RU2710262C1

RU2710262C1 - Biological analysis method

Info

Publication number: RU2710262C1
Application number: RU2019124485A
Authority: RU
Inventors: Николай Сергеевич Осин; Вера Гавриловна Помелова; Дмитрий Викторович Парамонов; Татьяна Александровна Быченкова
Original assignee: Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН")
Priority date: 2019-08-01
Filing date: 2019-08-01
Publication date: 2019-12-25

Abstract

FIELD: laboratory diagnostics.

SUBSTANCE: invention relates to laboratory diagnostics and can be used in biological microanalysis. To this end, solid-phase sorbents are prepared for desired analytes in form of microzones in an optically transparent vessel and ligands associated with long-term luminescent compounds. Then biospecific binding of analytes of sample and ligands in composition of reaction mixture in vessel with sorbents is carried out. Long-term luminescence signal is recorded from ligand-analyte-sorbent complexes when the sorbent is irradiated with a beam of light with a beam diameter not exceeding the sorbent area. Before measuring the luminescence, a muffling solution which does not miscible with the reaction mixture is added to the reaction mixture. Said quenching solution has density higher than the sample density and contains a substance which absorbs light in the region of excitation and emission of ligand luminescence.

EFFECT: invention increases sensitivity, accuracy of analysis and widens the dynamic range of determined concentrations of one or more analytes in a sample when diagnosing infectious and somatic diseases.

10 cl, 5 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области лабораторной диагностики с использованием реакций биоспецифического связывания типа аналит-лиганд, таких как антиген-антитело, гибридизация нуклеиновых кислот и т.п. и биореагентов, проявляющих реакцию, в виде длительно люминесцирующих лигандов.The invention relates to the field of laboratory diagnostics using biospecific binding reactions of the analyte-ligand type, such as an antigen-antibody, nucleic acid hybridization, and the like. and bioreagents exhibiting a reaction in the form of long luminescent ligands.

Известны способы лабораторной диагностики с использованием длительно люминесцирующих соединений в качестве биореагентов, проявляющих реакцию, имеющих время затухания люминесценции в диапазоне милли- и микросекунд.Known methods of laboratory diagnostics using long-term luminescent compounds as bioreagents exhibiting a reaction having a luminescence decay time in the range of milliseconds and microseconds.

Длительно люминесцирующие соединения регистрируют в режиме временного разрешения, что позволяет исключить фоновую люминесценцию примесей и повысить чувствительность и специфичность анализа в целом по сравнению с обычными приемами флуоресцентного биологического микроанализа без выделения временного интервала, эквивалентного постоянной времени затухания люминесценции.Long-term luminescent compounds are recorded in the time resolution mode, which eliminates the background luminescence of impurities and improves the sensitivity and specificity of the analysis as a whole compared to conventional methods of fluorescence biological microanalysis without isolating a time interval equivalent to the luminescence decay time constant.

В качестве длительно люминесцирующих соединений используют хелаты (комплексоны) ионов лантаноидов (Eu, Tb, Sm, Dy) и металлопорфирины с центральными атомами платины и палладия, имеющие узкие полосы и высокий квантовый выход люминесценции.As long-term luminescent compounds, chelates (complexons) of lanthanide ions (Eu, Tb, Sm, Dy) and metalloporphyrins with central platinum and palladium atoms, which have narrow bands and a high quantum yield of luminescence, are used.

Наибольшее распространение получил способ, основанный на технологии DELFIA™ (диссационно усиленного лантанидного флуоресцентного иммуноанализа), включающий прием перекомплексации ионов лантаноидов в мицеллярный раствор с комплексонами, многократно усиливающими их люминесценцию. Технология DELFIA™ широко используется в мире для неонатального скрининга наследственных болезней обмена у новорожденных. В технологии DELFIA™ в обязательном порядке используют стадию удаления непрореагировавших иммунореагентов многократной промывкой лунок микропланшетов или иных реакционных сосудов.The most widely used method is based on DELFIA ™ technology (disassembly-enhanced lanthanide fluorescence immunoassay), which includes the method of recomplexing lanthanide ions into a micellar solution with complexones that multiply their luminescence. DELFIA ™ technology is widely used in the world for neonatal screening of hereditary metabolic diseases in newborns. In the DELFIA ™ technology, the stage of removing unreacted immunoreagents without fail by repeatedly washing the wells of microplates or other reaction vessels is mandatory.

Известны способы проведения твердофазного иммуноанализа, не требующие перекомплексации ионов лантаноидов. В этом случае сигнал длительной люминесценции от ионов лантаноидов и металлопорфиринов регистрируют с поверхности оптически прозрачных полимерных материалов.Known methods for conducting solid-phase immunoassay, which do not require recompilation of lanthanide ions. In this case, the long-term luminescence signal from lanthanide ions and metalloporphyrins is recorded from the surface of optically transparent polymeric materials.

В качестве твердой фазы в этих способах могут быть использованы пробирки, лунки микропланшетов, слайды. Эти способы могут быть выполнены в виде мультиплексных систем (биочипов) для одновременного определения не одного, а сразу нескольких (множества) аналитов в одной пробе.Test tubes, microplate wells, slides can be used as the solid phase in these methods. These methods can be performed in the form of multiplex systems (biochips) for the simultaneous determination of not one but several (many) analytes in one sample.

Так, известен способ иммуноанализа и реагент для обнаружения гормонов в биологическом образце (патент США №5089423, класс НКИ 436-518). Способ предназначен для определения в образце крови альфафетопротеина, хорионического гонадотропина человека, ферритина, тиротропина и других гормонов. В способе используют иммобилизацию иммунореактивных веществ, например, антител на твердой фазе, реагирование комплементарных иммунореактивных веществ с веществами, иммобилизованными на твердой фазе. При этом комплементарные имунореактивные вещества связаны с частью лиганда, образуя с ионами металлов лантанидов флуоресцентные хелатные комплексы (метки). После осуществления реакции иммунологического связывания, иммунорективные вещества, не связавшиеся с иммунореактивными веществами, иммобилизованными на твердой фазе, отмываются, а твердая фаза высушивается. Флуоресценция хелатных меток на дне лунок на комплементарно связанных иммунореактивных веществах измеряется в режиме временного разрешения в присутствии редкоземельных металлов, стабильно связанных с хелатами. В способе исключается необходимость диссоциации меченых комплексов, образовавшихся на твердой фазе, что значительно упрощает процедуру анализа. Высушивание твердой фазы перед измерением флуоресценции исключает проблему поглощения и рассеяния возбуждающего потока и излучения эмиссии остаточным количеством реагентов в лунке.Thus, a method of immunoassay and a reagent for detecting hormones in a biological sample is known (US patent No. 5089423, class NCI 436-518). The method is intended for determining in a blood sample alpha-fetoprotein, human chorionic gonadotropin, ferritin, thyrotropin and other hormones. The method uses the immobilization of immunoreactive substances, for example, antibodies in the solid phase, the reaction of complementary immunoreactive substances with substances immobilized in the solid phase. In addition, complementary immunoreactive substances are associated with a part of the ligand, forming fluorescent chelate complexes (labels) with lanthanide metal ions. After the implementation of the immunological binding reaction, immunoreactive substances that are not bound to immunoreactive substances immobilized on the solid phase are washed off and the solid phase is dried. Fluorescence of chelate marks at the bottom of wells on complementary bound immunoreactive substances is measured in the time resolution mode in the presence of rare earth metals stably bound to chelates. The method eliminates the need for dissociation of labeled complexes formed on the solid phase, which greatly simplifies the analysis procedure. Drying the solid phase before measuring fluorescence eliminates the problem of absorption and scattering of the excitation flux and emission radiation by the residual amount of reagents in the well.

Для усиления сигнала в качестве лигандов используют длительно люминесцирующие метчики, включенные в состав наночастиц, поверхность которых включает биореагенты для биоспецифического связывания (антитела, днк-зонды, компоненты системы стрептавидин-биотин и т.п.).To amplify the signal, long-luminescent taps included in the composition of nanoparticles, the surface of which includes bioreagents for biospecific binding (antibodies, DNA probes, components of the streptavidin-biotin system, etc.), are used as ligands.

Наночастицы обеспечивают увеличение числа длительно люминесцирующих молекул, приходящихся на единичное биомолекулярное взаимодействие, что позволяет более чем в 10-100 раз повысить чувствительность анализа. Однако, применение наночастиц сопровождается увеличением вариабельности результатов анализа, т.к. вариабельность зависит от размера комплекса сорбент-аналит-лиганд и в случае применения наночастиц комплекс существенно больше и чувствительнее к режимам промывки. В процессе удаления непрореагировавших биоспецифических компонентов часть комплексов также может оказаться удаленной с поверхности иммуносорбента.Nanoparticles provide an increase in the number of long-term luminescent molecules per unit biomolecular interaction, which makes it possible to increase the analysis sensitivity by more than 10-100 times. However, the use of nanoparticles is accompanied by an increase in the variability of the analysis results, since the variability depends on the size of the sorbent-analyte-ligand complex, and in the case of using nanoparticles, the complex is much larger and more sensitive to washing regimes. In the process of removing unreacted biospecific components, some of the complexes may also be removed from the surface of the immunosorbent.

Известен способ твердофазного иммуноанализа (ФОСФАН™) с использованием в качестве меченых лигандов металлопорфиринов с центральными атомами платины и палладия [патент РФ №2184970, класс МПК G01N 33/5]. Способ используют и для выявления продуктов гибридизации нуклеиновых кислот.The known method of solid-phase immunoassay (FOSFAN ™) using metalloporphyrins with central atoms of platinum and palladium as labeled ligands [RF patent No. 2184970, IPC class G01N 33/5]. The method is also used to detect nucleic acid hybridization products.

Способ ФОСФАН™ включает следующие стадии:The FOSFAN ™ method comprises the following steps:

1. Приготовление сорбента для биоспецифического связывания аналитов на твердой фазе (дне) оптически прозрачного сосуда в виде отдельных микрозон.1. Preparation of a sorbent for biospecific binding of analytes on the solid phase (bottom) of an optically transparent vessel in the form of separate microzones.

2. Внесение пробы (клинического образца) в оптически прозрачный сосуд.2. The introduction of the sample (clinical sample) into an optically transparent vessel.

3. Внесение в буферном растворе лиганда, меченого длительно люминесцирующими метчиками.3. The introduction in the buffer solution of a ligand labeled with long luminescent taps.

4. Инкубация пробы с встряхиванием на шейкере.4. Incubation of the sample with shaking on a shaker.

5. Удаление из сосуда промывкой непрореагировавших компонентов пробы и лиганда.5. Removal from the vessel by washing of unreacted sample components and ligand.

6. Высушивание на твердой фазе образовавшихся комплексов сорбент-аналит-лиганд.6. Drying on the solid phase of the formed sorbent-analyte-ligand complexes.

7. Регистрация люминесцентного сигнала в режиме пространственного, временного и спектрального разрешения путем сканирования поверхности дна оптически прозрачного сосуда с иммобилизованными длительно люминесцирующими комплексами сорбент-аналит-лиганд.7. Registration of a luminescent signal in the spatial, temporal and spectral resolution mode by scanning the bottom surface of an optically transparent vessel with immobilized long-luminescent sorbent-analyte-ligand complexes.

В качестве сорбентов для биоспецифического связывания аналитов в этом способе используют иммобилизованные на дне лунок полистироловых микропланшетов антитела, антигены различной природы, биологически активные низкомолекулярные соединения на белковом носителе, а также ДНК-зонды для гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.As sorbents for biospecific binding of analytes in this method, antibodies immobilized at the bottom of polystyrene microplate wells, antigens of various nature, biologically active low molecular weight compounds on a protein carrier, as well as DNA probes for hybridization analysis of nucleic acids are used.

В качестве исследуемых проб используют сыворотку крови, мочу, другие биологические жидкости, сухие пятна крови и мочи, а также образцы проб из объектов внешней среды, содержащие инфекционный и другой исследуемый материал.As the studied samples, use blood serum, urine, other biological fluids, dry spots of blood and urine, as well as samples of samples from environmental objects containing infectious and other studied material.

В качестве лигандов используют конъюгаты антител и биологически активных соединений с длительно люминесцирующими соединениями, а также наночастицы, покрытые компонентами для биоспецифического связывания и включающие длительно люминесцирующие соединения. В технологии ФОСФАН™ для двухстадийного анализа используют универсальную систему стрептавидин-биотин.As ligands, conjugates of antibodies and biologically active compounds with long luminescent compounds, as well as nanoparticles coated with components for biospecific binding and including long luminescent compounds, are used. FOSFAN ™ technology uses a universal streptavidin-biotin system for two-step analysis.

Регистрацию длительной люминесценции осуществляют при облучении поверхности твердой фазы (полистирола) в диапазоне 365-375 нм в импульсном стробоскопическом режиме с выделением сигнала люминесценции европия с постоянной времени затухания 700 микросекунд на длине волны 615 нм, с выделением сигнала люминесценции платинакопропорфирина с постоянной времени затухания 80 микросекунд на длине волны 653 нм, с выделением сигнала люминесценции палладийкопропорфирина с постоянной времени затухания 1200 микросекунд на длине волны 670 нм, с выделением сигнала люминесценции ионов тербия с постоянной времени затухания 1200 микросекунд на длине волны 495 нм.Long-term luminescence is recorded by irradiating the surface of the solid phase (polystyrene) in the range 365-375 nm in a pulsed stroboscopic mode with the extraction of the europium luminescence signal with a decay time constant of 700 microseconds at a wavelength of 615 nm, with the release of a platinum-aproporphyrin luminescence signal with a decay time constant of 80 microseconds at a wavelength of 653 nm, with the release of the luminescence signal of palladium coproporphyrin with a constant decay time of 1200 microseconds at a wavelength of 670 nm, with the release of the signal ala of luminescence of terbium ions with a decay time constant of 1200 microseconds at a wavelength of 495 nm.

Для проведения мультиплексного анализа на дне лунок полистиролового микропланшета формируют микрозоны из сорбентов различной специфичности диаметром 0,3-0,4 мм, что позволяет выявлять одновременно в пробе до 16 аналитов с помощью фосфоресцентного сканера ИФИ-03, ИФИ-04, ИФИ-05 (ЗАО «ИММУНОСКРИН»).To conduct a multiplex analysis, microzones are formed at the bottom of the polystyrene microplate wells from sorbents of various specificities with a diameter of 0.3-0.4 mm, which makes it possible to simultaneously identify up to 16 analytes in a sample using a phosphorescence scanner IFI-03, IFI-04, IFI-05 ( CJSC IMMUNOSKRIN).

Недостатком данного и других способов с применением промывки твердой фазы при использовании люминесцирующих наночастиц является высокая вариабельность результатов измерений, обусловленная высокой чувствительностью лигандов к режимам промывки твердой фазы. Кроме того, способы с использованием процедуры отмывки (удаления) непрореагировавших реагентов, не могут быть применены для определения опасных инфекционных агентов, т.к. процедура промывки (удаления несвязавшихся компонентов пробы и, в том числе, биопатогенов) не может обеспечить надежный противоэпидемический режим проведения анализа из-за образования аэрозоля, сопровождающего процедуру промывки.The disadvantage of this and other methods using washing the solid phase when using luminescent nanoparticles is the high variability of the measurement results due to the high sensitivity of the ligands to the washing regimes of the solid phase. In addition, methods using the washing procedure (removal) of unreacted reagents cannot be used to determine dangerous infectious agents, because the washing procedure (removal of unbound sample components, including biopathogens) cannot provide a reliable anti-epidemic analysis regime due to the formation of an aerosol accompanying the washing procedure.

Следует отметить, что перечисленные выше способы с отмывкой твердой фазы используют и при анализе проб в виде дисков фильтровальной бумаги с нанесенными биологическими материалами (цельная кровь, плазма или другие биологические жидкости).It should be noted that the above methods with washing the solid phase are also used in the analysis of samples in the form of filter paper disks with applied biological materials (whole blood, plasma or other biological fluids).

Для реализации способов с использованием стадии промывки и клинических образцов в виде сухих пятен биологических материалов, например, при неонатальном скрининге наследственных болезней обмена у новорожденных, или выявлении наркотических веществ в пробах мочи, высушенных на фильтровальной бумаге, требуется специализированный комплект лабораторного оборудования, включающий не только фосфоресцентный сканер, но и промыватель (вошер), встряхиватель (шейкер), а также удалитель дисков сухих пятен крови, мочи (дискремувер). Процедура промывки и удаления дисков вносят дополнительные ошибки в анализ.To implement methods using the washing stage and clinical samples in the form of dry spots of biological materials, for example, in neonatal screening of hereditary metabolic diseases in newborns, or the detection of narcotic substances in urine samples dried on filter paper, a specialized set of laboratory equipment is required, including not only phosphorescence scanner, but also a washer (louse), a shaker (shaker), as well as a disc remover for dried blood stains, urine (disc remover). The rinsing and disc removal procedures introduce additional errors into the analysis.

Известны способы, не требующие удаления несвязавшихся люминесцирующих реагентов и, соответственно, не требующие перечисленного выше полного комплекта лабораторного оборудования для его реализации.Known methods that do not require the removal of unbound luminescent reagents and, accordingly, do not require the above complete set of laboratory equipment for its implementation.

Так, известны гомогенные способы лабораторной диагностики (иммуноанализа) на основе технологии TR-FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии в комплексах аналит-лиганд с участием донорно-акцепторной пары из двух лигандов, меченых коротко флуоресцирующим и длительно люминесцирующим метчиком). В этих способах используют длительно люминесцирующие криптаты (технология Trace, анализатор Kryptor, компания БРАМС ГмбХ, Германия) и реагенты для технологии Lance (Lanthanide Chelate Excite, компании Перкин-Эльмер, США). При образовании комплексов лиганд-аналит-лиганд и облучении пробы светом наблюдается перенос энергии с молекулы лиганда - донора на молекулу лиганд-акцептор. Эти способы не требуют стадии промывки и других дополнительных операций по освобождению от несвязавшихся иммунореагентов. Однако, эти способы имеют ограничения по чувствительности и динамическому диапазону определения аналитов из-за наличия фонового уровня люминесценции донора и акцептора. Кроме того, TR-FRET имеет ограниченный Ферсторовский радиус резонансного переноса энергии в донорно-акцепторных парах флуорохромов (порядка 20 нм) и не может быть эффективно применен для анализа протяженных объектов (например, микроорганизмов). Кроме того, эти способы не могут обеспечить выявление в пробе сразу нескольких аналитов без дополнительных приемов ее деления на отдельные порции.Thus, homogeneous laboratory diagnostic methods (immunoassays) are known based on the TR-FRET technology (fluorescence-resonance energy transfer in analyte-ligand complexes with the participation of a donor-acceptor pair of two ligands labeled with a short-fluorescent and long-luminescent taps). These methods use long-term luminescent cryptates (Trace technology, Kryptor analyzer, BRAMS GmbH, Germany) and reagents for Lance technology (Lanthanide Chelate Excite, Perkin-Elmer, USA). During the formation of ligand – analyte – ligand complexes and irradiation of the sample with light, energy transfer is observed from the ligand – donor molecule to the ligand – acceptor molecule. These methods do not require a washing step and other additional operations to free from unbound immunoreagents. However, these methods have limitations on the sensitivity and dynamic range of analyte determination due to the presence of a background level of luminescence of the donor and acceptor. In addition, TR-FRET has a limited Ferstor radius of resonant energy transfer in donor-acceptor pairs of fluorochromes (of the order of 20 nm) and cannot be effectively used to analyze extended objects (for example, microorganisms). In addition, these methods cannot ensure the identification of several analytes in a sample at once without additional methods of dividing it into separate portions.

Известны и другие способы с использованием длительно люминесцирующих соединений, не требующие удаления свободных реагентов и компонентов пробы. Так, известен твердофазный способ, в котором промывку твердой фазы и удаление несвязанного люминесцирующего лиганда не используют. Исключение стадии промывки твердой фазы обеспечивает конструкция биосенсорного устройства. Оптическая схема биосенсора сформирована таким образом, чтобы свет возбуждения не выходил в объем пробы, а испытывал полное внутреннее отражение на поверхности с иммуносорбентом. В этом случае сигнал регистрируют с поверхности от комплексов сорбент-аналит-лиганд и затрагивают свободные реагенты из очень тонкого слоя пробы, не превышающего половины длины волны возбуждающего света, т.е. около 180-190 нм (при возбуждении на длине волны 360-370 нм).Other methods are known using long-term luminescent compounds that do not require the removal of free reagents and sample components. Thus, a solid phase method is known in which washing the solid phase and removing the unbound luminescent ligand is not used. The exception to the stage of washing the solid phase provides the design of the biosensor device. The optical scheme of the biosensor is formed so that the excitation light does not enter the sample volume, but experiences complete internal reflection on the surface with the immunosorbent. In this case, the signal is recorded from the surface from the sorbent-analyte-ligand complexes and affects free reagents from a very thin layer of the sample, not exceeding half the wavelength of the exciting light, i.e. about 180-190 nm (when excited at a wavelength of 360-370 nm).

Для реализации этого способа используют биосенсорные устройства со сложной оптической системой и достаточно дорогими полимерными расходными материалами, обеспечивающими регистрацию сигнала с использованием эффекта полного внутреннего отражения. Кроме того, способ имеет ограничение по использованию для анализа в качестве аналитов достаточно протяженных корпускулярных объектов (микроорганизмов, простейших и т.п.), заметно превышающих по своим размерам половину длины волны возбуждающего света.To implement this method, biosensor devices with a complex optical system and rather expensive polymeric consumables are used that provide signal registration using the effect of total internal reflection. In addition, the method has a limitation on the use for analysis as analytes of sufficiently long corpuscular objects (microorganisms, protozoa, etc.), noticeably exceeding in size half the wavelength of exciting light.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа (прототипом) является способ гомогенного флуоресцентного иммуноанализа с использованием светопоглощающего материала [ЕР 019115575,G01N 33/58 Homogeneus fluorescence immunoassay using a light absorbing material]. Способ включает приготовление твердофазного иммуносорбента, проведение реакции биоспецифического связывания иммунореагентов, включая связывание на твердой фазе аналитов с лигандами, мечеными длительно люминесцирующими комплексами ионов лантаноидов и введение в состав буферной смеси светопоглощающего материала. В качестве светопоглощающего материала используют 1,8-анилинонафталеносульфонат (АНС) поглощающий в области возбуждения комплексов ионов лантаноидов. Этот прием позволяет почти в сто раз снизить уровень люминесценции от комплексов ионов лантаноидов, которые не включены в состав иммунных комплексов на твердой фазе и находятся в объеме жидкой пробы.The closest analogue of the proposed method (prototype) is a method of homogeneous fluorescent immunoassay using light-absorbing material [EP 019115575, G01N 33/58 Homogeneus fluorescence immunoassay using a light absorbing material]. The method includes preparing a solid-phase immunosorbent, conducting a biospecific binding of immunoreagents, including binding on a solid phase of analytes with ligands labeled with long-term luminescent complexes of lanthanide ions and the introduction of a light-absorbing material in the buffer mixture. As a light-absorbing material, 1,8-anilinonaphthalene sulfonate (ANS) is used, which absorbs in the region of excitation of lanthanide ion complexes. This technique allows one to reduce the level of luminescence from complexes of lanthanide ions, which are not included in the composition of immune complexes on the solid phase and are in the bulk of the liquid sample, by a hundred times.

Указанный способ имеет существенные ограничения по чувствительности, динамическому диапазону выявления аналитов и точности (коэффициент вариации), обусловленные неполным тушением люминесценции свободного лиганда в объеме пробы. Для расширения динамического диапазона выявляемых аналитов в область высоких концентраций для данного способа необходимо пропорционально увеличивать концентрацию меченого флуорохромом лиганда, что сопровождается увеличением люминесценции свободного лиганда и снижает чувствительность при выявлении низких концентраций аналитов. Таким образом, прототип не может обеспечить одновременное достижение высокой чувствительности, широкого динамического диапазона выявления аналитов и точности (коэффициент вариации).This method has significant limitations on sensitivity, dynamic range of analyte detection and accuracy (coefficient of variation) due to incomplete quenching of the ligand of the free ligand in the sample volume. To expand the dynamic range of analytes detected in the region of high concentrations for this method, it is necessary to proportionally increase the concentration of fluorochrome-labeled ligand, which is accompanied by an increase in the luminescence of the free ligand and reduces sensitivity when detecting low analyte concentrations. Thus, the prototype cannot provide the simultaneous achievement of high sensitivity, a wide dynamic range of detection of analytes and accuracy (coefficient of variation).

Задачей является создание способа анализа клинических образцов, в том числе потенциально контаминированных возбудителями инфекционных заболеваний, обеспечивающего по сравнению с прототипом повышение чувствительности, точности и многократное (10-100 раз) расширение динамического диапазона выявляемых концентраций аналитов.The objective is to create a method for the analysis of clinical samples, including those potentially contaminated with pathogens of infectious diseases, which provides, in comparison with the prototype, an increase in sensitivity, accuracy and multiple (10-100 times) expansion of the dynamic range of detectable analyte concentrations.

Способ может быть использован для одновременного определения в пробе нескольких аналитов, являющихся маркерами инфекционных и соматических заболеваний.The method can be used to simultaneously determine in the sample several analytes that are markers of infectious and somatic diseases.

Предлагаемый способ решает задачу проведения твердофазного биологического микроанализа и регистрации сигнала с использованием длительно люминесцирующих реагентов без стадии удаления непрореагировавших реагентов и компонентов пробы, т.е. без стадии промывки твердой фазы.The proposed method solves the problem of conducting solid-phase biological microanalysis and signal registration using long-term luminescent reagents without the stage of removal of unreacted reagents and sample components, i.e. without the stage of washing the solid phase.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение чувствительности, точности анализа и расширение динамического диапазона выявляемых концентраций при одновременном определении в пробе нескольких (множества) аналитов.The technical result achieved by using the invention is to increase the sensitivity, accuracy of the analysis and expand the dynamic range of the detected concentrations while simultaneously determining several (many) analytes in the sample.

Способ может быть использован при индикации в пробе возбудителей опасных инфекционных заболеваний без риска контаминации окружающей среды опасным инфекционным материалом. Способ исключает отмывку несвязавшихся реагентов и связанное с ней образование биоаэрозоля.The method can be used when indicating in the sample the causative agents of dangerous infectious diseases without the risk of environmental contamination with dangerous infectious material. The method eliminates the washing of unbound reagents and the associated formation of bioaerosol.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, также является возможность использования одновременно нескольких длительно люминесцирующих метчиков в высоких концентрациях (10⁹-10¹⁰ наночастиц с комплексонами ионов лантаноидов на пробу или 10-100 нг/мл конъюгата антител с металлопорфиринами) и, соответственно, определение не одного, а нескольких (множество) аналитов в пробе. Предлагаемый способ упрощает процедуру анализа, т.к. позволяет исключить применение комплекта вспомогательного оборудования (вошер, шейкер, дискремувер).The technical result achieved by using the invention is also the possibility of using simultaneously several long luminescent taps in high concentrations (10 ⁹ -10 ¹⁰ nanoparticles with complexones of lanthanide ions per sample or 10-100 ng / ml conjugate of antibodies with metalloporphyrins) and, accordingly, determination not one, but several (many) analytes in the sample. The proposed method simplifies the analysis procedure, because allows to exclude the use of a set of auxiliary equipment (a shader, a shaker, a disk remover).

Поставленная задача решается предлагаемым изобретением.The problem is solved by the invention.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе биологического микроанализа, включающем приготовление твердофазного сорбента к одному или нескольким (множеству) искомых аналитов в оптически прозрачном сосуде, приготовление лигандов, включающих реагенты для биоспецифического связывания искомых аналитов и длительно люминесцирующие соединения, внесение лигандов и пробы с аналитами в оптически прозрачный сосуд с твердофазными сорбентами, инкубацию пробы аналитов с сорбентами и лигандами и регистрацию сигнала длительной люминесценции от комплексов лиганд-аналит-сорбент при облучении сорбентов пучком света, не превышающем площадь сорбента, перед регистрацией сигнала люминесценции в сосуд к реакционной смеси добавляют не смешивающийся с ней раствор-тушитель, имеющий плотность выше плотности пробы, и содержащий вещество, поглощающее свет в области возбуждения и эмиссии люминесценции лигандов.The essence of the invention lies in the fact that in the method of biological microanalysis, including the preparation of a solid-phase sorbent for one or more (many) of the desired analytes in an optically transparent vessel, the preparation of ligands, including reagents for biospecific binding of the desired analytes and long-term luminescent compounds, the introduction of ligands and samples with analytes in an optically transparent vessel with solid-phase sorbents, incubation of an analyte sample with sorbents and ligands and registration of a long-term luminescence signal In the case of ligand – analyte – sorbent complexes, upon irradiating the sorbents with a light beam not exceeding the area of the sorbent, before recording the luminescence signal into the vessel, a non-miscible quencher solution with a density higher than the sample density and containing a substance that absorbs light in areas of ligand excitation and luminescence emission.

За счет более высокой плотности раствора-тушителя содержимое пробы, включая реагенты, несвязанные на твердой фазе в комплекс сорбент-аналит-лиганд, оттесняются от дна оптически прозрачного сосуда слоем раствора-тушителя и сигнал свободного флуорохрома (несвязанного на твердой фазе) полностью оказывается затушенным при прохождении через этот слой возбуждающего света. Раствор-тушитель образует разделительный слой между свободными и связанными лигандами и обеспечивает возможность регистрации люминесценции только связанного лиганда, что позволяет измерять количество аналита в комплексе с сорбентом.Due to the higher density of the quencher solution, the contents of the sample, including reagents unbound on the solid phase into the sorbent-analyte-ligand complex, are displaced from the bottom of the optically transparent vessel by the layer of the quencher solution and the signal of free fluorochrome (unbound on the solid phase) is completely quenched when passing through this layer of exciting light. The quencher solution forms a separation layer between free and bound ligands and provides the ability to register luminescence of only the bound ligand, which makes it possible to measure the amount of analyte in complex with the sorbent.

В качестве раствора - тушителя могут быть использованы перфторполиэфиры низкой вязкости, например ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009), включающие красители (например, гемоглобин или черную тушь), поглощающие в области возбуждения и эмиссии комплексонов ионов лантаноидов (европия, тербия, самария, диспрозия) или металлопорфиринов (с центральными атомами платины и палладия). Красители в составе раствора-тушителя должны иметь концентрацию 10^-2-10^-3 М и молярный коэффициент экстинкции не менее 5×10⁴ Мсм^-1. В качестве раствора-тушителя может быть также использован глицерин, включающий тушитель - тушь черную (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86).As a quenching solution, low viscosity perfluoropolyesters, for example PEF 40/30 (TU 2229-007-54226479-2009), including dyes (for example, hemoglobin or black mascara), which absorb lanthanide ions in the field of excitation and emission, can be used (europium) , terbium, samarium, dysprosium) or metalloporphyrins (with central atoms of platinum and palladium). Dyes in the composition of the quenching solution should have a concentration of 10 ^-2 -10 ^-3 M and a molar extinction coefficient of at least 5 × 10 ⁴ Mcm ^-1 . Glycerin can also be used as a quenching solution, including a quencher - black mascara (article 530-r, TU 6-15-458-86).

Сущность изобретения заключается в том, что лиганд готовят в виде наночастиц диаметром 50-300 нм, которые содержат на поверхности ковалентно связанные биоспецифические реагенты (например, антитела) и включают длительно люминесцирующие комплексоны с ионами европия.The essence of the invention lies in the fact that the ligand is prepared in the form of nanoparticles with a diameter of 50-300 nm, which contain covalently linked biospecific reagents (for example, antibodies) on the surface and include long-term luminescent complexons with europium ions.

Сущность изобретения заключается в том, что лиганд готовят в виде конъюгата антител с металлопорфирином.The essence of the invention lies in the fact that the ligand is prepared in the form of a conjugate of antibodies with metalloporphyrin.

Сущность изобретения заключается в том, что сорбент готовят в виде микрозоны диаметром 0,3-0,4 мм на дне оптически прозрачного сосуда.The essence of the invention lies in the fact that the sorbent is prepared in the form of a microzone with a diameter of 0.3-0.4 mm at the bottom of an optically transparent vessel.

Сущность изобретения заключается в том, что для определения нескольких аналитов на дне оптически прозрачного сосуда готовят сорбенты к каждому аналиту, а в реакционную смесь вносят лиганды к каждому аналиту.The essence of the invention lies in the fact that to determine several analytes at the bottom of an optically transparent vessel, sorbents are prepared for each analyte, and ligands are added to the reaction mixture for each analyte.

Сущность изобретения заключается в том, что реакционная смесь может включать сухое пятно биологического материала на фильтровальной бумаге с экстрагирующим буфером.The essence of the invention lies in the fact that the reaction mixture may include a dry spot of biological material on filter paper with extraction buffer.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемой, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию новизны.The authors are not aware of technical solutions having a combination of features similar to the claimed one, therefore, the claimed invention meets the criterion of novelty.

Примеры выполнения способа, представленные в составе описания изобретения, демонстрируют повышение чувствительности и точности (снижение коэффициента вариации) при количественном измерении аналита (тиротропина) в образцах сухих пятен крови новорожденных и возможность определения инфекционных биологических агентов в широком диапазоне концентраций без дополнительных процедур промывки и высушивания твердой фазы. Это снижает риск появления биологического аэрозоля и заражения людей при проведении экспериментальных работ.The examples of the method presented in the description of the invention demonstrate an increase in sensitivity and accuracy (decrease in the coefficient of variation) in the quantitative measurement of analyte (thyrotropin) in samples of dry blood stains of newborns and the possibility of determining infectious biological agents in a wide range of concentrations without additional washing and drying procedures for solid phase. This reduces the risk of biological aerosol and human infection during experimental work.

Указанный технический результат достигается за счет новых средств, а именно -применения раствора-тушителя, создающего оптически непрозрачную среду между твердой фазой и исследуемой пробой с реагентами, следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию технический уровень.The specified technical result is achieved due to new means, namely, the use of a quencher solution that creates an optically opaque medium between the solid phase and the test sample with reagents, therefore, the present invention meets the technical level criterion.

Изобретение может быть использовано в здравоохранении в лабораторной диагностике широкого спектра инфекционных и соматических заболеваний. В частности, для мониторинга тиреоидной функции щитовидной железы, проведения неонатального скрининга наследственных болезней обмена новорожденных, где в качестве клинического материала используют не только сыворотку или плазму крови, но и микрообразцы пробы в виде сухих пятен крови. Изобретение найдет применение при проведении специфической индикации возбудителей опасных инфекционных заболеваний, т.к. исключает стадии, сопровождающиеся образованием биоаэрозоля, и позволяет кардинально снизить риск заражения персонала при проведении экспериментальных работ.The invention can be used in healthcare in laboratory diagnostics of a wide range of infectious and somatic diseases. In particular, to monitor thyroid function of the thyroid gland, to conduct neonatal screening of hereditary metabolic diseases of newborns, where not only serum or blood plasma is used as clinical material, but also micro-samples in the form of dry blood spots. The invention will find application in carrying out specific indications of pathogens of dangerous infectious diseases, because eliminates the stages accompanied by the formation of bioaerosol, and can dramatically reduce the risk of infection of personnel during experimental work.

Для реализации способа используют зарегистрированные в Росздравнадзоре РФ и серийно выпускаемые биочип-анализаторы ИФИ-03, ИФИ-05 (Производитель ЗАО «ИММУНОСКРИН»). Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.To implement the method, the IFI-03, IFI-05 biochip analyzers registered in Roszdravnadzor of the Russian Federation and commercially available biochip analyzers are used. Therefore, the present invention meets the criterion of industrial applicability.

В предлагаемом способе заявляемые положительные эффекты связаны с раствором -тушителем и обусловлены отделением материала пробы, который не связан на твердой фазе, от образовавшихся на твердой фазе комплексов сорбент-аналит-лиганд.In the proposed method, the claimed positive effects are associated with a quencher solution and are due to the separation of the sample material, which is not bound on the solid phase, from the sorbent-analyte-ligand complexes formed on the solid phase.

Раствор-тушитель, благодаря более высокой плотности и несмешиваемости с материалом пробы, в отличие от способа - прототипа, позволяет кардинально (в 100 раз и более) снизить уровень фоновой люминесценции лигандов, использовать в биологическом микроанализе лиганды в многократно более высоких концентрациях, чем в прототипе и, как следствие, расширить динамический диапазон выявления аналитов, повысить чувствительность и точность измерения.The quencher solution, due to its higher density and immiscibility with the sample material, in contrast to the prototype method, can drastically (100 times or more) reduce the background luminescence level of ligands, use ligands in biological microanalysis at much higher concentrations than in the prototype and, as a result, expand the dynamic range of detection of analytes, increase the sensitivity and accuracy of measurement.

В отличие от прототипа, где невозможно кардинально снизить фоновую люминесценцию свободного лиганда, т.к. тушитель выполняет функцию экрана в области возбуждения лиганда непосредственно в объеме пробы, в предлагаемом способе тушитель находится в объеме разделительного слоя. Оптическая плотность разделительного слоя на несколько порядков выше, чем в прототипе, и люминесценция свободного лиганда отсутствует. Спектр веществ-тушителей может быть существенно шире, чем у прототипа, т.к. к этим красителям, находящимся в разделительном слое и не взаимодействующими с материалом пробы, не предъявляются дополнительные требования, связанные с необходимостью исключения побочных реакций с аналитами и матриксом пробы.In contrast to the prototype, where it is impossible to drastically reduce the background luminescence of the free ligand, because the quencher performs the function of a screen in the ligand excitation region directly in the sample volume; in the proposed method, the quencher is in the volume of the separation layer. The optical density of the separation layer is several orders of magnitude higher than in the prototype, and the luminescence of the free ligand is absent. The range of extinguishing agents can be significantly wider than that of the prototype, because these dyes that are in the separation layer and do not interact with the sample material do not have additional requirements associated with the need to exclude adverse reactions with analytes and the sample matrix.

Последовательность операций предлагаемого способаThe sequence of operations of the proposed method

1. Приготовление сорбентов для биоспецифического связывания аналитов на твердой фазе (дне) оптически прозрачного сосуда.1. Preparation of sorbents for biospecific binding of analytes on the solid phase (bottom) of an optically transparent vessel.

3. Внесение в составе буферного раствора лигандов, меченых длительно люминесцирующими метчиками.3. The introduction of ligands labeled with long-luminescent taps in the buffer solution.

4. Инкубация пробы с лигандами в буферном растворе.4. Incubation of the sample with ligands in a buffer solution.

5. Внесение раствора-тушителя перед регистрацией сигнала люминесценции для разделения пробы с буферным раствором от комплексов сорбент-аналит-лиганд на твердой фазе оптически прозрачных сосудов.5. The introduction of a quencher solution before recording the luminescence signal to separate the sample with the buffer solution from the sorbent-analyte-ligand complexes on the solid phase of optically transparent vessels.

6. Регистрация люминесцентного сигнала в режиме пространственного, временного и спектрального разрешения путем сканирования поверхности дна оптически прозрачного сосуда с иммобилизованными длительно люминесцирующими комплексами сорбент-аналит-лиганд.6. Registration of a luminescent signal in the spatial, temporal and spectral resolution mode by scanning the bottom surface of an optically transparent vessel with immobilized long-luminescent sorbent-analyte-ligand complexes.

В общем случае, к раствору-тушителю, обеспечивающему разделение материала пробы от комплексов сорбент-аналит-лиганд и тушение люминесценции несвязанных на твердой фазе флуорохромов, предъявляются следующие требования:In the general case, the quencher solution providing separation of the sample material from the sorbent-analyte-ligand complexes and quenching of the luminescence of fluorochromes unbound on the solid phase has the following requirements:

- раствор - тушитель должен иметь плотность выше плотности пробы клинического образца, не смешиваться и не растворять материал пробы, быть химически нейтральным, не иметь собственной длительной люминесценции в области эмиссии лигандов, меченых флуорохромами, и не приводить к десорбции комплексов сорбент-аналит-лиганд;- a solution - a quencher should have a density higher than the density of a sample of a clinical sample, not mix and dissolve the sample material, be chemically neutral, have no proper long-term luminescence in the field of emission of ligands labeled with fluorochromes, and not lead to desorption of sorbent-analyte-ligand complexes;

- вещество-тушитель в составе раствора-тушителя должно иметь молярный коэффициент экстинкции около 10⁴-10⁵ единиц оптической плотности в слое толщиной 1 см в полосе возбуждения (365-375 нм) и эмиссии флуорохромов (600-700 нм).- the quencher substance in the quencher solution should have a molar extinction coefficient of about 10 ⁴ -10 ⁵ optical density units in a 1 cm thick layer in the excitation band (365-375 nm) and fluorochrome emission (600-700 nm).

Для реализации способа используют люминесцентный сканер, имеющий фокусировку на дно оптически прозрачного сосуда с сорбентом. Сканер должен иметь площадь сканирующего луча, которая не превышает площадь микрозоны сорбента. В этом случае относительный вклад в люминесценцию от материала оптически прозрачного сосуда минимален.To implement the method, a luminescent scanner is used having focus on the bottom of an optically transparent vessel with a sorbent. The scanner must have a scanning beam area that does not exceed the microzone area of the sorbent. In this case, the relative contribution to the luminescence from the material of the optically transparent vessel is minimal.

О наличии искомого аналита в пробе судят по превышению люминесцентного сигнала при возбуждении люминесценции в зоне сорбента по сравнению с уровнем сигнала при возбуждении вне зоны сорбента.The presence of the desired analyte in the sample is judged by the excess of the luminescence signal upon excitation of luminescence in the sorbent zone compared to the signal level upon excitation outside the sorbent zone.

В качестве вещества с высокой оптической плотностью поглощения могут быть использованы различные нейтральные красители и суспензии микро- и наночастиц, включающие сильно поглощающие вещества, например, тушь, гемоглобин, красители метиленовые и т.п.As a substance with a high optical absorption density, various neutral dyes and suspensions of micro- and nanoparticles can be used, including strongly absorbing substances, for example, mascara, hemoglobin, methylene dyes, etc.

На фиг. 1 схематично представлен ход выполнения способа на модели пробы в виде сухого пятна крови новорожденного при определении тиреотропного гормона и тироксина.In FIG. 1 schematically shows the progress of the method on a sample model in the form of a dry spot in the blood of a newborn in determining thyroid stimulating hormone and thyroxine.

Стадия - А (до внесения раствора-тушителя)Stage - A (before making the quencher solution)

Стадия - В (после внесения раствора -тушителя)Stage - B (after making the quencher solution)

1.1 - дно лунки полистиролового микропланшета1.1 - the bottom of the well polystyrene microplate

1.2 - иммобилизованные на дне лунки антитела к тиреотропному гормону1.2 - antibodies to thyroid-stimulating hormone immobilized at the bottom of the hole

1.3 - иммобилизованные на дне лунки конъюгаты тироксина с бычьим сывороточным альбумином1.3 - bovine serum albumin conjugates of thyroxine immobilized at the bottom of the well

1.4 - образец сухого пятна крови новорожденного на фильтровальной бумаге №903 (Ватман) диаметром 3,2 мм1.4 - a sample of a dry spot of blood of a newborn on filter paper No. 903 (Whatman) with a diameter of 3.2 mm

1.5 - буфер анализа1.5 - analysis buffer

1.6 - наночастицы, покрытые антителами к тиреотропному гормону и включающие комплексоны с ионами европия для определения тиреотропного гормона1.6 - nanoparticles coated with antibodies to thyroid-stimulating hormone and including complexones with europium ions to determine thyroid-stimulating hormone

1.7 - конъюгаты специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину1.7 - conjugates of specific antibodies with platinoproporphyrin to thyroxine

1.8 - тиротропин, экстрагированный из пятна крови буфером анализа1.8 - thyrotropin extracted from the blood stain with assay buffer

1.9 - тироксин, экстрагированный из пятна крови буфером анализа1.9 - thyroxin extracted from blood stain with assay buffer

1.10 - комплексы наночастиц с тиротропином1.10 - complexes of nanoparticles with thyrotropin

1.11 - комплексы конюгатов специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину с тироксином1.11 - complexes of conjugates of specific antibodies with platinocoproporphyrin to thyroxine with thyroxine

1.12 - комплексы наночастиц с тиротропином, связанные на дне лунки с антителами к тиреотропному гормону1.12 - complexes of nanoparticles with thyrotropin bound at the bottom of the well with antibodies to thyroid stimulating hormone

1.13 - комплексы конюгатов специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину с тироксином, связанные на дне лунки с конъюгатом тироксина с бычьим сывороточным альбумином1.13 - complexes of conjugates of specific antibodies with platinocoproporphyrin to thyroxine with thyroxine, connected at the bottom of the hole with thyroxine conjugate with bovine serum albumin

1.14 - раствор-тушитель1.14 - quencher solution

1.15 - вещества, поглощающие свет в растворе - тушителе1.15 - substances that absorb light in a quencher solution

1.16 - толщина прослойки из раствора - тушителя1.16 - the thickness of the layer of the solution - quencher

На фиг. 2 представлены графики зависимости уровня сигнала люминесценции от концентрации лигандов (наночастиц с ионами европия (IgG-НЧ) и конъюгатов антител с платинокопропорфирином (IgG-PtKJI) в лунках полистиролового прозрачного микропланшета.In FIG. Figure 2 presents plots of the dependence of the luminescence signal on the concentration of ligands (nanoparticles with europium ions (IgG-NP) and conjugates of antibodies with platinum coproporphyrin (IgG-PtKJI) in the wells of a polystyrene transparent microplate.

(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация наночастиц (частиц/мл) и конъюгатов антител с платинакопропорфирином (нг/мл).(The ordinate axis is the relative level of the luminescence signal, the abscissa axis is the concentration of nanoparticles (particles / ml) and conjugates of antibodies with platinum acroporphyrin (ng / ml).

Объем пробы (буфера анализа) в лунках микропланшета - 60 мкл.The sample volume (assay buffer) in the wells of the microplate is 60 μl.

Наночастицы с ионами европия диаметром 50 нм включают до 2000 комплексов ионов европия и до 150 молекул специфического иммуноглобулина. Конъюгаты с платинакопропорфирином включают до 5 молекул платинакопропорфирина на одну молекулу специфического иммуноглобулина.Nanoparticles with europium ions with a diameter of 50 nm include up to 2000 complexes of europium ions and up to 150 molecules of a specific immunoglobulin. Conjugates with platinum acroporphyrin include up to 5 molecules of platinum acroporphyrin per molecule of specific immunoglobulin.

2 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации лиганда (наночастиц с ионами европия) без добавления раствора - тушителя для смеси из 4-х видов лигандов для выявления 4-х аналитов: антигенов возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза.2 - Graph of the luminescence signal versus ligand concentration (nanoparticles with europium ions) without adding a quenching solution for a mixture of 4 types of ligands to detect 4 analytes: antigens of plague, tularemia, anthrax and brucellosis.

3 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации лиганда (наночастиц с ионами европия) для смеси из 4-х видов лигандов для выявления аналитов: антигенов возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза в присутствии раствора -тушителя.3 - A graph of the luminescence signal versus ligand concentration (nanoparticles with europium ions) for a mixture of 4 types of ligands to identify analytes: plague, tularemia, anthrax and brucellosis antigens in the presence of a quencher solution.

4 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации конъюгата иммуноглобулина G с платинакопропорфирином без добавления раствора - тушителя.4 - A graph of the dependence of the luminescence signal on the concentration of the conjugate of immunoglobulin G with platinum acroporphyrin without the addition of a quencher solution.

5 - График зависимости сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина G с платинакопропорфирином в присутствии раствора - тушителя.5 - Graph of the signal on the concentration of the conjugate of immunoglobulin G with platinum accumulative in the presence of a quencher solution.

Состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.The composition of the solution - quencher: black mascara (article 530-r, TU 6-15-458-86) 1/5 part, glycerin 4/5.

Объем раствора - тушителя в лунках микропланшета - 30 мклThe volume of the solution - quencher in the wells of the microplate is 30 μl

На фиг. 3 представлены графики зависимости уровней сигналов люминесценции ионов европия от комплексов сорбент-аналит-лиганд при сканировании дна лунок полистироловых микропланшетов при выявлении двух аналитов: фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигена клеток возбудителя туляремии в различных концентрациях с помощью предлагаемого способа.In FIG. Figure 3 presents graphs of the dependence of the levels of luminescence signals of europium ions on sorbent-analyte-ligand complexes when scanning the bottom of polystyrene microplate wells when two analytes were detected: the plague microbe fraction F1 (Y. pestis) and the tularemia pathogen cell antigen in various concentrations using the proposed method.

6 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления Ф1 чумного микроба от концентрации фракции Ф1 (нг/мл).6 - Graph of the signal level in the microzone for the detection of plague microbe F1 from the concentration of the F1 fraction (ng / ml).

7 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена туляремийного микроба от концентрации корпускулярного антигена возбудителя (м.т./мл).7 - A graph of the dependence of the signal level in the microzone to detect the tularemia microbial antigen on the concentration of the corpuscular antigen of the pathogen (bw / ml).

8 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена сибиреязвенного микроба.8 - A graph of the dependence of the signal level in the microzone to detect the antigen of the anthrax microbe.

9 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена бруцелл.9 - A graph of the signal level in the microzone to detect brucella antigen.

Объем раствора - тушителя в лунках микропланшета - 30 мкл.The volume of the solution - quencher in the wells of the microplate is 30 μl.

Концентрация наночастиц с характеристикой, указанной на фиг. 1 для каждого из 4-х видов лигандов -10⁹частиц/лунка.The concentration of nanoparticles with the characteristic indicated in FIG. 1 for each of the 4 types of ligands -10 ⁹ particles / well.

На фиг. 4 представлены калибровочные графики определения тиреотропного гормона в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 10) и способом -прототипом (график 11).In FIG. 4 shows calibration graphs for determining thyroid stimulating hormone in dry blood spots of newborns by the proposed method (graph 10) and the prototype method (graph 11).

(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация гормона тиротропина мкМЕ/мл крови). Концентрация наночастиц -10⁸ частиц/лунка.(The ordinate axis is the relative level of the luminescence signal, the abscissa axis is the concentration of the thyrotropin hormone μMU / ml of blood). The concentration of nanoparticles is -10 ⁸ particles / well.

График 10 получен при использовании раствора - тушителя по предлагаемому способу (состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.)Schedule 10 was obtained using a quencher solution according to the proposed method (solution-quencher composition: black mascara (article 530-p, TU 6-15-458-86) 1/5 part, glycerin 4/5.)

График 11 получен при использовании способа-прототипа, где в качестве вещества -тушителя используется АНС (1,8 -анилиннафталенсульфонат в концентрации 5 10^-3 М).Schedule 11 was obtained using the prototype method, where ANS (1,8-aniline naphthalenesulfonate at a concentration of 5 10 ^-3 M) is used as a quencher substance.

На фиг. 5 представлен калибровочный график определения тироксина в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 12) и прототипом (график 13).In FIG. 5 shows a calibration graph for the determination of thyroxine in dry blood spots of newborns by the proposed method (graph 12) and the prototype (graph 13).

(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация гормона тироксина нг/мл крови).(The ordinate axis is the relative level of the luminescence signal, the abscissa axis is the concentration of the thyroxin hormone ng / ml of blood).

Объем пробы (буфера анализа) в лунках микропланшета - 60 мклThe sample volume (analysis buffer) in the wells of the microplate is 60 μl

Концентрация конъюгата наночастиц, покрытых моноклональными антителами к тиротропину-10⁸ частиц/лунка.The concentration of the conjugate of nanoparticles coated with monoclonal antibodies to thyrotropin-10 ⁸ particles / well.

График 12 получен при использовании раствора - тушителя по предлагаемому способу (состав раствора - тушителя: гемоглобин из крови человека 10 мг/мл, перфторполиэфир ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009))Schedule 12 was obtained using a quencher solution according to the proposed method (composition of the quencher solution: hemoglobin from human blood 10 mg / ml, perfluoropolyether PEF 40/30 (TU 2229-007-54226479-2009))

График 13 (прототип) получен при использовании в качестве вещества - тушителя АНС (1,8 -анилиннафталенсульфонат в концентрации 5 10^-3М)Schedule 13 (prototype) was obtained using ANS as a quencher (1,8-aniline naphthalenesulfonate at a concentration of 5 10 ^-3 M)

Ход проведения анализа поясняется фиг. 1.The progress of the analysis is illustrated in FIG. 1.

В оптически прозрачный сосуд (фиг. 1, стадия А) - на дно лунки полистиролового микропланшета - 1.1 с иммобилизованными сорбентами (микрозонами) из антител к тиреотропному гормону -1.2 и конъюгата тироксина с бычьим сывороточным альбумином 1.3 вносят пробу в виде образца сухого пятна крови новорожденного на фильтровальной бумаге №903 (Ватман) диаметром 3,2 мм - 1.4, вносят буфер анализа - 1.5, включающий компоненты для экстракции аналитов из пятна крови и лиганды в виде наночастиц, покрытых антителами к тиреотропному гормону и включающих комплексоны с ионами европия для определения тиреотропного гормона - 1.6 и конъюгаты специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину - 1.7.In the optically transparent vessel (Fig. 1, stage A), to the bottom of the well of a polystyrene microplate, 1.1, immobilized sorbents (microzones) from antibodies to thyroid stimulating hormone -1.2 and thyroxin conjugate with bovine serum albumin 1.3, a sample is made in the form of a sample of a dry blood spot of a newborn on filter paper No. 903 (Whatman) with a diameter of 3.2 mm — 1.4, add the assay buffer — 1.5, including components for the extraction of analytes from the blood stain and ligands in the form of nanoparticles coated with antibodies to thyroid-stimulating hormone and including complexons with and europium us to determine thyrotropin - 1.6 and conjugates with antibodies specific to thyroxine platinokoproporfirinom - 1.7.

В результате биоспецифических взаимодействий происходит связывание аналитов (тиротропина - 1.8 и тироксина - 1.9) с соответствующими лигандами (1.6 и 1.7) с образованием соответствующих комплексов аналит-лиганд к тиротропину - 1.10 и тироксину - 1.11 и последующей иммуносорбции в соответствующих микрозонах к тиротропину - 1.2 и тироксину - 1.3 конъюгатов с образованием в сэндвич анализе комплексов сорбент-аналит-лиганд (комплексы для тиротропина - 1.12), и в конкурентном анализе комплексы сорбент-лиганд (для тироксина - 1.13).As a result of biospecific interactions, the binding of analytes (thyrotropin 1.8 and thyroxine 1.9) to the corresponding ligands (1.6 and 1.7) with the formation of the corresponding complexes of analyte ligand to thyrotropin 1.10 and thyroxine 1.11 and subsequent immunosorption in the corresponding microzones to thyrotropin 1.2 and thyroxine - 1.3 conjugates with the formation of sorbent-analyte-ligand complexes in a sandwich analysis (complexes for thyrotropin - 1.12), and in a competitive analysis sorbent-ligand complexes (for thyroxine - 1.13).

После инкубации пробы в течение 4-х часов перед измерением сигнала люминесценции в лунку микропланшета добавляют раствор - тушитель - 1.14 (фиг. 1, стадия В), не смешивающийся с материалом пробы, имеющий плотность выше плотности пробы и включающий вещества, поглощающие в области возбуждения и эмиссии флуорохрома - 1.15. При этом, за счет разности в плотностях между водной фазой анализируемой пробы и раствора-тушителя, происходит образование прослойки - 1.16 (стрелкой указана толщина слоя раствора - тушителя) между твердой фазой - 1.1 и пробой с ее компонентами и свободными лигандами 1.4 -1.7. При этом происходит оттеснение от дна материала пробы, содержащей буфер анализа - 1.5, пятна крови - 1.4, свободные лиганды - 1.6, 1.7 и их конъюгаты - 1.10 и 1.11.After the sample has been incubated for 4 hours, before the measurement of the luminescence signal, a quencher solution 1.14 (Fig. 1, stage B) is added to the well of the microplate. It is immiscible with the sample material, having a density higher than the density of the sample and including substances that absorb in the field of excitation and emissions of fluorochrome - 1.15. At the same time, due to the difference in densities between the aqueous phase of the analyzed sample and the quencher solution, a layer is formed - 1.16 (the arrow indicates the thickness of the solution - quencher layer) between the solid phase - 1.1 and the sample with its components and free ligands 1.4 -1.7. In this case, the sample containing the analysis buffer — 1.5, blood stains — 1.4, free ligands — 1.6, 1.7, and their conjugates — 1.10 and 1.11, are pushed out from the bottom of the material.

Регистрацию сигнала люминесценции осуществляют на приборе ИФИ-05 (ЗАО ИММУНОСКРИН) путем сканирования дна лунок микропланшета лучом света диаметром 120 мкм, не превышающим размер микрозон с сорбентами (0,3-0,4 мм).The luminescence signal is recorded on an IFI-05 device (CJSC IMMUNOSKRIN) by scanning the bottom of the microplate wells with a 120 μm light beam not exceeding the size of microzones with sorbents (0.3-0.4 mm).

Сигнал люминесценции от комплексонов ионов европия регистрируют в стробоскопическом режиме с длительностью импульсов возбуждения 100 мкс, временем задержки между актом возбуждения и приемом сигнала люминесценции t_d - 300 мкс, длительностью строба регистрации t_g - 400 мкс на длине волны 613-615 нм при возбуждении на длине волны 365-375 нм.The luminescence signal from europium ion complexons is recorded in a stroboscopic mode with an excitation pulse duration of 100 μs, a delay time between the excitation event and reception of a luminescence signal t _d - 300 μs, a recording strobe time t _g - 400 μs at a wavelength of 613-615 nm when excited at wavelength 365-375 nm.

Сигнал люминесценции от платинакопропорфирина регистрируют в стробоскопическом режиме с длительностью импульсов возбуждения 10 мкс, временем задержки между актом возбуждения и приемом сигнала люминесценции t_d- 5 мкс, длительностью строба регистрации t_g - 50 мкс на длине волны 645-655 нм при возбуждении на длине волны 365-375 нм.The luminescence signal from platinum acroporphyrin is recorded in a stroboscopic mode with an excitation pulse duration of 10 μs, a delay time between the act of excitation and reception of a luminescence signal t _d - 5 μs, a recording strobe time t _g - 50 μs at a wavelength of 645-655 nm when excited at a wavelength 365-375 nm.

Фиг. 2 иллюстрирует зависимость сигнала люминесценции наночастиц с ионами европия (IgG-НЧ) -2 и конъюгатов антител с платинакопропорфирином (IgG-PtKTI) - 4 от их концентрации в пробе и эффективность тушения люминесценции IgG-НЧ - 3 и IgG-PtKTI - 5 при добавлении раствора- тушителя во всем диапазоне используемых концентраций IgG-НЧ и IgG-PtKTI при толшине слоя раствора тушителя 1 мм. Из представленных графиков следует, что раствор - тушитель практически полностью тушит люминесценцию комплексов ионов европия и платинакопропорфирина, находяшихся в объеме пробы.FIG. 2 illustrates the dependence of the luminescence signal of nanoparticles with europium ions (IgG-NP) -2 and conjugates of antibodies with platinum-proporfirin (IgG-PtKTI) - 4 on their concentration in the sample and the efficiency of luminescence quenching of IgG-NP-3 and IgG-PtKTI-5 when adding a quencher solution in the entire range of used concentrations of IgG-NP and IgG-PtKTI with a layer thickness of a quencher solution of 1 mm. From the graphs presented it follows that the quencher solution almost completely extinguishes the luminescence of complexes of europium ions and platinum accumulate in the sample volume.

Фиг. 3 иллюстрирует выявление предлагаемым способом одновременно двух аналитов: фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигена клеток возбудителя туляремии при их различном содержании в исследуемых пробах.FIG. 3 illustrates the identification by the proposed method of simultaneously two analytes: the F1 fraction of the plague microbe (Y. pestis) and the antigen of tularemia pathogen cells at their different contents in the studied samples.

Специфичность выявления предлагаемым способом искомых аналитов подтверждается тем, что сигналы люминесценции (при отсутствии в пробе антигенов клеток возбудителей сибирской язвы и бруцеллеза) наблюдаются только в зонах специфической сорбции фракции Ф1 чумного микроба и антигена клеток туляремийного микроба.The specificity of the detection of the desired analytes by the proposed method is confirmed by the fact that luminescence signals (in the absence of antigenic anthrax and brucellosis pathogens in the sample) are observed only in the zones of specific sorption of the F1 fraction of the plague microbe and the antigen of the tularemia microbe cells.

Сигналы люминесценции в микрозонах для сорбции антигенов клеток сибирской язвы и антигенов бруцелл остаются на низком уровне, эквивалентном уровню фона. Наличие в пробе фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигенов клеток возбудителя туляремии сопровождается ростом сигнала в соответствующих микрозонах пропорционально концентрации этих аналитов.Luminescence signals in microzones for sorption of antigens of anthrax cells and brucella antigens remain at a low level equivalent to the background level. The presence in the sample of the F1 fraction of the plague microbe (Y. pestis) and antigens of tularemia pathogen cells is accompanied by an increase in the signal in the corresponding microzones in proportion to the concentration of these analytes.

Фиг. 4 иллюстрирует определение тиреотропного гормона в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 10) и способом- прототипом (график 11). Из представленных на фиг. 4 данных следует, что предлагаемый способ обеспечивает близкую к линейной зависимость между сигналом люминесценции и концентрацией искомого аналита. Для прототипа уровень сигнала люминесценции меняется только в 2,6 раза при изменении концентрации более чем на 4 порядка. Предлагаемый способ позволяет кардинально снизить уровень фона по сравнению с прототипом и за счет использования более высоких концентраций лиганда существенно увеличить чувствительность.FIG. 4 illustrates the determination of thyroid-stimulating hormone in dry blood stains of newborns by the proposed method (graph 10) and the prototype method (graph 11). From those shown in FIG. 4 data it follows that the proposed method provides a close to linear relationship between the luminescence signal and the concentration of the desired analyte. For the prototype, the luminescence signal level changes only 2.6 times when the concentration changes by more than 4 orders of magnitude. The proposed method allows to drastically reduce the background level compared to the prototype and through the use of higher concentrations of the ligand to significantly increase the sensitivity.

Результаты, полученные при анализе клинических образцов предлагаемым способом и прототипом, представлены в сводной таблице. Коэффициент вариации рассчитан для пяти повторных измерений каждой анализируемой пробы. Из данных таблицы следует, что предлагаемый способ позволяет расширить диапазон выявляемых концентраций и значительно снизить вариабельность результатов измерений по сравнению с прототипом.The results obtained in the analysis of clinical samples of the proposed method and prototype are presented in the summary table. The coefficient of variation is calculated for five repeated measurements of each analyzed sample. From the table it follows that the proposed method allows to expand the range of detectable concentrations and significantly reduce the variability of the measurement results in comparison with the prototype.

Фиг. 5 иллюстрирует возможность существенного повышения чувствительности и точности определения гормона предлагаемым способом по сравнению с прототипом при использовании в качестве раствора-тушителя раствора перфторполиэфира ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009) с добавлением тушителя гемоглобина из крови человека. Из представленных данных (график 12 для предлагаемого способа и график 13 для прототипа) следует, что определение тироксина в конкурентном анализе предлагаемым способом существенно точнее, чем прототипом, т.к. уровень фоновой люминесценции, обусловленный свободным лигандом в пробах с высокой концентрацией тироксина (более 200 нг/мл), ниже не менее чем в 10-20 раз. При этом сигнал люминесценции в заявляемом способе меняется от 120000 отн.ед. при нулевой концентрации аналита до 150 отн.ед. при концентрации тироксина 200 нг/мл, в то время как для прототипа изменение сигнала происходит от 11000 отн.ед. до 9000 отн.ед., что связано с фоновой люминесценцией свободного лиганда, которая не может быть полностью затушена.FIG. 5 illustrates the possibility of a significant increase in the sensitivity and accuracy of hormone determination by the proposed method compared to the prototype when using a solution of PEF 40/30 perfluoropolyether solution (TU 2229-007-54226479-2009) with the addition of a hemoglobin quencher from human blood as a quencher solution. From the presented data (graph 12 for the proposed method and graph 13 for the prototype) it follows that the determination of thyroxine in the competitive analysis of the proposed method is significantly more accurate than the prototype, because the level of background luminescence due to the free ligand in samples with a high concentration of thyroxine (more than 200 ng / ml) is lower by at least 10–20 times. In this case, the luminescence signal in the present method varies from 120,000 rel. at zero analyte concentration up to 150 rel. at a thyroxine concentration of 200 ng / ml, while for the prototype, the signal change occurs from 11000 relative units up to 9000 relative units, which is associated with the background luminescence of the free ligand, which cannot be completely quenched.

Claims

1. A method of conducting biological microanalysis, including the preparation of solid-phase sorbents for the desired analytes in the form of microzones in an optically transparent vessel and ligands associated with long-term luminescent compounds, the biospecific binding of sample analytes and ligands in the reaction mixture in the vessel with sorbents and signal registration for a long time luminescence from the ligand-analyte-sorbent complexes upon irradiation of the sorbent with a light beam with a beam diameter not exceeding the area of the sorbent, different by the fact that before measuring luminescence, a quenching solution that is not miscible with it and has a density higher than the density of the sample and contains a substance that absorbs light in the region of ligand excitation and emission is added to the reaction vessel.

2. The method according to p. 1, characterized in that perfluoropolyethers are used as a quenching solution.

3. The method according to p. 1, characterized in that glycerin is used as a quenching solution.

4. The method according to claim 1, characterized in that mascara is used as a substance having intense light absorption in the region of ligand excitation and luminescence emission in the quencher solution.

5. The method according to p. 1, characterized in that non-luminescent dyes with a molar absorption coefficient in the field of ligand excitation and emission of not less than 5 are used as a substance having intense light absorption in the ligand excitation and luminescence emission region of the quencher solution. × 10 ^-4 M at a concentration of 5-10 g / l.

6. The method according to p. 1, characterized in that the ligand is prepared in the form of nanoparticles with a diameter of 50-300 nm, which contain covalently bonded biospecific reagents on the surface and include long-term luminescent complexons with europium ions.

7. The method according to p. 1, characterized in that the ligand is prepared in the form of a conjugate of antibodies with metalloporphyrin with a central atom of platinum or palladium.

8. The method according to p. 1, characterized in that the sorbents are prepared in the form of microzones with a diameter of 0.3-0.4 mm at the bottom of an optically transparent vessel.

9. The method according to p. 1, characterized in that for the determination of several analytes, sorbents are prepared for each analyte, and the reaction mixture includes ligands for each of them.

10. The method according to p. 1, characterized in that the reaction mixture may include a dry spot of biological material on filter paper with extraction buffer.