RU2717022C1

RU2717022C1 - Strain of bacteriophage pseudomonas aeruginosa n 328 (500322), intended for preparation of mono- and polyvalent treatment-and-prophylactic preparations of bacteriophages

Info

Publication number: RU2717022C1
Application number: RU2019120324A
Authority: RU
Inventors: Наталья Николаевна Ворошилова; Ольга Александровна Полыгач
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-03-17

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Invention relates to a strain of bacteriophage Pseudomonas aeruginosa used in production of medical biological antibacterial drugs – preparations of bacteriophages intended for prevention and treatment of pyoinflammatory and enteral diseases caused by bacteria Pseudomonas aeruginosa. Strain has lytic activity against Pseudomonas aeruginosa pulp viruses. Strain is deposited in the State Collection of Pathogenic Microorganisms (GKPM) of the Federal State Budgetary Institution "Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products” of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI "SCEEMP" of the Russian Ministry of Health) under registration No. 328 (500322).

EFFECT: strain has a wide spectrum of antibacterial activity in relation to epidemiologically significant hospital and isolated from patients with various pathologies of clinical strains of pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa, 100 % resistant to one or more antibiotics, obtained with maximum extension of geography of isolation regions.

1 cl, 4 ex, 1 dwg

Description

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к штамму бактериофага Pseudomonas aeruginosa, используемого при производстве медицинских биологических антибактериальных лекарственных средств - препаратов бактериофагов, предназначенных для профилактики и лечения гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных бактериями Pseudomonas aeruginosa.The invention relates to medical virology and microbiology, in particular to a strain of the bacteriophage Pseudomonas aeruginosa used in the manufacture of medical biological antibacterial drugs - preparations of bacteriophages intended for the prevention and treatment of purulent-inflammatory and enteric diseases caused by bacteria Pseudomonas aeruginosa.

Бактерии синегнойной палочки (лат.Pseudomonas aeruginosa) (далее - P. aeruginosa) отличаются высокой как естественной, так и приобретенной резистентностью (50-100%) к большинству антибиотиков и обладают способностью поражать все органы и ткани макроорганизма больного [1, 2, 3]. Бактерии P. aeruginosa являются одним из основных возбудителей нозокомиальных пневмоний, инфекций дыхательных путей, легких и плевры и вызывают тяжелейшие заболевания в виде муковисцидоза - от 20% до 61% всех внутрибольничных инфекций [2, 4]; от 11% до 30% нагноений ожоговых ран [4]; более 30% всех гнойно-воспалительных гинекологических и урологических инфекционных заболеваний; являются причиной 20-25% гнойных хирургических инфекций и генерализованных септических заболеваний - сепсиса, летальность при которых составляет 18% - 61% [4, 5].Pseudomonas aeruginosa bacteria (Latin P. aeruginosa) (hereinafter P. aeruginosa) are characterized by high both natural and acquired resistance (50-100%) to most antibiotics and have the ability to infect all organs and tissues of the patient’s macroorganism [1, 2, 3 ]. Bacteria P. aeruginosa are one of the main causative agents of nosocomial pneumonia, infections of the respiratory tract, lungs and pleura and cause severe diseases in the form of cystic fibrosis - from 20% to 61% of all nosocomial infections [2, 4]; from 11% to 30% suppuration of burn wounds [4]; more than 30% of all purulent-inflammatory gynecological and urological infectious diseases; they are the cause of 20-25% of purulent surgical infections and generalized septic diseases - sepsis, with a mortality rate of 18% - 61% [4, 5].

На сегодняшний день в Российской Федерации известны моно- и поливалентные лечебно-профилактические препараты бактериофагов, содержащие штаммы бактериофагов P. aeruginosa: «Бактериофаг синегнойной палочки», «Пиобактериофаг поливалентный очищенный», «Интести-бактериофаг», которые наряду с антибиотиками применяются для лечения и профилактики синегнойных инфекций.Today, mono- and polyvalent therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages containing bacteriophage strains of P. aeruginosa are known: “Pseudomonas aeruginosa bacteriophage”, “Purified polyvalent pyobacteriophage”, “Intesti-bacteriophage”, which, along with antibiotics, are used to treat and prevention of pseudomonas infections.

В соответствии с российскими требованиями Общей фармакопейной статьи «Бактериофаги. ОФС.1.7.1.0002.15 [6] («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II»), введенной в действие Приказом Минздрава России от 29.10.2015 №771 с 01.01.2016 и международными требованиями, установленными Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 №89 «Об утверждении Правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза» [7], Директивой №2001/83/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О Кодексе Сообщества о лекарственных средствах для использования человеком» (Принята в г. Брюсселе 06.11.2001) [8] для гарантий клинической эффективности, широкого спектра антибактериальной активности и генетической безопасности их терапевтического применения лечебно-профилактические препараты бактериофагов P. aeruginosa должны иметь в своем составе бактериофаги биологически, морфологически и генетически охарактеризованные с широким спектром антибактериальной активности, принадлежащие к генетическим литическим группам, не содержащие гены лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, обладающих способностью передавать лекарственную устойчивость и токсигенность другим бактериям в организме больного.In accordance with the Russian requirements of the General Pharmacopoeia article “Bacteriophages. OFS.1.7.1.0002.15 [6] (“State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIII Edition. Volume II”), enforced by Order of the Ministry of Health of Russia dated 10.29.2015 No. 771 from 01.01.2016 and international requirements established by the Decision of the Council of the Eurasian Economic Commission of November 3, 2016 No. 89 “On the Approval of the Rules for the Research of Biological Medicines of the Eurasian Economic Union” [7], Directive No. 2001/83 / EU of the European Parliament and the Council of the European Union “On the Community Code on Medicines for Human Use” (P was adopted in Brussels on November 6, 2001) [8] to guarantee clinical efficacy, a wide range of antibacterial activity and genetic safety of their therapeutic use, the therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages of P. aeruginosa should include bacteriophages biologically, morphologically and genetically characterized with a wide spectrum antibacterial activity belonging to the genetic lytic groups that do not contain genes for drug resistance, lysogenicity and toxigenicity, with the ability to Strongly transmit toxigenicity drug resistance and other bacteria in the patient.

Недостатком известных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов Р. aeruginosa является отсутствие вышеперечисленных характеристик биологических свойств бактериофагов в составе препаратов по причине пассирования на бактериальных штаммах P. aeruginosa фагов, выделенных из образцов почвы, сточных вод, отделяемого ран.A disadvantage of the known therapeutic and prophylactic preparations of P. aeruginosa bacteriophages is the absence of the above characteristics of the biological properties of bacteriophages in the composition of the preparations due to the passage of phage isolated from soil samples, wastewater, and wounds on bacterial strains of P. aeruginosa.

Критерием активности отобранных «пассажных» фагов при этом является степень и стабильность их литической активности в тесте по Аппельману в отношении производственных штаммов бактерий P. aeruginosa.The criterion for the activity of the selected "passage" phages is the degree and stability of their lytic activity in the Appelman test in relation to production strains of P. aeruginosa bacteria.

Пассажи бактериофагов проводят постоянно для поддержания необходимой активности и возможности их дальнейшего использования в качестве рабочего посевного материала при получении маточных фагов и получении собственно препаратов бактериофагов.Passages of bacteriophages are carried out constantly to maintain the necessary activity and the possibility of their further use as a working seed when receiving uterine phages and receiving bacteriophage preparations themselves.

Отдельные штаммы бактериофагов P. aeruginosa не выделяются и не изучаются, а постоянное пассирование бактериофагов на бактериальных клетках достаточно часто, из-за неконтролируемых рекомбинаций бактериофагов при их совместном размножении, приводит к «вырождению» пассажей и потере ими литической активности.Separate strains of bacteriophages of P. aeruginosa are not isolated and are not studied, and the constant passage of bacteriophages on bacterial cells often enough, due to uncontrolled recombination of bacteriophages when they multiply together, leads to the “degeneration” of passages and their loss of lytic activity.

Указанный способ создания антибактериальной основы препаратов бактериофагов на практике приводит к попаданию в состав «пассажных фагов» и в состав препаратов умеренных фагов и литических фагов, содержащих гены лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, которые обладают способностью передавать лекарственную устойчивость и токсигенность другим бактериям в организме больного.The indicated method of creating an antibacterial basis for bacteriophage preparations in practice leads to the inclusion of “passive phages” and to the preparations of moderate phages and lytic phages containing genes for drug resistance, lysogenicity and toxigenicity, which have the ability to transmit drug resistance and toxigenicity to other bacteria in the patient’s body .

Задача, решаемая изобретением, состоит в получении штамма литического бактериофага P. aeruginosa, не содержащего гены лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, обладающего широким спектром антибактериальной активности в отношении эпидемиологически значимых выделенных от больных клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa.The problem solved by the invention is to obtain a strain of lytic bacteriophage P. aeruginosa that does not contain genes for drug resistance, lysogenicity and toxigenicity, which has a wide spectrum of antibacterial activity against epidemiologically significant clinical and hospital strains of bacteria P. aeruginosa isolated from patients.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является селекция высокоактивного штамма бактериофага P. aeruginosa, предназначенного для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов P. aeruginosa, относящегося к генетической литической группе (роду), не содержащего гены лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, обладающего широким спектром антибактериальной активности в отношении эпидемиологически значимых выделенных от больных клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa и отвечающего российским и международным требованиям, предъявляемым к бактериофагам в составе лечебно-профилактических препаратов.The technical result of the invention is the selection of a highly active strain of the bacteriophage P. aeruginosa, intended for the preparation of mono- and polyvalent therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages P. aeruginosa, belonging to the genetic lytic group (genus), which does not contain genes for drug resistance, lysogenicity and toxigenicity, which has a wide spectrum of antibacterial activity against epidemiologically significant clinical and hospital strains of bacteria P. aeruginosa isolated from patients and meets Russian and international requirements for bacteriophages as part of therapeutic and prophylactic drugs.

Выделенный штамм бактериофага P. aeruginosa депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) под регистрационным номером №328 (500322) и обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении лекарственно-устойчивых клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa, относящийся по морфологии вирионов и генетическим свойствам к литическим бактериофагам порядка Caudovirales, семейства Myoviridae, рода Phikzlikevirus, не содержащий гены лизогении, токсигенности и лекарственной устойчивости.The isolated strain of bacteriophage P. aeruginosa was deposited in the State collection of pathogenic microorganisms (GKPM) of the Federal State Budgetary Institution “Scientific Center for Expertise of Medical Drugs” of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI “NTsESMP” of the Ministry of Health of Russia) under registration number 328 (500322) and has a wide spectrum of antibacterial activity against drug-resistant clinical and hospital strains of bacteria P. aeruginosa, related by virion morphology and gene the chemical properties of lytic bacteriophages of the order Caudovirales, family Myoviridae, genus Phikzlikevirus, which do not contain genes for lysogenesis, toxigenicity, and drug resistance.

Область применения штамма бактериофага №328 (500322) - производство лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, предназначенных для лечения гнойно-септических и энтеральных заболеваний, вызванных бактериями P. aeruginosa,: «Пиобактериофага поливалентного очищенного», «Интести-бактериофага», «Бактериофага синегнойной палочки».The scope of the bacteriophage strain No. 328 (500322) is the production of therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages intended for the treatment of purulent-septic and enteric diseases caused by P. aeruginosa bacteria: “Polyvalent purified pyobacteriophage”, “Intesti-bacteriophage”, “Pseudomonas aeruginosa bacteriophage” ".

Известен Патент RU 2455355, 2011 г. [9], в котором предлагается использовать штамм бактериофага P. aeruginosa ph57, выделенный из экскрементов животных вивария, в качестве основы ветеринарного антисептического средства для лечения гнойно-септических заболеваний животных, вызванных бактериями P. aeruginosa.Patent RU 2455355, 2011 [9] is known, in which it is proposed to use a bacteriophage strain P. aeruginosa ph57 isolated from animal feces of vivarium as the basis of a veterinary antiseptic for the treatment of purulent-septic diseases of animals caused by P. aeruginosa bacteria.

Недостатками изобретения являются:The disadvantages of the invention are:

- отсутствие генетических характеристик предлагаемого бактериофага ph57, определен только тип его нуклеиновой кислоты - ДНК;- the lack of genetic characteristics of the proposed bacteriophage ph57, only the type of its nucleic acid is determined - DNA;

- не определена его принадлежность к умеренным или литическим генетическим родам бактериофагов;- its membership in the moderate or lytic genetic genera of bacteriophages has not been determined;

- не установлено наличие или отсутствие генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, что не гарантирует генетическую безопасность его клинического применения даже в ветеринарии и противоречит российским и международным требованиям [7, 8, 9].- the presence or absence of genes for drug resistance, toxigenicity and lysogenicity has not been established, which does not guarantee the genetic safety of its clinical use even in veterinary medicine and contradicts Russian and international requirements [7, 8, 9].

- отсутствуют данные о широте спектра антибактериальной активности предлагаемого штамма бактериофага в отношении эпидемиологически значимых госпитальных и клинических - выделенных от больных с различной патологией штаммов бактерий P. aeruginosa, поскольку метод определения активности не описан, а спектр антибактериальной активности штамма фага - 100%, определенный на 78 штаммах, заявленный в патенте, не подтвержден данными примеров, которые показывают, что оценка спектра активности проведена авторами не на 78, а только на 10 штаммах бактерий P. aeruginosa.- there is no data on the breadth of the spectrum of antibacterial activity of the proposed bacteriophage strain in relation to epidemiologically significant hospital and clinical - isolated from patients with different pathologies of P. aeruginosa bacterial strains, since the method for determining the activity is not described, and the spectrum of antibacterial activity of the phage strain is 100%, determined on 78 strains claimed in the patent are not confirmed by the data of examples, which show that the activity spectrum was evaluated by the authors not on 78, but only on 10 strains of P. aerug bacteria inosa.

Известен патент WO 2015059298, 2015 г. [10], предлагающий 13 штаммов бактериофагов P. aeruginosa, для использования в качестве активных агентов фармацевтических или ветеринарных препаратов в различных композициях в количестве от 2 до 13 бактериофагов.Known patent WO 2015059298, 2015 [10], offering 13 strains of bacteriophages of P. aeruginosa, for use as active agents of pharmaceutical or veterinary preparations in various compositions in an amount of from 2 to 13 bacteriophages.

- отсутствие убедительных данных, подтверждающих (90%) широту спектра антибактериальной активности предлагаемых 13 штаммов бактериофагов Pseudomonas aeruginosa и их сочетаний (композиций), поскольку при изучении их спектра и степени антибактериальной активности не использованы эпидемиологически значимые госпитальные и клинические выделенных от больных с различной патологией штаммы бактерий P. aeruginosa, а использованы всего 20 коллекционных эталонных лабораторных штаммов бактерий P. aeruginosa из международной коллекции LMG (ВССМ LMG / бактерий Collection);- the lack of convincing data confirming (90%) the wide spectrum of antibacterial activity of the proposed 13 strains of bacteriophages Pseudomonas aeruginosa and their combinations (compositions), since epidemiologically significant hospital and clinical strains isolated from patients with various pathologies were not used to study their spectrum and degree of antibacterial activity P. aeruginosa bacteria, and only 20 collection reference laboratory strains of P. aeruginosa bacteria from the international LMG collection (BCCM LMG / bacteria Collection) were used;

- отсутствие сведений о литической природе предлагаемых 13 фагов - не установлено наличие или отсутствие у них генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, что не гарантирует генетическую безопасность их клинического применения и противоречит российским и международным требованиям [6,7,8].- lack of information about the lytic nature of the proposed 13 phages - the presence or absence of drug resistance, toxigenicity and lysogenicity genes was not established, which does not guarantee the genetic safety of their clinical use and contradicts Russian and international requirements [6,7,8].

Известен патент ЕР 2248890, 2010 г. [11], предлагающий использование 6 штаммов бактериофагов P. aeruginosa семейства Myoviridae литических родов РАК и СНА, для создания композиций фагов, предназначенных для профилактики или лечения муковисцидоза - легочных инфекционных заболеваний у млекопитающих и человека, вызванных бактериями P. aeruginosa штаммами РАК и СНА.Known patent EP 2248890, 2010 [11], proposing the use of 6 strains of bacteriophages P. aeruginosa family Myoviridae of the lytic genera RAC and CHA, to create phage compositions intended for the prevention or treatment of cystic fibrosis - pulmonary infections in mammals and humans caused by bacteria P. aeruginosa strains of CANCER and CHA.

- отсутствие сведений о наличии у запатентованных штаммов бактериофагов генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, достаточно узкий спектр (всего 30-40%) антибактериальной активности предлагаемых бактериофагов и их комбинаций и активность только в отношении штаммов бактерий P. aeruginosa РАК и СНА, вызывающих муковисцидоз;- lack of information on the presence of drug resistance, toxigenicity and lysogenicity genes in patented strains of bacteriophages, a fairly narrow spectrum (only 30-40%) of the antibacterial activity of the proposed bacteriophages and their combinations, and activity only against bacterial strains of P. aeruginosa PAA and CHA, causing cystic fibrosis ;

- отсутствие данных о широте спектра антибактериальной активности в отношении эпидемиологически значимых госпитальных и клиническиих выделенных от больных с различной патологией штаммов бактерий P. aeruginosa, а также малое количество тестированных штаммов бактерий P. aeruginosa при определении широты спектра антибактериальной активности (всего 40 штаммов бактерий P. aeruginosa РАК и СНА) и отсутствие данных о спектре антибактериальной активности предлагаемых бактериофагов в отношении представителей других генетических видов бактерий P. aeruginosa.- lack of data on the breadth of the spectrum of antibacterial activity in relation to epidemiologically significant hospital and clinical strains of bacteria P. aeruginosa isolated from patients with different pathologies, as well as the small number of tested bacterial strains of P. aeruginosa when determining the breadth of the spectrum of antibacterial activity (total 40 strains of bacteria P. aeruginosa CANCER and CHA) and the lack of data on the spectrum of antibacterial activity of the proposed bacteriophages in relation to representatives of other genetic species of bacteria P. aeruginosa.

Известен патент PL 007472, 2006 г. [12], в котором предложены 20 штаммов бактериофагов P. aeruginosa, активных в отношении лекарственно-устойчивых бактериальных штаммов гомологичных видов, и предназначенных для лечения муковисцидоза.Known patent PL 007472, 2006 [12], in which 20 strains of bacteriophages of P. aeruginosa are proposed that are active against drug-resistant bacterial strains of homologous species and are intended for the treatment of cystic fibrosis.

- недостаточная генетическая характеристика генома запатентованных фагов -определена только принадлежность к семейству, не установлена принадлежность к генетическому роду, не охарактеризована принадлежности к литическим или умеренным фагам;- insufficient genetic characteristics of the genome of the patented phages — only family membership has been determined, genetic status has not been established, membership in lytic or moderate phages has not been characterized;

- отсутствие сведений о наличии у запатентованных штаммов бактериофагов генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, и достаточно узкий спектр антибактериальной активности большинства штаммов в отношении бактерий гомологичного вида - лишь 2 штамма фагов P. aeruginosa были активны в отношении 43% и 64% бактерий P. aeruginosa.- the lack of information about the presence of drug resistance, toxigenicity and lysogenicity genes in patented bacteriophage strains and a fairly narrow spectrum of antibacterial activity of most strains against bacteria of a homologous species - only 2 phage strains of P. aeruginosa were active against 43% and 64% P. aeruginosa.

Известен патент RU 2186574, 2001 г. [13], в котором предложен препарат бактериофагов Combiphage, предназначенный для лечения инфекций, вызванных бактериями P. aeruginosa, представляющий собой суспензию в пептонной воде смеси 4 штаммов бактериофагов P. aeruginosa (№№05, 03, 06 и 07), дополнительно содержащий компоненты питательной среды и вспомогательные добавки.Known patent RU 2186574, 2001 [13], which proposed the preparation of bacteriophages Combiphage, intended for the treatment of infections caused by bacteria P. aeruginosa, which is a suspension in peptone water of a mixture of 4 strains of bacteriophages P. aeruginosa (No. 05, 03, 06 and 07), optionally containing components of a nutrient medium and auxiliary additives.

- отсутствие генетических характеристик предлагаемых штаммов бактериофагов Р. aeruginosa (№№05, 03, 06 и 07), определяющих их принадлежность к умеренным или литическим генетическим видам бактериофагов, принадлежность к семейству, роду, группе;- the lack of genetic characteristics of the proposed strains of bacteriophages of P. aeruginosa (No. 05, 03, 06 and 07), determining their affiliation with moderate or lytic genetic species of bacteriophages, belonging to the family, genus, group;

- отсутствие сведений о наличие у запатентованных штаммов бактериофагов генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, что приводит к отсутствию гарантий генетической безопасности клинического применения препарата Combiphage.- the lack of information about the presence of drug resistance, toxigenicity and lysogenicity genes in patented bacteriophage strains, which leads to the lack of guarantees of the genetic safety of the clinical use of Combiphage.

Известен патент RU 2112800, 1996 г. [15], в котором предлагается использовать пилеспецифичный бактериофаг P. aeruginosa - фаг №03, обладающий антибактериальной активностью в отношении пилесодержащих клинических штаммов бактерий P. aeruginosa, для включения его в состав лечебного препарата для лечения синегнойных инфекций. Между тем пили (фимбрии) бактерий P. aeruginosa являются одним, но не единственным, из факторов патогенности клинических штаммов бактерий P. aeruginosa.Known patent RU 2112800, 1996 [15], in which it is proposed to use a saw-specific bacteriophage of P. aeruginosa - phage No. 03, which has antibacterial activity against saw-bearing clinical bacterial strains of P. aeruginosa, for inclusion in the composition of a medicinal product for the treatment of Pseudomonas infections . Meanwhile, they drank (fimbriae) bacteria P. aeruginosa are one, but not the only one of the pathogenicity factors of clinical bacteria strains of P. aeruginosa.

При этом авторами показано, что у большинства фагорезистентных форм Р. aeruginosa пили отсутствуют, предлагаемый фаг №03 был не активен в отношении бактерии P. aeruginosa, не содержащих пили, к которым по данным авторов относится большинство фагорезистентных форм P. aeruginosa.Moreover, the authors showed that in most phage-resistant forms of P. aeruginosa they did not drink, the proposed phage No. 03 was inactive against P. aeruginosa bacteria that did not contain pili, which, according to the authors, refers to the majority of phage-resistant forms of P. aeruginosa.

- отсутствие обязательных полных генетических характеристик предлагаемого бактериофага P. aeruginosa №03;- the lack of mandatory complete genetic characteristics of the proposed bacteriophage P. aeruginosa No. 03;

Установлено, что в тестах с Митомицином-С, фаг P. aeruginosa №03 не лизогенизирует клетки бактерий P. aeruginosa, на основании чего сделан вывод о том, что это вирулентный (литический) фаг;It was established that in tests with Mitomycin-C, phage P. aeruginosa No. 03 does not lyse the bacteria cells of P. aeruginosa, based on which it was concluded that this is a virulent (lytic) phage;

- не определена принадлежность фага P. aeruginosa №03 к определенному генетическому порядку, семейству и роду, отсутствуют данные о наличии или отсутствии у фага генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, что не гарантирует генетическую безопасность его клинического применения и противоречит российским и международным требованиям [6, 7, 8].- the phage of P. aeruginosa No. 03 does not determine the specific genetic order, family, and genus; there is no evidence of the presence or absence of drug resistance, toxigenicity, and lysogenicity in the phage, which does not guarantee the genetic safety of its clinical use and is contrary to Russian and international requirements [ 6, 7, 8].

Известен патент RU 2113476, 1996 г. [15], в котором предлагается штамм бактериофага P. aeruginosa №02, для включения в состав поливалентного лечебного препарата, предназначенного для лечения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями P. aeruginosa.Known patent RU 2113476, 1996 [15], in which a bacteriophage strain P. aeruginosa No. 02 is proposed for inclusion in the composition of a multivalent therapeutic drug intended for the treatment of infectious diseases caused by bacteria P. aeruginosa.

- отсутствие обязательных полных генетических характеристик предлагаемого штамма бактериофага P. aeruginosa №02, указан только тип нуклеиновой кислоты - ДНК;- the lack of mandatory complete genetic characteristics of the proposed strain of bacteriophage P. aeruginosa No. 02, only the type of nucleic acid is indicated - DNA;

- отсутствие сведений о литической природе штамма фага №02, не определена его принадлежность к умеренным или литическим бактериофагам, принадлежность к порядку, семейству, роду, не установлено наличие или отсутствие у штамма фага Р. aeruginosa №02 генов лекарственной устойчивости, токсигенности и лизогенности, что не гарантирует генетическую безопасность клинического применения штамма и противоречит российским и международным требованиям [6, 7, 8].- the lack of information about the lytic nature of the phage strain No. 02, its membership in moderate or lytic bacteriophages, its belonging to the order, family, and genus has not been determined; the presence or absence of drug resistance, toxigenicity, and lysogenicity genes in the phage strain P. aeruginosa No. 02 has not been established, which does not guarantee the genetic safety of the clinical use of the strain and is contrary to Russian and international requirements [6, 7, 8].

Известен патент №2366437, 2007 г. [16], в котором для обеспечения стабильной вирулентности бактериофагов в композиции и их адаптации к циркулирующим возбудителям инфекций за счет получения бактериофагов путем последовательных многократных пассажей фагов препаратов бактериофагов через тест-штаммы и свежевыделенные изоляты нелизогенных бактерий с добавлением в питательную среду индуцирующего агента, например, митомицина С.Known patent No. 2366437, 2007 [16], in which, to ensure stable virulence of bacteriophages in the composition and their adaptation to circulating pathogens of infections by obtaining bacteriophages by successive repeated passages of phage preparations of bacteriophages through test strains and freshly isolated isolates of non-isogenic bacteria with the addition of into the culture medium of an inducing agent, for example, mitomycin C.

- использование для получения поливалентного препарата бактериофагов «пассажных» фагов - смесей фагов P. aeruginosa, а не отдельных штаммов бактериофагов P. aeruginosa с изученными биологическими и генетическими свойствами;- the use of "passive" phages - mixtures of phages of P. aeruginosa, rather than individual strains of bacteriophages of P. aeruginosa with the studied biological and genetic properties, to obtain a multivalent bacteriophage preparation;

- отсутствие гарантий получения стабильной индуцированной вирулентности у умеренных бактериофагов при использовании мутагена Митомицина С и гарантий, что препарат не будет содержать умеренных фагов. В патенте не содержится сведений о наличии в «пассажных» фагах, обработанных митомицином С, литических фагов, не имеющих нежелательные гены лекарственной устойчивости, токсигенности, лизогенности;- the absence of guarantees to obtain stable induced virulence in moderate bacteriophages when using the mutagen Mitomycin C and guarantees that the drug will not contain moderate phages. The patent does not contain information about the presence in the "passive" phages treated with mitomycin C of lytic phages that do not have undesirable genes for drug resistance, toxigenicity, and lysogenicity;

- отсутствие полной информации о биологических свойствах бактериофагов в составе препарата - морфологии фаговых вирионов, их принадлежности к порядку, семейству, роду, нет информации о нуклеотидной последовательности ДНК фагов в составе препарата с убедительным доказательством отсутствия у них нежелательных генов лекарственной устойчивости, токсигенности, лизогенности, что противоречит российским и международным требованиям и не обеспечивает генетическую безопасность терапевтического использования препарата бактериофагов.- lack of complete information about the biological properties of bacteriophages in the composition of the drug - the morphology of phage virions, their belonging to the order, family, genus, there is no information on the nucleotide sequence of DNA phages in the composition of the drug with convincing evidence of the absence of undesirable genes for drug resistance, toxigenicity, lysogenicity, which contradicts Russian and international requirements and does not ensure the genetic safety of the therapeutic use of the bacteriophage preparation.

Проведенный анализ изобретений свидетельствует о том, что ни один из приведенных аналогов не может быть выбран в качестве прототипа. При этом большинство аналогов не содержат информации, доказывающей широкий спектр антибактериальной активности запатентованных бактериофагов в отношении эпидемиологически значимых госпитальных и выделенных от больных клинических штаммов бактерий P. aeruginosa.The analysis of the inventions indicates that none of the analogues can be selected as a prototype. However, most analogues do not contain information proving a wide range of antibacterial activity of patented bacteriophages in relation to epidemiologically significant hospital and clinical strains of bacteria P. aeruginosa isolated from patients.

Приведенные аналоги не содержат предусмотренных российскими и международными требованиями полных сведений о генетических свойствах запатентованных бактериофагов; принадлежности к умеренным или литическим группам фагов; принадлежности к определенному генетическому порядку, семейству, роду; наличии или отсутствии у запатентованных фагов генов лекарственной устойчивости, лизогенности и токсигенности, в связи с чем их присутствие в лечебно-профилактических препаратах бактериофагов не обеспечивает эффективность и генетическую безопасность терапевтического использования препаратов.The above analogues do not contain the full information on the genetic properties of the patented bacteriophages provided for by Russian and international requirements; belonging to moderate or lytic phage groups; belonging to a specific genetic order, family, genus; the presence or absence of drug resistance, lysogenicity and toxigenicity genes in patented phages, and therefore their presence in bacteriophage therapeutic and prophylactic preparations does not ensure the effectiveness and genetic safety of the therapeutic use of drugs.

В отличие от большинства аналогов у штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322), предлагаемого для включения в состав моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов, существенными отличительными признаками являются:Unlike most analogues of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322), proposed for inclusion in the composition of mono- and polyvalent therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages, the essential distinguishing features are:

1. наличие характеристик биологических свойств - литический характер взаимодействия с бактериальными клетками, высокая степень (91%) и скорости адсорбции (7-10 мин), длительность латентного периода (30 мин), урожайность (10 фаговых вирионов/бакт.кл), морфологии негативных колоний;1. the presence of characteristics of biological properties - the lytic nature of the interaction with bacterial cells, a high degree (91%) and adsorption rates (7-10 min), latency (30 min), yield (10 phage virions / bact.cl), morphology negative colonies;

2. наличие характеристик морфологии бактериофаговых вирионов штамма фага №328 (500322), полученных путем электронной микроскопии;2. the presence of morphology characteristics of bacteriophage virions of the phage strain No. 328 (500322) obtained by electron microscopy;

3. наличие характеристик генетических свойств ДНК штамма фага №328 (500322), полученных путем высокопроизводительного полногеномного секвенирования его ДНК с последующим биоинформационным анализом, при котором установлена принадлежность штамма фага к литическим бактериофагам порядка Caudovirales, семейства Myoviridae, рода Phikzlikevirus и установлено отсутствие у штамма фага №328 (500322) генов лизогении, токсигенности и лекарственной устойчивости;3. the presence of characteristics of the genetic properties of the DNA of phage strain No. 328 (500322) obtained by high-throughput genome-wide sequencing of its DNA followed by bioinformation analysis, in which the phage strain belongs to lytic bacteriophages of the order Caudovirales, Myoviridae family, Phikzlikevirus genus and the phage strain is absent No. 328 (500322) of the genes for lysogenesis, toxigenicity and drug resistance;

4. наличие данных, полученные указанным в Государственной фармакопее РФ ГФXIII методом Аппельмана [6] о широком спектре антибактериальной активности штамма фага №328 (500322) (58,79%) в отношении 917 эпидемиологически значимых госпитальных и выделенных от больных клинических штаммов патогенных бактерий P. aeruginosa в 100% резистентных к одному или более антибиотикам, полученных из санитарно-эпидемиологических служб и стационаров с максимальным расширением географии регионов выделения - из 30 территориально удаленных регионов России и стран СНГ.4. the availability of data obtained by the Appelman method [6] indicated in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation GFXIII [6] on a wide spectrum of antibacterial activity of phage strain No. 328 (500322) (58.79%) in relation to 917 epidemiologically significant hospital strains of pathogenic bacteria P isolated from patients aeruginosa in 100% resistant to one or more antibiotics obtained from sanitary-epidemiological services and hospitals with the maximum expansion of the geography of the regions of separation - from 30 geographically remote regions of Russia and the CIS countries.

Предлагаемая совокупность существенных признаков изобретения является новой, а влияние отличительных от аналогов существенных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня техники.The proposed combination of essential features of the invention is new, and the effect of significant features distinctive from analogues on the achievement of a technical result does not follow from the prior art.

Для приготовления поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов предлагается штамм бактериофага P. aeruginosa, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) под регистрационным номером №328 (500322), всесторонне биологически, морфологически и генетически изученный, относящийся к литическим бактериофагам порядка Caudovirales, семейства Myoviridae, рода Phikzlikevirus, не содержащий гены лизогении, токсигенности и лекарственной устойчивости, обладающий широким спектром антибактериальной активности (58,79%) в отношении 917 эпидемиологически значимых госпитальных и выделенных от больных с различной патологией клинических штаммов патогенных бактерий P. aeruginosa в 100% резистентных к одному или более антибиотикам, полученных с максимальным расширением географии регионов выделения из санитарно-эпидемиологических служб и стационаров 30 территориально удаленных регионов России и стран СНГ.For the preparation of multivalent therapeutic and prophylactic preparations of bacteriophages, a bacteriophage strain P. aeruginosa is proposed, deposited in the State collection of pathogenic microorganisms (GKPM) of the Federal State Budgetary Institution Scientific Center for Expert Advice of Medical Applications of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI "NTsESMP" of the Ministry of Health of Russia) under registration No. 328 (500322), comprehensively biologically, morphologically and genetically studied, related to lytic bacterium Ofagam of order Caudovirales, family Myoviridae, genus Phikzlikevirus, which does not contain genes for lysogenesis, toxigenicity and drug resistance, has a wide spectrum of antibacterial activity (58.79%) in relation to 917 epidemiologically significant hospital and isolated from patients with various pathologies of clinical strains of pathogenic bacteria P. aeruginosa in 100% resistant to one or more antibiotics obtained with the maximum expansion of the geography of the regions of separation from sanitary-epidemiological services and hospitals 30 geographically remote Russia's regions and CIS countries.

Штамм бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) обеспечивает присутствие в лечебно-профилактических препаратах бактериофагов биологически, морфологически и генетически изученного литического бактериофага, а также обеспечивает широкий спектр и стабильность антибактериальной активности лечебно-профилактического препарата на его основе в отношении лекарственно устойчивых клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa, безвредность, эффективность, и генетическую безопасность его терапевтического применения.The strain of bacteriophage P. aeruginosa No. 328 (500322) ensures the presence of biologically, morphologically and genetically studied lytic bacteriophage in the treatment and prophylactic preparations of bacteriophages, and also provides a wide range and stability of the antibacterial activity of the treatment and prophylactic drug based on it in relation to drug-resistant clinical and hospital bacterial strains of P. aeruginosa, safety, efficacy, and genetic safety of its therapeutic use.

Штамм бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) характеризуется следующими свойствами.The bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) is characterized by the following properties.

1. Штамм бактериофага P. aeruginosa депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) под регистрационным номером №328 (500322).1. The strain of the bacteriophage P. aeruginosa was deposited in the State collection of pathogenic microorganisms (GKPM) of the Federal State Budgetary Institution “Scientific Center for Expertise of Medical Drugs” of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI “NTsESMP” of the Ministry of Health of Russia) under registration number 328 (500322).

Авторское обозначение штамма, с которым штамм бактериофага P. aeruginosa поступил на депонирование - бактериофаг P. aeruginosa PaUfa№P15.The author's designation of the strain with which the bacteriophage strain P. aeruginosa was deposited is the bacteriophage P. aeruginosa PaUfa№P15.

Дата депонирования в ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России - 01.11.2018.The date of deposit with the State Public Institution of Healthcare Federal State Institution “National Center for Healthcare and Social Development” of the Ministry of Health of the Russian Federation is 01.11.2018.

Место нахождения ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России: 127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2.Location GKPM FSBI "NTsESMP" Ministry of Health of Russia: 127051, Moscow, Petrovsky Boulevard, d. 8, p. 2.

Штамм бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) найден в 2016 году в естественных условиях в озерной воде г. Владивосток, изучен и охарактеризован депозитором в филиале АО «НПО «Микроген» в г. Уфа «Иммунопрепарат».The strain of bacteriophage P. aeruginosa No. 328 (500322) was found in vivo in 2016 in the lake water of the city of Vladivostok, studied and characterized by the depositor in the branch of NPO Microgen in Ufa Immunopreparat.

Тест-штамм бактерии P. aeruginosa, который используют для размножения штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322), выделен из клинического материала и депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) под номером №321 (500315).The test strain of the bacterium P. aeruginosa, which is used to propagate the strain of the bacteriophage P. aeruginosa No. 328 (500322), is isolated from clinical material and deposited in the State collection of pathogenic microorganisms (GKPM) of the Federal State Budgetary Institution “Scientific Center for Expertise of Medical Devices” of the Ministry Healthcare of the Russian Federation (FSBI "NTsESMP" of the Ministry of Health of Russia) under the number No. 321 (500315).

Тест-штамм бактерии P. aeruginosa №321 (500315) выделен от больного из клинического материала в 2009 году, типичен по своим культуральным, морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам, изучен и охарактеризован депозитором в филиале АО «НПО «Микроген» в г. Уфа «Иммунопрепарат».The test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315) was isolated from the patient from clinical material in 2009, is typical for its cultural, morphological, tinctorial and biochemical properties, studied and characterized by the depositor in the branch of NPO Microgen JSC in Ufa "Immunotherapy."

Авторское обозначение тест-штамма, поступившего на депонирование - штамм бактерии P. aeruginosa №376.The author's designation of the test strain received for deposit is the bacterial strain P. aeruginosa No. 376.

Место нахождения ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России: 127051, Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2.Location GKPM FSBI "NTsESMP" Ministry of Health of Russia: 127051, Moscow, Petrovsky Boulevard, d. 8, p. 2.

2. Способ выделения штамма бактериофага №328 (500322).2. The method of isolation of the bacteriophage strain No. 328 (500322).

Штамм фага выделен методом клонирования уколом из негативной колонии, полученной по рассеве пробы озерной воды и тест-штамма бактерии P. aeruginosa №321 (500315) двухслойным методом Грациа на 0,7% - 1,5% агаровой среде [17].The phage strain was isolated by cloning by injection from a negative colony obtained by screening a sample of lake water and a test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315) using the two-layer Grazia method on 0.7% –1.5% agar medium [17].

3. Условия размножения штамма бактериофага №328 (500322).3. The conditions for the propagation of the strain of bacteriophage No. 328 (500322).

Для размножения штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) используют 18-24 часовую бульонную культуру тест-штамма бактерии P. aeruginosa №321 (500315), жидкие (бульоны) и агаровые (0,7%, 1,5%) питательные среды на основе панкреатических мясных или казеиновых гидролизатов или мясо-пептонного бульона, рН 7,0-7,7.For propagation of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322), an 18-24 hour broth culture of the test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315), liquid (broths) and agar (0.7%, 1.5%) nutrients are used media based on pancreatic meat or casein hydrolysates or meat-peptone broth, pH 7.0-7.7.

Штамм бактерии P. aeruginosa №321 (500315) и штамм бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) одномоментно вносят в стерильный бульон в соотношении (фаг/бактерия) 1/10, инкубирование проводят при температуре 37°С в течение 18-24 часов в условиях периодического статического культивирования. Об окончании процесса культивирования штамма фага свидетельствует визуальное просветление культуральной жидкости (фаголизата).The bacterial strain P. aeruginosa No. 321 (500315) and the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) are simultaneously introduced into the sterile broth in the ratio (phage / bacterium) 1/10, incubation is carried out at a temperature of 37 ° C for 18-24 hours in conditions of periodic static cultivation. The end of the cultivation process of the phage strain is indicated by visual clarification of the culture fluid (phagolysate).

Штамм бактериофага №328 (500322) не чувствителен к хлороформу, поэтому фаголизат, содержащий штамм фага, консервируют добавлением хлороформа в конечной концентрации от объема - 5-10%. Концентрация фагов в фаголизате после окончания культивирования определяется методом Грациа [17] и составляет (0,5-5,0)×10⁹ фаговых вирионов в 1 мл.The bacteriophage strain No. 328 (500322) is not sensitive to chloroform, therefore, the phagolysate containing the phage strain is preserved by adding chloroform in a final concentration of 5-10% by volume. The concentration of phages in the phagolysate after cultivation is determined by the Grazia method [17] and amounts to (0.5–5.0) × 10 ⁹ phage virions in 1 ml.

4. Хранение штамма бактериофага №328 (500322).4. Storage of bacteriophage strain No. 328 (500322).

Штамм бактериофага устойчив к хлороформу, сохраняет антибактериальную литическую активность в течение 5 лет при хранении в виде фаголизата в мясо-пептонном бульоне (МПБ), содержащего 5-10% хлороформа, при температуре от +2°С до +8°С.The bacteriophage strain is resistant to chloroform, retains antibacterial lytic activity for 5 years when stored as a phagolysate in meat-peptone broth (MPB) containing 5-10% chloroform, at a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C.

При хранении лиофильно высушенного штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) в сахарозо-желатиновой среде при температуре от +2°С до +8°С штамм бактериофага сохраняет антибактериальную литическую активность в течение 15 лет.When storing the lyophilized dried bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) in a sucrose-gelatin medium at a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C, the bacteriophage strain retains antibacterial lytic activity for 15 years.

5. Морфология негативных колоний штамма бактериофага №328 (500322).5. Morphology of the negative colonies of the bacteriophage strain No. 328 (500322).

При высеве штамма фага двухслойным методом Грациа на газоне тест-штамма бактерии P. aeruginosa №321 (500315) образуются негативные колонии диаметром (1,0±0,5) мм и шириной зоны неполного лизиса (0,3-0,7) мм.When the phage strain is plated with the two-layer Grazia method on the lawn of the test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315), negative colonies are formed with a diameter of (1.0 ± 0.5) mm and an incomplete lysis zone width of (0.3-0.7) mm .

6. Морфология фаговых вирионов штамма бактериофага №328 (500322).6. Morphology of phage virions of the bacteriophage strain No. 328 (500322).

По данным электронной микроскопии штамм бактериофага №328 (500322) принадлежит к семейству Myoviridae, имеет капсид диаметром 115 нм, длина отростка составляет 150 нм. (фиг. 1).According to electron microscopy, the bacteriophage strain No. 328 (500322) belongs to the family Myoviridae, has a capsid with a diameter of 115 nm, the length of the process is 150 nm. (Fig. 1).

7. Особенности фаз взаимодействия штамма бактериофага с бактериальными клетками, изученные в одиночном цикле размножения [17] в модификации [18] с использованием тест-штамма бактерий P. aeruginosa №321 (500315) свидетельствуют, что штамм бактериофага №328 (500322) обладает литическим циклом взаимодействия с бактериальными клетками гомологичного вида бактерий - внутриклеточно размножается, лизирует бактериальные клетки и характеризуется следующими параметрами взаимодействия с ними:7. Features of the phases of interaction of the bacteriophage strain with bacterial cells, studied in a single reproduction cycle [17] in modification [18] using the bacterial test strain P. aeruginosa No. 321 (500315) indicate that the bacteriophage strain No. 328 (500322) has a lytic a cycle of interaction with bacterial cells of a homologous type of bacteria — it multiplies intracellularly, lyses bacterial cells and is characterized by the following parameters of interaction with them:

- степень максимальной адсорбции на бактериальных клетках Pseudomonas aeruginosa - 91%, время максимальной адсорбции - 7-10 мин.;- the degree of maximum adsorption on bacterial cells of Pseudomonas aeruginosa - 91%, the time of maximum adsorption - 7-10 minutes;

- длительность внутриклеточного цикла размножения - 30 мин.;- the duration of the intracellular cycle of reproduction - 30 min .;

- величина выхода фага из одной инфицированной бактериальной клетки (урожайность) - 10 фаг.вирионов/ бакт.кл.- the output of phage from one infected bacterial cell (yield) - 10 phage.virions / bact.cl.

8. Спектр антибактериальной активности штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322).8. The spectrum of antibacterial activity of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Широта спектра антибактериальной активности штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322), определенная в тесте Аппельмана, составляет 58,79% в отношении 917 выделенных от больных с различной патологией и госпитальных штаммов P. aeruginosa эпидемиологически значимых, типичных по своим культуральным, морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам, в 100% резистентных к одному или более антибиотикам, полученных из стационаров и санитарно-эпидемиологических служб 30 городов различных территориально удаленных регионов России и стран СНГ.The breadth of the spectrum of antibacterial activity of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322), determined in the Appelman test, is 58.79% for 917 isolated from patients with various pathologies and hospital strains of P. aeruginosa epidemiologically significant, typical for their cultural, morphological, tinctorial and biochemical properties, 100% resistant to one or more antibiotics, obtained from hospitals and sanitary-epidemiological services in 30 cities of different territorially remote regions of Russia and the CIS countries.

9. Генетические свойства штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322).9. Genetic properties of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Характеристика генома штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) - размер генома 278 771 п.н., ДНК двухцепочечная, содержание ГЦ - 36,8%.Genome characteristic of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) - genome size 278 771 bp, double-stranded DNA, content of HC - 36.8%.

По данным высокопроизводительного полногеномного секвенирования и последующего биоинформационного анализа штамм фага №328 (500322) относится к литическим бактериофагам порядка Caudovirales, близок по строению генома к группе литических фагов семейства Myoviridae, рода Phikzlikevirus.According to the data of high throughput genome sequencing and subsequent bioinformation analysis, the phage strain No. 328 (500322) belongs to the lytic bacteriophages of the order Caudovirales, is similar in genome structure to the group of lytic phages of the Myoviridae family, of the genus Phikzlikevirus.

В геноме штамма бактериофага отсутствуют гены лизогении, токсигенности, лекарственной устойчивости.The genome of the bacteriophage strain lacks genes for lysogenesis, toxigenicity, and drug resistance.

Полная нуклеотидная последовательность ДНК штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) определена высокопроизводительным полногеномным секвенированием на платформе Illumina Miseq со сборкой de novo.The complete nucleotide sequence of the DNA of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) was determined by high throughput genome sequencing on the Illumina Miseq platform with de novo assembly.

Пример 1. Условия выделения, размножения и хранения штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322).Example 1. Conditions for the isolation, reproduction and storage of a bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Штамм бактериофага №328 (500322) выделен методом клонирования [17] уколом из негативной колонии, полученной по рассеве двухслойным методом Грациа на 0,7% - 1,5% агаровой среде пробы полученной по рассеве двухслойным методом Грациа на 0,7% - 1,5% агаровой среде пробы озерной воды (г.Владивосток) и тест-штамма бактерии P. aeruginosa №321 (500315) и тест-штамма бактерии P. aeruginosa №321 (500315).The strain of bacteriophage No. 328 (500322) was isolated by cloning [17] by an injection from a negative colony obtained by sieving by the two-layer Grazia method on 0.7% - 1.5% agar medium of the sample obtained by sieving by the two-layer Grazia method by 0.7% - 1 , 5% agar medium, lake water samples (Vladivostok) and the test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315) and the test strain of the bacterium P. aeruginosa No. 321 (500315).

Для размножения штамма фага используют питательные среды - стерильный мясо-пептонный бульон или бульоны с основами роста в виде панкреатических гидролизатов мяса или казеина.To propagate the phage strain, nutrient media are used - sterile meat-peptone broth or broths with growth bases in the form of pancreatic meat or casein hydrolysates.

Для размножения штамма фага штамм бактерии P. aeruginosa №321 (500315) (18-24 часовую культуру) вносят в стерильный бульон в исходной концентрации бактерий (4,0-5,0)×10⁷ бакт.кл\мл и одномоментно вносят бактериофаг №328 (500322) в соотношении фаг/бактерия 1/10.To propagate the phage strain, the bacterial strain P. aeruginosa No. 321 (500315) (18-24 hours culture) is introduced into the sterile broth in the initial concentration of bacteria (4.0-5.0) × 10 ⁷ bactl / ml and the bacteriophage is introduced simultaneously. No. 328 (500322) in the ratio of phage / bacterium 1/10.

Инкубирование проводят в течение 18-24 часов при температуре 37°С в условиях периодического статического культивирования.Incubation is carried out for 18-24 hours at a temperature of 37 ° C under conditions of periodic static cultivation.

Об окончании процесса размножения фага свидетельствует визуальное просветление культуральной жидкости (фаголизата).The completion of the phage propagation process is indicated by visual enlightenment of the culture fluid (phagolysate).

Штамм фага №328 (500322) не чувствителен к хлороформу, поэтому фаголизат консервируют добавлением хлороформа (5-10)%. Концентрация фагов в фаголизате после окончания культивирования определяется методом Грациа и составляет (0,5-5,0)×10⁹ фаговых вирионов в 1 мл.The strain of phage No. 328 (500322) is not sensitive to chloroform, therefore, the phagolysate is preserved by the addition of chloroform (5-10)%. The concentration of phages in the phagolysate after the end of cultivation is determined by the Grazia method and is (0.5-5.0) × 10 ⁹ phage virions in 1 ml.

Штамм фага №328 (500322) сохраняет литическую активность при хранении в виде фаголизата, содержащего 5-10% хлороформа, при температуре от +2°С до +8°С в МПБ в течение 5 лет.The strain of phage No. 328 (500322) retains lytic activity when stored in the form of a phagolysate containing 5-10% chloroform, at a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C in BCH for 5 years.

Пример 2. Характеристика биологических свойств штамма бактериофага Р. aeruginosa №326 (500320).Example 2. Characterization of the biological properties of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 326 (500320).

Морфология негативных колоний штамма бактериофага №328 (500322).The morphology of the negative colonies of the bacteriophage strain No. 328 (500322).

Штамм фага при высеве разведений фага двухслойном методом Грациа в 1,5% - 0,7% агаровой среде [17] образует негативные колонии диаметром (1,0±0,5) мм, ширина зоны неполного лизиса (0,3-0,7) мм.The phage strain when seeding dilutions of the phage by the two-layer method of Grazia in 1.5% - 0.7% agar medium [17] forms negative colonies with a diameter of (1.0 ± 0.5) mm, the width of the zone of incomplete lysis (0.3-0, 7) mm.

Особенности фаз взаимодействия штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) с бактериальными клетками изучают в одиночном цикле размножения [17] в модификации [18] использованием тест-штамма бактерий P. aeruginosa 321 (500315).The features of the interaction phases of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) with bacterial cells are studied in a single reproduction cycle [17] in modification [18] using the bacterial test strain P. aeruginosa 321 (500315).

Результаты свидетельствуют, что штамм бактериофага обладает литическим циклом взаимодействия с бактериальными клетками гомологичного вида бактерий - внутриклеточно размножается и лизирует бактериальные клетки и характеризуется следующими параметрами взаимодействия с ними:The results indicate that the bacteriophage strain has a lytic cycle of interaction with bacterial cells of a homologous type of bacteria — it multiplies and lyses bacterial cells intracellularly and is characterized by the following parameters of interaction with them:

- степень максимальной адсорбции на бактериальных клетках P. aeruginosa - 91%, время максимальной адсорбции - 7-10 мин.;- the degree of maximum adsorption on bacterial cells of P. aeruginosa - 91%, the time of maximum adsorption - 7-10 minutes;

- длительность внутриклеточного цикла размножения на бактериальных клетках - 30 мин.;- the duration of the intracellular cycle of reproduction on bacterial cells is 30 minutes;

Пример 3. Морфология вирионов штамма фага P. aeruginosa №328 (500322).Example 3. The morphology of the virions of the phage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Изучение морфологии вирионов штамма бактериофага проводят методом электронной микроскопии. Суспензии бактериофаговых вирионов для электронной микроскопии очищали от бактериальных примесей методом ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия [19].The morphology of the virions of the bacteriophage strain is studied by electron microscopy. Suspensions of bacteriophage virions for electron microscopy were purified from bacterial impurities by ultracentrifugation in a gradient of cesium chloride [19].

Таксономическую принадлежность изучали с использованием электронного микроскопа JEM-1400 (Jeol, Япония), оснащенного цифровой камерой бокового ввода Veleta (SIS, Германия).Taxonomic affiliation was studied using a JEM-1400 electron microscope (Jeol, Japan) equipped with a Veleta digital lateral input camera (SIS, Germany).

Размеры и морфология вирионных частиц штамма бактериофага по данным электронной микроскопии - семейству Myoviridae, имеет капсид диаметром 115 нм, длина отростка составляет 150 нм. (фиг. 1).The size and morphology of the virion particles of the bacteriophage strain according to electron microscopy - the Myoviridae family, has a capsid with a diameter of 115 nm, the length of the process is 150 nm. (Fig. 1).

Пример 4. Спектр антибактериальной активности штамма бактериофага Р. aeruginosa №328 (500322).Example 4. The spectrum of antibacterial activity of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Для определения широты спектра антибактериальной активности штамма бактериофага используют тест Аппельмана в разведении 10^-1 [6] и эпидемиологически значимые штаммы бактерий P. aeruginosa (917 шт.), выделенные от больных с различной патологией и госпитальные, типичные по своим культуральным, тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам, в 100% резистентные к одному или нескольким антибиотикам, полученные из санитарно-эпидемиологических служб и стационаров 30 городов различных территориально удаленных регионов России и стран СНГ.To determine the breadth of the spectrum of antibacterial activity of a bacteriophage strain, the Apelman test is used at a dilution of 10 ^-1 [6] and epidemiologically significant bacterial strains of P. aeruginosa (917 pcs.), Isolated from patients with various pathologies and hospital, typical for their cultural, tinctorial, and morphological and biochemical properties that are 100% resistant to one or more antibiotics, obtained from sanitary-epidemiological services and hospitals in 30 cities of different geographically remote regions of Russia and the CIS countries.

Для оценки антибиотикочувствительности 917 клинических и госпитальных бактериальных штаммов P. aeruginosa, используют 1,5% МПА, метод антибиотических дисков, в том числе и набор дисков антибиотиков №9, рекомендованных для бактерий Р. aeruginosa (Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»).To assess the antibiotic sensitivity of 917 clinical and hospital bacterial strains of P. aeruginosa, use 1.5% MPA, the method of antibiotic discs, including a set of antibiotic discs No. 9 recommended for bacteria P. aeruginosa (Federal budget institution of science "St. Petersburg Scientific Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology ").

Тестирование антибиотикочувствительности клинических и госпитальных штаммов бактерий P. aeruginosa показывает, что бактерии P. aeruginosa (917 штаммов) в 100% резистентны к одному или более антибиотикам, в том числе к антибиотикам цефтазидиму (35,7%), гентамицину (41,0%), амикацину (43,5%), к аминогликозидам (60-85%), фторхинолам (77,0%), цефалоспоринам (60,0% - 76,0% - 85,0%), ципрофлоксацину (47,0%) и тикарциллину (53,5%), карбопенемам - меропинем, ипинем (70,0%).Testing the antibiotic sensitivity of clinical and hospital P. aeruginosa bacteria strains shows that P. aeruginosa bacteria (917 strains) are 100% resistant to one or more antibiotics, including ceftazidime antibiotics (35.7%), gentamicin (41.0%) ), amikacin (43.5%), aminoglycosides (60-85%), fluoroquinolam (77.0%), cephalosporins (60.0% - 76.0% - 85.0%), ciprofloxacin (47.0) %) and ticarcillin (53.5%), carbopenem - meropinem, ipinem (70.0%).

100% штаммов бактерий P. aeruginosa были резистентны к антибиотикам пенициллинового и тетрациклинового рядов.100% of P. aeruginosa bacterial strains were resistant to penicillin and tetracycline antibiotics.

Параллельное тестирование антибактериальной активности штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) в тесте по Аппельману в разведении 10^-1 на 917 клинических и госпитальных штаммах бактерий P. aeruginosa, 100% резистентных к одному или нескольким антибиотикам свидетельствует о широком спектре и стабильности антибактериальной активности штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322) - активность 58,79% в отношении бактерий P. aeruginosa.Parallel testing of the antibacterial activity of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) in the Appelman test at a dilution of 10 ^-1 on 917 clinical and hospital P. aeruginosa bacteria strains 100% resistant to one or more antibiotics indicates a wide spectrum and stability of antibacterial activity bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322) - an activity of 58.79% against P. aeruginosa bacteria.

Пример 5. Изучение генетических свойств штамма бактериофага P. aeruginosa №328 (500322).Example 5. The study of the genetic properties of the bacteriophage strain P. aeruginosa No. 328 (500322).

Для изучения генетических свойств штамма бактериофага P. aeruginosa использовали метод высокопроизводительного полногеномного секвенирования с последующим биоинформационным анализом.To study the genetic properties of the bacteriophage strain P. aeruginosa, the method of high-throughput genome sequencing followed by bioinformation analysis was used.

Для проведения анализов геномов штаммов бактериофагов P. aeruginosa выделяли ДНК штаммов бактериофагов методом экстракции фенол-хлороформом с предварительной ферментативной обработкой РНКазой А, ДНКазой I и Протеиназой К (Thermo Fisher Scientific, США) [20].To analyze the genomes of bacteriophage strains of P. aeruginosa, the DNA of bacteriophage strains was isolated by phenol-chloroform extraction with preliminary enzymatic treatment with RNase A, DNase I, and Proteinase K (Thermo Fisher Scientific, USA) [20].

Секвенирование библиотек ДНК проводили на платформе Illumina Miseq.DNA library sequencing was performed on the Illumina Miseq platform.

Сборка нуклеотидных последовательностей de novo была выполнена с помощью пакета ABYSS.The de novo nucleotide sequence assembly was performed using the ABYSS package.

Поиск открытых рамок трансляции (ОРТ), таксономическая и функциональная идентификация этих ОРТ была проведена с помощью программного обеспечения MG-RAST с использованием последовательностей ДНК, находящихся в базах данных GenBank и др.The search for open translation frames (ORT), taxonomic and functional identification of these ORTs was carried out using the MG-RAST software using DNA sequences found in the GenBank databases and others.

Характеристика генома штамма бактериофага P. aeruginosa - размер генома 278 771 н.п., ДНК двухцепочечная, содержание ГЦ - 36,8%.Genome characteristics of the bacteriophage strain P. aeruginosa - genome size 278 771 bp, double-stranded DNA, content of HC - 36.8%.

По данным высокопроизводительного полногеномного секвенирования и последующего биоинформационного анализа установлено, что штамм бактериофага №328 (500322) относится к литическим бактериофагам порядка Caudovirales, близок по строению генома к группе (роду) литических фагов семейства Myoviridae, рода Phikzlikevirus.According to the data of high throughput genome sequencing and subsequent bioinformation analysis, it was found that the bacteriophage strain No. 328 (500322) belongs to the lytic bacteriophages of the order Caudovirales, is similar in genome structure to the group (genus) of lytic phages of the Myoviridae family, genus Phikzlikevirus.

Установлено, что в геноме штамма бактериофага отсутствуют гены лизогении, токсигенности, лекарственной устойчивости.It has been established that the genome of a bacteriophage strain lacks genes for lysogenesis, toxigenicity, and drug resistance.

Источники информацииSources of information

1. Тикунова Н.В., Ворошилова Н.Н., Полыгач О.А., Морозова В.В., Тикунов А.Ю., Курильщиков A.M., Власов В.В.. Генетическая характеристика и спектр антибактериальной активности бактериофагов, входящих в состав промышленных серий лекарственного препарата Пиобактериофаг поливалентный очищенный. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2016; 2 (87): 93-100.1. Tikunova NV, Voroshilova NN, Polygach OA, Morozova VV, Tikunov A.Yu., Kurilshchikov AM, Vlasov VV. Genetic characteristics and spectrum of antibacterial activity of bacteriophages included in the industrial series of the drug Pyobacteriophage, polyvalent purified. Epidemiology and Vaccine Prevention. 2016; 2 (87): 93-100.

2. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» в 2011-2012 гг. Сухорукова М.В., Эйделынтейн М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Тимохова А.В., Шек Е.А., Дехнич А.В., Козлов Р.С. и исследовательская группа «МАРАФОН». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2014; 16(4): 273-279.2. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in Russian hospitals: the results of the MARATHON multicenter epidemiological study in 2011-2012. Sukhorukova M.V., Eidelynteyn M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Timokhova A.V., Shek E.A., Dehnich A.V., Kozlov R.S. and the MARATHON research team. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2014; 16 (4): 273-279.

3. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013-2014. Эйдельштейн М.В., Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Микотина А.В., Шек Е.А., Дехнич А.В., Азизов И.С., Козлов Р.С. и исследовательская группа «МАРАФОН». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2017; 19(1): 37-41.3. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in Russian hospitals: the results of the multicenter epidemiological study “MARAFON” 2013-2014. Eidelstein M.V., Sukhorukova M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Mikotina A.V., Shek E.A., Dehnich A.V., Azizov I.S., Kozlov R .WITH. and the MARATHON research team. Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2017; 19 (1): 37-41.

4. Кузнецова М.В. Распространенность возбудителя и разнообразие нозоологических форм синегнойной инфекции. Здоровье семьи - 21 век. 2014; 2: 84-112.4. Kuznetsova M.V. The prevalence of the pathogen and the diversity of nosological forms of Pseudomonas aeruginosa. Family Health - 21st Century. 2014; 2: 84-112.

5. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015; том 17 (3): 170-187.5. Lazareva A.V., Chebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar V.I., Mayansky N.A. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and pathology. Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2015; Volume 17 (3): 170-187.

6. Общая фармакопейная статья Бактериофаги. ОФС.1.7.1.0002.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том И.6. General pharmacopoeial article Bacteriophages. OFS.1.7.1.0002.15. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIII edition. Tom I.

7. Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза от 06.05.17 г, решение №89 от 03.11.2016 (доступно на: https://docs.eaeunion.org/docs/ru-ru/01411954/cncd_21112016_89).7. The rules for conducting research on biological drugs of the Eurasian Economic Union dated 05.06.17, decision No. 89 dated 03.11.2016 (available at: https://docs.eaeunion.org/docs/ru-ru/01411954/cncd_21112016_89).

8. Gilbert Verbeken, Jean-Paul Pirnay, Rob Lavigne, Serge Jennes, Daniel De Vos, Minne Casteels, and Isabelle Huys. Call for a Dedicated European Legal Framework for Bacteriophage Therapy. Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis. Feb 6, 2014; 62(2): 117-129.8. Gilbert Verbeken, Jean-Paul Pirnay, Rob Lavigne, Serge Jennes, Daniel De Vos, Minne Casteels, and Isabelle Huys. Call for a Dedicated European Legal Framework for Bacteriophage Therapy. Archivum Immunologiae Et Therapiae Experimentalis. Feb 6, 2014; 62 (2): 117-129.

9. Патент RU №2455355, опубл. 10.07.2012. Козлова Ю.Н., Репин B.E., Анищенко В.В., Власов В.В., Ганичев Д.А., Семенов С.А., Пугачев В.Г., Тарасов О.С. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa, используемый в качестве основы для приготовления асептического средства против синегнойной палочки.9. Patent RU No. 2455355, publ. 07/10/2012. Kozlova Yu.N., Repin B.E., Anischenko V.V., Vlasov V.V., Ganichev D.A., Semenov S.A., Pugachev V.G., Tarasov O.S. The strain of the bacteriophage Pseudomonas aeruginosa, used as the basis for the preparation of aseptic agents against Pseudomonas aeruginosa.

10. Патент WO 2015059298. Phage therapy of Pseudomonas infections. Pouillot Flavie, Blois Helene [FR], 30.04.2015.10. Patent WO 2015059298. Phage therapy of Pseudomonas infections. Pouillot Flavie, Blois Helene [FR], 04/30/2015.

11. Патент EP 2248890. Bacteriophages specific to РАК and СНА strains of Pseudomonas aeruginosa and their applications. Debarbieux Laurent [FR]; Morello Eric [FR]. 10.11.2010.11. Patent EP 2248890. Bacteriophages specific to CANCER and CHA strains of Pseudomonas aeruginosa and their applications. Debarbieux Laurent [FR]; Morello Eric [FR]. 11/10/2010.

12. Патент PL №007472, опубл. 27.10.2006. Вебер-Дабровска Б., Мульчик М., Гурски А., Боратыньски Я, Лусяк-Шелаховска М., Сыпер Д. Поливалентные штаммы бактериофага, способы их получения и использования и содержащее указанные штаммы лекарственное средство.12. Patent PL No. 007472, publ. 10/27/2006. Weber-Dabrovska B., Mulchik M., Gursky A., Boratynski I, Lusyak-Shelahowska M., Syper D. Polyvalent bacteriophage strains, methods for their preparation and use, and a drug containing these strains.

13. Патент RU №2186574, опубл. 10.08.2002. Яфаев Р.Х., Асланов Б.И., Зуева Л.П. Препарат поливалентного бактериофага против синегнойной палочки, штаммы бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПБГМА им. И.И. Мечникова №05, №03, №06 и №07, используемые при приготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки.13. Patent RU No. 2186574, publ. 08/10/2002. Yafaev R.Kh., Aslanov B.I., Zueva L.P. The preparation of polyvalent bacteriophage against Pseudomonas aeruginosa, strains of the bacteriophage Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa St. Petersburg State Medical Academy named after I.I. Mechnikov No. 05, No. 03, No. 06 and No. 07 used in the preparation of a multivalent drug against Pseudomonas aeruginosa.

14. Патент RU №2112800 от 29.03.1996. Жиленков Е.Л., Степанов А.В., Дианов Е.Е., Негрий В.Ф., Гаевская Г.Б. Штамм пилеспецифического бактериофага Pseudomonas aeruginosa ГНЦПМ №03, используемый для приготовления лечебного препарата против синегнойной палочки.14. Patent RU No. 2112800 dated 03/29/1996. Zhilenkov E.L., Stepanov A.V., Dianov E.E., Negrii V.F., Gaevskaya G.B. The strain pylonspecific bacteriophage Pseudomonas aeruginosa GNSTsM No. 03, used to prepare a therapeutic drug against Pseudomonas aeruginosa.

15. Патент RU №2113476 опубл. 20.06.1998. Жиленков Е.Л.; Благодатских А.Я.; Степанов А.В.; Негрий В.Ф.; Ковалева З.А. Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa SA ГНЦ ПМ №02, используемый при изготовлении поливалентного лечебного препарата против синегнойной палочки.15. Patent RU No. 2113476 publ. 06/20/1998. Zhilenkov E.L .; Blagodatsky A.Y .; Stepanov A.V .; Negrii V.F .; Kovaleva Z.A. The strain of the bacteriophage Pseudomonas aeruginosa SA SSC PM No. 02, used in the manufacture of a multivalent therapeutic drug against Pseudomonas aeruginosa.

16. Патент RU №2366437 опубл. 10.09.2009. Алешкин А.В., Алешкин В.А., Амерханова A.M., Афанасьев Д.С., Афанасьев С.С., Гаврин А.Г., Голикова В.М., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Киселева И.А., Логунов О.В., Пугачева Т.Г., Рубальский Е.О., Рубальский О.В. Композиция на основе бактериофага (варианты).16. Patent RU No. 2366437 publ. 09/10/2009. Aleshkin A.V., Aleshkin V.A., Amerkhanova AM, Afanasyev D.S., Afanasyev S.S., Gavrin A.G., Golikova V.M., Davydkin V.Yu., Davydkin I.Yu. , Kiseleva I.A., Logunov O.V., Pugacheva T.G., Rubalsky E.O., Rubalsky O.V. A composition based on a bacteriophage (options).

18. Авторское свидетельство №1158578 «Способ определения выхода бактериофага S3 шигелл Зонне», 1985 г.18. Copyright certificate No. 1158578 "Method for determining the yield of bacteriophage S3 Shigella Sonne", 1985

19. Каттер Э., Сулаквелидзе А. Бактериофаги: биология и практическое применение. Пер. с англ. Москва: Научный мир; 2012.19. Cutter E., Sulakvelidze A. Bacteriophages: biology and practical application. Per. from English Moscow: Scientific World; 2012.

20. Bacteriophage and its vectors. Ed.: Sambrook J., Russell D. Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press. 2001.20. Bacteriophage and its vectors. Ed .: Sambrook J., Russell D. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

Claims

The strain of the bacteriophage Pseudomonas aeruginosa, deposited in the State collection of pathogenic microorganisms (GKPM) of the Federal state budget institution "Scientific center for the examination of medical devices" of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI "NTsESMP" of the Ministry of Health of Russia) under registration number N328 (500322), which has antibacterial activity in against drug-resistant clinical and hospital strains of bacteria P. aeruginosa, intended for the preparation of mono- and polyvalent preparations Ratov bacteriophages used for the treatment and prevention of infectious diseases caused by bacteria Pseudomonas aeruginosa.