есть нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или заключен в нем или им).

В некоторых воплощениях изобретения гликоконъюгаты серотипа 8 по изобретению содержат менее чем приблизительно 50% свободного сахарида, менее чем приблизительно 45% свободного сахарида, менее чем приблизительно 40% свободного сахарида, менее чем приблизительно 35% свободного сахарида, менее чем приблизительно 30% свободного сахарида, менее чем приблизительно 25% свободного сахарида, менее чем приблизительно 20% свободного сахарида, менее чем приблизительно 15% свободного сахарида, менее чем приблизительно 10% свободного сахарида или менее чем приблизительно 5% свободного сахарида относительно общего количества сахарида серотипа 8. Предпочтительно гликоконъюгат серотипа 8 содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида.

Гликоконъюгаты серотипа 8 могут быть также охарактеризованы по их распределению молекулярного размера (K_d). Для определения распределения относительного молекулярного размера конъюгата можно использовать среды для эксклюзионной хроматографии (CL-4B). Для профилирования распределения молекулярного размера конъюгатов используют эксклюзионную хроматографию (SEC) на колонках с подачей самотеком. Большие молекулы, вытесняемые из пор в средах, элюируют быстрее, чем малые молекулы. Для сбора элюата с колонки используют коллекторы фракций. Фракции тестируют колориметрически посредством анализа сахаридов. Для определения K_d колонки калибруют, чтобы установить фракцию (V₀), в которой молекулы полностью вытесняются (K_d равно 0), и фракцию (V_i), в которой представлено максимальное удерживание (K_d равно 1). Фракцию (V_e), в которой достигается заданное свойство образца, соотносят с K_d согласно уравнению K_d=(V_e-V₀)/(V_i-V₀).

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 40% гликоконъюгатов серотипа 8 по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% гликоконъюгатов серотипа 8 по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60% гликоконъюгатов серотипа 8 по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4В. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 70% гликоконъюгатов серотипа 8 по изобретению характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

В предпочтительном воплощении изобретения от 40% до 90% гликоконъюгатов серотипа 8 характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 50% до 90% гликоконъюгатов серотипа 8 характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B. В предпочтительном воплощении изобретения от 65% до 80% гликоконъюгатов серотипа 8 характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

2. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению

В одном воплощении изобретения число капсульных сахаридов S. pneumoniae иммуногенной композиции может находиться в диапазоне от 1 серотипа (или «v», валентности) до 7 различных серотипов (7v). В одном воплощении изобретения присутствует 1 серотип. В одном воплощении изобретения присутствует 2 различных серотипа. В одном воплощении изобретения присутствует 3 различных серотипа. В одном воплощении изобретения присутствует 4 различных серотипа. В одном воплощении изобретения присутствует 5 различных серотипов. В одном воплощении изобретения присутствует 6 различных серотипов. В одном воплощении изобретения присутствует 7 различных серотипов. Капсульные сахариды конъюгированы с белком-носителем с образованием гликоконъюгатов, как описано в настоящем документе выше.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 15В (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.2 выше), гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.3 выше), гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 12F (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.5 выше), гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 10А (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.6 выше), гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 11A (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.7 выше) и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 8 (такого, как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.8 выше).

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгат, описанный в разделе 1.3.4 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F, такой как описанные в разделе 1.3.2 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F, такой как описанные в разделе 1.3.3 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F, такой как описанные в разделе 1.3.5 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 10А, такой как описанные в разделе 1.3.6 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 11A, такой как описанные в разделе 1.3.7 выше. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, такой как описанные в разделе 1.3.8 выше.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из двух серотипов S. pneumoniae, выбранных из группы, состоящей из: 15В и 22F, 15В и 33F, 15В и 12F, 15В и 10А, 15В и 11А, 15В и 8, 22F и 33F, 22F и 12F, 22F и 10А, 22F и 11А, 22F и 8, 33F и 12F, 33F и 10А, 33F и 11А, 33F и 8, 12F и 10А, 12F и 11А, 12F и 8, 10A и 11А, 10А и 8, и 11А и 8.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из трех следующих серотипов S. pneumoniae:

15B и 22F и 33F,

15B и 22F и 12F,

15B и 22F и 10А,

15В и 22F и 11A,

15B и 22F и 8,

15B и 33F и 12F,

15B и 33F и 10A,

15В и 33F и 11A,

15B и 33F и 8,

15B и 12F и 10A,

15В и 12F и 11A,

15В и 12F и 8,

15В и 10А и 11A,

15В и 10А и 8,

15В и 11A и 8,

22F и 33F и 12F,

22F и 33F и 10А,

22F и 33F и 11A,

22F и 33F и 8,

22F и 12F и 10А,

22F и 12F и 11А,

22F и 12F и 8,

22F и 10А и 11А,

22F и 10А и 8,

22F и 11A и 8,

33F и 12F и 10А,

33F и 12F и 11A,

33F и 12F и 8,

33F и 10А и 11А,

33F и 10А и 8,

33F и 11A и 8,

12F и 10А и 11А,

12F и 10А и 8,

12F и 11A и 8 или

10А и 11A и 8.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из четырех следующих серотипов S. pneumoniae:

15B и 22F и 33F и 12F,

15B и 22F и 33F и 10А,

15B и 22F и 33F и 11A,

15B и 22F и 33F и 8,

15B и 22F и 12F и 10A,

15B и 22F и 12F и 11A,

15B и 22F и 12F и 8,

15B и 22F и 10А и 11A,

15B и 22F и 10А и 8,

15B и 22F и 11А и 8,

15B и 33F и 12F и 10A,

15B и 33F и 12F и 11A,

15B и 33F и 12F и 8,

15В и 33F и 10A и 11A,

15В и 33F и 10А и 8,

15В и 33F и 11A и 8,

15В и 12F и 10А и 11A,

15В и 12F и 10А и 8,

15В и 12F и 11A и 8,

15В и 10А и 11A и 8,

22F и 33F и 12F и 10А,

22F и 33F и 12F и 11А,

22F и 33F и 12F и 8,

22F и 33F и 10А и 11A,

22F и 33F и 10А и 8,

22F и 33F и 11A и 8,

22F и 12F и 10A и 11А,

22F и 12F и 10А и 8,

22F и 12F и 11A и 8,

22F и 10А и 11A и 8,

33F и 12F и 10А и 11A,

33F и 12F и 10А и 8,

33F и 12F и 11A и 8,

33F и 10A и 11A и 8 или

12F и 10А и 11A и 8.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из пяти следующих серотипов S. pneumoniae:

15B и 22F и 33F и 12F и 10А,

15В и 22F и 33F и 12F и 11A,

15B и 22F и 33F и 12F и 8,

15В и 22F и 33F и 10А и 11А,

15B и 22F и 33F и 10А и 8,

15B и 22F и 33F и 11A и 8,

15В и 22F и 12F и 10А и 11А,

15B и 22F и 12F и 10А и 8,

15B и 22F и 12F и 11A и 8,

15В и 22F и 10А и 11A и 8,

15В и 33F и 12F и 10А и 11A,

15B и 33F и 12F и 10А и 8,

15B и 33F и 12F и 11A и 8,

15В и 33F и 10А и 11A и 8,

15В и 12F и 10А и 11A и 8,

22F и 33F и 12F и 10А и 11А,

22F и 33F и 12F и 10А и 8,

22F и 33F и 12F и 11A и 8,

22F и 33F и 10А и 11А и 8,

22F и 12F и 10А и 11А и 8 или

33F и 12F и 10А и 11A и 8.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из шести следующих серотипов S. pneumoniae:

15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11А,

15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 8,

15В и 22F и 33F и 12F и 11А и 8,

15В и 22F и 33F и 10А и 11А и 8,

15B и 22F и 12F и 10А и 11A и 8,

15В и 33F и 12F и 10А и 11A и 8 или

22F и 33F и 12F и 10А и 11А и 8.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат каждого из семи следующих серотипов S. pneumoniae: 15В и 22F и 33F и 12F и 10А и 11A и 8.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 15В, 22F, 33F, 12F, 10А, 11A и/или 8 любой из иммуногенных композиций, определенных в данном разделе, являются такими, как описано в разделах 1.3.2-1.3.8 выше.

Предпочтительно все гликоконъюгаты вышеописанных иммуногенных композиций индивидуально конъюгируют с белком-носителем.

В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 33F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 15В конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 12F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 10А конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 11A конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 8 конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций все гликоконъюгаты S. pneumoniae индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

В другом воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций все гликоконъюгаты S. pneumoniae индивидуально конъюгированы с PD. В другом воплощении все гликоконъюгаты S. pneumoniae индивидуально конъюгированы с ТТ. В другом воплощении все гликоконъюгаты S. pneumoniae индивидуально конъюгированы с DT.

В другом воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F, 33F, 15В, 12F, 10А, 11А и/или 8 индивидуально конъюгированы с DT. В другом воплощении гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F, 33F, 15В, 12F, 10А, 11А и/или 8 индивидуально конъюгированы с ТТ. В другом воплощении гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F, 33F, 15В, 12F, 10А, 11А и/или 8 индивидуально конъюгированы с PD.

В другом воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с DT. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с DT. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с PD. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с PD.

В другом воплощении любой из описанных выше иммуногенных композиций по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с DT. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с PD. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇. В другом воплощении по меньшей мере один из гликоконъюгатов индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇.

В одном воплощении описанные выше иммуногенные композиции содержат от 1 до 7 различных серотипов S. pneumoniae. В одном воплощении изобретения вышеописанная иммуногенная композиция представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения вышеописанная иммуногенная композиция представляет собой 6-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения вышеописанная иммуногенная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

1. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В, такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше.

2. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F, такой как описано в разделе 1.3.2 выше.

3. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1 или 2 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F, такой как описано в разделе 1.3.3 выше.

4. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1, 2 или 3 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F, такой как описано в разделе 1.3.5 выше.

5. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1, 2, 3 или 4 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S pneumoniae серотипа 10А, такой как описано в разделе 1.3.6 выше.

6. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1, 2, 3, 4 или 5 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 11А, такой как описано в разделе 1.3.7 выше.

7. В другом воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно к п. 1, 2, 3, 4, 5 или 6 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, такой как описано в разделе 1.3.8 выше.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит конъюгированные сахариды S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты иммуногенной композиции по изобретению состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11A, 12F, 15В, 22F и 33F.

Предпочтительно все гликоконъюгаты иммуногенной композиции по изобретению (например, по любому из п.п. 1-7 выше) индивидуально конъюгированы с белком-носителем.

В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 1-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 2-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 3-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 4-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 5-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 10А конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше п.п. 6-7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 11A конъюгирован с CRM₁₉₇. В одном воплощении описанного выше п. 7 гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8 конъюгирован с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты иммуногенной композиции описанных выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты иммуногенной композиции описанных выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгированы с PD. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты иммуногенной композиции описанных выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгированы с ТТ. В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты иммуногенной композиции описанных выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгированы с DT.

В одном воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с DT. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с DT.

В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с PD. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с PD.

В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) S. pneumoniae индивидуально конъюгирован(ы) с DT. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с ТТ. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с CRM₁₉₇, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с PD. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с DT, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с ТТ, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇. В другом воплощении изобретения по меньшей мере один из гликоконъюгатов иммуногенной композиции по описанным выше п.п. 1-7 индивидуально конъюгирован с PD, а другой(ие) гликоконъюгат(ы) индивидуально конъюгирован(ы) с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше иммуногенная композиция представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше иммуногенная композиция представляет собой 6-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше иммуногенная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

После конъюгирования капсульного полисахарида с белком-носителем гликоконъюгаты подвергают очистке (обогащению в отношении количества конъюгата полисахарид-белок) с помощью ряда методик. Эти методики включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюции, колоночную хроматографию и глубинное фильтрование (см., например, публикацию заявки на патент США №2007/0184072 или WO 2008/079653). После очистки отдельных гликоконъюгатов их объединяют с получением лекарственной формы иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

В одном воплощении изобретения дозировка иммуногенной композиции является такой, как описано в разделе 5 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше иммуногенные композиции дополнительно содержат антиген(ы) из других патогенных организмов, в частности из бактерий и/или вирусов, как описано в разделе 6 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше иммуногенные композиции дополнительно содержат один или более адъювантов, как описано в разделе 6 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше иммуногенные композиции готовят, как описано в разделе 8 ниже.

3. Иммуногенные композиции, которые можно применять в комбинации с иммуногенными композициями по настоящему изобретению

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции по изобретению (такие как любая из описанных в разделе 2 выше) применяют в комбинации со второй иммуногенной композицией.

В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

1. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

2. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п. 1 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

3. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п. 1 или 2 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 6А и 19А (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

4. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2 или 3 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 3 (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

5. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2, 3 или 4 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F, такой как описано в разделе 1.3.2 выше.

6. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2, 3, 4 или 5 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F, такой как описано в разделе 1.3.3 выше.

Предпочтительно все гликоконъюгаты описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с белком-носителем.

В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 6А и 19А конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 3 конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 33F конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с PD.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгирован с ТТ.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгирован с DT.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с PD, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, а гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любой из описанных выше вторых иммуногенных композиций индивидуально конъюгированы с PD, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇, и гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇.

В одном воплощении описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат от 7 до 15 различных серотипов S. pneumoniae. В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат гликоконъюгаты 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных серотипов. В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат гликоконъюгаты от 10 до 15 различных серотипов. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 10-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 7 конъюгатов состоят из 7 гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 10-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 10 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата 5. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 12 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 13 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 15 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения дозировка описанной выше второй иммуногенной композиции является такой, как описано в разделе 5 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции дополнительно содержат антиген(ы) из других патогенных организмов, в частности из бактерий и/или вирусов, как описано в разделе 6 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции дополнительно содержат один или более адъювантов, как описано в разделе 7 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции готовят, как описано в разделе 8 ниже.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции по изобретению (такие как любая из описанных в разделе 2 выше) применяют в комбинации с вакцинами ПРЕВНАР^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР^®) (семивалентная вакцина), СИНФЛОРИКС^® (десятивалентная вакцина) и/или ПРЕВНАР 13^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР 13^®) (тринадцативалентная вакцина).

4. Набор по настоящему изобретению

В одном аспекте в изобретении предложен набор, содержащий: (а) первую иммуногенную композицию, как определено в разделе 2 выше; и (б) вторую иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

В одном аспекте в изобретении предложен набор, содержащий: (а) первую иммуногенную композицию, как определено в разделе 2 выше; и (б) вторую иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

В одном аспекте в изобретении предложен набор, содержащий: (а) первую иммуногенную композицию, как определено в разделе 2 выше; и (б) вторую иммуногенную композицию, как определено в разделе 3 выше.

1. В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора (часть (б) набора) содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

2. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

3. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п. 1 или 2 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипов 6А и 19А (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

4. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2 или 3 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 3 (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

5. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2, 3 или 4 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F, такой как описано в разделе 1.3.2 выше.

6. В другом воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно к п.п. 1, 2, 3, 4 или 5 выше содержит по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F, такой как описано в разделе 1.3.3 выше.

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора (часть (б) набора) содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.1 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 22F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1 и 1.3.2 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 33F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1 и 1.3.3 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 22F и 33F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1, 1.3.2 и 1.3.3 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1 и 1.3.2 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1 и 1.3.3 выше).

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F (такие как гликоконъюгаты, описанные в разделах 1.3.1, 1.3.2 и 1.3.3 выше).

Предпочтительно все гликоконъюгаты описанных выше вторых иммуногенных композиций набора индивидуально конъюгируют с белком-носителем.

В одном воплощении любого из описанных выше наборов гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше наборов гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше наборов гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 6А и 19А конъюгированы с CRM₁₉₇. В одном воплощении любого из описанных выше наборов гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 3 конъюгированы с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты любого из описанных выше наборов индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

В другом воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любого из описанных выше наборов индивидуально конъюгированы с PD.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С любого из описанных выше наборов конъюгирован с ТТ.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F любого из описанных выше наборов конъюгирован с DT.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любого из описанных выше наборов индивидуально конъюгированы с PD, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, а гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

В одном воплощении изобретения гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F любого из описанных выше наборов индивидуально конъюгированы с PD, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT, гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇, и гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇.

В одном воплощении описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат от 7 до 15 различных серотипов S. pneumoniae. В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат гликоконъюгаты 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных серотипов. В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции содержат гликоконъюгаты от 10 до 15 различных серотипов. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 10-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию. В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 7 конъюгатов состоят из 7 гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 10-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 10 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 12 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 13 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19A, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения описанная выше вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 15 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения дозировка описанной выше второй иммуногенной композиции является такой, как описано в разделе 5 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции дополнительно содержат антиген(ы) из других патогенных организмов, в частности из бактерий и/или вирусов, как описано в разделе 6 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции дополнительно содержат один или более адъювантов, как описано в разделе 7 ниже.

В одном воплощении изобретения описанные выше вторые иммуногенные композиции готовят, как описано в разделе 8 ниже.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции по изобретению (такие как любая из описанных в разделе 2 выше) применяют в комбинации с вакцинами ПРЕВНАР^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР^®) (семивалентная вакцина), СИНФЛОРИКС^® (десятивалентная вакцина) и/или ПРЕВНАР 13^® (в некоторых странах ПРЕВЕНАР 13^®) (тринадцативалентная вакцина).

В одном аспекте настоящего изобретения набор принимает форму двух контейнеров. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения каждая из иммуногенных композиций набора (то есть первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция) содержится в отдельном контейнере.

В одном воплощении изобретения первая иммуногенная композиция набора (часть (а) набора) содержится в контейнере, выбранном из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, пакета, банки, ампулы, картриджа и одноразового шприца-ручки. В некоторых воплощениях изобретения контейнер силиконизирован.

В одном воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора (часть (б) набора) содержится в контейнере, выбранном из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, пакета, банки, ампулы, картриджа и одноразового шприца-ручки. В некоторых воплощениях изобретения контейнер силиконизирован.

В одном воплощении изобретения контейнер выполнен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.д.) и/или полимеров (например, термопластических полимеров, эластомеров, термопластических эластомеров). В одном воплощении изобретения контейнер выполнен из стекла.

В одном воплощении изобретения первая и вторая иммуногенные композиции набора содержатся в шприце или одноразовом шприце-ручке. В одном воплощении изобретения первая и вторая иммуногенные композиции набора содержатся в шприце. В некоторых воплощениях изобретения шприцы силиконизированы. В некоторых воплощениях изобретения силиконизированные шприцы выполнены из стекла.

В одном воплощении изобретения первая и вторая иммуногенные композиции набора смешивают непосредственно перед применением для совместного введения.

В одном воплощении изобретения первая и вторая иммуногенные композиции имеют жидкую форму, предпочтительно содержащуюся в двух контейнерах. В одном воплощении изобретения первый и второй контейнеры представляют собой отдельные камеры в двухкамерном шприце так, что при его активации жидкость в первом контейнере поступает во второй контейнер. Затем полученная в результате смесь может выходить из шприца. Две иммуногенные композиции содержатся отдельно до готовности к смешиванию.

В одном воплощении изобретения первая и/или вторая иммуногенная композиция набора имеет(ют) лиофилизированную форму.

В одном воплощении изобретения первая иммуногенная композиция набора имеет лиофилизированную форму, а вторая иммуногенная композиция имеет жидкую форму. В другом воплощении изобретения вторая иммуногенная композиция набора имеет лиофилизированную форму, а первая иммуногенная композиция имеет жидкую форму. В указанных воплощениях изобретения лиофилизированная иммуногенная композиция может быть восстановлена непосредственно перед применением жидкой иммуногенной композицией для совместного введения обеих иммуногенных композиций.

В указанных воплощениях изобретения набор содержит два контейнера, где один контейнер включает жидкий материал для восстановления, а второй контейнер включает лиофилизированный материал. В одном воплощении изобретения второй контейнер герметично запечатан. В одном воплощении изобретения жидкий материал вводят во второй контейнер посредством первой иглы, в результате чего восстанавливают лиофилизированный материал до жидкой формы. Затем полученную в результате смесь забирают в контейнер (такой как шприц) для введения пациенту. В одном воплощении изобретения стадию забора выполняют посредством первой иглы. В одном воплощении изобретения стадию забора выполняют посредством второй иглы. В одном воплощении изобретения игла, используемая на стадии забора, представляет собой ту же иглу, которую используют для введения пациенту. В одном воплощении изобретения игла, используемая на стадии забора, представляет собой другую иглу, чем игла, используемая для введения пациенту.

В одном воплощении изобретения второй контейнер представляет собой флакон. В следующем воплощении изобретения первый и второй контейнеры представляют собой отдельные камеры в двухкамерном шприце так, что при его активации жидкий материал из первого контейнера поступает во второй контейнер. Полученная в результате смесь находится в шприце в жидкой форме. В предпочтительном воплощении изобретения лиофилизированный и жидкий материалы содержатся отдельно до готовности к смешиванию.

В одном воплощении изобретения набор содержит готовый заполненный шприц и флакон. В одном воплощении изобретения шприц содержит однократную дозу первой иммуногенной композиции, а флакон содержит однократную дозу второй иммуногенной композиции. В одном воплощении изобретения шприц содержит однократную дозу второй иммуногенной композиции, а флакон содержит однократную дозу первой иммуногенной композиции. В другом воплощении изобретения шприц и флакон содержат многократные дозы.

5. Дозировка иммуногенных композиций

Количество(а) гликоконъюгата(ов) в каждое дозе выбирают как количество, которое индуцирует защитный иммунный ответ при отсутствии значимых нежелательных побочных эффектов у вакцинируемых лиц в характерных случаях. Такое количество будет варьировать в зависимости от конкретного применяемого иммуногена и формы его выпуска.

5.1 Количество гликоконъюгата

Количество конкретного гликоконъюгата в иммуногенной композиции можно рассчитывать на основании общего содержания полисахарида (конъюгированного и неконъюгированного) на этот конъюгат. Например, гликоконъюгат с 20% свободного полисахарида содержит в 100 мкг дозы полисахарида приблизительно 80 мкг конъюгированного полисахарида и приблизительно 20 мкг неконъюгированного полисахарида. Количество гликоконъюгата может варьировать в зависимости от серотипа пневмококка. Концентрацию сахарида можно определить посредством анализа с уроновой кислотой.

«Иммуногенное количество» различных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может различаться, и каждый может содержать приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг или приблизительно 100 мкг любого конкретного полисахаридного антигена.

Как правило, каждая доза содержит от 0,1 мкг до 100 мкг полисахарида на данный серотип, в частности от 0,5 мкг до 20 мкг, более конкретно от 1,0 мкг до 10 мкг и даже более конкретно от 2,0 мкг до 5,0 мкг. Любое целое число в пределах любого из указанных выше диапазонов рассматривают как воплощение изобретения.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 1,0 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 3,0 мкг, приблизительно 3,2 мкг, приблизительно 3,4 мкг, приблизительно 3,6 мкг, приблизительно 3,8 мкг, приблизительно 4,0 мкг, приблизительно 4,2 мкг, приблизительно 4,4 мкг, приблизительно 4,6 мкг, приблизительно 4,8 мкг, приблизительно 5,0 мкг, приблизительно 5,2 мкг, приблизительно 5,4 мкг, приблизительно 5,6 мкг, приблизительно 5,8 мкг или приблизительно 6,0 мкг полисахарида на каждый конкретный гликоконъюгат.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 1,1 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,3 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,5 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,7 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 1,9 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,1 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,3 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,7 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 2,9 мкг или приблизительно 3,0 мкг полисахарида на гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F.

В одном воплощении изобретения каждая доза будет содержать приблизительно 1,1 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,3 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,5 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,7 мкг, приблизительно 1,8 мкг, приблизительно 1,9 мкг, приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,1 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,3 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,7 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 2,9 мкг или приблизительно 3,0 мкг полисахарида на гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11A, 12F, 15В, 22F и 33F.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 2,0 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 3,0 мкг, приблизительно 3,2 мкг, приблизительно 3,4 мкг, приблизительно 3,6 мкг, приблизительно 3,8 мкг, приблизительно 4,0 мкг, приблизительно 4,2 мкг, приблизительно 4,4 мкг, приблизительно 4,6 мкг, приблизительно 4,8 мкг, приблизительно 5,0, приблизительно 5,2 мкг, приблизительно 5,4 мкг, приблизительно 5,6 мкг, приблизительно 5,8 мкг или приблизительно 6,0 мкг полисахарида на гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 6В.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F и от приблизительно 3,0 мкг до приблизительно 6,0 мкг полисахарида на гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 6В.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F и от приблизительно 4,0 мкг до приблизительно 4,8 мкг полисахарида на гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 6В.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 2,2 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и/или 33F и приблизительно 4,4 мкг полисахарида на гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 6В.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, 10А, 11A, 12F, 15В, 22F и 33F.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит от приблизительно 2,0 мкг до приблизительно 2,5 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 2,2 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, 10А, 11A, 12F, 15В, 22F и 33F.

5.2. Количество носителя

Как правило, каждая доза иммуногенной композиции по изобретению содержит от 1 мкг до 150 мкг белка-носителя, в частности от 10 мкг до 100 мкг белка-носителя, более конкретно от 15 мкг до 50 мкг белка-носителя и даже более конкретно от 16 мкг до 40 мкг белка-носителя. В одном воплощении изобретения указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 11 мкг, приблизительно 12 мкг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 14 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 51 мкг, приблизительно 52 мкг, приблизительно 53 мкг, приблизительно 54 мкг, приблизительно 55 мкг, приблизительно 56 мкг, приблизительно 57 мкг, приблизительно 58 мкг, приблизительно 59 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 61 мкг, приблизительно 62 мкг, приблизительно 63 мкг, приблизительно 64 мкг, приблизительно 65 мкг, приблизительно 66 мкг, приблизительно 67 мкг, приблизительно 68 мкг, приблизительно 69 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 71 мкг, приблизительно 72 мкг, приблизительно 73 мкг, приблизительно 74 мкг или приблизительно 75 мкг белка-носителя. В одном воплощении изобретения указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном воплощении изобретения каждая доза содержит приблизительно 10 мкг, приблизительно 11 мкг, приблизительно 12 мкг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 14 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг или приблизительно 30 мкг белка-носителя. В одном воплощении изобретения указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

6. Дополнительные антигены

Иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат конъюгированный(ые) сахаридный(ые) антиген(ы) S. pneumoniae (гликоконъюгат(ы)). Они могут также включать по меньшей мере один антиген из других патогенных организмов, в частности бактерий и/или вирусов.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем документе, дополнительно содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы, состоящей из дифтерийного анатоксина (D), столбнячного анатоксина (Т), коклюшного антигена (Р), ацеллюлярного коклюшного антигена (Ра), поверхностного антигена вируса гепатита В (HBV) (HBsAg), антигена вируса гепатита А (HAV), конъюгированного капсульного сахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib) и инактивированной полиовирусной вакцины (IPV).

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат D-T-Pa. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат D-T-Pa-Hib, D-T-Pa-IPV или D-T-Pa-HBsAg. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат D-T-Pa-HBsAg-IPV или D-T-Pa-HBsAg-Hib. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib.

Коклюшные антигены: Bordetella pertussis вызывает коклюш. Коклюшные антигены в вакцинах являются либо целлюлярными (цельноклеточными, в форме инактивированных клеток В. pertussis), либо ацеллюлярными. Получение целлюлярных коклюшных антигенов широко описано документально (например, они могут быть получены путем инактивации нагреванием культуры I фазы В. pertussis). Тем не менее, предпочтительно в изобретении применяют ацеллюлярные антигены. При применении ацеллюлярных антигенов предпочтительно применять один, два или (предпочтительно) три из следующих антигенов: (1) обезвреженный коклюшный токсин (коклюшный анатоксин, или РТ); (2) филаментный гемагглютинин (FHA); (3) пертактин (также известный как 69-килодальтонный белок наружной мембраны). Перед применением в соответствии с изобретением FHA и пертактин можно обрабатывать формальдегидом. РТ предпочтительно обезвреживают обработкой формальдегидом и/или глутаральдегидом. Ацеллюлярные коклюшные антигены предпочтительно адсорбируют на одном или более адъювантов, представляющих собой соли алюминия. В качестве альтернативы их можно добавлять в неадсорбированном состоянии. При добавлении пертактина предпочтительно он уже адсорбирован на адъюванте, представляющем собой гидрат окиси алюминия. РТ и FHA могут быть адсорбированы на адъюванте, представляющем собой гидрат окиси алюминия или фосфат алюминия. Наиболее предпочтительна адсорбция всех из РТ, FHA и пертактина на гидрате окиси алюминия.

Инактивированная вакцина против полиовируса: Полиовирус вызывает полиомиелит. В предпочтительных воплощениях изобретения вероятнее используют IPV, чем пероральную полиовирусную вакцину. До введения пациентам полиовирусы должны быть инактивированы, что может быть достигнуто в результате обработки формальдегидом. Полиомиелит может быть вызван полиовирусом одного из трех типов. Эти три типа являются сходными и вызывают идентичные симптомы, но они различаются по антигенам, и инфекция одним типом не защищает от инфекции другими. Поэтому предпочтительно применять в изобретении три полиовирусных антигена: полиовируса типа 1 (например, штамма Mahoney), полиовируса типа 2 (например, штамма MEF-1) и полиовируса типа 3 (например, штамм Saukett). Вирусы предпочтительно выращивают, очищают и инактивируют отдельно, после чего их объединяют с получением нерасфасованной трехвалентной смеси для применения с изобретением.

Дифтерийный анатоксин: Corynebacterium diphtheriae вызывает дифтерию. Дифтерийный токсин можно обрабатывать (например, используя формалин или формальдегид) для удаления токсичности, сохраняя при этом его способность к индуцированию специфических антител на токсин после введения. Эти дифтерийные анатоксины применяют в дифтерийных вакцинах. Предпочтительные дифтерийные анатоксины получают обработкой формальдегидом. Дифтерийный анатоксин может быть получен путем выращивания С. diphtheriae в ростовой среде с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Затем материал анатоксина может быть обработан способом, включающим стерильное фильтрование и/или диализ. Дифтерийный анатоксин предпочтительно адсорбирован на адъюванте, представляющем собой гидрат окиси алюминия.

Столбнячный анатоксин: Clostridium tetani вызывает столбняк. Столбнячный токсин может быть обработан с получением защитного анатоксина. Эти анатоксины применяют в столбнячных вакцинах. Предпочтительные столбнячные анатоксины получают обработкой формальдегидом. Столбнячный анатоксин может быть получен путем выращивания С. tetani в ростовой среде с последующей обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Затем этот материал может быть обработан способом, включающим стерильное фильтрование и/или диализ.

Антигены вируса гепатита А: Вирус гепатита A (HAV) является одним из известных агентов, вызывающих вирусный гепатит. Предпочтительный компонент HAV основан на инактивации вируса, инактивация которого может быть достигнута путем обработки формалином.

Вирус гепатита В (HBV) является одним из известных агентов, вызывающих вирусный гепатит. Основным компонентом капсида является белок, известный как поверхностный антиген HBV или чаще HBsAg, который в характерном случае представляет собой 226-аминокислотный полипептид с молекулярной массой приблизительно 24 кДа. Все существующие вакцины для гепатита В содержат HBsAg, и при введении этого антигена в нормальный вакцинируемый организм он стимулирует выработку антител к HBsAg, которые защищают его от инфекции HBV.

Для производства вакцины HBsAg получен двумя путями: очисткой антигена в форме частиц из плазмы крови хронических носителей гепатита В или экспрессией этого белка методами рекомбинантных ДНК (например, рекомбинантной экспрессии в клетках дрожжей). В отличие от нативного HBsAg (то есть в виде препарата, очищенного из плазмы крови), экспрессируемый в дрожжах HBsAg, как правило, не гликозилирован, и поэтому является наиболее предпочтительной формой HBsAg для применения с изобретением.

Конъюгированные антигены Haemophilus influenzae типа b: Haemophilus influenzae типа b (Hib) вызывает бактериальный менингит. Вакцины для профилактики Hib, как правило, основаны на антигене капсульного сахарида, получение которого широко отражено документально. Сахарид Hib может быть конъюгирован с белком-носителем для усиления его иммуногенности, особенно у детей. В характерном случае белки-носители представляют собой столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM₁₉₇, белок D Н. influenzae и белковый комплекс наружной мембраны менингококка серогруппы В. Сахаридная группировка конъюгата может содержать полноразмерный полирибозилрибитолфосфат (PRP) в виде, полученном из бактерий Hib, и/или фрагменты полноразмерного PRP. Конъюгаты Hib могут быть адсорбированы или не адсорбированы на адъюванте, представляющем собой соль алюминия.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают в себя конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают в себя конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы А (MenA), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, дополнительно включают в себя конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где любой(ые) из описанных выше дополнительных антигенов входит(ят) в состав первой иммуногенной композиции (части (а) набора).

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где любой(ые) из описанных выше дополнительных антигенов входит(ят) в состав второй иммуногенной композиции (части (б) набора).

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где любой(ые) из описанных выше дополнительных антигенов входит(ят) в состав первой иммуногенной композиции (части (а) набора), и любой(ые) из описанных выше дополнительных антигенов входит(ят) в состав второй иммуногенной композиции (части (б) набора).

7. Адъювант(ы)

В некоторых воплощениях изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, могут дополнительно содержать по меньшей мере один, два или три адъюванта. Термин «адъювант» относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут действовать, прежде всего, в качестве системы доставки, прежде всего, в качестве иммуномодулятора или обладать выраженными обоими признаками. Приемлемые адъюванты включают только приемлемые для применения у млекопитающих, в том числе у людей.

Примеры известных подходящих адъювантов типа системы доставки, которые можно применять у людей, включают, без ограничений, квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидрат окиси алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии масло-в-воде, такие как MF59 (4,3% масс./об. сквалена, 0,5% масс./об. полисорбата 80 (Твин^® 80), 0,5% масс./об. сорбитантриолеата (Спан 85)), эмульсии вода-в-масле, такие как Монтанид™ и микрочастицы или наночастицы сополимера D,L-молочной и гликолевой кислоты (PLG).

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат соли алюминия (квасцы) в качестве адъюванта (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидрат окиси алюминия). В предпочтительном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат в качестве адъюванта фосфат алюминия или гидрат окиси алюминия. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

Примеры известных подоходящих адъювантов иммуномодуляторного типа, которые можно применять у людей, включают, без ограничений, сапониновые экстракты из коры дерева Aquilla (QS21, QUILA^®), агонисты TLR4 (Toll-подобный рецептор 4), такие как MPL (монофосфориллипид A), 3DMPL (3-О-деацетилированный MPL) или GLA-AQ, мутанты LT/CT, цитокины, такие как различные интерлейкины (например, IL-2, IL-12) или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), и т.п.

Примеры известных подоходящих адъювантов иммуномодуляторного типа, обладающих признаками как доставки, так и иммуномодуляторов, которые можно применять у людей, включают, без ограничений, ISCOM (иммуностимулирующие комплексы) (см., например,

et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 и WO 2007/026190) или GLA-EM, представляющий собой комбинацию агониста TLR4 и эмульсии масло-в-воде.

Для ветеринарных применений, включающих, без ограничений, эксперименты с использованием животных, можно применять полный адъювант Фрейнда (CFA), неполный адъювант Фрейнда (IFA), EMULSIGEN^®, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, называемый nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835А, называемый МТР-РЕ) и RIBI™, содержащий три компонента, экстрагированные из бактерий, монофосфориллипид А, трегалозы димиколат и скелет клеточной стенки (MPL плюс TDM плюс CWS) в 2% эмульсии сквален/Твин^® 80.

Дополнительные примеры адъювантов для увеличения эффективности пневмококковых вакцин, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничений: (1) композиции в виде эмульсии масло-в-воде (содержащие или не содержащие другие специфические иммуностимулирующие агенты, такие как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки), такие как, например, (a) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Твин^® 80, 5% плюроник-блокполимера L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный с образованием эмульсии с субмикронным размером частиц, либо перемешанный на вихревой мешалке с образованием эмульсии с более крупным размером частиц, и (б) адъювантная система RIBI™ (RAS) (Ribi Immunochem, г. Гамильтон, штат Монтана, США), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твин^® 80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки, таких как монофосфориллипид А (MPL), трегалозы димиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL плюс CWS (DETOX™); (2) можно использовать сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, г. Ворчестер, штат Массачусетс, США), ABISCO® (Isconova, Швеция) или ISCOMATRIX^® (Commonwealth Serum Laboratories, Австралия), или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), где ISCOM могут не содержать дополнительный детергент (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF) и т.д.; (5) монофосфориллипид A (MPL) или 3-О-деацилированный MPL (3dMPL) (см., например, GB-2220221, ЕР 0689454), возможно по существу в отсутствие квасцов при применении с пневмококковыми сахаридами (см., например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями масло-в-воде (см., например, ЕР 0835318, ЕР 0735898, ЕР 0761231); (7) простой эфир полиоксиэтилена или сложный эфир полиоксиэтилена (см., например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество сложный эфир полиоксиэтиленсорбита в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество простой или сложный алкиловый эфир полиоксиэтилена в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, олигонуклеотид CpG) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частица соли металла (см., например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсия масло-в-воде (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21) плюс 3dMPL плюс IM2 (возможно, плюс стерол) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты, для усиления эффективности композиции. Мурамилпептиды включают N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG в качестве адъюванта. Используемый в настоящем документе олигонуклеотид CpG относится к иммуностимулирующему олигонуклеотиду CpG (CpG ODN), и, соответственно, если не указано иное, эти термины используют взаимозаменяемо. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды CpG содержат один или более иммуностимулирующих мотивов CpG, представляющих собой неметилированные динуклеотиды цитозин-гуанин, возможно в пределах определенных предпочтительных контекстов оснований. Статус метилирования иммуностимулирующего мотива CpG в целом относится к остатку цитозина в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированный динуклеотид CpG, представляет собой олигонуклеотид, содержащий 5'-неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3'-гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с Toll-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом воплощении изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или более метилированных динуклеотидов CpG, которые будут активировать иммунную систему посредством TLR9, но не настолько сильно, как если бы мотив(ы) CpG был(и) неметилированным(и). Иммуностимулирующие олигонуклеотиды CpG могут содержать один или более чем один палиндром, который, в свою очередь, может включать в себя динуклеотид CpG. Олигонуклеотиды CpG описаны в ряде опубликованных патентов, опубликованных заявок на патенты и других публикаций, в том числе в патентах США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат любой из олигонуклеотидов CpG, описанных на странице 3, строка 22 - странице 12, строка 36 документа WO 2010/125480.

Идентифицированы различные классы иммуностимулирующих олигонуклеотидов CpG. Эти классы обозначены как А, В, С и Р и более подробно описаны на странице 3, строка 22 - странице 12, строка 36 документа WO 2010/125480. Способы по изобретению охватывают применение этих различных классов иммуностимулирующих олигонуклеотидов CpG.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG класса А. Предпочтительно олигонуклеотид CpG «класса А» по изобретению имеет приведенную ниже нуклеотидную последовательность:

. Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов А-класса включают:

; где «*» относится к фосфоротиоатной связи, а «_» относится к фосфодиэфирной связи.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG класса В. В одном воплощении настоящего изобретения олигонуклеотид CpG для применения в настоящем изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса В, представленный по меньшей мере формулой:

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3', где X₁, Х₂, Х₃ и Х₄ представляют собой нуклеотиды. В одном воплощении изобретения Х₂ представляет собой аденин, гуанин или тимин. В другом воплощении изобретения Х₃ представляет собой цитозин, аденин или тимин.

Последовательности олигонуклеотида CpG класса В по изобретению представляют собой последовательности, в широком смысле описанные выше, а также раскрытые в документах: WO 96/02555, WO 98/18810 и в патентах США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Примеры последовательностей включают, без ограничений, последовательности, раскрытые в этих последних заявках и патентах.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид CpG «класса В» по изобретению имеет приведенную ниже нуклеотидную последовательность:

, либо

, либо

, либо

, либо

В любой из этих последовательностей все связи могут представлять собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении изобретения в любой из этих последовательностей одна или более связей могут представлять собой фосфодиэфирные связи, предпочтительно между «С» и «G» мотива CpG, с получением полумягкого олигонуклеотида CpG. В любой из этих последовательностей 5' Т может быть замещен этил-уридином или атомом галогена; примеры замещений атомом галогена включают, без ограничений, замещения бром-уридином или йод-уридином.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов В-класса включают:

, либо

, либо

, либо

, либо

.

где «*» относится к фосфоротиоатной связи.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG класса С. В одном воплощении изобретения олигонуклеотид CpG «класса С» по изобретению имеет приведенную ниже нуклеотидную последовательность:

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

В любой из этих последовательностей все связи могут представлять собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении изобретения в любой из этих последовательностей одна или более связей могут представлять собой фосфодиэфирные связи, предпочтительно между «С» и «G» мотива CpG, с получением полумягкого олигонуклеотида CpG.

Некоторые неограничивающие примеры олигонуклеотидов С-класса включают:

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

, либо

где «*» относится к фосфоротиоатной связи, а «_» относится к фосфодиэфирной связи.

В любой из этих последовательностей 5' Т может быть замещен этил-уридином или атомом галогена; примеры замещений атомом галогена включают, без ограничений, замещения бром-уридином или йод-уридином.

В одном воплощении настоящего изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат олигонуклеотид CpG класса Р. В одном воплощении настоящего изобретения олигонуклеотид CpG для применения в настоящем изобретении представляет собой олигонуклеотид CpG класса Р, содержащий домен активации 5' TLR и по меньшей мере два палиндромных участка, где один палиндромный участок представляет собой 5'-палиндромный участок по меньшей мере из 6 нуклеотидов в длину, соединенный с 3'-палиндромным участком по меньшей мере из 8 нуклеотидов в длину либо непосредственно, либо посредством спейсера, где олигонуклеотид включает по меньшей мере динуклеотид YpR. В одном воплощении изобретения указанный олигонуклеотид не представляет собой последовательность

.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид CpG класса Р включает по меньшей мере один неметилированный динуклеотид CpG. В другом воплощении изобретения домен активации TLR представляет собой TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT или TTTT. Еще в одном воплощении изобретения домен активации TLR находится внутри 5'-палиндромного участка. В другом воплощении изобретения домен активации TLR находится в ближайшем 5'-положении к 5'-палиндромному участку.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотиды CpG «класса Р» по изобретению имеют приведенную ниже нуклеотидную последовательность:

.

В указанных последовательностях все связи могут представлять собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении изобретения одна или более связей могут представлять собой фосфодиэфирные связи, предпочтительно между «С» и «G» мотива CpG, с получением полумягкого олигонуклеотида CpG. В любой из этих последовательностей 5' Т может быть замещен этил-уридином или атомом галогена; примеры замещений атомом галогена включают, без ограничений, замещения бром-уридином или йод-уридином.

Неограничивающий пример олигонуклеотидов Р-класса включают:

где «*» относится к фосфоротиоатной связи, а «_» относится к фосфодиэфирной связи.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь. В другом воплощении изобретения все межнуклеотидные связи олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи. В другом воплощении изобретения олигонуклеотид включает по меньшей мере одну связь, подобную фосфодиэфирной связи. В другом воплощении изобретения связь, подобная фосфодиэфирной связи, представляет собой фосфодиэфирную связь. В другом воплощении изобретения липофильная группа конъюгирована с олигонуклеотидом. В одном воплощении изобретения липофильная группа представляет собой холестерин.

В одном воплощении изобретения все межнуклеотидные связи олигонуклеотидов CpG, раскрытые в настоящем документе, представляют собой фосфодиэфирные связи («мягкие» олигонуклеотиды, как описано в WO 2007/026190). В другом воплощении изобретения олигонуклеотидам CpG по изобретению придают устойчивость к разложению (например, стабилизируют). «Стабилизированный олигонуклеотид» относится к олигонуклеотиду, который обладает относительной устойчивостью к разложению in vivo (например, экзо- или эндонуклеазой). Стабилизацию нуклеиновой кислоты можно осуществить посредством модификаций каркаса. Олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи обеспечивают максимальную активность и защищают олигонуклеотид от разложения внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут иметь химерный каркас, содержащий комбинации фосфодиэфирных и фосфоротиоатных связей. Для задач настоящего изобретения химерный каркас относится к частично стабилизированному каркасу, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь представляет собой фосфодиэфирную или подобную фосфодиэфирной связь, и где по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь представляет собой стабилизированную межнуклеотидную связь, где по меньшей мере одна фосфодиэфирная или подобная фосфодиэфирной связь отличается от по меньшей мере одной стабилизированной связи. В случае преимущественной локализации фосфодиэфирной связи внутри мотива CpG такие молекулы называют «полумягкими», как описано в WO 2007/026190.

Другие модифицированные олигонуклеотиды включают комбинации фосфодиэфирных, фосфоротиоатных, метилфосфонатных, метилфосфоротиоатных, фосфородитиоатных и/или пара-этокси-связей.

ODN со смешанным модифицированным каркасом можно синтезировать, как описано в WO 2007/026190.

Размер олигонуклеотида CpG (то есть число нуклеотидных остатков вдоль длины олигонуклеотида) также может вносить вклад в стимулирующую активность олигонуклеотида. Для облегчения захвата в клетки олигонуклеотид CpG по изобретению предпочтительно имеет минимальную длину 6 нуклеотидных остатков. Олигонуклеотиды любого размера, большего, чем 6 нуклеотидов (даже длиной в несколько т.п.н.) способны к индуцированию иммунного ответа при наличии достаточного количества иммуностимулирующих мотивов, поскольку олигонуклеотиды большей длины разлагаются внутри клетки. В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотиды CpG имеют длину от 6 до 100 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 30 нуклеотидов. В важных воплощениях изобретения нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды по изобретению не представляют собой плазмиды или экспрессионные векторы.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид CpG, раскрытый в настоящем документе, содержит замены или модификации, например в основаниях и/или сахарах, как описано в параграфах 134-147 WO 2007/026190.

В одном воплощении изобретения олигонуклеотид CpG химически модифицирован. Примеры химических модификаций известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в публикациях Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; и Hunziker et al. (1995) Mod. Synth. Methods 7:331-417. Олигонуклеотид согласно изобретению может иметь одну или более модификаций, где каждая модификация локализована в конкретном фосфодиэфирном межнуклеозидном мостике и/или в конкретном β-D-рибозном звене и/или в конкретном природном положении нуклеозидного основания по сравнению с олигонуклеотидом такой же последовательности, состоящем из природной ДНК или РНК.

В некоторых воплощениях изобретения CpG-содержащие нуклеиновые кислоты можно просто смешивать с иммуногенными носителями в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники (см., например, WO 03/024480).

В конкретном воплощении настоящего изобретения любая из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе, содержит от 2 мкг до 100 мг олигонуклеотида CpG, предпочтительно от 0,1 мг до 50 мг олигонуклеотида CpG, предпочтительно от 0.2 мг до 10 мг олигонуклеотида CpG, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг олигонуклеотида CpG, предпочтительно от 0,3 мг до 5 мг олигонуклеотида CpG, еще более предпочтительно от 0,5 до 2 мг олигонуклеотида CpG, еще более предпочтительно от 0,75 до 1,5 мг олигонуклеотида CpG. В предпочтительном воплощении изобретения любая из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе, содержит приблизительно 1 мкг олигонуклеотида CpG

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению (такая, как определено в разделе 2 выше) содержит адъювант, как определено выше, предпочтительно соль алюминия (квасцы) (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидрат окиси алюминия). В предпочтительном воплощении изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит в качестве адъюванта фосфат алюминия или гидрат окиси алюминия.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция, которую можно применять в комбинации с иммуногенной композицией по изобретению (такая, как определено в разделе 3 выше), содержит адъювант, как определено выше, предпочтительно соль алюминия (квасцы) (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидрат окиси алюминия). В предпочтительном воплощении изобретения указанные иммуногенные композиции содержат в качестве адъюванта фосфат алюминия или гидрат окиси алюминия.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где только первая иммуногенная композиция (часть (а) набора) содержит адъювант, как определено выше.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где только вторая иммуногенная композиция (часть (б) набора) содержит адъювант, как определено выше.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) содержат адъювант, как определено выше.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) содержат адъювант, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидрата окиси алюминия.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) содержат в качестве адъюванта фосфат алюминия.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) содержат в качестве адъюванта гидрат окиси алюминия.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) содержат в качестве адъюванта сульфат алюминия.

8. Приготовление

Иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, можно готовить в жидкой форме (то есть в виде растворов или суспензий) или в лиофилизированной форме. Жидкие композиции можно преимущественно вводить непосредственно из их упакованной формы, и поэтому они идеальны для введения путем инъекции без необходимости в восстановлении в водной среде, что в ином случае требуется для лиофилизированных композиций.

Приготовление иммуногенной композиции, раскрытой в настоящем документе, может быть выполнено с использованием способов, признанных в данной области техники. Например, отдельные пневмококковые конъюгаты могут быть приготовлены в физиологически приемлемом растворителе для получения композиции. Примеры таких растворителей включают, без ограничений, воду, забуференный фосфатом физиологический раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В настоящем описании предложена иммуногенная композиция, содержащая любую комбинацию гликоконъюгатов, раскрытых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем документе, находится в жидкой форме, предпочтительно в водной жидкой форме.

Иммуногенные композиции по данному описанию могут содержать одно или более из буфера, соли, двухвалентного катиона, неионного детергента, криопротектора, такого как сахар, и антиоксиданта, такого как акцептор свободных радикалов или хелатирующий агент, или любых их комбинаций.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат буфер. В одном воплощении изобретения указанный буфер имеет pKa от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5. В некоторых воплощениях изобретения буфер представляет собой фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер. В некоторых воплощениях изобретения буфер представляет собой сукцинатный буфер в конечной концентрации от 1 мМ до 10 мМ. В одном конкретном воплощении изобретения конечная концентрация сукцинатного буфера составляет приблизительно 5 мМ.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат соль. В некоторых воплощениях изобретения соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном воплощении изобретения соль представляет собой хлорид натрия. В одном конкретном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат хлорид натрия в концентрации 150 нМ.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, содержат поверхностно-активное вещество. В одном воплощении изобретения поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20 (Твин™20), полисорбата 40 (Твин™40), полисорбата 60 (Твин™ 60), полисорбата 65 (Твин™ 65), полисорбата 80 (Твин™ 80), полисорбата 85 (Твин™ 85), Тритон™ N-101, Тритон™ Х-100, октоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, триэтаноламинполипептидолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарата (PEG-15, Solutol Н 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В одном конкретном воплощении изобретения поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80. В некоторых из указанных воплощений изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В некоторых из указанных воплощений изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В некоторых из указанных воплощений изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В других воплощениях изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 80 (масс./масс.). В другом воплощении изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет 1% полисорбата 80 (масс./масс.).

В некоторых воплощениях изобретения иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем документе, имеет рН от 5,5 до 7,5, более предпочтительно рН от 5,6 до 7,0, еще более предпочтительно рН от 5,8 до 6,0.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен контейнер, заполненный любой из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе. В одном воплощении изобретения контейнер выбран из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, пакета, банки, ампулы, картриджа и одноразового шприца-ручки. В некоторых воплощениях изобретения контейнер силиконизирован.

В одном воплощении изобретения контейнер выполнен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.д.) и/или полимеров (например, термопластических полимеров, эластомеров, термопластических эластомеров). В одном воплощении изобретения контейнер выполнен из стекла.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен шприц, заполненный любой из иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем документе. В некоторых воплощениях изобретения шприц силиконизирован и/или выполнен из стекла.

В характерном случае доза иммуногенной композиции, раскрытой в настоящем документе, для инъекций имеет объем от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно объем приблизительно 0,5 мл.

Следовательно, контейнер или шприц, как определено выше, заполняют объемом от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, еще более предпочтительно объемом приблизительно 0,5 мл, любой из иммуногенных композиций, определенных в настоящем документе.

В одном воплощении изобретения лекарственную форму иммуногенной композиции по изобретению (такой, как определено в разделе 2 выше) готовят, как раскрыто выше.

В одном воплощении изобретения лекарственную форму иммуногенной композиции, которую можно применять в комбинации с иммуногенной композицией по изобретению (как определено в разделе 3 выше), готовят, как раскрыто выше.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) готовят, как описано выше.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) готовят в жидкой форме.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где обе иммуногенные композиции (части (а) и (б) набора) готовят в лиофилизированной форме.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где первая иммуногенная композиция (часть (а) набора), имеет жидкую форму, а вторая иммуногенная композиция (часть (б) набора) имеет лиофилизированную форму.

В одном аспекте изобретения предложен набор, как определено в разделе 4 выше, где первая иммуногенная композиция (часть (а) набора), имеет лиофилизированную форму, а вторая иммуногенная композиция (часть (б) набора) имеет жидкую форму.

9. Применения иммуногенных композиций и наборов по изобретению

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве лекарственного средства.

Иммуногенные композиции и наборы, описанные в настоящем документе, можно применять в различных терапевтических или профилактических способах для профилактики, лечения или улучшения состояния при бактериальной инфекции, заболевании или состоянии у субъекта. В частности, иммуногенные композиции и наборы, описанные в настоящем документе, можно применять для профилактики, лечения или улучшения состояния при инфекции S. pneumoniae, вызванном ею заболевании или состоянии у субъекта.

Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложен способ профилактики, лечения или улучшения состояния при инфекции, заболевании или состоянии, ассоциированых с S. pneumoniae, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в настоящем документе.

В некоторых таких воплощениях изобретения инфекция, заболевание или состояние выбраны из группы, состоящей из пневмонии, синусита, среднего отита, острого среднего отита, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса головного мозга.

В одном воплощении в изобретении предложен способ индуцирования иммунного ответа на S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве вакцины. В таких воплощениях изобретения иммуногенные композиции и наборы, описанные в настоящем документе, можно применять для профилактики инфекции S. pneumoniae у субъекта. Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложен способ профилактики инфекции S. pneumoniae у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. В некоторых таких воплощениях изобретения инфекция выбрана из группы, состоящей из пневмонии, синусита, среднего отита, острого среднего отита, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса головного мозга. В одном аспекте изобретения субъект, подлежащий вакцинации, представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, крупный рогатый скот или собака.

В одном аспекте изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в способе профилактики, лечения или улучшения состояния при инфекции, заболевании или состоянии, ассоциированных с S. pneumoniae, у субъекта. В некоторых таких воплощениях изобретения инфекция, заболевание или состояние выбраны из группы, состоящей из пневмонии, синусита, среднего отита, острого среднего отита, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса головного мозга.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве вакцины. В таких воплощениях изобретения иммуногенные композиции и наборы, описанные в настоящем документе, можно применять для профилактики инфекции S. pneumoniae у субъекта. Таким образом, в одном аспекте изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в способе профилактики инфекции S. pneumoniae у субъекта. В некоторых таких воплощениях изобретения инфекция выбрана из группы, состоящей из пневмонии, синусита, среднего отита, острого среднего отита, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, целлюлита, инфекции мягких тканей и абсцесса головного мозга. В одном аспекте изобретения субъект, подлежащий вакцинации, представляет собой млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, крупный рогатый скот или собака.

Иммуногенные композиции и наборы по настоящему изобретению можно применять для защиты или лечения человека, подверженного пневмококковой инфекции, посредством введения иммуногенных композиций системным или мукозальным путем. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят внутримышечным, интраперитонеальным, внутрикожным или подкожным путем. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят путем внутримышечной, интраперитонеальной, внутрикожной или подкожной инъекции. В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту способна индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С, которое измеряют с помощью стандартного анализа ELISA (иммуносорбентного ферментного анализа). В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту может индуцировать образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В и 15С, которое измеряют с помощью стандартного анализа ELISA.

В способе ELISA (иммуносорбентного ферментного анализа) антитела сыворотки крови вакцинированных субъектов инкубируют с полисахаридами, адсорбированными на твердой подложке. Связанные антитела выявляют с использованием вторичных выявляющих антител, конъюгированных с ферментом.

В одном воплощении изобретения указанный стандартный анализ ELISA представляет собой стандартизованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) анализ ELISA, как определено в документе ВОЗ «Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA)» (документ доступен на сайте http://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf; доступ осуществлялся 31 марта 2014 г.).

ELISA позволяет количественно определить типоспецифические антитела IgG к капсульному полисахариду (PS) S. pneumoniae, присутствующие в сыворотке крови человека. При внесении разведений сыворотки крови человека в планшеты для микротитрования, покрытые типоспецифическим капсульным PS, антитела, специфичные к этому капсульному PS, связываются с планшетами для микротитрования. Антитела, связанные с планшетами, выявляют с использованием козьего антитела против IgG человека, меченного щелочной фосфатазой, с последующим добавлением субстрата пара-нитрофенилфосфата. Оптическая плотность окрашенного конечного продукта пропорциональна количеству антитела к капсульному PS, присутствующего в сыворотке крови.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), способна вызывать у человека выработку антител IgG, способных к связыванию полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В в концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено в анализе ELISA.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), способна вызывать у человека выработку антител IgG, способных к связыванию полисахарида S. pneumoniae серотипа 15С в концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено в анализе ELISA.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), способна вызывать у человека выработку антител IgG, способных к связыванию полисахарида S. pneumoniae серотипов 15В и 15С в концентрации по меньшей мере 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,35, 0,4 или 0,5 мкг/мл, как определено в анализе ELISA.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15В в анализе опсонофагоцитоза, как раскрыто в настоящем документе (таком как анализ ОРА, описанный в примере 12).

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при тестировании в анализе ОРА, как раскрыто в настоящем описании (таком как анализ ОРА в примере 12), характеризуется более высоким титром ОРА по сравнению с титром ОРА, полученным с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту способна индуцировать образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15С в анализе опсонофагоцитоза, как раскрыто в настоящем документе (таком как анализ ОРА, описанный в примере 12). В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при тестировании в анализе ОРА, как раскрыто в настоящем описании (таком как анализ ОРА в примере 12), характеризуется более высоким титром ОРА по сравнению с титром ОРА, полученным с неконъюгированным нативным капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 15В.

Пневмококковый опсонофагоцитарный анализ (ОРА), в котором измеряют уничтожение клеток S. pneumoniae эффекторными клетками-фагоцитами в присутствии функционального антитела и комплемента, считают важным косвенным показателем для оценки эффективности пневмококковых вакцин.

Опсонофагоцитарный анализ (ОРА) можно проводить путем совместной инкубации смеси клеток Streptococcus pneumoniae, исследуемой сыворотки крови человека, инактивированной нагреванием, дифференцированных клеток HL-60 (фагоцитов) и экзогенного источника комплемента (например, комплемент детеныша кролика). В ходе инкубации протекает опсонофагоцитоз, и посредством опсонофагоцитоза происходит уничтожение бактериальных клеток, покрытых антителом и комплементом. Число колониеобразующих единиц (CFU) выживших бактерий, избежавших опсонофагоцитоза, определяют путем посева анализируемой смеси. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками, не содержащими исследуемую сыворотку крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

При данном типе анализа уничтожения ОРА положительным результатом считают конечный титр 1:8 или более.

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), может вызывать титр антител по меньшей мере 1:8 к S. pneumoniae серотипа 15В у по меньшей мере 50% субъектов, как определено посредством анализа опсонофагоцитарного уничтожения (ОРА). В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), может вызывать титр антител по меньшей мере 1:8 к S. pneumoniae серотипа 15В у по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или по меньшей мере 93% субъектов, как определено посредством анализа опсонофагоцитарного уничтожения (ОРА).

В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), может вызывать титр антител по меньшей мере 1:8 к S. pneumoniae серотипа 15С у по меньшей мере 50% субъектов, как определено посредством анализа опсонофагоцитарного уничтожения (ОРА). В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), может вызывать титр антител по меньшей мере 1:8 к S. pneumoniae серотипа 15С у по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или по меньшей мере 95% субъектов, как определено посредством анализа опсонофагоцитарного уничтожения (ОРА).

В следующем аспекте в настоящем описании предложен способ лечения или профилактики инфекции S. pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с S. pneumoniae серотипа 15А, 15В и/или 15С у субъекта, включающий стадию введения терапевтически или профилактически эффективного количества любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше). В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту индуцирует образование антител, способных к связыванию с S. pneumoniae серотипа 15В, 15А и/или 15С. В одном воплощении изобретения иммуногенная композиция по настоящему описанию, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), при введении субъекту индуцирует образование антител, способных к уничтожению S. pneumoniae серотипа 15В, 15С и/или 15А в анализе опсонофагоцитарной активности, как раскрыто в настоящем документе (таком как анализ ОРА в примере 12).

В одном воплощении описания предложен способ защиты субъекта от инфекции S. pneumoniae серотипа 15С, или способ профилактики инфекции S. pneumoniae серотипа 15С, или способ уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae серотипа 15С, где эти способы включают введение субъекту иммуногенного количества любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше). В одном воплощении описания предложен способ лечения или профилактики инфекции S. pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше). В другом воплощении описания предложен способ лечения или профилактики инфекции S. pneumoniae, заболевания или состояния, ассоциированного с S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) у субъекта, включающий стадию получения препарата поликлонального или моноклонального антитела из любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), и применения указанного препарата антитела для обеспечения пассивного иммунитета у субъекта.

В одном воплощении описание относится к применению любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше) для производства лекарственного средства для защиты субъекта от инфекции S. pneumoniae и/или профилактики инфекции S. pneumoniae и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта от инфекции S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) и/или профилактики инфекции S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B).

В одном воплощении описание относится к применению любой из иммуногенных композиций по настоящему описанию, содержащей по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B (такой как гликоконъюгаты, описанные в разделе 1.3.4 выше), для защиты субъекта от инфекции S. pneumoniae и/или профилактики инфекции S. pneumoniae и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae, и/или защиты субъекта от инфекции S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) и/или профилактики инфекции S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B) и/или уменьшения тяжести или задержки возникновения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией, вызванной S. pneumoniae серотипа 15А, 15B и/или 15С (предпочтительно 15B и/или 15С, более предпочтительно 15B).

10. Субъект, подлежащий лечению иммуногенными композициями и наборами по изобретению

Как раскрыто в настоящем документе, иммуногенные композиции и наборы, описанные в настоящем документе, можно применять в различных терапевтических или профилактических способах для профилактики, лечения или улучшения состояния при бактериальной инфекции, заболевании или состоянии у субъекта.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный субъект представляет собой человека. В наиболее предпочтительном воплощении изобретения указанный субъект представляет собой новорожденного (то есть в возрасте до трех месяцев), младенца (то есть в возрасте от 3 месяцев до одного года) или ребенка, начинающего ходить (то есть в возрасте от одного года до четырех лет).

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции и наборы, раскрытые в настоящем документе, предназначены для применения в качестве вакцины.

В таком воплощении изобретения вакцинируемый субъект может быть в возрасте младше 1 года. Например, вакцинируемый субъект может быть в возрасте приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 месяцев. В одном воплощении изобретения вакцинируемый субъект находится в возрасте приблизительно 2, приблизительно 4 или приблизительно 6 месяцев. В другом воплощении изобретения вакцинируемый субъект находится в возрасте младше 2 лет. Например, вакцинируемый субъект может быть в возрасте от приблизительно 12 до приблизительно 15 месяцев. В некоторых случаях требуется только одна доза иммуногенной композиции согласно изобретению, но в некоторых обстоятельствах можно вводить вторую, третью или четвертую дозу (см. раздел 11 ниже).

В одном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект представляет собой взрослого человека в возрасте 50 лет или старше, более предпочтительно взрослого человека в возрасте 55 лет или старше. В одном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект представляет собой взрослого человека в возрасте 65 лет или старше, в возрасте 70 лет или старше, в возрасте 75 лет или старше или в возрасте 80 лет или старше.

В одном воплощении изобретения вакцинируемый субъект представляет собой лицо с нарушенным иммунитетом, в частности человека. Лицо с нарушенным иммунитетом обычно определяют как лицо, проявляющее ослабленную или сниженную способность к развитию нормальной гуморальной или клеточной защиты от заражения инфекционными агентами.

В одном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом страдает заболеванием или состоянием, которое нарушает иммунную систему и приводит в результате к недостаточному антительному ответу для защиты от пневмококкового заболевания или для его лечения.

В одном воплощении изобретения указанное заболевание представляет собой первичное иммунодефицитное расстройство. Предпочтительно указанное первичное иммунодефицитное расстройство выбрано из группы, состоящей из: объединенных Т- и В-клеточных иммунодефицитов, дефицитов антител, четко выраженных синдромов, заболеваний, обусловленных нарушением регуляции иммунитета, фагоцитарных расстройств, врожденных иммунодефицитов, аутовоспалительных расстройств и дефицитов комплемента. В одном воплощении изобретения указанное первичное иммунодефицитное расстройство выбрано из расстройств, описанных на странице 24, строка 11 - странице 25, строка 19 документа WO 2010/125480.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом страдает заболеванием, выбранным из группы, состоящей из: HIV-инфекции (вирус иммунодефицита человека), синдрома приобретенного иммунодефицита (AIDS), рака, хронических сердечных или легочных расстройств, застойной сердечной недостаточности, сахарного диабета, хронического заболевания печени, алкоголизма, цирроза, утечки спинномозговой жидкости, кардиомиопатии, хронического бронхита, эмфиземы легких, хронической обструктивной болезни легких (COPD), дисфункции селезенки (такой как серповидно-клеточная анемия), отсутствия функции селезенки (аспления), злокачественного заболевания крови, лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, лимфомы, почечной недостаточности, нефротического синдрома и бронхиальной астмы.

В одном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом страдает алиментарной недостаточностью.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом принимает лекарственное средство или получает лечение, снижающее сопротивляемость организма инфекции. В одном воплощении изобретения указанное лекарственное средство выбрано из лекарственных средств, описанных на странице 26, строка 33 - странице 26, строка 4 документа WO 2010/125480.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом является курильщиком.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом имеет содержание белых кровяных телец в крови (содержание лейкоцитов в крови) менее 5×10⁹ клеток на литр, или менее 4×10⁹ клеток на литр, или менее 3×10⁹ клеток на литр, или менее 2×10⁹ клеток на литр, или менее 1×10⁹ клеток на литр, или менее 0,5×10⁹ клеток на литр, или менее 0,3×10⁹ клеток на литр, или менее 0,1×10⁹ клеток на литр.

Содержание белых кровяных клеток в крови (содержание лейкоцитов в крови): число белых кровяных клеток (WBC) в крови. WBC обычно измеряют в составе СВС (общего анализа крови). Белые кровяные клетки представляют собой клетки, которые борются с инфекцией в крови, и отличатся от красных (переносящих кислород) кровяных клеток, известных как эритроциты. Существуют различные типы белых кровяных клеток, включая нейтрофилы (полиморфоядерные лейкоциты; PMN), палочкоядерные лейкоциты (несколько незрелые нейтрофилы), лимфоциты Т-типа (Т-клетки), лимфоциты В-типа (В-клетки), моноциты, эозинофилы и базофилы. Содержание белых кровяных клеток в крови отражает все типы белых кровяных клеток. Диапазон нормы содержания белых кровяных клеток в крови обычно составляет от 4300 до 10800 клеток на кубический миллиметр крови. Оно также может называться количеством лейкоцитов и может быть выражено в международных единицах как 4,3-10,8×10⁹ клеток на литр.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом страдает нейтропенией. В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом имеет содержание нейтрофилов в крови менее 2×10⁹ клеток на литр, или менее 1×10⁹ клеток на литр, или менее 0,5×10⁹ клеток на литр, или менее 0,1×10⁹ клеток на литр, или менее 0,05×10⁹ клеток на литр.

Низкое содержание белых кровяных клеток или «нейтропения» представляет собой состояние, характеризующееся патологически низкими уровнями нейтрофилов в циркулирующей крови. Нейтрофилы представляют собой особый вид белых кровяных клеток, которые помогают предотвращать инфекции и бороться с ними. Наиболее частой причиной нейтропении у раковых пациентов является побочный эффект химиотерапии. Нейтропения, индуцированная химиотерапией, приводит к повышенному риску инфекции у пациента и прекращению лечения рака.

В конкретном воплощении настоящего изобретения вакцинируемый субъект с нарушенным иммунитетом имеет содержание клеток CD4+ менее 500/мм³, или содержание клеток CD4+ менее 300/мм³, или содержание клеток CD4+ менее 200/мм³, содержание клеток CD4+ менее 100/мм³, содержание клеток CD4+ менее 75/мм³, или содержание клеток CD4+ менее 50/мм³.

Анализы на содержание CD4-клеток обычно описывают как число клеток в мм³. Нормальное содержание CD4-клеток составляет от 500 до 1600, а содержание CD8-клеток составляет от 375 до 1100. Содержание CD4 резко падает у людей с HIV.

В одном воплощении изобретения любой из субъектов с нарушенным иммунитетом, как раскрыто в настоящем документе, может быть человеком мужского пола или человеком женского пола.

11. Схема иммунизации

В некоторых случаев необходима только одна доза иммуногенной композиции в соответствии с изобретением, но в некоторых обстоятельствах, таких как состояния значительного иммунодефицита или недоразвитого иммунитета можно вводить вторую, третью или четвертую дозу. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с адекватным разделением по времени.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации иммуногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой однократную дозу. В конкретном воплощении изобретения указанная схема однократной дозы предназначена для здоровых лиц в возрасте по меньшей мере 2 лет.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации иммуногенной композицией в соответствии с изобретением представляет собой схему многократных доз. Схему многократных доз часто применяют при таких состояниях, как иммунодефицит (например, у пожилых людей или у людей с нарушенным иммунитетом) или недоразвитый иммунитет (например, у новорожденных людей (то есть в возрасте младше трех месяцев), младенцев (то есть в возрасте от 3 месяцев до одного года) или детей, начинающих ходить (то есть в возрасте от одного года до четырех лет)). В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 дозы) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, и одну или более бустерных доз вводят через интервалы, находящиеся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель между дозами, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недели.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, а бустерную дозу вводят спустя приблизительно 3 месяца.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 6, 7 или 8 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 6, 7 или 8 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 6, 7 или 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 6, 7 или 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 6, 7 или 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

Один аспект изобретения относится к любой иммуногенной композиции по изобретению для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения со второй иммуногенной композицией. Один аспект изобретения относится к любому набору, раскрытому в настоящем документе, для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения.

Под «совместным введением» подразумевают, что введение терапевтически эффективных доз первой и второй иммуногенных композиций осуществляют в одной единичной дозированной форме.

Под «сопутствующим введением» подразумевают, что введение терапевтически эффективных доз первой и второй иммуногенных композиций осуществляют через одну и ту же область доступа, но в отдельных единичных дозированных формах через короткий период времени друг от друга. Сопутствующее введение означает введение по существу двух иммуногенных композиций примерно в одно и то же время, но в отдельных дозированных формах, через одну и ту же область доступа. Сопутствующее введение первой и второй иммуногенных композиций часто осуществляется во время одного посещения медицинского учреждения.

Под «параллельным введением» подразумевают, что введение терапевтически эффективных доз первой и второй иммуногенных композиций осуществляют в отдельных единичных дозированных формах через короткий период времени друг от друга в различных анатомических областях. Параллельное введение означает введение по существу двух иммуногенных композиций примерно в одно и то же время, но в отдельных дозированных формах и в различных анатомических областях. Параллельное введение первой и второй иммуногенных композиций часто осуществляется во время одного посещения медицинского учреждения.

Под «последовательным введением» подразумевают введение терапевтически эффективной дозы только первой или только второй иммуногенной композиции с последующим введением терапевтически эффективной дозы оставшейся иммуногенной композиции через интервал по меньшей мере приблизительно 1 месяца. Например, в одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию вводят в одной дозированной форме, а затем через интервал по меньшей мере приблизительно 1 месяца вводят вторую иммуногенную композицию в одной отдельной дозированной форме. В альтернативном воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят в одной дозированной форме, а затем через интервал по меньшей мере приблизительно 1 месяца вводят первую иммуногенную композицию в одной отдельной дозированной форме. Последовательное введение первой и второй иммуногенных композиций часто осуществляется во время различных посещений медицинского учреждения.

В одном аспекте настоящего изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (такую как описано в разделе 2 выше) вводят совместно, сопутствующе, параллельно или последовательно со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В некоторых случаях необходима только одна доза каждой из иммуногенной композиции, но в некоторых обстоятельствах можно вводить вторую, третью или четвертую дозу одной или каждой из иммуногенных композиций. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с достаточным разделением по времени.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) для совместного введения со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным совместным введением представляет собой однократную дозу. В конкретном воплощении изобретения указанная схема однократной дозы предназначена для здоровых лиц в возрасте по меньшей мере 2 лет.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным совместным введением представляет собой схему многократных доз. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 дозы) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, и одну или более бустерных доз вводят через интервалы, находящиеся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель между дозами, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недели.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, а бустерную дозу вводят приблизительно через 3 месяца.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) для сопутствующего введения со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным сопутствующим введением представляет собой схему однократной дозы (для определения схемы иммунизации в качестве однократной дозы рассматривают введение первой и второй иммуногенной композиции, но в отдельных единичных дозированных формах). В конкретном воплощении изобретения указанная схема однократной дозы предназначена для здоровых лиц в возрасте по меньшей мере 2 лет.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным сопутствующим введением представляет собой схему многократных доз (для определения схемы иммунизации в качестве однократной дозы рассматривают введение первой и второй иммуногенной композиции, но в отдельных единичных дозированных формах). В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 дозы) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, и одну или более бустерных доз вводят через интервалы, находящиеся в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недели.

В одном воплощении изобретения примирующую дозу вводят в сутки 0, а бустерную дозу вводят спустя приблизительно 3 месяца.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5, 6, 7 или 8 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) для параллельного введения со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным параллельным введением представляет собой схему однократной дозы (для определения схемы иммунизации в качестве однократной дозы рассматривают введение первой и второй иммуногенной композиции, но в отдельных единичных дозированных формах). В конкретном воплощении изобретения указанная схема однократной дозы предназначена для здоровых лиц в возрасте по меньшей мере 2 лет.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным параллельным введением представляет собой схему многократных доз, в частности любую из схем многократных доз, раскрытых выше для сопутствующего введения.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) для последовательного введения со второй иммуногенной композицией. В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в первую очередь, а вторую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь. В другом воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в первую очередь, а первую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2, 3 или 4 доз.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2 доз. В конкретном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы вакцинации из 2 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в первую очередь, а вторую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь. В другом воплощении вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в первую очередь, а первую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

В одном воплощении указанной схемы вакцинации из 2 доз первую и вторую дозы вводят в первый год жизни. В одном воплощении указанных схем из 2 доз первую дозу вводят в первый год жизни, а вторая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении указанную дозу для ребенка, начинающего ходить, вводят в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении указанную дозу для ребенка, начинающего ходить, вводят в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 3 доз. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 3 доз первую и вторую дозы вводят в первый год жизни, а третья доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении первая и вторая дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, а третья доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении первая и вторая дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, а третья доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 3 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первых двух доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 3 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первых двух доз, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 3 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей дозы.

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз.

В другом воплощении указанной схемы из 3 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первых двух доз, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй и третьей доз.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 4 доз.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанной схемы из 4 доз указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением третьей дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы и четвертой дозы через от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев после третьей дозы.

В одном воплощении указанной схемы из 4 доз первую и вторую дозы вводят в первый год жизни, а третья и четвертая дозы представляют собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении указанной схемы из 4 доз первую, вторую и третью дозы вводят в первый год жизни, а четвертая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 4 доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первых трех доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первых трех доз, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой и второй доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой и второй доз, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей дозы, и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде четвертой дозы.

В другом воплощении указанной схемы из 4 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде второй и третьей доз, и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 5 доз.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема из 5 доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев, с последующим введением пятой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением пятой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением пятой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением пятой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы и пятой дозы через от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев после четвертой дозы.

В одном воплощении указанной схемы из 5 доз первую, вторую и третью дозы вводят в первый год жизни, а четвертая и пятая дозы представляют собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

В одном воплощении указанной схемы из 5 доз первую, вторую, третью и четвертую дозы вводят в первый год жизни, а пятая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема из 5 доз состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В воплощении указанной схемы из 5 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (такую как описано в разделе 2 выше, обозначенную в таблице ниже как 1-я ИК) и вторую иммуногенную композицию (такую как раскрытые в разделе 3 выше, обозначенную ниже в таблице как 2-я ИК) вводят в следующем порядке:

В таблице выше представлен порядок введения первой и второй иммуногенной композиции (обозначенных как 1-я ИК и 2-я ИК, соответственно) для различных доз, например, схему номер 1 следует читать как: в воплощении указанной схемы из 5 доз вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй, третьей и четвертой доз, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде пятой дозы.

В предпочтительном воплощении изобретения порядок введения первой и второй иммуногенной композиции осуществляют в соответствии со схемой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20 или 21.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанными последовательными дозами состоит из серии из 6 доз.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 6 доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением шестой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим введением шестой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы, или из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим введением шестой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении указанной схемы из 6 доз первую, вторую, третью, четвертую и пятую дозы вводят в первый год жизни, а шестая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема из 6 доз состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 6 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (такую как описано в разделе 2 выше) и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят в порядке, соответствующем любой из 30 схем, предложенных для схемы из 5 доз (см. таблицу выше, схемы 1-30), с последующим введением шестой дозы. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде шестой дозы. В другом воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят в виде шестой дозы.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанными последовательными дозами состоит из серии из 7 доз.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 7 доз состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением седьмой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении указанной схемы из 7 доз первую, вторую, третью, четвертую, пятую и шестую дозы вводят в первый год жизни, а седьмая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема из 7 доз состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема из 7 доз состоит из серии из 6 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 7 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (такую как описано в разделе 2 выше) и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 6 доз (см. выше), с последующим введением седьмой дозы. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде седьмой дозы. В другом воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят в виде седьмой дозы.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанными последовательными дозами состоит из серии из 8 доз.

В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 8 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 8 доз состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением восьмой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

В одном воплощении указанной схемы из 8 доз первую, вторую, третью, четвертую, пятую, шестую и седьмую дозы вводят в первый год жизни, а восьмая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема из 8 доз состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема из 7 доз состоит из серии из 7 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 8 доз первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (такую как описано в разделе 2 выше) и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 7 доз (см. выше), с последующим введением восьмой дозы. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде восьмой дозы. В другом воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят в виде восьмой дозы.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к последовательному введению:

(а) первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) и

(б) параллельному введению первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) со второй иммуногенной композицией.

В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2 введений. В одном воплощении изобретения схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в первую очередь, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют во вторую очередь. В другом воплощении параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют в первую очередь, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят во вторую очередь.

В одном воплощении указанной схемы из 2 введений первое и второе введения выполняют в первый год жизни. В одном воплощении указанной схемы из 2 введений первое введение выполняют в первый год жизни, а второе введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 3 введений. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 3 введений первое и второе введения выполняют в первый год жизни, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 3 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом и втором введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при третьем введении.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем введении.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором введении, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем введении.

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором введении, а при третьем введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией.

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором и третьем введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором и третьем введениях.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 4 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 4 введений указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 4 введений первое, второе и третье введения выполняют в первый год жизни, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 4 введений состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 4 введений состоит из серии введений в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом, втором и третьем введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом, втором и третьем введениях, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом и втором введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом и втором введениях, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при третьем введении, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем введении, а при четвертом введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором, третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, а первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором, третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором введении, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем введении, а при четвертом введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором введении, при третьем введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией, и при четвертом введении вводят первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором введении, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором введении, и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при втором и третьем введениях, и первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при втором и третьем введениях, и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при четвертом введении.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 5 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после введения первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 5 доз первое, второе, третье и четвертое введение выполняют в первый год жизни, а пятое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 5 введений состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 5 введений введение первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением (обозначенную в таблице ниже как 1-я ИК) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией (обозначенное в таблице ниже как 1-я ИК/2-я ИК) выполняют в следующем порядке:

В таблице выше приведен порядок введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (обозначенного в таблице выше как 1-я ИК) и параллельного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией (обозначенного в таблице выше как 1-я ИК/2-я ИК) для различных доз, например схему 1 следует читать как: в воплощении указанной схемы из 5 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют в виде первой, второй, третьей и четвертой доз, а введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением выполняют в виде пятой дозы.

В предпочтительном воплощении изобретения порядок введения осуществляют в соответствии со схемой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22 или 23.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением доз состоит из серии из 6 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 6 введений состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 6 введений первое, второе, третье, четвертое и пятое введение выполняют в первый год жизни, а шестое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 6 введений состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 6 введений введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением и второй иммуногенной композиции выполняют в порядке, соответствующем любой из 30 схем, предложенных для схемы из 5 введений (см. таблицу выше, схемы 1-30), с последующим шестым введением. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при шестом введении. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при шестом введении.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 7 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 7 введений состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 7 введений первое, второе, третье, четвертое, пятое и шестое введения выполняют в первый год жизни, а седьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 7 введений состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 7 введений введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 6 введений (см. таблицу выше, схемы 1-30), с последующим седьмым введением. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при седьмом введении. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют при седьмом введении.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 8 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 8 введений состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим восьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 8 введений первое, второе, третье, четвертое, пятое, шестое и седьмое введения выполняют в первый год жизни, а восьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 8 введений состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 8 введений введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 7 введений (см. выше), с последующим введением восьмой дозы. В одном воплощении изобретения первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде восьмой дозы. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией выполняют в виде восьмой дозы.

В одном воплощении изобретения в раскрытых выше схемах введения параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к последовательному введению:

(а) второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) и

(б) параллельному введению первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией.

В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема введения представляет собой любую из раскрытых выше схем для последовательного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением и параллельного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением со второй иммуногенной композицией (внизу страницы 176 - страница 189), где введение указанной второй иммуногенной композиции (а) заменяет введение первой иммуногенной композиции (а) в указанных схемах.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем введения параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

Таким образом, в одном воплощении настоящее изобретение относится к последовательному введению:

(а) второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) и

(б) параллельному введению первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией.

В одном воплощении изобретения указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой любую из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2 введений. В одном воплощении изобретения схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 2 введений, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят в первую очередь, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют во вторую очередь. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют в первую очередь, а введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) выполняют во вторую очередь.

В одном воплощении указанной схемы из 2 введений первое и второе введения выполняют в первый год жизни. В одном воплощении указанной схемы из 2 введений первое введение выполняют в первый год жизни, а второе введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 2 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 3 введений. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где первые два введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим третьим введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 3 доз первое и второе введения выполняют в первый год жизни, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят в первую очередь, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют во вторую очередь.

В одном воплощении указанной схемы из 3 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом и втором введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при третьем введении.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, а вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем введении.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) выполняют при втором введении, и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем введении.

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором введении, а при третьем введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше).

Еще в одном воплощении указанной схемы из 3 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом введении, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) выполняют при втором и третьем введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 3 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) выполняют при первом введении, а вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором и третьем введениях.

В одном воплощении указанной схемы из 3 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенное в таблице ниже как 2-я ИК) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) (обозначенное в таблице ниже как 1-я ИК/2-я ИК) выполняют в следующем порядке:

В таблице выше приведен порядок введения второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенного в таблице выше как 2-я ИК) и параллельного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией (обозначенного в таблице выше как 1-я ИК/2-я ИК) для различных доз, например схему номер 1 следует читать как: в одном воплощении указанной схемы из 3 введений вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют в виде третьей дозы.

В предпочтительном воплощении изобретения порядок введения соответствует схеме 1.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 3 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 4 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанной схемы из 4 введений указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 4 введений первое, второе и третье введения выполняют в первый год жизни, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 4 введений состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 3 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема из 4 введений состоит из серии введений в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом, втором и третьем введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом, втором и третьем введениях, а вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при первом и втором введениях, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, а вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом и втором введениях, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при третьем введении, и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом и втором введениях, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем введении, а при четвертом введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом введении, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при втором, третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, а вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором, третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при втором введении, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем введении, а при четвертом введении выполняют параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при третьем введении, и вторую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при втором введении, и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором введении, и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при третьем и четвертом введениях.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3) вводят при первом введении, параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при втором и третьем введениях, и вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при четвертом введении.

В другом воплощении указанной схемы из 4 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию (такую как описано в разделе 3 выше) вводят при втором и третьем введениях, и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при четвертом введении.

Таким образом, в одном воплощении указанной схемы из 4 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенное в таблице ниже как 2-я ИК) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией (обозначенное в таблице ниже как 1-я ИК/2-я ИК) выполняют в следующем порядке:

В таблице выше приведен порядок введения второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенного в таблице выше как 2-я ИК) и параллельного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией (обозначенного в таблице выше как 1-я ИК/2-я ИК) для различных доз, например схему номер 1, следует читать как: в одном воплощении указанной схемы из 3 введений вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй и третьей доз, а параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют в виде четвертой дозы.

В предпочтительном воплощении изобретения порядок введения соответствует схеме 1, 3 или 5.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 4 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 5 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после введения первой дозы. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 5 доз первое, второе, третье и четвертое введение выполняют в первый год жизни, а пятое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 5 введений состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 4 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 5 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенное в таблице ниже как 2-я ИК) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией (обозначенное в таблице ниже как 1-я ИК/2-я ИК) выполняют в следующем порядке:

В таблице выше приведен порядок введения второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) (обозначенного в таблице выше как 2-я ИК) и параллельного введения первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композицией (обозначенного в таблице выше как 1-я ИК/2-я ИК) для различных доз, например схему 1, следует читать как: в одном воплощении указанной схемы из 5 введений параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют в виде первой, второй, третьей и четвертой доз, а введение второй иммуногенной композиции выполняют в виде пятой дозы.

В предпочтительном воплощении изобретения порядок введения осуществляют в соответствии со схемой 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 30.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 5 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением доз состоит из серии из 6 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 6 введений состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения, или из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев, с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 6 введений первое, второе, третье, четвертое и пятое введение выполняют в первый год жизни, а шестое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 6 введений состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 6 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композиции выполняют в порядке, соответствующем любой из 30 схем, предложенных для схемы из 5 введений (см. таблицу выше, схемы 1-30), с последующим шестым введением. В одном воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят при шестом введении. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при шестом введении.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 6 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 7 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 7 введений состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим седьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 7 введений первое, второе, третье, четвертое, пятое и шестое введения выполняют в первый год жизни, а седьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 7 введений состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 7 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композиции выполняют в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 6 введений (см. выше), с последующим седьмым введением. В одном воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят при седьмом введении. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют при седьмом введении.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 7 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 8 введений.

В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев. В конкретном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца, или из серии из 8 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 2 месяцев.

В одном воплощении изобретения указанная схема 8 введений состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим восьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

В одном воплощении указанной схемы из 8 введений первое, второе, третье, четвертое, пятое, шестое и седьмое введения выполняют в первый год жизни, а восьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить. В одном воплощении изобретения указанная схема 8 введений состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев. В одном воплощении изобретения указанная схема состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца (например, 28-40 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-15 месяцев.

В одном воплощении указанной схемы из 8 введений введение второй иммуногенной композиции (такой как описано в разделе 3 выше) и параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением (такой как описано в разделе 2 выше) с указанной второй иммуногенной композиции выполняют в порядке, соответствующем любой из схем, предложенных для схемы из 7 введений (см. выше), с последующим введением восьмой дозы. В одном воплощении изобретения вторую иммуногенную композицию вводят при введении восьмой дозы. В другом воплощении изобретения параллельное введение первой иммуногенной композиции в соответствии с изобретением с указанной второй иммуногенной композицией выполняют в виде восьмой дозы.

В одном воплощении изобретения в любой из раскрытых выше схем 8 введений параллельное(ие) введение(я) заменяют сопутствующим введением.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем документе, вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции вводят путем внутримышечной инъекции в бедро или плечо. В одном воплощении изобретения областью инъекции является переднебоковая бедренная мышца или дельтовидная мышца.

В одном воплощении изобретения иммуногенные композиции вводят путем подкожной инъекции в бедро или плечо. В одном воплощении изобретения областью инъекции является жировая ткань над переднебоковой бедренной мышцей или жировая ткань над трехглавой мышцей.

В случае параллельного введения первую инъекцию можно выполнять в одно бедро, а вторую - в другое бедро (предпочтительно в переднебоковые бедренные мышцы). Альтернативно первую инъекцию можно выполнять в одно плечо, а вторую - в другое плечо (предпочтительно в дельтовидные мышцы). Первую инъекцию можно также выполнять в бедро, а вторую - в плечо, или первую инъекцию в плечо, а вторую - в бедро.

В одном аспекте изобретение относится к набору по настоящему изобретению (такому как описано в разделе 4) для применения в любой из раскрытых выше схем иммунизации.

Конкретные воплощения изобретения изложены в следующих пронумерованных параграфах.

1. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из группы, состоящей из гликоконъюгата из серотипа 15В S. pneumoniae, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 22F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 33F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 12F, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 10А, гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 11А и гликоконъюгата из S. pneumoniae серотипа 8, где указанная композиция представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

2. Иммуногенная композиция по параграфу 1, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В.

3. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-2, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F.

4. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-3, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F.

5. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-4, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F.

6. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-5, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 10А.

7. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-6, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 11А.

8. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-7, содержащая по меньшей мере один гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8.

9. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-8, содержащая гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15В, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 22F, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 33F, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 12F, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 10А, гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 11А и гликоконъюгат из S. pneumoniae серотипа 8, где указанная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

10. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-9, где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

11. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-9, где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с PD.

12. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-9, где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с ТТ.

13. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-9, где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с DT.

14. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-13, где указанный гликоконъюгат 15В имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа.

15. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-14, где указанный гликоконъюгат 15В имеет молекулярную массу от 10000 кДа до 16000 кДа.

16. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-15, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 15В составляет от 0,5 до 3.

17. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-16, где соотношение (масс/масс.) капсульного полисахарида серотипа 15В и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 15В составляет от 0,7 до 0,9.

18. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-17, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит менее чем приблизительно 50% свободного полисахарида серотипа 15В по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 15В.

19. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-18, где по меньшей мере 40% гликоконъюгата серотипа 15В характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

20. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-19, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

21. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-20, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

22. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-21, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

23. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-22, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в гликоконъюгате серотипа 15В к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

24. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-23, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,1 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

25. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-24, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,5 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

26. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-25, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит по меньшей мере 0,7 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 15В.

27. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-26, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 15В составляет от 2 до 15.

28. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-27, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 1500 кДа.

29. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-28, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 15В представляет собой CRM₁₉₇.

30. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-29, где указанный гликоконъюгат серотипа 15В получен с использованием восстановительного аминирования.

31. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-30, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 400 кДа до 15000 кДа.

32. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-31, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 8000 кДа.

33. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-32, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 22F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 22F составляет от 0,5 до 3.

34. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-33, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 22F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 22F составляет от 0,9 до 1,1.

35. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-34, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 22F по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 22F.

36. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-35, где по меньшей мере 30% гликоконъюгата серотипа 22F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

37. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-36, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 22F.

38. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-37, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 22F.

39. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-38, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате серотипа 22F к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 22F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

40. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-39, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 22F в гликоконъюгате серотипа 22F к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 22F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

41. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-40, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 22F составляет от 2 до 15.

42. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-41, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

43. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-42, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 22F представляет собой CRM₁₉₇.

44. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 3-43, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F получен с использованием восстановительного аминирования.

45. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-44, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа.

46. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-45, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 5000 кДа.

47. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-46, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 33F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 33F составляет от 0,2 до 4.

48. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-47, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 33F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 33F составляет от 0,4 до 1,7.

49. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-48, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит менее чем приблизительно 40% свободного капсульного полисахарида серотипа 33F по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 33F.

50. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-49, где по меньшей мере 35% гликоконъюгата серотипа 33F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

51. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-50, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F.

52. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-51, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,7 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F.

53. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-52, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате серотипа 33F к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 33F в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

54. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-53, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 33F в гликоконъюгате серотипа 33F к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 33F в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

55. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-54, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 33F составляет от 2 до 20.

56. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-55, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

57. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-56, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 2-25 повторяющихся сахаридных звеньев.

58. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-57, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 33F представляет собой CRM₁₉₇.

59. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-58, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F получен с использованием восстановительного аминирования.

60. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 4-59, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F получен с использованием конъюгирования еТЕС.

61. Иммуногенная композиция по параграфу 60, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F представлен общей формулой (III):

где атомы, составляющие спейсер еТЕС, находятся в прямоугольнике в центре.

62. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-61, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа.

63. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-62, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F имеет молекулярную массу от 500 кДа до 5000 кДа.

64. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-63, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 12F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 12F составляет от 0,2 до 4.

65. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-64, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 12F и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 12F составляет от 0,8 до 1,8.

66. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-65, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит менее чем приблизительно 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 12F по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 12F.

67. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-66, где по меньшей мере 35% гликоконъюгата серотипа 12F характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

68. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-67, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 12F составляет от 2 до 20.

69. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-68, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

70. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-69, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 2-25 повторяющихся сахаридных звеньев.

71. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-70, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 12F представляет собой CRM₁₉₇.

72. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-71, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F получен с использованием восстановительного аминирования.

73. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 5-72, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F получен с использованием TEMPO/NCS-восстановительного аминирования.

74. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-73, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа.

75. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-74, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 10000 кДа.

76. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-75, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 10А и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 10А составляет от 0,5 до 3.

77. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-76, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 10А и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 10А составляет от 0,8 до 1,2.

78. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-77, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А содержит менее чем приблизительно 50% свободного полисахарида серотипа 10А по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 10А.

79. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-78, где по меньшей мере 30% гликоконъюгата серотипа 10А характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

80. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-79, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 10А составляет от 2 до 15.

81. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-80, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

82. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-81, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 10А представляет собой CRM₁₉₇.

83. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 6-82, где указанный гликоконъюгат серотипа 10А получен с использованием восстановительного аминирования.

84. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-83, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа.

85. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-84, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А имеет молекулярную массу от 500 кДа до 20000 кДа.

86. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-85, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 11А и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 11А составляет от 0,2 до 4.

87. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-86, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 11А и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 11А составляет от 0,8 до 1,6.

88. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-87, где гликоконъюгат серотипа 11А содержит менее чем приблизительно 50% свободного капсульного полисахарида серотипа 11А по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 11А.

89. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-88, где по меньшей мере 30% гликоконъюгата серотипа 11А характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

90. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-89, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 0,3 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А.

91. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-90, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 1,8 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А.

92. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-91, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в выделенном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

93. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-92, где отношение числа мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в гликоконъюгате серотипа 11А к числу мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 11А в активированном полисахариде составляет по меньшей мере 0,6.

94. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-93, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 0,1 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А.

95. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-94, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А содержит по меньшей мере 0,4 мМ глицерина на мМ капсульного полисахарида серотипа 11А.

96. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-95, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 11А составляет от 1 до 15.

97. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-96, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

98. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-97, где белок носитель указанного гликоконъюгата серотипа 11А представляет собой CRM₁₉₇.

99. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 7-98, где указанный гликоконъюгат серотипа 11А получают с использованием восстановительного аминирования.

100. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-99, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа.

101. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-100, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 15000 кДа.

102. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-101, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 8 и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 8 составляет от 0,2 до 4.

103. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-102, где соотношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 8 и белка-носителя в гликоконъюгате серотипа 8 составляет от 0,8 до 1,5.

104. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-103, где гликоконъюгат серотипа 8 содержит менее чем приблизительно 50% свободного полисахарида серотипа 8 по сравнению с общим количеством капсульного полисахарида серотипа 8.

105. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-104, где по меньшей мере 30% гликоконъюгата серотипа 8 характеризуется K_d, меньшей или равной 0,3 на колонке CL-4B.

106. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-105, где степень конъюгирования указанного гликоконъюгата серотипа 8 составляет от 2 до 20.

107. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-106, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа.

108. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-107, где белок-носитель указанного гликоконъюгата серотипа 8 представляет собой CRM₁₉₇.

109. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1 или 8-108, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 получают с использованием восстановительного аминирования.

110. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-109, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит от 0,1 мкг до 100 мкг полисахарида каждого серотипа.

111. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-110, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит от 1,0 мкг до 10 мкг полисахарида каждого серотипа.

112. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-111, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит приблизительно 1,0 мкг, приблизительно 1,2 мкг, приблизительно 1,4 мкг, приблизительно 1,6 мкг, приблизительно 1,8 мкг, 2,0 мкг, приблизительно 2,2 мкг, приблизительно 2,4 мкг, приблизительно 2,6 мкг, приблизительно 2,8 мкг, приблизительно 3,0 мкг, приблизительно 3,2 мкг, приблизительно 3,4 мкг, приблизительно 3,6 мкг, приблизительно 3,8 мкг, приблизительно 4,0 мкг, приблизительно 4,2 мкг, приблизительно 4,4 мкг, приблизительно 4,6 мкг, приблизительно 4,8 мкг, приблизительно 5,0 мкг, приблизительно 5,2 мкг, приблизительно 5,4 мкг, приблизительно 5,6 мкг, приблизительно 5,8 мкг или приблизительно 6,0 мкг полисахарида на гликоконъюгат каждого серотипа.

113. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-112, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит от приблизительно 1,5 мкг до приблизительно 3,0 мкг полисахарида на каждый гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и/или 33F в случае их наличия.

114. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-113, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит от 10 мкг до 150 мкг белка-носителя.

115. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-114, где каждая доза указанной иммуногенной композиции содержит приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 11 мкг, приблизительно 12 мкг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 14 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 51 мкг, приблизительно 52 мкг, приблизительно 53 мкг, приблизительно 54 мкг, приблизительно 55 мкг, приблизительно 56 мкг, приблизительно 57 мкг, приблизительно 58 мкг, приблизительно 59 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 61 мкг, приблизительно 62 мкг, приблизительно 63 мкг, приблизительно 64 мкг, приблизительно 65 мкг, приблизительно 66 мкг, приблизительно 67 мкг, приблизительно 68 мкг, приблизительно 69 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 71 мкг, приблизительно 72 мкг, приблизительно 73 мкг, приблизительно 74 мкг или приблизительно 75 мкг белка-носителя.

116. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-115, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген из других патогенов.

117. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-116, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген, выбранный из группы, состоящей из дифтерийного анатоксина (D), столбнячного анатоксина (Т), коклюшного антигена (Р), ацеллюлярного коклюшного антигена (Ра), поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В (HBV), антигена вируса гепатита A (HAV), конъюгированного капсульного сахарида Haemophilus influenzae типа b (Hib) и инактивированной вакцины против полиовируса (IPV).

118. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т и Ра.

119. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Ра и Hib.

120. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Ра и IPV.

121. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Ра и HBsAg.

122. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Pa, HBsAg и IPV.

123. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Pa, HBsAg и Hib.

124. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-117, дополнительно содержащая D, Т, Pa, HBsAg, IPV и Hib.

125. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-124, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY).

126. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-125, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

127. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-126, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы А (MenA).

128. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-127, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135).

129. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-128, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

130. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-124, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

131. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-124, дополнительно содержащая конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы А (MenA), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы W135 (MenW135), конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы Y (MenY) и/или конъюгированный капсульный сахарид N. meningitidis серогруппы С (MenC).

132. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, дополнительно содержащая по меньшей мере один адъювант.

133. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-132, дополнительно содержащая по меньшей мере один адъювант, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия или гидрата окиси алюминия, фосфата кальция, липосом, эмульсии масло-в-воде, MF59 (4,3% масс./об. сквалена, 0,5% масс./об. полисорбата 80, 0,5% масс./об. сорбитантриолеата), эмульсии вода-в-масле, Монтанид™, микрочастиц сополимера D,L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLG) и наночастиц сополимера D,L-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLG).

134. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, дополнительно содержащая по меньшей мере один адъювант, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидрата окиси алюминия.

135. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, дополнительно содержащая фосфат алюминия в качестве адъюванта.

136. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, дополнительно содержащая сульфат алюминия в качестве адъюванта.

137. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, дополнительно содержащая гидрат окиси алюминия в качестве адъюванта.

138. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, содержащая в качестве адъюванта от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

139. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, содержащая в качестве адъюванта от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

140. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-131, содержащая в качестве адъюванта приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

141. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-140, дополнительно содержащая олигонуклеотид CpG.

142. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-141, которая приготовлена в жидкой форме.

143. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-141, которая приготовлена в лиофилизированной форме.

144. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-142, которая приготовлена в водной жидкой форме.

145. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-144, содержащая одно или более из буфера, соли, двухвалентного катиона, неионного детергента, криопротектора, такого как сахар, и антиоксиданта, такого как акцептор свободных радикалов или хелатирующий агент, или любых их комбинаций.

146. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-145, содержащая буфер.

147. Иммуногенная композиция по параграфу 146, где указанный буфер имеет pKa от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5.

148. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 146-147, где указанный буфер представляет собой фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер.

149. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 146-148, где указанный буфер представляет собой сукцинатный буфер в конечной концентрации от 1,0 мМ до 10 мМ.

150. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 146-149, где указанный буфер представляет собой сукцинатный буфер в конечной концентрации приблизительно 5,0 мМ.

151. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-150, содержащая соль.

152. Иммуногенная композиция по параграфу 151, где указанная соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

153. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 151-152, где указанная соль представляет собой хлорид натрия.

154. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 151-153, где указанная соль представляет собой хлорид натрия в концентрации приблизительно 150 мМ.

155. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-154, содержащая поверхностно-активное вещество.

156. Иммуногенная композиция по параграфу 155, где указанное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 65, полисорбата 80, полисорбата 85, Тритон N-101, Тритон Х-100, октоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, триэтаноламинполипептидолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарата, полиоксиэтилен-35-рицинолеата, соевого лецитина и полоксамера.

157. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-156, где указанное поверхностно-активное вещество выбрано из группы полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 65, полисорбата 80, полисорбата 85 и полоксамера.

158. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-157, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

159. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-158, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 в конечной концентрации от по меньшей мере 0,0001% до 10% по массе (масс./масс.).

160. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-159, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 в конечной концентрации от по меньшей мере 0,001% до 1% по массе (масс./масс.).

161. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-160, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 в конечной концентрации от по меньшей мере 0,01% до 1% по массе (масс./масс.).

162. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 155-161, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 в конечной концентрации 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% по массе (масс./масс.).

163. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-162, которая имеет рН от 5,5 до 7,5.

164. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-163, которая имеет рН от 5,6 до 7,0.

165. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-164, которая имеет рН от 5,8 до 6,0.

166. Набор, содержащий: (а) первую иммуногенную композицию, содержащую указанную иммуногенную композицию по любому из параграфов 1-165; и (б) вторую иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

167. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

168. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

169. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

170. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

171. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 22F.

172. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 33F.

173. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 33F.

174. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F.

175. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F.

176. 175. Набор по параграфу 166, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

177. Набор по любому из параграфов 166-176, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F конъюгированы с CRM₁₉₇.

178. Набор по любому из параграфов 166-177, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F конъюгированы с CRM₁₉₇.

179. Набор по любому из параграфов 166-178, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 6А и 19А конъюгированы с CRM₁₉₇.

180. Набор по любому из параграфов 166-179, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 3 конъюгированы с CRM₁₉₇.

181. Набор по любому из параграфов 166-180, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F конъюгированы с CRM₁₉₇.

182. Набор по любому из параграфов 166-181, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 33F конъюгированы с CRM₁₉₇.

183. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 166-182, где все указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

184. Набор по любому из параграфов 166-176, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 и 23F индивидуально конъюгированы с PD.

185. Набор по любому из параграфов 166-176 или 184, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ.

186. Набор по любому из параграфов 166-176 или 184-185, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

187. Набор по любому из параграфов 166-176 или 184-186, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F индивидуально конъюгированы с PD, указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ и указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

188. Набор по любому из параграфов 184-187, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇.

189. Набор по любому из параграфов 184-188, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇.

190. Набор по любому из параграфов 166-189, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

191. Набор по любому из параграфов 166-190, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

192. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

193. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

194. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

195. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 12 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

196. Набор по любому из параграфов 166-192, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 13 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

197. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

198. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

199. Набор по любому из параграфов 166-191, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 15 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

200. Набор по любому из параграфов 166-199, где все указанные гликоконъюгаты второй иммуногенной композиции конъюгированы с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.

201. Набор по любому из параграфов 166-200, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит от 1,0 мкг до 10 мкг полисахарида каждого серотипа.

202. Набор по любому из параграфов 166-201, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит от 10 мкг до 150 мкг белка-носителя.

203. Набор по любому из параграфов 166-202, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг или приблизительно 50 мкг белка-носителя.

204. Набор по любому из параграфов 166-203, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из других патогенов.

205. Набор по любому из параграфов 166-204, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант.

206. Набор по любому из параграфов 166-204, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидрата окиси алюминия.

207. Набор по любому из параграфов 166-204, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит фосфат алюминия в качестве адъюванта.

208. Набор по любому из параграфов 166-204, где указанная иммуногенная композиция дополнительно содержит в качестве адъюванта от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

209. Набор по любому из параграфов 166-204, где указанная иммуногенная композиция дополнительно содержит в качестве адъюванта приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

210. Набор по любому из параграфов 166-209, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер.

211. Набор по параграфу 210, где указанный буфер имеет pKa от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,5.

212. Набор по любому из параграфов 210-211, где указанный буфер представляет собой фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер.

213. Набор по параграфу 212, где указанный буфер представляет собой сукцинатный буфер в конечной концентрации приблизительно 5,0 мМ.

214. Набор по любому из параграфов 166-213, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит соль.

215. Набор по параграфу 214, где указанная соль выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

216. Набор по любому из параграфов 166-215, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит хлорид натрия в конечной концентрации 150 мМ.

217. Набор по любому из параграфов 166-216, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

218. Набор по параграфу 217, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

219. Набор по параграфу 218, где конечная концентрация полисорбата 80 составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% (масс./масс.).

220. Набор по любому из параграфов 166-219, которая имеет рН от 5,8 до 6,0.

221. Набор по любому из параграфов 166-220, где указанная первая иммуногенная композиция и указанная вторая иммуногенная композиция находятся в отдельных контейнерах.

222. Набор по любому из параграфов 166-221, где указанные первая и вторая иммуногенные композиции приготовлены в жидкой форме.

223. Набор по любому из параграфов 166-221, где указанные первая и вторая иммуногенные композиции приготовлены в лиофилизированной форме.

224. Набор по любому из параграфов 166-221, где указанная первая иммуногенная композиция имеет жидкую форму, а указанная вторая иммуногенная композиция имеет лиофилизированную форму.

225. Набор по любому из параграфов 166-221, где указанная первая иммуногенная композиция имеет лиофилизированную форму, а указанная вторая иммуногенная композиция имеет жидкую форму.

226. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165, где указанную иммуногенную композицию вводят совместно, сопутствующе, параллельно или последовательно со второй иммуногенной композицией.

227. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения со второй иммуногенной композицией.

228. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения с любой из иммуногенных композиций, раскрытых в разделе 3 выше.

229. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-228, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один гликоконъюгат Streptococcus pneumoniae серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

230. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

231. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F.

232. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

233. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F.

234. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F и 22F.

235. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F и 33F.

236. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 22F и 33F.

237. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F.

238. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F.

239. Иммуногенная композиция по параграфу 229, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F.

240. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-239, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F конъюгированы с CRM₁₉₇.

241. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-240, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 5 и 7F конъюгированы с CRM₁₉₇.

242. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-241, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 6А и 19А конъюгированы с CRM₁₉₇.

243. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-242, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 3 конъюгирован с CRM₁₉₇.

244. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-243, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F конъюгирован с CRM₁₉₇.

245. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-244, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F конъюгирован с CRM₁₉₇.

246. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-246, где все указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM₁₉₇.

247. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-239, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F индивидуально конъюгированы с PD.

248. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-239 или 247, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ.

249. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-239 или 247-248, где указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

250. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-239 или 247-249, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и/или 23F индивидуально конъюгированы с PD, указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 18С конъюгирован с ТТ и указанный гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 19F конъюгирован с DT.

251. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 247-250, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 22F конъюгированы с CRM₁₉₇.

252. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 247-251, где указанные гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипа 33F конъюгированы с CRM₁₉₇.

253. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-252, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

254. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-253, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 10, 11, 12, 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

255. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-254, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13, 14 или 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

256. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-255, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию.

257. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-254, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 22F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

258. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-254, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 11-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 11 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

259. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-254, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой конъюгированную 12-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 12 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14 и 23F, индивидуально конъюгированных с PD, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированного с ТТ, гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированного с DT, гликоконъюгата S. pneumoniae 22F, конъюгированного с CRM197, и гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 33F, конъюгированного с CRM₁₉₇.

260. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-256, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 13 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

261. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-255, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 22F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

262. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-255, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 14-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 14 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

263. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-255, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 15 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F, 22F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇.

264. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-263, где все указанные гликоконъюгаты второй иммуногенной композиции конъюгированы с белком-носителем посредством восстановительного аминирования.

265. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-264, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит от 1 до 10 мкг полисахарида каждого серотипа.

266. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-265, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит от 10 мкг до 150 мкг белка-носителя.

267. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-266, где каждая доза указанной второй иммуногенной композиции содержит приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг или приблизительно 50 мкг белка-носителя.

268. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-267, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит антигены из других патогенов.

269. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-268, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант.

270. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-268, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидрата окиси алюминия.

271. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-268, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит фосфат алюминия в качестве адъюванта.

272. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-268, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит в качестве адъюванта от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

273. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-268, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит в качестве адъюванта приблизительно 0,25 мг/мл элементного алюминия в форме фосфата алюминия.

274. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-273, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер.

275. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-274, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит буфер, имеющий pKa от 3,5 до 7,5.

276. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 274-275, где указанный буфер указанной второй иммуногенной композиции представляет собой фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер.

277. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 274-276, где указанный буфер указанной второй иммуногенной композиции представляет собой сукцинатный буфер в конечной концентрации приблизительно 5,0 мМ.

278. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-277, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит соль.

279. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-278, где указанная соль второй иммуногенной композиции выбрана из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации.

280. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-279, где указанная вторая иммуногенная композиция содержит хлорид натрия в конечной концентрации 150 мМ.

281. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-280, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

282. Иммуногенная композиция по параграфу 281, где указанное поверхностно-активное вещество указанной второй иммуногенной композиции представляет собой полисорбат 80.

283. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 281-282, где конечная концентрация полисорбата 80 в указанной второй иммуногенной композиции составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% (масс./масс.).

284. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 229-283, где указанная вторая иммуногенная композиция имеет рН от 5,8 до 6,0.

285. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации представляет собой схему с однократной дозой.

286. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации представляет собой схему с многократными дозами.

287. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

288. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев.

289. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

290. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

291. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 6 месяцев.

292. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

293. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

294. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

295. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 2 или 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, с последующей дозой для ребенка, начинающего ходить, в 12-18 месяцев.

296. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, с последующей дозой для ребенка, начинающего ходить, в 12-18 месяцев.

297. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из 4 доз вакцины, вводимых в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

298. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 для применения в вакцинации, где схема вакцинации состоит из примирующей дозы, вводимой в сутки 0, и одной или более бустерных доз, вводимых через интервалы в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель.

299. Набор по любому из параграфов 166-225 для совместного, сопутствующего, параллельного или последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций.

300. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-284 или набор по параграфу 299 для применения в способе совместного введения первой и второй иммуногенных композиций.

301. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 300, где схема вакцинации указанного совместного введения представляет собой однократную дозу.

302. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 300, где схема вакцинации указанного совместного введения представляет собой схему с многократными дозами.

303. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

304. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

305. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

306. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

307. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

308. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом приблизительно 1, 2, 3 или 4 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

309. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 дозы) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

310. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

311. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

312. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из примирующей дозы, вводимой в сутки 0, и одной или более бустерных доз, вводимых через интервалы в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недель.

313. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 302, где указанная схема многократных доз состоит из серии из примирующей дозы, вводимой в сутки 0, и бустерной дозы, вводимой примерно на 3 месяца позднее.

314. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-284 или набор по параграфу 299 для применения в способе параллельного введения первой и второй иммуногенных композиций.

315. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 314, где схема вакцинации указанного параллельного введения представляет собой однократную дозу.

316. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 314, где схема вакцинации указанного параллельного введения представляет собой схему с многократными дозами.

317. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-284 или набор по параграфу 299 для применения в способе сопутствующего введения первой и второй иммуногенных композиций.

318. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 317, где схема вакцинации указанного сопутствующего введения представляет собой однократную дозу.

319. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 317, где схема вакцинации указанного сопутствующего введения представляет собой схему с многократными дозами.

320. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

321. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

322. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 315 или 318, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

323. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

324. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

325. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

326. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 дозы) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

327. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, и с последующей дозой для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

328. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

329. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из примирующей дозы, вводимой в сутки 0, и одной или более бустерных доз, вводимых через интервалы в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 недель, предпочтительно с интервалом дозирования 4-8 недель.

330. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 316 или 319, где указанная схема многократных доз состоит из примирующей дозы, вводимой в сутки 0, и бустерной дозы, вводимой примерно на 3 месяца позднее.

331. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 226-284 или набор по параграфу 299 для применения в способе последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций.

332. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 331, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз.

333. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 331 или 332, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2, 3 или 4 доз.

334. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-333, где первую иммуногенную композицию вводят в первую очередь, а вторую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

335. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-333, где вторую иммуногенную композицию вводят в первую очередь, а первую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

336. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-335, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

337. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-335, где схема вакцинации состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

338. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-338, где первую и вторую дозы вводят в первый год жизни.

339. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-338, где первую дозу вводят в первый год жизни, а вторая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

340. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 339, где указанную дозу для ребенка, начинающего ходить, вводят в возрасте 12-18 месяцев.

341. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 332 или 333, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 3 доз.

342. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 341, где указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

343. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 341, где указанная схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

344. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-343, где первую и вторую дозы вводят в первый год жизни, а третья доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

345. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-344, где первая и вторая дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, а третья доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

346. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

347. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

348. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

349. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, и вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы.

350. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз.

351. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 341-345, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а первую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз.

352. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 332 или 333, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 4 доз.

353. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 352, где первая, вторая и третья дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

354. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 352 или 353, где первая, вторая и третья дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

355. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-354, где первую, вторую и третью дозы вводят в первый год жизни, а четвертая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

356. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-355, где первая, вторая и третья дозы разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между дозами), начиная с 2-месячного возраста, а четвертая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

357. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй и третьей доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

358. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй и третьей доз, а первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

359. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

360. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

361. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

362. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

363. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

364. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а первую иммуногенную композицию вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

365. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

366. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

367. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

368. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

369. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

370. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 352-356, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

371. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-332, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 5 доз.

372. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 371, где схема вакцинации состоит из серии из 4 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев с последующей пятой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

373. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 371-372, где первую, вторую, третью и четвертую дозы вводят в первый год жизни, а пятая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

374. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 371-372, где первую иммуногенную композицию (1-ю ИК) и вторую иммуногенную композицию (2-ю ИК) вводят в соответствии с любой из следующих схем:

375. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-332, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 6 доз.

376. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 375, где схема вакцинации состоит из серии из 5 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующей шестой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

377. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 375-376, где первую, вторую, третью, четвертую и пятую дозы вводят в первый год жизни, а шестая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

378. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 375-377, где первую иммуногенную композицию и вторую иммуногенную композицию вводят в соответствии с любой из схем по параграфу 374 с последующей шестой дозой.

379. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 378, где первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде шестой дозы.

380. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 378, где вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде шестой дозы.

381. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-332, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 7 доз.

382. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 381, где схема вакцинации состоит из серии из 6 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, с последующей седьмой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

383. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 381-382, где первую, вторую, третью, четвертую, пятую и шестую дозы вводят в первый год жизни, а седьмая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

384. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 381-383, где первую иммуногенную композицию и вторую иммуногенную композицию вводят в соответствии с любой из схем по параграфу 379 или 380 с последующей седьмой дозой.

385. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 384, где первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде седьмой дозы.

386. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 384, где вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде седьмой дозы.

387. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-332, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 8 доз.

388. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 387, где схема вакцинации состоит из серии из 7 доз, разделенных интервалом приблизительно 1 месяца, с последующей восьмой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

389. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 387-388, где первую, вторую, третью, четвертую, пятую, шестую и седьмую дозы вводят в первый год жизни, а восьмая доза представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

390. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 387-389, где первую иммуногенную композицию и вторую иммуногенную композицию вводят в соответствии с любой из схем по параграфу 385 или 386 с последующей восьмой дозой.

391. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 390, где первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде восьмой дозы.

392. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 390, где вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят в виде восьмой дозы.

393. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-333, где схема вакцинации состоит из последовательного введения:

(а) первой иммуногенной композиции и

(б) параллельного или сопутствующего введения первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией.

394. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 2 введений.

395. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 393-395, где схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

396. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 393-396, где первую иммуногенную композицию вводят в первую очередь, а параллельное или сопутствующее введение выполняют во вторую очередь.

397. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 393-396, где параллельное или сопутствующее введение выполняют в первую очередь, а первую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

398. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 393-398, где первое и второе введения выполняют в первый год жизни.

399. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 393-398, где первое введение выполняют в первый год жизни, а второе введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

400. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 399, где указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-18 месяцев.

401. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 3 введений.

402. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 401, где указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

403. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-402, где первое и второе введения выполняют в первый год жизни, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

404. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-403, где первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

405. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где первую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении.

406. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, а первую иммуногенную композицию вводят при третьем введении.

407. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, и первую иммуногенную композицию вводят при третьем введении.

408. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию вводят при втором введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении.

409. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором и третьем введениях.

410. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 401-404, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, а первую иммуногенную композицию вводят при втором и третьем введениях.

411. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 4 введений.

412. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 411, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

413. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 411, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

414. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-413, где первое, второе и третье введения выполняют в первый год жизни, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

415. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-414, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

416. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом, втором и третьем введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

417. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом, втором и третьем введениях, а первую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

418. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем и четвертом введениях.

419. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, а первую иммуногенную композицию вводят при третьем и четвертом введениях.

420. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении, и первую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

421. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, первую иммуногенную композицию вводят при третьем введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

422. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором, третьем и четвертом введениях.

423. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, а первую иммуногенную композицию вводят при втором, третьем и четвертом введениях.

424. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, первую иммуногенную композицию вводят при третьем введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

425. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию вводят при втором введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении, и первую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

426. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, и первую иммуногенную композицию вводят при третьем и четвертом введении.

427. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию вводят при втором введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем и четвертом введениях.

428. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где первую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором и третьем введениях, и первую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

429. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 411-415, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, первую иммуногенную композицию вводят при втором и третьем введениях, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

430. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 5 введений.

431. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 430, где схема вакцинации состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

432. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 430-431, где первое, второе, третье и четвертое введения выполняют в первый год жизни, а пятое введение представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

433. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 430-432, где первую иммуногенную композицию (1-ю ИК) и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией (1-я ИК/2-я ИК) выполняют в соответствии с любой из следующих схем:

434. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 6 введений.

435. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 434, где схема вакцинации состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

436. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 434-435, где первое, второе, третье, четвертое и пятое введения выполняют в первый год жизни, а шестое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

437. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 434-436, где первую иммуногенную композицию и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 433 с последующим шестым введением.

438. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 437, где первую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при шестом введении.

439. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 437, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при шестом введении.

440. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 7 введений.

441. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 440, где схема вакцинации состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим седьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

442. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 440-441, где первое, второе, третье, четвертое, пятое и шестое введения выполняют в первый год жизни, а седьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

443. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 440-442, где первую иммуногенную композицию и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 438 или 439 с последующим седьмым введением.

444. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 443, где первую иммуногенную композицию вводят при седьмом введении.

445. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 443, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при седьмом введении.

446. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 393, где схема вакцинации состоит из серии из 8 введений.

447. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 446, где схема вакцинации состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим восьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

448. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 446-447, где первое, второе, третье, четвертое, пятое, шестое и седьмое введения выполняют в первый год жизни, а восьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

449. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 446-448, где первую иммуногенную композицию и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 444 или 445 с последующим восьмым введением.

450. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 449, где первую иммуногенную композицию вводят при восьмом введении.

451. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 449, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при восьмом введении.

452. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-333, где схема вакцинации состоит из последовательного введения:

(а) второй иммуногенной композиции и

(б) параллельного или сопутствующего введения первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией.

453. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 452, где указанная схема представляет собой любую из схем в соответствии с параграфами 394-451, где введение первой иммуногенной композиции (а) в указанных параграфах заменено введением второй иммуногенной композиции (а) в указанных параграфах.

454. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве лекарственного средства.

455. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве вакцины.

456. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в способе профилактики, лечения или улучшения состояния при бактериальной инфекции, заболевании или состоянии у субъекта.

457. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в способе профилактики бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта.

458. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в способе защиты или лечения человека, подверженного пневмококковой инфекции, посредством введения указанных иммуногенных композиций системным или мукозальным путем.

459. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 458, где указанную(ые) иммуногенную(ые) композицию(и) вводят внутримышечным, интраперитонеальным, внутрикожным или подкожным путем.

460. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве вакцины, где вакцинируемый субъект представляет собой человека в возрасте младше 1 года.

461. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве вакцины, где вакцинируемый субъект представляет собой человека в возрасте младше 2 лет.

462. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве вакцины, где вакцинируемый субъект представляет собой взрослого человека в возрасте 50 лет или старше.

463. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения в качестве вакцины, где вакцинируемый субъект представляет собой человека с нарушенным иммунитетом.

464. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения по схеме однократной дозы.

465. Иммуногенная композиция по любому из параграфов 1-165 или набор по любому из параграфов 166-225 для применения по схеме многократных доз.

466. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

467. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев.

468. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 3 доз, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующей четвертой дозой через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы.

469. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

470. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 2 или 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, начиная с 2-месячного возраста, и с последующим введением дозы для ребенка, начинающего ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

471. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 465, где указанная схема многократных доз состоит из серии из 4 доз вакцины, которые вводят в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

472. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 331-333, где схема вакцинации состоит из последовательного введения:

(а) второй иммуногенной композиции и

(б) параллельного или сопутствующего введения первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией.

473. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 2 введений.

474. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 472-473, где схема вакцинации состоит из серии из 2 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

475. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 472-474, где первую иммуногенную композицию вводят в первую очередь, а параллельное или сопутствующее введение выполняют во вторую очередь.

476. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 472-474, где параллельное или сопутствующее введение выполняют в первую очередь, а вторую иммуногенную композицию вводят во вторую очередь.

477. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 472-476, где первое и второе введения выполняют в первый год жизни.

478. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 472-476, где первое введение выполняют в первый год жизни, а второе введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

479. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 478, где указанное введение ребенку, начинающему ходить, выполняют в возрасте 12-18 месяцев.

480. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 3 введений.

481. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 480, где указанная схема состоит из серии из 3 введений, разделенных интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 12 месяцев.

482. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-481, где первое и второе введения выполняют в первый год жизни, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

483. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-482, где первое и второе введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а третье введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

484. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении.

485. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, а вторую иммуногенную композицию вводят при третьем введении.

486. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, и вторую иммуногенную композицию вводят при третьем введении.

487. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию вводят при втором введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении.

488. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором и третьем введениях.

489. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 480-483, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, а вторую иммуногенную композицию вводят при втором и третьем введениях.

490. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 4 введений.

491. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 490, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 4 месяцев с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

492. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 490, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующим четвертым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

493. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-492, где первое, второе и третье введения выполняют в первый год жизни, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

494. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-493, где первое, второе и третье введения разделены интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введениями), начиная с 2-месячного возраста, а четвертое введение выполняют ребенку, начинающему ходить, в возрасте 12-18 месяцев.

495. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом, втором и третьем введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

496. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом, втором и третьем введениях, а вторую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

497. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем и четвертом введениях.

498. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, а вторую иммуногенную композицию вводят при третьем и четвертом введениях.

499. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом и втором введениях, параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении, и вторую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

500. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом и втором введениях, вторую иммуногенную композицию вводят при третьем введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

501. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-194, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, а параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором, третьем и четвертом введениях.

502. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, а вторую иммуногенную композицию вводят при втором, третьем и четвертом введениях.

503. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, вторую иммуногенную композицию вводят при третьем введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

504. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию вводят при втором введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем введении, и вторую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

505. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором введении, и вторую иммуногенную композицию вводят при третьем и четвертом введении.

506. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию вводят при втором введении, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при третьем и четвертом введениях.

507. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где вторую иммуногенную композицию вводят при первом введении, параллельное или сопутствующее введение выполняют при втором и третьем введениях, и вторую иммуногенную композицию вводят при четвертом введении.

508. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 490-494, где параллельное или сопутствующее введение выполняют при первом введении, вторую иммуногенную композицию вводят при втором и третьем введениях, и параллельное или сопутствующее введение выполняют при четвертом введении.

509. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 5 введений.

510. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 509, где схема вакцинации состоит из серии из 4 введений, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев с последующим пятым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

511. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 509-510, где первое, второе, третье и четвертое введения выполняют в первый год жизни, а пятое введение представляет собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

512. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 509-511, где вторую иммуногенную композицию (2-ю ИК) и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией (1-я ИК/2-я ИК) выполняют в соответствии с любой из следующих схем:

513. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 6 введений.

514. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 513, где схема состоит из серии из 5 введений, где каждое введение отделено интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующим шестым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

515. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 513-514, где первое, второе, третье, четвертое и пятое введения выполняют в первый год жизни, а шестое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

516. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 513-515, где первую иммуногенную композицию и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 512 с последующим шестым введением.

517. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 516, где вторую иммуногенную композицию в соответствии с изобретением вводят при шестом введении.

518. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 516, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при шестом введении.

519. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 7 введений.

520. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 519, где схема вакцинации состоит из серии из 6 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим седьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

521. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 519-520, где первое, второе, третье, четвертое, пятое и шестое введения выполняют в первый год жизни, а седьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

522. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 519-521, где вторую иммуногенную композицию и параллельное введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 517 или 518 с последующим седьмым введением.

523. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 522, где вторую иммуногенную композицию вводят при седьмом введении.

524. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 522, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при седьмом введении.

525. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 472, где схема вакцинации состоит из серии из 8 введений.

526. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 525, где схема вакцинации состоит из серии из 7 введений, где каждое введение отделено интервалом приблизительно 1 месяца с последующим восьмым введением через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первого введения.

527. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 525-526, где первое, второе, третье, четвертое, пятое, шестое и седьмое введения выполняют в первый год жизни, а седьмое введение выполняют ребенку, начинающему ходить.

528. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 525-527, где вторую иммуногенную композицию и параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют в соответствии с любой из схем по параграфу 523 или 524 с последующим восьмым введением.

529. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 528, где вторую иммуногенную композицию вводят при восьмом введении.

530. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 528, где параллельное или сопутствующее введение первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией выполняют при восьмом введении.

531. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 352, где первую и вторую дозы вводят в первый год жизни, а третья и четвертая дозы представляют собой дозы для ребенка, начинающего ходить.

532. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 352, где схема состоит из серии из 2 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением третьей дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы и четвертой дозы через от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев после третьей дозы.

533. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй и третьей доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

534. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой, второй и третьей доз, а первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

535. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

536. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, а первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

537. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

538. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой и второй доз, первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

539. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

540. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, а первую иммуногенную композицию вводят в виде второй, третьей и четвертой доз.

541. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

542. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

543. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и первую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

544. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй дозы и вторую иммуногенную композицию вводят в виде третьей и четвертой доз.

545. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где первую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, вторую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз и первую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

546. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 531-532, где вторую иммуногенную композицию вводят в виде первой дозы, первую иммуногенную композицию вводят в виде второй и третьей доз и вторую иммуногенную композицию вводят в виде четвертой дозы.

547. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 371, где первую, вторую и третью дозы вводят в первый год жизни, а четвертая и пятая дозы представляют собой дозу для ребенка, начинающего ходить.

548. Иммуногенная композиция или набор по параграфу 371, где схема состоит из серии из 3 доз, где каждая доза отделена интервалом от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев, с последующим введением четвертой дозы через от приблизительно 10 месяцев до приблизительно 13 месяцев после первой дозы и пятой дозы через от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 месяцев после четвертой дозы.

549. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 547-548, где первую иммуногенную композицию (1-ю ИК) и вторую иммуногенную композицию (2-ю ИК) вводят в соответствии с любой из следующих схем:

550. Иммуногенная композиция или набор по любому из параграфов 547-548, где первую иммуногенную композицию (1-ю ИК) и вторую иммуногенную композицию (2-ю ИК) вводят в соответствии с любой из следующих схем:

Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» означает нахождение в статистически значимом диапазоне значения, такого как указанный диапазон концентрации, временная рамка, молекулярная масса, температура или рН. Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, как правило в пределах 20%, более характерно в пределах 10% и даже более характерно в пределах 5% или в пределах 1% данного значения или диапазона. Иногда такой диапазон может находиться в пределах ошибки эксперимента, характерной для стандартных способов, используемых для измерения и/или определения данного значения или диапазона. Допустимая вариация, охватываемая термином «приблизительно», будет зависеть от конкретной исследуемой системы и может быть легко воспринята обычным специалистом в данной области техники. В тех случаях, где в данной заявке указан диапазон, каждое целое число внутри этого диапазона также рассматривают как воплощение данного описания.

Термины «содержащий», «содержат» и «содержит» в данном документе авторы изобретения подразумевают как возможно заменяемые в каждом случае терминами «состоящий по существу из», «состоит по существу из», «состоят по существу из», «состоящий из», «состоит из» и «состоят из», соответственно.

Термины «иммуногенное количество», «иммунологически эффективное количество», «терапевтически эффективное количество», «профилактически эффективное количество» или «доза», каждый из которых в данном документе используют взаимозаменяемо, в целом относятся к количеству антигена или иммуногенной композиции, достаточному, чтобы вызвать иммунный ответ, либо клеточный (Т-клеточный), либо гуморальный (В-клеточный или антительный) ответ, либо оба ответа, определяемый количественно с помощью стандартных анализов, известных специалистам в данной области техники.

Все цитируемые в данном описании литературные источники или заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки.

Изобретение проиллюстрировано сопроводительными примерами. Приведенные ниже примеры выполняют, используя стандартные методы, которые являются хорошо известными и рутинными для специалистов в данной области техники за исключением подробно описанных. Эти примеры носят иллюстративный, но не ограничительный характер для изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Общий способ получения еТЕС-связанных гликоконъюгатов

Активация сахарида и тиолирование цистамина дигидрохлоридом

Сахарид восстанавливают в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Содержание влаги в растворе определяют с помощью анализа методом Карла Фишера (KF) и регулируют до достижения содержания влаги от 0,1% до 0,4%, в характерном случае 0,2%.

Для инициации активации готовят свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) при концентрации 100 мг/мл в DMSO. Сахарид активируют различными количествами CDT/CDI (1-10 молярных эквивалентов), и реакционную смесь оставляют для протекания реакции на 1 час при 23±2°С. Уровень активации можно определить с помощью HPLC. Готовят свежий раствор цистамина дигидрохлорида в безводном DMSO при концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид подвергают взаимодействию с 1 молярным эквивалентом (мол. экв.) цистамина дигидрохлорида. Альтернативно, активированный сахарид подвергают взаимодействию с 1 мол. экв. цистеамина гидрохлорида. Реакционную смесь для тиолирования оставляют для протекания реакции на 21±2 часа при 23±2°С с получением тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяют на основании добавленного количества CDT/CDI.

Остаточный CDT/CDI в растворе реакционной смеси для активации гасят добавлением 100 мМ раствора тетрабората натрия, рН 9,0. Выполняют расчеты по определению добавленного количества тетрабората и для регулирования конечного содержания влаги до 1-2% общего водного раствора.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

Реакционную смесь для тиолированного сахарида разводят в 10 раз добавлением к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0 и фильтруют через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида выполняют против 40-кратного диаобъема WFI (вода для инъекций). После разведения ретентата 10% объема 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 6,0 к нему добавляют 1-5 мол. экв. раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР). Эту реакционную смесь для восстановления оставляют для протекания реакции на 20±2 часа при 5±3°С. Очистку активированного тиолированного сахарида выполняют предпочтительно путем ультрафильтрации/диафильтрации против предварительно охлажденного 10 мМ раствора однозамещенного фосфата натрия, рН 4,3. Альтернативно, тиолированный сахарид очищают с помощью стандартных методик эксклюзионной хроматографии (SEC) или методов ионообменной хроматографии. Аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида отбирают для анализов по определению концентрации сахарида и содержания тиола (реакции Эллмана).

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

В качестве альтернативы описанной выше методики очистки активированный тиолированный сахарид также очищали, как описано ниже.

К реакционной смеси для тиолированного сахарида добавляли 5-10 мол. экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) и оставляли для протекания реакции на 3±1 час при 23±2°С. Затем реакционную смесь разводили в 5 раз добавлением к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0 и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида выполняли с использованием 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ раствора однозамещенного фосфата натрия, рН 4,3. Аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида отбирали для анализов по определению концентрации сахарида и содержания тиола (реакции Эллмана).

Активация и очистка бромацетилированного белка-носителя

Свободные аминогруппы белка-носителя подвергают бромацетилированию путем взаимодействия с агентом бромацетилирования, таким как сложный эфир бромуксусной кислоты и N-гидроксисукцинимида (BAANS), бромацетилбромид или другой приемлемый реактив.

Перед активацией белок-носитель (в 0,1 М растворе фосфата натрия, рН 8,0±0,2) сначала выдерживают при 8±3°С, приблизительно при рН 7. К раствору белка добавляют сложный эфир N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора в диметилсульфоксиде (DMSO) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS: белок (масс./масс.). Реакционную смесь мягко перемешивают при 5±3°С в течение 30-60 минут. Полученный в результате бромацетилированный (активированный) белок очищают, например путем ультрафильтрации/диафильтрации, используя мембрану MWCO (с номинальным отсечением по молекулярной массе) 10 кДа и используя 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,0). После очистки концентрацию белка в бромацетилированном белке-носителе оценивают с помощью количественного определения белка методом Лоури.

Степень активации определяют с помощью анализа общего содержания бромида ионообменной жидкостной хроматографией, сопряженной с кондуктометрическим выявлением с подавлением фоновой электропроводности (ионной хроматографией). При приготовлении образца для анализа связанный бромид на активированном бромацетилированном белке отщепляют от белка и определяют количественно параллельно определению любого свободного бромида, который может присутствовать.

Любой остаточный ковалентно связанный бром на белке высвобождают путем преобразования в ионный бромид путем нагревания образца в щелочном 2-меркаптоэтаноле.

Активация и очистка бромацетилированного белка CRM₁₉₇

CRM₁₉₇ разводили до 5 мг/мл 10 мМ 0,9% раствора NaCl, забуференного фосфатом, рН 7 (PBS), а затем готовили 0,1 М раствор NaHCO₃, рН 7,0, используя 1 М исходный раствор. BAANS добавляли при соотношении CRM₁₉₇: BAANS 1:0,35 (масс.:масс.), используя исходный раствор BAANS 20 мг/мл в DMSO. Реакционную смесь инкубировали при температуре от 3°С до 11°С в течение 30 мин - 1 часа, затем очищали путем ультрафильтрации/диафильтрации, используя мембрану MWCO 10K и 10 мМ раствор фосфата натрия/0,9% NaCl, рН 7,0. Очищенный активированный белок CRM₁₉₇ подвергали анализу методом Лоури для определения концентрации белка, а затем разводили PBS до 5 мг/мл. В качестве криопротектора добавляли сахарозу до 5% масс./об. и активированный белок замораживали и хранили при -25°С до потребности для конъюгирования.

Бромацетилирование остатков лизина CRM₁₉₇ было очень постоянным, приводя в результате к активации от 15 до 25 остатков лизина из 39 доступных остатков лизина. В результате реакции получали высокие выходы активированного белка.

Конъюгирование активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем

До начала реакции конъюгирования реакционные сосуды предварительно охлаждают до 5°С. Последовательно добавляют бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид и смешивают при скорости перемешивания 150-200 об/мин. Исходное соотношение сахарид/белок составляет 0,9±0,1. рН реакционной смеси доводят до 8,0±0,1 1 М раствором NaOH. Реакционную смесь оставляют для протекания реакции конъюгирования при 5°С на 20±2 часа.

Кэпирование остаточных реакционноспособных функциональных групп

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят путем взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве кэпирующего реагента в течение 3 часов при 5°С. Остаточные свободные сульфгидрильные группы кэпируют 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°С.

Очистка еТЕС-связанного гликоконъюгата

Реакционную смесь для конъюгирования (после кэпирования IAA) фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата проводят против 5 мМ раствора сукцината в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0. Затем ретентат гликоконъюгата фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Аликвоту гликоконъюгата отбирают для анализов. Остаточный гликоконъюгат хранят при 5°С.

Пример 2. Приготовление еТЕС-конъюгатов Pn-33F

Процесс активации

Активация полисахарида Pn33F

Полисахарид Pn-33F объединяли с 500 мМ 1,2,4-триазола (в WFI) до получения 10 граммов триазола на один грамм полисахарида. Смесь подвергали поверхностному замораживанию тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов (shell-frozen) в бане сухой лед-этанол, после чего лиофилизировали до сухого состояния. Лиофилизированный полисахарид 33F восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Содержание влаги в лиофилизированном растворе 33F/DMSO определяли путем анализа методом Карла Фишера (KF). Содержание влаги регулировали добавлением WFI к раствору 33F/DMSO до достижения содержания влаги 0,2%.

Для инициации активации готовили свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) в виде раствора 100 мг/мл в DMSO. Перед стадией тиолирования полисахарид Pn33F активировали различными количествами CDT. Активацию CDT выполняли при 23±2°С в течение 1 часа. Уровень активации определяли методом HPLC (А220/А205). Добавляли 100 мМ раствор тетрабората натрия, рН 9,0 для гашения какого-либо остаточного CDT в растворе реакционной смеси для активации. Выполняют расчеты по определению добавленного количества тетрабората и для регулирования конечного содержания влаги, составляющего до 1,2% общего водного раствора. Эту реакционную смесь оставляли для протекания реакции на 1 час при 23±2°С.

Тиолирование активированного полисахарида Pn-33F

Готовили свежий раствор цистамина дигидрохлорида в безводном DMSO и добавляли 1 мол. экв. цистамина дигидрохлорида к раствору реакционной смеси активированного полисахарида. Эту реакционную смесь оставляли для протекания реакции на 21±3 часа при 23±2°С. Раствор тиолированного сахарида разводили в 10 раз добавлением к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0. Разведенный раствор реакционной смеси фильтруют через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного полисахарида Pn-33F выполняли с помощью кассет мембран MWCO 100K для ультрафильтрации, используя воду для инъекций (WFI).

Восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида Pn-33F

После разведения ретентата 10% объема 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 6,0 к нему добавляли 5 мол. экв. раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР). Эту реакционную смесь для восстановления оставляли для протекания реакции на 2±1 час при 23±2°С. Диафильтрацию тиолированного полисахарида 33F выполняли с помощью кассет мембран MWCO 100K для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против предварительно охлажденного 10 мМ раствора фосфата натрия, рН 4,3. Ретентат тиолированного полисахарида 33F отбирали для обоих анализов - концентрации сахарида и определения тиола (реакции Эллмана).

Альтернативное восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида Pn-33F

В качестве альтернативы описанной выше методики очистки активированный тиолированный сахарид 33F также очищали, как описано ниже.

К реакционной смеси для тиолированного сахарида добавляли раствор 5 мол. экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) и оставляли для протекания реакции на 3±1 час при 23±2°С. Затем реакционную смесь разводили в 5 раз добавлением к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0 и фильтровали через фильтр 5 мкм. Диафильтрацию тиолированного сахарида выполняли с использованием 40-кратного диаобъема предварительно охлажденного 10 мМ раствора однозамещенного фосфата натрия, рН 4,3, с помощью кассет мембран MWCO 100К для ультрафильтрации. Ретентат тиолированного полисахарида 33F отбирали для обоих анализов - концентрации сахарида и определения тиола (реакции Эллмана). Блок-схема процесса активации приведена на Фиг. 8(А).

Процесс конъюгирования

Конъюгирование тиолированного полисахарида Pn33F с бромацетилированным белком CRM₁₉₇

Белок-носитель CRM₁₉₇ отдельно подвергали активации, как описано в примере 1, а затем подвергали взаимодействию с активированным полисахаридом Pn-33F для реакции конъюгирования. До начала реакции конъюгирования реакционные сосуды предварительно охлаждали до 5°С. Бромацетилированный CRM₁₉₇ и тиолированный полисахарид 33F смешивали вместе в реакционном сосуде при скорости перемешивания 150-200 об/мин. Исходное соотношение сахарид/белок составляло 0,9±0,1. рН реакционной смеси доводили до 8,0-9,0. Реакционную смесь оставляли для протекания реакции конъюгирования при 5°С на 20±2 часа.

Кэпирование реакционноспособных групп на бромацетилированном белке CRM₁₉₇ и тиолированном полисахариде Pn33F

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белках CRM₁₉₇ кэпировали путем взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3 часов при 5°С с последующим кэпированием каких-либо остаточных свободных сульфгидрильных групп тиолированного 33F-полисахарида 4 мол. экв. йодацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°С.

Очистка еТЕС-связанного гликоконъюгата Pn-33F

Раствор для конъюгирования фильтровали через фильтр 0,45 мкм или 5 мкм. Диафильтрацию гликоконъюгата 33F проводили с помощью кассет мембран MWCO 300K для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против 5 мМ раствора фосфата натрия в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0. Затем ретентат гликоконъюгата Pn-33F 300K фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили при 5°С. Блок-схема процесса конъюгирования представлена на Фиг. 8(Б).

Результаты

Параметры реакции и данные характеризации для нескольких партий еТЕС-гликоконъюгатов Pn-33F представлены в таблице 1. В результате активации CDT и тиолирования цистамина дигидрохлоридом получили гликоконъюгаты, в которых выход сахарида составлял от 63% до 90%, и содержание свободных сахаридов составляло от менее 1% до 13%.

Н/Д - данные недоступны

Титры ОРА еТЕС-гликоконъюгатов Pn-33F с CRM₁₉₇

Титры ОРА Pn-33F у мышей определяли в стандартных условиях (аналогично методикам ОРА, описанным ниже для конъюгатов 10А и 22F). Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI) через четыре и семь недель представлены в таблице 2, где показано, что гликоконъюгат серотипа 33F Pn вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности.

Пример 3. Приготовление дополнительных еТЕС-конъюгатов Pn-33F

Дополнительные еТЕС-конъюгаты Pn-33F получали с использованием процесса, описанного в примере 2. Параметры реакции и данные характеризации для нескольких партий еТЕС-гликоконъюгатов Pn-33F представлены в таблице 3.

ПКО - предел количественного определения; Н/Д - данные недоступны

Как показано выше и в таблице 3, было получено несколько конъюгатов Pn-33F с использованием описанного выше конъюгирования еТЕС. Химия еТЕС позволяет получить конъюгаты с высоким выходом, низкой % долей свободного сахарида и высокой степенью конъюгирования (конъюгированных остатков лизина). Кроме того, при использовании процесса конъюгирования еТЕС было возможно сохранить более 80% ацетильных функциональных групп.

Пример 4. Оценка стабильности еТЕС-гликоконъюгатов Pn-33F: тенденции % свободного сахарида

Аликвоты партии конъюгатов 33F-2B (см. таблицу 1) распределяли в полипропиленовые пробирки и хранили при 4°С, 25°С и 37°С, соответственно, и отслеживали тенденции % свободного сахарида. Данные (% свободного сахарида) представлены в таблице 4. Как показано в этой таблице, значительные изменения % свободного сахарида отсутствовали.

нед. - неделя; М - месяц; Н/Д - данные недоступны.

Также проводили ускоренную оценку стабильности другой партии конъюгатов (партия 33F-3C) при 37°С вплоть до 1 месяца. Как показано в таблице 5, значимые изменения % свободного сахарида при 37°С в течение вплоть до 1 месяца отсутствовали.

Для дополнительного подтверждения стабильности еТЕС-конъюгатов потенциальные тенденции % свободного сахарида отслеживали в дополнительных партиях конъюгатов (33F-3C и 33F-5E (см. таблицу 1)), которые хранили при 4°С в течение вплоть до приблизительно 1 года. Как показано в таблице 6, значимые изменения уровней % свободного сахарида для конъюгатов, которые хранили при 4°С в течение продолжительного периода времени приблизительно до 1 года, отсутствовали.

М - месяц; Н/Д - данные недоступны.

Было продемонстрировано, что конъюгаты серотипа 33F, полученные посредством химии 33F еТЕС, стабильны, и при отслеживании тенденций содержания свободного сахарида при различных температурах (в реальном времени и ускоренным методом) заметного разложения не наблюдали.

Пример 5. Приготовление конъюгатов Pn-8 с CRM₁₉₇

Получение гликоконъюгатов Pn-8 RAC/DMSO

Замороженный полисахарид размораживали и переносили в реакционный сосуд. К раствору полисахарида добавляли 2 М раствор уксусной кислоты и WFI (воду для инъекций) до достижения конечной концентрации полисахарида приблизительно 2,5 г/л и конечной концентрации уксусной кислоты 0,2 М.

Гидролиз полисахарида

Перед активацией нативный полисахарид подвергали химическому гидролизу. Разведенный раствор полисахарида нагревали до 70°С, а затем выдерживали при этой температуре в течение 3,5 часа.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида инициировали добавлением раствора перйодата натрия и реакционную смесь выдерживали для протекания реакции в течение 20 ч при 23°С.

Очистка активированного полисахарида

Активированный полисахарид концентрировали с использованием кассет для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против 20-кратного диаобъема WFI.

Лиофилизация

Активированный полисахарид объединяют с сахарозой в соотношении 25 граммов сахарозы на один грамм активированного полисахарида. Флаконы, содержащие активированный сахарид и сахарозу, подвергают поверхностному замораживанию тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов в этанольных банях и лиофилизировали.

Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали до 2 мг/мл в DMSO. К лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли DMSO для восстановления. Восстановленный CRM₁₉₇ добавляли к восстановленному активированному полисахариду. Затем конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси цианоборгидрида натрия и инкубировали при 23°С в течение 24 ч. Остановку реакции конъюгирования выполняют путем добавления 2 МЭкв боргидрида натрия. Эта реакция кэпирования протекала в течение 3 ч при 23°С.

Очистка конъюгата

Раствор конъюгата затем разводили в охлажденном 5 мМ растворе сукцината в 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0), фильтровали, концентрировали до 2-4 г/л, используя целлюлозные мембраны 300 К, и выполняли первую стадию диафильтрации против 5 мМ сукцината - 0,9% физиологического раствора (рН 6,0). Стадию конечной очистки выполняли путем диафильтрации с буфером 5 мМ сукцината в 0,9% физиологическом растворе, рН 6,0. После завершения диафильтрации очищенный конъюгат переносили в сборный резервуар через фильтр 0,22 мкм.

Разведение нерасфасованного одновалентного конъюгата

Конъюгат дополнительно разводили 5 мМ сукцинатом/0,9% физиологическим раствором (рН 6) до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. Стадия конечного фильтрования 0,22 мкм была завершена с получением нерасфасованного продукта одновалентного конъюгата (МВС) для приготовления.

С использованием описанного выше процесса было получено несколько конъюгатов путем варьирования различных параметров (например, исходного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и МЭкв цианоборгидрида натрия). Характеризация репрезентативных гликоконъюгатов Pn-8 с CRM₁₉₇ приведена в таблице 7.

Титры опсонофагоцитарной активности (ОРА) для конъюгатов серотип 8-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях (аналогично методикам ОРА, описанным ниже для конъюгатов 10А и 22F). Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели при различных дозах представлены в таблицах 8 и 9 (два отдельных эксперимента), показывающих, что конъюгат серотипа 8 (образцы 1-9; данные характеризации этих конъюгатов также см. в таблице 7) вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности.

Как видно из таблицы 8, было показано, что конъюгаты серотипа 8 вызывают статистически значимо повышенный титр антител по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, который приводил к слабым титрам антител.

В целом данные, полученные для конъюгатов, приготовленных с помощью описанного выше процесса восстановительного аминирования, демонстрируют, что он дает возможность получить конъюгаты с хорошим выходом конъюгирования, низкой % долей свободного сахарида и надлежащей стабильностью. Кроме того, приготовленные конъюгаты вызывали высокие титры ОРА в мышиной модели иммуногенности.

Пример 6. Приготовление конъюгата полисахарида серотипа 10А с CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А

Капсульные полисахариды серотипа 10А могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники (см., например, способы, раскрытые в публикациях заявок на патент США №№2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498 и в WO 2008/118752). Streptococcus pneumoniae серотипа 10А выращивали в посевной бутыли, а затем переносили в посевной ферментер. Как только была достигнута целевая оптическая плотность, клетки переносили в промышленный ферментер. Ферментационную смесь инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации.

Окисление изолированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А

К раствору полисахарида добавляли рассчитанный объем 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 6,0) и воды для инъекций (WFI) до достижения конечной концентрации полисахарида 2,5 г/л и конечной концентрации калийфосфатного буфера 25 мМ, и при необходимости рН доводили до приблизительно 6,0. Затем разведенный полисахарид охлаждали до 5°С. Окисление инициировали добавлением 0,25 молярных эквивалентов (МЭкв) раствора перйодата натрия. Время реакции окисления составляло приблизительно 4 ч при 5°С. Реакцию окисления гасили 1 МЭкв 2,3-бутандиола при непрерывном перемешивании при 5°С в течение 1-2 ч.

После достижения целевого времени реакции активированный полисахарид концентрировали с использованием кассет Millipore для ультрафильтрации с MWCO 30 К. Затем выполняли диафильтрацию против 20-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид характеризуют среди прочего (1) по молекулярной массе методом SEC-MALLS и (2) по степени окисления.

Конъюгирование активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования состоял из следующих стадий:

а. Объединение с эксципиентом сахарозой и лиофилизация;

б. Восстановление лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование; и

г. Очистка конъюгата

а. Объединение с сахарозой

Активированный полисахарид объединяют с сахарозой в соотношении 25 г сахарозы на грамм активированного полисахарида. Затем флакон с объединенной смесью лиофилизировали. После лиофилизации флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С.

б. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида к рассчитанному количеству CRM₁₉₇ добавляли такое же количество DMSO для восстановления.

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в DMSO) добавляли к восстановленному активированному полисахариду в реакторе для конъюгирования. Конечная концентрация полисахарида составляет 1 г/л. Конъюгирование выполняют путем добавления к реакционной смеси 1,2 МЭкв цианоборгидрида натрия. Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 24 ч. Остановку реакции конъюгирования выполняют путем добавления 2 МЭкв боргидрида натрия. Реакционную смесь для кэпирования инкубировали при 23°С в течение 3 ч.

Остановку реакции конъюгирования выполняют путем добавления 2 МЭкв боргидрида натрия. Эта реакция кэпирования протекала в течение 3 ч при 23°С.

г. Очистка конъюгата

Затем раствор конъюгата разводили в 5-кратном (по объему) охлажденном 5 мМ сукцинате - 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0) и выполняли 20-кратную диафильтрацию, используя 5 мМ сукцинат в 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0). После завершения первоначальной диафильтрации ретентат конъюгата переносили через фильтр 0,22 мкм. Конъюгат разводили дополнительно 5 мМ раствором сукцината в 0,9% физиологическом растворе (рН 6), и после стадии конечного фильтрования 0,22 мкм его хранили при 2-8°С.

С использованием описанного выше процесса было получено несколько конъюгатов путем варьирования различных параметров (например, исходного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и МЭкв цианоборгидрида натрия). Было продемонстрировано, что конъюгаты серотипа 10А, полученные описанным выше химическим методом, стабильны, и при отслеживании тенденций содержания свободного сахарида при различных температурах (в реальном времени и ускоренным методом) заметного разложения не наблюдали. Характеризация репрезентативных гликоконъюгатов Pn-10А с CRM₁₉₇ приведена в таблице 10.

Титры опсонофагоцитарной активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 10A-CRM₁₉₇ у мышей определяли в стандартных условиях. Группы из тридцати самок швейцарских мышей Вебстер 6-7-недельного возраста иммунизировали 0,001 мкг, 0,01 мкг или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов подкожным путем на неделе 0. На неделе 3 мышам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгата, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфические анализы ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 4.

Анализы опсонофагоцитарной активности (ОРА) используют для количественного определения функциональных антител в сыворотке крови мышей, специфичной к серотипу 10А S. pneumoniae. Исследуемую сыворотку помещают в условия аналитических реакций, позволяющих измерить способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, к опсонизации бактерий и запуску накопления комплемента, что способствует фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Методики ОРА были основаны на методах, описанных в публикации Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2): 287-295, со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку крови серийно разводили в 2,5 раза и добавляли в аналитические микротитрационные планшеты. В лунки добавляли живые целевые штаммы бактерий серотипа 10А, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 30 минут. В лунки добавляли дифференцированные клетки HL-60 (фагоциты) и сыворотку крови крольчат (возраста от 3 до 4 недель, PEL-FREEZ®, конечная концентрация 12,5%), и планшеты встряхивали при 37°С в течение 60 минут. Для остановки реакции во все лунки добавляли 80 мкл 0,9% NaCl, перемешивали, и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки планшетов с фильтрами MULTISCREEN® HTS HV (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты в вакууме, и в каждую лунку добавляли 150 мкл питательной среды HYSOY® и профильтровывали. Затем планшеты с фильтрами инкубировали при 37°С, 5% CO₂ в течение ночи, а затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., г. Геркулес, штат Калифорния, США). Затем планшеты окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Колонии визуализировали и подсчитывали на анализаторе Cellular Technology Limited (CTL) (г. Шейкер-Хайтс, штат Огайо, США) IMMUNOSPOT®. Необработанные данные подсчета колоний использовали для построения кривых уничтожения и расчета титров ОРА.

Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI) через четыре недели при различных дозах представлены в таблице 11, показывающей, что конъюгат серотипа 10А (образцы 1-3; данные характеризации этих конъюгатов также см. в таблице 10) вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности. Как видно из таблицы 11, было показано, что конъюгаты серотипа 10А вызывают статистически значимо повышенный титр антител по сравнению с контрольным неконъюгированным полисахаридом, который приводил к слабому ответу ОРА.

Пример 7. Конъюгирование Pn серотипа 12F с использованием TEMPO/NCS

Для улучшения стабильности гликоконъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇ были изучены альтернативные химические методы с использованием свободного радикала 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимида (NCS) в качестве соокислителя для окисления первичных спиртов до альдегидных групп. Анализ методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией (GC/MS) показал, что центры окисления отличались от центров окисления, опосредованного перйодатом. В случае окисления TEMPO-NCS были окислены α-D-Glcp и 2-Glcp, тогда как основным центром окисления при использовании перйодата был α-D-Galp (см. Фиг. 4). Как более подробно описано в настоящем документе, TEMPO использовали в каталитических количествах (меньше или равно 0,1 молярных эквивалентов), и желаемой степени окисления (DO) достигали за счет варьирования используемых количеств NCS. Несколько конъюгатов были последовательно синтезированы и охарактеризованы. Как правило, получение гликоконъюгатов серотипа 12F проводили в несколько фаз, как описано ниже:

а) Гидролиз полисахарида серотипа 12F до молекулярной массы от 50 кДа до 500 кДа

б) Активация полисахарида серотипа 12F TEMPO/NCS;

в) Очистка активированного полисахарида;

г) Конъюгирование полисахарида серотипа 12F с белком CRM₁₉₇; и

д) Очистка конъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇.

Гидролиз и окисление полисахарида серотипа 12F

Гидролиз полисахарида, как правило, выполняли в кислых условиях при нагревании с получением молекулярной массы в желаемом диапазоне от 100 кДа до 350 кДа. Характерный эксперимент описан ниже.

Гидролиз

Раствор полисахарида серотипа 12F добавляли в реакционный сосуд с рубашкой. К этому раствору добавляли необходимый объем 0,30 М уксусной кислоты и воды для инъекций (WFI) для поддержания концентрации уксусной кислоты приблизительно 0,1 М. рН раствора доводили до 3,2±0,3, используя 1 н. NaOH или ледяную уксусную кислоту. Температуру реакционной смеси повышали до 70±5°С. Реакционную смесь перемешивали при 70±5°С в течение 90-120 минут. Реакционную смесь охлаждали до 23±2°С и нейтрализовали (рН 7,0) добавлением 1 М раствора NaOH. Гидролизованный полисахарид очищали ультрафильтрацией/диафильтрацией против WFI с использованием мембран с MWCO 30K. Раствор фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили при температуре от 2 до 8°С до окисления. Молекулярную массу гидролизованного полисахарида анализировали методом SEC-MALLS, чтобы гарантировать, что молекулярная масса попадает в целевой диапазон от 100 кДа до 350 кДа.

Частичное окисление

В одном эксперименте размер полисахарида серотипа 12F изменяли механическим путем с использованием гомогенизации под давлением с помощью микрофлюидизатора с уменьшением молекулярной массы до приблизительно 100 кДа - 500 кДа. Полисахарид с измененным размером добавляли в реакционный сосуд при концентрации 4,0 мг/мл и смешивали с бикарбонатным/карбонатным буфером (буфер 0,5 М NaHCO₃/0,05 М Na₂CO₃, рН 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешанной смеси добавляли не более 0,1 молярного эквивалента TEMPO. Реакцию начинали добавлением от 0,6 до 1,0 молярного эквивалента NCS. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид очищали диафильтрацией с WFI, используя мембрану 30K для ультрафильтрации. Очищенный полисахарид собирали и определяли степень окисления (DO) путем измерения количества альдегида (с использованием анализа с 3-метил-2-бензотиазолинонгидразоном (МВТН)) и полисахарида (с использованием количественного анализа с антроном).

В другом эксперименте полисахарид серотипа 12F подвергали гидролизу для уменьшения молекулярной массы до молекулярной массы приблизительно от 100 кДа до 500 кДа. Полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционный сосуд и смешивали с буфером 0,5 М NaHCO₃/0,05 М Na₂CO₃ (рН 8,6) в соотношении 1:1 об./об. К перемешанной смеси добавляли от 0,6 до 1,0 молярного эквивалента NCS, растворенного в WFI. Активацию инициировали добавлением приблизительно 0,1 молярного эквивалента TEMPO, растворенного в WFI. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего активированный полисахарид очищали диафильтрацией с WFI, используя мембрану 30K для ультрафильтрации. Очищенный активированный полисахарид фильтровали через фильтр 0,2 мкм и хранили при 4°С до использования.

Реакции окисления, опосредованные TEMPO/NCS, также успешно выполняли в натрийфосфатных буферах рН 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0. В некоторых экспериментах по активации для гашения реактивов во избежание переокисления сахарида использовали первичный спирт, такой как н-пропанол. В другой серии экспериментов полисахарид, гидролизованный химическим путем, подвергали окислению непосредственно без стадии очистки ультрафильтрацией/диафильтрацией.

Конъюгирование окисленного полисахарида серотипа 12F

В одном эксперименте очищенный окисленный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционный сосуд с последующим добавлением 0,5 М натрийфосфатного буфера (рН 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К этому раствору добавляли предварительно лиофилизированный CRM₁₉₇ и тщательно перемешивали для получения гомогенного раствора. рН доводили до 6,8, используя разбавленную HCl или 1 н. раствор NaOH. За этим следовало добавление 1,5 молярных эквивалентов NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре (23°С) и в течение 2,5 дней при 37°С. Затем реакционную смесь разбавляли 1-кратным 0,9% физиологическим раствором, и непрореагировавшие альдегидные группы «кэпировали» 2 молярными эквивалентами боргидрида натрия. Время реакции кэпирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте очищенный активированный серотип 12F добавляли в реакционный сосуд с последующим добавлением 0,5 М натрийфосфатного буфера (рН 6,5) до конечной концентрации буфера 0,1 М. К этому раствору добавляли предварительно лиофилизированный CRM₁₉₇ и тщательно перемешивали до получения гомогенного раствора. рН доводили до 6,8, используя разбавленную HCl или 1 н. раствор NaOH. За этим следовало добавление 3 молярных эквивалентов NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°С и в течение 48 часов при 37°С. Затем реакционную смесь разбавляли 1-кратным 0,9% физиологическим раствором, и при перемешивании непрореагировавшие альдегидные группы «кэпировали» 1 молярным эквивалентом боргидрида натрия NaBH₄. Время реакции кэпирования составляло 3 часа.

В другом эксперименте очищенный активированный полисахарид серотипа 12F добавляли в реакционный сосуд и смешивали с раствором CRM₁₉₇. Смесь лиофилизировали и порошок растворяли в 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 6,8) до конечной концентрации сахарида 5 мг/мл. При необходимости рН доводили до 6,8, используя разбавленную HCl или 1 н. раствор NaOH. За этим следовало добавление 3 молярных эквивалентов NaCNBH₃. Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при 23°С и в течение 48 часов при 37°С. Затем реакционную смесь разбавляли 1-кратным 0,9% физиологическим раствором, непрореагировавшие альдегидные группы «кэпировали» 1 молярным эквивалентом боргидрида натрия NaBH₄. Время реакции кэпирования составляло 3 часа.

Очистка конъюгата

Реакционную смесь после кэпирования фильтровали, используя фильтр 5 мкм, а затем очищали, используя мембраны с MWCO 100K для ультрафильтрации. Сначала конъюгат подвергали диафильтрации с использованием буфера 10 мМ сукцинат/0,9% физиологический раствор, рН 6,0. Затем очищенный конъюгат фильтровали через фильтры 0,45/0,22 мкм с получением нерасфасованного конъюгата.

Степень окисления

Успешное окисление первичных спиртов в полисахариде серотипа 12F было достигнуто с использованием системы TEMPO/NCS. Гидролизованные полисахариды серотипа 12F окисляли до различных уровней степени окисления (DO) путем регулирования количества соокислителя NCS. Влияние варьирующих количеств NCS на DO при использовании различных партий и молекулярных масс полисахарида представлено на Фиг. 9. Как правило, реакция окисления завершается в течение 2 часов, поскольку после 2 часов значимого изменения DO не наблюдали.

С использованием полисахарида, окисленного TEMPO/NCS, было получено и охарактеризовано несколько конъюгатов серотипа 12F. Сводные результаты представлены в таблице 12.

Пример 8. Иммуногенность конъюгатов Pn-серотип 12F-CRM₁₉₇ при использовании способа окисления TEMPO/NCS

Титры опсонофагоцитарной активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 12F-CRM₁₉₇ у мышей определяли у мышей в стандартных условиях. Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре и через семь недель представлены в таблице 13, показывающей, что конъюгат серотипа 12F-CRM₁₉₇ (партия 12F-97B; данные характеризации этого конъюгата также см. в таблице 12) вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности. Конъюгат, полученный методом TEMPO-NCS, обладал большей иммуногенностью, чем контрольный конъюгат (171В), полученный в результате окисления перйодатом.

Пример 9. Оценка стабильности гликоконъюгатов Pn-12F

Сравнение стабильности (при 25°С) конъюгатов, полученных путем окисления перйодатом, с полученными окислением TEMPO/NCS (см. Фиг. 10) показало, что конъюгат, полученный путем окисления полисахаридов Pn-12F, был относительно более стабильным. Как показано на Фиг. 10, для гликоконъюгата, полученного путем окисления полисахарида Pn-12F перйодатом при 25°С, наблюдали увеличение количества свободных сахаридов со временем. В отличие от него, гликоконъюгат, полученный путем окисления полисахарида Pn-12F с использованием TEMPO/NCS, в аналогичных условиях не проявлял значимой тенденции к увеличению количества свободных сахаридов.

Пример 10. Приготовление конъюгата полисахарида серотипа 15B-CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 15В

Капсульные полисахариды серотипа 15В могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных обычным специалистам в данной области техники. S. pneumoniae серотипа 15В выращивали в посевной бутыли, а затем переносили в посевной ферментер. Как только была достигнута целевая оптическая плотность, клетки переносили в промышленный ферментер. Ферментационный бульон инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации.

Затем очищенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В подвергали изменению размера путем гомогенизации высокого давления, используя гомогенизатор PANDA 2K® (GEA Niro Soavi, г. Парма, Италия) с получением выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В.

Предпочтительно выделенный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, полученный с помощью описанного выше процесса, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Окисление изолированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,0) путем последовательного добавления рассчитанного количества 500 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) и WFI до получения конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости рН реакционной смеси доводили приблизительно до рН 6,0. После доведения рН температуру реакционной смеси доводили до 23°С. Окисление инициировали добавлением приблизительно 0,25 молярных эквивалентов перйодата натрия. Реакцию окисления проводили при 23°С в течение приблизительно 16 ч.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием кассет с MWCO 10K для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против 20-кратных диаобъемов WFI. Затем очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид был охарактеризован среди прочего по (1) концентрации сахарида методом колориметрического анализа; (2) концентрации альдегида методом колориметрического анализа; (3) степени окисления (4) молекулярной массе по SEC-MALLS и (5) присутствию О-ацетила и глицерина.

SEC-MALLS используют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC используют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Рефрактометрический детектор (RI) и детектор рассеивания лазерного излучения с кратными углами (MALLS) используют для определения молекулярной массы. При взаимодействии света с веществом он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадратом dn/dc (значением инкремента удельного показателя преломления) и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывают на основании показаний сигнала рассеянного света детектора MALLS и сигнала концентрации с детектора RI.

Степень окисления (DO = число моль повторяющегося сахарного звена/число моль альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Число моль повторяющегося сахарного звена определяют различными колориметрическими методами, например с использованием антронового метода. Сначала полисахарид расщепляют до моносахаридов под действием серной кислоты и нагревания. Реактив антрон взаимодействует с гексозами с образованием комплекса, имеющего желто-зеленый цвет, оптическая плотность которого регистрируется спектрофотометрически при 625 нм. В пределах диапазона анализа оптическая плотность прямо пропорциональна присутствующему количеству гексозы.

Одновременно также определяют число моль альдегида, используя колориметрический метод с МВТН. В количественном анализе с МВТН задействовано образование азинового соединения в результате взаимодействия альдегидных групп (из данного образца) с 3-метил-2-бензотиазолонгидразоном (реактивом анализа МВТН). Избыток 3-метил-2-бензотиазолонгидразона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Этот реакционноспособный катион взаимодействует с азином с образованием хромофора синего цвета. Затем образовавшийся хромофор регистрируется спектроскопически при 650 нм.

Предпочтительно активированный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, полученный с помощью описанного выше процесса, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 50 кДа до 500 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 350 кДа.

Конъюгирование активированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 15В с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования состоял из следующих стадий:

а) Объединение с эксципиентом сахарозой и лиофилизация;

б) Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в) Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование; и

г) Очистка конъюгата

а) Объединение с эксципиентом сахарозой и лиофилизация

Активированный полисахарид объединяли с сахарозой в соотношении 25 граммов сахарозы на один грамм активированного полисахарида. Затем флакон с объединенной смесью лиофилизировали. После лиофилизации флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С. Рассчитанное количество CRM₁₉₇ подвергали поверхностному замораживанию тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизировали отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°С.

б) Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида к лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли равное количество безводного DMSO для восстановления.

в) Конъюгирование и кэпирование

Восстановленный активированный полисахарид объединяли с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционном сосуде (исходное отношение: 0,8:1) с последующим тщательным перемешиванием до получения прозрачного раствора, после чего конъюгирование инициировали добавлением цианоборгидрида натрия. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет приблизительно 1 г/л. Конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси 1,0-1,5 МЭкв цианоборгидрида натрия и инкубировали при 23°С в течение 40-48 ч. Реакцию конъюгирования останавливали добавлением 2 МЭкв боргидрида натрия (NaBH₄) для кэпирования непрореагировавших альдегидов. Эта реакция кэпирования продолжалась при 23°С в течение 3 ч.

г) Очистка конъюгата

При подготовке к очистке раствор конъюгата разводили 1:10 охлажденным 5 мМ раствором сукцината в 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0) и очищали фильтрованием с тангенциальным потоком, используя мембраны с MWCO 100-300K. Разведенный раствор конъюгата пропускали через фильтр 5 мкм и выполняли диафильтрацию, используя в качестве среды 5 мМ раствор сукцината в 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0). После завершения диафильтрации ретентат конъюгата переносили через фильтр 0,22 мкм.

Конъюгат дополнительно разводили 5 мМ сукцинатом/0,9% физиологическим раствором (рН 6) до целевой концентрации сахарида приблизительно 0,5 мг/мл. После завершения стадии конечного фильтрования через фильтр 0,22 мкм получили гликоконъюгат.

Предпочтительно конъюгат, полученный с помощью описанного выше процесса, содержит по меньшей мере 0,6 мМ ацетата на один мМ капсульного полисахарида серотипа 15В и имеет молекулярную массу от 3000 кДа до 20000 кДа и степень конъюгирования от 2 до 6.

Пример 11. Характеризация гликоконъюгата, содержащего капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, ковалентно связанный с CRM₁₉₇

Конъюгат 1 был получен способом по примеру 10. Конъюгаты 2 и 3 были получены аналогичным способом с использованием различных количеств окисляющего агента. Конъюгат 4 был получен аналогичным способом за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В не подвергали изменению размера и активировали до низкой DO (более высокий уровень окисления) и выполняли конъюгирование в водной среде. Конъюгат 5 был получен аналогичным способом за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В подвергали изменению размера путем химического гидролиза и выполняли конъюгирование в водной среде. Конъюгаты 6 и 7 были получены аналогичным способом за исключением того, что очищенный капсульный полисахарид серотипа 15В не подвергали изменению размера.

Полученные конъюгаты были охарактеризованы, и сводные результаты представлены в таблице 14.

НД - данные недоступны

Процентное содержание свободного полисахарида измеряют с помощью методики, в которой для связывания белка и ковалентно связанного сахарида с целью его удаления центрифугированием используют гель гидрата окиси алюминия. Образцы смешивают с гелем гидрата окиси алюминия, забуференным фосфатом, и центрифугируют. Связанный сахарид осаждается с гелем, а свободный сахарид остается в супернатанте. Полученный в результате супернатант и контрольные образцы подвергают количественному определению с помощью соответствующих колориметрических анализов для определения процентного содержания свободного сахарида и для подтверждения достаточного удаления белка и выделения сахарида.

Для аминокислотного анализа образец полисахарид-белок сначала подвергают гидролизу до отдельных компонентов в виде свободных аминокислот, используя гидролиз 6 н. соляной кислотой (HCl) в вакууме при нагревании (160°С в течение 15 минут). После гидролиза образцы анализируют с помощью анализатора аминокислот. Отдельные аминокислоты разделяют посредством ионообменной хроматографии, используя ступенчатый градиент натрийцитратного буфера с изменениями температуры и скорости потока. После разделения количество каждого аминокислотного остатка определяют, используя систему выявления нингидриновым сочетанием после выхода из колонки. В этой системе нингидрин смешивается с элюатом колонки в реакционной системе на выходе из колонки, и смесь пропускают через фотометр. В результате реакции нингидрина с элюируемыми аминокислотами образуется соединение пурпурного цвета с максимальным поглощением при 570 нм. Данное поглощение представляет собой линейный ответ (функцию) от количества присутствующих α-аминогрупп, и данная реакция обеспечивает количественный колориметрический анализ для всех органических соединений, содержащих α-аминогруппы. При взаимодействии с иминокислотами, такими как пролин и гидроксипролин, не имеющими свободной аминогруппы, образуется ярко-желтое соединение, которое регистрируют при 440 нм. Площади пика для каждой аминокислоты рассчитывают с использованием показаний при обоих значениях длины волны 570 нм и 440 нм.

Выход рассчитывают следующим образом: (количество полисахарида в конъюгате ×100)/количество активированного полисахарида.

Для конъюгатов (4 и 5), полученных с использованием водной среды, показана значительная потеря уровней О-ацетила. Для конъюгатов, образованных в растворителе DMSO с использованием нативного полисахарида без изменения размера MW (6 и 7), потеря уровней О-ацетила не показана. Однако, помимо плохих характеристик фильтруемости, выходы конъюгата были очень низкими. Конъюгаты, образованные в DMSO с использованием полисахаридов, которые были подвергнуты изменению размера путем гомогенизации высокого давления (1, 2 и 3), характеризовались высоким выходом и лучшими характеристиками фильтруемости при значительном сохранении уровней О-ацетила. Эти конъюгаты также имели очень низкие уровни свободных полисахаридов.

Пример 12. Анализ опсонофагоцитарной активности (ОРА) с использованием конъюгатов Pn-серотип 15B-CRM₁₉₇

Иммуногенность конъюгатов S. pneumoniae серотипа 15В по изобретению можно оценивать с использованием анализа ОРА, описанного ниже.

Группы из 30 самок швейцарских мышей Вебстер 6-7-недельного возраста иммунизировали 0,001 мкг, 0,01 мкг или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов подкожным путем на неделе 0. На неделе 3 мышам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгата, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфические анализы ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 4.

ОРА используют для количественного определения функциональных антител в сыворотках крови мышей, специфичных к серотипу 15В S. pneumoniae. Исследуемую сыворотку помещают в условия аналитических реакций, позволяющих количественно определить способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, к опсонизации бактерий и запуску накопления комплемента, что способствует фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Методики ОРА были основаны на методах, описанных в публикации Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2):287-295, со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку крови серийно разводили в 2,5 раза и добавляли в аналитические микротитрационные планшеты. В лунки добавляли живые целевые бактерии серотипа 15В, и планшеты встряхивали при 37°С в течение 30 минут. В лунки добавляли дифференцированные клетки HL-60 (фагоциты) и сыворотку крови крольчат (возраста от 3 до 4 недель, PEL-FREEZ®, конечная концентрация 6,25%), и планшеты встряхивали при 37°С в течение 45 минут. Для остановки реакции во все лунки добавляли 80 мкл 0,9% раствора NaCl, перемешивали, и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки планшетов с фильтрами MULTISCREEN® HTS HV (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты в вакууме, и в каждую лунку добавляли 150 мкл питательной среды HYSOY® и профильтровывали. Затем планшеты с фильтрами инкубировали при 37°С, 5% CO₂ в течение ночи, а затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., г. Геркулес, штат Калифорния, США). Затем планшеты окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Колонии визуализировали и подсчитывали на анализаторе Cellular Technology Limited (CTL) (г. Шейкер-Хайтс, штат Огайо, США) IMMUNOSPOT®. Исходные данные подсчета колоний использовали для построения кривых уничтожения и расчета титров ОРА.

Иммуногенность конъюгатов 1 и 2 исследована в соответствии с описанным выше анализом. В том же анализе также был исследован один дополнительный конъюгат и неконъюгированный нативный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В (неконъюгированный PS).

Конъюгат 9 готовили путем конъюгирования нативного (то есть не подвергнутого изменению размера) капсульного полисахарида серотипа 15В с CRM₁₉₇ путем восстановительного аминирования в водном растворе.

Результаты представлены в таблице 15.

Как показано в таблице 15 выше, конъюгаты 1 и 2 при введении мышам вызывали выработку антител, способных к опсонизации S. pneumoniae серотипа 15В, запускающей накопление комплемента, способствуя, таким образом, фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Кроме того, несмотря на их более низкую молекулярную массу, они также проявляют сходный уровень иммуногенности по сравнению с конъюгатом 9, не подвергнутым изменению размера.

Пример 13. Приготовление конъюгата полисахарида серотипа 22F-CRM₁₉₇

Получение выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F

S. pneumoniae серотипа 22F выращивали в посевной бутыли, а затем переносили в посевной ферментер. Как только была достигнута целевая оптическая плотность, клетки переносили в промышленный ферментер. Ферментационную смесь инактивировали добавлением N-лауроилсаркозина и очищали с помощью ультрафильтрации и диафильтрации.

Очищенный полисахарид S. pneumoniae серотипа 22F подвергали изменению размера путем гомогенизации высокого давления, используя гомогенизатор PANDA 2K® (GEA Niro Soavi, г. Парма, Италия) с получением выделенного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F.

Окисление изолированного капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калийфосфатном буфере (рН 5,8), полученном путем последовательного добавления рассчитанного количества 500 мМ калийфосфатного буфера (рН 5,8) и WFI до получения конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости рН реакционной смеси доводили приблизительно до 5,8. После доведения рН температуру реакционной смеси понижали до 5°С. Окисление инициировали добавлением 0,10 молярных эквивалентов (МЭкв) перйодата натрия. Целевое время реакции окисления составляет 16 ч при 5°С.

Реакцию окисления гасили 2 МЭкв 2,3-бутандиола при непрерывном перемешивании при 5°С в течение 1-2 ч.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием кассет с MWCO 100K для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против 35-кратного диаобъема WFI. Очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С. Очищенный активированный сахарид характеризуют среди прочего (1) по молекулярной массе методом SEC-MALLS; (2) присутствию О-ацетила и (3) степени окисления.

SEC-MALLS используют для определения молекулярной массы полисахаридов и конъюгатов полисахарид-белок. SEC используют для разделения полисахаридов по гидродинамическому объему. Рефрактометрический детектор (RI) и детектор рассеивания лазерного излучения с кратными углами (MALLS) используют для определения молекулярной массы. При взаимодействии света с веществом он рассеивается, и количество рассеянного света связано с концентрацией, квадратом dn/dc (значением инкремента удельного показателя преломления) и молярной массой вещества. Измерение молекулярной массы рассчитывают на основании показаний сигнала рассеянного света детектора MALLS и сигнала концентрации с детектора RI.

Степень окисления (DO = число моль повторяющегося сахарного звена/число моль альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом:

Число моль повторяющегося сахарного звена определяют различными колориметрическими методами, например с использованием антронового метода. Сначала полисахарид расщепляют до моносахаридов под действием серной кислоты и нагревания. Реактив антрон взаимодействует с гексозами с образованием комплекса, имеющего желто-зеленый цвет, оптическая плотность которого регистрируется спектрофотометрически при 625 нм. В пределах диапазона анализа оптическая плотность прямо пропорциональна присутствующему количеству гексозы.

Одновременно также определяют число моль альдегида, используя колориметрический метод с МВТН. В количественном анализе с МВТН задействовано образование азинового соединения в результате взаимодействия альдегидных групп (из данного образца) с 3-метил-2-бензотиазолонгидразоном (реактивом анализа МВТН). Избыток 3-метил-2-бензотиазолонгидразона окисляется с образованием реакционноспособного катиона. Этот реакционноспособный катион взаимодействует с азином с образованием хромофора синего цвета. Затем образовавшийся хромофор регистрируется спектроскопически при 650 нм.

Конъюгирование активированного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F с CRM₁₉₇

Процесс конъюгирования состоял из следующих стадий:

а. Объединение с эксципиентом сахарозой и лиофилизация;

б. Восстановление лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование; и

г. Очистка конъюгата

а. Объединение с сахарозой и лиофилизация

Активированный полисахарид объединяли с сахарозой (50% масс/об. в WFI) в соотношении 25 граммов сахарозы на один грамм активированного полисахарида. Затем флакон с объединенной смесью лиофилизировали. После лиофилизации флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20°С. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ (целевое исходное отношение сахарид (S)/белок (Р)=1) подвергали поверхностному замораживанию тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизировали отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20°С.

б. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида к лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли равное количество безводного DMSO для восстановления.

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇ и кэпирование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в DMSO) объединяли в сосуде для реакции конъюгирования с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси 1,5 МЭкв цианоборгидрида натрия и инкубировали при 23°С в течение 20 ч. Остановку реакции конъюгирования выполняют путем добавления 2 МЭкв боргидрида натрия. Реакционную смесь для кэпирования инкубировали при 23°С в течение 3 ч.

г. Очистка конъюгата

При подготовке к очистке раствор конъюгата разводили 1:5 в охлажденном 5 мМ растворе сукцината в 0,9% физиологическом растворе (рН 6,0) и очищали фильтрованием с тангенциальным потоком, используя мембраны с MWCO 100K, и выполняли 20-кратную диафильтрацию, используя в качестве среды 5 мМ сукцинат - 0,9% физиологический раствор (рН 6,0). После завершения диафильтрации ретентат конъюгата дополнительно разводили, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили при 2-8°С.

С использованием описанного выше процесса было получено несколько конъюгатов путем варьирования различных параметров (например, исходного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и МЭкв цианоборгидрида натрия). Характеризация репрезентативных гликоконъюгатов Pn-22F с CRM₁₉₇ приведена в таблице 16.

НД - данные недоступны

Содержание (сохраненного) О-ацетила в % в конечном конъюгате рассчитывали на основании отношения содержания О-ацетила конъюгата (число мкмоль О-ацетила на один мкмоль повторяющегося сахаридного звена серотипа 22F) к содержанию О-ацетила в полисахариде (число мкмоль О-ацетила на один мкмоль повторяющегося сахаридного звена серотипа 22F).

Проведена оценка иммуногенности конъюгатов, полученных, как описано выше, с использованием анализа опсонофагоцитарной активности (ОРА), описанного ниже.

Группы из тридцати самок швейцарских мышей Вебстер 6-7-недельного возраста иммунизировали 0,001 мкг, 0,005 мкг или 0,01 мкг исследуемых конъюгатов подкожным путем на неделе 0. На неделе 3 мышам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгата, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфические анализы ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 4.

Анализы опсонофагоцитарной активности (ОРА) используют для количественного определения функциональных антител в сыворотке крови мышей, специфичной к серотипу 22F S. pneumoniae. Исследуемую сыворотку помещают в условия аналитических реакций, позволяющих количественно определить способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, к опсонизации бактерий и запуску накопления комплемента, что способствует фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Методики ОРА были основаны на методах, описанных в публикации Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2): 287-295, со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку крови серийно разводили в 2,5 раза и добавляли в аналитические микротитрационные планшеты. В лунки добавляли живые целевые штаммы бактерий серотипа 22F, и планшеты встряхивали при 25°С в течение 30 минут. В лунки добавляли дифференцированные клетки HL-60 (фагоциты) и сыворотку крови крольчат (возраста от 3 до 4 недель, PEL-FREEZ®, конечная концентрация 12,5%), и планшеты встряхивали при 37°С в течение 45 минут. Для остановки реакции во все лунки добавляли 80 мкл 0,9% раствора NaCl, перемешивали, и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки планшетов с фильтрами MULTISCREEN® HTS HV (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты в вакууме, и в каждую лунку добавляли 150 мкл питательной среды HYSOY® и профильтровывали. Затем планшеты с фильтрами инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи, а затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., г. Геркулес, штат Калифорния, США). Затем планшеты окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Колонии визуализировали и подсчитывали на анализаторе Cellular Technology Limited (CTL) (г. Шейкер-Хайтс, штат Огайо, США) IMMUNOSPOT®. Исходные данные подсчета колоний использовали для построения кривых уничтожения и расчета титров ОРА.

Титры опсонофагоцитарной активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 22F-CRM₁₉₇ у мышей определяли, как описано выше. Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели при различных дозах представлены в таблицах 17 и 18 (два отдельных эксперимента), показывающих, что конъюгат серотипа 22F (партии 1-7; данные характеризации этих конъюгатов также см. в таблице 16) вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности.

Пример 14. Приготовление конъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇

Приготовление гликоконъюгатов Pn-11A RAC

Замороженный, подвергнутый изменению размера полисахарид, который хранился в деионизированной воде или 25 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,0), размораживали при 5°С.

Окисление полисахарида

Окисление полисахарида проводили в 100 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,0) путем добавления 500 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,0) и WFI до получения конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. Реакцию окисления проводили при 23°С. Окисление инициировали добавлением перйодата натрия. Скорость перемешивания находилась в диапазоне 100-140 об/мин.

Очистка активированного полисахарида 11А

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием кассет для ультрафильтрации. Диафильтрацию выполняли против 20-кратного диаобъема WFI. После фильтрования через фильтр 0,22 мкм очищенный активированный полисахарид хранили при 5°С.

Описание процесса конъюгирования

Процесс конъюгирования состоял из следующих стадий:

а. Поверхностное замораживание тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизация белка CRM₁₉₇;

б. Восстановление активированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

г. Очистка и разведение конъюгата.

а. Поверхностное замораживание тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизация белка CRM₁₉₇

Белок CRM₁₉₇ подвергали поверхностному замораживанию в тонком слое жидкости на стенке вращающегося сосуда и лиофилизировали.

б. Восстановление активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Раствор активированного полисахарида (приблизительно 10 г/л) загружали в реактор с последующим добавлением рассчитанного количества 0,5 н. натрийфосфатного буфера (рН 7,2). При перемешивании добавляли лиофилизированный белок CRM₁₉₇, и реакционную смесь перемешивали в течение 2-4 часа для достижения полного растворения CRM₁₉₇.

в. Конъюгирование и кэпирование

Конъюгирование инициировали добавлением цианоборгидрида натрия. Реакционную смесь инкубировали при 23°С в течение 72-96 ч. Остановку реакции конъюгирования выполняли путем добавления 0,5-кратного количества WFI с последующим добавлением 2 МЭкв боргидрида натрия. Эту реакцию кэпирования выдерживали при 23°С в течение 3-4 ч.

г. Разведение и первоначальная очистка конъюгата

При подготовке к очистке раствор конъюгата разводили 1:5 (объем реакционной смеси) 0,15 н. натрийфосфатным буфером (рН 8,0) и очищали фильтрованием с тангенциальным потоком (TFF). Разведенный конъюгат смешивали в сосуде для разведения, а затем пропускали через фильтр 5 мкм. Затем фильтрованный раствор конъюгата концентрировали до 1-2 г/л. Выполняли двухстадийный процесс диафильтрации. На стадии один проводили TFF с использованием 30-кратного (объема диафильтрации) 0,15 н. натрийфосфатного буфера (рН 8,0), а затем 20-кратного раствора 5 мМ сукцинат - 0,9% NaCl (рН 6,0). После завершения первоначальной диафильтрации ретентат конъюгата переносили через фильтр 0,45 мкм в сборный резервуар.

Конечная диафильтрация конъюгата

Конечная стадия очистки состояла в 20-кратной диафильтрации со средой, представляющей собой 5 мМ сукцинат - 0,9% NaCl, рН 6,0, используя регенерированные целлюлозные мембраны.

Разведение одновалентного нерасфасованного конъюгата (Monovalent Bulk Conjugate, MBC)

Конъюгат дополнительно разводили 5 мМ сукцинатом/0,9% NaCl, рН 6, до целевой концентрации сахарида 0,5 мг/мл. Стадия конечного фильтрования 0,22 мкм была завершена с получением продукта одновалентного нерасфасованного конъюгата (МВС) для приготовления лекарственной формы.

С использованием описанного выше процесса было получено несколько конъюгатов путем варьирования различных параметров (например, исходного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и МЭкв цианоборгидрида натрия). Характеризация репрезентативных гликоконъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇ приведена в таблице 19 (партии 1-5).

Приготовление гликоконъюгатов Pn-11А с использованием RAC/DMSO

Окисленный полисахарид готовили и очищали, как описано выше (см. Приготовление гликоконъюгатов Pn-11А RAC).

Конъюгирование посредством восстановительного аминирования в DMSO (RAC/DMSO)

Конъюгирование 11А посредством RAC/DMSO состояла из следующих стадий:

а. Объединение с сахарозой, поверхностное замораживание тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизация;

б. Восстановление лиофилизированного полисахарида и CRM₁₉₇;

в. Конъюгирование активированного полисахарида с CRM₁₉₇; и

г. Очистка и разведение конъюгата.

а. Объединение с сахарозой, поверхностное замораживание тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов и лиофилизация

Активированный полисахарид, приготовленный из подвергнутого изменению размера полисахарида объединяли с сахарозой (50% масс/об. в WFI) в соотношении 25 граммов сахарозы на один грамм активированного полисахарида. Компоненты смешивали во флаконе для поверхностного замораживания тонкого слоя жидкости на стенках вращающихся сосудов с объединенной смесью, а затем смесь лиофилизировали. Белок CRM₁₉₇ подвергали поверхностному замораживанию в тонком слое жидкости на стенке вращающегося сосуда и лиофилизировали отдельно.

б. Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка CRM₁₉₇

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в DMSO до концентрации 2 мг/мл. После полного растворения полисахарида к лиофилизированному CRM₁₉₇ добавляли DMSO для восстановления.

в. Конъюгирование и кэширование

Восстановленный CRM₁₉₇ (в DMSO) объединяли в сосуде для реакции конъюгирования с восстановленным активированным полисахаридом. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляет 1 г/л. Конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси цианоборгидрида натрия и инкубировали при 23°С в течение 22 часов. Остановку реакции конъюгирования выполняют путем добавления 2 МЭкв боргидрида натрия. Эту реакцию кэпирования выдерживали при 23°С в течение 3-4 ч.

г. Очистка и разведение конъюгата.

Раствор конъюгата очищали и разводили, используя способ, подобный описанному выше.

С использованием описанного выше процесса было получено несколько конъюгатов путем варьирования различных параметров (например, исходного соотношения сахарид-белок, концентрации реакционной смеси и МЭкв цианоборгидрида натрия). Характеризация репрезентативных гликоконъюгатов Pn-11А с CRM₁₉₇, полученных описанным выше способом, приведена в таблице 19 (партии 6-8).

НД - данные недоступны

*Глицерин определяли количественно методом высокоэффективной ионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектором (HPAEC-PAD) после его высвобождения из полисахарида фтористоводородной кислотой (HF).

В целом данные, полученные для конъюгатов, приготовленных с помощью описанных выше процессов восстановительного аминирования, демонстрируют, что этот процесс позволяет получить конъюгаты с хорошим выходом конъюгирования, низким % содержания свободного сахарида и надлежащей стабильностью.

Оценкивали иммуногенность конъюгатов, полученных, как описано выше, с использованием анализа опсонофагоцитарной активности (ОРА), описанного ниже.

Группы из тридцати самок швейцарских мышей Вебстер 6-7-недельного возраста иммунизировали 0,001 мкг, 0,005 мкг, 0,01 мкг или 0,1 мкг исследуемых конъюгатов подкожным путем на неделе 0. На неделе 3 мышам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгата, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфические анализы ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 4.

Анализы опсонофагоцитарной активности (ОРА) используют для количественного определения функциональных антител в сыворотке крови мышей, специфичной к серотипу 11A S. pneumoniae. Исследуемую сыворотку помещают в условия аналитических реакций, позволяющих количественно определить способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, к опсонизации бактерий и запуску накопления комплемента, что способствует фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Методики ОРА были основаны на методах, описанных в публикации Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2): 287-295, со следующими модификациями. Исследуемую сыворотку крови серийно разводили в 2,5 раза и добавляли в аналитические микротитрационные планшеты. В лунки добавляли живые целевые штаммы бактерий серотипа 22F, и планшеты встряхивали при 25°С в течение 30 минут. В лунки добавляли дифференцированные клетки HL-60 (фагоциты) и сыворотку крови крольчат (возраста от 3 до 4 недель, PEL-FREEZ®, конечная концентрация 12,5%), и планшеты встряхивали при 37°С в течение 60 минут. Для остановки реакции во все лунки добавляли 80 мкл 0,9% раствора NaCl, перемешивали, и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки планшетов с фильтрами MULTISCREEN® HTS HV (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты в вакууме, и в каждую лунку добавляли 150 мкл питательной среды HYSOY® и профильтровывали. Затем планшеты с фильтрами инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи, а затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., г. Геркулес, штат Калифорния, США). Затем планшеты окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Колонии визуализировали и подсчитывали на анализаторе Cellular Technology Limited (CTL) (г. Шейкер-Хайтс, штат Огайо, США) IMMUNOSPOT®. Исходные данные подсчета колоний использовали для построения кривых уничтожения и расчета титров ОРА.

Титры опсонофагоцитарной активности (ОРА) для конъюгатов серотипа 11А-CRM₁₉₇ у мышей определяли, как описано выше. Титры ОРА (геометрическое среднее титра (GMT) с 95% доверительным интервалом (CI)) через четыре недели при различных дозах представлены в таблице 20, показывающей, что конъюгат серотипа 11А (партии 2-4 и 8; данные характеризации этих конъюгатов также см. в таблице 19) вызывал титры ОРА в мышиной модели иммуногенности.

Пример 15. Приготовление 16-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины

Готовили 16-валентную конъюгатную композицию, содержащую гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F (16vPnC), которые были все по отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты S. pneumoniae из серотипов 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, гликоконъюгаты S. pneumoniae из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в документе WO 2006/110381.

Требуемые объемы нерасфасованных концентратов рассчитывали на основании объема партии и концентраций нерасфасованного сахарида. Приготовленную нерасфасованную вакцину получали путем добавления требуемого объема буфера NaCl/сукцинат (рН 5,8) до получения конечной целевой концентрации сукцината в буфере 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 16 пневмококковых конъюгатов. Препарат фильтровали через PES (полиэфирсульфоновую) мембрану Millipore 0,2 мкм с последующим добавлением AlPO₄. Композицию перемешивали для обеспечения возможности связывания и достижения гомогенности.

Затем композицию заполняли в стеклянные шприцы для доставки объема дозы 0,5 мл.

Готовая дозированная форма состояла из 2,2 мкг каждого из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇, 4,4 мкг гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ сукцинатного буфера рН 5,8, 0,02% (масс./масс.) PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ на дозу 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇ составляло приблизительно 38 мкг на дозу 0,5 мл.

Пример 16. Приготовление 20-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины

Готовили 20-валентную конъюгатную композицию, содержащую гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F (20vPnC), которые были все по отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты S. pneumoniae из серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F были получены, как раскрыто выше, в гликоконъюгаты S. pneumoniae из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F были получены, как раскрыто в документе WO 2006/110381.

Требуемые объемы нерасфасованных концентратов рассчитывали на основании объема партии и концентраций нерасфасованного сахарида. Приготовленную нерасфасованную вакцину получали путем добавления требуемого объема буфера NaCl/сукцинат (рН 5,8) до получения конечной целевой концентрации сукцината в буфере 5,0 мМ и 150 мМ NaCl. Добавляли полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 20 пневмококковых конъюгатов. Препарат фильтровали через PES мембрану Millipore 0,2 мкм с последующим добавлением AlPO₄. Композицию хорошо перемешивали для получения максимального связывания конъюгатов с алюминием.

Затем композицию заполняют в стеклянные шприцы для доставки объема дозы 0,5 мл.

Готовая дозированная форма состояла из 2,2 мкг каждого из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇, 4,4 мкг гликоконъюгата S. pneumoniae серотипа 6В, 5 мМ сукцинатного буфера рН 5,8, 0,02% (масс./масс.) PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ на дозу 0,5 мл. Содержание CRM₁₉₇ составляло приблизительно 46 мкг на дозу 0,5 мл.

Пример 17. Иммуногенность 16-валентной иммуногенной композиции

Иммуногенность 16-валентной иммуногенной композиции (см. пример 15) оценивали у кроликов с использованием мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIA) для измерения концентраций серотип-специфичного IgG в сыворотках крови и серотип-специфичных ОРА.

Группы из десяти самок новозеландских белых кроликов массой от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предлагаемой клинической дозой для человека (2,2 мкг конъюгата, кроме серотипа 6В, количество которого составляло 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AlPO₄) внутримышечным путем на неделе 0. На неделе 2 кроликам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгатной вакцины, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфичные анализы dLIA и ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 0 и недели 4.

Для определения общего количества полисахарид-связывающего антитела (IgG), специфичного к каждому пневмококковому полисахариду (PnPS), оценивали кроличьи сыворотки крови в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIA; 13-плексном dLIA, серотипы ПРЕВНАР 13^®, и 7-плексном dLIA, дополнительные серотипы). 13-плексный анализ количественно определяет антитела к PnPS, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгатную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F), а 7-плексный анализ количественно определяет антитела к PnPS дополнительных серотипов (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, связанных с конъюгатами PnPS (конъюгаты PnPS-PLL: PnPS, конъюгированные с поли-L-лизином).

Кратко, эталонный стандарт, контрольные образцы и исследуемые сыворотки крови сначала предварительно адсорбировали на двух адсорбентах Pn: CWPS1 (полисахариде клеточной стенки PnA, содержащем С-полисахарид) и CWPS2 (CWP из бескапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для кэпирования связывания неспецифических антител с покрывающим антигеном PnPS. После предварительной адсорбции PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответствующими разведениями эталонного стандарта сыворотки крови, контрольных образцов или исследуемых кроличьих сыворотоки крови. После инкубации каждую смесь промывали и добавляли вторичное козье противокроличье антитело IgG, конъюгированное с R-фикоэритрином. Флуоресцентные сигналы (выраженные в виде медианных интенсивностей флуоресценции (MFI)) измеряли, используя считывающее устройство Bio-Plex, и соотносили с количеством PnPS-специфичного IgG. Значения для исследуемых сывороток крови указывали в виде (единицы/мл, ед./мл).

Серотип-специфичные ОРА проводили, как описано выше. Титр ОРА представляет собой величину, обратно пропорциональную самому высокому разведению сыворотки крови, приводящему в результате к 50% уменьшению числа колониеобразующих единиц (CFU) бактерий по сравнению с контролем без сыворотки крови (определяемом как число CFU на исходном уровне). Титр интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Результаты показали значимое повышение ответов серотип-специфичного IgG и функциональных антител ОРА после двух иммунизации 16vPnC (таблица 21). Уровни IgG в сыворотке крови повысились более чем на 2 log выше исходного уровня. Аналогично, был вызван сильный ответ функциональных антител ОРА с минимум 22-кратным повышением GMT ОРА по сравнению с исходным уровнем. В образцах сыворотки крови до иммунизации (неделя 0) для большинства серотипов 16v Pn не выявлены обнаружимые уровни PnPS-специфичного IgG и функциональных антител ОРА за исключением серотипов 14 и 33F. Для этих серотипов присутствовали низкие уровни титров ОРА, но эти исходные ответы не оказали нежелательного влияния на ответ антител после вакцинации.

Пример 18. Иммуногенность 20-валентной иммуногенной композиции

Иммуногенность 20-валентной иммуногенной композиции (полученной, как описано в примере 16) оценивали у кроликов с использованием мультиплексных прямых иммуноанализов Luminex (dLIA) для измерения концентраций серотип-специфичного IgG в образцах сыворотках крови и серотип-специфичных ОРА.

Группы из десяти самок новозеландских белых кроликов массой от 2,5 кг до 3,5 кг иммунизировали предлагаемой клинической дозой для человека (2,2 мкг конъюгата, кроме серотипа 6В, количество которого составляло 4,4 мкг; плюс 0,1 мг алюминия в виде AlPO₄) внутримышечным путем на неделе 0. На неделе 2 кроликам проводили бустер-иммунизацию такой же дозой конъюгатной вакцины, а затем брали кровь на неделе 4. Серотип-специфичные анализы dLIA и ОРА выполняли на образцах сыворотки крови недели 0 и недели 4.

Для определения общего количества полисахарид-связывающего антитела (IgG), специфичного к каждому пневмококковому полисахариду (PnPS), кроличьи сыворотки крови оценивали в двух прямых иммуноанализах Luminex (dLIA; 13-плексном dLIA, серотипы ПРЕВНАР 13^®, и 7-плексном dLIA, дополнительные серотипы). 13-плексный анализ количественно определяет антитела к PnPS, специфичные к 13 серотипам, включенным в 13-валентную пневмококковую конъюгатную (PnC) вакцину (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F), а 7-плексный анализ количественно определяет антитела к PnPS дополнительных серотипов (15В, 22F, 33F). Каждый анализ содержит комбинацию из 13 или 7 спектрально различных магнитных микросфер, связанных с конъюгатами PnPS (конъюгаты PnPS-PLL: PnPS, конъюгированные с поли-L-лизином).

Кратко, эталонный стандарт, контрольные образцы и исследуемые сыворотки крови сначала предварительно адсорбировали на двух адсорбентах Pn: CWPS1 (полисахариде клеточной стенки PnA, содержащем С-полисахарид) и CWPS2 (CWP из бескапсульного S. pneumoniae серотипа 2) для кэпирования связывания неспецифических антител с покрывающим антигеном PnPS. После предварительной адсорбции PnPS-связанные микросферы инкубировали с соответствующими разведениями эталонного стандарта сыворотки крови, контрольных образцов или исследуемых образцов кроличьей сыворотки крови. После инкубации каждую смесь промывали и добавляли вторичное козье противокроличье антитело IgG, конъюгированное с R-фикоэритрином. Флуоресцентные сигналы (выраженные в виде медианных интенсивностей флуоресценции (MFI)) измеряли, используя считывающее устройство Bio-Plex, и соотносили с количеством PnPS-специфичного IgG. Значения для исследуемых сывороток крови указывали в виде (единицы/мл, ед./мл).

Серотип-специфичные ОРА проводили, как описано выше. Титр ОРА представляет собой величину, обратно пропорциональную самому высокому разведению сыворотки крови, приводящему в результате к 50% уменьшению числа колониеобразующих единиц (CFU) бактерий по сравнению с контролем без сыворотки крови (определяемом как число CFU на исходном уровне). Титр интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Для кроликов, иммунизированных 20vPnC, также показаны значимые повышения общего IgG и титров функциональных антител ОРА к серотипам, общим для композиций 16v и 20v, а также к дополнительным четырем серотипам (8, 10А, 11А и 12F) (таблица 22). Для всех 20 серотипов после двух иммунизации было индуцировано 2-логарифмическое повышение концентраций IgG в сыворотке крови. GMT ОРА, вызванные вакциной, были по меньшей мере в 27 раз выше исходного уровня. Титры ОРА низкого уровня в образцах сыворотки крови до иммунизации также наблюдали для серотипов 14 и 33F после вакцинации 20vPnC, но это, опять же, не изменило силу ответов антител после вакцинации.

Лекарственные формы 16vPnC и 20vPnC вызывали сильный гуморальный ответ, который был как специфичен к полисахаридам пневмококка, так и ассоциирован функциональным уничтожением бактерий (см. таблицы 21 и 22). В заключение, в исследованиях, показанных в примерах 17 и 18, продемонстрирована высокая иммуногенность обеих композиций 16vPnC и 20vPnC.

Пример 19. Оценка перекрестно-реактивных опсонофагоцитарных иммунных ответов в пределах серогруппы 9 Streptococcus pneumoniae

Пневмококковый опсонофагоцитарный анализ (ОРА), в котором количественно определяют уничтожение клеток S. pneumoniae фагоцитарными эффекторными клетками в присутствии функционального антитела и комплемента, считают важным косвенным показателем для оценки эффективонсти пневмококковых вакцин.

Материалы и методы

Две рандомизированно выбранных подгруппы образцов иммунной сыворотки крови от взрослых людей, вакцинированных 13-валентной пневмококковой конъюгатной вакциной (13v PnC), исследовали в анализах ОРА на предмет серотипов 9V, 9А, 9L и 9N. Сыворотки крови были отобраны из клинических исследований США 6115А1-004 (N равно 59, после вакцинации) и 6115А1-3005 (N равно 66, соответствующие образцы до и после вакцинации) соответственно.

Исследование 6115А1-3005 (идентификатор: ClinicalTrials.gov: NCT00546572) представляло собой рандомизированное, с активным контролем, модифицированное двойное слепое исследование 3 фазы по оценке безопасности, переносимости и иммуногенности ПРЕВНАР 13^® по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у пожилых амбулаторных пациентов в возрасте 70 лет и старше, получивших 1 дозу 23vPS по меньшей мере за 5 лет до включения для участия в исследовании (см.: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572; доступ осуществлялся 31 марта 2014).

Исследование 6115А1-004 (идентификатор: ClinicalTrials.gov:NCT00427895) представляло собой рандомизированное, с активным контролем, модифицированное двойное слепое исследование 3 фазы по оценке безопасности, переносимости и иммуногенности 13-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины (13vPnC) по сравнению с 23-валентной пневмококковой полисахаридной вакциной (23vPS) у взрослых в возрасте от 60 до 64 лет, ранее не подвергавшихся вакцинации 23vPS, и безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины 13vPnC у взрослых в возрасте от 18 до 59 лет, ранее не подвергавшихся вакцинации 23vPS (см.: http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895; доступ осуществлялся 31 марта 2014 г.).

13-Валентная пневмококковая конъюгатная вакцина (13vPnC), тестируемая в данных исследованиях, содержала конъюгаты из пневмококковых серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с белком-носителем, представляющим собой перекрестно-реагирующий материал дифтерийного токсина 197 (CRM₁₉₇).

ОРА используют для количественного определения функциональных антител в сыворотках крови человека к S. pneumoniae серотипов 9V, 9N, 9А и/или 9L. Исследуемую сыворотку помещают в условия аналитических реакций, позволяющих количественно определить способность иммуноглобулина, специфичного к капсульному полисахариду, к опсонизации бактерий и запуску накопления комплемента, что способствует фагоцитозу и уничтожению бактерий фагоцитами. Титр ОРА определяют как кратность разведения, приводящую в результате к 50% уменьшению количества бактерий по сравнению с контрольными лунками без исследуемой сыворотки крови. Титр ОРА интерполируют из двух разведений, которые охватывают этот 50% порог уничтожения.

Методики ОРА были основаны на методах, описанных в публикации Hu et al. (2005) Clin Diagn Lab Immunol 122: 287-295. Готовили серийные 2,5-кратные разведения исследуемой сыворотки крови, инактивированной нагреванием, вносили в аналитические планшеты вместе с целевыми бактериями и инкубировали в течение 30 минут при встряхивании. Затем в лунки добавляли дифференцированные клетки HL-60 (фагоциты) и сыворотку крови крольчат (от 3 до 4-недельного возраста, PEL-FREEZ®, Arkansas, конечная концентрация 12,5%) при приблизительном соотношении эффектора и мишени 200:1 и инкубировали при 37°С при встряхивании. Для остановки реакции во все лунки добавляли 80 мкл 0,9% раствора NaCl, перемешивали, и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки планшетов с фильтрами MULTISCREEN® HTS HV (MILLIPORE®), содержащие 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты в вакууме, и в каждую лунку добавляли 150 мкл питательной среды HYSOY® и профильтровывали. Затем планшеты с фильтрами инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи, а затем фиксировали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad Laboratories, Inc., г. Геркулес, штат Калифорния, США). Затем планшеты окрашивали Кумасси синим и обесцвечивали один раз. Колонии визуализировали и подсчитывали на анализаторе Cellular Technology Limited (CTL) (г. Шейкер-Хайтс, штат Огайо, США) IMMUNOSPOT®.

Статистический анализ: Рассчитывали двухсторонние корреляции Пирсона.

Результаты - ответы ОРА на 9V, 9А, 9L и 9N

Перекрестно-функциональный ответ на серотипы 9А, 9L и 9N в иммунных сыворотках взрослых, иммунизированных вакциной 13vPnC, оценивали в соответствующих анализах опсонофагоцитарной активности на микроколониях (mcOPA) параллельно с оценкой гомологичного функционального ответа на серотип 9V. Исследовали две случайным образом отобранные подгруппы иммунных сывороток от взрослых, вакцинированных 13vPnC. Образцы сыворотки крови были отобраны из клинических исследований США 6115А1-004 (N равно 59, после вакцинации) и 6115А1-3005 (N равно 66, соответствующие образцы до и после вакцинации) соответственно.

Участники исследования 6115А1-004 ранее не подвергались какой-либо пневмококковой вакцинации, и в рамках протокола исследования получили однократную дозу 13vPnC. В иммунных сыворотках исследования 6115А1-004 выявлены сходные процентные доли отвечающих на иммунизацию образцов сыворотки для всех серогрупп, которые составляли 98,3%, 98,3%, 100% и 93,2% для 9V, 9А, 9L и 9N соответственно (Фиг. 11), что подтверждает результаты исследования 6115А1-3005 (Фиг. 12). Относительно высокие корреляции титра ОРА наблюдали между серотипами 9V и 9А (коэффициент корреляции Пирсона ρ равен 0,5456, р меньше 0,0001) или 9L (ρ равен 0,7353, р меньше 0,0001), но не наблюдали для 9N (ρ равен 0,1217, р меньше 0,3627).

Субъекты в исследовании 6115А1-3005 ранее получили 1 дозу вакцины 23vPS по меньшей мере за 5 лет до включения для участия в исследовании, и в рамках протокола исследования получили однократную дозу 13vPnC. Гомологичный ответ в ОРА на серотип 9V и перекрестной реактивности антител к 9V на серотипы 9А, 9L и 9N оценивали на панели соответствующих образцов сыворотки крови до и после вакцинации (N равно 66) от взрослых, иммунизированных вакциной 13vPnC (исследование 6115А1-3005). Как видно на Фиг. 12, в анализе ОРА был выявлен относительно высокий иммунитет (процентная доля отвечающих) к 9V (84%), 9А (66%), 9L (82%) и 9N (86%), что, вероятно, связано с предшествующей иммунизацией вакциной 23vPS, которая включает в себя неконъюгированные полисахариды серотипов 9V и 9N. Однако процентная доля отвечающих возросла до 95% или более для всех четырех серотипов после вакцинации 13vPnC, которая содержит только конъюгат 9V из серогруппы 9. Кратность повышения значений титров представлена в таблице 23, и ее значения были сходными между серотипами, что также позволяет предположить перекрестную реактивность.

Более полный анализ распределения титра ОРА представлен обратными кумулятивными кривыми нормального распределения (RCDC) на Фиг. 13-16. На RCDC показано повышение серотип-специфичного иммунного ответа после вакцинации для серотипов 9V, 9А, 9L и в меньшей степени 9N. Анализ корреляции кратности повышения титров отдельных соответствующих образцов сыворотки крови между 9V/9A, 9V/9L и 9V/9N также проводили с использованием корреляции Пирсона. Относительно высокие корреляции кратности повышения титров наблюдали между серотипами 9V и 9А (коэффициент корреляции Пирсона ρ равен 0,8720, р меньше 0,0001) или 9N (ρ равен 0,5801, р меньше 0,0001), но в меньшей степени для 9L (ρ равен 0,1804, р меньше 0,1640).

Вывод

На основании этих данных вакцина 13vPnC, вероятно, обеспечивает более широкий охват серотипов за счет обеспечения дополнительной защиты от серотипов 9А, 9L и 9N.

Пример 20. Перекрестно-функциональные ответы ОРА между серотипом 15В и серотипом 15С

Пневмококковая серогруппа 15 включает четыре структурно родственных серотипа: 15А, 15В, 15С и 15F. Серотипы 15В и 15С невозможно отличить друг от друга методиками генетического типирования, и они имеют аналогичный состав капсульных полисахаридов за исключением того, что 15B-PS представляет собой О-ацетилированный вариант 15C-PS. Чтобы понять, обладают ли антитела к капсульным полисахаридам серотипа 15В функциональной перекрестной реактивностью к серотипу 15С, 10 кроликов иммунизировали вакцинами 16vPnC (см. пример 15) и 20vPnC (см. пример 16), где обе вакцины содержат иммуногенный конъюгат, содержащий капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 15В, связанный с CRM₁₉₇, как раскрыто в настоящем документе в рамках их композиции. Сыворотки крови до и после вакцинации исследовали в анализах ОРА против целевых пневмококковых штаммов серотипов 15В и 15С.

Из 10 кроликов каждой группы 100% имели ответ ОРА на серотип 15В после иммунизации конъюгатом серотипа 15В. Из этих же образцов 100% также имели ответ ОРА на серотип 15С (таблица 24 и таблица 25). В образцах сыворотки крови до вакцинации наблюдали низкие титры ОРА в ОРА 15С. Тем не менее, более чем 10-кратное повышение GMT ОРА в образцах сыворотки крови после вакцинации по сравнению с образцами сыворотки крови до вакцинации показало, что иммуногенные конъюгаты по изобретению индуцируют образование антител, способных к уничтожению Streptococcus pneumoniae серотипа 15В и 15С в ОРА.

* Титр невозможно определить в связи с неудачными кривыми уничтожения

Пример 21. Приготовление 7-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины

Готовили 7-валентную конъюгатную композицию, содержащую гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F (7vPnC), которые были все по отдельности конъюгированы с CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F были получены, как описано выше.

Требуемые объемы нерасфасованных концентратов рассчитывали на основании объема партии и концентраций нерасфасованного сахарида. Приготовленную нерасфасованную вакцину получали путем добавления требуемого объема буфера NaCl/сукцинат (рН 5,8) до получения конечной целевой концентрации в буфере 5,0 мМ сукцината и 150 мМ NaCl. Добавляют полисорбат 80 до конечной концентрации 0,02% и 7 пневмококковых конъюгатов. Препарат фильтровали через PES мембрану Millipore 0,2 мкм с последующим добавлением AlPO₄. Композицию хорошо перемешивали для получения максимального связывания конъюгатов с алюминием.

Затем композицию заполняют в стеклянные шприцы для доставки объема дозы 0,5 мл.

Готовая дозированная форма состояла из 2,2 мкг каждого из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 8, 10А, 11А, 12F, 15В, 22F и 33F, индивидуально конъюгированных с CRM₁₉₇, 5,0 мМ сукцинатного буфера рН 5,8, 0,02% (масс./масс.) PS80, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл алюминия в виде AlPO₄ на дозу 0,5 мл.

Все публикации и заявки на патенты, упоминаемые в описании, являются показателем уровня знаний специалистов в области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки в такой же степени, как в случае конкретного указания каждой отдельной публикации или заявки на патент как включенной посредством ссылки.

Хотя изложенное выше изобретение для ясности его понимания описано в некоторых подробностях путем иллюстрации и примера, на практике могут быть выполнены некоторые изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Claims (24)

1. Набор для индуцирования иммунного ответа против S. pneumoniae, содержащий:

(а) первую иммуногенную композицию, содержащую гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 15B, где указанный гликоконъюгат серотипа 15B имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 15B к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 15B составляет от 0,5 до 3,0, и где указанный гликоконъюгат серотипа 15B содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 15B,

гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 22F, где указанный гликоконъюгат серотипа 22F имеет молекулярную массу от 1000 кДа до 12500 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 22F к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 22F составляет от 0,5 до 2, и где указанный гликоконъюгат серотипа 22F содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 22F,

гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 33F, где указанный гликоконъюгат серотипа 33F имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 33F к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 33F составляет от 0,2 до 4, и где указанный гликоконъюгат серотипа 33F содержит по меньшей мере 0,1 мМ ацетата на мМ капсульного полисахарида серотипа 33F,

гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 12F, где указанный гликоконъюгат серотипа 12F имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 12F к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 12F составляет от 0,2 до 4,

гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 10A, где указанный гликоконъюгат серотипа 10A имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 10A к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 10A составляет от 0,5 до 3,

гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 11A, где указанный гликоконъюгат серотипа 11A имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 11A к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 11A составляет от 0,2 до 4,

и гликоконъюгат S. pneumoniae серотипа 8, где указанный гликоконъюгат серотипа 8 имеет молекулярную массу от 50 кДа до 20000 кДа, отношение (масс./масс.) капсульного полисахарида серотипа 8 к белку-носителю в гликоконъюгате серотипа 8 составляет от 0,2 до 4, где указанная композиция представляет собой 7-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, и где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM197 (перекрестно-реагирующий материал 197); и

(б) вторую иммуногенную композицию, содержащую гликоконъюгаты Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, и где указанные гликоконъюгаты индивидуально конъюгированы с CRM197, для сопутствующего, параллельного или последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций, где гликоконъюгаты представляют собой капсульные полисахариды указанных серотипов, конъюгированные с CRM197.

2. Набор по п. 1, где указанная первая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант.

3. Набор по п. 1 или 2, где указанная вторая иммуногенная композиция представляет собой 13-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, где указанные 13 конъюгатов состоят из гликоконъюгатов S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F, индивидуально конъюгированных с CRM197.

4. Набор по любому из пп. 1-3, где указанная вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант.

5. Набор по любому из пп. 1-4 для применения в способе параллельного введения первой и второй иммуногенных композиций.

6. Набор по любому из пп. 1-4 для применения в способе сопутствующего введения первой и второй иммуногенных композиций.

7. Набор по любому из пп. 5, 6, где схема вакцинации с указанным параллельным или сопутствующим введением представляет собой схему многократных доз.

8. Набор по п. 7, где указанная схема многократных доз состоит из по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 доз) в первый год жизни, за которой следует по меньшей мере одна доза для ребенка, начинающего ходить.

9. Набор по любому из пп. 1-4 для применения в способе последовательного введения первой и второй иммуногенных композиций.

10. Набор по п. 9, где схема вакцинации с указанным последовательным введением состоит из серии из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз.

11. Набор по любому из пп. 9, 10, где схема вакцинации состоит из последовательного введения:

(а) первой иммуногенной композиции и

(б) параллельного или сопутствующего введения первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией.

12. Набор по любому из пп. 9, 10, где схема вакцинации состоит из последовательного введения:

(а) второй иммуногенной композиции и

(б) параллельного или сопутствующего введения первой иммуногенной композиции со второй иммуногенной композицией.

Images