RU2795855C2 - Abc transporters for highly efficient production of rebaudiosides - Google Patents
Abc transporters for highly efficient production of rebaudiosides Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795855C2 RU2795855C2 RU2021124655A RU2021124655A RU2795855C2 RU 2795855 C2 RU2795855 C2 RU 2795855C2 RU 2021124655 A RU2021124655 A RU 2021124655A RU 2021124655 A RU2021124655 A RU 2021124655A RU 2795855 C2 RU2795855 C2 RU 2795855C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- leu
- ser
- ile
- val
- ala
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ1. CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATION
В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки на патент США №62/796 228, поданной 24 января 2019 г., озаглавленной «АВС-ТРАНСПОРТЕРЫ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ПРОИЗВОДСТВА РЕБАУДИОЗИДОВ», раскрытие которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.This application claims the benefit of U.S. Provisional Application No. 62/796,228, filed Jan. 24, 2019, entitled "ABS TRANSPORTERS FOR HIGH-EFFICIENCY REBAUDIOSIDES", the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
2. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ2. FIELD OF TECHNOLOGY
Настоящее раскрытие относится к конкретным ABC-транспортерам, клеткам-хозяевам, содержащим их, и способам их использования для продукции стевиола и/или ребаудиозидов, включая ребаудиозид D и ребаудиозид М.The present disclosure relates to specific ABC transporters, host cells containing them, and methods of using them to produce steviol and/or rebaudiosides, including rebaudioside D and rebaudioside M.
3. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ3. GENERAL
[0001] Желательно, чтобы подсластители с пониженной калорийностью, полученные из натуральных источников, ограничивали воздействие повышенного потребления сахара на здоровье. Растение стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) производит множество сладких на вкус гликозилированных дитерпенов, называемых гликозидами стевиола. Из всех известных стевиоловых гликозидов Reb М обладает наивысшей эффективностью (примерно в 200-300 раз слаще сахарозы) и имеет наиболее привлекательный вкусовой профиль. Однако Reb М вырабатывается растением стевия только в незначительных количествах и составляет небольшую часть от общего содержания стевиоловых гликозидов (<1,0%), что делает нецелесообразным выделение Reb М из листьев стевии. Необходимы альтернативные методы получения Reb М. Одним из таких подходов является применение синтетической биологии для создания микроорганизмов (например, дрожжей), которые производят большие количества Reb М из устойчивых источников сырья.[0001] Desirably, reduced calorie sweeteners derived from natural sources limit the health effects of increased sugar intake. The stevia plant (Stevia rebaudiana Bertoni) produces a variety of sweet-tasting glycosylated diterpenes called steviol glycosides. Of all known steviol glycosides, Reb M has the highest potency (approximately 200-300 times sweeter than sucrose) and has the most attractive flavor profile. However, Reb M is produced by the stevia plant only in small amounts and constitutes a small part of the total content of steviol glycosides (<1.0%), which makes it impractical to isolate Reb M from stevia leaves. Alternative methods for obtaining Reb M are needed. One such approach is the use of synthetic biology to create microorganisms (eg yeast) that produce large quantities of Reb M from sustainable sources of raw materials.
[0002] Для экономичного производства продукта с использованием синтетической биологии каждый этап биоконверсии сырья в продукт должен иметь высокую эффективность преобразования (в идеале>90%). При разработке дрожжей для производства Reb М мы отметили, что цитозольное накопление Reb М подавляет метаболический путь стевиоловых гликозидов, сконструированный в дрожжах, тем самым ограничивая общий выход цикла ферментации. Это подавление, вероятно, связано с ингибированием продукта или ингибированием конечным продуктом одного или нескольких ферментов, участвующих в биосинтезе стевиоловых гликозидов. Соответственно, новые механизмы снятия ингибирования продукта необходимы для повышения эффективности преобразования биосинтетического производства Reb М.[0002] For economical production of a product using synthetic biology, each step in the bioconversion of raw materials into a product must have a high conversion efficiency (ideally >90%). In developing yeast for the production of Reb M, we noted that the cytosolic accumulation of Reb M suppresses the metabolic pathway of steviol glycosides engineered in yeast, thereby limiting the overall yield of the fermentation cycle. This inhibition is likely due to inhibition of the product or inhibition by the end product of one or more of the enzymes involved in the biosynthesis of steviol glycosides. Accordingly, new mechanisms for removing product inhibition are needed to improve the conversion efficiency of the biosynthetic production of Reb M.
4. РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ4. DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0003] В настоящем документе представлены генетически модифицированные клетки-хозяева, композиции и способы для улучшенного продуцирования Reb М. Эти композиции и способы частично основаны на экспрессии определенных гетерологических АВС-транспортеров в клетках-хозяевах, которые были генетически модифицированы для получения стевиоловых гликозидов, таких как Reb М. Эти ABC-транспортеры способны переносить определенные стевиоловые гликозиды, предпочтительно Reb М и/или родственный высокомолекулярный стевиолгликозид ребаудиозид D (Reb D), из цитозоля либо во внеклеточное пространство, либо в просвет субклеточных органелл, например, дрожжевую вакуоль. Секвестрация некоторых стевиоловых гликозидов, таких как Reb D и Reb М, увеличивает эффективность метаболического пути стевиоловых гликозидов за счет снятия ингибирования продукта, вызванного накоплением стевиоловых гликозидов.[0003] Genetically modified host cells, compositions and methods for improved production of Reb M are provided herein. These compositions and methods are based in part on the expression of certain heterologous ABC transporters in host cells that have been genetically modified to produce steviol glycosides such as as Reb M. These ABC transporters are capable of transporting certain steviol glycosides, preferably Reb M and/or the related high molecular weight steviol glycoside rebaudioside D (Reb D), from the cytosol either into the extracellular space or into the lumen of subcellular organelles such as the yeast vacuole. Sequestration of certain steviol glycosides, such as Reb D and Reb M, increases the efficiency of the steviol glycoside metabolic pathway by removing product inhibition caused by accumulation of steviol glycosides.
[0004] В одном аспекте изобретения в настоящем документе представлены генетически модифицированные клетки-хозяева и способы их использования для получения промышленно полезных соединений. В одном аспекте в настоящем документе представлена генетически модифицированная клетка-хозяин, способная продуцировать один или более стевиоловых гликозидов, где клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую ABC-транспортер, аминокислотная последовательность которого имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательности аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей со следующими идентификаторами: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30.[0004] In one aspect of the invention, provided herein are genetically modified host cells and methods for using them to produce industrially useful compounds. In one aspect, provided herein is a genetically modified host cell capable of producing one or more steviol glycosides, wherein the host cell contains a heterologous nucleic acid encoding an ABC transporter whose amino acid sequence has at least 80% sequence identity to the amino acid sequence selected from sequences with the following identifiers: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID: 28, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30.
[0005] В одном варианте изобретения ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей со следующими идентификаторами: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID. NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30. В другом варианте осуществления генетически модифицированные клетки-хозяева по изобретению содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие геранилгеранилпирофосфатсинтазу (GGPPS), энт-копалилпирофосфатсинтазу (CPS), энт-кауренсинтазу (KS), энт-каурен-19-оксидазу (КО), 13-гидроксилазу энт-кауреновой кислоты (КАН), цитохром р450 редуктазу (CPR) и одну или несколько УДФ-глюкозилтрансфераз (UGT). В дополнительном варианте осуществления одна или несколько УДФ-глюкозилтрансфераз (UGT) выбраны из EUGT11. UGT85C2, UGT74G1, UGT91D like3, UGT76G1 и UGT40087. В дополнительном варианте осуществления изобретения геранилгеранилпирофосфатсинтаза (GGPPS) имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 9, энт-копалилпирофосфатсинтаза (CPS) имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 10, энт-кауренсинтаза (KS) имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 11, энт-каурен-19-оксидаза (КО) имеет аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 12, 13-гидроксилаза энт-кауреновой кислоты (КАН) имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13, цитохром р450 редуктаза (CPR) имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, и одна или несколько УДФ-глюкозилтрансфераз (UGT) имеют аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотой последовательностью, выбранная из группы, состоящей из последовательностей со следующими идентификаторами: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27.[0005] In one embodiment of the invention, the ABC transporter has an amino acid sequence having a sequence selected from the group consisting of sequences with the following identifiers: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQID. NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 30. In another embodiment, the genetically modified host cells of of the invention contain nucleic acids encoding geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS), ent-copalyl pyrophosphate synthase (CPS), ent-kaurene synthase (KS), ent-kaurene-19-oxidase (KO), ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase (CAN), cytochrome p450 reductase (CPR) and one or more UDP-glucosyltransferases (UGT). In a further embodiment, one or more UDP-glucosyltransferases (UGTs) are selected from EUGT11. UGT85C2, UGT74G1, UGT91D like3, UGT76G1 and UGT40087. In a further embodiment of the invention, geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 9, ent-copalyl pyrophosphate synthase (CPS) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: : 10, ent-kaurene synthase (KS) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 11, ent-kaurene-19 oxidase (KO) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 12, ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase (CAN) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 13, cytochrome p450 reductase (CPR) has an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with SEQ ID NO: 14, and one or more UDP-glucosyltransferases (UGTs) have an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of sequences with the following identifiers: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27.
[0006] В конкретном варианте осуществления изобретения геранилгеранилпирофосфатсинтаза (GGPPS) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, энт-копалилпирофосфатсинтаза (CPS) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, энт-кауренсинтаза (KS) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, энт-каурен-19-оксидаза (КО) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, 13-гидроксилаза энт-кауреновой кислоты (КАН) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, редуктаза цитохрома р450 (CPR) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и одна или несколько УДФ-глюкозилтрансфераз (UGT) содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей со следующими идентификаторами: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 27.[0006] In a specific embodiment, geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, ent-copalyl pyrophosphate synthase (CPS) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, ent-kaurene synthase (KS) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 , ent-kaurene-19-oxidase (KO) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase (CAH) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, cytochrome p450 reductase (CPR) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and one or more UDP-glucosyltransferases (UGT) contain an amino acid sequence selected from the group consisting of sequences with the following identifiers: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 27.
[0007] В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин выбрана из клетки бактерии, гриба, водоросли, насекомого или растения. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Saccharomyces cerevisiae.[0007] In one embodiment, the host cell is selected from a bacterial, fungal, algal, insect, or plant cell. In another embodiment, the host cell is a Saccharomyces cerevisiae cell.
[0008] В одном из вариантов осуществления ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 1.[0008] In one embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[0009] В другом варианте осуществления ABC-транс портер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 2.[0009] In another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0010] В другом варианте осуществления ABC-транс портер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 3.[0010] In another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
[ООН] В еще одном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 4.[UN] In yet another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
[0012] В дополнительном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 5.[0012] In a further embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
[0013] В другом варианте осуществления ABC-транс портер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 6.[0013] In another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
[0014] В другом варианте осуществления ABC-транс портер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 7.[0014] In another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
[0015] В еще одном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 8.[0015] In yet another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
[0016] В еще одном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 28.[0016] In yet another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
[0017] В еще одном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 29.[0017] In yet another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
[0018] В еще одном воплощении ABC-транспортер имеет аминокислотную последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 30.[0018] In yet another embodiment, the ABC transporter has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
[0019] В варианте осуществления изобретения один или несколько стевиоловых гликозидов выбирают из ребаудиозида A (Reb А), ребаудиозида В (Reb В), Reb D. ребаудиозида Е (Reb Е) или Reb М. В другом варианте осуществления один или несколько стевиоловых гликозидов включают Reb М.[0019] In an embodiment, the one or more steviol glycosides are selected from rebaudioside A (Reb A), rebaudioside B (Reb B), Reb D. rebaudioside E (Reb E), or Reb M. In another embodiment, one or more steviol glycosides include Reb M.
[0020] В одном варианте осуществления большая часть одного или нескольких стевиоловых гликозидов накапливается в просвете органеллы. В другом варианте осуществления большая часть одного или нескольких стевиоловых гликозидов накапливается внеклеточно.[0020] In one embodiment, most of the one or more steviol glycosides accumulate in the lumen of the organelle. In another embodiment, most of the one or more steviol glycosides accumulate extracellularly.
[0021] В другом аспекте изобретение обеспечивает последовательность нуклеиновой кислоты кассеты экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует ABC-транспортер. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность кассеты экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты имеет кодирующую последовательность с идентификатором SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27, где кодирующая последовательность функционально связана с гетер о логичным промотором.[0021] In another aspect, the invention provides a nucleic acid sequence for an expression cassette of a heterologous nucleic acid that expresses an ABC transporter. In one embodiment, the nucleotide sequence of the heterologous nucleic acid expression cassette has the coding sequence of SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 27, where the coding sequence is operably linked to a heterologous promoter.
[0022] В другом аспекте изобретение обеспечивает способ получения стевиола или одного или нескольких стевиоловых гликозидов, включающий: культивирование популяции клеток-хозяев по изобретению в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения стевиола или одного или нескольких стевиоловых гликозидов, чтобы дать культуральный бульон; и выделение стевиола или одного или нескольких стевиоловых гликозидов из культурального бульона.[0022] In another aspect, the invention provides a method for producing steviol or one or more steviol glycosides, comprising: culturing a population of host cells of the invention in a carbon source medium under conditions suitable for producing steviol or one or more steviol glycosides to produce a culture broth ; and isolating the steviol or one or more steviol glycosides from the culture broth.
[0023] В другом аспекте изобретение обеспечивает способ получения Reb D, включающий: культивирование популяции клеток-хозяев по изобретению в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения Reb D с получением культурального бульона; и выделение указанного соединения Reb D из культуральной жидкости.[0023] In another aspect, the invention provides a method for producing Reb D, comprising: culturing a population of host cells of the invention in a carbon source medium under conditions suitable for producing Reb D to form a culture broth; and isolating said Reb D compound from the culture fluid.
[0024] В другом аспекте изобретение обеспечивает способ получения Reb М, включающий: культивирование популяции клеток-хозяев по изобретению в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения Reb М с получением культурального бульона; и выделение указанного соединения Reb М из культурального бульона.[0024] In another aspect, the invention provides a method for producing Reb M, comprising: culturing a population of host cells of the invention in a carbon source medium under conditions suitable for producing Reb M to form a culture broth; and isolating said Reb M compound from the culture broth.
5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ5. BRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
[0025] На Фиг. 1 схематически показан ферментативный путь от нативного дрожжевого метаболита фарнезилпирофосфата (FPP) до стевиола.[0025] In FIG. 1 schematically shows the enzymatic pathway from the native yeast metabolite farnesyl pyrophosphate (FPP) to steviol.
[0026] На Фиг. 2 схематически показан ферментативный путь от стевиола до Ребаудиозида М.[0026] In FIG. 2 schematically shows the enzymatic pathway from steviol to Rebaudioside M.
[0027] Фиг. 3 представляет собой схему ДНК-конструкции посадочной площадки, используемой для вставки транспортеров в штаммы Reb М. Каждый конец конструкции содержит последовательность ДНК длиной 500 п. и. ниже дрожжевого гена SFM1 для облегчения гомологичной рекомбинации в этом локусе. Введение посадочной площадки в этот локус не приводит к удалению какого-либо гена. Посадочная площадка содержит полноразмерный промотор GAL1, за которым следует сайт узнавания эндонуклеазы F-CphI и терминатор из природного дрожжевого гена НЕМ 13.[0027] FIG. 3 is a diagram of a DNA landing pad construct used to insert transporters into Reb M strains. Each end of the construct contains a 500 bp DNA sequence. downstream of the yeast SFM1 gene to facilitate homologous recombination at that locus. The introduction of a landing site at this locus does not result in the deletion of any gene. The landing pad contains the full length GAL1 promoter followed by the F-CphI endonuclease recognition site and a terminator from the native yeast HEM 13 gene.
[0028] Фиг. 4 представляет собой график процентного содержания Reb D+Reb М, обнаруженного в супернатанте. Штаммы дрожжей с разными сверхэкспрессированными переносчиками выращивали в микротитровальных планшетах. Здесь проиллюстрирован процент Reb D+Reb M (измеренный в мкмолях), который обнаруживается в супернатанте после удаления клеток. Родительский штамм не содержит сверхэкспрессированного транспортера. Количество Reb D+Reb М, измеренное в супернатанте, делится на количество Reb D+Reb М, измеренное во всем клеточном бульоне, чтобы получить процентное содержание Reb D+Reb М в супернатанте.[0028] FIG. 4 is a graph of the percentage of Reb D+Reb M found in the supernatant. Yeast strains with different overexpressed carriers were grown in microtiter plates. Illustrated here is the percentage of Reb D+Reb M (measured in µmol) that is found in the supernatant after cell removal. The parent strain does not contain an overexpressed transporter. The amount of Reb D+Reb M measured in the supernatant is divided by the amount of Reb D+Reb M measured in the entire cell broth to obtain the percentage of Reb D+Reb M in the supernatant.
[0029] Фиг. 5 представляет собой график общего содержания стевиоловых гликозидов по отношению к исходному в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей с разными сверхэкспрессированными переносчиками выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации представлена общая сумма всех стевиоловых гликозидов (измеренная в мкмолях), обнаруженная в цельноклеточном бульоне (как в клетках, так и в супернатанте), относительно родительского штамма. Родительский штамм не содержит сверхэкспрессированного транспортера.[0029] FIG. 5 is a graph of total steviol glycosides versus stock in whole cell broth. Yeast strains with different overexpressed carriers were grown in microtiter plates. This illustration shows the total sum of all steviol glycosides (measured in µmol) found in whole cell broth (both cells and supernatant) relative to the parent strain. The parent strain does not contain an overexpressed transporter.
[0030] Фиг. 6 представляет собой график количества Reb D+Reb М по отношению к исходному в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей с разными сверхэкспрессированными переносчиками выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации показана сумма Reb D+Reb М (измеренная в мкмолях), обнаруженная в бульоне целых клеток (как в клетках, так и в супернатанте), относительно родительского штамма. Родительский штамм не содержит сверхэкспрессированного транспортера.[0030] FIG. 6 is a graph of the amount of Reb D+Reb M versus stock in whole cell broth. Yeast strains with different overexpressed vectors were grown in microtiter plates. This illustration shows the sum of Reb D+Reb M (measured in µmoles) found in whole cell broth (both cells and supernatant) relative to the parent strain. The parent strain does not contain an overexpressed transporter.
[0031] Фиг. 7 представляет собой график общего количества стевиоловых гликозидов относительно родительского в супернатанте. Штаммы дрожжей с разными сверхэкспрессированными переносчиками выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации представлена общая сумма всех стевиоловых гликозидов (измеренная в мкмолях), обнаруженная в супернатанте после удаления клеток, относительно родительского штамма. Родительский штамм не содержит сверхэкспрессированного транспортера.[0031] FIG. 7 is a plot of total steviol glycosides relative to parent in the supernatant. Yeast strains with different overexpressed vectors were grown in microtiter plates. This illustration shows the total amount of all steviol glycosides (measured in µmol) found in the supernatant after cell removal, relative to the parent strain. The parent strain does not contain an overexpressed transporter.
[0032] На Фиг. 8 показан процент всех продуцируемых стевиоловых гликозидов, находящихся в супернатанте. Штаммы дрожжей с разными сверхэкспрессированными переносчиками выращивали в микротитровальных планшетах. Эта цифра показывает процент всех стевиоловых гликозидов, продуцируемых клетками (измеренный в мкмолях), который обнаруживается в супернатанте. Суммарное количество стевиоловых гликозидов, измеренное в супернатанте, делится на количество общих стевиоловых гликозидов, измеренных во всем клеточном бульоне, для получения процента общих стевиоловых гликозидов в супернатанте.[0032] In FIG. 8 shows the percentage of all produced steviol glycosides present in the supernatant. Yeast strains with different overexpressed vectors were grown in microtiter plates. This figure indicates the percentage of all steviol glycosides produced by the cells (measured in µmoles) that is found in the supernatant. The total amount of steviol glycosides measured in the supernatant is divided by the amount of total steviol glycosides measured in the entire cell broth to obtain the percentage of total steviol glycosides in the supernatant.
[0033] Фиг. 9 представляет собой график количества Reb D+Reb М по отношению к исходному в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей, экспрессирующие версии ВРТ1 с метками ЗФБ и без меток и транспортера Т4 Fungal 5, выращивали в микротитровальных планшетах. Сравнивались относительные активности версий транспортеров с метками ЗФБ и без меток. Данные показывают, что версии с метками ЗФБ вели себя аналогично непомеченным версиям транспортеров.[0033] FIG. 9 is a graph of the amount of Reb D+Reb M versus stock in whole cell broth. Yeast strains expressing GPB-labeled and unlabeled versions of VPT1 and the T4 Fungal 5 transporter were grown in microtiter plates. The relative activities of the transporter versions with and without GFB labels were compared. The data shows that the ZFB-tagged versions behaved similarly to the untagged transporter versions.
[0034] Фиг. 10 представляет собой набор микрофотографий светлопольных (А) и флуоресцентных (В) изображений дрожжей, экспрессирующих ВРТ1 с метками ЗФБ.[0034] FIG. 10 is a set of brightfield (A) and fluorescent (B) micrographs of yeast expressing BPT1 labeled with GFB.
[0035] Фиг. 11 представляет собой набор микрофотографий светлопольных (А) и флуоресцентных (В) изображений дрожжей, экспрессирующих транспортер Т4 Fungal 5 с метками ЗФБ.[0035] FIG. 11 is a set of brightfield (A) and fluorescent (B) micrographs of yeast expressing the T4 Fungal 5 transporter labeled with GFB.
[0036] Фиг. 12 представляет собой график количества Reb М относительно родительского с Т4 Fungal 5 дикого типа в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей, экспрессирующие транспортеры T4_Fungal_5 и его варианты (Isolate_l-8), полученные с помощью подверженной ошибкам ПЦР и отбора, выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации показан титр Reb М (измеренный в мкмолях), который обнаруживается в цельноклеточном бульоне (как в клетках, так и в супернатанте) штаммов дрожжей, экспрессирующих мутагенизированные варианты транспортера T4_Fungal_5 (Isolate_l-8) по сравнению с немутагенизированным T4_Fungal_5. Данные демонстрируют, что экспрессия Isolates 1-8 приводила к улучшенной продукции Reb М штаммами дрожжей по сравнению с Т4 Fungal 5.[0036] FIG. 12 is a plot of Reb M versus parent with T4 Fungal 5 wt in whole cell broth. Yeast strains expressing the T4_Fungal_5 transporters and its variants (Isolate_l-8) obtained by error-prone PCR and selection were grown in microtiter plates. This illustration shows the Reb M titer (measured in µmol) found in whole cell broth (both in cells and in supernatant) of yeast strains expressing mutagenized variants of the T4_Fungal_5 transporter (Isolate_l-8) compared to non-mutagenized T4_Fungal_5. The data demonstrate that expression of Isolates 1-8 resulted in improved production of Reb M by yeast strains compared to T4 Fungal 5.
[0037] Фиг. 13 представляет собой график доли Reb М общих стевиоловых гликозидов относительно родительского с T4_Fungal_5 дикого типа в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей, экспрессирующие транспортеры Т4 Fungal 5 и его варианты (Isolate 1-8), полученные с помощью подверженной ошибкам ПЦР и отбора, выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации показано отношение Reb М к общей сумме всех стевиоловых гликозидов (измеренной в мкмолях), которое обнаруживается в цельноклеточном бульоне (как в клетках, так и в супернатанте) штаммов дрожжей, экспрессирующих мутагенизированные варианты транспортера T4_Fungal_5 (Isolate_l-8) по сравнению с немутагенизированным Т4 Fungal 5. Данные демонстрируют, что экспрессия Isolates 1-8 приводила к увеличению доли Reb М среди всех стевиоловых гликозидов по сравнению с транспортером T4_Fungal_5. Другими словами, Isolates_l-8 демонстрируют повышенное предпочтение субстрата для Reb М.[0037] FIG. 13 is a graph of the proportion of Reb M total steviol glycosides relative to parent with T4_Fungal_5 wild type in whole cell broth. Yeast strains expressing the Fungal 5 T4 transporters and its variants (Isolate 1-8) obtained by error-prone PCR and selection were grown in microtiter plates. This illustration shows the ratio of Reb M to the total sum of all steviol glycosides (measured in µmoles) found in whole cell broth (both in cells and in supernatant) of yeast strains expressing mutagenized variants of the T4_Fungal_5 (Isolate_l-8) transporter compared to unmutated T4 Fungal 5. The data demonstrate that expression of Isolates 1-8 resulted in an increase in the proportion of Reb M among all steviol glycosides compared to the T4_Fungal_5 transporter. In other words, Isolates_l-8 show an increased substrate preference for Reb M.
[0038] Фиг. 14 представляет собой график количества Reb М в цельноклеточном бульоне и фракции супернатанта, продуцируемой штаммами, экспрессирующими транспортеры T4_Fungal_5 или Fungal_5_muA. Штаммы дрожжей, экспрессирующие Т4 Fungal 5 или Fungal 5 muA под контролем PGAL3 (более низкая сила, чем PGAL1), выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации показан титр Reb М (измеренный в мкмолях), который обнаруживается в цельноклеточном бульоне (как в клетках, так и в супернатанте) и фракции супернатанта штаммов дрожжей. Данные подтверждают, что Fungal 5 muA действительно обеспечивает улучшенную производительность при экспрессии в дрожжевом штамме: на 30% больше Reb М в цельноклеточном бульоне и на 40% больше внеклеточного Reb М продуцируется штаммом с Fungal_5_muA, чем штаммом с T4_Fungal_5 дикого типа, когда оба транспортера были выражены при более низкой силе промотора.[0038] FIG. 14 is a graph of the amount of Reb M in whole cell broth and the supernatant fraction produced by strains expressing the T4_Fungal_5 or Fungal_5_muA transporters. Yeast strains expressing T4 Fungal 5 or Fungal 5 muA under the control of PGAL3 (lower strength than PGAL1) were grown in microtiter plates. This illustration shows the Reb M titer (measured in µmoles) found in whole cell broth (both cells and supernatant) and supernatant fractions of yeast strains. The data confirm that Fungal 5 muA does provide improved performance when expressed in a yeast strain: 30% more Reb M in whole cell broth and 40% more extracellular Reb M is produced by the Fungal_5_muA strain than by the wild-type T4_Fungal_5 strain when both transporters were expressed at lower promoter strength.
[0039] Фиг. 15 представляет собой график количества Reb М относительно родительского с Fungal 5 muA в бульоне из цельных клеток. Штаммы дрожжей, экспрессирующие транспортер Fungal_5_muA и восемь его вариантов, в которых одна, две или три мутации были возвращены к последовательности T4_Fungal_5 дикого типа, выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации показан титр Reb М (измеренный в мкмолях), который обнаруживается в бульоне целых клеток (как в клетках, так и в супернатанте) штаммов дрожжей, экспрессирующих восемь вариантов Fungal_5_muA относительно Fungal_5_muA. Данные демонстрируют влияние различных мутаций на продукцию Reb М, особенно интересен положительный эффект реверсии E1320V. [0040] Фиг. 16 представляет собой график общего количества стевиоловых гликозидов относительно родительского с Fungal_5_muA в цельноклеточном бульоне. Штаммы дрожжей, экспрессирующие транспортер Fungal_5_muA и восемь его вариантов, в которых одна, две или три мутации были возвращены к последовательности Т4 Fungal 5 дикого типа, выращивали в микротитровальных планшетах. На этой иллюстрации представлена общая сумма всех стевиоловых гликозидов (измеренная в мкмолях), обнаруженная в цельноклеточном бульоне (как в клетках, так и в супернатанте) штаммов дрожжей, экспрессирующих восемь вариантов Fungal_5_muA относительно Fungal_5_muA. Данные демонстрируют влияние различных мутаций на производство TSG. Вместе с ФИГ. 15 он иллюстрирует не только различия в активности, но и предпочтение субстратов.[0039] FIG. 15 is a plot of Reb M versus parent with Fungal 5 muA in whole cell broth. Yeast strains expressing the Fungal_5_muA transporter and eight variants thereof, in which one, two or three mutations were reverted to the wild-type T4_Fungal_5 sequence, were grown in microtiter plates. This illustration shows the Reb M titer (measured in µmol) found in whole cell broth (both in cells and in the supernatant) of yeast strains expressing eight Fungal_5_muA variants relative to Fungal_5_muA. The data demonstrate the effect of various mutations on Reb M production, of particular interest is the positive effect of E1320V reversion. [0040] FIG. 16 is a graph of total steviol glycosides versus parent with Fungal_5_muA in whole cell broth. Yeast strains expressing the Fungal_5_muA transporter and eight variants thereof, in which one, two, or three mutations were reverted to the wild-type T4 Fungal 5 sequence, were grown in microtiter plates. This illustration shows the total sum of all steviol glycosides (measured in µmol) found in whole cell broth (both in cells and in supernatant) of yeast strains expressing eight variants of Fungal_5_muA relative to Fungal_5_muA. The data demonstrate the impact of various mutations on TSG production. Together with FIG. 15 he illustrates not only differences in activity but also substrate preference.
6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 6.1 Терминология6. DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS 6.1 Terminology
[0041] Используемый здесь термин «гетерологичный» относится к тому, что обычно не встречается в природе. Термин «гетерологичная нуклеотидная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая обычно не встречается в данной клетке в природе. Как таковая гетерологичная нуклеотидная последовательность может быть: (а) чужеродной для своей клетки-хозяина (т.е. «экзогенной» для клетки); (b) естественным образом возникающая в клетке-хозяине (т.е. «эндогенно»), но присутствующая в клетке в неестественном количестве (т.е. в большем или меньшем количестве, чем в клетке-хозяине в естественных условиях); или (с) естественным образом возникающая в клетке-хозяине, но располагающаяся вне ее естественного локуса. [0042] С другой стороны, термин «нативный» или «эндогенный», используемый здесь в отношении молекул и, в частности, ферментов и нуклеиновых кислот, означает молекулы, которые экспрессируются в организме, в котором они возникли, или встречаются в природе. Понятно, что экспрессия природных ферментов или полинуклеотидов может быть изменена в рекомбинантных микроорганизмах.[0041] As used herein, the term "heterologous" refers to that which is not normally found in nature. The term "heterologous nucleotide sequence" refers to a nucleotide sequence that does not normally occur naturally in a given cell. As such, a heterologous nucleotide sequence may be: (a) foreign to its host cell (ie "exogenous" to the cell); (b) occurring naturally in the host cell (ie, "endogenously"), but present in the cell in an unnatural amount (ie, more or less than naturally occurring in the host cell); or (c) naturally occurring in the host cell but located outside its natural locus. [0042] On the other hand, the term "native" or "endogenous", as used herein in relation to molecules and, in particular, enzymes and nucleic acids, means molecules that are expressed in the organism in which they originated, or occur in nature. It is understood that the expression of naturally occurring enzymes or polynucleotides can be altered in recombinant microorganisms.
[0043] Используемый здесь термин «кассета экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с одним или несколькими регуляторными элементами, достаточными для экспрессии кодирующей последовательности в клетке-хозяине. В одном варианте осуществления «кассета экспрессии ABC-транспортера» относится к кассете экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, в которой гетерологичная нуклеиновая кислота содержит кодирующую последовательность для полипептида АВС-транспортера. Неограничивающие примеры регуляторных элементов включают промоторы, энхансеры, сайленсеры, терминаторы и сигналы поли-А.[0043] As used herein, the term "heterologous nucleic acid expression cassette" refers to a nucleic acid sequence that contains a coding sequence operably linked to one or more regulatory elements sufficient for expression of the coding sequence in a host cell. In one embodiment, an "ABC transporter expression cassette" refers to a heterologous nucleic acid expression cassette in which the heterologous nucleic acid contains the coding sequence for an ABC transporter polypeptide. Non-limiting examples of regulatory elements include promoters, enhancers, silencers, terminators, and poly-A signals.
[0044] Используемые здесь термины «ABC-транспортер» и «АТФ-связывающий кассетный транспортер» относятся к суперсемейству мембранно-ассоциированных полипептидов, которые связывают гидролиз аденозинтрифосфата (АТФ) с перемещением различных субстратов через биологические мембраны.[0044] As used herein, the terms "ABC transporter" and "ATP binding cassette transporter" refer to a superfamily of membrane-associated polypeptides that link the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) to the movement of various substrates across biological membranes.
[0045] Используемый здесь термин относится к АВС-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1):[0045] As used herein, the term refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1):
кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 20):encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 20):
[0046] Используемый здесь термин «T4 Fungal 1» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2):[0046] The term "T4 Fungal 1" as used herein refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 2):
кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 21):encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 21):
[0047] Используемый здесь термин «T4_Fungal_10» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 3):[0047] As used herein, the term "T4_Fungal_10" refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 3):
и кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 22):and is encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 22):
[0048] Используемый здесь термин «T4_Fungal_2» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 4):[0048] As used herein, the term "T4_Fungal_2" refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 4):
кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 23):encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 23):
[0049] Используемый здесь термин «T4 Fungal 3» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 5):[0049] As used herein, the term "T4 Fungal 3" refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 5):
[0050] Используемый здесь термин «T4_Fungal_4» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 6):[0050] As used herein, the term "T4_Fungal_4" refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 6):
кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 25):encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 25):
[0051] Используемый здесь термин «T4_Fungal_5» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 7):[0051] As used herein, the term "T4_Fungal_5" refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 7):
и кодируется следующей последовательностью нуклеиновых кислот (идентификатор последовательности SEQ ID NO: 26):and is encoded by the following nucleic acid sequence (sequence identifier SEQ ID NO: 26):
[0052] Используемый здесь термин «T4 Fungal 8» относится к ABC-транспортеру, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 8):[0052] The term "T4 Fungal 8" as used herein refers to an ABC transporter having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 8):
[0053] Используемый здесь термин «родительская клетка» относится к клетке, которая имеет идентичный генетический фон с генетически модифицированной клеткой-хозяином, описанной в данном документе, за исключением того, что она не содержит одну или несколько конкретных генетических модификаций, встроенных в модифицированную клетку-хозяин, например, одна или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из: гетерологичной экспрессияифермента стевиолового пути, гетерологичной экспрессии фермента стевиолгликозидного пути, гетерологичной экспрессии геранилгеранилдифосфатсинтазы, гетерологичной экспрессии копалилдифосфатсинтазы, гетерологичной экспрессии каурен-синтазы, гетерологичной экспрессии кауреноксидазы (например, кауреноксидаза Pimm sativum), гетерологичной экспрессии стевиолсинтазы (гидроксилазы кауреновой кислоты), гетерологичной экспрессии редуктазы цитохрома Р450, гетерологичной экспрессии EUGT11, гетерологичной экспрессии UGT74G1, гетерологичной экспрессии UGT76G1, гетерологичной экспрессии UGT85C2, гетерологичной экспрессии UGT91D и гетерологичной экспрессии UGT40087 или его варианта.[0053] As used herein, the term "parent cell" refers to a cell that has an identical genetic background to the genetically modified host cell described herein, except that it does not contain one or more specific genetic modifications incorporated into the modified cell. host, e.g., one or more modifications selected from the group consisting of: heterologous expression of the steviol pathway enzyme, heterologous expression of the steviol glycosidic pathway enzyme, heterologous expression of geranylgeranyl diphosphate synthase, heterologous expression of copalyl diphosphate synthase, heterologous expression of kaurene synthase, heterologous expression of kaurene oxidase (e.g., kaurene oxidase Pimm sativum), heterologous expression of steviol synthase (kaurenoic acid hydroxylase), heterologous expression of cytochrome P450 reductase, heterologous expression of EUGT11, heterologous expression of UGT74G1, heterologous expression of UGT76G1, heterologous expression of UGT85C2, heterologous expression of UGT91D, and heterologous expression of UGT40087 or a variant thereof .
[0054] Используемый здесь термин «встречающееся в природе» относится к тому, что встречается в природе. Например, ABC-транспортер, присутствующий в организме, который может быть выделен из источника в природе и который не был намеренно модифицирован человеком в лаборатории, является естественным ABC-транспортером. И наоборот, в контексте настоящего описания термин «не встречающийся в природе» относится к тому, что не встречается в природе, но создается в результате вмешательства человека.[0054] As used herein, the term "naturally occurring" refers to what is found in nature. For example, an ABC transporter present in the body that can be isolated from a source in nature and that has not been intentionally modified by humans in the laboratory is a natural ABC transporter. Conversely, in the context of the present description, the term "non-naturally occurring" refers to something that does not occur in nature, but is created as a result of human intervention.
[0055] Термин «среда» относится к культуральной среде и/или среде ферментации. [0056] Термин «ферментационная композиция» относится к композиции, которая включает генетически модифицированные клетки-хозяева и продукты или метаболиты, продуцируемые генетически модифицированными клетками-хозяевами. Примером ферментационной композиции является бульон для цельных клеток, который может представлять собой все содержимое сосуда (например, колбы, тарелки или ферментатора), включая клетки, водную фазу и соединения, полученные из генетически модифицированных клеток-хозяев.[0055] the Term "environment" refers to the culture medium and/or fermentation medium. [0056] The term "fermentation composition" refers to a composition that includes genetically modified host cells and products or metabolites produced by genetically modified host cells. An example of a fermentation composition is a whole cell broth, which can be the entire contents of a vessel (eg, flask, plate, or fermentor), including cells, an aqueous phase, and compounds derived from genetically modified host cells.
[0057] Используемый здесь термин «продукция» обычно относится к количеству стевиола или стевиолгликозида, продуцируемого генетически модифицированной клеткой-хозяином, предоставленной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления продукция выражается как выход стевиола или стевиолгликозида клеткой-хозяином. В других вариантах осуществления продукция выражается как продуктивность клетки-хозяина по продуцированию стевиола или стевиолгликозида.[0057] As used herein, the term "production" generally refers to the amount of steviol or steviol glycoside produced by the genetically modified host cell provided herein. In some embodiments, production is expressed as the yield of steviol or steviol glycoside by the host cell. In other embodiments, production is expressed as the productivity of the host cell to produce steviol or steviol glycoside.
[0058] Используемый здесь термин «продуктивность» относится к продукции стевиола или стевиолгликозида клеткой-хозяином, выраженной как количество продуцируемого стевиола или стевиолгликозида (по массе) на количество ферментационного бульона, в котором культивируется клетка-хозяин (по объему) с течением времени (в час). [0059] Используемый здесь термин «выход» относится к продукции стевиола или стевиолгликозида клеткой-хозяином, выраженной как количество продуцируемого стевиола или стевиолгликозида на количество источника углерода, потребляемого клеткой-хозяином, по массе.[0058] As used herein, the term "productivity" refers to the production of steviol or steviol glycoside by a host cell, expressed as the amount of steviol or steviol glycoside produced (by weight) per amount of fermentation broth in which the host cell is cultured (by volume) over time (in hour). [0059] As used herein, the term "yield" refers to the production of steviol or steviol glycoside by the host cell, expressed as the amount of steviol or steviol glycoside produced per amount of carbon source consumed by the host cell, by weight.
[0060] Используемый здесь термин «неопределяемый уровень» соединения (например, Reb М, стевиоловых гликозидов или других соединений) означает уровень соединения, который слишком низок для измерения и/или анализа стандартным методом измерения соединение. Например, термин включает уровень соединения, который не определяется аналитическими методами, известными в данной области.[0060] As used herein, the term "undetectable level" of a compound (eg, Reb M, steviol glycosides, or other compounds) means a level of a compound that is too low to be measured and/or analyzed by a standard compound measurement method. For example, the term includes a compound level that is not determined by analytical methods known in the art.
[0061] Термин «каурен» относится к соединению каурена, включая любой стереоизомер каурена. В конкретных вариантах осуществления термин относится к энантиомеру, известному в данной области как энт-каурен. В конкретных вариантах осуществления термин относится к соединению согласно следующей структуре:[0061] The term "kaurene" refers to a compound of kaurene, including any stereoisomer of kaurene. In specific embodiments, the term refers to the enantiomer known in the art as ent-kaurene. In particular embodiments, the term refers to a compound according to the following structure:
[0062] Термин «кауренол» относится к соединению кауренол, включая любой стереоизомер кауренола. В конкретных вариантах осуществления термин относится к энантиомеру, известному в данной области как энт-кауренол. В конкретных вариантах осуществления термин относится к соединению согласно следующей структуре.[0062] The term "kaurenol" refers to a kaurenol compound, including any stereoisomer of kaurenol. In specific embodiments, the term refers to the enantiomer known in the art as ent-kaurenol. In particular embodiments, the term refers to a compound according to the following structure.
[0063] Термин «кауренал» относится к составному кауреналу, включая любой стереоизомер кауренала. В конкретных вариантах осуществления термин относится к энантиомеру, известному в данной области как энт-кауренал. В конкретных вариантах осуществления термин относится к соединению согласно следующей структуре.[0063] The term "kaurenal" refers to a compound kaurenal, including any stereoisomer of kaurenal. In specific embodiments, the term refers to the enantiomer known in the art as ent-caurenal. In particular embodiments, the term refers to a compound according to the following structure.
[0064] Термин «кауреновая кислота» относится к соединению кауреновой кислоты, включая любой стереоизомер кауреновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления термин относится к энантиомеру, известному в данной области как энт-кауреновая кислота. В конкретных вариантах осуществления термин относится к соединению согласно следующей структуре.[0064] The term "kaurenoic acid" refers to a compound of kaurenoic acid, including any stereoisomer of kaurenoic acid. In specific embodiments, the term refers to the enantiomer known in the art as ent-kaurenic acid. In particular embodiments, the term refers to a compound according to the following structure.
[0065] Термин «стевиол» относится к соединению стевиола, включая любой стереоизомер стевиола. В конкретных вариантах осуществления термин относится к соединению согласно следующей структуре.[0065] The term "steviol" refers to a compound of steviol, including any stereoisomer of steviol. In particular embodiments, the term refers to a compound according to the following structure.
ОНHE
ноBut
[0066] Используемый здесь термин «стевиоловый гликозид(ы)» относится к гликозиду стевиола, включая, но не ограничиваясь ими, природные стевиоловые гликозиды, например, стевиолмонозид, стевиолбиозид, рубузозид, дулкозид В, дулкозид А, ребаудиозид В, ребаудиозид G, стевиозид, ребаудиозид С, ребаудиозид F, ребаудиозид А, ребаудиозид I, ребаудиозид Е, ребаудиозид Н, ребаудиозид L, ребаудиозид К, ребаудиозид J, ребаудиозид М, ребаудиозид D, ребаудиозид N, ребаудиозид О, синтетические стевиоловые гликозиды, например, ферментативно стевиолгликозиды гликозиды и их комбинации.[0066] The term "steviol glycoside(s)" as used herein refers to steviol glycoside, including but not limited to naturally occurring steviol glycosides, e.g. , rebaudioside C, rebaudioside F, rebaudioside A, rebaudioside I, rebaudioside E, rebaudioside H, rebaudioside L, rebaudioside K, rebaudioside J, rebaudioside M, rebaudioside D, rebaudioside N, rebaudioside O, synthetic steviol glycosides, for example, enzymatic steviol glycosides glycosides and their combinations.
[0067] Используемый здесь термин «Ребаудиозид М» относится к соединению следующей структуры.[0067] As used herein, the term "Rebaudioside M" refers to a compound of the following structure.
[0068] Используемый здесь термин «вариант» относится к полипептиду, отличающемуся от специально указанного «эталонного» полипептида (например, последовательности дикого типа) вставками, делениями, мутациями и/или заменами аминокислот, но сохраняет активность, которая по существу аналогичен эталонному полипептиду. В некоторых вариантах осуществления вариант создается методами рекомбинантной ДНК или мутагенезом. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид отличается от своего эталонного полипептида заменой одного основного остатка на другой (например, Arg на Lys), заменой одного гидрофобного остатка на другой (например, Leu на Не) или заменой одного ароматического остатка для другого (например, Phe для Туг) и т.д. В некоторых вариантах осуществления варианты включают аналоги, в которых получены консервативные замены, приводящие к значительной структурной аналогии эталонной последовательности. Примеры таких консервативных замен, без ограничения, включают глутаминовую кислоту вместо аспарагиновой кислоты и наоборот, глугамин для аспарагина и наоборот, серии на треонин и наоборот, лизин на аргинин и наоборот, или любой из изолейцина, валина или лейцина друг для друга.[0068] As used herein, the term "variant" refers to a polypeptide that differs from a specifically designated "reference" polypeptide (e.g., wild-type sequence) in amino acid insertions, deletions, mutations, and/or substitutions, but retains an activity that is substantially similar to the reference polypeptide. In some embodiments, the implementation of the option is created by methods of recombinant DNA or mutagenesis. In some embodiments, the variant polypeptide differs from its reference polypeptide by substituting one basic residue for another (e.g., Arg for Lys), substituting one hydrophobic residue for another (e.g., Leu for He), or substituting one aromatic residue for another (e.g., Phe for Tug), etc. In some embodiments, variants include analogs in which conservative substitutions are made resulting in significant structural similarity to the reference sequence. Examples of such conservative substitutions, without limitation, include glutamic acid for aspartic acid and vice versa, glugamine for asparagine and vice versa, series for threonine and vice versa, lysine for arginine and vice versa, or any of isoleucine, valine, or leucine for each other.
[0069] Используемый здесь термин«идентичность последовательностей» или «процент идентичности» в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или белков относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или одинаковых нуклеотидов. Например, последовательность может иметь процентную идентичность по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более высокую идентичность в указанной области для ссылки последовательность при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или обозначенной области при измерении с использованием алгоритма сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального контроля. Например, процент идентичности определяется путем вычисления отношения количества идентичных нуклеотидов (или аминокислотных остатков) в последовательности, деленного на длину всех нуклеотидов (или аминокислотных остатков) за вычетом длин любых пробелов.[0069] As used herein, the term "sequence identity" or "percent identity" in the context of two or more nucleic acid or protein sequences refers to two or more sequences or subsequences that are the same or have a certain percentage of amino acid residues or the same nucleotides. For example, the sequence may have a percent identity of at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or better identity in the specified region to reference the sequence when compared and aligned for maximum match in the comparison window or designated region when measured using a sequence comparison algorithm or by manual alignment and visual inspection. For example, percent identity is determined by calculating the ratio of the number of identical nucleotides (or amino acid residues) in a sequence divided by the length of all nucleotides (or amino acid residues) minus the lengths of any gaps.
[0070] Для удобства степень идентичности между двумя последовательностями может быть установлена с использованием компьютерных программ и математических алгоритмов, известных в данной области техники. Такие алгоритмы, которые вычисляют процент идентичности последовательностей, обычно учитывают пробелы и несовпадения последовательностей в сравниваемой области. Для этой цели хорошо подходят программы, которые сравнивают и выравнивают последовательности, такие как Clustal W (Thompson et al, (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ALIGN (Myers et al, (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson et al, (1988) PNAS, 85: 2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol, 183: 63-98) и BLAST с пробелами (Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402). BLAST или BLAST 2.0 (Altschul et al, J. Mot. Biol 215: 403-10, 1990) доступны из нескольких источников, включая Национальный центр биологической информации (NCBI) и в Интернете, для использования в сочетании с программами анализа последовательностей BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN и TBLASTX. Дополнительную информацию можно найти на веб-сайте NCBI.[0070] For convenience, the degree of identity between two sequences can be established using computer programs and mathematical algorithms known in the art. Such algorithms that calculate percent sequence identity typically take into account gaps and sequence mismatches in the region being compared. Programs that compare and align sequences are well suited for this purpose, such as Clustal W (Thompson et al, (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ALIGN (Myers et al, (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson et al, (1988) PNAS, 85: 2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol, 183: 63-98) and gapped BLAST (Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402). BLAST or BLAST 2.0 (Altschul et al, J. Mot. Biol 215: 403-10, 1990) is available from several sources, including the National Center for Biological Information (NCBI) and the Internet, for use in conjunction with the BLASTP, BLASTN sequence analysis programs , BLASTX, TBLASTN and TBLASTX. More information can be found on the NCBI website.
[0071] В некоторых вариантах осуществления выравнивание последовательностей и расчеты процента идентичности могут быть определены с использованием программы BLAST с использованием ее стандартных параметров по умолчанию. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и расчетов идентичности последовательностей программа BLASTN используется со своими параметрами по умолчанию (штраф за открытие пробела=5, штраф за расширение пробела=2, нуклеиновое совпадение=2, нуклеиновое несоответствие=-3, ожидаемое значение=10.0, размер слова=11, максимальное количество совпадений в диапазоне запроса=0). Для выравнивания полипептидных последовательностей и расчетов идентичности последовательностей программа BLASTP используется с параметрами по умолчанию (Матрица выравнивания=BLOSUM62; Стоимость пробелов: Существование=11, Расширение=1; Композиционные корректировки=Условная оценка композиции, корректировка матрицы; Ожидаемое значение=10,0; Размер слова=6; Максимальное количество совпадений в диапазоне запроса=0). В качестве альтернативы можно использовать следующую программу и параметры: программное обеспечение Align Plus из Clone Manager Suite, версия 5 (Sci-Ed Software); Сравнение ДНК: глобальное сравнение, стандартная линейная матрица оценок, штраф за несоответствие=2, штраф за открытые пропуски=4, штраф за расширение пропусков=1. Сравнение аминокислот: Глобальное сравнение, Матрица оценок BLOSUM 62. В вариантах осуществления, описанных в данном документе, идентичность последовательности вычисляется с использованием программ BLASTN или BLASTP с использованием их параметров по умолчанию. В вариантах осуществления, описанных в данном документе, выравнивание последовательностей двух или более последовательностей выполняется с использованием Clustal W с использованием предложенных параметров по умолчанию (Отмена выравнивания входных последовательностей: нет; Mbed-подобное дерево направляющих кластеров: да; Mbed-подобная итерация кластеризации: да; число объединенных итераций: по умолчанию (0): Максимальное количество итераций направляющего дерева: по умолчанию; Максимальное количество итераций НММ: по умолчанию; Порядок: ввод).[0071] In some embodiments, sequence alignments and percent identity calculations can be determined using the BLAST program using its standard default settings. For nucleotide sequence alignment and sequence identity calculations, the BLASTN program is used with its default parameters (open gap penalty=5, gap widening penalty=2, nucleo match=2, nucleo mismatch=-3, expected value=10.0, word length= 11, maximum number of matches in query range=0). For polypeptide sequence alignment and sequence identity calculations, the BLASTP program is used with default parameters (Alignment Matrix=BLOSUM62; Gaps Cost: Existence=11, Extension=1; Compositional Adjustments=Conditional Composition Score, Matrix Adjustment; Expected Value=10.0; Size words=6; Maximum number of matches in query range=0). Alternatively, you can use the following program and settings: Align Plus software from Clone Manager Suite, version 5 (Sci-Ed Software); DNA Comparison: Global Comparison, Standard Linear Score Matrix, Mismatch Penalty=2, Open Gap Penalty=4, Gap Expansion Penalty=1. Amino Acid Comparison: Global Comparison, BLOSUM Scoring Matrix 62. In the embodiments described herein, sequence identity is calculated using the BLASTN or BLASTP programs using their default parameters. In the embodiments described herein, sequence alignment of two or more sequences is performed using Clustal W using the proposed default options (Input Sequence De-alignment: No; Mbed-like Cluster Guide Tree: Yes; Mbed-like Clustering Iteration: Yes ; number of merged iterations: default (0): Maximum number of steering tree iterations: default; Maximum number of HMM iterations: default; Order: input).
6.2 ABC-транспортер, нуклеиновые кислоты, кассеты экспрессии и клетки-хозяева6.2 ABC transporter, nucleic acids, expression cassettes and host cells
[0072] В одном аспекте в настоящем документе представлены рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые экспрессируют ABC-транспортеры. АВС-транспортеры согласно изобретению могут быть идентифицированы поиском на основе последовательностей в отношении последовательностей известных АВС-транспортеров. Примерная база данных последовательностей известных АВС-транспортеров предоставлена (Ковальчук и Дриссен, Филогенетический анализ грибковых АВС-транспортеров (Kovalchuk and Driessen, Phylogenetic Analysis of Fungal ABC Transporters), BMC Genomics, 2010, 11:177). Базы данных АВС-транспортеров BLAST также могут быть созданы из дополнительных организмов. В предпочтительных вариантах осуществления базы данных грибковых последовательностей из (1) Hansenula polymorpha DL-1 (NRRL-Y-7560), (2) Yarrowia lipolytica ATCC 18945, (3) Arxula adeninivorans ATCC 76597, (4) S. cerevisiae CAT-1, (5) Lipomyces starkeyi ATCC 58690, (6) Kluyveromyces marxianus, (7) Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, (8) Komagataella phaffii NRRL Y-11430, (9) S. cerevisiae MBG3370, (10) S. cerevisiae MBG3373, (11) K. lactis ATCC 8585, (12) Candida utilis ATCC 22023, (13) Pichia pastoris ATCC 28485 и (14) Aspergillus oryzae NRRL5590 служат в качестве источников АВС-транспортеров изобретения.[0072] In one aspect, provided herein are recombinant nucleic acids that express ABC transporters. The ABC transporters of the invention can be identified by sequence-based searches against sequences of known ABC transporters. An exemplary sequence database of known ABC transporters is provided (Kovalchuk and Driessen, Phylogenetic Analysis of Fungal ABC Transporters, BMC Genomics, 2010, 11:177). Databases of BLAST ABC transporters can also be generated from additional organisms. In preferred embodiments, a fungal sequence database from (1) Hansenula polymorpha DL-1 (NRRL-Y-7560), (2) Yarrowia lipolytica ATCC 18945, (3) Arxula adeninivorans ATCC 76597, (4) S. cerevisiae CAT-1 , (5) Lipomyces starkeyi ATCC 58690, (6) Kluyveromyces marxianus, (7) Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, (8) Komagataella phaffii NRRL Y-11430, (9) S. cerevisiae MBG3370, (10) S. cerevisiae MBG3373, (11) K. lactis ATCC 8585, (12) Candida utilis ATCC 22023, (13) Pichia pastoris ATCC 28485, and (14) Aspergillus oryzae NRRL5590 serve as sources of the ABC transporters of the invention.
[0073] Нуклеотидные последовательности ORF, полученные в результате геномного секвенирования de novo, сборки и аннотации различных организмов, анализируют с помощью алгоритма tblastn с использованием Biopython или любого другого подходящего программного обеспечения для анализа последовательностей. Алгоритм tblastn обеспечивает выравнивание белковых последовательностей известных АВС-транспортеров с транслированной ДНК нуклеотидных последовательностей ORF для каждого организма во всех 6 возможных рамках считывания с использованием BLAST. Примерные параметры BLAST являются стандартными с evalue=1е-25 (таблицы 4 и 5). Совпадения могут быть впоследствии отфильтрованы, чтобы обеспечить глобальное выравнивание не менее 2000 нуклеотидов.[0073] ORF nucleotide sequences derived from de novo genomic sequencing, assembly, and annotation of various organisms are analyzed with the tblastn algorithm using Biopython or any other suitable sequence analysis software. The tblastn algorithm aligns protein sequences of known ABC transporters with translated DNA ORF nucleotide sequences for each organism in all 6 possible reading frames using BLAST. Exemplary BLAST parameters are standard with evalue=1e-25 (Tables 4 and 5). Matches can be subsequently filtered to provide a global alignment of at least 2000 nucleotides.
[0074] В других вариантах осуществления изобретения весь протеом организма может быть извлечен из Uniprot с помощью Uniprot API, чтобы создать базу данных для поиска BLAST. Алгоритм blastp может применяться к базе данных, производной от Uniprot. В одном варианте осуществления параметры BLAST могут быть стандартными с evalue=0,001. В конкретных вариантах осуществления фильтрация может выполняться на основе процентного отсечения идентичности>40% и процентного отсечения выровненной длины>60%. В предпочтительных вариантах осуществления совпадения должны соответствовать по меньшей мере одной из 610 исходных последовательностей из ссылки.[0074] In other embodiments, the entire proteome of an organism can be retrieved from the Uniprot using the Uniprot API to create a BLAST search database. The blastp algorithm can be applied to a database derived from Uniprot. In one embodiment, the BLAST parameters may be standard with evalue=0.001. In particular embodiments, filtering may be performed based on >40% identity cutoff and >60% aligned length cutoff. In preferred embodiments, the matches must match at least one of the 610 original sequences from the reference.
[0075] После идентификации нуклеотидных последовательностей можно разработать праймеры для амплификации каждой полной ORF, амплифицированной с помощью ПЦР. Каждый праймер ПЦР в идеале должен иметь фланкирующую гомологию с последовательностями промотора и терминатора ДНК промотора и терминатора, используемых в кассете гетерологичной нуклеотидной экспрессии, добавленной к концам для облегчения гомологичной рекомбинации амплифицированного гена в сайт-мишень посадочной площадки для получения специфической кассеты экспрессии АВС-транспортера. Каждый ген ABC-транспортера может быть индивидуально трансформирован в виде единственной копии в родительский штамм дрожжей Reb М, описанный в данном документе, и подвергнут скринингу на способность увеличивать титры продукта при сверхэкспрессии in vivo.[0075] Once the nucleotide sequences have been identified, primers can be designed to amplify each complete ORF amplified by PCR. Each PCR primer should ideally have flanking homology to the promoter and terminator DNA promoter and terminator sequences used in the heterologous nucleotide expression cassette, added to the ends to facilitate homologous recombination of the amplified gene into the landing site target site to produce a specific ABC transporter expression cassette. Each ABC transporter gene can be individually transformed as a single copy into the Reb M yeast parental strain described herein and screened for the ability to increase product titers when overexpressed in vivo.
[0076] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, аминокислотная последовательность которого представлена любой из последовательностей с идентификатором SEQ ID NO: 1-8. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, представленную любой из последовательностей с идентификатором SEQ Ш NO: 20-27.[0076] In some embodiments, the implementation of the recombinant nucleic acids encode a polypeptide, the amino acid sequence of which is represented by any of the sequences with the identifier SEQ ID NO: 1-8. In some embodiments, the implementation of the recombinant nucleic acid contains a nucleotide sequence represented by any of the sequences with the identifier SEQ III NO: 20-27.
[0077] В настоящем документе также представлены клетки-хозяева, содержащие один или несколько полипептидов или нуклеиновых кислот АВС-транспортера, представленных в настоящем документе, которые способны продуцировать стевиоловые гликозиды. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева могут продуцировать стевиоловые гликозиды из источника углерода в культуральной среде. В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева могут продуцировать стевиол из источника углерода в культуральной среде и могут дополнительно продуцировать Reb А или Reb D из стевиола. В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева могут дополнительно продуцировать Reb М из Reb D. В конкретных вариантах осуществления Reb D и/или Reb М транспортируются в просвет одной или нескольких органелл. В конкретных вариантах осуществления Reb D и/или Reb М транспортируются во внеклеточное пространство (т.е. супернатант).[0077] Also provided herein are host cells comprising one or more of the ABC transporter polypeptides or nucleic acids provided herein that are capable of producing steviol glycosides. In some embodiments, the host cells can produce steviol glycosides from a carbon source in the culture medium. In specific embodiments, the host cells can produce steviol from a carbon source in the culture medium and can additionally produce Reb A or Reb D from steviol. In specific embodiments, host cells can further produce Reb M from Reb D. In specific embodiments, Reb D and/or Reb M are transported into the lumen of one or more organelles. In specific embodiments, Reb D and/or Reb M are transported to the extracellular space (ie, supernatant).
[0078] В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, экспрессирующие АВС-транспортеры в соответствии с вышеуказанными вариантами осуществления, продуцируют не менее 20%, не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80%, по крайней мере, на 90% или, по крайней мере, на 100% больше общего стевиол гликозида (TSG) по сравнению с родительской клеткой-хозяином, в которой отсутствует кассета экспрессии АВС-транспортера.[0078] In some embodiments, host cells expressing ABC transporters according to the above embodiments produce at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, not less than 80%, at least 90% or at least 100% more total steviol glycoside (TSG) compared to a parental host cell lacking the ABC transporter expression cassette.
[0079] В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, экспрессирующие АВС-транспортеры в соответствии с вышеуказанными вариантами осуществления, продуцируют по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 75% больше TSG в супернатанте по сравнению с родительской клеткой-хозяином, в которой отсутствует кассета экспрессии АВС-транспортера. В конкретном варианте осуществления клетки-хозяева, экспрессирующие ABC-транспортеры в соответствии с вышеуказанными вариантами осуществления, продуцируют по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 или по меньшей мере в 5 раз больше TSG в супернатанте по сравнению с родительской клеткой-хозяином, в которой отсутствует кассета экспрессии АВС-транспортера.[0079] In some embodiments, host cells expressing ABC transporters according to the above embodiments produce at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50% , at least 60%, at least 70%, or at least 75% more TSG in the supernatant compared to the parental host cell lacking the ABC transporter expression cassette. In a specific embodiment, host cells expressing the ABC transporters according to the above embodiments produce at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold or at least 5-fold TSG in the supernatant compared to a parental host cell lacking the ABC transporter expression cassette.
[0080] В предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин может включать один или несколько ферментативных путей, способных производить кауреновую кислоту, указанные пути взяты по отдельности или вместе. Как описано в данном документе, клетки-хозяева содержат гидроксилазу кауреновой кислоты Stevia rebaudiana, представленную в настоящем документе, способную превращать кауреновую кислоту в стевиол. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать фарнезилдифосфат в геранилгеранилдифосфат.В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать геранилгеранилдифосфат в копалилдифосфат.В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать копалилдифосфат в каурен. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать каурен в кауреновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать стевиол в один или несколько гликозидов стевиола. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один, два, три, четыре или более ферментов, вместе способных превращать стевиол в Reb А. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать Reb А в Reb D. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных превращать Reb D в Reb М. Полезные ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, известны специалистам. Особенно полезные ферменты и нуклеиновые кислоты описаны в разделах ниже и дополнительно описаны, например, в US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188, WO 2016/038095 A2 и US 2016/0198748 Al.[0080] In preferred embodiments, the host cell may include one or more enzymatic pathways capable of producing kaurenic acid, these pathways taken individually or together. As described herein, the host cells contain the Stevia rebaudiana kaurenic acid hydroxylase provided herein, which is capable of converting kaurenic acid to steviol. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting farnesyl diphosphate to geranylgeranyl diphosphate. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting geranylgeranyl diphosphate to copalyl diphosphate. In some embodiments, the host cell further comprises one or several enzymes capable of converting copalyl diphosphate to kaurene. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting kaurene to kaurenic acid. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting steviol to one or more steviol glycosides. In some embodiments, the host cell further comprises one, two, three, four or more enzymes together capable of converting steviol to Reb A. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting Reb A to Reb D. In some embodiments, the host cell further comprises one or more enzymes capable of converting Reb D to Reb M. Useful enzymes and nucleic acids encoding enzymes are known to those skilled in the art. Particularly useful enzymes and nucleic acids are described in the sections below and are further described in, for example, US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188, WO 2016/038095 A2 and US 2016/0198748 Al.
[0081] В дополнительных вариантах осуществления клетки-хозяева дополнительно содержат один или несколько ферментов, способных производить геранилгеранилдифосфат из источника углерода. К ним относятся ферменты каскада реакций DXP и ферменты каскада реакций MEV. Полезные ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, известны специалистам в данной области. Примеры ферментов каждого пути описаны ниже и дополнительно описаны, например, в US 2016/0177341 Al, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.[0081] In further embodiments, the host cells further comprise one or more enzymes capable of producing geranylgeranyl diphosphate from a carbon source. These include enzymes in the DXP pathway and enzymes in the MEV pathway. Useful enzymes and nucleic acids encoding enzymes are known to those skilled in the art. Examples of enzymes of each pathway are described below and are further described, for example, in US 2016/0177341 Al, which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки-хозяева включают один или несколько или все ферменты изопреноидного пути, выбранные из группы, состоящей из: (а) фермента, который конденсирует две молекулы ацетил-коэнзима А с образованием ацетоацетил-КоА (например, тиолаза ацетил-КоА); (b) фермента, который конденсирует ацетоацетил-КоА с другой молекулой ацетил-КоА с образованием 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА (ГМГ-КоА) (например, синтаза ГМГ-КоА); (с) фермент, превращающий HMG-CoA в мевалонат (например, HMG-CoA редуктаза); (d) фермент, превращающий мевалонат в мевалонат-5-фосфат (например, мевалонат-киназа); (е) фермент, превращающий мевалонат-5-фосфат в мевалонат-5-пирофосфат (например, фосфомевалонат киназа); (f) фермент, превращающий мевалонат 5-пирофосфат в изопентенил дифосфат (IPP) (например, мевалонат пирофосфат декарбоксилаза); (g) фермент, который превращает IPP в диметилаллил пирофосфат (DMAPP) (например, изомераза IPP); (h) полипренил синтаза, которая может конденсировать молекулы IPP и/или DMAPP с образованием полипрениловых соединений, содержащих более пяти углеродов; (i) фермент, который конденсирует IPP с DMAPP с образованием геранил пирофосфата (GPP) (например, синтаза GPP); (j) фермент, который конденсирует две молекулы IPP с одной молекулой DMAPP (например, синтаза FPP); (к) фермент, который конденсирует IPP с GPP с образованием фарнезилпирофосфата (FPP) (например, FPP-синтаза); (1) фермент, который конденсирует IPP и DMAPP с образованием геранилгеранилпирофосфата (GGPP); и (т) фермент, который конденсирует IPP и FPP с образованием GGPP. [0083] В некоторых вариантах осуществления дополнительные ферменты являются природными. В предпочтительных вариантах осуществления дополнительные ферменты гетерологичны. В некоторых вариантах осуществления два или более ферментов могут быть объединены в один полипептид.[0082] In some embodiments, the host cells include one or more or all of the isoprenoid pathway enzymes selected from the group consisting of: (a) an enzyme that condenses two molecules of acetyl coenzyme A to form acetoacetyl CoA (e.g., thiolase acetyl-CoA); (b) an enzyme that condenses acetoacetyl-CoA with another acetyl-CoA molecule to form 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) (eg, HMG-CoA synthase); (c) an enzyme that converts HMG-CoA to mevalonate (eg HMG-CoA reductase); (d) an enzyme that converts mevalonate to mevalonate-5-phosphate (eg, mevalonate kinase); (e) an enzyme that converts mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-pyrophosphate (eg, phosphomevalonate kinase); (f) an enzyme that converts mevalonate 5-pyrophosphate to isopentenyl diphosphate (IPP) (eg, mevalonate pyrophosphate decarboxylase); (g) an enzyme that converts IPP to dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) (eg, IPP isomerase); (h) polyprenyl synthase, which can condense IPP and/or DMAPP molecules to form polyprenyl compounds containing more than five carbons; (i) an enzyme that condenses IPP with DMAPP to form geranyl pyrophosphate (GPP) (eg, GPP synthase); (j) an enzyme that condenses two IPP molecules with one DMAPP molecule (eg FPP synthase); (j) an enzyme that condenses IPP to GPP to form farnesyl pyrophosphate (FPP) (eg, FPP synthase); (1) an enzyme that condenses IPP and DMAPP to form geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP); and (t) an enzyme that condenses IPP and FPP to form GGPP. [0083] In some embodiments, the additional enzymes are naturally occurring. In preferred embodiments, the additional enzymes are heterologous. In some embodiments, two or more enzymes can be combined into one polypeptide.
6.3 Клеточные штаммы6.3 Cell strains
[0084] Предлагаемые здесь подходящие композиции и способы для клеток-хозяев включают клетки архей, прокариот или эукариот.[0084] Suitable compositions and methods provided herein for host cells include archaeal, prokaryotic, or eukaryotic cells.
[0085] Подходящие прокариотические хозяева включают, без ограничения, любые из множества грамположительных, грамотрицательных или грамположительных бактерий. Примеры включают, но не ограничиваются ими, клетки, принадлежащие к родам: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus. В revi bacterium, Chromatium, Clostridium, Cory neb acterium, Enterobacter, Erwinia, Escheracillobacterium, Lactobactobacter, Erwinia, Escheracillobacterium, Lactobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus и Zymomonas. Примеры прокариотических штаммов включают в себя, но не ограничиваются ими: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Br evib acterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei и Staphylococcus aureus. В конкретном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli.[0085] Suitable prokaryotic hosts include, without limitation, any of a variety of Gram-positive, Gram-negative, or Gram-positive bacteria. Examples include, but are not limited to, cells belonging to the genera: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus. B revi bacterium, Chromatium, Clostridium, Coryneb acterium, Enterobacter, Erwinia, Escheracillobacterium, Lactobactobacter, Erwinia, Escheracillobacterium, Lactobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scene desmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus and Zymomonas. Examples of prokaryotic strains include, but are not limited to: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Br evib acterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomona mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei and Staphylococcus aureus. In a specific embodiment, the host cell is an Escherichia coli cell.
[0086] Подходящие хозяева архей включают, но не ограничиваются ими, клетки, принадлежащие к родам: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus и Thermoplasma. Примеры штаммов архей включают, но не ограничиваются ими: Archaeoglobus fulgidus, Halobacterium sp., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi и Aeropyrum pernix.[0086] Suitable archaeal hosts include, but are not limited to, cells belonging to the genera: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus, and Thermoplasma. Examples of archaeal strains include, but are not limited to: Archaeoglobus fulgidus, Halobacterium sp., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, and Aeropyrum pernix.
[0087] Подходящие эукариотические хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки грибов, клетки водорослей, клетки насекомых и клетки растений. В некоторых вариантах осуществления дрожжи, используемые в настоящих способах, включают дрожжи, депонированные в хранилищах микроорганизмов (например, IFO, АТСС и т.д.) и принадлежащие к родам Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis и Zygozyma, среди других.[0087] Suitable eukaryotic hosts include, but are not limited to, fungal cells, algal cells, insect cells, and plant cells. In some embodiments, yeasts used in the present methods include yeasts deposited in microorganism stores (e.g., IFO, ATCC, etc.) and belonging to the genera Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum , Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogata ea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia Pichia Rhodosporidium Rhodotorula Saccharomyces Saccharomycodes Saccharomycopsis Saitoella ium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis and Zygozyma, among others.
[0088] В некоторых вариантах осуществления изобретения микроорганизм-хозяин представляет собой Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (ранее называвшийся Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninustula polymorus (теперь известный как Pichiaa angienusa polymoris) или Pichia adeninustula polymorns. В некоторых вариантах осуществления изобретения микроорганизм-хозяин представляет собой штамм рода Candida, такой как Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis или Candida utilis.[0088] In some embodiments, the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (formerly known as Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninustula polymorus (now known as Pichiaa angienusa polymoris) or Pichia adeninustula polymorns. In some embodiments, the host microorganism is a strain of the genus Candida, such as Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, or Candida utilis.
[0089] В конкретном варианте осуществления микроорганизмом-хозяином является Saccharomyces cerevisiae. В некоторых вариантах осуществления изобретения хозяин представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный из группы, состоящей из пекарских дрожжей, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, ТА, BG-1, CR-1, SA-1, М-26, Y-904, РЕ-2, РЕ-5, VR-1, BR-1, BR-2, МЕ-2, VR-2, МА-3, МА-4, САТ-1, СВ-1, NR-1, ВТ-1 и AL-1. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм-хозяин представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный из группы, состоящей из РЕ-2, САТ-1, VR-1, BG-1, CR-1 и SA-1. В конкретном варианте осуществления штамм Saccharomyces cerevisiae представляет собой РЕ-2. В другом конкретном варианте осуществления штамм Saccharomyces cerevisiae представляет собой САТ-1. В другом конкретном варианте осуществления штамм Saccharomyces cerevisiae представляет собой BG-1.[0089] In a particular embodiment, the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae. In some embodiments, the host is a strain of Saccharomyces cerevisiae selected from the group consisting of baker's yeast, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR -1, SA-1, M-26, Y-904, RE-2, RE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4 , CAT-1, SV-1, NR-1, BT-1 and AL-1. In some embodiments, the host microorganism is a Saccharomyces cerevisiae strain selected from the group consisting of PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1, and SA-1. In a specific embodiment, the Saccharomyces cerevisiae strain is PE-2. In another specific embodiment, the Saccharomyces cerevisiae strain is CAT-1. In another specific embodiment, the Saccharomyces cerevisiae strain is BG-1.
[0090] В некоторых вариантах осуществления микроорганизм-хозяин представляет собой микроорганизм, который подходит для промышленной ферментации. В конкретных вариантах осуществления микроорганизм кондиционируется для существования в условиях высокой концентрации растворителя, высокой температуры, расширенного использования субстрата, ограничения питательных веществ, осмотического стресса из-за сахара и солей, кислотности, сульфита и бактериального загрязнения или их комбинаций, которые считаются стрессовыми условиями промышленная ферментационная среда.[0090] In some embodiments, the host microorganism is a microorganism that is suitable for industrial fermentation. In specific embodiments, the microorganism is conditioned to exist under conditions of high solvent concentration, high temperature, increased substrate utilization, nutrient restriction, osmotic stress due to sugar and salts, acidity, sulfite, and bacterial contamination, or combinations thereof, which are considered to be stressful conditions in an industrial fermentation plant. Wednesday.
6.4 Пути биосинтеза стевиола и стевиол гликозидов6.4 Biosynthetic pathways for steviol and steviol glycosides
[0091] В некоторых вариантах осуществления путь биосинтеза стевиола и/или путь биосинтеза стевиоловых гликозидов активируется в генетически модифицированных клетках-хозяевах, представленных в настоящем документе, путем инженерии клеток для экспрессии полинуклеотидов и/или полипептидов, кодирующих один или несколько ферментов этого пути. ФИГ. 1 иллюстрирует примерный путь биосинтеза стевиола.[0091] In some embodiments, the steviol biosynthetic pathway and/or the steviol glycoside biosynthetic pathway is activated in the genetically modified host cells provided herein by engineering the cells to express polynucleotides and/or polypeptides encoding one or more enzymes of the pathway. FIG. 1 illustrates an exemplary steviol biosynthetic pathway.
[0092] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью геранилгеранилдифосфатсинтазы (GGPPS). В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью копалилдифосфатсинтазы или эит-копалилпирофосфатсинтазы (CDPS; также называемый энт-копалилпирофосфатсинтазой или CPS). В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью кауренсинтазы (KS; также называемой энт-кауренсинтазой). В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные клетки-хозяева, представленные в настоящем документе, содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий кауреноксидазной активностью (КО; также называемый энт-каурен-19-оксидазой), как описано в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные клетки-хозяева, представленные в настоящем документе, содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью полипептида гидроксилазы кауреновой кислоты (КАН; также называемый стевиолсинтазой), в соответствии с вариантами осуществления, представленными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью цитохром Р450 редуктазы (CPR).[0092] Thus, in some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having copalyl diphosphate synthase or eit-copalyl pyrophosphate synthase (CDPS; also referred to as ent-copalyl pyrophosphate synthase or CPS) activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having kaurene synthase (KS; also referred to as ent-kaurene synthase) activity. In specific embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having kaurene oxidase (KO; also referred to as ent-kaurene-19 oxidase) activity as described herein. In specific embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of a kaurenic acid hydroxylase (CAH; also referred to as steviol synthase) polypeptide, according to the embodiments provided herein. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having cytochrome P450 reductase (CPR) activity.
[0093] В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT74G1. В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT76G1. В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT85C2. В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT91D. В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGTad. Как описано ниже, UGTad относится к уридиндифосфат-зависимой гликозилтрансферазе, способной переносить фрагмент глюкозы в положение С-2' 19-О-глюкозы Reb А с образованием Reb D.[0093] In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having UGT74G1 activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having UGT76G1 activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having UGT85C2 activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having UGT91D activity. In some embodiments, the genetically modified host cells provided herein comprise a heterologous polynucleotide encoding a polypeptide having UGTad activity. As described below, UGTad refers to a uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase capable of transferring a glucose moiety to the C-2' position of the 19-O-glucose of Reb A to form Reb D.
[0094] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вариантный фермент.В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных замен относительно соответствующего полипептида. В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативных аминокислотных замен относительно эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления любая из описанных здесь нуклеиновых кислот может быть оптимизирована для клетки-хозяина, например, оптимизирована кодонами.[0094] In some embodiments, the host cell contains a variant enzyme. In some embodiments, the variant may contain up to 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acid substitutions relative to the corresponding polypeptide. In some embodiments, a variant may contain up to 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 conservative amino acid substitutions relative to the reference polypeptide. In some embodiments, any of the nucleic acids described herein may be optimized for the host cell, eg, codon optimized.
[0095] Примеры нуклеиновых кислот и ферментов пути биосинтеза стевиола и/или пути биосинтеза стевиоловых гликозидов описаны ниже.[0095] Examples of nucleic acids and enzymes of the steviol biosynthetic pathway and/or the steviol glycoside biosynthetic pathway are described below.
6.4.1 Геранилгеранилдифосфатсинтаза (GGPPS)6.4.1 Geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS)
[0096] Геранилгеранилдифосфатсинтазы (ЕС 2.5.1.29) катализируют превращение фарнезилпирофосфата в геранилгеранилдифосфат.Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ABD92926), Gibberella fujikuroi (учетный номер САА75568), Mus musculus (учетный номер ААН69913), Thalassiosira pseudonana (учетный номер ХР 002288339), Streptomyces clavuligerus (учетный номер ZP_05004570), Sulfiilobus acidocaldarius (учетный номер ВАА43200), Synechococcus sp.(учетный номер АВС98596), Arabidopsis thaliana (учетный номер NP 195399) и Blakeslea trispora (учетный номер AFC92798.1) и описанные в US 2014/0329281 Al. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот GGPPS. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов GGPPS.[0096] Geranylgeranyl diphosphate synthases (EC 2.5.1.29) catalyze the conversion of farnesyl pyrophosphate to geranylgeranyl diphosphate. 13), Thalassiosira pseudonana (account number XP 002288339), Streptomyces clavuligerus (Ac. ZP_05004570), Sulfiilobus acidocaldarius (Ac. BAA43200), Synechococcus sp. 92798.1) and described in US 2014/0329281 Al. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these GGPPS nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these GGPPS enzymes.
6.4.2 Копалилдифосфатсинтаза (CDPS)6.4.2 Copalyl diphosphate synthase (CDPS)
[0097] Копалилдифосфатсинтазы (ЕС 5.5.1.13) катализируют превращение геранилгеранилдифосфата в копалилдифосфат.Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ААВ87091), Streptomyces clavuligerus (учетный номер EDY51667), Bradyrhizobium japonicum (учетный номер ААС28895.1), Zea mays (учетный номер AY562490), Arabidopsis thaliana (учетный номер NM 116512) и Oryza sativa (учетный номер Q5MQ85.1) и описанные в US 2014/0329281 Al. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот CDPS. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов CDPS.[0097] Copalyl diphosphate synthases (EC 5.5.1.13) catalyze the conversion of geranylgeranyl diphosphate to copalyl diphosphate. 895.1), Zea mays ( accession number AY562490), Arabidopsis thaliana (accession number NM 116512) and Oryza sativa (accession number Q5MQ85.1) and described in US 2014/0329281 Al. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these CDPS nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these CDPS enzymes.
6.4.3 Каурен-синтаза (KS)6.4.3 Kaurene synthase (KS)
[0098] Каурен-синтазы (ЕС 4.2.3.19) катализируют превращение копалилдифосфата в каурен и дифосфат.Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Bradyrhizobium japonicum (учетный номер ААС28895.1), Phaeosphaeria sp. (учетный номер 013284), Arabidopsis thaliana (учетный номер Q9SAK2) и Picea glauca (учетный номер ADB55711.1) и описанные в US 2014/0329281 Al. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот KS. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов KS.[0098] Kaurene synthases (EC 4.2.3.19) catalyze the conversion of copalyl diphosphate to kaurene and diphosphate. (accession number 013284), Arabidopsis thaliana (accession number Q9SAK2) and Picea glauca (accession number ADB55711.1) and described in US 2014/0329281 Al. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these KS nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these KS enzymes.
6.4.4 Бифункциональная копалилдифосфатсинтаза (CDPS) и кауренсинтаза (KS)6.4.4 Bifunctional copalyl diphosphate synthase (CDPS) and kaurene synthase (KS)
[0099] Также можно использовать бифункциональные ферменты CDPS-KS (ЕС 5.5.1.13 и ЕС 4.2.3.19). Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Phomopsis amygdali (учетный номер BAG30962), Physcomitrella patens (учетный номер BAF61135) и Gibberella fujikuroi (учетный номер Q9UVY5.1) и описанные в US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот CDPS-KS. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов CDPS-KS.[0099] The bifunctional CDPS-KS enzymes (EC 5.5.1.13 and EC 4.2.3.19) can also be used. Illustrative examples of enzymes include Phomopsis amygdali (accession number BAG30962), Physcomitrella patens (accession number BAF61135) and Gibberella fujikuroi (accession number Q9UVY5.1) and described in US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0 159188 and WO 2016/038095A2. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these CDPS-KS nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these CDPS-KS enzymes.
6.4.5 Энт-кауреноксидаза (КО)6.4.5 Ent-kaurene oxidase (KO)
[00100] Энт-кауреноксидазы (ЕС 1.14.13.78; также называемые здесь кауреноксидазами) катализируют превращение каурена в кауреновую кислоту. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Oryza sativa (учетный номер Q5Z5R4), Gibberella fujikuroi (учетный номер 094142), Arabidopsis thaliana (учетный номер Q93ZB2), Stevia rebaudiana (учетный номер AAQ63464.1) и Pisum sativum (номер Uniprot Q6XAF4) и описанные в US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот КО. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов КО.[00100] Ent-kaurene oxidases (EC 1.14.13.78; also referred to herein as kaurene oxidases) catalyze the conversion of kaurene to kaurenic acid. Illustrative examples of enzymes include Oryza sativa (accession number Q5Z5R4), Gibberella fujikuroi (accession number 094142), Arabidopsis thaliana (accession number Q93ZB2), Stevia rebaudiana (accession number AAQ63464.1) and Pisum sativum (uniprot accession number Q6XAF4) and described in the US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 and WO 2016/038095 A2. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these KO nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these KO enzymes.
6.4.6 Стевиолсинтаза (КАН)6.4.6 Steviol synthase (CAN)
[00101] Стевиолсинтазы или гидроксилазы кауреновой кислоты (КАН) (ЕС 1.14.13) катализируют превращение кауреновой кислоты в стевиол. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ACD93722), Stevia rebaudiana (SEQ ID NO: 10) Arabidopsis thaliana (учетный номер NP_197872), Vitis vinifera (учетный номер XP 002282091) и Medicago trunculata (учетный номер ABC59076) и описанные в US 2014/0329281 A1,US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот КАН. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов КАН.[00101] Steviol synthases or kaurenic acid hydroxylases (CAH) (EC 1.14.13) catalyze the conversion of kaurenic acid to steviol. Illustrative examples of enzymes include Stevia rebaudiana (Access Number ACD93722), Stevia rebaudiana (SEQ ID NO: 10) Arabidopsis thaliana (Access Number NP_197872), Vitis vinifera (Access Number XP 002282091), and Medicago trunculata (Access Number ABC59076) and described in the US 2014/0329281 A1, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 and WO 2016/038095 A2. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these CAH nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these CAH enzymes.
6.4.7 Редуктаза цитохрома Р450 (CPR)6.4.7 Cytochrome P450 reductase (CPR)
[00102] Редуктазы цитохрома Р450 (ЕС 1.6.2.4) необходимы для активности КО и/или КАН, указанных выше. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер АВВ88839) Arabidopsis thaliana (учетный номер NP_194183), Gibberella fujikuroi (учетный номер САЕ09055) и Artemisia annua (учетный номер АВС47946.1) и описанные в US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот CPR. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов CPR.[00102] Cytochrome P450 reductases (EC 1.6.2.4) are required for KO and/or CAN activity as noted above. Illustrative examples of enzymes include Stevia rebaudiana (Access Number ABB88839) Arabidopsis thaliana (Access Number NP_194183), Gibberella fujikuroi (Account Number CAE09055), and Artemisia annua (Account Number ABC47946.1) and described in US 2014/0329281 Al, US 2014/0357588 Al, US 2015/0159188 and WO 2016/038095A2. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these CPR nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these CPR enzymes.
6.4.8 УДФ гликозилтрансфераза 74G1 (UGT74G1)6.4.8 UDP glycosyltransferase 74G1 (UGT74G1)
[00103] UGT74G1 способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил: трансфераза стевиол 19-СООН и как уридин-5'-дифосфоглюкозил: стевиол-13-О-глюкозид 19-СООН трансфераза. Как показано на Фиг. 1, UGT74G1 способен превращать стевиол в 19-гликозид. UGT74G1 также способен превращать стевиолмонозид в рубузозид. UGT74G1 также может превращать стевиолбиозид в стевиозид. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, Richman et al, 2005, Plant J.41: 56-67 и US 2014/0329281 и WO 2016/038095 A2 и учетный номер AAR06920.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот UGT74G1. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов UGT74G1.[00103] UGT74G1 is able to function as uridine-5'-diphosphoglucosyl:steviol 19-COOH transferase and as uridine-5'-diphosphoglucosyl:steviol-13-O-glucoside 19-COOH transferase. As shown in FIG. 1, UGT74G1 is able to convert steviol to 19-glycoside. UGT74G1 is also capable of converting steviol monoside to rubusoside. UGT74G1 can also convert steviolbioside to stevioside. Illustrative examples of enzymes include Stevia rebaudiana enzymes (eg Richman et al, 2005, Plant J. 41: 56-67 and US 2014/0329281 and WO 2016/038095 A2 and accession number AAR06920.1). Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these UGT74G1 nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these UGT74G1 enzymes.
6.4.9 УДФ гликозилтрансфераза 76G1 (UGT76G1)6.4.9 UDP glycosyltransferase 76G1 (UGT76G1)
[00104] UGT76G1 способен переносить фрагмент глюкозы в С-3 'C-13-О-глюкозы акцепторной молекулы, стевиол-1,2 гликозида. Таким образом, UGT76G1 способен функционировать как уридин 5'-дифосфоглюкозил: стевиол 13-0-1,2 глюкозид С-3' глюкозилтрансфераза и уридин 5'-дифосфоглюкозил: стевиол-19-О-глюкоза, 13-0-1,2 биозид С-3' глюкозилтрансфераза. UGT76G1 способен превращать стевиолбиозид в Reb В. UGT76G1 также способен превращать стевиозид в Reb A. UGT76G1 также способен преобразовывать Reb D в Reb М. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты Richman et al, 2005, Plant J'.41: 56-67 и US 2014/0329281 Al и WO 2016/038095 A2 и учетный номер AAR06912.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот UGT76G1. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов UGT76G1.[00104] UGT76G1 is able to transfer a glucose moiety to the C-3'C-13-O-glucose acceptor molecule, steviol-1,2 glycoside. Thus, UGT76G1 is able to function as uridine 5'-diphosphoglucosyl: steviol 13-0-1,2 glucoside C-3' glucosyltransferase and uridine 5'-diphosphoglucosyl: steviol-19-O-glucose, 13-0-1,2 bioside C-3' glucosyltransferase. UGT76G1 is able to convert steviolbioside to Reb B. UGT76G1 is also able to convert stevioside to Reb A. UGT76G1 is also able to convert Reb D to Reb M. Illustrative examples of enzymes include the enzymes of Stevia rebaudiana (e.g. those of Richman et al, 2005, Plant J'.41: 56-67 and US 2014/0329281 Al and WO 2016/038095 A2 and accession number AAR06912.1). Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these UGT76G1 nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these UGT76G1 enzymes.
6.4.10 УДФ гликозилтрансфераза 85С2 (UGT85C2)6.4.10 UDP glycosyltransferase 85C2 (UGT85C2)
[00105] UGT85C2 способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил: стевиол 13-ОН трансфераза и уридин-5'-дифосфоглюкозил: стевиол-19-О-глюкозид 13-ОН трансфераза. UGT85C2 способен превращать стевиол в стевиолмонозид, а также способен превращать 19-гликозид в рубузозид. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, Richman et al, 2005, Plant JA\: 56-67 и US 2014/0329281 Al и WO 2016/038095 A2 и учетный номер AAR06916.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот UGT85C2. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов UGT85C2.[00105] UGT85C2 is able to function as uridine-5'-diphosphoglucosyl:steviol 13-OH transferase and uridine-5'-diphosphoglucosyl:steviol-19-O-glucoside 13-OH transferase. UGT85C2 is able to convert steviol to steviol monoside and is also able to convert 19-glycoside to rubusoside. Illustrative examples of enzymes include those of Stevia rebaudiana (eg, Richman et al, 2005, Plant JA\: 56-67 and US 2014/0329281 Al and WO 2016/038095 A2 and accession number AAR06916.1). Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these UGT85C2 nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these UGT85C2 enzymes.
6.4.11 УДФ-гликозилтрансфераза 91D (UGT91D)6.4.11 UDP-glycosyltransferase 91D (UGT91D)
[00106] UGT91D способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил:стевиол-13-О-глюкозид трансфераза, перенося молекулу глюкозы на С-2' 13-О-глюкозы акцепторной молекулы, стевиол-13-О-глюкозида (стевиолмонозида), для получения стевиолбиозида. UGT91D также способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил: рубузозидтрансфераза, перенося фрагмент глюкозы на С-2 '13-О-глюкозы акцепторной молекулы, рубузозида, с получением стевиозида. UGT91D также обозначается как UGT91D2, UGT91D2e или UGT91D-like3. Иллюстративные примеры ферментов UGT91D включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты с последовательностью UGT с учетным номером АСЕ87855.1, US 2014/0329281 Al, WO 2016/038095 А2 и SEQ ID NO: 7). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одной из этих нуклеиновых кислот UGT91D. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих ферментов UGT91D.[00106] UGT91D is able to function as a uridine-5'-diphosphoglucosyl:steviol-13-O-glucoside transferase, transferring a glucose molecule to the C-2' 13-O-glucose acceptor molecule, steviol-13-O-glucoside (steviol monoside), to obtain steviolbioside. UGT91D is also able to function as a uridine-5'-diphosphoglucosyl: rubusoside transferase, transferring a glucose moiety to the C-2'13-O-glucose acceptor molecule, rubusoside, to produce stevioside. UGT91D is also referred to as UGT91D2, UGT91D2e or UGT91D-like3. Illustrative examples of UGT91D enzymes include those of Stevia rebaudiana (e.g., enzymes with the UGT sequence of accession number ACE87855.1, US 2014/0329281 Al, WO 2016/038095 A2 and SEQ ID NO: 7). Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one of these UGT91D nucleic acids. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these UGT91D enzymes.
6.4.12 Уридиндифосфат-зависимая гликозилтрансфераза, способная превращать Reb А в Reb D (UGTad)6.4.12 Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase capable of converting Reb A to Reb D (UGTad)
[00107] Уридиндифосфат-зависимая гликозилтрансфераза (UGTad) способна переносить фрагмент глюкозы в положение С-2' 19-О-глюкозы Reb А с образованием Reb D. UGTad также способен переносить фрагмент глюкозы в положение С-2' 19-О-глюкозы стевиозида для образования Reb Е. Полезные примеры UGT включают Os UGT 91С1 из Oryza sativa (также обозначаемый как EUGT11 в Houghton-Lars en et al, WO 2013/022989 A2; XP 015629141.1) и S1UGT 101249881 из Solanum lycopersicum также упоминается как UGTSL2 в Markosyan et al, WO2014/193888 Al; XP 004250485.1). Дополнительные полезные UGT включают в себя UGT40087 (XP 004982059.1; как описано в WO 2018/031955), sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840 (ХР 003560669.1), HvUGTVl (BAJ94055.1), Bd_UGT10850 (ХР 010230871.1) и Ob_UGT91Bl_like (ХР 006650455.1).[00107] Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase (UGTad) is able to transfer a glucose moiety to the C-2' 19-O-glucose position of Reb A to form Reb D. UGTad is also able to transfer a glucose moiety to the C-2' position of 19-O-glucose of stevioside to form Reb E. Useful examples of UGT include Os UGT 91C1 from Oryza sativa (also referred to as EUGT11 in Houghton-Lars en et al, WO 2013/022989 A2; XP 015629141.1) and S1UGT 101249881 from Solanum lycopersicum also referred to as UGTSL2 in Markosyan et al, WO2014/193888Al; XP 004250485.1). Additional useful UGTs include UGT40087 (XP 004982059.1; as described in WO 2018/031955), sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840 (XP 003560669.1), HvUGTVl (BAJ94055.1), Bd_UGT10850 ( XP 010230871.1) and Ob_UGT91Bl_like (XP 006650455.1).
Любой UGT или вариант UGT можно использовать в композициях и способах, описанных в данном документе. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, применимы в клетках и способах, представленных здесь. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичности последовательности по меньшей мере с одним из таких UGT. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% по меньшей мере с одним из этих UGT. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрена нуклеиновая кислота, кодирующая вариант UGT, описанный в настоящем документе.Any UGT or UGT variant can be used in the compositions and methods described herein. Nucleic acids encoding these enzymes are applicable in the cells and methods presented here. In some embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid having at least 80%, 85%, 90%, or 95% sequence identity with at least one such UGT. In certain embodiments, provided herein are cells and methods using a nucleic acid encoding a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95% sequence identity with at least one of these UGTs. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid encoding a UGT variant described herein.
6.5 Путь MEV Производство FPP и/или GGPP6.5 MEV Pathway Production of FPP and/or GGPP
[00108] В некоторых вариантах осуществления предложенная здесь генетически модифицированная клетка-хозяин содержит один или несколько гетерологичных ферментов пути MEV, полезных для образования FPP и/или GGPP. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует ацетоацетил-КоА с ацетил-КоА с образованием ГМГ-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который превращает ГМГ-КоА в мевалонат.В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который фосфорилирует мевалонат до мевалонат-5-фосфата. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который превращает мевалонат-5-фосфат в мевалонат-5-пирофосфат.В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который превращает мевалонат-5-пирофосфат в изопентенилпирофосфат.В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который превращает изопентенилпирофосфат в диметилаллилдифосфат.[00108] In some embodiments, the genetically modified host cell provided herein contains one or more heterologous MEV pathway enzymes useful for the formation of FPP and/or GGPP. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes comprise an enzyme that condenses acetyl-CoA with malonyl-CoA to form acetoacetyl-CoA. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes comprise an enzyme that condenses two molecules of acetyl-CoA to form acetoacetyl-CoA. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes comprise an enzyme that condenses acetoacetyl-CoA to acetyl-CoA to form HMG-CoA. In some embodiments, one or more MEV pathway enzymes contain an enzyme that converts HMG-CoA to mevalonate. In some embodiments, one or more MEV pathway enzymes contain an enzyme that phosphorylates mevalonate to mevalonate-5-phosphate. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes comprise an enzyme that converts mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-pyrophosphate. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes contain an enzyme that converts mevalonate-5-pyrophosphate to isopentenyl pyrophosphate. In some embodiments, one or more of the MEV pathway enzymes comprise an enzyme that converts isopentenyl pyrophosphate to dimethylallyl diphosphate.
[00109] В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV выбраны из группы, состоящей из ацетил-КоА-тиолазы, ацетоацетил-КоА-синтетазы, ГМГ-КоА-синтазы, ГМГ-КоА-редуктазы, мевалонаткиназы, фосфомевалонаткиназы, мевалонатпирофосфатдекарбонатной кислоты и изопентилдифосфата:диметилаллилдифосфата-изомеразы (IDI или IPP-изомеразы). В некоторых вариантах осуществления, что касается фермента пути MEV, способного катализировать образование ацетоацетил-КоА, генетически модифицированная клетка-хозяин содержит либо фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например ацетил-КоА тиолаза; или фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например ацетоацетил-КоА-синтазы. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит как фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетил-КоА тиолазу; и фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например ацетоацетил-КоА-синтазы.[00109] In some embodiments, one or more MEV pathway enzymes are selected from the group consisting of acetyl-CoA thiolase, acetoacetyl-CoA synthetase, HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, mevalon kinase, phosphomevalon kinase, mevalonate pyrophosphate decarbonate, and isopentyl diphosphate:dimethylallyl diphosphate isomerase (IDI or IPP isomerase). In some embodiments, for an MEV pathway enzyme capable of catalyzing the formation of acetoacetyl-CoA, the genetically modified host cell contains either an enzyme that condenses two molecules of acetyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, such as acetyl-CoA thiolase; or an enzyme that condenses acetyl-CoA with malonyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, such as acetoacetyl-CoA synthase. In some embodiments, the genetically modified host cell contains both an enzyme that condenses two molecules of acetyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, eg, acetyl-CoA thiolase; and an enzyme that condenses acetyl-CoA with malonyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, such as acetoacetyl-CoA synthase.
[00110] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих более одного фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих два фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих фермент, который может превращать ГМГ-КоА в мевалонат, и фермент, который может превращать мевалонат в мевалонат-5-фосфат. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих три фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих четыре фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих пять ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих шесть ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих семь ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит множество гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих все ферменты пути MEV.[00110] In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding more than one MEV pathway enzyme. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding two enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding an enzyme that can convert HMG-CoA to mevalonate and an enzyme that can convert mevalonate to mevalonate-5-phosphate. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding the three enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding the four enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding the five enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding the six enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding the seven enzymes of the MEV pathway. In some embodiments, the host cell contains a plurality of heterologous nucleic acids encoding all of the enzymes of the MEV pathway.
[00111] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может превращать изопентенилпирофосфат (IPP) в диметилаллилпирофосфат (DMAPP). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может конденсировать молекулы IPP и/или DMAPP с образованием полипренильного соединения. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может модифицировать IPP или полипренил с образованием изопреноидного соединения, такого как FPP.[00111] In some embodiments, the genetically modified host cell further comprises a heterologous nucleic acid encoding an enzyme that can convert isopentenyl pyrophosphate (IPP) to dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). In some embodiments, the genetically modified host cell further comprises a heterologous nucleic acid encoding an enzyme that can condense IPP and/or DMAPP molecules to form a polyprenyl compound. In some embodiments, the genetically modified host cell further comprises a heterologous nucleic acid encoding an enzyme that can modify IPP or polyprenyl to form an isoprenoid compound, such as FPP.
6.5.1 Превращение ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА6.5.1 Conversion of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA
[00112] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать две молекулы ацетил-кофермента А с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетил-КоА-тиолазы. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (РЕГИОН NC 000913: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) и (L20428; Saccharomyces cerevisiae).[00112] In some embodiments, the genetically modified host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can condense two molecules of acetyl coenzyme A to form acetoacetyl CoA, e.g., acetyl CoA thiolase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (REGION NC 000913: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) and (L20428; Saccharomyces cerevisiae).
[00113] Ацетил-КоА тиолаза катализирует обратимую конденсацию двух молекул ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, но эта реакция термодинамически невыгодна; Тиолиз ацетоацетил-КоА предпочтительнее синтеза ацетоацетил-КоА. Ацетоацетил-КоА-синтаза (AACS) (также называемая ацетил-КоА: малонил-КоА-ацилтрансфераза; ЕС 2.3.1.194) конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В отличие от тиолазы ацетил-КоА, синтез ацетоацетил-КоА, катализируемый AACS, по существу является энергетически выгодной реакцией из-за связанного декарбоксилирования малонил-КоА. Кроме того, AACS не проявляет активности тиолиза в отношении ацетоацетил-КоА, и, таким образом, реакция необратима.[00113] Acetyl-CoA thiolase catalyzes the reversible condensation of two molecules of acetyl-CoA to form acetoacetyl-CoA, but this reaction is thermodynamically unfavorable; Thiolysis of acetoacetyl-CoA is preferable to synthesis of acetoacetyl-CoA. Acetoacetyl-CoA synthase (AACS) (also called acetyl-CoA: malonyl-CoA acyltransferase; EC 2.3.1.194) condenses acetyl-CoA with malonyl-CoA to form acetoacetyl-CoA. Unlike acetyl-CoA thiolase, synthesis of acetoacetyl-CoA catalyzed by AACS is essentially an energetically favorable reaction due to the coupled decarboxylation of malonyl-CoA. In addition, AACS does not exhibit thiolysis activity against acetoacetyl-CoA, and thus the reaction is irreversible.
[00114] В клетках-хозяевах, содержащих ацетил-СоА тиолазу и гетерологичную ADA и/или фосфотрансацетилазу (РТА), обратимая реакция, катализируемая ацетил-СоА тиолазой, которая способствует тиолизу ацетоацетил-СоА, может привести к большому пулу ацетил-СоА. Принимая во внимание обратимую активность ADA, этот пул ацетил-КоА может, в свою очередь, подталкивать ADA к обратной реакции превращения ацетил-КоА в ацетальдегид, тем самым уменьшая преимущества, обеспечиваемые ADA в отношении продукции ацетил-КоА. Точно так же активность РТА обратима, и, таким образом, большой пул ацетил-СоА может подтолкнуть РТА к обратной реакции превращения ацетил-СоА в ацетилфосфат.Следовательно, в некоторых вариантах осуществления, чтобы обеспечить сильное притяжение ацетил-КоА для запуска прямой реакции ADA и РТА, в пути MEV генетически модифицированной клетки-хозяина, представленной в настоящем документе, используется ацетоацетил-КоА-синтаза для образования ацетоацетил-КоА из ацетил-КоА и малонил-КоА.[00114] In host cells containing acetyl-CoA thiolase and heterologous ADA and/or phosphotransacetylase (PTA), a reversible reaction catalyzed by acetyl-CoA thiolase that promotes thiolysis of acetoacetyl-CoA can result in a large pool of acetyl-CoA. Given the reversible activity of ADA, this pool of acetyl-CoA may in turn push ADA to reverse the conversion of acetyl-CoA to acetaldehyde, thereby reducing the benefits provided by ADA in terms of acetyl-CoA production. Similarly, PTA activity is reversible, and thus a large pool of acetyl-CoA can push PTA to reverse acetyl-CoA to acetyl phosphate. PTA, in the MEV pathway of the genetically modified host cell presented herein, uses acetoacetyl-CoA synthase to generate acetoacetyl-CoA from acetyl-CoA and malonyl-CoA.
[00115] В некоторых вариантах осуществления AACS происходит от Streptomyces sp., штамм CL190 (Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107 (25): 11265-70 (2010). Репрезентативные нуклеотидные последовательности AACS Streptomyces sp., штамм CL190 включает инвентарный номер АВ540131.1. Репрезентативные белковые последовательности AACS Streptomyces sp., штамм CL190 включает учетные номера D7URV0, ВАJ10048. Другие ацетоацетил-СоА-синтазы, применимые для композиций и способов, представленных в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, Streptomyces sp.(АВ183750; КО-3988 BAD86806); S. anulatus, штамм 9663 (FN 178498; САХ48662); Streptomyces sp.КО-3988 (АВ212624; ВАЕ78983); Actinoplanes sp.A40644 (AB113568; BAD07381); Streptomyces sp.С (NZACEW010000640; ZP_05511702): Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); Mycobacterium ulcerans Agy99 (NC 008611; YP 907152); Mycobacterium marinum M (NC 010612; YP 001851502); Streptomyces sp.Mgl (NZ DS570501; ZP 05002626); Streptomyces sp.AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); S. roseosporus NRRL 15998 (NZ ABYB01000295: ZP_04696763); Streptomyces sp.ACTE (NZADFD01000030; ZP_06275834); S viridochromogenes DSM 40736 (NZ ACEZ01000031; ZP 05529691); Frankia sp.CcI3 (NC 007777; YP 480101); Nocardia brasiliensis (NC 018681; YP 006812440.1); nAustwickia chelonae (NZBAGZ01000005; ZP 10950493.1). Дополнительные подходящие ацетоацетил-КоА-синтазы включают те, что описаны в публикациях патентных заявок США №№2010/0285549 и 2011/0281315, содержание которых полностью включено посредством ссылки.[00115] In some embodiments, the AACS is from Streptomyces sp., strain CL190 (Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107 (25): 11265-70 (2010). Representative AACS nucleotide sequences of Streptomyces sp., strain CL190 include accession number AB540131.1 Representative AACS protein sequences of Streptomyces sp., strain CL190 include accession numbers D7URV0, BAJ10048 Other acetoacetyl-CoA synthases useful for the compositions and methods provided herein include, but are not limited to, Streptomyces sp. (AB183750; KO-3988 BAD86806); S. anulatus, strain 9663 (FN 178498; CAX48662); Streptomyces sp.KO-3988 (AB212624; BAE78983); Actinoplanes sp.A40644 (AB113568; BAD07381); Streptomy ces sp.С ( NZACEW010000640; ZP_05511702): Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); Mycobacterium ulcerans Agy99 (NC 008611; YP 907152); Mycobacterium marinum M (NC 01061 2; YP 001851502); Streptomyces sp. Mgl (NZ DS570501; ZP 05002626); Streptomyces sp.AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); S. roseosporus NRRL 15998 (NZ ABYB01000295: ZP_04696763); Streptomyces sp.ACTE (NZADFD01000030; ZP_06275834); S viridochromogenes DSM 40736 (NZ ACEZ01000031; ZP 05529691); Frankia sp. CcI3 (NC 007777; YP 480101); Nocardia brasiliensis (NC 018681; YP 006812440.1); nAustwickia chelonae (NZBAGZ01000005; ZP 10950493.1). Additional suitable acetoacetyl-CoA synthases include those described in US Patent Application Publication Nos. 2010/0285549 and 2011/0281315, the contents of which are incorporated by reference in their entirety.
[00116] Ацетоацетил-КоА-синтазы, также используемые в композициях и способах, представленных в настоящем документе, включают те молекулы, которые, как говорят, являются «производными» любой из ацетоацетил-КоА-синтаз, описанных в данном документе. Такое «производное» имеет следующие характеристики: (1) оно имеет существенную гомологию с любой из ацетоацетил-КоА-синтаз, описанных здесь; и (2) способен катализировать необратимую конденсацию ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. Считается, что производное ацетоацетил-КоА синтазы имеет "существенную гомологию" с ацетоацетил-КоА синтазой, если аминокислотная последовательность производного по крайней мере на 80%, более предпочтительно по крайней мере на 90%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 95% совпадает с аминокислотной последовательностью ацетоацетил-КоА синтазы.[00116] Acetoacetyl-CoA synthases also used in the compositions and methods provided herein include those molecules that are said to be "derivatives" of any of the acetoacetyl-CoA synthases described herein. Such a "derivative" has the following characteristics: (1) it has significant homology to any of the acetoacetyl-CoA synthases described herein; and (2) is able to catalyze the irreversible condensation of acetyl-CoA with malonyl-CoA to form acetoacetyl-CoA. An acetoacetyl-CoA synthase derivative is considered to have "substantial homology" to acetoacetyl-CoA synthase if the amino acid sequence of the derivative is at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% identical to amino acid sequence of acetoacetyl-CoA synthase.
6.5.2 Превращение ацетоацетил-КоА в ГМГ-КоА6.5.2 Conversion of acetoacetyl-CoA to HMG-CoA
[00117] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать ацетоацетил-КоА с другой молекулой ацетил-КоА с образованием 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА (ГМГ-КоА), например, ГМГ- КоА-синтаза. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (NC 001145; комплемент 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (Х96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kit007302; Homo sapiens) и (NC 002758, Locus tag SAV2546, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus).[00117] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can condense acetoacetyl-CoA with another acetyl-CoA molecule to form 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA), e.g., HMG - CoA synthase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (NC 001145; complement 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kit007302; Homo sapi ens) and (NC 002758, Locus tag SAV2546, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus).
6.5.3 Превращение ГМГ-КоА в мевалонат6.5.3 Conversion of HMG-CoA to mevalonate
[00118] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может превращать ГМГ-КоА в мевалонат, например, ГМГ-КоА редуктазу. В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза представляет собой НАДН-использующую гидроксиметилглутарил-КоА редуктазу- Ко А редуктазу. ГМГ-Ко А-редуктазы (ЕС 1.1.1.34: ЕС 1.1.1.88) катализируют восстановительное деацилирование (8)-ГМГ-КоА до (R)-мевалоната, и их можно разделить на два класса: ГМГ класса I и класса П. Класс I включает ферменты эукариот и большинства архей, а класс II включает редуктазы ГМГ-КоА некоторых прокариот и архей. Помимо расхождения в последовательностях, ферменты двух классов также различаются по своей кофакторной специфичности. В отличие от ферментов класса I, которые используют исключительно НАДФН, редуктазы ГМГ-КоА класса II различаются по способности различать НАДФН и НАДН. См., например, Hedl и др., Journal of Bacteriology (Журнал бактериологии) 186 (7): 1927-1932 (2004). Ниже приведены особенности кофакторов для некоторых редуктаз ГМГ-КоА класса П.[00118] In some embodiments, the implementation of the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can convert HMG-CoA to mevalonate, for example, HMG-CoA reductase. In some embodiments, the HMG-CoA reductase is a NADH-using hydroxymethylglutaryl-CoA reductase-Co A reductase. HMG-Co A reductases (EC 1.1.1.34: EC 1.1.1.88) catalyze the reductive deacylation of (8)-HMG-CoA to (R)-mevalonate and can be divided into two classes: HMG class I and class P. Class I includes the enzymes of eukaryotes and most archaea, and class II includes the HMG-CoA reductases of some prokaryotes and archaea. In addition to sequence differences, the two classes of enzymes also differ in their cofactor specificity. Unlike class I enzymes, which exclusively use NADPH, class II HMG-CoA reductases differ in their ability to discriminate between NADPH and NADH. See, for example, Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004). Below are the features of cofactors for some HMG-CoA class P reductases.
Особенности кофакторов для некоторых редуктаз ГМГ-КоА класса IIFeatures of cofactors for some HMG-CoA class II reductases
[00119] Подходящие ГМГ-КоА-редуктазы для композиций и способов, представленных в настоящем документе, включают ГМГ-КоА-редуктазы, которые способны использовать НАДН в качестве кофактора, например, ГМГ-КоА-редуктазу из P. mevalonii, A. fulgidus или S. aureus. В конкретных вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза способна использовать только НАДН в качестве кофактора, например, ГМГ-КоА редуктазу из Р. mevalonii, S. pomeroyi или D. acidovorans.[00119] Suitable HMG-CoA reductases for the compositions and methods provided herein include HMG-CoA reductases that are capable of using NADH as a cofactor, such as HMG-CoA reductase from P. mevalonii, A. fulgidus, or S. aureus. In specific embodiments, the implementation of the HMG-CoA reductase is capable of using only NADH as a cofactor, for example, HMG-CoA reductase from P. mevalonii, S. pomeroyi or D. acidovorans.
[00120] В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, происходит из Pseudomonas mevalonii. Последовательность гена mvaA дикого типа Pseudomonas mevalonii, который кодирует ГМГ-КоА редуктазу (ЕС 1.1.1.88), была описана ранее. См. Beach and Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989). Репрезентативные нуклеотидные последовательности mvaA Pseudomonas mevalonii включают учетный номер М24015. Репрезентативные белковые последовательности ГМГ-КоА-редуктазы Pseudomonas mevalonii включают учетные номера ААА25837, Р13702, MVAA PSEMV. [00121] В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, получена из Silicibacter pomeroyi. Репрезентативные нуклеотидные последовательности ГМГ-КоА редуктазы Silicibacter pomeroyi включают учетный номер NC 006569.1. Репрезентативные белковые последовательности ГМГ-КоА-редуктазы Silicibacter pomeroyi включают учетный номер YP 164994.[00120] In some embodiments, the HMG-CoA reductase using NADH is from Pseudomonas mevalonii. The sequence of the Pseudomonas mevalonii wild-type mvaA gene, which encodes the HMG-CoA reductase (EC 1.1.1.88), has been described previously. See Beach and Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989). Representative mvaA Pseudomonas mevalonii nucleotide sequences include accession number M24015. Representative protein sequences of Pseudomonas mevalonii HMG-CoA reductase include accession numbers AAA25837, P13702, MVAA PSEMV. [00121] In some embodiments, the HMG-CoA reductase using NADH is derived from Silicibacter pomeroyi. Representative nucleotide sequences of HMG-CoA reductase Silicibacter pomeroyi include accession number NC 006569.1. Representative protein sequences of Silicibacter pomeroyi HMG-CoA reductase include YP accession number 164994.
[00122] В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, получена из Delftia acidovorans. Репрезентативная нуклеотидная[00122] In some embodiments, the HMG-CoA reductase using NADH is derived from Delftia acidovorans. Representative nucleotide
последовательность ГМГ-КоА редуктазы Delftia acidovorans включает NC 010002 REGION: комплемент (319980..321269). Репрезентативные последовательности белка ГМГ-КоА-редуктазы Delftia acidovorans включают учетный номер YP 001561318. [00123] В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА-редуктазы, использующие НАДН, происходят из Solanum tuberosum (Crane et al., J. Plant Physiol. 159: 1301-1307 (2002)).the HMG-CoA reductase sequence of Delftia acidovorans includes NC 010002 REGION: complement (319980..321269). Representative sequences for the Delftia acidovorans HMG-CoA reductase protein include YP accession number 001561318. [00123] In some embodiments, the HMG-CoA reductases using NADH are from Solanum tuberosum (Crane et al., J. Plant Physiol. 159: 1301 -1307 (2002)).
[00124] ГМГ-КоА-редуктазы, использующие НАДН, также полезные в композициях и способах, представленных в настоящем документе, включают те молекулы, которые, как говорят, являются «производными» любой из использующих НАДН ГМГ-КоА-редуктаз, описанных в данном документе, например, из P.mevalonii, S. pomeroyi и D. acidovorans. Такое «производное» имеет следующие характеристики: (1) оно имеет существенную гомологию с любой из описанных здесь редуктаз ГМГ-КоА, использующих НАДН; и (2) способен катализировать восстановительное деацилирование(8)-ГМГ-КоА до (R) -мевалоната, предпочтительно используя НАДН в качестве кофактора. Производное ГМГ-КоА-редуктазы, использующей НАДН, имеет «существенную гомологию» с ГМГ-КоА-редуктазой, использующей НАДН, если аминокислотные последовательности производного составляют не менее 80%, а более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 95%, как и у ГМГ-КоА редуктазы, использующей НАДН.[00124] NADH-using HMG-CoA reductases also useful in the compositions and methods provided herein include those molecules said to be "derivatives" of any of the NADH-using HMG-CoA reductases described herein. document, for example, from P. mevalonii, S. pomeroyi and D. acidovorans. Such a "derivative" has the following characteristics: (1) it has significant homology to any of the NADH-using HMG-CoA reductases described herein; and (2) is capable of catalyzing the reductive deacylation of (8)-HMG-CoA to (R)-mevalonate, preferably using NADH as a cofactor. A derivative of an HMG-CoA reductase using NADH has "substantial homology" to an HMG-CoA reductase using NADH if the amino acid sequences of the derivative are at least 80%, and more preferably at least 90%, and most preferably at least , 95%, as in HMG-CoA reductase using NADH.
[00125] В данном контексте фраза «с использованием НАДН» означает, что ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, является селективной в отношении НАДН по сравнению с НАДН в качестве кофактора, например, демонстрируя более высокую специфическую активность для НАДН, чем для НАДН. В некоторых вариантах осуществления селективность по НАДН в качестве кофактора выражается как отношение й:Са/НАДН^/ £сагГНАДФ1Я В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА-редуктаза, использующая НАДН, имеет отношение ксщ(:НАДЯ)/ кст(^АДФЯ) по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25 или более 25. В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА-редуктаза, использующая НАДН, использует исключительно НАДН. Например, ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, которая использует НАДН исключительно, проявляет некоторую активность с НАДН, поставляемым в качестве единственного кофактора in vitro, и не проявляет обнаруживаемой активности, когда НАДФН предоставляется в качестве единственного кофактора. Любой метод определения кофакторной специфичности, известный в данной области, может быть использован для идентификации ГМГ-КоА редуктаз, предпочитающих НАДН в качестве кофактора, включая те, которые описаны Kim et al, Protein Science 9: 1226-1234 (2000); и Wilding et al., J. Bacteriol. 182 (18): 5147-52 (2000), содержание которой полностью включено в настоящий документ.[00125] In this context, the phrase "using NADH" means that the HMG-CoA reductase using NADH is selective for NADH over NADH as a cofactor, for example, showing higher specific activity for NADH than for NADH. In some embodiments, the selectivity for NADH as a cofactor is expressed as the ratio of s: C a / NADH ^ / sag GNADP1 R In some embodiments, HMG -CoA reductase using NADH is related to s t ( ^ ADPH) is at least 5, 10, 15, 20, 25, or greater than 25. In some embodiments, the NADH-using HMG-CoA reductase uses NADH exclusively. For example, HMG-CoA reductase using NADH, which uses NADH exclusively, exhibits some activity with NADH supplied as the sole cofactor in vitro and exhibits no detectable activity when NADPH is provided as the sole cofactor. Any method of determining cofactor specificity known in the art can be used to identify HMG-CoA reductases that prefer NADH as a cofactor, including those described by Kim et al, Protein Science 9: 1226-1234 (2000); and Wilding et al., J. Bacteriol. 182 (18): 5147-52 (2000), the contents of which are incorporated herein in their entirety.
[00126] В некоторых вариантах осуществления изобретения ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, сконструирована так, чтобы быть селективной в отношении НАДН по сравнению с НАПД, например, посредством сайт-направленного мутагенеза кармана связывания кофактора. Способы конструирования НАДН-селективности описаны в Watanabe et al, Microbiology 153:3044-3054 (2007), а методы определения кофакторной специфичности ГМГ-КоА редуктаз описаны в Kim et al, Protein Sci. 9: 1226-1234 (2000), содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.[00126] In some embodiments, the HMG-CoA reductase using NADH is engineered to be selective for NADH over NAPD, for example, by site-directed mutagenesis of the cofactor binding pocket. Methods for constructing NADH selectivity are described in Watanabe et al, Microbiology 153:3044-3054 (2007), and methods for determining the cofactor specificity of HMG-CoA reductases are described in Kim et al, Protein Sci. 9: 1226-1234 (2000), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[00127] В некоторых вариантах осуществления ГМГ-КоА редуктаза, использующая НАДН, происходит от вида-хозяина, который изначально включает путь разложения мевалоната, например, от вида-хозяина, который катаболизирует мевалонат в качестве своего единственного источника углерода. В этих вариантах осуществления ГМГ-КоА-редуктаза, использующая НАДН, которая обычно катализирует окислительное ацилирование интернализованного (R) -мевалоната до (8)-ГМГ-КоА внутри его нативной клетки-хозяина, используется для катализа обратной реакции, то есть, восстановительное деацилирование (8)-ГМГ-КоА до (К)-мевалоната в генетически модифицированной клетке-хозяине, включающей путь биосинтеза мевалоната. Прокариоты, способные расти на мевалонате в качестве единственного источника углерода, были описаны: Anderson et al., J. Bacteriol, 171 (12): 6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171: 2994-3001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); and Takatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 110:187-193 (1983), содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. [00128] В некоторых вариантах осуществления представленных здесь композиций и способов клетка-хозяин содержит как HMGr, использующую НАДН, так и ГМГ-КоА-редуктазу, использующую НАДФН. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих ГМГ-КоА-редуктазу, использующую НАДФН, включают, помимо прочего: (NM 206548; Drosophila melanogaster), (NC 002758, метка локуса SAV2545, GenelD 1122570; Staphylococcus aureus), (ABO 15627; Streptomyces sp.КО 3988), (AX 128213, обеспечивающий последовательность, кодирующую усеченную ГМГ-КоА-редуктазу; Saccharomyces cerevisiae) и (NC_001145: комплемент (115734.118898: Saccharomyces cerevisiae).[00127] In some embodiments, the HMG-CoA reductase using NADH is from a host species that originally includes a mevalonate degradation pathway, e.g., from a host species that catabolizes mevalonate as its sole carbon source. In these embodiments, HMG-CoA reductase using NADH, which typically catalyzes the oxidative acylation of internalized (R)-mevalonate to (8)-HMG-CoA within its native host cell, is used to catalyze the reverse reaction, i.e., reductive deacylation (8)-HMG-CoA to (K)-mevalonate in a genetically modified host cell, including the mevalonate biosynthetic pathway. Prokaryotes capable of growing on mevalonate as the sole carbon source have been described: Anderson et al., J. Bacteriol, 171 (12): 6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171: 2994-3001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); and Takatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. commun. 110:187-193 (1983), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. [00128] In some embodiments of the compositions and methods provided herein, the host cell contains both HMGr using NADH and HMG-CoA reductase using NADPH. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding an HMG-CoA reductase using NADPH include, but are not limited to: (NM 206548; Drosophila melanogaster), (NC 002758, locus tag SAV2545, GenelD 1122570; Staphylococcus aureus), (ABO 15627; Streptomyces sp. KO 3988), (AX 128213 providing a sequence encoding a truncated HMG-CoA reductase; Saccharomyces cerevisiae) and (NC_001145: complement (115734.118898: Saccharomyces cerevisiae).
6.5.4 Превращение мевалоната в мевалонат-5-фосфат6.5.4 Conversion of mevalonate to mevalonate-5-phosphate
[00129] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может превращать мевалонат в мевалонат-5-фосфат, например мевалонаткиназу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (L77688; Arabidopsis thaliana) и (Х55875; Saccharomyces cerevisiae).[00129] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can convert mevalonate to mevalonate-5-phosphate, such as mevalonate kinase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (L77688; Arabidopsis thaliana) and (X55875; Saccharomyces cerevisiae).
6.5.5 Превращение мевалонат-5-фосфата в мевалонат-5-пирофосфат6.5.5 Conversion of mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-pyrophosphate
[00130] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может превращать мевалонат-5-фосфат в мевалонат-5-пирофосфат, например, фосфомевалонаткиназу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens) и (NC_001145. комплемент 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).[00130] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can convert mevalonate-5-phosphate to mevalonate-5-pyrophosphate, such as phosphomevalonate kinase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens) and (NC_001145. complement 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).
6.5.6 Превращение мевалонат-5-пирофосфата в IPP6.5.6 Conversion of mevalonate-5-pyrophosphate to IPP
[00131] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может превращать мевалонат-5-пирофосфат в изопентенилдифосфат (1РР)>например, мевалонатпирофосфатдекарбоксилазу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (Х97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) и (U49260; Homo sapiens).[00131] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can convert mevalonate-5-pyrophosphate to isopentenyl diphosphate (1PP) > eg, mevalonate pyrophosphate decarboxylase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) and (U49260; Homo sapiens).
6.5.7 Преобразование IPP в DMAPP6.5.7 Converting IPP to DMAPP
[00132] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать IPP, генерируемый посредством пути MEV, в диметилаллилпирофосфат (DMAPP), например, изомеразу IPP. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli) и (AF082326; Haematococcus pluvialis).[00132] In some embodiments, the host cell further comprises a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can convert IPP generated by the MEV pathway to dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP), eg, IPP isomerase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli) and (AF082326; Haematococcus pluvialis).
6.5.8 Полипренилсинтазы6.5.8 Polyprenyl synthase
[00133] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипренилсинтазу, которая может конденсировать молекулы IPP и/или DMAPP с образованием полипренильных соединений, содержащих более пяти атомов углерода. [00134] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать одну молекулу IPP с одной молекулой DMAPP с образованием одной молекулы геранилпирофосфата («GPP»), например, GPP-синтазы. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113: Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376: Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus AP11092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ipspini), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera) и (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).[00133] In some embodiments, the host cell further comprises a heterologous nucleotide sequence encoding a polyprenyl synthase that can condense IPP and/or DMAPP molecules to form polyprenyl compounds having more than five carbon atoms. [00134] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can condense one molecule of IPP with one molecule of DMAPP to form one molecule of geranyl pyrophosphate ("GPP"), e.g., GPP synthase. Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113: Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus) , (Y17376: Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus AP11092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ipspini) ), (AF182828 ; Mentha x piperita) , Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).
[00135] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать две молекулы IPP с одной молекулой DMAPP или добавлять молекулу IPP к молекуле GPP с образованием молекулы фарнезилпирофосфата («FPP»), например, FPP-синтаза. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC 008022, Locus YP 598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC 008023, Locus YP 600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC 008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stear other mophilus), (NC_002940, Locus NP_873754: Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP 395294; Lactobacillus sakei subsp.sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll-130), (АВ003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YV_20W6%; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp.NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, локус AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, локус AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6) и (NC_004556, локус NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal).[00135] In some embodiments, the host cell contains a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can fuse two IPP molecules with one DMAPP molecule or add an IPP molecule to a GPP molecule to form a farnesyl pyrophosphate (“FPP”) molecule, e.g., FPP synthase . Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K -12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFA PS; Homo sapiens) , (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus) YP 598856 Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC 008023, Locus YP 600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC 008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D 84432, Locus BAA12575, Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stear other mophilus), (NC_002940, Locus NP_873754: Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae R d KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP 395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll-130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YV_2 0W6% Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp.NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6 ) and (NC_004556, locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal).
[00136] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может объединять IPP и DMAPP или IPP и FPP с образованием геранилгеранилпирофосфата («GGPP»). Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, но не ограничиваются ими: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (ВТ005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ AABF02000074, Locus ZP 00144509; Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (ABO55496; Hevea brasiliensis), (AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus), (ABO 16044; Mus musculus), (ААВХ01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ AAKL01000008, Locus ZP 00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (ABO 16095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ESI 14), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides) и (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159).[00136] In some embodiments, the host cell further comprises a heterologous nucleotide sequence encoding an enzyme that can combine IPP and DMAPP or IPP and FPP to form geranylgeranyl pyrophosphate ("GGPP"). Illustrative examples of nucleotide sequences encoding such an enzyme include, but are not limited to: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis sero var israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ AABF02000074, Locus ZP 00144509; Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (ABO55496; Hevea brasiliensis), ( AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus), (ABO 16044; Mus musculus), (AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ AAKL01000008 , Locus ZP 00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae) itrophicus SB) , (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ESI 14), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodob actor sphaeroides) and (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159).
[00137] Хотя примеры ферментов мевалонатного пути описаны выше, в некоторых вариантах осуществления ферменты пути DXP можно использовать в качестве альтернативного или дополнительного пути для продуцирования DMAPP и IPP в клетках-хозяевах, композициях и способах, описанных в данном документе. Ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты пути DXP, хорошо известны и охарактеризованы в данной области, например, WO 2012/135591 А2.[00137] Although examples of mevalonate pathway enzymes are described above, in some embodiments, DXP pathway enzymes can be used as an alternative or additional pathway for the production of DMAPP and IPP in host cells, the compositions and methods described herein. Enzymes and nucleic acids encoding DXP pathway enzymes are well known and characterized in the art, for example WO 2012/135591 A2.
6.6 Способы получения стевиоловых гликозидов6.6 Processes for the preparation of steviol glycosides
[00138] В другом аспекте в настоящем документе предоставляется способ получения гликозида стевиола, который включает стадии: (а) культивирования популяции любой из генетически модифицированных клеток-хозяев, описанных в данном документе, которые способны продуцировать гликозид стевиола в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения гликозидного соединения стевиола; и (b) выделение указанного стевиолгликозидного соединения из среды.[00138] In another aspect, provided herein is a method for producing steviol glycoside, which includes the steps of: (a) culturing a population of any of the genetically modified host cells described herein that are capable of producing steviol glycoside in an environment with a carbon source under conditions, suitable for preparing the steviol glycosidic compound; and (b) isolating said steviol glycosidic compound from the medium.
[00139] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин продуцирует повышенное количество стевиолового гликозида по сравнению с родительской клеткой, не содержащей одну или несколько модификаций, или родительской клеткой, содержащей только подмножество одной или нескольких модификаций генетически модифицированной клетки-хозяина, но в остальном генетически идентичной. В некоторых вариантах осуществления увеличенное количество составляет по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65. %, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более 100%, как измерено, например, по выходу, объему производства и/или производительности, в граммах на литр клеточной культуры, миллиграммах на грамм веса сухих клеток, на единицу объема клеточной культуры, на единицу веса сухих клеток, на единицу объема клеточной культуры в единицу времени или на единицу веса сухих клеток в единицу времени.[00139] In some embodiments, the genetically modified host cell produces an increased amount of steviol glycoside compared to a parent cell that does not contain one or more modifications, or a parent cell that contains only a subset of one or more modifications of the genetically modified host cell, but otherwise genetically identical. In some embodiments, the increased amount is at least 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 .%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% or more than 100%, as measured, for example, by yield, production volume and/or productivity, in grams per liter of cell culture, milligrams per gram of dry cell weight, per unit volume of cell culture, per unit weight of dry cells, per unit volume of cell culture per unit time, or per unit weight of dry cells per unit time.
[00140] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 1 грамм на литр ферментационной среды. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 5 граммов на литр ферментационной среды. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 10 грамм на литр ферментационной среды. В некоторых вариантах осуществления стевиоловый гликозид производится в количестве от около 10 до около 50 граммов, от около 10 до около 15 граммов, более чем около 15 граммов, более чем около 20 граммов, более чем около 25 граммов или более чем около 30 грамм на литр клеточной культуры.[00140] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is greater than about 1 gram per liter of fermentation medium. In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is greater than about 5 grams per liter of fermentation medium. In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is greater than about 10 grams per liter of fermentation medium. In some embodiments, the steviol glycoside is manufactured in an amount of about 10 to about 50 grams, about 10 to about 15 grams, more than about 15 grams, more than about 20 grams, more than about 25 grams, or more than about 30 grams per liter. cell culture.
[00141] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 50 миллиграммов на грамм сухой массы клетки. В некоторых таких воплощениях гликозид стевиола производится в количестве от около 50 до около 1500 миллиграмм, более чем около 100 миллиграмм, более чем около 150 миллиграмм, более чем около 200 миллиграмм, более чем около 250 миллиграмм, более чем около 500 миллиграмм, более чем около 750 миллиграмм или более чем около 1000 миллиграмм на грамм сухого веса клеток.[00141] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is greater than about 50 milligrams per gram of cell dry weight. In some such embodiments, the steviol glycoside is manufactured in an amount of from about 50 to about 1500 milligrams, more than about 100 milligrams, more than about 150 milligrams, more than about 200 milligrams, more than about 250 milligrams, more than about 500 milligrams, more than about 750 milligrams or more than about 1000 milligrams per gram of cell dry weight.
[00142] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 15%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 35%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 45%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 30 раз, по меньшей мере примерно в 40 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, по меньшей мере примерно в 75 раз, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз, по меньшей мере примерно в 400 раз, по меньшей мере примерно в 500 раз или по меньшей мере примерно в 1000 раз или более, выше, чем уровень стевиолгликозида, продуцируемого родительской клеткой, в расчете на единицу объема клеточной культуры.[00142] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 60%, at least at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 2 times, at least about 2.5 times, at least about 5 times, at least at least about 10 times, at least about 20 times, at least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 75 times, at least about 100 times, at least about 200 times, at least about 300 times, at least about 400 times, at least about 500 times, or at least about 1000 times or more, higher than the level steviol glycoside produced by the parent cell, per unit volume of the cell culture.
[00143] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 15%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 35%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 45%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 30 раз, по меньшей мере примерно в 40 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, по меньшей мере примерно в 75 раз, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз, по меньшей мере примерно в 400 раз, по меньшей мере примерно в 500 раз или по меньшей мере примерно в 1000 раз или более, выше, чем уровень стевиолгликозида, продуцируемого родительской клеткой, в расчете на единицу массы сухой клетки.[00143] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 60%, at least at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 2 times, at least about 2.5 times, at least about 5 times, at least at least about 10 times, at least about 20 times, at least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 75 times, at least about 100 times, at least about 200 times, at least about 300 times, at least about 400 times, at least about 500 times, or at least about 1000 times or more, higher than the level steviol glycoside produced by the parent cell, per unit mass of dry cell.
[00144] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 15%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 35%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 45%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 30 раз, по меньшей мере примерно в 40 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, по меньшей мере примерно в 75 раз, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз, по меньшей мере примерно в 400 раз, по меньшей мере примерно в 500 раз или по меньшей мере примерно в 1000 раз или более, выше, чем уровень стевиолгликозида, продуцируемого родительской клеткой, в расчете на единицу объема клеточной культуры в единицу времени. [00145] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 15%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 25%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 35%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 45%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 30 раз, по меньшей мере примерно в 40 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, по меньшей мере примерно в 75 раз, по меньшей мере примерно в 100 раз, по меньшей мере примерно в 200 раз, по меньшей мере примерно в 300 раз, по меньшей мере примерно в 400 раз, по меньшей мере примерно в 500 раз или по меньшей мере примерно в 1000 раз или более, выше, чем уровень стевиолгликозида, продуцируемого родительской клеткой, в расчете на единицу сухой массы клетки в единицу времени. [00146] В большинстве вариантов осуществления продукция повышенного уровня стевиолгликозида клеткой-хозяином индуцируется присутствием индуцирующего соединения. Такой клеткой-хозяином можно легко манипулировать в отсутствие индуцирующего соединения. Затем добавляют индуцирующее соединение для индукции продукции повышенного уровня стевиолгликозида клеткой-хозяином. В других вариантах осуществления продукция повышенного уровня стевиолгликозида клеткой-хозяином индуцируется изменением условий культивирования, таких как, например, температура роста, состав среды и т.п.[00144] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 60%, at least at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 2 times, at least about 2.5 times, at least about 5 times, at least at least about 10 times, at least about 20 times, at least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 75 times, at least about 100 times, at least about 200 times, at least about 300 times, at least about 400 times, at least about 500 times, or at least about 1000 times or more, higher than the level steviol glycoside produced by the parent cell, per unit volume of the cell culture per unit time. [00145] In some embodiments, the host cell produces an elevated level of steviol glycoside that is at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50%, at least about 60%, at least at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 2 times, at least about 2.5 times, at least about 5 times, at least at least about 10 times, at least about 20 times, at least about 30 times, at least about 40 times, at least about 50 times, at least about 75 times, at least about 100 times, at least about 200 times, at least about 300 times, at least about 400 times, at least about 500 times, or at least about 1000 times or more, higher than the level steviol glycoside produced by the parent cell, per unit of dry mass of the cell per unit of time. [00146] In most embodiments, the production of elevated levels of steviol glycoside by the host cell is induced by the presence of an inducing compound. Such a host cell can be easily manipulated in the absence of an inducing compound. An inducing compound is then added to induce the production of elevated levels of steviol glycoside by the host cell. In other embodiments, production of an increased level of steviol glycoside by the host cell is induced by changing culture conditions such as, for example, growth temperature, medium composition, and the like.
6.7 Кулътуральные среды и условия6.7 Culture media and conditions
[00147] Материалы и методы для поддержания и роста микробных культур хорошо известны специалистам в области микробиологии или науки о ферментации (см., например, Bailey et al, Biochemical Engineering Fundamentals (Основы биохимической инженерии), второе издание, McGraw Hill, New York, 1986 г.). Необходимо учитывать подходящую культуральную среду, рН, температуру и требования к аэробным, микроаэробным или анаэробным условиям, в зависимости от конкретных требований клетки-хозяина, ферментации и процесса.[00147] Materials and methods for maintaining and growing microbial cultures are well known to those skilled in microbiology or fermentation science (see, for example, Bailey et al, Biochemical Engineering Fundamentals, Second Edition, McGraw Hill, New York, 1986). Suitable culture media, pH, temperature, and requirements for aerobic, microaerobic, or anaerobic conditions must be considered, depending on the specific requirements of the host cell, fermentation, and process.
[00148] Способы получения стевиоловых гликозидов, представленные в настоящем документе, могут быть выполнены в подходящей культуральной среде (например, с добавлением пантотената или без него) в подходящем контейнере, включая, помимо прочего, планшет для культивирования клеток, планшет для микротитрования, колбу или ферментатор. Кроме того, способы могут быть выполнены в любом масштабе ферментации, известном в данной области, для поддержки промышленного производства микробных продуктов. Может быть использован любой подходящий ферментатор, включая ферментатор с мешалкой, ферментатор с эрлифтом, пузырьковый ферментатор или любую их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления, использующих Saccharomyces cerevisiae в качестве клетки-хозяина, штаммы можно выращивать в ферментаторе, как подробно описано Kosaric и др. в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Энциклопедии промышленной химии Ульманна), шестое издание, том 12, страницы 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Вайнхайм, Германия.[00148] The methods for producing steviol glycosides provided herein can be performed in a suitable culture medium (e.g., with or without the addition of pantothenate) in a suitable container, including, but not limited to, a cell culture plate, a microtiter plate, a flask, or fermenter. In addition, the methods can be performed at any fermentation scale known in the art to support industrial production of microbial products. Any suitable fermenter may be used, including a stirred fermenter, an airlift fermenter, a bubble fermenter, or any combination thereof. In specific embodiments using Saccharomyces cerevisiae as the host cell, the strains can be grown in a fermenter as detailed by Kosaric et al. in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, Pages 398-473 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germany.
[00149] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда представляет собой любую культуральную среду, в которой может существовать генетически модифицированный микроорганизм, способный продуцировать стевиоловый гликозид, т.е. поддерживать рост и жизнеспособность. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда представляет собой водную среду, содержащую источники ассимилируемого углерода, азота и фосфата. Такая среда может также включать соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества. В некоторых вариантах осуществления источник углерода и каждое из основных питательных веществ для клеток добавляются в ферментационную среду постепенно или непрерывно, и каждое необходимое питательное вещество поддерживается по существу на минимальном уровне, необходимом для эффективной ассимиляции растущими клетками, например, в соответствии с заданной кривой роста клеток, основанной на метаболической или дыхательной функции клеток, которые преобразуют источник углерода в биомассу.[00149] In some embodiments, the culture medium is any culture medium in which a genetically modified microorganism capable of producing steviol glycoside, i. support growth and vitality. In some embodiments, the culture medium is an aqueous medium containing sources of assimilable carbon, nitrogen, and phosphate. Such an environment may also include appropriate salts, minerals, metals, and other nutrients. In some embodiments, the carbon source and each of the essential cell nutrients are added to the fermentation medium gradually or continuously, and each essential nutrient is maintained at substantially the minimum level necessary for efficient assimilation by growing cells, e.g., following a predetermined cell growth curve. based on the metabolic or respiratory function of the cells that convert the carbon source into biomass.
[00150] Подходящие условия и подходящие среды для культивирования микроорганизмов хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления подходящая среда дополняется одним или несколькими дополнительными агентами, такими как, например, индуктор (например, когда одна или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих продукт гена, находятся под контролем индуцибельного промотора), репрессор (например, когда одна или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих продукт гена, находятся под контролем репрессируемого промотора) или агента отбора (например, антибиотика для отбора микроорганизмов, содержащих генетические модификации).[00150] Suitable conditions and suitable media for culturing microorganisms are well known in the art. In some embodiments, a suitable environment is supplemented with one or more additional agents, such as, for example, an inducer (for example, when one or more nucleotide sequences encoding a gene product are under the control of an inducible promoter), a repressor (for example, when one or more nucleotide sequences coding for the gene product are under the control of a repressed promoter) or a selection agent (for example, an antibiotic for the selection of microorganisms containing genetic modifications).
[00151] В некоторых вариантах осуществления источник углерода представляет собой моносахарид (простой сахар), дисахарид, полисахарид, неферментируемый источник углерода или одну или несколько их комбинаций. Неограничивающие примеры подходящих моносахаридов включают глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу, ксилозу, рибозу и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих дисахаридов включают сахарозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих полисахаридов включают крахмал, гликоген, целлюлозу, хитин и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих неферментируемых источников углерода включают ацетат и глицерин.[00151] In some embodiments, the carbon source is a monosaccharide (simple sugar), a disaccharide, a polysaccharide, a non-fermentable carbon source, or one or more combinations thereof. Non-limiting examples of suitable monosaccharides include glucose, galactose, mannose, fructose, xylose, ribose, and combinations thereof. Non-limiting examples of suitable disaccharides include sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, and combinations thereof. Non-limiting examples of suitable polysaccharides include starch, glycogen, cellulose, chitin, and combinations thereof. Non-limiting examples of suitable non-fermentable carbon sources include acetate and glycerol.
[00152] Концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде достаточна для стимулирования роста клеток, но не настолько высока, чтобы подавлять рост используемых микроорганизмов. Как правило, культивирование проводится с источником углерода, таким как глюкоза, добавляемым в количествах, обеспечивающих желаемый уровень роста и биомассы. В других вариантах осуществления концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде больше примерно 1 г/л, предпочтительно больше примерно 2 г/л и более предпочтительно больше примерно 5 г/л. Кроме того, концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде обычно составляет менее примерно 100 г/л, предпочтительно менее примерно 50 г/л и более предпочтительно менее примерно 20 г/л. Следует отметить, что ссылки на концентрации компонентов культуры могут относиться как к начальным, так и/или текущим концентрациям компонентов. В некоторых случаях может быть желательно позволить питательной среде истощиться от источника углерода во время культивирования.[00152] The concentration of a carbon source, such as glucose, in the culture medium is sufficient to stimulate cell growth, but not so high as to inhibit the growth of the microorganisms used. Typically, cultivation is carried out with a carbon source, such as glucose, added in amounts that provide the desired level of growth and biomass. In other embodiments, the concentration of a carbon source, such as glucose, in the culture medium is greater than about 1 g/L, preferably greater than about 2 g/L, and more preferably greater than about 5 g/L. In addition, the concentration of a carbon source such as glucose in the culture medium is typically less than about 100 g/L, preferably less than about 50 g/L, and more preferably less than about 20 g/L. It should be noted that references to concentrations of culture components may refer to both initial and/or current concentrations of components. In some cases, it may be desirable to allow the growth medium to deplete from the carbon source during culture.
[00153] Источники ассимилируемого азота, которые можно использовать в подходящей культуральной среде, включают, помимо прочего, простые источники азота, источники органического азота и сложные источники азота. Такие источники азота включают безводный аммиак, соли аммония и вещества животного, растительного и/или микробного происхождения. Подходящие источники азота включают, но не ограничиваются ими, гидролизаты белка, гидролизаты микробной биомассы, пептон, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, мочевину и аминокислоты. Обычно концентрация источников азота в культуральной среде больше примерно 0,1 г/л, предпочтительно больше примерно 0,25 г/л и более предпочтительно больше примерно 1,0 г/л. Однако при превышении определенных концентраций добавление источника азота к культуральной среде не способствует росту микроорганизмов. В результате концентрация источников азота в культуральной среде составляет менее примерно 20 г/л, предпочтительно менее примерно 10 г/л и более предпочтительно менее примерно 5 г/л. Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно позволить питательной среде истощиться от источников азота во время культивирования.[00153] Assimilated nitrogen sources that can be used in a suitable culture medium include, but are not limited to, simple nitrogen sources, organic nitrogen sources, and complex nitrogen sources. Such nitrogen sources include anhydrous ammonia, ammonium salts, and substances of animal, vegetable and/or microbial origin. Suitable nitrogen sources include, but are not limited to, protein hydrolysates, microbial biomass hydrolysates, peptone, yeast extract, ammonium sulfate, urea, and amino acids. Typically, the concentration of nitrogen sources in the culture medium is greater than about 0.1 g/L, preferably greater than about 0.25 g/L, and more preferably greater than about 1.0 g/L. However, beyond certain concentrations, the addition of a nitrogen source to the culture medium does not promote microbial growth. As a result, the concentration of nitrogen sources in the culture medium is less than about 20 g/L, preferably less than about 10 g/L, and more preferably less than about 5 g/L. In addition, in some cases it may be desirable to allow the growth medium to be depleted from nitrogen sources during cultivation.
[00154] Эффективная питательная среда может содержать другие соединения, такие как неорганические соли, витамины, следовые количества металлов или стимуляторы роста. Такие другие соединения также могут присутствовать в источниках углерода, азота или минералов в эффективной среде или могут быть добавлены специально в среду.[00154] An effective nutrient medium may contain other compounds such as inorganic salts, vitamins, trace metals, or growth promoters. Such other compounds may also be present in the carbon, nitrogen, or mineral sources in the effective medium, or may be added specifically to the medium.
[00155] Питательная среда также может содержать подходящий источник фосфата. Такие источники фосфатов включают источники как неорганических, так и органических фосфатов. Предпочтительные источники фосфатов включают, но не ограничиваются ими, фосфатные соли, такие как одно- или двухосновные фосфаты натрия и калия, фосфат аммония и их смеси. Обычно концентрация фосфата в культуральной среде больше примерно 1,0 г/л, предпочтительно больше примерно 2,0 г/л и более предпочтительно больше примерно 5,0 г/л. Однако при превышении определенных концентраций добавление фосфата в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов. Соответственно, концентрация фосфата в культуральной среде обычно составляет менее примерно 20 г/л, предпочтительно менее примерно 15 г/л и более предпочтительно менее примерно 10 г/л.[00155] The nutrient medium may also contain a suitable source of phosphate. Such phosphate sources include both inorganic and organic phosphate sources. Preferred phosphate sources include, but are not limited to, phosphate salts such as mono- or dibasic sodium and potassium phosphates, ammonium phosphate, and mixtures thereof. Typically, the phosphate concentration in the culture medium is greater than about 1.0 g/L, preferably greater than about 2.0 g/L, and more preferably greater than about 5.0 g/L. However, above certain concentrations, the addition of phosphate to the culture medium does not promote the growth of microorganisms. Accordingly, the phosphate concentration in the culture medium is typically less than about 20 g/L, preferably less than about 15 g/L, and more preferably less than about 10 g/L.
[00156] Подходящая культуральная среда может также включать источник магния, предпочтительно в форме физиологически приемлемой соли, такой как гептагидрат сульфата магния, хотя можно использовать другие источники магния в концентрациях, которые вносят аналогичные количества магния. Обычно концентрация магния в культуральной среде больше примерно 0,5 г/л, предпочтительно больше примерно 1,0 г/л и более предпочтительно больше примерно 2,0 г/л. Однако при превышении определенных концентраций добавление магния в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов. Соответственно, концентрация магния в культуральной среде обычно составляет менее примерно 10 г/л, предпочтительно менее примерно 5 г/л и более предпочтительно менее примерно 3 г/л. Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно позволить культуральной среде истощиться от источника магния во время культивирования.[00156] A suitable culture medium may also include a magnesium source, preferably in the form of a physiologically acceptable salt such as magnesium sulfate heptahydrate, although other magnesium sources can be used at concentrations that contribute similar amounts of magnesium. Typically, the concentration of magnesium in the culture medium is greater than about 0.5 g/L, preferably greater than about 1.0 g/L, and more preferably greater than about 2.0 g/L. However, when certain concentrations are exceeded, the addition of magnesium to the culture medium does not promote the growth of microorganisms. Accordingly, the concentration of magnesium in the culture medium is typically less than about 10 g/L, preferably less than about 5 g/L, and more preferably less than about 3 g/L. In addition, in some cases it may be desirable to allow the culture medium to be depleted from the magnesium source during culture.
[00157] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда может также включать биологически приемлемый хелатирующий агент, такой как дигидрат тринатрийцитрата. В таком случае концентрация хелатирующего агента в культуральной среде больше примерно 0,2 г/л, предпочтительно больше примерно 0,5 г/л и более предпочтительно больше примерно 1 г/л. Однако при превышении определенных концентраций добавление хелатирующего агента к культуральной среде не способствует росту микроорганизмов. Соответственно, концентрация хелатирующего агента в культуральной среде обычно составляет менее примерно 10 г/л, предпочтительно менее примерно 5 г/л и более предпочтительно менее примерно 2 г/л.[00157] In some embodiments, the culture medium may also include a biologically acceptable chelating agent, such as trisodium citrate dihydrate. In such a case, the concentration of the chelating agent in the culture medium is greater than about 0.2 g/L, preferably greater than about 0.5 g/L, and more preferably greater than about 1 g/L. However, when certain concentrations are exceeded, the addition of a chelating agent to the culture medium does not promote the growth of microorganisms. Accordingly, the concentration of the chelating agent in the culture medium is typically less than about 10 g/L, preferably less than about 5 g/L, and more preferably less than about 2 g/L.
[00158] Культуральная среда может также изначально включать биологически приемлемую кислоту или основание для поддержания желаемого рН культуральной среды. Биологически приемлемые кислоты включают, но не ограничиваются ими, соляную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и их смеси. Биологически приемлемые основания включают, но не ограничиваются ими, гидроксид аммония, гидроксид натрия, гидроксид калия и их смеси. В некоторых вариантах осуществления используемое основание представляет собой гидроксид аммония.[00158] The culture medium may also initially include a biologically acceptable acid or base to maintain the desired pH of the culture medium. Biologically acceptable acids include, but are not limited to, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and mixtures thereof. Biologically acceptable bases include, but are not limited to, ammonium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, and mixtures thereof. In some embodiments, the base used is ammonium hydroxide.
[00159] Культуральная среда может также включать биологически приемлемый источник кальция, включая, но не ограничиваясь этим, хлорид кальция. Обычно концентрация источника кальция, такого как хлорид, дигидрат кальция, в культуральной среде находится в диапазоне от примерно 5 мг/л до примерно 2000 мг/л, предпочтительно в диапазоне от примерно 20 мг/л до примерно 1000 мг/л и более предпочтительно в диапазоне от примерно 50 мг/л до примерно 500 мг/л.[00159] The culture medium may also include a biologically acceptable source of calcium, including but not limited to calcium chloride. Typically, the concentration of a calcium source, such as calcium chloride, calcium dihydrate, in the culture medium is in the range of about 5 mg/l to about 2000 mg/l, preferably in the range of about 20 mg/l to about 1000 mg/l, and more preferably in range from about 50 mg/l to about 500 mg/l.
[00160] Питательная среда также может включать хлорид натрия. Обычно концентрация хлорида натрия в культуральной среде находится в диапазоне от примерно 0,1 г/л до примерно 5 г/л, предпочтительно в диапазоне от примерно 1 г/л до примерно 4 г/л, а более предпочтительно в диапазоне от примерно 2 г/л до примерно 4 г/л.[00160] The nutrient medium may also include sodium chloride. Typically, the concentration of sodium chloride in the culture medium is in the range of about 0.1 g/l to about 5 g/l, preferably in the range of about 1 g/l to about 4 g/l, and more preferably in the range of about 2 g/l /l to about 4 g/l.
[00161] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда может также включать следовые количества металлов. Такие следовые количества металлов могут быть добавлены в культуральную среду в виде исходного раствора, который для удобства может быть приготовлен отдельно от остальной культуральной среды. Обычно количество такого раствора микроэлементов металлов, добавляемого в культуральную среду, составляет более примерно 1 мл/л, предпочтительно более примерно 5 мл/л и более предпочтительно более примерно 10 мл/л. Однако при превышении определенных концентраций добавление следов металлов в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов. Соответственно, количество такого раствора следов металлов, добавляемого в культуральную среду, обычно составляет менее примерно 100 мл/л, предпочтительно менее примерно 50 мл/л и более предпочтительно менее примерно 30 мл/л. Следует отметить, что, в дополнение к добавлению следов металлов в основной раствор, отдельные компоненты могут быть добавлены отдельно, каждый в пределах диапазонов, независимо от количества компонентов, продиктованных указанными выше диапазонами раствора следов металлов.[00161] In some embodiments, the implementation of the culture medium may also include trace amounts of metals. Such trace amounts of metals may be added to the culture medium as a stock solution, which for convenience may be prepared separately from the rest of the culture medium. Typically, the amount of such metal trace element solution added to the culture medium is greater than about 1 ml/l, preferably greater than about 5 ml/l, and more preferably greater than about 10 ml/l. However, when certain concentrations are exceeded, the addition of trace metals to the culture medium does not promote the growth of microorganisms. Accordingly, the amount of such a trace metal solution added to the culture medium is typically less than about 100 ml/l, preferably less than about 50 ml/l, and more preferably less than about 30 ml/l. It should be noted that, in addition to adding trace metals to the main solution, the individual components can be added separately, each within ranges, regardless of the amount of components dictated by the above ranges of the trace metal solution.
[00162] Культуральная среда может включать другие витамины, такие как пантотенат, биотин, кальций, пантотенат, инозит, пиридоксин-HCl и тиамин-HCl. Такие витамины могут быть добавлены в культуральную среду в виде исходного раствора, который для удобства может быть приготовлен отдельно от остальной культуральной среды. Однако при превышении определенных концентраций добавление витаминов в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов.[00162] The culture medium may include other vitamins such as pantothenate, biotin, calcium, pantothenate, inositol, pyridoxine-HCl, and thiamine-HCl. Such vitamins can be added to the culture medium as a stock solution, which for convenience can be prepared separately from the rest of the culture medium. However, when certain concentrations are exceeded, the addition of vitamins to the culture medium does not promote the growth of microorganisms.
[00163] Описанные здесь способы ферментации могут выполняться в обычных режимах культивирования, которые включают, но не ограничиваются, периодический, периодический процесс с подпиткой, рециркуляцию клеток, непрерывный и полунепрерывный. В некоторых вариантах осуществления ферментацию проводят в периодическом режиме с подпиткой. В таком случае некоторые компоненты среды истощаются во время культивирования, включая пантотенат во время производственной стадии ферментации. В некоторых вариантах осуществления в культуру могут быть добавлены относительно высокие концентрации таких компонентов в начале, например, стадии продуцирования, так что рост и/или продуцирование стевиоловых гликозидов поддерживается в течение периода времени, прежде чем потребуются добавления. Предпочтительные диапазоны этих компонентов поддерживаются на протяжении всей культуры путем внесения добавок по мере того, как уровни истощаются в культуре. Уровни компонентов в культуральной среде можно контролировать, например, путем периодического отбора проб культуральной среды и анализа концентраций. В качестве альтернативы, как только стандартная процедура культивирования разработана, добавления могут быть сделаны через определенные интервалы времени, соответствующие известным уровням, в определенные периоды времени в культуре. Как будет понятно специалистам в данной области, скорость потребления питательного вещества увеличивается во время культивирования по мере увеличения плотности клеток в среде. Более того, чтобы избежать попадания чужеродных микроорганизмов в культуральную среду, добавление проводят с использованием известных в данной области методов асептического добавления. Кроме того, во время культивирования можно добавить небольшое количество пеногасителя.[00163] The fermentation methods described herein can be performed under conventional culture modes, which include, but are not limited to, batch, fed-batch, cell recycling, continuous, and semi-continuous. In some embodiments, the fermentation is carried out in a fed-batch mode. In this case, some components of the medium are depleted during cultivation, including pantothenate during the production stage of fermentation. In some embodiments, relatively high concentrations of such components may be added to the culture at the start of, for example, the production step so that growth and/or production of steviol glycosides is maintained for a period of time before additions are required. The preferred ranges of these components are maintained throughout the culture by adding supplements as levels become depleted in the culture. The levels of the components in the culture medium can be monitored, for example, by periodically sampling the culture medium and analyzing the concentrations. Alternatively, once a standard culture procedure has been developed, additions can be made at specific time intervals corresponding to known levels at specific times in culture. As will be appreciated by those skilled in the art, the rate of nutrient uptake increases during culture as cell density in the medium increases. Moreover, in order to avoid the entry of foreign microorganisms into the culture medium, the addition is carried out using aseptic addition methods known in the art. In addition, a small amount of defoamer can be added during cultivation.
[00164] Температура культуральной среды может быть любой температурой, подходящей для роста генетически модифицированных клеток и/или продукции стевиолового гликозида. Например, перед инокуляцией культуральной среды инокулятом, культуральная среда может быть доведена до температуры в диапазоне от примерно 20°С до примерно 45°С, предпочтительно до температуры в диапазоне от примерно 25°С до примерно 40°С, и более предпочтительно в диапазоне от примерно 28°С до примерно 32°С.[00164] The temperature of the culture medium can be any temperature suitable for the growth of genetically modified cells and/or the production of steviol glycoside. For example, prior to inoculation of the culture medium with the inoculum, the culture medium may be brought to a temperature in the range of about 20°C to about 45°C, preferably to a temperature in the range of about 25°C to about 40°C, and more preferably in the range of about 28°C to about 32°C.
[00165] рН культуральной среды можно контролировать путем добавления кислоты или основания в культуральную среду. В таких случаях, когда аммиак используется для регулирования рН, он также удобно служит источником азота в культуральной среде. Предпочтительно рН поддерживается от примерно 3,0 до примерно 8,0, более предпочтительно от примерно 3,5 до примерно 7,0 и наиболее предпочтительно от примерно 4,0 до примерно 6,5.[00165] The pH of the culture medium can be controlled by adding an acid or base to the culture medium. In such cases, when ammonia is used to adjust the pH, it also conveniently serves as a source of nitrogen in the culture medium. Preferably, the pH is maintained from about 3.0 to about 8.0, more preferably from about 3.5 to about 7.0, and most preferably from about 4.0 to about 6.5.
[00166] В некоторых вариантах осуществления концентрация источника углерода, такая как концентрация глюкозы в культуральной среде, отслеживается во время культивирования. Концентрацию глюкозы в культуральной среде можно контролировать с помощью известных методов, таких как, например, использование теста фермента глюкозооксидазы или жидкостной хроматографии высокого давления, которые можно использовать для мониторинга концентрации глюкозы в супернатанте, например, в бесклеточном компоненте питательной среды. Концентрация источника углерода обычно поддерживается ниже уровня, при котором происходит ингибирование роста клеток. Хотя такая концентрация может варьироваться от организма к организму, для глюкозы как источника углерода ингибирование роста клеток происходит при концентрациях глюкозы, превышающих примерно 60 г/л, и может быть легко определено испытанием. Соответственно, когда глюкоза используется в качестве источника углерода, глюкоза предпочтительно подается в ферментатор и поддерживается ниже пределов обнаружения. В качестве альтернативы, концентрация глюкозы в культуральной среде поддерживается в диапазоне от примерно 1 г/л до примерно 100 г/л, более предпочтительно в диапазоне от примерно 2 г/л до примерно 50 г/л, и наболее предпочтительно в диапазоне от примерно 5 г/л до примерно 20 г/л. Хотя концентрацию источника углерода можно поддерживать на желаемых уровнях путем добавления, например, по существу чистого раствора глюкозы, приемлемо и может быть предпочтительным поддержание концентрации источника углерода в культуральной среде путем добавления аликвот исходной питательной среды. Использование аликвот исходной культуральной среды может быть желательным, поскольку концентрации других питательных веществ в среде (например, источников азота и фосфата) могут поддерживаться одновременно. Аналогичным образом, концентрации следов металлов можно поддерживать в культуральной среде путем добавления аликвот раствора следовых количеств металлов.[00166] In some embodiments, the concentration of a carbon source, such as the concentration of glucose in the culture medium, is monitored during culture. The glucose concentration in the culture medium can be monitored using known methods, such as, for example, using the glucose oxidase enzyme test or high pressure liquid chromatography, which can be used to monitor the glucose concentration in the supernatant, for example, in the cell-free component of the culture medium. The concentration of the carbon source is usually maintained below the level at which inhibition of cell growth occurs. Although this concentration may vary from organism to organism, for glucose as a carbon source, inhibition of cell growth occurs at glucose concentrations greater than about 60 g/l and can be easily determined by testing. Accordingly, when glucose is used as a carbon source, the glucose is preferably fed to the fermenter and maintained below detection limits. Alternatively, the glucose concentration in the culture medium is maintained in the range of about 1 g/L to about 100 g/L, more preferably in the range of about 2 g/L to about 50 g/L, and most preferably in the range of about 5 g/l up to about 20 g/l. Although the concentration of the carbon source can be maintained at desired levels by adding, for example, a substantially pure glucose solution, it is acceptable and may be preferable to maintain the concentration of the carbon source in the culture medium by adding aliquots of the original nutrient medium. The use of aliquots of the original culture medium may be desirable since the concentrations of other nutrients in the medium (eg nitrogen and phosphate sources) can be maintained simultaneously. Similarly, trace metal concentrations can be maintained in the culture medium by adding aliquots of the trace metal solution.
[00167] Другие подходящие ферментационные среды и методы описаны, например, в WO 2016/196321.[00167] Other suitable fermentation media and methods are described, for example, in WO 2016/196321.
6.8 Составы для ферментации6.8 Fermentation compositions
[00168] В другом аспекте в настоящем документе представлены составы для ферментации, содержащие генетически модифицированную клетку-хозяина, описанную в данном документе, и стевиоловые гликозиды, полученные из генетически модифицированной клетки-хозяина. Составы для ферментации могут дополнительно содержать среду. В некоторых вариантах осуществления составы для ферментации содержат генетически модифицированную клетку-хозяин и дополнительно содержат Reb A, Reb D и Reb М. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции, представленные в настоящем документе, содержат Reb М в качестве основного компонента стевиоловых гликозидов, полученных из генетически модифицированной клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления составы для ферментации содержат Reb A, Reb D и Reb М в соотношении по меньшей мере 1:7:50. В некоторых вариантах осуществления составы для ферментации содержат Reb A, Reb D и Reb М в соотношении по меньшей мере от 1:7:50 до 1:100:1000. В некоторых вариантах осуществления составы для ферментации содержат соотношение по меньшей мере от 1:7:50 до 1:200:2000. В некоторых вариантах осуществления соотношение Reb A, Reb D и Reb М основано на общем содержании стевиоловых гликозидов, связанных с генетически модифицированной клеткой-хозяином и средой. В некоторых вариантах осуществления соотношение Reb A, Reb D и Reb М основано на общем содержании стевиоловых гликозидов в среде. В некоторых вариантах осуществления соотношение Reb A, Reb D и Reb М основано на общем содержании стевиоловых гликозидов, связанных с генетически модифицированной клеткой-хозяином.[00168] In another aspect, provided herein are fermentation formulations comprising the genetically modified host cell described herein and steviol glycosides derived from the genetically modified host cell. The fermentation compositions may additionally contain a medium. In some embodiments, the fermentation compositions contain a genetically modified host cell and further comprise Reb A, Reb D, and Reb M. In certain embodiments, the fermentation compositions provided herein contain Reb M as the main component of steviol glycosides derived from modified host cell. In some embodiments, the fermentation compositions contain Reb A, Reb D, and Reb M in a ratio of at least 1:7:50. In some embodiments, the fermentation formulations contain Reb A, Reb D, and Reb M in a ratio of at least 1:7:50 to 1:100:1000. In some embodiments, the fermentation compositions contain a ratio of at least 1:7:50 to 1:200:2000. In some embodiments, the ratio of Reb A, Reb D, and Reb M is based on the total content of steviol glycosides associated with the genetically modified host cell and environment. In some embodiments, the ratio of Reb A, Reb D, and Reb M is based on the total content of steviol glycosides in the medium. In some embodiments, the ratio of Reb A, Reb D, and Reb M is based on the total content of steviol glycosides associated with the genetically modified host cell.
[00169] В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции, представленные в настоящем документе, содержат Reb М2 на неопределяемом уровне. В некоторых вариантах осуществления составы для ферментации, представленные в настоящем документе, содержат неприродные стевиоловые гликозиды в неопределяемом уровне.[00169] In some embodiments, the fermentation compositions provided herein contain Reb M2 at an undetectable level. In some embodiments, the fermentation formulations provided herein contain non-natural steviol glycosides at an undetectable level.
6.9 Восстановление стевиоловых гликозидов6.9 Recovery of steviol glycosides
[00170] Как только стевиоловый гликозид продуцируется клеткой-хозяином, он может быть выделен или изолирован для последующего использования с использованием любых подходящих способов разделения и очистки, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления осветленную водную фазу, содержащую стевиоловый гликозид, отделяют от ферментации центрифугированием. В других вариантах осуществления осветленная водная фаза, содержащая стевиоловый гликозид, отделяется от ферментации путем добавления деэмульгатора в реакцию ферментации. Наглядные примеры деэмульгаторов включают флокулянты и коагулянты.[00170] Once the steviol glycoside is produced by the host cell, it can be isolated or isolated for later use using any suitable separation and purification methods known in the art. In some embodiments, the clarified aqueous phase containing the steviol glycoside is separated from the fermentation by centrifugation. In other embodiments, the clarified aqueous phase containing the steviol glycoside is separated from the fermentation by adding a demulsifier to the fermentation reaction. Illustrative examples of demulsifiers include flocculants and coagulants.
[00171] Стевиоловый гликозид, продуцируемый в этих клетках, может присутствовать в супернатанте культуры и/или быть связанным с клетками-хозяевами. В вариантах осуществления, где часть стевиоловых гликозидов связана с клеткой-хозяином, выделение стевиоловых гликозидов может включать способ улучшения высвобождения стевиоловых гликозидов из клеток. В некоторых вариантах осуществления это может принимать форму промывки клеток горячей водой или буферной обработки, с поверхностно-активным веществом или без него, а также с добавлением буферов или солей или без них. В некоторых вариантах осуществления температура представляет собой любую температуру, которая считается подходящей для высвобождения стевиоловых гликозидов. В некоторых вариантах осуществления температура находится в диапазоне от 40 до 95°С; или от 60 до 90°С; или от 75 до 85°С. В некоторых вариантах осуществления температура составляет 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95°С. В некоторых вариантах осуществления изобретения физическое или химическое разрушение клетки используется для увеличения высвобождения стевиоловых гликозидов из клетки-хозяина. Альтернативно и/или впоследствии стевиоловый гликозид в культуральной среде может быть извлечен с использованием операций блока выделения, включая, помимо прочего, экстракцию растворителем, очистку мембраны, концентрирование мембраны, адсорбцию, хроматографию, выпаривание, химическую дериватизацию, кристаллизацию и сушку.[00171] The steviol glycoside produced in these cells may be present in the culture supernatant and/or associated with the host cells. In embodiments where a portion of the steviol glycosides is bound to the host cell, isolating the steviol glycosides may include a method of improving the release of the steviol glycosides from the cells. In some embodiments, this may take the form of hot water washing or buffering of the cells, with or without a surfactant, and with or without the addition of buffers or salts. In some embodiments, the temperature is any temperature deemed appropriate for the release of steviol glycosides. In some embodiments, the implementation of the temperature is in the range from 40 to 95°C; or from 60 to 90°C; or from 75 to 85°C. In some embodiments, the temperature is 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, or 95°C. In some embodiments of the invention, physical or chemical disruption of the cell is used to increase the release of steviol glycosides from the host cell. Alternatively and/or subsequently, the steviol glycoside in the culture medium can be recovered using isolation unit operations including but not limited to solvent extraction, membrane purification, membrane concentration, adsorption, chromatography, evaporation, chemical derivatization, crystallization, and drying.
6.10 Способы создания генетически модифицированных клеток6.10 Methods for creating genetically modified cells
[00172] В настоящем документе также представлены способы получения клетки-хозяина, которая была создана с помощью генной инженерии и содержала одну или несколько модификаций, описанных выше, например, одну или несколько нуклеиновых гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих гидроксилазу кауреновой кислоты Stevia rebaudiana, и/или ферменты биосинтетического пути, например, для соединения стевиоловых гликозидов. Экспрессия гетерологичного фермента в клетке-хозяине может быть достигнута путем введения в клетки-хозяева нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, под контролем регуляторных элементов, которые обеспечивают экспрессию в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой внехромосомную плазмиду. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой вектор хромосомной интеграции, который может интегрировать нуклеотидную последовательность в хромосому клетки-хозяина. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой линейный фрагмент двухцепочечной ДНК, которая может интегрировать посредством гомологии нуклеотидную последовательность в хромосому клетки-хозяина.[00172] Also provided herein are methods for obtaining a host cell that has been genetically engineered and contains one or more of the modifications described above, for example, one or more nucleic heterologous nucleic acids encoding Stevia rebaudiana kaurenoic acid hydroxylase, and/ or enzymes of the biosynthetic pathway, for example, for the connection of steviol glycosides. Expression of a heterologous enzyme in a host cell can be achieved by introducing into the host cells a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the enzyme under the control of regulatory elements that allow expression in the host cell. In some embodiments, the nucleic acid is an extrachromosomal plasmid. In other embodiments, the implementation of the nucleic acid is a vector of chromosomal integration, which can integrate the nucleotide sequence into the chromosome of the host cell. In other embodiments, the nucleic acid is a linear piece of double-stranded DNA that can integrate, via homology, a nucleotide sequence into the chromosome of a host cell.
[00173] Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти белки, могут быть введены в клетку-хозяина любым способом, известным специалисту в данной области, без ограничения (см., например, Hinnen et al. (1978) Proc. Национальной академии наук USA 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology (Методы в энзимологии), т.185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression ~ A Laboratory Manual (Перенос и экспрессия генов - лабораторное руководство), Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование - лабораторное руководство), Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et at, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). Примеры методик включают, но не ограничиваются ими, сферопластинг, электропорацию, трансформацию, опосредованную PEG 1000, и трансформацию, опосредованную ацетатом лития или хлоридом лития.[00173] Nucleic acids encoding these proteins can be introduced into the host cell by any method known to the person skilled in the art, without limitation (see, for example, Hinnen et al. (1978) Proc. National Academy of Sciences USA 75:1292 -3 Cregg et al (1985) Mol Cell Biol 5:3376-3385 Goeddel et al eds, 1990, Methods in Enzymology Vol.185, Academic Press, Inc., CA ; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression ~ A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et at, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). Examples of techniques include, but are not limited to, spheroplasting, electroporation, PEG 1000 mediated transformation, and lithium acetate or lithium chloride mediated transformation.
[00174] Количество фермента в клетке-хозяине может быть изменено путем изменения транскрипции гена, кодирующего фермент. Это может быть достигнуто, например, путем изменения числа копий нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент (например, путем использования вектора экспрессии с большим или меньшим числом копий, содержащего нуклеотидную последовательность, или путем введения дополнительных копий нуклеотидной последовательности в геном клетки-хозяина, или путем удаления или нарушения нуклеотидной последовательности в геноме клетки-хозяина), путем изменения порядка кодирующих последовательностей в полицистронной мРНК оперона или разбиения оперона на отдельные гены, каждый из которых имеет свои собственные элементы управления, или путем увеличения силы промотора или оператора, с которым операбельно связана нуклеотидная последовательность. В качестве альтернативы или в дополнение, количество копий фермента в клетке-хозяине может быть изменено путем изменения уровня трансляции мРНК, кодирующей фермент.Этого можно достичь, например, изменяя стабильность мРНК, изменяя последовательность сайта связывания рибосомы, изменяя расстояние или последовательность между сайтом связывания рибосомы и стартовым кодоном кодирующей последовательности фермента, изменяя всю межцистронную область, расположенную "выше" или рядом с 5'-стороной стартового кодона кодирующей области фермента, стабилизируя З'-конец транскрипта мРНК с помощью шпилек и специализированных последовательностей, изменяя использование кодонов фермента, изменяя экспрессию используемых тРНК редких кодонов в биосинтезе фермента и/или повышении стабильности фермента, например, посредством мутации его кодирующей последовательности.[00174] The amount of the enzyme in the host cell can be changed by changing the transcription of the gene encoding the enzyme. This can be achieved, for example, by changing the copy number of the nucleotide sequence encoding the enzyme (for example, by using an expression vector with more or less copies of the nucleotide sequence, or by introducing additional copies of the nucleotide sequence into the genome of the host cell, or by removing or disruption of the nucleotide sequence in the genome of the host cell), by changing the order of the coding sequences in the polycistronic mRNA of the operon, or splitting the operon into separate genes, each with its own control elements, or by increasing the strength of the promoter or operator to which the nucleotide sequence is operably linked . Alternatively or in addition, the number of copies of the enzyme in the host cell can be changed by changing the level of translation of the mRNA encoding the enzyme. This can be achieved, for example, by changing the stability of the mRNA, changing the sequence of the ribosome binding site, changing the distance or sequence between the ribosome binding site and the start codon of the coding sequence of the enzyme, changing the entire intercistronic region located "above" or near the 5'-side of the start codon of the coding region of the enzyme, stabilizing the 3'-end of the mRNA transcript using hairpins and specialized sequences, changing the use of codons of the enzyme, changing the expression used tRNA rare codons in the biosynthesis of the enzyme and/or increasing the stability of the enzyme, for example, by mutating its coding sequence.
[00175] Активность фермента в клетке-хозяине может быть изменена различными способами, включая, в частности, экспрессию модифицированной формы фермента, обладающей повышенной или пониженной растворимостью в клетке-хозяине, экспрессию измененной формы фермента, в которой отсутствует домен, через который ингибируется активность фермента, экспрессия измененной формы фермента, которая имеет более высокий или более низкий Kcat или более низкий или более высокий Km для субстрата, или экспрессия измененной формы фермента, которая в большей или меньшей степени подвержена обратному или прямому регулированию со стороны другой молекулы в пути. [00175] The activity of the enzyme in the host cell can be altered in various ways, including, in particular, the expression of a modified form of the enzyme having increased or decreased solubility in the host cell, the expression of an altered form of the enzyme in which there is no domain through which the activity of the enzyme is inhibited , the expression of an altered form of an enzyme that has a higher or lower Kcat or a lower or higher Km for the substrate, or the expression of an altered form of an enzyme that is more or less up- or down-regulated by another molecule in the pathway.
[00176] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, используемая для генетической модификации клетки-хозяина, содержит один или несколько селектируемых маркеров, полезных для отбора трансформированных клеток-хозяев и для оказания селективного давления на клетку-хозяина для сохранения чужеродной ДНК.[00176] In some embodiments, the nucleic acid used to genetically modify the host cell contains one or more selectable markers useful for selecting transformed host cells and for applying selective pressure on the host cell to retain foreign DNA.
[00177] В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер представляет собой маркер устойчивости к антибиотикам. Иллюстративные примеры маркеров устойчивости к антибиотикам включают, но не ограничиваются ими, продукты генов BLA, NAT], PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, мышиного dhfr, HPH, DSDA, KANR и SH BLE. Продукт гена BLA из E.coli придает устойчивость к бета-лактамным антибиотикам (например, цефалоспоринам узкого спектра действия, цефамицинам и карбапенемам (эртапенем), цефамандолу и цефоперазону) и ко всем антиграмм-отрицательным бактериальным пенициллинам, кроме темоциллина; продукт гена NAT1 из S. noursei придает устойчивость к норсеотрицину; продукт гена PAT из S. viridochromogenes Ти94 придает устойчивость к биалофосу; продукт гена AURI-C из Saccharomyces cerevisiae придает устойчивость к Auerobasidin А (АЬА); продукт гена PDR4 придает устойчивость к церуленину; продукт гена SMR1 придает устойчивость к сульфометуронметилу; продукт гена CAT из транспозона Тп9 придает устойчивость к хлорамфениколу; продукт гена dhfr мыши придает устойчивость к метотрексату; продукт гена HPH Klebsiella pneumonia придает устойчивость к гигромицину В; продукт tqu&DSDA Е. coli позволяет клеткам расти на чашках с D-серином в качестве единственного источника азота; ген KANR транспозона Тп903 придает устойчивость к G418; а продукт гена SHBLE из Streptoalloteichus hindustanus придает устойчивость к зеоцину (блеомицину). В некоторых вариантах осуществления маркер устойчивости к антибиотикам удаляется после выделения генетически модифицированной клетки-хозяина, описанной в настоящем документе.[00177] In some embodiments, the selectable marker is an antibiotic resistance marker. Illustrative examples of antibiotic resistance markers include, but are not limited to, BLA, NAT], PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, mouse dhfr, HPH, DSDA, KAN R , and SH BLE gene products. The BLA gene product from E. coli confers resistance to beta-lactam antibiotics (eg, narrow-spectrum cephalosporins, cephamycins and carbapenems (ertapenem), cefamandole and cefoperazone) and to all antigram-negative bacterial penicillins except temocillin; the NAT1 gene product from S. noursei confers resistance to norseothricin; the PAT gene product from S. viridochromogenes Ti94 confers resistance to bialophos; the AURI-C gene product from Saccharomyces cerevisiae confers resistance to Auerobasidin A (ALA); the PDR4 gene product confers resistance to cerulenin; the SMR1 gene product confers resistance to sulfometuronmethyl; the CAT gene product from the Tn9 transposon confers resistance to chloramphenicol; the mouse dhfr gene product confers resistance to methotrexate; the HPH gene product of Klebsiella pneumonia confers resistance to hygromycin B; the E. coli tqu&DSDA product allows cells to grow on plates with D-serine as the sole source of nitrogen; the KAN R gene of the Tp903 transposon confers resistance to G418; and the SHBLE gene product from Streptoalloteichus hindustanus confers resistance to zeocin (bleomycin). In some embodiments, the antibiotic resistance marker is removed after the genetically modified host cell described herein is isolated.
[00178] В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер устраняет ауксотрофию (например, пищевую ауксотрофию) у генетически модифицированного микроорганизма. В таких вариантах осуществления родительский микроорганизм включает функциональное нарушение в одном или нескольких генных продуктах, которые функционируют в пути биосинтеза аминокислот или нуклеотидов, и когда не функциональность делает родительскую клетку неспособной к росту в среде без добавления одного или нескольких питательных веществ. Такие генные продукты включают, но не ограничиваются ими, генные продукты HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, МЕТ 15, TRP1, ADE2 и URA3 в дрожжах. Затем ауксотрофный фенотип может быть спасен путем трансформации родительской клетки экспрессирующим вектором или конструкцией хромосомной интеграции, кодирующей функциональную копию разрушенного генного продукта, и генерируемая генетически модифицированная клетка-хозяин может быть выбрана на основе потери ауксотрофного фенотипа родительская ячейка. Использование генов URA3, TRP1 и LYS2 в качестве селектируемых маркеров имеет заметное преимущество, поскольку возможны как положительный, так и отрицательный отбор. Положительный отбор осуществляется ауксотрофной комплементацией мутаций URA3, TRP1 и LYS2, тогда как отрицательный отбор основан на специфических ингибиторах, например, 5-фтороротовой кислоте (FOA), 5-фторантраниловой кислоте и аминоадипиновой кислоте (аАА), соответственно, которые предотвращают рост прототрофных штаммов, но допускают рост мутантов URA3, TRP1 и LYS2 соответственно. В других вариантах осуществления селектируемый маркер устраняет другие нелетальные недостатки или фенотипы, которые можно идентифицировать известным методом селекции.[00178] In some embodiments, the implementation of the selectable marker eliminates auxotrophy (eg, nutritional auxotrophy) in a genetically modified microorganism. In such embodiments, the parent microorganism includes a functional disorder in one or more gene products that function in the amino acid or nucleotide biosynthetic pathway, and where the non-functionality renders the parent cell unable to grow in the medium without the addition of one or more nutrients. Such gene products include, but are not limited to, the HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2, and URA3 gene products in yeast. The auxotrophic phenotype can then be rescued by transforming the parent cell with an expression vector or chromosome integration construct encoding a functional copy of the disrupted gene product, and the genetically modified host cell generated can be selected based on the loss of the auxotrophic phenotype of the parent cell. The use of the URA3, TRP1, and LYS2 genes as selectable markers has a significant advantage, since both positive and negative selection is possible. Positive selection is carried out by auxotrophic complementation of URA3, TRP1 and LYS2 mutations, while negative selection is based on specific inhibitors, for example, 5-fluororotic acid (FOA), 5-fluoroanthranilic acid and aminoadipic acid (aAA), respectively, which prevent the growth of prototrophic strains but allow the growth of URA3, TRP1 and LYS2 mutants, respectively. In other embodiments, the selectable marker eliminates other non-lethal deficiencies or phenotypes that can be identified by a known selection method.
[00179] В данном документе описаны конкретные гены и белки, которые можно использовать в способах, композициях и организмах согласно настоящему раскрытию; однако будет признано, что абсолютная идентичность таких генов не является необходимой. Например, могут быть выполнены изменения в конкретном гене или полинуклеотиде, включающем последовательность, кодирующую полипептид или фермент, и проведен скрининг на активность. Обычно такие изменения включают консервативные мутации и молчащие мутации. Такие модифицированные или мутированные полинуклеотиды и полипептиды могут быть проверены на экспрессию функционального фермента с использованием способов, известных в данной области. [00180] Из-за присущей вырожденности генетического кода другие полинуклеотиды, которые кодируют по существу такие же или функционально эквивалентные полипептиды, также могут быть использованы для клонирования и экспрессии полинуклеотидов. кодирующих такие ферменты.[00179] This document describes specific genes and proteins that can be used in the methods, compositions and organisms according to the present disclosure; however, it will be recognized that the absolute identity of such genes is not necessary. For example, changes can be made to a particular gene or polynucleotide comprising the sequence encoding the polypeptide or enzyme and screened for activity. Typically, such changes include conservative mutations and silent mutations. Such modified or mutated polynucleotides and polypeptides can be tested for functional enzyme expression using methods known in the art. [00180] Due to the inherent degeneracy of the genetic code, other polynucleotides that encode substantially the same or functionally equivalent polypeptides can also be used to clone and express the polynucleotides. encoding these enzymes.
[00181] Как будет понятно специалистам в данной области, может быть выгодно модифицировать кодирующую последовательность для усиления ее экспрессии в конкретном хозяине. Генетический код дублируется 64 возможными кодонами, но большинство организмов обычно используют подмножество этих кодонов. Кодоны, которые чаще всего используются у вида, называются оптимальными кодонами, а те, которые не используются очень часто, классифицируются как редкие или редко используемые кодоны. Кодоны могут быть заменены, чтобы отразить предпочтительное использование кодонов хозяином, в процессе, который иногда называют «оптимизацией кодонов» или «контролем смещения кодонов вида». Оптимизация кодонов для других клеток-хозяев может быть легко определена с использованием таблиц использования кодонов или может быть выполнена с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, такого как CodonOp (www.idtdna.com/CodonOptfrom) от Integrated DNA Technologies.[00181] As will be appreciated by those skilled in the art, it may be advantageous to modify a coding sequence to enhance its expression in a particular host. The genetic code is duplicated by 64 possible codons, but most organisms typically use a subset of these codons. The codons that are used most often in a species are called optimal codons, while those that are not used very often are classified as rare or rarely used codons. Codons can be swapped to reflect the host's preferred codon usage, in a process sometimes referred to as "codon optimization" or "species codon bias control". Codon optimization for other host cells can be easily determined using codon usage tables or can be performed using commercially available software such as CodonOp (www.idtdna.com/CodonOptfrom) from Integrated DNA Technologies.
[00182] Оптимизированные кодирующие последовательности, содержащие кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина (Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17:477-508), могут быть получены, например, для увеличения скорости трансляции или для получения рекомбинантных РНК-транскриптов с желательными свойствами, такими как более длительный период полураспада, по сравнению с транскриптами, полученными из неоптимизированной последовательности. Стоп-кодоны трансляции также могут быть изменены для отражения предпочтений хозяина. Например, типичными стоп-кодонами для S. cerevisiae и млекопитающих являются UAA и UGA, соответственно. Типичным стоп-кодоном для однодольных растений является UGA, тогда как насекомые и Е. coli обычно используют UAA в качестве стоп-кодона (Dalphin et at, 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).[00182] Optimized coding sequences containing codons preferred for a particular prokaryotic or eukaryotic host (Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. RNA transcripts with desirable properties, such as a longer half-life, compared to transcripts derived from a non-optimized sequence. Translation stop codons can also be changed to reflect host preferences. For example, typical stop codons for S. cerevisiae and mammals are UAA and UGA, respectively. A typical stop codon for monocot plants is UGA, while insects and E. coli typically use UAA as the stop codon (Dalphin et at, 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).
[00183] Специалисты в данной области поймут, что из-за вырожденной природы генетического кода множество молекул ДНК, различающихся своими нуклеотидными последовательностями, можно использовать для кодирования данного фермента согласно описанию изобретения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая биосинтетические ферменты, описанные выше, упоминается здесь просто для иллюстрации варианта осуществления настоящего описания, и это описание включает молекулы ДНК любой последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности полипептидов и белков ферментов, используемых в способах описания изобретения. Подобным образом полипептид обычно может переносить одну или несколько аминокислотных замен, делеций и вставок в своей аминокислотной последовательности без потери или значительной потери желаемой активности. Описание включает такие полипептиды с аминокислотными последовательностями, отличными от описанных здесь конкретных белков, при условии, что модифицированные или вариантные полипептиды обладают ферментативной анаболической или катаболической активностью эталонного полипептида. Кроме того, аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями ДНК, показанными в данном документе, просто иллюстрируют варианты осуществления настоящего описания.[00183] Those skilled in the art will appreciate that, due to the degenerate nature of the genetic code, many DNA molecules differing in their nucleotide sequences can be used to encode a given enzyme as described herein. The native DNA sequence encoding the biosynthetic enzymes described above is mentioned here merely to illustrate an embodiment of the present disclosure, and this disclosure includes DNA molecules of any sequence that encode the amino acid sequences of the polypeptides and proteins of the enzymes used in the methods of describing the invention. Similarly, a polypeptide can typically tolerate one or more amino acid substitutions, deletions, and insertions in its amino acid sequence without loss or significant loss of the desired activity. The description includes such polypeptides with amino acid sequences different from the specific proteins described here, provided that the modified or variant polypeptides have the enzymatic anabolic or catabolic activity of the reference polypeptide. In addition, the amino acid sequences encoded by the DNA sequences shown herein are merely illustrative of embodiments of the present disclosure.
[00184] Кроме того, описание охватывает гомологи ферментов, применимых для композиций и способов, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления два белка (или область белков) по существу гомологичны, если аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере примерно 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичных областей. Чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут быть введены пробелы в одной или обеих из первой и второй аминокислотной или нуклеиновой последовательностей для оптимального выравнивания и негомологичные последовательности можно не принимать во внимание для целей сравнения). В одном варианте осуществления длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, обычно по меньшей мере 40%, более типично по меньшей мере 50%, еще более типично по меньшей мере 60% и даже более типично по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны в этом положении (в данном случае "идентичность" аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна "гомологии" аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.[00184] In addition, the description covers the homologues of enzymes applicable to the compositions and methods presented herein. In some embodiments, two proteins (or a region of proteins) are substantially homologous if the amino acid sequences contain at least about 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical areas. To determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for purposes of optimal comparison (e.g., gaps can be introduced in one or both of the first and second amino acid or nucleic sequences for optimal alignment, and non-homologous sequences can be ignored for comparison purposes). In one embodiment, the length of the reference sequence aligned for comparison purposes is at least 30%, typically at least 40%, more typically at least 50%, even more typically at least 60%, and even more typically at least 70%, 80%, 90%, 100% of the reference sequence length. The amino acid residues or nucleotides at the respective amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (in this case, "identity" of amino acids or nucleic acids is equivalent to "homology" of amino acids or nucleic acids). The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space that must be entered to optimally align the two sequences.
[00185] Когда термин «гомологичный» используется в отношении белков или пептидов, считается, что неидентичные положения остатков часто отличаются консервативными аминокислотными заменами. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена существенно не изменяет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательностей или степень гомологии может быть увеличена для корректировки консервативного характера замены. Способы выполнения этой регулировки хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Pearson W.R., 1994, Methods inMol Biol 25: 365-89).[00185] When the term "homologous" is used in relation to proteins or peptides, it is believed that non-identical residue positions are often distinguished by conservative amino acid substitutions. A "conservative amino acid substitution" is one in which an amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). As a rule, conservative amino acid substitution does not significantly change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of homology may be increased to correct for the conservative nature of the substitution. Methods for making this adjustment are well known to those skilled in the art (see, for example, Pearson W.R., 1994, Methods inMol Biol 25: 365-89).
[00186] Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга: 1) серии (S), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (К); 5) изолейцин (I), лейцин (L), аланин (А), валин (V) и 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).[00186] Each of the following six groups contains amino acids that are conservative substitutions for each other: 1) series (S), threonine (T); 2) aspartic acid (D), glutamic acid (E); 3) asparagine (N), glutamine (Q); 4) arginine (R), lysine (K); 5) isoleucine (I), leucine (L), alanine (A), valine (V) and 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W).
[00187] Гомология последовательностей полипептидов, которую также называют процентной идентичностью последовательностей, обычно измеряется с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Типичным алгоритмом, используемым для сравнения последовательности молекулы с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от разных организмов, является компьютерная программа BLAST. При поиске в базе данных, содержащей последовательности от большого числа различных организмов, обычно сравнивают аминокислотные последовательности.[00187] Polypeptide sequence homology, also referred to as percent sequence identity, is typically measured using sequence analysis software. A typical algorithm used to compare the sequence of a molecule against a database containing a large number of sequences from different organisms is the BLAST computer program. When searching a database containing sequences from a large number of different organisms, it is common to compare amino acid sequences.
[00188] Кроме того, любой из генов, кодирующих вышеупомянутые ферменты (или любые другие, упомянутые здесь (или любой из регуляторных элементов, которые контролируют или модулируют их экспрессию)), можно оптимизировать методами генетической/белковой инженерии, такими как направленная эволюция или рациональный мутагенез, которые известны специалистам в данной области техники. Такое действие позволяет специалистам в данной области оптимизировать экспрессию и активность ферментов в дрожжах.[00188] In addition, any of the genes encoding the aforementioned enzymes (or any others mentioned here (or any of the regulatory elements that control or modulate their expression)) can be optimized by genetic/protein engineering methods such as directed evolution or rational mutagenesis, which are known to those skilled in the art. This action allows those skilled in the art to optimize the expression and activity of enzymes in yeast.
[00189] Кроме того, гены, кодирующие эти ферменты, могут быть идентифицированы от других видов грибов и бактерий и могут быть экспрессированы для модуляции этого пути. Различные организмы могут служить источниками этих ферментов, включая, помимо прочего, Saccharomyces spp., включая S. cerevisiae и S. uvarum, Kluyveromyces spp., включая К. thermotolerans, К. lactis и К. marxianus, Pichia spp., Hansenula spp., включая H. polymorpha, Candida spp., Trichosporon spp., Yamadazyma spp., включая Y. spp.stipitis, Torulasporapretoriensis, Issatchenkia orientalis, Schizosaccharomyces spp., включая S. pombe, Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Neurospora spp.или Ustilago spp.Источники генов анаэробных грибов включают, но не ограничиваются ими, Piromyces spp., Orpinomyces spp.или Neocallimastix spp.Источники прокариотических ферментов, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Clostridium spp., Cory neb acterium spp., Pseudomonas spp., Lactococcus spp., Enterobacter spp.и Salmonella spp.[00189] In addition, genes encoding these enzymes can be identified from other fungal and bacterial species and can be expressed to modulate this pathway. Various organisms can serve as sources of these enzymes, including but not limited to Saccharomyces spp., including S. cerevisiae and S. uvarum, Kluyveromyces spp., including K. thermotolerans, K. lactis and K. marxianus, Pichia spp., Hansenula spp. , including H. polymorpha, Candida spp., Trichosporon spp., Yamadazyma spp., including Y. spp.stipitis, Torulasporapretoriensis, Issatchenkia orientalis, Schizosaccharomyces spp. or Ustilago spp. Anaerobic fungal gene sources include, but are not limited to, Piromyces spp., Orpinomyces spp., or Neocallimastix spp. Prokaryotic enzyme sources that may be used include, but are not limited to, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Clostridium spp., Coryneb acterium spp., Pseudomonas spp., Lactococcus spp., Enterobacter spp. and Salmonella spp.
[00190] Методы, известные специалистам в данной области, могут быть подходящими для идентификации дополнительных гомологичных генов и гомологичных ферментов. Как правило, аналогичные гены и/или аналогичные ферменты можно идентифицировать с помощью функционального анализа, и они будут иметь функциональное сходство. Методы, известные специалистам в данной области, могут быть подходящими для идентификации аналогичных генов и аналогичных ферментов. Например, для идентификации гомологичных или аналогичных UDP-гликозилтрансфераз, КАН или любых генов, белков или ферментов биосинтетического пути методы могут включать, но не ограничиваются ими, клонирование гена с помощью ПЦР с использованием праймеров на основе опубликованной последовательности гена/представляющий интерес фермент, или с помощью вырожденной ПЦР с использованием вырожденных праймеров, предназначенных для амплификации консервативной области среди представляющего интерес гена. Кроме того, специалист в данной области может использовать методы для идентификации гомологичных или аналогичных генов, белков или ферментов с функциональной гомологией или сходством. Методы включают исследование клетки или клеточной культуры на каталитическую активность фермента с помощью ферментных анализов in vitro на указанную активность (например, как описано здесь или в Kiritani, К., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology (Методы этимологии для аминокислот с разветвленной цепью), 1970), затем выделение фермента с указанной активностью посредством очистки, определения белковой последовательности фермента с помощью таких методов, как деградация по Эдману, конструирование праймеров ПЦР для вероятной последовательности нуклеиновой кислоты, амплификация указанной последовательности ДНК посредством ПЦР и клонирование указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Для идентификации гомологичных или подобных генов и/или гомологичных или подобных ферментов, аналогичных генов и/или аналогичных ферментов или белков методы также включают сравнение данных, касающихся гена или фермента-кандидата, с такими базами данных, как BRENDA, KEGG или MetaCYC. Ген или фермент-кандидат могут быть идентифицированы в вышеупомянутых базах данных в соответствии с изложенными здесь идеями.[00190] Methods known to those skilled in the art may be suitable for identifying additional homologous genes and homologous enzymes. Typically, similar genes and/or similar enzymes can be identified by functional analysis and will have functional similarities. Methods known to those skilled in the art may be suitable for identifying similar genes and similar enzymes. For example, to identify homologous or similar UDP glycosyltransferases, CANs, or any genes, proteins, or enzymes of the biosynthetic pathway, methods may include, but are not limited to, gene cloning by PCR using primers based on the published sequence of the gene/enzyme of interest, or with using degenerate PCR using degenerate primers designed to amplify a conserved region within the gene of interest. In addition, one of skill in the art can use methods to identify homologous or similar genes, proteins, or enzymes with functional homology or similarity. Methods include testing a cell or cell culture for the catalytic activity of an enzyme using in vitro enzyme assays for said activity (for example, as described here or in Kiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970), then isolating an enzyme with said activity by purification, determining the protein sequence of the enzyme using methods such as Edman degradation, designing PCR primers for a putative nucleic acid sequence, amplifying said DNA sequence by PCR, and cloning said nucleic acid sequence. In order to identify homologous or similar genes and/or homologous or similar enzymes, analogous genes and/or analogous enzymes or proteins, the methods also include comparing the candidate gene or enzyme data with databases such as BRENDA, KEGG or MetaCYC. A candidate gene or enzyme can be identified in the aforementioned databases in accordance with the ideas set forth here.
7. ПРИМЕРЫ7. EXAMPLES
Пример 1. Методы трансформации дрожжейExample 1 Yeast Transformation Methods
[00191] Каждая конструкция ДНК была интегрирована в Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) с использованием стандартных методов молекулярной биологии для оптимизированной трансформации ацетатом лития. Вкратце, клетки выращивали в течение ночи в среде дрожжевого экстракта с пептон-декстрозой (YPD) при 30°С при встряхивании (200 об/мин), разбавляли до OD600 0,1 в 100 мл YPD и выращивали до OD600 0,6-0,8. Для каждой трансформации 5 мл культуры собирали центрифугированием, промывали в 5 мл стерильной воды, снова центрифугировали, ресуспендировали в 1 мл 100 мМ ацетата лития и переносили в микроцентрифужную пробирку. Клетки центрифугировали (13000 g) в течение 30 секунд, супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в смеси для трансформации, состоящей из 240 мкл 50% ПЭГ, 36 мкл 1 М ацетата лития, 10 мкл вареной ДНК спермы лосося и 74 мкл донорской ДНК. Донорская ДНК включала плазмиду, несущую ген эндонуклеазы F-CphI, экспрессируемую для экспрессии под дрожжевым промотором TDH3 (см. пример 4). После теплового шока при 42°С в течение 40 минут клетки выделяли в течение ночи в среде YPD, содержащей соответствующий антибиотик, для отбора клеток, которые поглотили плазмиду F-Cphl. После восстановления в течение ночи клетки ненадолго центрифугировали и высевали на среду YPD, содержащую соответствующий антибиотик, для отбора клеток, которые поглотили плазмиду F-Cphl. Интеграцию ДНК подтверждали с помощью ПЦР колоний с праймерами, специфичными для интеграции.[00191] Each DNA construct was integrated into Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) using standard molecular biology techniques for optimized transformation with lithium acetate. Briefly, cells were grown overnight in peptone dextrose (YPD) yeast extract medium at 30°C with shaking (200 rpm), diluted to OD600 0.1 in 100 ml YPD and grown to OD600 0.6-0 ,8. For each transformation, 5 ml of culture was collected by centrifugation, washed in 5 ml of sterile water, centrifuged again, resuspended in 1 ml of 100 mM lithium acetate and transferred to a microcentrifuge tube. The cells were centrifuged (13,000 g) for 30 seconds, the supernatant was removed and the cells were resuspended in a transformation mixture consisting of 240
Пример 2: Получение основного штамма дрожжей, способного к высокой гидравлической проницаемости к фарнезилпирофосфату (FPP) и изопреноиду фарнезенуExample 2 Preparation of a Basic Yeast Strain Capable of High Hydraulic Permeability to Farnesyl Pyrophosphate (FPP) and Farnesene Isoprenoid
[00192] Штамм, продуцирующий фарнезен, был создан из штамма Saccharomyces cerevisiae дикого типа (CEN.PK2) путем экспрессии генов мевалонатного пути под контролем промоторов GAL1 или GAL10. Этот штамм включал следующие хромосомно интегрированные гены мевалонатного пути из S. cerevisiae: ацетил-КоА тиолаза ГМГ-КоА синтаза, ГМГ-КоА редуктаза мевалонаткиназа, фосфомевалонаткиназа, мевалонатпирофосфатдекарбоксилаза и IPP:DMAPP изомераза. Кроме того, штамм содержал множество копий фарнезен-синтазы из Artemisia annua, также под контролем промоторов GAL1 или GAL10. Все описанные здесь гетерологичные гены были оптимизированы по кодонам с использованием общедоступных или других подходящих алгоритмов. Штамм также содержал делецию гена GAL80, а ген ERG9, кодирующий сквален-синтазу, был понижен путем замены нативного промотора на промотор дрожжевого гена МЕТЗ (Westfall и др., Труды Национальной академии наук США 109(3), 2012, стр. Е111-Е118). Примеры того, как создать штаммы S. cerevisiae с высокой гидравлической проницаемостью к изопреноидам, описаны в патенте США №8,415,136 и патенте США №8,236,512, которые полностью включены в настоящий документ.[00192] A farnesene-producing strain was generated from a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) by expression of the mevalonate pathway genes under the control of the GAL1 or GAL10 promoters. This strain included the following chromosomally integrated genes of the mevalonate pathway from S. cerevisiae: acetyl-CoA thiolase HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase, mevalonate pyrophosphate decarboxylase, and IPP:DMAPP isomerase. In addition, the strain contained many copies of farnesene synthase from Artemisia annua, also under the control of the GAL1 or GAL10 promoters. All heterologous genes described here have been codon optimized using publicly available or other suitable algorithms. The strain also contained a deletion of the GAL80 gene, and the ERG9 gene encoding squalene synthase was downgraded by replacing the native promoter with the yeast MET3 gene promoter (Westfall et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109(3), 2012, pp. E111-E118 ). Examples of how to create S. cerevisiae strains with high hydraulic permeability to isoprenoids are described in US Pat. No. 8,415,136 and US Pat. No. 8,236,512, which are incorporated herein in their entirety.
Пример 3. Получение базового штамма дрожжей, способного к высокой гидравлической проницаемости к Reb МExample 3 Preparation of a basic yeast strain capable of high hydraulic permeability to Reb M
[00193] На ФИГ. 1 показан пример пути биосинтеза от FPP к стевиолу. На ФИГ.2 показан примерный биосинтетический путь от стевиола до гликозида Reb М. Чтобы преобразовать штамм на основе фарнезена, описанный выше, в тот, который иметь высокую гидравлическую проницаемость к изопреноид каурену С20, в геном были интегрированы четыре копии геранилгеранилпирофосфатсинтазы (GGPPS), за которыми следовали две копии копалилдифосфатсинтазы и одна копия кауренсинтазы. На этом этапе все копии фарнезенсинтазы были удалены из штамма. Как только было подтверждено, что новый штамм вырабатывает энт-каурен, оставшиеся гены для превращения энт-каурена в Reb М были вставлены в геном. В таблице 1 перечислены все гены и промоторы, используемые для преобразования FPP в Reb М. Каждый ген после кауренсинтазы был интегрирован в виде единой копии, за исключением фермента Sr.KAH, для которого были интегрированы две копии гена. Штамм, содержащий все гены, описанные в таблице 1, в первую очередь продуцировал Reb М.[00193] FIG. 1 shows an example biosynthetic pathway from FPP to steviol. FIG. 2 shows an exemplary biosynthetic pathway from steviol to Reb M glycoside. To convert the farnesene-based strain described above into one that has high hydraulic permeability to C20 isoprenoid kaurene, four copies of geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) were integrated into the genome, for followed by two copies of copalyl diphosphate synthase and one copy of kaurene synthase. At this stage, all copies of farnesene synthase were removed from the strain. Once the new strain was confirmed to produce ent-kaurene, the remaining genes for converting ent-kaurene to Reb M were inserted into the genome. Table 1 lists all genes and promoters used to convert FPP to Reb M. Each gene was integrated as a single copy after kaurene synthase, with the exception of the Sr.KAH enzyme, for which two copies of the gene were integrated. A strain containing all of the genes described in Table 1 produced primarily Reb M.
Таблица 1. Гены, промоторы и аминокислотные последовательности ферментов, используемых для преобразования FPP в RebMTable 1. Genes, promoters and amino acid sequences of enzymes used to convert FPP to RebM
Первые 65 аминокислот удалены и заменены метиониномFirst 65 amino acids removed and replaced with methionine
Пример 4. Создание штамма для скрининга переносчиков стевиоловых гликозидов.Example 4 Creation of a Strain for Steviol Glycoside Transporter Screening.
[00194] Для быстрого скрининга переносчиков стевиоловых гликозидов in vivo в штамме, продуцирующем Reb М, в описанный выше штамм вставляли посадочную площадку. Посадочная площадка состояла из 500 п. н. последовательностей ДНК, нацеленных на локус, на обоих концах конструкции в геномной области ниже открытой рамки считывания SFM1 (см. Фиг. 3). Внутри посадочная площадка содержала промотор GAL1 и терминатор дрожжей, фланкирующий сайт узнавания эндонуклеазы (F-Cphl).[00194] For rapid in vivo screening of steviol glycoside transporters in a strain producing Reb M, a landing pad was inserted into the strain described above. The landing site consisted of 500 bp. locus-targeted DNA sequences at both ends of the construct in the genomic region below the SFM1 open reading frame (see Fig. 3). Inside, the landing site contained the GAL1 promoter and a yeast terminator flanking the endonuclease recognition site (F-Cphl).
Пример 5: Условия культивирования дрожжейExample 5 Yeast Culture Conditions
[00195] Колонии дрожжей со сверхэкспрессированным белком-переносчиком собирали в 96-луночные микротитрационные планшеты, содержащие среду Bird Seed Media (BSM, первоначально описанную van Hoek et al., Biotechnology andBioengineering (Биотехнология и биоинженерия) 68 (5), 2000, pp.517-523) с 20 мкг/л сахарозы, 3,75 г/л сульфата аммония и 1 г / л лизина. Клетки культивировали при 28°С в инкубаторе для микротитровальных планшетов с высокой емкостью, встряхивая при 1000 об/мин и влажности 80% в течение 3 дней, пока культуры не достигли исчерпания углерода. Насыщенные для роста культуры пересевали в свежие чашки, содержащие BSM с 40 г/л сахарозы и 3,75 г/л сульфата аммония, взяв 14,4 мкл из насыщенных культур и разбавив 360 мкл свежей среды. Клетки в продукционной среде культивировали при 30°С в высокопроизводительном шейкере для микротитровальных планшетов при 1000 об/мин и влажности 80% в течение дополнительных 3 дней перед экстракцией и анализом.[00195] Yeast colonies overexpressing the carrier protein were collected in 96-well microtiter plates containing Bird Seed Media (BSM, originally described by van Hoek et al., Biotechnology and Bioengineering (Biotechnology and Bioengineering) 68 (5), 2000, pp. 517-523) with 20 µg/l sucrose, 3.75 g/l ammonium sulfate and 1 g/l lysine. Cells were cultured at 28° C. in a high capacity microtiter plate incubator, shaking at 1000 rpm and 80% humidity for 3 days until the cultures reached carbon depletion. Cultures saturated for growth were subcultured into fresh plates containing BSM with 40 g/l sucrose and 3.75 g/l ammonium sulfate, taking 14.4 μl from saturated cultures and diluting 360 μl with fresh medium. Cells in production medium were cultured at 30° C. in a high performance microtiter plate shaker at 1000 rpm and 80% humidity for an additional 3 days before extraction and analysis.
Пример 6. Условия приготовления пробы цельноклеточного бульона для анализа стевиоловых гликозидовExample 6 Conditions for preparing a whole cell broth sample for the analysis of steviol glycosides
[00196] Для анализа количества всех стевиоловых гликозидов, продуцируемых в культуре, по завершении культивирования бульон для цельных клеток разбавляли 628 мкл 100% этанола, герметично закрывали фольгой и встряхивали при 1250 об / мин в течение 30 секунд для экстракции стевиоловых гликозидов. 314 мкл воды добавляли непосредственно в каждую лунку для разбавления экстракта. Планшет быстро центрифугировали для получения осадка. Внутренний стандарт, 208 мкл смеси этанол: вода 50:50, содержащей 0,48 мг / л ребаудиозида N, переносили в новый аналитический планшет объемом 250 мкл и в аналитический планшет добавляли 2 мкл смеси культура / этанол. Перед анализом планшет закрывали фольгой.[00196] To analyze the amount of all steviol glycosides produced in the culture, at the end of the culture, the whole cell broth was diluted with 628 μl of 100% ethanol, sealed with foil, and shaken at 1250 rpm for 30 seconds to extract the steviol glycosides. 314 µl of water was added directly to each well to dilute the extract. The tablet was quickly centrifuged to obtain a precipitate. An internal standard, 208 µl ethanol:water 50:50 containing 0.48 mg/l rebaudioside N, was transferred to a new 250 µl assay plate and 2 µl culture/ethanol mixture was added to the assay plate. Before analysis, the plate was covered with foil.
Пример 7. Условия приготовления пробы супернатанта культуры для анализа стевиоловых гликозидовExample 7 Conditions for Preparation of Culture Supernatant Sample for Analysis of Steviol Glycosides
[00197] Для анализа количества всех продуцируемых и экскретируемых в культуральную среду стевиоловых гликозидов после завершения культивирования бульон целых клеток центрифугировали в течение 5 минут при 2000х g для осаждения клеток. Аликвоту 240 мкл полученного супернатанта переносили в пустой 96-луночный планшет для микротитрования. Образцы супернатанта разбавляли 480 мкл 100% этанола, герметично закрывали фольгой и встряхивали при 1250 об/мин в течение 30 секунд для экстракции стевиоловых гликозидов. Для разбавления экстракта в каждую лунку добавляли 240 мкл воды. Планшет быстро центрифугировали для осаждения любых твердых частиц. Внутренний стандарт, 208 мкл смеси этанол: вода 50:50, содержащей 0,48 мг/л ребаудиозида N, переносили в новый аналитический планшет объемом 250 мкл и в аналитический планшет добавляли 2 мкл смеси культура / этанол. Перед анализом планшет закрывали фольгой.[00197] To analyze the amount of all steviol glycosides produced and excreted into the culture medium, after completion of the culture, the whole cell broth was centrifuged for 5 minutes at 2000 xg to pellet the cells. A 240 μl aliquot of the resulting supernatant was transferred to an empty 96-well microtiter plate. Supernatant samples were diluted with 480 μl of 100% ethanol, sealed with foil and shaken at 1250 rpm for 30 seconds to extract the steviol glycosides. To dilute the extract, 240 µl of water was added to each well. The plate was quickly centrifuged to precipitate any particulate matter. An internal standard, 208 μl of 50:50 ethanol:water containing 0.48 mg/l rebaudioside N, was transferred to a new 250 μl assay plate and 2 μl of culture/ethanol mixture was added to the assay plate. Before analysis, the plate was covered with foil.
Пример 8: Аналитические методыExample 8: Analytical Methods
[00198] Образцы для измерения стевиоловых гликозидов анализировали с помощью масс-спектрометра (Agilent 6470-QQQ) с автоматическим пробоотборником системы RapidFire 365 с картриджем С8, используя конфигурации, показанные в таблицах 2 и 3.[00198] Samples for measuring steviol glycosides were analyzed using a mass spectrometer (Agilent 6470-QQQ) with a RapidFire 365 autosampler with a C8 cartridge using the configurations shown in Tables 2 and 3.
Таблица 2. Конфигурация системы RapidFire 365Table 2. RapidFire 365 System Configuration
Таблица 3. Конфигурации метода 6470-QQQ MSTable 3. Method 6470-QQQ MS Configurations
[00199] Площади пиков из хроматограммы масс-спектрометра использовали для построения калибровочной кривой. Молярные соотношения соответствующих соединений определяли путем количественного определения количества в молях каждого соединения посредством внешней калибровки с использованием аутентичного стандарта, а затем выбирая соответствующие соотношения.[00199] Peak areas from the mass spectrometer chromatogram were used to construct a calibration curve. The molar ratios of the respective compounds were determined by quantifying the mole amount of each compound by external calibration using an authentic standard and then selecting the appropriate ratios.
Пример 9. Скрининг транспортеров, способных увеличивать титры стевиоловых гликозидов in vivoExample 9 Screening for transporters capable of increasing titers of steviol glycosides in vivo
[00200] В штамме, продуцирующем Reb М, без экспрессии дополнительных переносчиков, приблизительно 80% стевиоловых гликозидов с более высокой молекулярной массой Reb D и Reb М были связаны с биомассой (см. Фиг. 4). Эта ассоциация биомассы, вероятно, связана с тем, что Reb D и Reb М не эффективно транспортируются из клетки и удерживаются в цитоплазме. Накопление Reb D и Reb М может привести к ингибированию продукта, что уменьшит поток углерода через метаболический путь стевиоловых гликозидов. Следовательно, ожидается, что экспрессия одного или нескольких транспортеров, которые будут транспортировать стевиоловые гликозиды (особенно Reb D и Reb М) из цитоплазмы в среду (супернатант), ослабит ингибирование продукта и, таким образом, увеличит поток углерода через этот путь, что приведет к увеличению титры стевиоловых гликозидов. Чтобы идентифицировать переносчики, способные экспортировать стевиоловые гликозиды с более высокой молекулярной массой из клетки и, таким образом, снимать ингибирование продукта, мы проверили ряд переносчиков, идентифицированных из различных грибов, на способность увеличивать общие титры стевиоловых гликозидов, особенно титр гликозидов с более высокой молекулярной массой (т.е. Reb D и Reb М).[00200] In a Reb M producing strain without expression of additional transporters, approximately 80% of the higher molecular weight steviol glycosides Reb D and Reb M were biomass bound (see FIG. 4). This biomass association is likely due to the fact that Reb D and Reb M are not efficiently transported out of the cell and retained in the cytoplasm. Accumulation of Reb D and Reb M can lead to product inhibition, which will reduce the carbon flux through the steviol glycoside metabolic pathway. Therefore, the expression of one or more transporters that will transport steviol glycosides (especially Reb D and Reb M) from the cytoplasm to the medium (supernatant) is expected to attenuate product inhibition and thus increase carbon flux through this pathway, leading to increase in titers of steviol glycosides. In order to identify transporters capable of exporting higher molecular weight steviol glycosides from the cell and thus reversing product inhibition, we tested a number of transporters identified from various fungi for the ability to increase total titers of steviol glycosides, especially the titer of higher molecular weight glycosides. (i.e. Reb D and Reb M).
[00201] Все белки, аннотированные как переносчики из генома S. cerevisiae. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием CEN.PK2 в качестве источника геномной ДНК. Каждый праймер для ПЦР имел 40 п. н. фланкирующей гомологии к PGAL1 и последовательностям ДНК терминатора дрожжей в посадочной площадке (см. Фиг. 3), добавленным к концам для облегчения гомологичной рекомбинации амплифицированного гена в посадочную площадку. В дополнение к скринингу всех эндогенных транспортных белков S. cerevisiae, обнаруженных в CEN.PK2, был проведен расширенный биоинформатический поиск белков-переносчиков ABC из небольшого числа грибов и дополнительных штаммов S. cerevisiae.[00201] All proteins annotated as carriers from the S. cerevisiae genome. amplified by PCR using CEN.PK2 as a source of genomic DNA. Each PCR primer was 40 bp. flanking homology to PGAL1 and landing site yeast terminator DNA sequences (see FIG. 3) added to the ends to facilitate homologous recombination of the amplified gene into the landing site. In addition to screening for all endogenous S. cerevisiae transport proteins found in CEN.PK2, an extensive bioinformatic search for ABC transport proteins from a small number of fungi and additional S. cerevisiae strains was performed.
[00202] Чтобы создать библиотеку грибковых АВС-транспортеров, мы сначала получили аминокислотные последовательности из публикации Ковальчука и Дриссена «Филогенетический анализ грибковых АВС-транспортеров» (Ковальчук и Дриссен, ВМС Genomics, 11, 2010, стр. 177-197) в Филогенетический анализ АВС-транспортеров проведен для 27 видов грибов. Из этого литературного источника было выбрано всего 610 аминокислотных последовательностей, которые включали все переносчики, обозначенные как принадлежащие подсемействам АВС-С, ABC-D и ABC-G. Затем мы разработали собственные базы данных BLAST для следующих грибов: (1) Hansenula polymorpha DL-1 (NRRL-Y-7560), (2) Yarrowia lipolytica ATCC 18945, (3)Arxula adeninivorans ATCC 76597, (4)5'. cerevisiae CAT-1, (5) Lipomyces starkeyi ATCC 58690, (6) Kluyveromyces marxianus, (7) Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, (8) Komagataella phaffii NRRL Y-11430, (9) S. cerevisiae MBG3370, (10) S. cerevisiae MBG3373, (11) Kluyveromyces lactis ATCC 8585, (12) Candida utilis ATCC 22023, (13) Pichia pastoris ATCC 28485 и (14) Aspergillus oryzae NRRL5590.[00202] To create a library of fungal ABC transporters, we first obtained the amino acid sequences from Kovalchuk and Driessen's Phylogenetic Analysis of Fungal ABC Transporters (Kovalchuk and Driessen, BMC Genomics, 11, 2010, pp. 177-197) to Phylogenetic Analysis ABC-transporters were carried out for 27 species of mushrooms. A total of 610 amino acid sequences were selected from this literature, which included all transporters designated as belonging to the ABC-C, ABC-D and ABC-G subfamilies. We then developed our own BLAST databases for the following fungi: (1) Hansenula polymorpha DL-1 (NRRL-Y-7560), (2) Yarrowia lipolytica ATCC 18945, (3) Arxula adeninivorans ATCC 76597, (4)5'. cerevisiae CAT-1, (5) Lipomyces starkeyi ATCC 58690, (6) Kluyveromyces marxianus, (7) Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042, (8) Komagataella phaffii NRRL Y-11430, (9) S. cerevisiae MBG3370, (10) S cerevisiae MBG3373, (11) Kluyveromyces lactis ATCC 8585, (12) Candida utilis ATCC 22023, (13) Pichia pastoris ATCC 28485, and (14) Aspergillus oryzae NRRL5590.
[00203] Для организмов, у которых у нас уже были собственные нуклеотидные последовательности ORF, полученные в результате усилий по геномному секвенированию, сборке и аннотации de novo, мы применили tBLASTn с помощью Biopython. Алгоритм tBLASTn позволял быстро выравнивать белковые последовательности (в данном случае 610 семенных последовательностей от Ковальчука и Дриссена (ВМС Genomics, 11, 2010, стр. 177-197)) с транслированной ДНК нуклеотидных последовательностей ORF для каждого организма во всех шести возможных рамках считывания с использованием BLAST. Параметры tBLASTn были стандартными с evalue=1 е"25 (см. таблицу 4). Все вычисления выполнялись через API-интерфейс biopython (версия 1.70, загруженная из PyPI) с использованием Python 2.7.12 и Ubuntu 16.04.5 LTS (GNU/Linux 4.4.0-138-generic х86_64). Совпадения были впоследствии отфильтрованы, чтобы обеспечить глобальное выравнивание не менее 2000 нуклеотидов. Все совпадения, соответствующие этим критериям, переводились на следующий этап рабочего процесса.[00203] For organisms that we already had our own ORF nucleotide sequences from de novo genome sequencing, assembly and annotation efforts, we applied tBLASTn with Biopython. The tBLASTn algorithm allowed rapid alignment of protein sequences (in this case, 610 seed sequences from Kovalchuk and Driessen (BMC Genomics, 11, 2010, pp. 177-197)) with translated DNA ORF nucleotide sequences for each organism in all six possible reading frames using BLAST. The tBLASTn parameters were standard with evalue=1 e" 25 (see Table 4). All calculations were performed via the biopython API (version 1.70 downloaded from PyPI) using Python 2.7.12 and Ubuntu 16.04.5 LTS (GNU/Linux 4.4.0-138-generic x86_64) Matches were subsequently filtered to ensure a global alignment of at least 2000 nucleotides All matches that met these criteria were advanced to the next step in the workflow.
Таблица 4. Параметры tBLASTn по умолчаниюTable 4. tBLASTn Default Parameters
[00204] Для остальных организмов, для которых не было собственной геномной последовательности, весь протеом организма был получен от Uniprot с использованием Uniprot API, чтобы создать базу данных для поиска BLASTp.В большинстве случаев в Uniprot была точная запись для вида, для которого у нас была собственная геномная ДНК, но в других случаях было близкое, но не точное совпадение с собственными штаммами грибов. В последних случаях мы полагались на высокую вероятность того, что последовательности генов будут достаточно похожи, чтобы праймеры, разработанные для сравнения Uniprot, по-прежнему амплифицировали бы внутреннюю геномную ДНК. Затем мы применили BLASTp с помощью Biopython к базе данных, производной от Uniprot. Параметры BLAST были стандартными, с оценкой=0,001 (см. Таблицу 5). Последующая фильтрация была выполнена на основе процентного отсечения идентичности>40% и процентного отсечения выровненной длины>60%. Все вычисления выполнялись через API-интерфейс biopython (версия 1.70, загруженная из PyPI) с использованием Python 2.7.12 и Ubuntu 16.04.5 LTS (GNU/Linux 4.4.0-138-generic х86 64). Совпадения должны соответствовать по крайней мере одной из 610 исходных последовательностей из ссылки. Затем совпадения были преобразованы в нуклеотидную последовательность с помощью службы сопоставления идентификаторов Uniprot ID в идентификаторы EMBL. Европейская лаборатория молекулярной биологии позволяет извлекать нуклеотидные последовательности из записи Uniprot. Мы использовали любые обращения, соответствующие этим критериям, на следующем этапе рабочего процесса.[00204] For the rest of the organisms that did not have their own genomic sequence, the entire proteome of the organism was obtained from Uniprot using the Uniprot API to create a database for BLASTp searches. In most cases, Uniprot had an exact entry for the species for which we have had their own genomic DNA, but in other cases there was a close but not exact match with their own fungal strains. In the latter cases, we relied on a high probability that the gene sequences would be sufficiently similar that the primers designed to compare Uniprot would still amplify internal genomic DNA. We then applied BLASTp with Biopython to a database derived from Uniprot. BLAST parameters were standard, score=0.001 (see Table 5). Subsequent filtering was performed based on percent identity cutoff >40% and percent alignment length cutoff >60%. All calculations were performed via the biopython API (version 1.70 downloaded from PyPI) using Python 2.7.12 and Ubuntu 16.04.5 LTS (GNU/Linux 4.4.0-138-generic x86 64). Matches must match at least one of the 610 source sequences from the link. The matches were then converted to a nucleotide sequence using the Uniprot ID to EMBL ID matching service. The European Molecular Biology Laboratory allows the extraction of nucleotide sequences from the Uniprot record. We have used any cases that meet these criteria in the next step of the workflow.
Таблица 5. Параметры BLASTp по умолчаниюTable 5. BLASTp default parameters
[00205] После того, как все нуклеотидные последовательности были идентифицированы, были сконструированы праймеры для амплификации каждой полной ORF с помощью ПЦР. Каждый праймер для ПЦР имел 40 п. н. фланкирующей гомологии к PGAL1 и последовательностям ДНК терминатора дрожжей в посадочной площадке (Фиг. 3), добавленным к концам для облегчения гомологичной рекомбинации амплифицированного гена в посадочную площадку. Каждый ген транспортера был индивидуально трансформирован в виде единственной копии в штамм дрожжей, продуцирующих Reb М, описанный выше, и подвергнут скринингу на способность увеличивать титры продукта при сверхэкспрессии in vivo.[00205] After all nucleotide sequences were identified, primers were designed to amplify each complete ORF by PCR. Each PCR primer was 40 bp. flanking homology to PGAL1 and yeast terminator DNA sequences in the landing site (FIG. 3) added to the ends to facilitate homologous recombination of the amplified gene into the landing site. Each transporter gene was individually transformed as a single copy into the Reb M producing yeast strain described above and screened for the ability to increase product titers when overexpressed in vivo.
Пример 11: Сверхэкспрессия транспортеров, приводящая к увеличению продукции стевиоловых гликозидов in vivoExample 11 Overexpression of Transporters Leading to Increased Production of Steviol Glycosides in Vivo
[00206] Скрининг транспортеров S. cerevisiae in vivo обнаружил восемь транспортеров, которые статистически увеличивали продукцию общего стевиолгликозида (TSG) при сверхэкспрессии, по сравнению с родительским штаммом Reb М, который не содержал сверхэкспрессируемого транспортера (см. Фиг. 5). TSG рассчитывали как сумму в микромолях всех стевиоловых гликозидов, продуцируемых клеткой (при измерении экстракцией из цельноклеточного бульона). Все идентифицированные транспортеры попадают в класс транспортеров, известных как ABC-транспортеры. Сверхэкспрессия этих транспортеров увеличивала TSG с 20% до двукратного по сравнению с родительским. Повышение TSG за счет сверхэкспрессии транспортера может быть связано с повышенным транспортом всех стевиоловых гликозидов или только подмножества стевиоловых гликозидов. Таким образом, данные также были проанализированы, чтобы определить влияние сверхэкспрессии переносчика только на более высокомолекулярные стевиоловые гликозиды Reb D и Reb М. Из восьми переносчиков, которые увеличивали TSG, семь из них также увеличивали общую продукцию Reb D и Reb М, как показано на ФИГ.6. Увеличение Reb D и Reb М со сверхэкспрессией транспортеров варьировало от 30% до двукратного увеличения.[00206] An in vivo transporter screening of S. cerevisiae revealed eight transporters that statistically increased total steviol glycoside (TSG) production when overexpressed compared to the Reb M parent strain, which did not contain the overexpressed transporter (see Figure 5). TSG was calculated as the sum in micromoles of all steviol glycosides produced by the cell (as measured by extraction from whole cell broth). All identified transporters fall into the class of transporters known as ABC transporters. Overexpression of these transporters increased TSG from 20% to twofold compared to the parent. The increase in TSG due to transporter overexpression may be due to increased transport of all steviol glycosides or only a subset of steviol glycosides. Therefore, the data were also analyzed to determine the effect of transporter overexpression on only the higher molecular weight steviol glycosides Reb D and Reb M. Of the eight transporters that increased TSG, seven of them also increased the total production of Reb D and Reb M, as shown in FIG. .6. The increase in Reb D and Reb M with transporter overexpression ranged from 30% to a two-fold increase.
Пример 12: Внеклеточный и внутриклеточный транспорт стевиоловых гликозидовExample 12 Extracellular and Intracellular Transport of Steviol Glycosides
[00207] Семь из восьми штаммов Reb М, несущих сверхэкспрессированные транспортеры, приводящие к увеличению общего количества стевиоловых гликозидов во всем клеточном бульоне, также увеличивали общее содержание стевиоловых гликозидов в супернатанте (Фиг. 7). В то время как четыре транспортера увеличивали общее количество стевиоловых гликозидов во всем клеточном бульоне почти в два раза (ФИГ. 5), типичное увеличение TSG в супернатанте было меньше и составляло от 35 до 70% (ФИГ. 7). Однако транспортер Т4 Fungal 5 увеличивал TSG в супернатанте примерно в пять раз (Фиг. 7). Данные, представленные на ФИГ. 5 и 7, демонстрируют, что штаммы с некоторыми сверхэкспрессированными транспортерами производят больше в пересчете на TSG, но увеличение TSG не всегда отражается линейным увеличением TSG в супернатанте.[00207] Seven of the eight strains of Reb M carrying overexpressed transporters resulting in an increase in total steviol glycosides in total cell broth also increased total steviol glycosides in the supernatant (FIG. 7). While the four transporters almost doubled the total amount of steviol glycosides in the whole cell broth (FIG. 5), the typical increase in TSG in the supernatant was less, ranging from 35 to 70% (FIG. 7). However, the T4 transporter Fungal 5 increased TSG in the supernatant by about five times (FIG. 7). The data presented in FIG. 5 and 7 demonstrate that strains with some overexpressed transporters produce more in terms of TSG, but the increase in TSG is not always reflected by a linear increase in TSG in the supernatant.
[00208] Подробный анализ доли общих продуцируемых стевиоловых гликозидов, находящихся в супернатанте (Фиг. 8), показывает, что большинство транспортеров (шесть из восьми) показали более низкую долю TSG в супернатанте по сравнению с родительским. Это говорит о том, что переносчики удаляли стевиоловые гликозиды из цитозоля, тем самым снимая ингибирование продукта и обеспечивая большее образование продукта, но они не переносили стевиоловые гликозиды в среду. Вместо этого эти переносчики, скорее всего, транспортируют стевиоловые гликозиды в вакуоль или какой-либо другой клеточный компартмент.Напротив, транспортер T4_Fungal_5 приводил к тому, что почти 100% продуцируемого TSG находилось в супернатанте (Фиг. 8). Это указывает на то, что Т4 Fungal 5, вероятно, является транспортером плазматической мембраны, который способен удалять стевиоловые гликозиды из цитоплазмы клетки и переносить их из клетки в среду. Кроме того, данные на ФИГ.4 показывают, что транспортер T4_Fungal_5 переносит стевиоловые гликозиды с более высокой молекулярной массой Reb D и Reb М из клетки в среду; действительно, почти 100% как Reb D, так и Reb М находились во фракции супернатанта.[00208] A detailed analysis of the proportion of total produced steviol glycosides found in the supernatant (FIG. 8) shows that most of the transporters (six out of eight) showed a lower proportion of TSG in the supernatant compared to the parent. This suggests that the transporters removed steviol glycosides from the cytosol, thereby removing the inhibition of the product and providing more product formation, but they did not transfer steviol glycosides to the medium. Instead, these transporters most likely transport the steviol glycosides into the vacuole or some other cellular compartment. In contrast, the T4_Fungal_5 transporter resulted in nearly 100% of the TSG produced being in the supernatant (FIG. 8). This indicates that T4 Fungal 5 is probably a plasma membrane transporter that is able to remove steviol glycosides from the cell cytoplasm and transfer them from the cell to the environment. In addition, the data in FIG. 4 show that the T4_Fungal_5 transporter transports the higher molecular weight steviol glycosides Reb D and Reb M from the cell into the medium; indeed, almost 100% of both Reb D and Reb M were in the supernatant fraction.
[00209] Одним из результатов скрининга транспортеров оказался эндогенный АВС-транспортер S. cerevisiae ВРТ1. Этот белок аннотирован в базе данных генома Saccharomyces для локализации в вакуоли. Транспортеры Т4 Fungal 2 и Т4 Fungal 4 имеют белковые последовательности, которые на 99% идентичны CEN.PK2 ВРТ1 и происходят из штаммов S. cerevisiae САТ-1 и MBG3373, соответственно; они являются аллелями ВРТ1. Все другие транспортеры на 30-43% идентичны по последовательности белка ВРТ1 и представляют собой новые ABC-транспортеры, которые могут переносить стевиоловые гликозиды через мембраны (см. Таблицу 6). Из оставшихся не-ВРТ1 транспортеров, которые переносят стевиоловые гликозиды, ни одна из белковых последовательностей не идентична более чем на 53% любому другому белку, что показывает, что остальные пять белков являются уникальными последовательностями.[00209] One result of the transporter screening was the endogenous S. cerevisiae BPT1 ABC transporter. This protein has been annotated in the Saccharomyces genome database for vacuole localization. The T4 Fungal 2 and T4 Fungal 4 transporters have protein sequences that are 99% identical to BPT1 CEN.PK2 and originate from S. cerevisiae CAT-1 and MBG3373 strains, respectively; they are alleles of VPT1. All other transporters are 30-43% identical in sequence to the BPT1 protein and are novel ABC transporters that can transport steviol glycosides across membranes (see Table 6). Of the remaining non-BPT1 transporters that carry steviol glycosides, none of the protein sequences is more than 53% identical to any other protein, indicating that the remaining five proteins are unique sequences.
Таблица 6. Процентная идентичность всех транспортеров, увеличивающих титры стевиоловых гликозидовTable 6. Percent identity of all transporters that increase the titers of steviol glycosides
Пример 13: Клеточная локализация BPT1 и T4_Fungal_5Example 13: Cellular Localization of BPT1 and T4_Fungal_5
[00210] Чтобы определить клеточную локализацию сверхэкспрессированных белков ВРТ1 и Т4 Fungal 5 в штаммах, продуцирующих Reb М, мы создали гибридные белки транспортер-ЗФБ. Каждый белок транспортера (ВРТ1 или T4_Fungal_5) имел белок ЗФБ, слитый с С-концом транспортера; слитые белки-переносчики ЗФБ экспрессировались через промотор GAL1 и содержали терминатор дрожжей. Штаммы конструировали, как описано в Примере 4, с той лишь разницей, что слитый белок транспортер-ЗФБ использовали вместо простого белка транспортера. Клетки с правильно интегрированными конструкциями транспортер-ЗФБ подтверждали с помощью ПЦР колоний, культивировали, как в примере 5, и подтверждали их активность, эквивалентную активности штаммов, содержащих транспортер без С-концевой метки ЗФБ (Фиг. 9).[00210] To determine the cellular localization of overexpressed BPTI and T4 Fungal 5 proteins in Reb M producing strains, we created transporter-GFP fusion proteins. Each transporter protein (BPT1 or T4_Fungal_5) had a GFP protein fused to the C-terminus of the transporter; the GFP fusion proteins were expressed through the GAL1 promoter and contained the yeast terminator. The strains were constructed as described in Example 4, with the only difference being that a transporter-GFP fusion protein was used instead of a simple transporter protein. Cells with correctly integrated transporter-GFP constructs were confirmed by colony PCR, cultured as in Example 5, and confirmed to be equivalent in activity to strains containing the transporter without the GFP C-terminal tag (FIG. 9).
[00211] Чтобы визуализировать локализацию белка с помощью ЗФБ, клетки размножали, как в Примере 5, но собирали через 2 дня в производственной среде для наблюдения. Клетки дважды промывали равными объемами ФСБ (фосфатно-солевого буфера) и затем ресуспендировали до ODeoo 1,0 в ФСБ. Клетки фиксировали с использованием 1% агарозных подушечек, установленных на предметном стекле, и визуализировали при 100-кратном увеличении с масляной иммерсией с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа при возбуждении 488 нм или в ярком поле. Клетки, экспрессирующие ВРТ1, меченный на С-конце ЗФБ, демонстрировали паттерны флуоресценции, согласующиеся с локализацией гибридного белка в вакуоли (Фиг. 10). Это был ожидаемый результат, поскольку сообщалось, что ВРТ1 обычно локализуется в вакуоли у дрожжей (Sharma et al., Eukaryot. Cell 1 (3), 2002, стр. 391-400). Меченный на С-конце белок Т4 Fungal 5 показал другую локализацию ЗФБ, что согласуется с локализацией белка на плазматической мембране (Фиг. 11).[00211] To visualize protein localization with GFP, cells were expanded as in Example 5 but harvested 2 days later in production environment for observation. Cells were washed twice with equal volumes of PBS (phosphate-buffered saline) and then resuspended to ODeoo 1.0 in PBS. Cells were fixed using 1% agarose pads mounted on a glass slide and visualized at 100x oil immersion using a standard fluorescent microscope at 488 nm excitation or bright field. Cells expressing BPT1 labeled at the C-terminus of GFB showed fluorescence patterns consistent with vacuole localization of the fusion protein (FIG. 10). This was an expected result, since it has been reported that BPT1 is usually localized in the yeast vacuole (Sharma et al., Eukaryot. Cell 1 (3), 2002, pp. 391-400). The C-terminally labeled T4 Fungal 5 protein showed a different localization of GFP, consistent with the localization of the protein on the plasma membrane (Fig. 11).
Пример 14: Направленная эволюция белка T4_Fungal_5 с использованием подверженной ошибкам ПЦР и селекции ростаExample 14 Guided Evolution of the T4_Fungal_5 Protein Using Error-Prone PCR and Growth Selection
[00212] Транспортер Т4 Fungal 5 активно удаляет как Reb D, так и Reb М из цитоплазмы (см. ФИГ.4). Reb D является непосредственным субстратом для Reb М (ФИГ. 2), таким образом, удаление Reb D из цитозоля снижает общее количество Reb М, продуцируемого дрожжами. Таким образом, Т4 Fungal 5 подвергался ферментной эволюции для увеличения как его общей активности, так и его специфичности в отношении Reb М. Кодирующая последовательность ДНК (CDS) T4_Fungal_5 была подвергнута мутагенезу с помощью подверженной ошибкам ПЦР с использованием набора для произвольного мутагенеза GeneMorph II (Agilent Technologies, Inc.) и полученную библиотеку ДНК трансформировали в дрожжевой штамм Reb М, аналогичный тому, который использовался в скрининге переносчиков, упомянутом в примере 11, но имеющий две дополнительные копии UGT76G1, обе экспрессируемые под промоторами GAL1. Дополнительную трансформацию с использованием транспортера T4_Fungal_5 дикого типа проводили в качестве контроля. Преобразования выполняли, как описано в Примере 1. После восстановления в течение ночи культуры переносили в производственную среду с добавлением селективного антибиотика для продолжения роста. Определяли OD6oo культур и проводили серийные разведения культур свежей продукционной средой, содержащей антибиотик, во избежание углеродного голодания. Образцы культуры отбирали ежедневно для обоих исходных архивов глицерина и высевали для образования отдельных колоний на чашки с агаром YPD, содержащие антибиотик. Титры TSG и Reb М 88 колоний из каждого суточного образца оценивали и сравнивали с использованием методов, описанных в примерах 6, 7 и 8. На основании этих данных был идентифицирован момент времени, когда был выявлен самый высокий процент колоний, продуцирующих TSG, равный или больший, чем у контрольного штамма (экспрессирующего Т4 Fungal 5 дикого типа). Дополнительные колонии с этого момента времени высевали из глицерина, и 900 колоний были отобраны и подвергнуты скринингу. Скрининг выявил восемь изолятов, которые увеличили титры Reb М на 26% до 47% и увеличили соотношение Reb М / TSG на 10% по сравнению с контролем (Фиг. 12 и 13). Данные на ФИГ. 12 и 13 показывают, что мутации, идентифицированные в транспортере Т4 Fungal 5, увеличивают как общую активность в отношении стевиоловых гликозидов, так и специфичность в отношении Reb М.[00212] Transporter T4 Fungal 5 actively removes both Reb D and Reb M from the cytoplasm (see FIG. 4). Reb D is a direct substrate for Reb M (FIG. 2), thus removal of Reb D from the cytosol reduces the total amount of Reb M produced by yeast. Thus, T4 Fungal 5 was enzymatically evolved to increase both its overall activity and its specificity for Reb M. The T4_Fungal_5 DNA coding sequence (CDS) was mutated by error-prone PCR using the GeneMorph II random mutagenesis kit (Agilent Technologies, Inc.) and the resulting DNA library were transformed into a Reb M yeast strain similar to that used in the vector screening mentioned in Example 11, but having two additional copies of UGT76G1, both expressed under GAL1 promoters. Additional transformation using the wild-type T4_Fungal_5 transporter was performed as a control. Transformations were performed as described in Example 1. After overnight reconstitution, cultures were transferred to production medium supplemented with a selective antibiotic to continue growth. The OD6oo of the cultures was determined and serial dilutions of the cultures were made with fresh production medium containing the antibiotic to avoid carbon starvation. Culture samples were taken daily for both stock glycerol archives and plated to form single colonies on YPD agar plates containing the antibiotic. TSG and Reb M titers of 88 colonies from each daily sample were assessed and compared using the methods described in examples 6, 7 and 8. Based on these data, the point in time was identified when the highest percentage of colonies producing TSG equal to or greater than than the control strain (expressing T4 Fungal 5 wt). Additional colonies from this point in time were seeded from glycerol and 900 colonies were selected and screened. The screening identified eight isolates that increased Reb M titers by 26% to 47% and increased the Reb M/TSG ratio by 10% compared to controls (FIGS. 12 and 13). The data in FIG. 12 and 13 show that the mutations identified in the Fungal 5 T4 transporter increase both overall steviol glycoside activity and Reb M specificity.
[00213] Секвенирование гена T4_Fungal_5 по Сэнгеру показало, что все восемь изолятов содержали одинаковые замены нуклеиновых кислот, в результате чего были заменены четыре аминокислоты: V666A, Y942N, L956P и E1320V. Этот мутантный аллель был назван «Fungal 5 muA». Чтобы проверить причинную связь Fungal 5 muA с улучшенным титром и специфичностью, мутантный аллель был амплифицирован из одного из изолятов и повторно введен в родительский штамм. Полученный штамм повторил фенотипы и продемонстрировал применение Fungal_5_muA для улучшения продукции и специфичности стевиоловых гликозидов. Когда Т4 Fungal 5 и Fungal 5 muA экспрессировались под более слабым промотором GAL3, штамм с Fungal 5 muA продуцировал на 30% больше Reb М в цельноклеточном бульоне и на 40% больше внеклеточного Reb М, чем штамм с T4_Fungal_5 дикого типа (Фиг. 14), что соответствует более ранним данным.[00213] Sanger sequencing of the T4_Fungal_5 gene showed that all eight isolates contained the same nucleic acid substitutions, resulting in four amino acid substitutions: V666A, Y942N, L956P and E1320V. This mutant allele was named "Fungal 5 muA". To test the causality of Fungal 5 muA with improved titer and specificity, a mutant allele was amplified from one of the isolates and reintroduced into the parent strain. The resulting strain replicated the phenotypes and demonstrated the use of Fungal_5_muA to improve the production and specificity of steviol glycosides. When T4 Fungal 5 and Fungal 5 muA were expressed under the weaker GAL3 promoter, the Fungal 5 muA strain produced 30% more Reb M in whole cell broth and 40% more extracellular Reb M than the wild type T4_Fungal_5 strain (Fig. 14) , which is consistent with earlier data.
Пример 15: Дальнейшее улучшение Fungal_5_muAExample 15: Further improvement of Fungal_5_muA
[00214] Для дальнейшего улучшения Fungal_5_muA путем удаления потенциально вредных мутаций мы создали дополнительные варианты мутанта Т4 Fungal 5 с одной, двумя или тремя аминокислотными заменами, идентифицированными в Fungal S muA, и ввели их в штамм дрожжей, используемый для скрининга библиотеки мутагенеза Т4 Fungal 5 в Примере 14. Хотя однократная реверсия V666A в Fungal 5 muA оказала незначительное влияние на продукцию TSG или Reb М, реверсия E1320V была полезной, и тройной мутант V666A Y942N L956P продуцировал на 14% больше TSG и на 12% больше Reb М, чем штамм Fungal 5 muA (Фиг. 15 и 16). Однако дальнейшая реверсия L956P в тройном мутанте (V666A Y942N) привела к 10% снижению Reb М и 19% снижению продуцирования TSG по сравнению с тройным мутантом V666A Y942N L956P. По сравнению со штаммом Fungal_5_muA, единственный мутантный штамм Y942N продуцировал на 21% больше TSG, но на 10% меньше количества Reb М. Эти данные демонстрируют, что мутация Y942N улучшала общую активность Т4 Fungal 5 в экспорте стевиоловых гликозидов, но оказывала отрицательное влияние на его специфичность в отношении Reb М.[00214] To further improve Fungal_5_muA by removing potentially deleterious mutations, we generated additional Fungal 5 T4 mutant variants with one, two, or three amino acid substitutions identified in Fungal S muA and introduced them into the yeast strain used to screen the Fungal 5 T4 mutagenesis library in Example 14. Although a single reversion of V666A to Fungal 5 muA had little effect on TSG or Reb M production, E1320V reversion was beneficial and the V666A Y942N L956P triple mutant produced 14% more TSG and 12% more Reb M than the Fungal strain. 5 muA (Fig. 15 and 16). However, further reversion of L956P in the triple mutant (V666A Y942N) resulted in a 10% decrease in Reb M and a 19% decrease in TSG production compared to the V666A Y942N L956P triple mutant. Compared to the Fungal_5_muA strain, a single Y942N mutant strain produced 21% more TSG but 10% less Reb M. These data demonstrate that the Y942N mutation improved the overall activity of T4 Fungal 5 in the export of steviol glycosides, but had a negative effect on its specificity for Reb M.
[00215] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в данный документ посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была специально и отдельно указана как включенная посредством ссылки. Хотя вышеизложенные варианты осуществления были описаны подробно в целях иллюстрации и примера для ясности понимания, для специалиста в данной области техники будет ясно в свете раскрытия настоящего изобретения, что в изобретение могут быть внесены определенные изменения и модификации без отступления от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.[00215] All publications, patents, and patent applications referred to in this specification are incorporated herein by reference, as if each individual publication, patent, or patent application were specifically and separately indicated as being incorporated by reference. Although the foregoing embodiments have been described in detail for purposes of illustration and example for clarity of understanding, it will be clear to a person skilled in the art in light of the disclosure of the present invention that certain changes and modifications may be made to the invention without departing from the spirit or scope of the appended claims.
--->--->
SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING
<110> AMYRIS, INC.<110> AMYRIS, INC.
<120> ABC TRANSPORTERS FOR THE HIGH EFFICIENCY PRODUCTION OF <120> ABC TRANSPORTERS FOR THE HIGH EFFICIENCY PRODUCTION OF
REBAUDIOSIDES REBAUDIOSIDES
<130> 107345.00779<130> 107345.00779
<140> PCT/US2020/014859<140> PCT/US2020/014859
<141> 2020-01-23<141> 2020-01-23
<150> US 62/796,228<150> US 62/796,228
<151> 2019-01-24<151> 2019-01-24
<160> 30 <160> 30
<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 1559<211> 1559
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: CEN.PK.BPT1 ABC-transporter<223> Synthetic: CEN.PK.BPT1 ABC-transporter
<400> 1<400> 1
Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val
20 25 30 20 25 30
Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln
35 40 45 35 40 45
Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn
50 55 60 50 55 60
Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu
85 90 95 85 90 95
Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln
115 120 125 115 120 125
Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe
130 135 140 130 135 140
Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln
165 170 175 165 170 175
Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile
180 185 190 180 185 190
Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu
195 200 205 195 200 205
Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr
210 215 220 210 215 220
Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu
245 250 255 245 250 255
Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu
260 265 270 260 265 270
Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe
275 280 285 275 280 285
Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu
290 295 300 290 295 300
Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Leu Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile
325 330 335 325 330 335
Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn
340 345 350 340 345 350
Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser
355 360 365 355 360 365
Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu
370 375 380 370 375 380
Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly
405 410 415 405 410 415
Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu
420 425 430 420 425 430
Gly Lys Ala Val Ile Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro Gly Lys Ala Val Ile Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro
435 440 445 435 440 445
Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln
450 455 460 450 455 460
Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn
465 470 475 480 465 470 475 480
Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala
485 490 495 485 490 495
Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys
500 505 510 500 505 510
Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro
515 520 525 515 520 525
Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp
530 535 540 530 535 540
Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn
545 550 555 560 545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile
565 570 575 565 570 575
Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser
580 585 590 580 585 590
Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp
595 600 605 595 600 605
Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp
610 615 620 610 615 620
Lys Ser Lys Glu Val Leu Thr Ser Ser Gln Ser Gly Asp Asn Leu Arg Lys Ser Lys Glu Val Leu Thr Ser Ser Gln Ser Gly Asp Asn Leu Arg
625 630 635 640 625 630 635 640
Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn
645 650 655 645 650 655
Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln
675 680 685 675 680 685
Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile
690 695 700 690 695 700
Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met
705 710 715 720 705 710 715 720
Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln
725 730 735 725 730 735
Asp Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu Asp Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu
740 745 750 740 745 750
Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile
755 760 765 755 760 765
Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val
770 775 780 770 775 780
Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val
785 790 795 800 785 790 795 800
Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys
805 810 815 805 810 815
Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val
820 825 830 820 825 830
Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu
835 840 845 835 840 845
Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn
850 855 860 850 855 860
Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp
865 870 875 880 865 870 875 880
Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu
885 890 895 885 890 895
Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp
900 905 910 900 905 910
Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg
915 920 925 915 920 925
Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln
930 935 940 930 935 940
Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Lys Ala Glu Lys Thr Glu Val Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Lys Ala Glu Lys Thr Glu Val
945 950 955 960 945 950 955 960
Gly Arg Val Lys Thr Lys Ile Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly Gly Arg Val Lys Thr Lys Ile Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly
965 970 975 965 970 975
Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val
980 985 990 980 985 990
Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn
995 1000 1005 995 1000 1005
Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Thr Ile Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Thr Ile
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Asp Ile Ser Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Asp Ile Ser
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys
1550 1555 1550 1555
<210> 2<210> 2
<211> 1620<211> 1620
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_1 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_1 ABC transporter
<400> 2<400> 2
Met Ser Leu Glu Leu Ser Asn Ser Thr Leu Cys Asp Ser Tyr Trp Ala Met Ser Leu Glu Leu Ser Asn Ser Thr Leu Cys Asp Ser Tyr Trp Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Asp Asp Phe Thr Ala Cys Gly Arg Gln Leu Val Glu Ser Trp Val Val Asp Asp Phe Thr Ala Cys Gly Arg Gln Leu Val Glu Ser Trp Val
20 25 30 20 25 30
Ser Val Pro Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Val Ala Phe Asn Leu Leu Ser Val Pro Leu Val Leu Ser Ala Leu Val Val Ala Phe Asn Leu Leu
35 40 45 35 40 45
Arg Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Thr Asp Pro Tyr Ser Lys Leu Asp Arg Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Thr Asp Pro Tyr Ser Lys Leu Asp
50 55 60 50 55 60
Ala Glu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Asn Gly His Ala Leu Tyr Thr Ser Ala Glu Gln Gln Pro Leu Leu Gln Asn Gly His Ala Leu Tyr Thr Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Ile Glu Ser Asp Asn Thr Asp Ile Phe Gln Arg His Phe Asp Ile Ser Ile Glu Ser Asp Asn Thr Asp Ile Phe Gln Arg His Phe Asp Ile
85 90 95 85 90 95
Ala Leu Leu Lys Pro Val Lys Asp Asp Gly Lys Pro Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Lys Pro Val Lys Asp Asp Gly Lys Pro Ile Gly Val Val
100 105 110 100 105 110
Arg Ile Val Tyr Arg Asp Thr Ala Glu Lys Leu Lys Val Ala Leu Glu Arg Ile Val Tyr Arg Asp Thr Ala Glu Lys Leu Lys Val Ala Leu Glu
115 120 125 115 120 125
Glu Ile Leu Leu Ile Ser Gln Thr Val Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ser Glu Ile Leu Leu Ile Ser Gln Thr Val Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ser
130 135 140 130 135 140
Arg Leu Glu Asp Ile Ser Glu Ser Arg Phe Leu Leu Val Lys Tyr Ile Arg Leu Glu Asp Ile Ser Glu Ser Arg Phe Leu Leu Val Lys Tyr Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Phe Ser Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Val Ile Thr Ser Ala Arg Leu Asn Phe Ser Leu Trp Leu Tyr Leu Thr Val Ile Thr Ser Ala Arg Leu
165 170 175 165 170 175
Leu Asn Val Thr Lys Gly Phe Ser Ala Asn Arg Val Asp Leu Trp Tyr Leu Asn Val Thr Lys Gly Phe Ser Ala Asn Arg Val Asp Leu Trp Tyr
180 185 190 180 185 190
His Cys Ala Ile Leu Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Asn Ser Val Met Leu His Cys Ala Ile Leu Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Asn Ser Val Met Leu
195 200 205 195 200 205
Phe Arg Ser Ala Leu Leu His His Val Ser Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Phe Arg Ser Ala Leu Leu His Val Ser Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp
210 215 220 210 215 220
Phe Tyr Val Thr Gln Phe Val Ile Asn Thr Leu Leu Cys Leu Thr Asn Phe Tyr Val Thr Gln Phe Val Ile Asn Thr Leu Leu Cys Leu Thr Asn
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Leu Glu Lys Leu Ser Asp Lys Pro Ala Ile Val Tyr Glu Glu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Ser Asp Lys Pro Ala Ile Val Tyr Glu Glu Glu
245 250 255 245 250 255
Gly Val Ile Pro Ser Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Asp Ile Met Gly Val Ile Pro Ser Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Asp Ile Met
260 265 270 260 265 270
Thr Tyr Gly Tyr Leu Asp Lys Met Val Phe Ser Ser Tyr Trp Lys Pro Thr Tyr Gly Tyr Leu Asp Lys Met Val Phe Ser Ser Tyr Trp Lys Pro
275 280 285 275 280 285
Ile Thr Met Glu Glu Val Trp Gly Leu Arg Tyr Asp Asp Tyr Ser His Ile Thr Met Glu Glu Val Trp Gly Leu Arg Tyr Asp Asp Tyr Ser His
290 295 300 290 295 300
Asp Val Leu Ile Arg Phe His Lys Leu Lys Ser Ser Ile Arg Phe Thr Asp Val Leu Ile Arg Phe His Lys Leu Lys Ser Ser Ile Arg Phe Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Arg Leu Phe Leu Gln Phe Lys Lys Glu Leu Ala Leu Gln Thr Leu Leu Arg Leu Phe Leu Gln Phe Lys Lys Glu Leu Ala Leu Gln Thr Leu
325 330 335 325 330 335
Cys Thr Cys Ile Glu Ala Leu Leu Ile Phe Val Pro Pro Leu Cys Leu Cys Thr Cys Ile Glu Ala Leu Leu Ile Phe Val Pro Pro Leu Cys Leu
340 345 350 340 345 350
Lys Lys Ile Leu Glu Tyr Ile Glu Ser Pro His Thr Lys Ser Arg Ser Lys Lys Ile Leu Glu Tyr Ile Glu Ser Pro His Thr Lys Ser Arg Ser
355 360 365 355 360 365
Met Ala Trp Phe Tyr Val Leu Ile Met Phe Gly Ser Gly Val Ile Ala Met Ala Trp Phe Tyr Val Leu Ile Met Phe Gly Ser Gly Val Ile Ala
370 375 380 370 375 380
Cys Ser Phe Ser Gly Arg Gly Leu Phe Leu Gly Arg Arg Ile Cys Thr Cys Ser Phe Ser Gly Arg Gly Leu Phe Leu Gly Arg Arg Ile Cys Thr
385 390 395 400 385 390 395 400
Arg Met Arg Ser Ile Leu Ile Gly Glu Ile Tyr Ser Lys Ala Leu Arg Arg Met Arg Ser Ile Leu Ile Gly Glu Ile Tyr Ser Lys Ala Leu Arg
405 410 415 405 410 415
Arg Arg Leu Gly Ser Thr Asp Lys Glu Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Arg Arg Leu Gly Ser Thr Asp Lys Glu Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp
420 425 430 420 425 430
Asp Lys Ser Ala Lys Ser Lys Lys Glu Asp Glu Pro Ser Asn Lys Glu Asp Lys Ser Ala Lys Ser Lys Lys Glu Asp Glu Pro Ser Asn Lys Glu
435 440 445 435 440 445
Leu Gly Gly Ile Ile Asn Leu Met Ala Val Asp Ala Phe Lys Val Ser Leu Gly Gly Ile Ile Asn Leu Met Ala Val Asp Ala Phe Lys Val Ser
450 455 460 450 455 460
Glu Ile Gly Gly Tyr Leu His Tyr Phe Pro Asn Ser Phe Val Met Ala Glu Ile Gly Gly Tyr Leu His Tyr Phe Pro Asn Ser Phe Val Met Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Ala Val Ala Ile Tyr Met Leu Tyr Lys Leu Leu Gly Trp Ser Ser Leu Ala Val Ala Ile Tyr Met Leu Tyr Lys Leu Leu Gly Trp Ser Ser Leu
485 490 495 485 490 495
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ile Ala Ile Leu Pro Ile Asn Tyr Met Leu Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ile Ala Ile Leu Pro Ile Asn Tyr Met Leu
500 505 510 500 505 510
Val Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Gln Lys Gln Met Leu Leu Val Thr Asp Val Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Gln Lys Gln Met Leu Leu Val Thr Asp
515 520 525 515 520 525
Lys Arg Ile Gln Lys Thr Asn Glu Ala Phe Gln Asn Ile Arg Ile Ile Lys Arg Ile Gln Lys Thr Asn Glu Ala Phe Gln Asn Ile Arg Ile Ile
530 535 540 530 535 540
Lys Tyr Phe Ala Trp Glu Asp Lys Phe Ala Asp Thr Ile Met Lys Ile Lys Tyr Phe Ala Trp Glu Asp Lys Phe Ala Asp Thr Ile Met Lys Ile
545 550 555 560 545 550 555 560
Arg Glu Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Val Gly Arg Cys Val Val Trp Ala Arg Glu Glu Glu Leu Gly Tyr Leu Val Gly Arg Cys Val Val Trp Ala
565 570 575 565 570 575
Leu Leu Ile Phe Leu Trp Leu Val Val Pro Thr Ile Val Thr Leu Ile Leu Leu Ile Phe Leu Trp Leu Val Val Pro Thr Ile Val Thr Leu Ile
580 585 590 580 585 590
Thr Phe Tyr Ala Tyr Thr Val Ile Gln Gly Asn Pro Leu Thr Ser Pro Thr Phe Tyr Ala Tyr Thr Val Ile Gln Gly Asn Pro Leu Thr Ser Pro
595 600 605 595 600 605
Ile Ala Phe Thr Ala Leu Ser Leu Phe Thr Leu Leu Arg Gly Pro Leu Ile Ala Phe Thr Ala Leu Ser Leu Phe Thr Leu Leu Arg Gly Pro Leu
610 615 620 610 615 620
Asp Ala Leu Ala Asp Met Leu Ser Met Val Met Gln Cys Lys Val Ser Asp Ala Leu Ala Asp Met Leu Ser Met Val Met Gln Cys Lys Val Ser
625 630 635 640 625 630 635 640
Leu Asp Arg Val Glu Asp Phe Leu Asn Glu Pro Glu Thr Thr Lys Tyr Leu Asp Arg Val Glu Asp Phe Leu Asn Glu Pro Glu Thr Thr Lys Tyr
645 650 655 645 650 655
Gln Gln Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Asn Ser Pro Leu Ile Gly Phe Gln Gln Leu Ser Ala Pro Arg Gly Pro Asn Ser Pro Leu Ile Gly Phe
660 665 670 660 665 670
Glu Asn Ala Thr Phe Tyr Trp Ser Lys Asn Ser Lys Ala Glu Phe Ala Glu Asn Ala Thr Phe Tyr Trp Ser Lys Asn Ser Lys Ala Glu Phe Ala
675 680 685 675 680 685
Leu Lys Asp Leu Asn Ile Asp Phe Lys Val Gly Lys Leu Asn Val Val Leu Lys Asp Leu Asn Ile Asp Phe Lys Val Gly Lys Leu Asn Val Val
690 695 700 690 695 700
Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Leu Leu Ala Leu Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
Gly Glu Met Asp Leu Asp Lys Gly Asn Val Phe Leu Pro Gly Ala Ile Gly Glu Met Asp Leu Asp Lys Gly Asn Val Phe Leu Pro Gly Ala Ile
725 730 735 725 730 735
Pro Arg Asp Asp Leu Thr Pro Asn Pro Val Thr Gly Leu Met Glu Ser Pro Arg Asp Asp Leu Thr Pro Asn Pro Val Thr Gly Leu Met Glu Ser
740 745 750 740 745 750
Val Ala Tyr Cys Ser Gln Thr Ala Trp Leu Leu Asn Ala Thr Val Lys Val Ala Tyr Cys Ser Gln Thr Ala Trp Leu Leu Asn Ala Thr Val Lys
755 760 765 755 760 765
Asp Asn Ile Ile Phe Ala Ser Pro Phe Asn Gln Glu Arg Tyr Asp Ala Asp Asn Ile Ile Phe Ala Ser Pro Phe Asn Gln Glu Arg Tyr Asp Ala
770 775 780 770 775 780
Val Ile His Ala Cys Gly Leu Thr Arg Asp Leu Ser Ile Leu Glu Ala Val Ile His Ala Cys Gly Leu Thr Arg Asp Leu Ser Ile Leu Glu Ala
785 790 795 800 785 790 795 800
Gly Asp Glu Thr Glu Ile Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gly Asp Glu Thr Glu Ile Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly
805 810 815 805 810 815
Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Ser Ser Ala Ser Gln Lys Gln Arg Val Ser Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Ser Ser Ala Ser
820 825 830 820 825 830
Tyr Leu Leu Leu Asp Asp Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Tyr Leu Leu Leu Asp Asp Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala
835 840 845 835 840 845
Val His Ile Tyr Asp Tyr Cys Ile Asn Gly Glu Leu Met Lys Gly Arg Val His Ile Tyr Asp Tyr Cys Ile Asn Gly Glu Leu Met Lys Gly Arg
850 855 860 850 855 860
Thr Cys Ile Leu Val Ser His Asn Val Ser Leu Thr Val Lys Glu Ala Thr Cys Ile Leu Val Ser His Asn Val Ser Leu Thr Val Lys Glu Ala
865 870 875 880 865 870 875 880
Asp Phe Val Val Met Met Asp Asn Gly Arg Ile Lys Ala Gln Gly Ser Asp Phe Val Val Met Met Asp Asn Gly Arg Ile Lys Ala Gln Gly Ser
885 890 895 885 890 895
Val Asp Glu Leu Met Gln Glu Gly Leu Leu Asn Glu Glu Val Val Lys Val Asp Glu Leu Met Gln Glu Gly Leu Leu Asn Glu Glu Val Val Lys
900 905 910 900 905 910
Ser Val Met Gln Ser Arg Ser Ala Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ala Leu Ser Val Met Gln Ser Arg Ser Ala Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ala Leu
915 920 925 915 920 925
Asp Asp Asn Ser Pro Ile Ser Ser Glu Ala Ile Ala Glu Gly Leu Ala Asp Asp Asn Ser Pro Ile Ser Ser Glu Ala Ile Ala Glu Gly Leu Ala
930 935 940 930 935 940
Lys Lys Thr Gln Lys Pro Glu Gln Ser Lys Lys Ser Lys Leu Ile Glu Lys Lys Thr Gln Lys Pro Glu Gln Ser Lys Lys Ser Lys Leu Ile Glu
945 950 955 960 945 950 955 960
Asp Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ser Val Lys Pro Glu Ile Tyr Tyr Ala Asp Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ser Val Lys Pro Glu Ile Tyr Tyr Ala
965 970 975 965 970 975
Tyr Phe Arg Tyr Phe Gly Asn Pro Ala Leu Trp Ile Met Ile Ala Phe Tyr Phe Arg Tyr Phe Gly Asn Pro Ala Leu Trp Ile Met Ile Ala Phe
980 985 990 980 985 990
Leu Phe Ile Gly Ser Gln Ser Val Asn Val Tyr Gln Ser Tyr Trp Leu Leu Phe Ile Gly Ser Gln Ser Val Asn Val Tyr Gln Ser Tyr Trp Leu
995 1000 1005 995 1000 1005
Arg Arg Trp Ser Ala Ile Glu Asp Lys Arg Asp Leu Ser Ala Phe Arg Arg Trp Ser Ala Ile Glu Asp Lys Arg Asp Leu Ser Ala Phe
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ser Asn Ser Asn Asp Met Thr Leu Phe Leu Phe Pro Thr Phe His Ser Asn Ser Asn Asp Met Thr Leu Phe Leu Phe Pro Thr Phe His
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Ser Ile Asn Trp His Arg Pro Leu Val Asn Tyr Ala Leu Gln Pro Ser Ile Asn Trp His Arg Pro Leu Val Asn Tyr Ala Leu Gln Pro
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Gly Leu Ala Val Glu Glu Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ile Thr Phe Gly Leu Ala Val Glu Glu Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ile Thr
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Ile Tyr Thr Leu Ile Gly Leu Ala Phe Ala Thr Leu Gly Ser Ser Ile Tyr Thr Leu Ile Gly Leu Ala Phe Ala Thr Leu Gly Ser Ser
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Arg Val Ile Leu Thr Phe Ile Gly Gly Leu Asn Val Ser Arg Lys Arg Val Ile Leu Thr Phe Ile Gly Gly Leu Asn Val Ser Arg Lys
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Ile Phe Lys Asp Leu Leu Asp Lys Leu Leu His Ala Lys Leu Arg Ile Phe Lys Asp Leu Leu Asp Lys Leu Leu His Ala Lys Leu Arg
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Phe Phe Asp Gln Thr Pro Ile Gly Arg Ile Met Asn Arg Phe Ser Phe Phe Asp Gln Thr Pro Ile Gly Arg Ile Met Asn Arg Phe Ser
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Lys Asp Ile Glu Ala Ile Asp Gln Glu Leu Ala Leu Tyr Ala Glu Lys Asp Ile Glu Ala Ile Asp Gln Glu Leu Ala Leu Tyr Ala Glu
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Glu Phe Val Thr Tyr Leu Ile Ser Cys Leu Ser Thr Leu Val Val Glu Phe Val Thr Tyr Leu Ile Ser Cys Leu Ser Thr Leu Val Val
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Val Cys Ala Val Thr Pro Ala Phe Leu Val Ala Gly Val Leu Ile Val Cys Ala Val Thr Pro Ala Phe Leu Val Ala Gly Val Leu Ile
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Leu Leu Val Tyr Tyr Gly Val Gly Val Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Leu Leu Val Tyr Tyr Gly Val Gly Val Leu Tyr Leu Glu Leu Ser
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Arg Asp Leu Lys Arg Phe Glu Ser Ile Thr Lys Ser Pro Ile His Arg Asp Leu Lys Arg Phe Glu Ser Ile Thr Lys Ser Pro Ile His
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Met Thr Thr Ile Arg Ala Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Met Thr Thr Ile Arg Ala
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Tyr Gly Asp Glu Arg Arg Phe Leu Lys Gln Asn Phe Glu Lys Ile Tyr Gly Asp Glu Arg Arg Phe Leu Lys Gln Asn Phe Glu Lys Ile
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Asp Val Asn Asn Arg Pro Phe Trp Tyr Val Trp Val Asn Asn Arg Asp Val Asn Asn Arg Pro Phe Trp Tyr Val Trp Val Asn Asn Arg
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Trp Leu Ala Tyr Arg Ser Asp Met Ile Gly Ala Phe Ile Ile Phe Trp Leu Ala Tyr Arg Ser Asp Met Ile Gly Ala Phe Ile Ile Phe
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Phe Ala Ala Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Asp Lys Ile Asp Ala Phe Ala Ala Ala Phe Ala Val Ala Tyr Ser Asp Lys Ile Asp Ala
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Gly Leu Ala Gly Ile Ser Leu Ser Phe Ser Val Ser Phe Arg Tyr Gly Leu Ala Gly Ile Ser Leu Ser Phe Ser Val Ser Phe Arg Tyr
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Thr Ala Val Trp Val Val Arg Met Tyr Ala Tyr Val Glu Met Ser Thr Ala Val Trp Val Val Arg Met Tyr Ala Tyr Val Glu Met Ser
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Met Asn Ser Val Glu Arg Val Gln Glu Tyr Ile Glu Gln Thr Pro Met Asn Ser Val Glu Arg Val Gln Glu Tyr Ile Glu Gln Thr Pro
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Gln Glu Pro Pro Lys Tyr Leu Pro Gln Asp Pro Val Asn Ser Trp Gln Glu Pro Pro Lys Tyr Leu Pro Gln Asp Pro Val Asn Ser Trp
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Pro Ser Asn Gly Val Ile Asp Val Gln Asn Ile Cys Ile Arg Tyr Pro Ser Asn Gly Val Ile Asp Val Gln Asn Ile Cys Ile Arg Tyr
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Ser Pro Glu Leu Pro Arg Val Ile Asp Asn Val Ser Phe His Val Ser Pro Glu Leu Pro Arg Val Ile Asp Asn Val Ser Phe His Val
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Asn Ala Gly Glu Lys Ile Gly Val Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly Asn Ala Gly Glu Lys Ile Gly Val Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ser Phe Phe Arg Phe Val Asp Leu Glu Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ser Phe Phe Arg Phe Val Asp Leu Glu
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asp Gly Leu Asp Ile Ser Lys Ile Gly Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asp Gly Leu Asp Ile Ser Lys Ile Gly
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Leu Lys Pro Leu Arg Lys Gly Leu Thr Ile Ile Pro Gln Asp Pro Leu Lys Pro Leu Arg Lys Gly Leu Thr Ile Ile Pro Gln Asp Pro
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Thr Leu Phe Ser Gly Thr Ile Arg Ser Asn Leu Asp Ile Phe Gly Thr Leu Phe Ser Gly Thr Ile Arg Ser Asn Leu Asp Ile Phe Gly
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Glu Tyr Gly Asp Leu Gln Met Phe Glu Ala Leu Arg Arg Val Asn Glu Tyr Gly Asp Leu Gln Met Phe Glu Ala Leu Arg Arg Val Asn
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Leu Ile Ser Val Asp Asp Tyr Gln Arg Ile Val Asp Gly Asn Gly Leu Ile Ser Val Asp Asp Tyr Gln Arg Ile Val Asp Gly Asn Gly
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Ala Ala Val Ala Asp Glu Thr Ala Gln Ala Arg Gly Asp Asn Val Ala Ala Val Ala Asp Glu Thr Ala Gln Ala Arg Gly Asp Asn Val
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Asn Lys Phe Leu Asp Leu Asp Ser Thr Val Ser Glu Gly Gly Gly Asn Lys Phe Leu Asp Leu Asp Ser Thr Val Ser Glu Gly Gly Gly
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Asn Leu Ser Gln Gly Glu Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ser Asn Leu Ser Gln Gly Glu Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ser
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Ile Leu Lys Met Pro Lys Ile Leu Met Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ile Leu Lys Met Pro Lys Ile Leu Met Leu Asp Glu Ala Thr Ala
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Ser Ile Asp Tyr Glu Ser Asp Ala Lys Ile Gln Ala Thr Ile Arg Ser Ile Asp Tyr Glu Ser Asp Ala Lys Ile Gln Ala Thr Ile Arg
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Glu Glu Phe Ser Ser Ser Thr Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Glu Glu Phe Ser Ser Ser Thr Val Leu Thr Ile Ala His Arg Leu
1550 1555 1560 1550 1555 1560
Lys Thr Ile Ile Asp Tyr Asp Lys Ile Leu Leu Leu Asp His Gly Lys Thr Ile Ile Asp Tyr Asp Lys Ile Leu Leu Leu Asp His Gly
1565 1570 1575 1565 1570 1575
Lys Val Lys Glu Tyr Asp His Pro Tyr Lys Leu Ile Thr Asn Lys Lys Val Lys Glu Tyr Asp His Pro Tyr Lys Leu Ile Thr Asn Lys
1580 1585 1590 1580 1585 1590
Lys Ser Asp Phe Arg Lys Met Cys Gln Asp Thr Gly Glu Phe Asp Lys Ser Asp Phe Arg Lys Met Cys Gln Asp Thr Gly Glu Phe Asp
1595 1600 1605 1595 1600 1605
Asp Leu Val Asn Leu Ala Lys Gln Ala Tyr Arg Lys Asp Leu Val Asn Leu Ala Lys Gln Ala Tyr Arg Lys
1610 1615 1620 1610 1615 1620
<210> 3<210> 3
<211> 1515<211> 1515
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_10 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_10 ABC transporter
<400> 3<400> 3
Met Gly Gln Ser Glu Arg Ala Ala Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Asn Met Gly Gln Ser Glu Arg Ala Ala Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg Asn
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Thr Glu Cys Trp Leu Cys Arg Asp Lys Glu Gly Phe Gly Pro Ile Thr Thr Glu Cys Trp Leu Cys Arg Asp Lys Glu Gly Phe Gly Pro Ile
20 25 30 20 25 30
Ser Tyr Tyr Gly Asp Phe Thr Val Cys Phe Ile Asp Gly Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Gly Asp Phe Thr Val Cys Phe Ile Asp Gly Val Leu Leu
35 40 45 35 40 45
Asn Phe Ala Ala Leu Phe Met Leu Ile Phe Gly Thr Tyr Gln Val Val Asn Phe Ala Ala Leu Phe Met Leu Ile Phe Gly Thr Tyr Gln Val Val
50 55 60 50 55 60
Lys Leu Ser Lys Lys Glu His Pro Gly Ile Lys Tyr Arg Arg Asp Trp Lys Leu Ser Lys Lys Glu His Pro Gly Ile Lys Tyr Arg Arg Asp Trp
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Leu Phe Ser Arg Ile Thr Leu Val Gly Cys Phe Leu Leu Phe Thr Leu Leu Phe Ser Arg Ile Thr Leu Val Gly Cys Phe Leu Leu Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Ser Met Ala Ala Tyr Tyr Ser Ser Glu Lys His Glu Ser Ile Ala Leu Ser Met Ala Ala Tyr Tyr Ser Ser Glu Lys His Glu Ser Ile Ala Leu
100 105 110 100 105 110
Thr Ser Gln Tyr Thr Leu Thr Leu Met Ser Ile Phe Val Ala Leu Met Thr Ser Gln Tyr Thr Leu Thr Leu Met Ser Ile Phe Val Ala Leu Met
115 120 125 115 120 125
Leu His Trp Val Glu Tyr His Arg Ser Arg Ile Ser Asn Gly Ile Val Leu His Trp Val Glu Tyr His Arg Ser Arg Ile Ser Asn Gly Ile Val
130 135 140 130 135 140
Leu Phe Tyr Trp Leu Phe Glu Thr Leu Phe Gln Gly Ser Lys Trp Val Leu Phe Tyr Trp Leu Phe Glu Thr Leu Phe Gln Gly Ser Lys Trp Val
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Phe Ser Ile Arg His Ala Tyr Asn Leu Asn His Glu Trp Pro Val Asn Phe Ser Ile Arg His Ala Tyr Asn Leu Asn His Glu Trp Pro Val
165 170 175 165 170 175
Ser Tyr Ser Val Tyr Ile Leu Thr Ile Phe Gln Thr Ile Ser Ala Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Ile Leu Thr Ile Phe Gln Thr Ile Ser Ala Phe
180 185 190 180 185 190
Met Ile Leu Ile Leu Glu Ala Gly Phe Glu Lys Pro Leu Pro Ser Tyr Met Ile Leu Ile Leu Glu Ala Gly Phe Glu Lys Pro Leu Pro Ser Tyr
195 200 205 195 200 205
Gln Arg Val Ile Glu Ser Tyr Ser Lys Gln Lys Arg Asn Pro Val Asp Gln Arg Val Ile Glu Ser Tyr Ser Lys Gln Lys Arg Asn Pro Val Asp
210 215 220 210 215 220
Asn Ser His Ile Phe Gln Arg Leu Ser Phe Ser Trp Met Thr Glu Leu Asn Ser His Ile Phe Gln Arg Leu Ser Phe Ser Trp Met Thr Glu Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Lys Thr Gly Tyr Lys Lys Tyr Leu Thr Glu Gln Asp Leu Tyr Lys Met Lys Thr Gly Tyr Lys Lys Tyr Leu Thr Glu Gln Asp Leu Tyr Lys
245 250 255 245 250 255
Leu Pro Lys Ser Phe Gly Ala Lys Glu Ile Ser His Lys Phe Ser Glu Leu Pro Lys Ser Phe Gly Ala Lys Glu Ile Ser His Lys Phe Ser Glu
260 265 270 260 265 270
Arg Trp Gln Tyr Gln Leu Lys His Lys Ala Asn Pro Ser Leu Ala Trp Arg Trp Gln Tyr Gln Leu Lys His Lys Ala Asn Pro Ser Leu Ala Trp
275 280 285 275 280 285
Ala Leu Leu Ser Thr Phe Gly Gly Lys Ile Leu Leu Gly Gly Ile Phe Ala Leu Leu Ser Thr Phe Gly Gly Lys Ile Leu Leu Gly Gly Ile Phe
290 295 300 290 295 300
Lys Val Ala Tyr Asp Ile Leu Gln Phe Thr Gln Pro Gln Leu Leu Arg Lys Val Ala Tyr Asp Ile Leu Gln Phe Thr Gln Pro Gln Leu Leu Arg
305 310 315 320 305 310 315 320
Ile Leu Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Gln Ile Leu Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Gln
325 330 335 325 330 335
Leu Pro Leu Val Arg Gly Val Met Leu Ser Ile Ala Met Phe Val Val Leu Pro Leu Val Arg Gly Val Met Leu Ser Ile Ala Met Phe Val Val
340 345 350 340 345 350
Ser Val Val Gln Thr Ser Ile Leu His Gln Tyr Phe Leu Asn Ala Phe Ser Val Val Gln Thr Ser Ile Leu His Gln Tyr Phe Leu Asn Ala Phe
355 360 365 355 360 365
Asp Thr Gly Met His Ile Lys Ser Gly Met Thr Ser Val Ile Tyr Gln Asp Thr Gly Met His Ile Lys Ser Gly Met Thr Ser Val Ile Tyr Gln
370 375 380 370 375 380
Lys Ala Leu Val Leu Ser Ser Glu Ala Ser Ala Ser Ser Ser Thr Gly Lys Ala Leu Val Leu Ser Ser Glu Ala Ser Ala Ser Ser Ser Thr Gly
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Ile Val Asn Leu Met Ser Val Asp Val Gln Arg Leu Gln Asp Leu Asp Ile Val Asn Leu Met Ser Val Asp Val Gln Arg Leu Gln Asp Leu
405 410 415 405 410 415
Thr Gln Trp Gly Gln Ile Ile Trp Ser Gly Pro Phe Gln Ile Ile Leu Thr Gln Trp Gly Gln Ile Ile Trp Ser Gly Pro Phe Gln Ile Ile Leu
420 425 430 420 425 430
Cys Leu Val Ser Leu Tyr Lys Leu Leu Gly Pro Cys Met Trp Val Gly Cys Leu Val Ser Leu Tyr Lys Leu Leu Gly Pro Cys Met Trp Val Gly
435 440 445 435 440 445
Val Ile Ile Met Ile Ile Met Ile Pro Ile Asn Ser Val Ile Val Arg Val Ile Ile Met Ile Ile Met Ile Pro Ile Asn Ser Val Ile Val Arg
450 455 460 450 455 460
Ile Gln Lys Lys Leu Gln Lys Ile Gln Met Lys Asn Lys Asp Glu Arg Ile Gln Lys Lys Leu Gln Lys Ile Gln Met Lys Asn Lys Asp Glu Arg
465 470 475 480 465 470 475 480
Thr Arg Val Thr Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Lys Ser Leu Lys Val Thr Arg Val Thr Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Lys Ser Leu Lys Val
485 490 495 485 490 495
Tyr Gly Trp Glu Ile Pro Tyr Lys Ala Lys Leu Asp His Val Arg Asn Tyr Gly Trp Glu Ile Pro Tyr Lys Ala Lys Leu Asp His Val Arg Asn
500 505 510 500 505 510
Asp Lys Glu Leu Lys Asn Leu Lys Lys Met Gly Cys Thr Leu Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Asn Leu Lys Lys Met Gly Cys Thr Leu Ala Leu
515 520 525 515 520 525
Ala Ser Phe Gln Phe Asn Ile Val Pro Phe Leu Val Ser Cys Ser Thr Ala Ser Phe Gln Phe Asn Ile Val Pro Phe Leu Val Ser Cys Ser Thr
530 535 540 530 535 540
Phe Ala Val Phe Val Phe Thr Glu Asp Arg Pro Leu Ser Thr Asp Leu Phe Ala Val Phe Val Phe Thr Glu Asp Arg Pro Leu Ser Thr Asp Leu
545 550 555 560 545 550 555 560
Val Phe Pro Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Leu Ser Phe Pro Leu Ala Val Phe Pro Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Leu Ser Phe Pro Leu Ala
565 570 575 565 570 575
Val Val Pro Asn Ala Ile Ser Ser Phe Ile Glu Ala Ser Val Ser Val Val Val Pro Asn Ala Ile Ser Ser Phe Ile Glu Ala Ser Val Ser Val
580 585 590 580 585 590
Asn Arg Leu Tyr Ala Phe Leu Thr Asn Glu Glu Leu Gln Thr Asp Ala Asn Arg Leu Tyr Ala Phe Leu Thr Asn Glu Glu Leu Gln Thr Asp Ala
595 600 605 595 600 605
Val His Arg Glu Pro Lys Val Asn Asn Ile Gly Asp Glu Gly Val Lys Val His Arg Glu Pro Lys Val Asn Asn Ile Gly Asp Glu Gly Val Lys
610 615 620 610 615 620
Val Ser Asp Ala Thr Phe Leu Trp Gln Arg Lys Pro Glu Tyr Lys Val Val Ser Asp Ala Thr Phe Leu Trp Gln Arg Lys Pro Glu Tyr Lys Val
625 630 635 640 625 630 635 640
Ala Leu Lys Asn Ile Asn Phe Ser Ala Lys Lys Gly Glu Leu Thr Cys Ala Leu Lys Asn Ile Asn Phe Ser Ala Lys Lys Gly Glu Leu Thr Cys
645 650 655 645 650 655
Ile Val Gly Lys Val Gly Ser Gly Lys Ser Ala Leu Ile Gln Ser Leu Ile Val Gly Lys Val Gly Ser Gly Lys Ser Ala Leu Ile Gln Ser Leu
660 665 670 660 665 670
Leu Gly Asp Leu Ile Arg Val Lys Gly Tyr Ala Ala Val His Gly Ser Leu Gly Asp Leu Ile Arg Val Lys Gly Tyr Ala Ala Val His Gly Ser
675 680 685 675 680 685
Val Ala Tyr Val Ser Gln Val Ala Trp Ile Met Asn Gly Thr Val Lys Val Ala Tyr Val Ser Gln Val Ala Trp Ile Met Asn Gly Thr Val Lys
690 695 700 690 695 700
Asp Asn Ile Ile Phe Gly His Lys Tyr Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Leu Asp Asn Ile Ile Phe Gly His Lys Tyr Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Ile Lys Ala Cys Ala Leu Ala Ile Asp Leu Ser Met Leu Pro Asp Thr Ile Lys Ala Cys Ala Leu Ala Ile Asp Leu Ser Met Leu Pro Asp
725 730 735 725 730 735
Gly Asp Gln Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile Ser Leu Ser Gly Gly Gly Asp Gln Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile Ser Leu Ser Gly Gly
740 745 750 740 745 750
Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Arg Ala Asp Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Arg Ala Asp
755 760 765 755 760 765
Thr Tyr Leu Leu Asp Asp Pro Leu Ala Ala Val Asp Glu His Val Ala Thr Tyr Leu Leu Asp Asp Pro Leu Ala Ala Val Asp Glu His Val Ala
770 775 780 770 775 780
Lys His Leu Ile Glu His Val Leu Gly Pro His Gly Leu Leu His Ser Lys His Leu Ile Glu His Val Leu Gly Pro His Gly Leu Leu His Ser
785 790 795 800 785 790 795 800
Lys Thr Lys Val Leu Ala Thr Asn Lys Ile Ser Val Leu Ser Ile Ala Lys Thr Lys Val Leu Ala Thr Asn Lys Ile Ser Val Leu Ser Ile Ala
805 810 815 805 810 815
Asp Ser Ile Thr Leu Met Glu Asn Gly Glu Ile Ile Gln Gln Gly Thr Asp Ser Ile Thr Leu Met Glu Asn Gly Glu Ile Ile Gln Gln Gly Thr
820 825 830 820 825 830
Tyr Glu Glu Thr Asn Asn Thr Thr Asp Ser Pro Leu Ser Lys Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Asn Asn Thr Thr Asp Ser Pro Leu Ser Lys Leu Ile
835 840 845 835 840 845
Ser Glu Phe Gly Lys Lys Gly Lys Ala Thr Pro Ser Gln Ser Thr Thr Ser Glu Phe Gly Lys Lys Gly Lys Ala Thr Pro Ser Gln Ser Thr Thr
850 855 860 850 855 860
Ser Leu Thr Lys Leu Ala Thr Ser Asp Leu Gly Ser Ser Ser Asp Ser Ser Leu Thr Lys Leu Ala Thr Ser Asp Leu Gly Ser Ser Ser Asp Ser
865 870 875 880 865 870 875 880
Lys Val Ser Asp Val Ser Ile Asp Val Ser Gln Leu Asp Thr Glu Asn Lys Val Ser Asp Val Ser Ile Asp Val Ser Gln Leu Asp Thr Glu Asn
885 890 895 885 890 895
Leu Thr Glu Ala Glu Glu Leu Lys Ser Leu Arg Arg Ala Ser Met Ala Leu Thr Glu Ala Glu Glu Leu Lys Ser Leu Arg Arg Ala Ser Met Ala
900 905 910 900 905 910
Thr Leu Gly Ser Ile Gly Phe Asp Asp Asp Glu Asn Ile Ala Arg Arg Thr Leu Gly Ser Ile Gly Phe Asp Asp Asp Glu Asn Ile Ala Arg Arg
915 920 925 915 920 925
Glu His Arg Glu Gln Gly Lys Val Lys Trp Asp Ile Tyr Met Glu Tyr Glu His Arg Glu Gln Gly Lys Val Lys Trp Asp Ile Tyr Met Glu Tyr
930 935 940 930 935 940
Ala Arg Ala Cys Asn Pro Arg Ser Val Cys Val Phe Leu Phe Phe Ile Ala Arg Ala Cys Asn Pro Arg Ser Val Cys Val Phe Leu Phe Phe Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Val Leu Ser Met Leu Leu Ser Val Leu Gly Asn Phe Trp Leu Lys His Val Leu Ser Met Leu Leu Ser Val Leu Gly Asn Phe Trp Leu Lys His
965 970 975 965 970 975
Trp Ser Glu Val Asn Thr Gly Glu Gly Tyr Asn Pro His Ala Ala Arg Trp Ser Glu Val Asn Thr Gly Glu Gly Tyr Asn Pro His Ala Ala Arg
980 985 990 980 985 990
Tyr Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Leu Gly Val Gly Ser Ala Leu Ala Thr Tyr Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Leu Gly Val Gly Ser Ala Leu Ala Thr
995 1000 1005 995 1000 1005
Leu Ile Gln Thr Ile Val Leu Trp Val Phe Cys Thr Ile His Gly Leu Ile Gln Thr Ile Val Leu Trp Val Phe Cys Thr Ile His Gly
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ser Arg Tyr Leu His Asp Ala Met Ala Thr Ser Val Leu Lys Ala Ser Arg Tyr Leu His Asp Ala Met Ala Thr Ser Val Leu Lys Ala
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Pro Met Ser Phe Phe Glu Thr Thr Pro Ile Gly Arg Ile Leu Asn Pro Met Ser Phe Phe Glu Thr Thr Pro Ile Gly Arg Ile Leu Asn
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Arg Phe Ser Asn Asp Ile Tyr Lys Val Asp Glu Val Leu Gly Arg Arg Phe Ser Asn Asp Ile Tyr Lys Val Asp Glu Val Leu Gly Arg
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Thr Phe Ser Gln Phe Phe Ala Asn Val Val Lys Val Ser Phe Thr Thr Phe Ser Gln Phe Phe Ala Asn Val Val Lys Val Ser Phe Thr
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Ile Ile Val Ile Cys Met Ala Thr Trp Gln Phe Ile Phe Ile Ile Ile Ile Val Ile Cys Met Ala Thr Trp Gln Phe Ile Phe Ile Ile
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Leu Pro Leu Ser Val Leu Tyr Ile Tyr Tyr Gln Gln Tyr Tyr Leu Leu Pro Leu Ser Val Leu Tyr Ile Tyr Tyr Gln Gln Tyr Tyr Leu
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Arg Thr Ser Arg Glu Leu Arg Arg Leu Asp Ser Val Thr Arg Ser Arg Thr Ser Arg Glu Leu Arg Arg Leu Asp Ser Val Thr Arg Ser
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Pro Ile Tyr Ala His Phe Gln Glu Thr Leu Gly Gly Leu Thr Thr Pro Ile Tyr Ala His Phe Gln Glu Thr Leu Gly Gly Leu Thr Thr
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Ile Arg Gly Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Phe Val His Ile Asn Gln Ile Arg Gly Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Phe Val His Ile Asn Gln
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Thr Arg Val Asp Asn Asn Met Ser Ala Phe Tyr Pro Ser Val Asn Thr Arg Val Asp Asn Asn Met Ser Ala Phe Tyr Pro Ser Val Asn
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Ala Asn Arg Trp Leu Ala Phe Arg Leu Glu Phe Ile Gly Ser Ile Ala Asn Arg Trp Leu Ala Phe Arg Leu Glu Phe Ile Gly Ser Ile
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Ile Ile Leu Gly Ser Ser Met Leu Ala Val Ile Arg Leu Gly Asn Ile Ile Leu Gly Ser Ser Met Leu Ala Val Ile Arg Leu Gly Asn
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Gly Thr Leu Thr Ala Gly Met Ile Gly Leu Ser Leu Ser Phe Ala Gly Thr Leu Thr Ala Gly Met Ile Gly Leu Ser Leu Ser Phe Ala
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Leu Gln Ile Thr Gln Ser Leu Asn Trp Ile Val Arg Met Thr Val Leu Gln Ile Thr Gln Ser Leu Asn Trp Ile Val Arg Met Thr Val
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Glu Val Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Lys Glu Tyr Glu Val Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Lys Glu Tyr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ala Glu Leu Lys Ser Glu Ala Pro Tyr Ile Ile Glu Asp His Arg Ala Glu Leu Lys Ser Glu Ala Pro Tyr Ile Ile Glu Asp His Arg
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Pro Pro Ala Ser Trp Pro Glu Lys Gly Asp Val Lys Phe Val Asn Pro Pro Ala Ser Trp Pro Glu Lys Gly Asp Val Lys Phe Val Asn
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Tyr Ser Thr Arg Tyr Arg Pro Glu Leu Glu Leu Ile Leu Lys Asp Tyr Ser Thr Arg Tyr Arg Pro Glu Leu Glu Leu Ile Leu Lys Asp
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Ile Asn Leu His Ile Leu Pro Lys Glu Lys Ile Gly Ile Val Gly Ile Asn Leu His Ile Leu Pro Lys Glu Lys Ile Gly Ile Val Gly
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Thr Leu Ala Leu Phe Arg Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Thr Leu Ala Leu Phe Arg
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Ile Ile Glu Ala Ala Ser Gly His Ile Ile Ile Asp Gly Ile Pro Ile Ile Glu Ala Ala Ser Gly His Ile Ile Ile Asp Gly Ile Pro
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Ile Asp Ser Ile Gly Leu Ala Asp Leu Arg His Arg Leu Ser Ile Ile Asp Ser Ile Gly Leu Ala Asp Leu Arg His Arg Leu Ser Ile
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Ile Pro Gln Asp Ser Gln Ile Phe Glu Gly Thr Ile Arg Glu Asn Ile Pro Gln Asp Ser Gln Ile Phe Glu Gly Thr Ile Arg Glu Asn
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Ile Asp Pro Ser Lys Gln Tyr Thr Asp Glu Gln Ile Trp Asp Ala Ile Asp Pro Ser Lys Gln Tyr Thr Asp Glu Gln Ile Trp Asp Ala
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Leu Glu Leu Ser His Leu Lys Asn His Val Lys Asn Met Gly Pro Leu Glu Leu Ser His Leu Lys Asn His Val Lys Asn Met Gly Pro
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Asp Gly Leu Glu Thr Met Leu Ser Glu Gly Gly Gly Asn Leu Ser Asp Gly Leu Glu Thr Met Leu Ser Glu Gly Gly Gly Asn Leu Ser
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Val Gly Gln Arg Gln Leu Met Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Ile Val Gly Gln Arg Gln Leu Met Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Ile
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Ser Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp Ser Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Val Glu Thr Asp Gln Leu Ile Gln Lys Thr Ile Arg Glu Ala Phe Val Glu Thr Asp Gln Leu Ile Gln Lys Thr Ile Arg Glu Ala Phe
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Lys Glu Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asn Thr Ile Lys Glu Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asn Thr Ile
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Met Asp Ser Asp Arg Ile Ile Val Leu Asp Lys Gly Arg Val Thr Met Asp Ser Asp Arg Ile Ile Val Leu Asp Lys Gly Arg Val Thr
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Glu Phe Asp Thr Pro Ala Asn Leu Leu Asn Lys Lys Asp Ser Ile Glu Phe Asp Thr Pro Ala Asn Leu Leu Asn Lys Lys Asp Ser Ile
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Phe Tyr Ser Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Ala Glu Phe Tyr Ser Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Ala Glu
1505 1510 1515 1505 1510 1515
<210> 4<210> 4
<211> 1559<211> 1559
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_2 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_2 ABC-transporter
<400> 4<400> 4
Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val
20 25 30 20 25 30
Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln
35 40 45 35 40 45
Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn
50 55 60 50 55 60
Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu
85 90 95 85 90 95
Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln
115 120 125 115 120 125
Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe
130 135 140 130 135 140
Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln
165 170 175 165 170 175
Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile
180 185 190 180 185 190
Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu
195 200 205 195 200 205
Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr
210 215 220 210 215 220
Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu
245 250 255 245 250 255
Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu
260 265 270 260 265 270
Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe
275 280 285 275 280 285
Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu
290 295 300 290 295 300
Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Phe Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile
325 330 335 325 330 335
Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn
340 345 350 340 345 350
Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser
355 360 365 355 360 365
Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu
370 375 380 370 375 380
Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly
405 410 415 405 410 415
Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu
420 425 430 420 425 430
Gly Lys Ala Val Val Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro Gly Lys Ala Val Val Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro
435 440 445 435 440 445
Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln
450 455 460 450 455 460
Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn
465 470 475 480 465 470 475 480
Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala
485 490 495 485 490 495
Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys
500 505 510 500 505 510
Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro
515 520 525 515 520 525
Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp
530 535 540 530 535 540
Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn
545 550 555 560 545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile
565 570 575 565 570 575
Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser
580 585 590 580 585 590
Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp
595 600 605 595 600 605
Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp
610 615 620 610 615 620
Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Ser Ser Gln Ser Gly Asp Asn Leu Arg Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Ser Ser Gln Ser Gly Asp Asn Leu Arg
625 630 635 640 625 630 635 640
Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn
645 650 655 645 650 655
Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln
675 680 685 675 680 685
Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile
690 695 700 690 695 700
Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met
705 710 715 720 705 710 715 720
Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln
725 730 735 725 730 735
Asn Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu Asn Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu
740 745 750 740 745 750
Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile
755 760 765 755 760 765
Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val
770 775 780 770 775 780
Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val
785 790 795 800 785 790 795 800
Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys
805 810 815 805 810 815
Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val
820 825 830 820 825 830
Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu
835 840 845 835 840 845
Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn
850 855 860 850 855 860
Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp
865 870 875 880 865 870 875 880
Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu
885 890 895 885 890 895
Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp
900 905 910 900 905 910
Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg
915 920 925 915 920 925
Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln
930 935 940 930 935 940
Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Glu Ala Glu Lys Thr Glu Val Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Glu Ala Glu Lys Thr Glu Val
945 950 955 960 945 950 955 960
Gly Arg Val Lys Thr Lys Val Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly Gly Arg Val Lys Thr Lys Val Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly
965 970 975 965 970 975
Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val
980 985 990 980 985 990
Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn
995 1000 1005 995 1000 1005
Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Met Ile Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Met Ile
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Gly Ile Ser Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Gly Ile Ser
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys
1550 1555 1550 1555
<210> 5<210> 5
<211> 1638<211> 1638
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_3 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_3 ABC-transporter
<400> 5<400> 5
Met Asn Ser Tyr Asn Glu Ser Ala Pro Thr Gly Cys Ser Phe Trp Asp Met Asn Ser Tyr Asn Glu Ser Ala Pro Thr Gly Cys Ser Phe Trp Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Asp Asp Ile Ser Pro Cys Ile Arg Lys Ser Leu Leu Asp Ser Tyr Asn Asp Asp Ile Ser Pro Cys Ile Arg Lys Ser Leu Leu Asp Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Pro Ala Ala Ile Val Val Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Leu Pro Ala Ala Ile Val Val Gly Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Ala Gln Gln Ile Lys Thr His Arg Lys Leu Tyr Ala Lys Asp Glu Gly Ala Gln Gln Ile Lys Thr His Arg Lys Leu Tyr Ala Lys Asp Glu
50 55 60 50 55 60
Thr Gln Pro Leu Leu Glu Pro Ala Asn Gly Ser Pro Thr Asp Tyr Ser Thr Gln Pro Leu Leu Glu Pro Ala Asn Gly Ser Pro Thr Asp Tyr Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Thr Tyr Gly Thr Ile Asp Tyr Glu Glu Glu Gln Ser Thr Ala Glu Asn Thr Tyr Gly Thr Ile Asp Tyr Glu Glu Glu Gln Ser Thr Ala Glu
85 90 95 85 90 95
Leu Thr Thr Ser Gln Lys His Phe Asp Ile Ser Arg Leu Glu Pro Leu Leu Thr Thr Ser Gln Lys His Phe Asp Ile Ser Arg Leu Glu Pro Leu
100 105 110 100 105 110
Lys Asp Asp Gly Thr Pro Leu Gly Leu Val Lys Tyr Val Gln Arg Asp Lys Asp Asp Gly Thr Pro Leu Gly Leu Val Lys Tyr Val Gln Arg Asp
115 120 125 115 120 125
Gly Trp Glu Lys Val Lys Leu Ile Leu Glu Phe Val Ile Leu Ile Phe Gly Trp Glu Lys Val Lys Leu Ile Leu Glu Phe Val Ile Leu Ile Phe
130 135 140 130 135 140
Gln Leu Val Ile Ala Val Val Ala Leu Phe Val Pro Ser Leu Asn Gln Gln Leu Val Ile Ala Val Val Ala Leu Phe Val Pro Ser Leu Asn Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Trp Glu Gly Tyr Lys Leu Thr Pro Ile Val Arg Val Phe Val Trp Glu Trp Glu Gly Tyr Lys Leu Thr Pro Ile Val Arg Val Phe Val Trp
165 170 175 165 170 175
Ile Phe Leu Phe Ala Leu Gly Ser Ile Arg Ala Leu Asn Lys Ser Gly Ile Phe Leu Phe Ala Leu Gly Ser Ile Arg Ala Leu Asn Lys Ser Gly
180 185 190 180 185 190
Pro Phe Pro Leu Ala Asn Ile Ser Leu Leu Tyr Tyr Ile Val Asn Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Ile Ser Leu Leu Tyr Tyr Ile Val Asn Ile
195 200 205 195 200 205
Val Pro Ser Ala Leu Ser Phe Arg Ser Val Leu Ile His Pro Gln Asn Val Pro Ser Ala Leu Ser Phe Arg Ser Val Leu Ile His Pro Gln Asn
210 215 220 210 215 220
Ser Gln Leu Val Asn Tyr Tyr Tyr Ser Phe Gln Phe Ile Asn Asn Thr Ser Gln Leu Val Asn Tyr Tyr Tyr Ser Phe Gln Phe Ile Asn Asn Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gly Ser Ala Arg Val Phe Asp His Pro Ser Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gly Ser Ala Arg Val Phe Asp His Pro Ser
245 250 255 245 250 255
Val Leu Phe Asp Thr Asp Asp Gly Val Lys Pro Ser Pro Glu Asn Asn Val Leu Phe Asp Thr Asp Asp Gly Val Lys Pro Ser Pro Glu Asn Asn
260 265 270 260 265 270
Ser Asn Phe Phe Glu Ile Val Thr Tyr Ser Trp Ile Asp Pro Leu Ile Ser Asn Phe Phe Glu Ile Val Thr Tyr Ser Trp Ile Asp Pro Leu Ile
275 280 285 275 280 285
Phe Lys Ala Tyr Lys Thr Pro Leu Gln Phe Asn Asp Ile Trp Gly Leu Phe Lys Ala Tyr Lys Thr Pro Leu Gln Phe Asn Asp Ile Trp Gly Leu
290 295 300 290 295 300
Arg Ile Asp Asp Tyr Ala Tyr Phe Leu Leu Arg Arg Phe Lys Asp Leu Arg Ile Asp Asp Tyr Ala Tyr Phe Leu Leu Arg Arg Phe Lys Asp Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Gly Phe Thr Arg Thr Phe Thr Tyr Lys Ile Phe Tyr Phe Ser Lys Gly Gly Phe Thr Arg Thr Phe Thr Tyr Lys Ile Phe Tyr Phe Ser Lys Gly
325 330 335 325 330 335
Asp Leu Ala Ala Gln Ala Leu Trp Ala Ser Ile Asp Ser Met Leu Ile Asp Leu Ala Ala Gln Ala Leu Trp Ala Ser Ile Asp Ser Met Leu Ile
340 345 350 340 345 350
Phe Gly Pro Ser Leu Leu Leu Lys Arg Ile Leu Glu Tyr Val Asp Asn Phe Gly Pro Ser Leu Leu Leu Lys Arg Ile Leu Glu Tyr Val Asp Asn
355 360 365 355 360 365
Pro Gly Met Thr Ser Arg Asn Met Ala Trp Leu Tyr Val Leu Thr Met Pro Gly Met Thr Ser Arg Asn Met Ala Trp Leu Tyr Val Leu Thr Met
370 375 380 370 375 380
Phe Phe Ile Gln Ile Ser Asp Ser Leu Val Ser Gly Arg Ser Leu Tyr Phe Phe Ile Gln Ile Ser Asp Ser Leu Val Ser Gly Arg Ser Leu Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Val Cys Ile Arg Met Lys Ala Leu Ile Ile Gly Glu Leu Gly Arg Arg Val Cys Ile Arg Met Lys Ala Leu Ile Ile Gly Glu
405 410 415 405 410 415
Val Tyr Ala Lys Ala Leu Arg Arg Arg Met Thr Ser Pro Glu Glu Leu Val Tyr Ala Lys Ala Leu Arg Arg Arg Met Thr Ser Pro Glu Glu Leu
420 425 430 420 425 430
Ile Glu Glu Val Asp Pro Lys Asp Gly Lys Ala Pro Ile Ala Asp Gln Ile Glu Glu Val Asp Pro Lys Asp Gly Lys Ala Pro Ile Ala Asp Gln
435 440 445 435 440 445
Thr Ser Lys Glu Glu Ser Lys Ser Thr Glu Leu Gly Gly Ile Ile Asn Thr Ser Lys Glu Glu Ser Lys Ser Thr Glu Leu Gly Gly Ile Ile Asn
450 455 460 450 455 460
Leu Met Ala Val Asp Ala Ser Lys Val Ser Glu Leu Cys Ser Tyr Leu Leu Met Ala Val Asp Ala Ser Lys Val Ser Glu Leu Cys Ser Tyr Leu
465 470 475 480 465 470 475 480
His Phe Phe Val Asn Ser Phe Phe Met Ile Ile Val Ala Val Thr Leu His Phe Phe Val Asn Ser Phe Phe Met Ile Ile Val Ala Val Thr Leu
485 490 495 485 490 495
Leu Tyr Arg Leu Leu Gly Trp Ser Ala Leu Ala Gly Ser Ser Ser Ile Leu Tyr Arg Leu Leu Gly Trp Ser Ala Leu Ala Gly Ser Ser Ser Ile
500 505 510 500 505 510
Leu Ile Leu Leu Pro Leu Asn Tyr Lys Leu Ala Ser Lys Ile Gly Glu Leu Ile Leu Leu Pro Leu Asn Tyr Lys Leu Ala Ser Lys Ile Gly Glu
515 520 525 515 520 525
Phe Gln Lys Glu Met Leu Gly Ile Thr Asp Asn Arg Ile Gln Lys Leu Phe Gln Lys Glu Met Leu Gly Ile Thr Asp Asn Arg Ile Gln Lys Leu
530 535 540 530 535 540
Asn Glu Ala Phe Gln Ser Ile Arg Ile Ile Lys Phe Phe Ala Trp Glu Asn Glu Ala Phe Gln Ser Ile Arg Ile Ile Lys Phe Phe Ala Trp Glu
545 550 555 560 545 550 555 560
Glu Asn Phe Ala Lys Glu Ile Met Lys Val Arg Asn Glu Glu Ile Arg Glu Asn Phe Ala Lys Glu Ile Met Lys Val Arg Asn Glu Glu Ile Arg
565 570 575 565 570 575
Tyr Leu Arg Tyr Arg Val Ile Val Trp Thr Cys Ser Ala Phe Val Trp Tyr Leu Arg Tyr Arg Val Ile Val Trp Thr Cys Ser Ala Phe Val Trp
580 585 590 580 585 590
Phe Ile Thr Pro Thr Leu Val Thr Leu Ile Ser Phe Tyr Phe Tyr Val Phe Ile Thr Pro Thr Leu Val Thr Leu Ile Ser Phe Tyr Phe Tyr Val
595 600 605 595 600 605
Val Phe Gln Gly Lys Ile Leu Thr Thr Pro Val Ala Phe Thr Ala Leu Val Phe Gln Gly Lys Ile Leu Thr Pro Val Ala Phe Thr Ala Leu
610 615 620 610 615 620
Ser Leu Phe Asn Leu Leu Arg Ser Pro Leu Asp Gln Leu Ser Asp Met Ser Leu Phe Asn Leu Leu Arg Ser Pro Leu Asp Gln Leu Ser Asp Met
625 630 635 640 625 630 635 640
Leu Ser Phe Met Val Gln Ser Lys Val Ser Leu Asp Arg Val Gln Lys Leu Ser Phe Met Val Gln Ser Lys Val Ser Leu Asp Arg Val Gln Lys
645 650 655 645 650 655
Phe Leu Glu Glu Gln Glu Ser Asp Lys Tyr Glu Gln Leu Thr His Thr Phe Leu Glu Glu Gln Glu Ser Asp Lys Tyr Glu Gln Leu Thr His Thr
660 665 670 660 665 670
Arg Gly Ala Asn Ser Pro Glu Val Gly Phe Glu Asn Ala Thr Leu Ser Arg Gly Ala Asn Ser Pro Glu Val Gly Phe Glu Asn Ala Thr Leu Ser
675 680 685 675 680 685
Trp Asn Lys Gly Ser Lys Asn Asp Phe Gln Leu Lys Asp Ile Asp Ile Trp Asn Lys Gly Ser Lys Asn Asp Phe Gln Leu Lys Asp Ile Asp Ile
690 695 700 690 695 700
Ala Phe Lys Val Gly Lys Leu Asn Val Ile Ile Gly Pro Thr Gly Ser Ala Phe Lys Val Gly Lys Leu Asn Val Ile Ile Gly Pro Thr Gly Ser
705 710 715 720 705 710 715 720
Gly Lys Thr Ser Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Glu Met Gln Leu Thr Gly Lys Thr Ser Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Glu Met Gln Leu Thr
725 730 735 725 730 735
Asn Gly Lys Ile Phe Leu Pro Gly Ser Thr Pro Arg Asp Glu Leu Ile Asn Gly Lys Ile Phe Leu Pro Gly Ser Thr Pro Arg Asp Glu Leu Ile
740 745 750 740 745 750
Pro Asn Pro Glu Thr Gly Met Thr Glu Ala Val Ala Tyr Cys Ser Gln Pro Asn Pro Glu Thr Gly Met Thr Glu Ala Val Ala Tyr Cys Ser Gln
755 760 765 755 760 765
Ile Ala Trp Leu Leu Asn Asp Thr Val Lys Asn Asn Ile Val Phe Ala Ile Ala Trp Leu Leu Asn Asp Thr Val Lys Asn Asn Ile Val Phe Ala
770 775 780 770 775 780
Ala Pro Phe Asn Gln Gln Arg Tyr Asp Ala Val Ile Asp Ala Cys Gly Ala Pro Phe Asn Gln Gln Arg Tyr Asp Ala Val Ile Asp Ala Cys Gly
785 790 795 800 785 790 795 800
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Val Leu Asp Ala Gly Asp Ala Thr Glu Ile Leu Thr Arg Asp Leu Lys Val Leu Asp Ala Gly Asp Ala Thr Glu Ile
805 810 815 805 810 815
Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser
820 825 830 820 825 830
Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Ser Asn Ala Arg His Val Leu Leu Asp Asp Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Ser Asn Ala Arg His Val Leu Leu Asp Asp
835 840 845 835 840 845
Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Ala Trp Ile Tyr Glu Asn Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Ala Trp Ile Tyr Glu Asn
850 855 860 850 855 860
Cys Ile Thr Gly Pro Leu Met Lys Asp Arg Thr Cys Ile Leu Val Ser Cys Ile Thr Gly Pro Leu Met Lys Asp Arg Thr Cys Ile Leu Val Ser
865 870 875 880 865 870 875 880
His Asn Val Ala Leu Thr Val Arg Asp Ala Ala Trp Ile Val Ala Met His Asn Val Ala Leu Thr Val Arg Asp Ala Ala Trp Ile Val Ala Met
885 890 895 885 890 895
Asp Asn Gly Arg Val Leu Glu Gln Gly Thr Cys Glu Asp Leu Leu Ser Asp Asn Gly Arg Val Leu Glu Gln Gly Thr Cys Glu Asp Leu Leu Ser
900 905 910 900 905 910
Ser Gly Ser Leu Gly His Asp Asp Leu Val Ser Thr Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Leu Gly His Asp Asp Leu Val Ser Thr Val Ile Ser Ser
915 920 925 915 920 925
Arg Ser Gln Ser Ser Val Asn Leu Lys Gln Leu Asn Val Ser Asp Thr Arg Ser Gln Ser Ser Val Asn Leu Lys Gln Leu Asn Val Ser Asp Thr
930 935 940 930 935 940
Ser Glu Ile His Gln Lys Leu Lys Lys Ile Ala Glu Ser Asp Lys Ala Ser Glu Ile His Gln Lys Leu Lys Lys Ile Ala Glu Ser Asp Lys Ala
945 950 955 960 945 950 955 960
Asp Gln Leu Asp Glu Glu Arg Leu Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ile Glu Asp Gln Leu Asp Glu Glu Arg Leu Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ile Glu
965 970 975 965 970 975
Asp Glu Thr Lys Ser Ser Gly Ala Val Ser Trp Glu Val Tyr Lys Phe Asp Glu Thr Lys Ser Ser Gly Ala Val Ser Trp Glu Val Tyr Lys Phe
980 985 990 980 985 990
Tyr Gly Arg Ala Phe Gly Gly Val Phe Ile Trp Phe Val Phe Val Ala Tyr Gly Arg Ala Phe Gly Gly Val Phe Ile Trp Phe Val Phe Val Ala
995 1000 1005 995 1000 1005
Ala Phe Ala Ala Ser Gln Gly Ser Asn Ile Met Gln Ser Val Trp Ala Phe Ala Ala Ser Gln Gly Ser Asn Ile Met Gln Ser Val Trp
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Leu Lys Ile Trp Ala Ala Ala Asn Asp Lys Leu Val Ser Pro Ala Leu Lys Ile Trp Ala Ala Ala Asn Asp Lys Leu Val Ser Pro Ala
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Phe Thr Met Ser Ile Asp Arg Ser Leu Asn Ala Leu Lys Glu Gly Phe Thr Met Ser Ile Asp Arg Ser Leu Asn Ala Leu Lys Glu Gly
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Arg Ala Ser Val Ala Ser Val Glu Trp Ser Arg Pro Leu Gly Phe Arg Ala Ser Val Ala Ser Val Glu Trp Ser Arg Pro Leu Gly
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Gly Glu Met Phe Arg Val Tyr Gly Glu Glu Ser Ser His Ser Ser Gly Glu Met Phe Arg Val Tyr Gly Glu Glu Ser Ser His Ser Ser
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Gly Tyr Tyr Ile Thr Ile Tyr Ala Leu Ile Gly Leu Ser Tyr Ala Gly Tyr Tyr Ile Thr Ile Tyr Ala Leu Ile Gly Leu Ser Tyr Ala
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Leu Ile Ser Ala Phe Arg Val Tyr Val Val Phe Met Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ala Phe Arg Val Tyr Val Val Phe Met Gly Gly Ile
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Val Ala Ser Asn Lys Ile Phe Glu Asp Met Leu Thr Lys Ile Phe Val Ala Ser Asn Lys Ile Phe Glu Asp Met Leu Thr Lys Ile Phe
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Asn Ala Lys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Thr Pro Ile Gly Arg Ile Asn Ala Lys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Thr Pro Ile Gly Arg Ile
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Met Asn Arg Phe Ser Lys Asp Thr Glu Ser Ile Asp Gln Glu Leu Met Asn Arg Phe Ser Lys Asp Thr Glu Ser Ile Asp Gln Glu Leu
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Ala Pro Tyr Ala Glu Gly Phe Ile Val Ser Val Leu Gln Cys Gly Ala Pro Tyr Ala Glu Gly Phe Ile Val Ser Val Leu Gln Cys Gly
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Ala Thr Ile Leu Leu Ile Cys Ile Ile Thr Pro Gly Phe Ile Val Ala Thr Ile Leu Leu Ile Cys Ile Ile Thr Pro Gly Phe Ile Val
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Phe Ala Ala Phe Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Tyr Ile Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Ile Val Ile Ile Tyr Tyr Tyr Ile Gly Ala Leu
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Glu Leu Lys Arg Tyr Asp Ser Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Glu Leu Lys Arg Tyr Asp Ser Ile Thr
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Val Ser Pro Ile His Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Val Val Ser Pro Ile His Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Val
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Thr Thr Ile Arg Ala Tyr Gly Asp Glu Arg Arg Phe Met Arg Gln Thr Thr Ile Arg Ala Tyr Gly Asp Glu Arg Arg Phe Met Arg Gln
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Asn Leu Glu Lys Ile Asp Asn Asn Asn Arg Ser Phe Phe Tyr Leu Asn Leu Glu Lys Ile Asp Asn Asn Asn Arg Ser Phe Phe Tyr Leu
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Trp Val Ala Asn Arg Trp Leu Ala Leu Arg Val Asp Phe Val Gly Trp Val Ala Asn Arg Trp Leu Ala Leu Arg Val Asp Phe Val Gly
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Ala Leu Val Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Val Met Leu Ser Ile Ala Leu Val Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Val Met Leu Ser Ile
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Gly His Ile Asp Ala Gly Met Ala Gly Leu Ser Leu Ser Tyr Ala Gly His Ile Asp Ala Gly Met Ala Gly Leu Ser Leu Ser Tyr Ala
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Ile Ala Phe Thr Gln Ser Ala Leu Trp Val Val Arg Leu Tyr Ser Ile Ala Phe Thr Gln Ser Ala Leu Trp Val Val Arg Leu Tyr Ser
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Val Val Glu Met Asn Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Glu Glu Tyr Val Val Glu Met Asn Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Glu Glu Tyr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Leu Asn Ile Asp Gln Glu Pro Asp Arg Glu Ile Pro Asp Asn Lys Leu Asn Ile Asp Gln Glu Pro Asp Arg Glu Ile Pro Asp Asn Lys
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Pro Pro Ser Ser Trp Pro Glu Thr Gly Glu Ile Glu Val Asp Asp Pro Pro Ser Ser Trp Pro Glu Thr Gly Glu Ile Glu Val Asp Asp
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Val Ser Leu Arg Tyr Ala Pro Ser Leu Pro Lys Val Ile Lys Asn Val Ser Leu Arg Tyr Ala Pro Ser Leu Pro Lys Val Ile Lys Asn
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Val Ser Phe Lys Val Glu Pro Arg Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Val Ser Phe Lys Val Glu Pro Arg Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ala Phe Phe Arg Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ala Phe Phe Arg
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Phe Val Asp Pro Glu Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asp Gly Ile Asp Phe Val Asp Pro Glu Ser Gly Ser Ile Lys Ile Asp Gly Ile Asp
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Ile Thr Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Arg Asn Ala Val Thr Ile Ile Thr Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Arg Asn Ala Val Thr Ile
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Ile Pro Gln Asp Pro Thr Leu Phe Thr Gly Thr Ile Arg Ser Asn Ile Pro Gln Asp Pro Thr Leu Phe Thr Gly Thr Ile Arg Ser Asn
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Leu Asp Pro Phe Asn Gln Tyr Ser Asp Ala Glu Ile Phe Glu Ser Leu Asp Pro Phe Asn Gln Tyr Ser Asp Ala Glu Ile Phe Glu Ser
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Leu Lys Arg Val Asn Leu Val Ser Thr Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Lys Arg Val Asn Leu Val Ser Thr Asp Glu Pro Thr Ser Gly
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Ser Ser Ser Asp Asn Ile Glu Asp Ser Asn Glu Asn Val Asn Lys Ser Ser Ser Asp Asn Ile Glu Asp Ser Asn Glu Asn Val Asn Lys
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Phe Leu Asn Leu Asn Asn Thr Val Ser Glu Gly Gly Ser Asn Leu Phe Leu Asn Leu Asn Asn Thr Val Ser Glu Gly Gly Ser Asn Leu
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Ser Gln Gly Gln Arg Gln Leu Thr Cys Leu Ala Arg Ser Leu Leu Ser Gln Gly Gln Arg Gln Leu Thr Cys Leu Ala Arg Ser Leu Leu
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Lys Ser Pro Lys Ile Ile Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Ile Lys Ser Pro Lys Ile Ile Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Ile
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Asp Tyr Asn Thr Asp Ser Lys Ile Gln Thr Thr Ile Arg Glu Glu Asp Tyr Asn Thr Asp Ser Lys Ile Gln Thr Thr Ile Arg Glu Glu
1550 1555 1560 1550 1555 1560
Phe Ser Asp Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Arg Ser Phe Ser Asp Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Arg Ser
1565 1570 1575 1565 1570 1575
Ile Ile Asp Tyr Asp Lys Ile Leu Val Met Asp Ala Gly Arg Val Ile Ile Asp Tyr Asp Lys Ile Leu Val Met Asp Ala Gly Arg Val
1580 1585 1590 1580 1585 1590
Val Glu Tyr Asp Asp Pro Tyr Lys Leu Ile Ser Asp Gln Asn Ser Val Glu Tyr Asp Asp Pro Tyr Lys Leu Ile Ser Asp Gln Asn Ser
1595 1600 1605 1595 1600 1605
Leu Phe Tyr Ser Met Cys Ser Asn Ser Gly Glu Leu Asp Thr Leu Leu Phe Tyr Ser Met Cys Ser Asn Ser Gly Glu Leu Asp Thr Leu
1610 1615 1620 1610 1615 1620
Val Lys Leu Ala Lys Glu Ala Phe Ile Ala Lys Arg Asn Lys Lys Val Lys Leu Ala Lys Glu Ala Phe Ile Ala Lys Arg Asn Lys Lys
1625 1630 1635 1625 1630 1635
<210> 6<210> 6
<211> 1559<211> 1559
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_4 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_4 ABC-transporter
<400> 6<400> 6
Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro Met Ser Ser Leu Glu Val Val Asp Gly Cys Pro Tyr Gly Tyr Arg Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val Tyr Pro Asp Ser Gly Thr Asn Ala Leu Asn Pro Cys Phe Ile Ser Val
20 25 30 20 25 30
Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln Ile Ser Ala Trp Gln Ala Val Phe Phe Leu Leu Ile Gly Ser Tyr Gln
35 40 45 35 40 45
Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn Leu Trp Lys Leu Tyr Lys Asn Asn Lys Val Pro Pro Arg Phe Lys Asn
50 55 60 50 55 60
Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Ile Asn Ser Arg His Leu Thr His Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu Thr Asn Val Cys Phe Gln Ser Thr Leu Ile Ile Cys Glu Leu Ala Leu
85 90 95 85 90 95
Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala Val Ser Gln Ser Ser Asp Arg Val Tyr Pro Phe Ile Leu Lys Lys Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln Leu Tyr Leu Asn Leu Leu Phe Asn Leu Gly Ile Ser Leu Pro Thr Gln
115 120 125 115 120 125
Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe Tyr Leu Ala Tyr Phe Lys Ser Thr Phe Ser Met Gly Asn Gln Leu Phe
130 135 140 130 135 140
Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg Tyr Tyr Met Phe Gln Ile Leu Leu Gln Leu Phe Leu Ile Leu Gln Arg
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln Tyr Tyr His Gly Ser Ser Asn Glu Arg Leu Thr Val Ile Ser Gly Gln
165 170 175 165 170 175
Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile Thr Ala Met Ile Leu Glu Val Leu Leu Leu Phe Asn Ser Val Ala Ile
180 185 190 180 185 190
Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu Phe Ile Tyr Asp Leu Cys Ile Phe Glu Pro Ile Asn Glu Leu Ser Glu
195 200 205 195 200 205
Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr Tyr Tyr Lys Lys Asn Gly Trp Tyr Pro Pro Val His Val Leu Ser Tyr
210 215 220 210 215 220
Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn Ile Thr Phe Ile Trp Met Asn Lys Leu Ile Val Glu Thr Tyr Arg Asn
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asn Gln Leu Pro Leu Pro Pro Val Asp Leu
245 250 255 245 250 255
Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu Asn Ile Lys Ser Ile Ser Lys Glu Phe Lys Ala Asn Trp Glu Leu Glu
260 265 270 260 265 270
Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe Lys Trp Leu Asn Arg Asn Ser Leu Trp Arg Ala Ile Trp Lys Ser Phe
275 280 285 275 280 285
Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Val Ala Met Leu Tyr Glu Thr Thr Ser Asp Leu
290 295 300 290 295 300
Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Phe Leu Ser Val Val Gln Pro Gln Phe Leu Arg Ile Phe Ile Asp Gly Phe
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile Asn Pro Glu Thr Ser Ser Lys Tyr Pro Pro Leu Asn Gly Val Phe Ile
325 330 335 325 330 335
Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn Ala Leu Thr Leu Phe Val Ile Ser Val Val Ser Val Phe Leu Thr Asn
340 345 350 340 345 350
Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser Gln Phe Tyr Ile Gly Ile Phe Glu Ala Gly Leu Gly Ile Arg Gly Ser
355 360 365 355 360 365
Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Val Tyr Gln Lys Ser Leu Arg Leu Thr Leu Ala Glu
370 375 380 370 375 380
Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp Arg Asn Glu Lys Ser Thr Gly Asp Ile Leu Asn Leu Met Ser Val Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly Val Leu Arg Ile Gln Arg Phe Phe Glu Asn Ala Gln Thr Ile Ile Gly
405 410 415 405 410 415
Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu Ala Pro Ile Gln Ile Ile Val Val Leu Thr Ser Leu Tyr Trp Leu Leu
420 425 430 420 425 430
Gly Lys Ala Val Ile Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro Gly Lys Ala Val Ile Gly Gly Leu Val Thr Met Ala Ile Met Met Pro
435 440 445 435 440 445
Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln Ile Asn Ala Phe Leu Ser Arg Lys Val Lys Lys Leu Ser Lys Thr Gln
450 455 460 450 455 460
Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn Met Lys Tyr Lys Asp Met Arg Ile Lys Thr Ile Thr Glu Leu Leu Asn
465 470 475 480 465 470 475 480
Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala Ala Ile Lys Ser Ile Lys Leu Tyr Ala Trp Glu Glu Pro Met Met Ala
485 490 495 485 490 495
Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys Arg Leu Asn His Val Arg Asn Asp Met Glu Leu Lys Asn Phe Arg Lys
500 505 510 500 505 510
Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro Ile Gly Ile Val Ser Asn Leu Ile Tyr Phe Ala Trp Asn Cys Val Pro
515 520 525 515 520 525
Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp Leu Met Val Thr Cys Ser Thr Phe Gly Leu Phe Ser Leu Phe Ser Asp
530 535 540 530 535 540
Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn Ser Pro Leu Ser Pro Ala Ile Val Phe Pro Ser Leu Ser Leu Phe Asn
545 550 555 560 545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile Ile Leu Asn Ser Ala Ile Tyr Ser Val Pro Ser Met Ile Asn Thr Ile
565 570 575 565 570 575
Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser Ile Glu Thr Ser Val Ser Met Glu Arg Leu Lys Ser Phe Leu Leu Ser
580 585 590 580 585 590
Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp Asp Glu Ile Asp Asp Ser Phe Ile Glu Arg Ile Asp Pro Ser Ala Asp
595 600 605 595 600 605
Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp Glu Arg Ala Leu Pro Ala Ile Glu Met Asn Asn Ile Thr Phe Leu Trp
610 615 620 610 615 620
Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Ser Ser Gln Ser Arg Asp Asn Leu Arg Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Ser Ser Gln Ser Arg Asp Asn Leu Arg
625 630 635 640 625 630 635 640
Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn Thr Asp Glu Glu Ser Ile Ile Gly Ser Ser Gln Ile Ala Leu Lys Asn
645 650 655 645 650 655
Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly Ile Asp His Phe Glu Ala Lys Arg Gly Asp Leu Val Cys Val Val Gly
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln Arg Val Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu Lys Ala Ile Leu Gly Gln
675 680 685 675 680 685
Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile Leu Pro Cys Met Ser Gly Ser Arg Asp Ser Ile Pro Pro Lys Leu Ile
690 695 700 690 695 700
Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met Ile Arg Ser Ser Ser Val Ala Tyr Cys Ser Gln Glu Ser Trp Ile Met
705 710 715 720 705 710 715 720
Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln Asn Ala Ser Val Arg Glu Asn Ile Leu Phe Gly His Lys Phe Asp Gln
725 730 735 725 730 735
Asn Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu Asn Tyr Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Ala Cys Gln Leu Leu Pro Asp Leu
740 745 750 740 745 750
Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile Lys Ile Leu Pro Asp Gly Asp Glu Thr Leu Val Gly Glu Lys Gly Ile
755 760 765 755 760 765
Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Leu Ser Leu Ala Arg Ala Val
770 775 780 770 775 780
Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val Tyr Ser Arg Ala Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Ile Leu Ser Ala Val
785 790 795 800 785 790 795 800
Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys Asp Ala Glu Val Ser Lys Asn Ile Ile Glu Tyr Val Leu Ile Gly Lys
805 810 815 805 810 815
Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Thr Ile Ile Leu Thr Thr Asn Thr Val
820 825 830 820 825 830
Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu Ser Ile Leu Lys His Ser Gln Met Ile Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Glu
835 840 845 835 840 845
Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn Ile Val Glu Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Val Met Asn Arg Lys Asn Asn
850 855 860 850 855 860
Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp Thr Ser Lys Leu Lys Lys Leu Leu Glu Glu Phe Asp Ser Pro Ile Asp
865 870 875 880 865 870 875 880
Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu Asn Gly Asn Glu Ser Asp Val Gln Thr Glu His Arg Ser Glu Ser Glu
885 890 895 885 890 895
Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp Val Asp Glu Pro Leu Gln Leu Lys Val Thr Glu Ser Glu Thr Glu Asp
900 905 910 900 905 910
Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg Glu Val Val Thr Glu Ser Glu Leu Glu Leu Ile Lys Ala Asn Ser Arg
915 920 925 915 920 925
Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln Arg Ala Ser Leu Ala Thr Leu Arg Pro Arg Pro Phe Val Gly Ala Gln
930 935 940 930 935 940
Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Glu Ala Glu Lys Thr Glu Val Leu Asp Ser Val Lys Lys Thr Ala Gln Glu Ala Glu Lys Thr Glu Val
945 950 955 960 945 950 955 960
Gly Arg Val Lys Thr Lys Val Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly Gly Arg Val Lys Thr Lys Val Tyr Leu Ala Tyr Ile Lys Ala Cys Gly
965 970 975 965 970 975
Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val Val Leu Gly Val Val Leu Phe Phe Leu Phe Met Ile Leu Thr Arg Val
980 985 990 980 985 990
Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asn Phe Trp Leu Lys Tyr Trp Ser Glu Ser Asn
995 1000 1005 995 1000 1005
Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val Glu Lys Asn Gly Ser Asn Glu Arg Val Trp Met Phe Val Gly Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Gly Val Ala Ser Ala Ala Phe Asn Asn Leu Arg
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys Ser Ile Met Met Leu Leu Tyr Cys Ser Ile Arg Gly Ser Lys Lys
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr Leu His Glu Ser Met Ala Lys Ser Val Ile Arg Ser Pro Met Thr
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser Phe Phe Glu Thr Thr Pro Val Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ser
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Met Asp Ala Val Asp Ser Asn Leu Gln Tyr Ile Phe Ser
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu Phe Phe Phe Lys Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Val Thr Val Ile Leu
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu Val Gly Tyr Asn Met Pro Trp Phe Leu Val Phe Asn Met Phe Leu
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser Val Val Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gln Thr Phe Tyr Ile Val Leu Ser
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met Arg Glu Leu Lys Arg Leu Ile Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ile Met
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala Ser Leu Met Ser Glu Ser Leu Asn Gly Tyr Ser Ile Ile Asp Ala
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile Tyr Asp His Phe Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Asn Tyr Glu Lys Ile
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg Gln Tyr Asn Val Asp Phe Val Phe Asn Phe Arg Ser Thr Asn Arg
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu Trp Leu Ser Val Arg Leu Gln Thr Ile Gly Ala Thr Ile Val Leu
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Ala Thr Met Asn Thr Lys Arg Gln
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu Leu Ser Ser Gly Met Val Gly Leu Leu Met Ser Tyr Ser Leu Glu
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Met Ile Val Thr Gly Ser Leu Thr Trp Ile Val Arg Thr Thr Val Met Ile
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu Glu Thr Asn Ile Val Ser Val Glu Arg Ile Val Glu Tyr Cys Glu
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Ile Asn Pro Glu Lys Arg Pro Asp
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser Glu Asn Trp Pro Ser Lys Gly Gly Ile Glu Phe Lys Asn Tyr Ser
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn Thr Lys Tyr Arg Glu Asn Leu Asp Pro Val Leu Asn Asn Ile Asn
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Val Lys Ile Glu Pro Cys Glu Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu Gly Ala Gly Lys Ser Thr Leu Ser Leu Ala Leu Phe Arg Ile Leu
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Asp Ile Ser Glu Pro Thr Glu Gly Lys Ile Ile Ile Asp Gly Ile Asp Ile Ser
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ile Gly Leu Phe Asp Leu Arg Ser His Leu Ala Ile Ile Pro
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp Gln Asp Ala Gln Ala Phe Glu Gly Thr Val Lys Thr Asn Leu Asp
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu Pro Phe Asn Arg Tyr Ser Glu Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Glu
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys Gln Ala His Leu Lys Pro His Leu Glu Lys Met Leu His Ser Lys
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp Pro Arg Gly Asp Asp Ser Asn Glu Glu Asp Gly Asn Val Asn Asp
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val Ile Leu Asp Val Lys Ile Asn Glu Asn Gly Ser Asn Leu Ser Val
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Ala Arg Ala Leu Leu Asn Arg
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Met
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys Glu Thr Asp Lys Ile Ile Gln Asp Thr Ile Arg Arg Glu Phe Lys
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu Asp Arg Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Ile Asp Thr Val Leu
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu Asp Ser Asp Lys Ile Ile Val Leu Asp Gln Gly Ser Val Arg Glu
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe Phe Asp Ser Pro Ser Lys Leu Leu Ser Asp Lys Thr Ser Ile Phe
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys Tyr Ser Leu Cys Glu Lys Gly Gly Tyr Leu Lys
1550 1555 1550 1555
<210> 7<210> 7
<211> 1381<211> 1381
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_5 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_5 ABC-transporter
<400> 7<400> 7
Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe
20 25 30 20 25 30
Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp
50 55 60 50 55 60
Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala
100 105 110 100 105 110
Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn
115 120 125 115 120 125
Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe
130 135 140 130 135 140
Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val
165 170 175 165 170 175
Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly
180 185 190 180 185 190
Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile
195 200 205 195 200 205
Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala
210 215 220 210 215 220
Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr
245 250 255 245 250 255
Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile
260 265 270 260 265 270
Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn
275 280 285 275 280 285
Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile
290 295 300 290 295 300
Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu
325 330 335 325 330 335
Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro
370 375 380 370 375 380
Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val
405 410 415 405 410 415
Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp
450 455 460 450 455 460
Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe
465 470 475 480 465 470 475 480
Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu
485 490 495 485 490 495
Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser
500 505 510 500 505 510
Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys
515 520 525 515 520 525
Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly
530 535 540 530 535 540
Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu
545 550 555 560 545 550 555 560
Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly
565 570 575 565 570 575
Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys
580 585 590 580 585 590
Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg
595 600 605 595 600 605
Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met
610 615 620 610 615 620
Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala
645 650 655 645 650 655
Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Val Leu Ser Ala Val Asp Ala Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Val Leu Ser Ala Val Asp Ala
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly
675 680 685 675 680 685
Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala
690 695 700 690 695 700
Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met
725 730 735 725 730 735
Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala
740 745 750 740 745 750
Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln
755 760 765 755 760 765
Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Arg Ala Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Glu Arg Ala
770 775 780 770 775 780
Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly
785 790 795 800 785 790 795 800
Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu
805 810 815 805 810 815
Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe
820 825 830 820 825 830
Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly
835 840 845 835 840 845
Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu
850 855 860 850 855 860
Phe Val Val Met Gly Tyr Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn Phe Val Val Met Gly Tyr Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn
865 870 875 880 865 870 875 880
Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp
885 890 895 885 890 895
Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp
900 905 910 900 905 910
Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro
915 920 925 915 920 925
Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Tyr Ile Pro Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Tyr Ile Pro
930 935 940 930 935 940
Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Leu Phe Thr Phe Ile Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Leu Phe Thr Phe Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala
965 970 975 965 970 975
Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly
980 985 990 980 985 990
Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys
995 1000 1005 995 1000 1005
Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys
1115 1120 1125 1115 1120 1125
His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val
1370 1375 1380 1370 1375 1380
<210> 8<210> 8
<211> 1650<211> 1650
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: T4_Fungal_8 ABC-transporter<223> Synthetic: T4_Fungal_8 ABC-transporter
<400> 8<400> 8
Met Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Asn Leu Asp Ala Ile Ser Asp Ser Met Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ser Asn Leu Asp Ala Ile Ser Asp Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Cys Pro Phe Trp Arg Tyr Asp Asp Ile Thr Glu Cys Gly Arg Val Gln Cys Pro Phe Trp Arg Tyr Asp Asp Ile Thr Glu Cys Gly Arg Val Gln
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile Asn Tyr Tyr Leu Pro Ile Thr Leu Val Gly Val Ser Leu Leu Tyr Ile Asn Tyr Tyr Leu Pro Ile Thr Leu Val Gly Val Ser Leu Leu
35 40 45 35 40 45
Tyr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Gln His Tyr Tyr Arg Lys Pro Gln Glu Tyr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Gln His Tyr Tyr Arg Lys Pro Gln Glu
50 55 60 50 55 60
Ile Lys Pro Ser Val Ala Ser Glu Leu Leu Gly Ser Asn Leu Thr Asp Ile Lys Pro Ser Val Ala Ser Glu Leu Leu Gly Ser Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Pro Asn Glu Asn Lys Pro Leu Leu Ser Glu Ser Thr Gln Ala Leu Leu Pro Asn Glu Asn Lys Pro Leu Leu Ser Glu Ser Thr Gln Ala Leu
85 90 95 85 90 95
Tyr Thr Asn Pro Asp Ser Asn Lys Thr Gly Phe Ser Leu Lys Glu Glu Tyr Thr Asn Pro Asp Ser Asn Lys Thr Gly Phe Ser Leu Lys Glu Glu
100 105 110 100 105 110
His Phe Ser Ile Asn Lys Val Thr Leu Thr Glu Ile His Ser Asn Lys His Phe Ser Ile Asn Lys Val Thr Leu Thr Glu Ile His Ser Asn Lys
115 120 125 115 120 125
His Asp Ala Val Lys Ile Val Arg Arg Asn Trp Leu Glu Lys Leu Arg His Asp Ala Val Lys Ile Val Arg Arg Asn Trp Leu Glu Lys Leu Arg
130 135 140 130 135 140
Val Phe Leu Glu Trp Val Leu Cys Ala Leu Gln Leu Cys Ile Tyr Ile Val Phe Leu Glu Trp Val Leu Cys Ala Leu Gln Leu Cys Ile Tyr Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Val Trp Ser Lys Tyr Thr Asn Thr Gln Glu Asp Phe Pro Met His Ser Val Trp Ser Lys Tyr Thr Asn Thr Gln Glu Asp Phe Pro Met His
165 170 175 165 170 175
Ala Ser Ile Ser Gly Leu Met Leu Trp Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Ser Ile Ser Gly Leu Met Leu Trp Ser Leu Leu Leu Leu Val Val
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Arg Leu Ala Asn Ile Asn Gln Asn Ile Ser Trp Ile Asn Ser Ser Leu Arg Leu Ala Asn Ile Asn Gln Asn Ile Ser Trp Ile Asn Ser
195 200 205 195 200 205
Gly Pro Gly Asn Leu Trp Ala Leu Ser Phe Ala Cys Tyr Leu Ser Leu Gly Pro Gly Asn Leu Trp Ala Leu Ser Phe Ala Cys Tyr Leu Ser Leu
210 215 220 210 215 220
Phe Cys Gly Ser Val Leu Pro Leu Arg Ser Ile Tyr Ile Gly His Ile Phe Cys Gly Ser Val Leu Pro Leu Arg Ser Ile Tyr Ile Gly His Ile
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Asp Glu Ile Ala Ser Thr Phe Tyr Lys Leu Gln Phe Tyr Leu Ser Thr Asp Glu Ile Ala Ser Thr Phe Tyr Lys Leu Gln Phe Tyr Leu Ser
245 250 255 245 250 255
Leu Thr Leu Phe Leu Leu Leu Phe Thr Ser Gln Ala Gly Asn Arg Phe Leu Thr Leu Phe Leu Leu Leu Phe Thr Ser Gln Ala Gly Asn Arg Phe
260 265 270 260 265 270
Ala Ile Ile Tyr Lys Ser Thr Pro Asp Ile Thr Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ile Ile Tyr Lys Ser Thr Pro Asp Ile Thr Pro Ser Pro Glu Pro
275 280 285 275 280 285
Ile Val Ser Ile Ala Ser Tyr Ile Thr Trp Ala Trp Val Asp Lys Phe Ile Val Ser Ile Ala Ser Tyr Ile Thr Trp Ala Trp Val Asp Lys Phe
290 295 300 290 295 300
Leu Trp Lys Ala His Gln Asn Tyr Ile Glu Met Lys Asp Val Trp Gly Leu Trp Lys Ala His Gln Asn Tyr Ile Glu Met Lys Asp Val Trp Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Met Val Glu Asp Tyr Ser Ile Leu Val Ile Lys Arg Phe Asn His Leu Met Val Glu Asp Tyr Ser Ile Leu Val Ile Lys Arg Phe Asn His
325 330 335 325 330 335
Phe Val Gln Asn Lys Thr Lys Ser Arg Thr Phe Ser Phe Asn Leu Ile Phe Val Gln Asn Lys Thr Lys Ser Arg Thr Phe Ser Phe Asn Leu Ile
340 345 350 340 345 350
His Phe Phe Met Lys Phe Ile Ala Ile Gln Gly Ala Trp Ala Thr Ile His Phe Phe Met Lys Phe Ile Ala Ile Gln Gly Ala Trp Ala Thr Ile
355 360 365 355 360 365
Ser Ser Val Ile Ser Phe Val Pro Thr Met Leu Leu Arg Arg Ile Leu Ser Ser Val Ile Ser Phe Val Pro Thr Met Leu Leu Arg Arg Ile Leu
370 375 380 370 375 380
Glu Tyr Val Glu Asp Gln Ser Thr Ala Pro Leu Asn Leu Ala Trp Met Glu Tyr Val Glu Asp Gln Ser Thr Ala Pro Leu Asn Leu Ala Trp Met
385 390 395 400 385 390 395 400
Tyr Ile Phe Leu Met Phe Leu Ala Arg Ile Leu Thr Ala Ile Cys Ala Tyr Ile Phe Leu Met Phe Leu Ala Arg Ile Leu Thr Ala Ile Cys Ala
405 410 415 405 410 415
Ala Gln Ala Leu Phe Leu Gly Arg Arg Val Cys Ile Arg Met Lys Ala Ala Gln Ala Leu Phe Leu Gly Arg Arg Val Cys Ile Arg Met Lys Ala
420 425 430 420 425 430
Ile Ile Ile Ser Glu Ile Tyr Ser Lys Ala Leu Arg Arg Lys Ile Ser Ile Ile Ile Ser Glu Ile Tyr Ser Lys Ala Leu Arg Arg Lys Ile Ser
435 440 445 435 440 445
Pro Asn Ser Thr Lys Glu Pro Thr Asp Val Val Asp Pro Gln Glu Leu Pro Asn Ser Thr Lys Glu Pro Thr Asp Val Val Asp Pro Gln Glu Leu
450 455 460 450 455 460
Asn Asp Lys Gln His Val Asp Gly Asp Glu Glu Ser Ala Thr Thr Ala Asn Asp Lys Gln His Val Asp Gly Asp Glu Glu Ser Ala Thr Thr Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Asn Leu Gly Ala Ile Ile Asn Leu Met Ala Val Asp Ala Phe Lys Val Asn Leu Gly Ala Ile Ile Asn Leu Met Ala Val Asp Ala Phe Lys Val
485 490 495 485 490 495
Ser Glu Ile Cys Ala Tyr Leu His Ser Phe Ile Glu Ala Ile Ile Met Ser Glu Ile Cys Ala Tyr Leu His Ser Phe Ile Glu Ala Ile Ile Met
500 505 510 500 505 510
Thr Ile Val Ala Leu Phe Leu Leu Tyr Arg Leu Ile Gly Trp Ser Ala Thr Ile Val Ala Leu Phe Leu Leu Tyr Arg Leu Ile Gly Trp Ser Ala
515 520 525 515 520 525
Leu Val Gly Ser Ala Met Ile Ile Cys Phe Leu Pro Leu Asn Phe Lys Leu Val Gly Ser Ala Met Ile Ile Cys Phe Leu Pro Leu Asn Phe Lys
530 535 540 530 535 540
Leu Ala Ser Leu Leu Gly Thr Leu Gln Lys Lys Ser Leu Ala Ile Thr Leu Ala Ser Leu Leu Gly Thr Leu Gln Lys Lys Ser Leu Ala Ile Thr
545 550 555 560 545 550 555 560
Asp Lys Arg Ile Gln Lys Leu Asn Glu Ala Phe Gln Ala Ile Arg Ile Asp Lys Arg Ile Gln Lys Leu Asn Glu Ala Phe Gln Ala Ile Arg Ile
565 570 575 565 570 575
Ile Lys Phe Phe Ser Trp Glu Glu Asn Phe Glu Lys Asp Ile Gln Asn Ile Lys Phe Phe Ser Trp Glu Glu Asn Phe Glu Lys Asp Ile Gln Asn
580 585 590 580 585 590
Thr Arg Asp Glu Glu Leu Asn Met Leu Leu Lys Arg Ser Ile Val Trp Thr Arg Asp Glu Glu Leu Asn Met Leu Leu Lys Arg Ser Ile Val Trp
595 600 605 595 600 605
Ala Leu Ser Ser Leu Val Trp Phe Ile Thr Pro Ser Ile Val Thr Ser Ala Leu Ser Ser Leu Val Trp Phe Ile Thr Pro Ser Ile Val Thr Ser
610 615 620 610 615 620
Ala Ser Phe Ala Val Tyr Ile Tyr Val Gln Gly Gln Thr Leu Thr Thr Ala Ser Phe Ala Val Tyr Ile Tyr Val Gln Gly Gln Thr Leu Thr Thr
625 630 635 640 625 630 635 640
Pro Val Ala Phe Thr Ala Leu Ser Leu Phe Ala Leu Leu Arg Asn Pro Pro Val Ala Phe Thr Ala Leu Ser Leu Phe Ala Leu Leu Arg Asn Pro
645 650 655 645 650 655
Leu Asp Met Leu Ser Asp Met Leu Ser Phe Val Ile Gln Ser Lys Val Leu Asp Met Leu Ser Asp Met Leu Ser Phe Val Ile Gln Ser Lys Val
660 665 670 660 665 670
Ser Leu Asp Arg Val Gln Glu Phe Leu Asn Glu Glu Glu Thr Lys Lys Ser Leu Asp Arg Val Gln Glu Phe Leu Asn Glu Glu Glu Glu Thr Lys Lys
675 680 685 675 680 685
Tyr Glu Gln Leu Thr Val Ser Arg Asn Lys Leu Gly Leu Gln Asn Ala Tyr Glu Gln Leu Thr Val Ser Arg Asn Lys Leu Gly Leu Gln Asn Ala
690 695 700 690 695 700
Thr Phe Thr Trp Asp Lys Asn Asn Gln Asp Phe Lys Leu Lys Asn Leu Thr Phe Thr Trp Asp Lys Asn Asn Gln Asp Phe Lys Leu Lys Asn Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Ile Asp Phe Lys Ile Gly Lys Leu Asn Val Ile Val Gly Pro Thr Thr Ile Asp Phe Lys Ile Gly Lys Leu Asn Val Ile Val Gly Pro Thr
725 730 735 725 730 735
Gly Ser Gly Lys Thr Ser Leu Leu Met Gly Leu Leu Gly Glu Met Glu Gly Ser Gly Lys Thr Ser Leu Leu Met Gly Leu Leu Gly Glu Met Glu
740 745 750 740 745 750
Leu Leu Asn Gly Lys Val Phe Val Pro Ser Leu Asn Pro Arg Glu Glu Leu Leu Asn Gly Lys Val Phe Val Pro Ser Leu Asn Pro Arg Glu Glu
755 760 765 755 760 765
Leu Val Val Glu Ala Asp Gly Met Thr Asn Ser Ile Ala Tyr Cys Ser Leu Val Val Glu Ala Asp Gly Met Thr Asn Ser Ile Ala Tyr Cys Ser
770 775 780 770 775 780
Gln Ala Ala Trp Leu Leu Asn Asp Thr Val Arg Asn Asn Ile Leu Phe Gln Ala Ala Trp Leu Leu Asn Asp Thr Val Arg Asn Asn Ile Leu Phe
785 790 795 800 785 790 795 800
Asn Ala Pro Tyr Asn Glu Asn Arg Tyr Asn Ala Val Ile Ser Ala Cys Asn Ala Pro Tyr Asn Glu Asn Arg Tyr Asn Ala Val Ile Ser Ala Cys
805 810 815 805 810 815
Gly Leu Lys Arg Asp Phe Glu Ile Leu Ser Ala Gly Asp Gln Thr Glu Gly Leu Lys Arg Asp Phe Glu Ile Leu Ser Ala Gly Asp Gln Thr Glu
820 825 830 820 825 830
Ile Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ile Gly Glu Lys Gly Ile Thr Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val
835 840 845 835 840 845
Ser Leu Ala Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ser Arg His Leu Leu Leu Asp Ser Leu Ala Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ser Arg His Leu Leu Leu Asp
850 855 860 850 855 860
Asp Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Leu Trp Ile Tyr Glu Asp Cys Leu Ser Ala Val Asp Ser His Thr Ala Leu Trp Ile Tyr Glu
865 870 875 880 865 870 875 880
Asn Cys Ile Thr Gly Pro Leu Met Glu Gly Arg Thr Cys Val Leu Val Asn Cys Ile Thr Gly Pro Leu Met Glu Gly Arg Thr Cys Val Leu Val
885 890 895 885 890 895
Ser His Asn Val Ala Leu Thr Leu Lys Asn Ala Asp Trp Val Ile Ile Ser His Asn Val Ala Leu Thr Leu Lys Asn Ala Asp Trp Val Ile Ile
900 905 910 900 905 910
Met Glu Asn Gly Arg Val Lys Glu Gln Gly Glu Pro Val Glu Leu Leu Met Glu Asn Gly Arg Val Lys Glu Gln Gly Glu Pro Val Glu Leu Leu
915 920 925 915 920 925
Gln Lys Gly Ser Leu Gly Asp Asp Ser Met Val Lys Ser Ser Ile Leu Gln Lys Gly Ser Leu Gly Asp Asp Ser Met Val Lys Ser Ser Ile Leu
930 935 940 930 935 940
Ser Arg Thr Ala Ser Ser Val Asn Ile Ser Glu Thr Asn Ser Lys Ile Ser Arg Thr Ala Ser Ser Val Asn Ile Ser Glu Thr Asn Ser Lys Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Ser Ser Gly Pro Lys Ala Pro Ala Glu Ser Asp Asn Ala Asn Glu Glu Ser Ser Gly Pro Lys Ala Pro Ala Glu Ser Asp Asn Ala Asn Glu Glu
965 970 975 965 970 975
Ser Thr Thr Cys Gly Asp Arg Ser Lys Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Ser Thr Thr Cys Gly Asp Arg Ser Lys Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala
980 985 990 980 985 990
Glu Glu Thr Lys Ser Asn Gly Val Val Ser Leu Asp Val Tyr Lys Trp Glu Glu Thr Lys Ser Asn Gly Val Val Ser Leu Asp Val Tyr Lys Trp
995 1000 1005 995 1000 1005
Tyr Ala Val Phe Phe Gly Gly Trp Lys Met Ile Ser Phe Leu Cys Tyr Ala Val Phe Phe Gly Gly Trp Lys Met Ile Ser Phe Leu Cys
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Phe Ile Phe Leu Phe Ala Gln Met Ile Ser Ile Ser Gln Ala Trp Phe Ile Phe Leu Phe Ala Gln Met Ile Ser Ile Ser Gln Ala Trp
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Trp Leu Arg Ala Trp Ala Ser Asn Asn Thr Leu Lys Val Phe Ser Trp Leu Arg Ala Trp Ala Ser Asn Asn Thr Leu Lys Val Phe Ser
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Asn Leu Gly Leu Gln Thr Met Arg Pro Phe Ala Leu Ser Leu Gln Asn Leu Gly Leu Gln Thr Met Arg Pro Phe Ala Leu Ser Leu Gln
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Gly Lys Glu Ala Ser Pro Val Thr Leu Ser Ala Val Phe Pro Asn Gly Lys Glu Ala Ser Pro Val Thr Leu Ser Ala Val Phe Pro Asn
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Gly Ser Leu Thr Thr Ala Thr Glu Pro Asn His Ser Asn Ala Tyr Gly Ser Leu Thr Thr Ala Thr Glu Pro Asn His Ser Asn Ala Tyr
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Tyr Leu Ser Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Val Phe Gln Ala Leu Cys Tyr Leu Ser Ile Tyr Leu Gly Ile Gly Val Phe Gln Ala Leu Cys
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Ser Ser Ser Lys Ala Ile Ile Asn Phe Val Ala Gly Ile Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ala Ile Ile Asn Phe Val Ala Gly Ile Arg Ala
1115 1120 1125 1115 1120 1125
Ser Arg Lys Ile Phe Asn Leu Leu Leu Lys Asn Val Leu Tyr Ala Ser Arg Lys Ile Phe Asn Leu Leu Leu Lys Asn Val Leu Tyr Ala
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Lys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Thr Pro Ile Gly Arg Ile Met Asn Lys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Thr Pro Ile Gly Arg Ile Met Asn
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Arg Phe Ser Lys Asp Ile Glu Ser Ile Asp Gln Glu Leu Thr Pro Arg Phe Ser Lys Asp Ile Glu Ser Ile Asp Gln Glu Leu Thr Pro
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Tyr Met Glu Gly Ala Phe Gly Ser Leu Ile Gln Cys Val Ser Thr Tyr Met Glu Gly Ala Phe Gly Ser Leu Ile Gln Cys Val Ser Thr
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Ile Ile Val Ile Ala Tyr Ile Thr Pro Gln Phe Leu Ile Val Ala Ile Ile Val Ile Ala Tyr Ile Thr Pro Gln Phe Leu Ile Val Ala
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Ala Ile Val Met Leu Leu Phe Tyr Phe Val Ala Tyr Phe Tyr Met Ala Ile Val Met Leu Leu Phe Tyr Phe Val Ala Tyr Phe Tyr Met
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Ser Gly Ala Arg Glu Leu Lys Arg Leu Glu Ser Met Ser Arg Ser Ser Gly Ala Arg Glu Leu Lys Arg Leu Glu Ser Met Ser Arg Ser
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Pro Ile His Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Ile Thr Thr Pro Ile His Gln His Phe Ser Glu Thr Leu Val Gly Ile Thr Thr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ile Arg Ala Phe Ser Asp Glu Arg Arg Phe Leu Val Asp Asn Met Ile Arg Ala Phe Ser Asp Glu Arg Arg Phe Leu Val Asp Asn Met
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Lys Lys Ile Asp Asp Asn Asn Arg Pro Phe Phe Tyr Leu Trp Val Lys Lys Ile Asp Asp Asn Asn Arg Pro Phe Phe Tyr Leu Trp Val
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Cys Asn Arg Trp Leu Ser Tyr Arg Ile Glu Leu Ile Gly Ala Leu Cys Asn Arg Trp Leu Ser Tyr Arg Ile Glu Leu Ile Gly Ala Leu
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Ile Val Leu Ala Ala Gly Ser Phe Ile Leu Leu Asn Ile Lys Ser Ile Val Leu Ala Ala Gly Ser Phe Ile Leu Leu Asn Ile Lys Ser
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Ile Asp Ser Gly Leu Ala Gly Ile Ser Leu Gly Phe Ala Ile Gln Ile Asp Ser Gly Leu Ala Gly Ile Ser Leu Gly Phe Ala Ile Gln
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Phe Thr Asp Gly Ala Leu Trp Val Val Arg Leu Tyr Ser Asn Val Phe Thr Asp Gly Ala Leu Trp Val Val Arg Leu Tyr Ser Asn Val
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Glu Met Asn Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Thr Thr Glu Met Asn Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Thr Thr
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Ile Glu Gln Glu Pro Ser Asn Val Gly Ala Leu Val Pro Pro Cys Ile Glu Gln Glu Pro Ser Asn Val Gly Ala Leu Val Pro Pro Cys
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Glu Trp Pro Gln Asn Gly Lys Ile Glu Val Lys Asp Leu Ser Leu Glu Trp Pro Gln Asn Gly Lys Ile Glu Val Lys Asp Leu Ser Leu
1370 1375 1380 1370 1375 1380
Arg Tyr Ala Ala Gly Leu Pro Lys Val Ile Lys Asn Val Thr Phe Arg Tyr Ala Ala Gly Leu Pro Lys Val Ile Lys Asn Val Thr Phe
1385 1390 1395 1385 1390 1395
Thr Val Asp Ser Lys Cys Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly Thr Val Asp Ser Lys Cys Lys Val Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly
1400 1405 1410 1400 1405 1410
Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ala Leu Phe Arg Phe Leu Asp Ala Gly Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ala Leu Phe Arg Phe Leu Asp
1415 1420 1425 1415 1420 1425
Pro Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Ile Asp Asp Val Asp Ile Thr Thr Pro Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Ile Asp Asp Val Asp Ile Thr Thr
1430 1435 1440 1430 1435 1440
Ile Gly Leu Lys Arg Leu Arg Gln Ser Ile Thr Ile Ile Pro Gln Ile Gly Leu Lys Arg Leu Arg Gln Ser Ile Thr Ile Ile Pro Gln
1445 1450 1455 1445 1450 1455
Asp Pro Thr Leu Phe Thr Gly Thr Leu Lys Thr Asn Leu Asp Pro Asp Pro Thr Leu Phe Thr Gly Thr Leu Lys Thr Asn Leu Asp Pro
1460 1465 1470 1460 1465 1470
Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Ala Glu Ile Phe Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Asn Glu Tyr Ser Glu Ala Glu Ile Phe Glu Ala Leu Lys Arg
1475 1480 1485 1475 1480 1485
Val Asn Leu Val Ser Ser Glu Glu Leu Gly Asn Pro Ser Thr Ser Val Asn Leu Val Ser Ser Glu Glu Leu Gly Asn Pro Ser Thr Ser
1490 1495 1500 1490 1495 1500
Asp Ser Thr Ser Val His Ser Ala Asn Met Asn Lys Phe Leu Asp Asp Ser Thr Ser Val His Ser Ala Asn Met Asn Lys Phe Leu Asp
1505 1510 1515 1505 1510 1515
Leu Glu Asn Glu Val Ser Glu Gly Gly Ser Asn Leu Ser Gln Gly Leu Glu Asn Glu Val Ser Glu Gly Gly Ser Asn Leu Ser Gln Gly
1520 1525 1530 1520 1525 1530
Gln Arg Gln Leu Ile Cys Leu Ala Arg Ser Leu Leu Arg Cys Pro Gln Arg Gln Leu Ile Cys Leu Ala Arg Ser Leu Leu Arg Cys Pro
1535 1540 1545 1535 1540 1545
Lys Val Ile Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Ile Asp Tyr Asn Lys Val Ile Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Ile Asp Tyr Asn
1550 1555 1560 1550 1555 1560
Ser Asp Ser Lys Ile Gln Ala Thr Ile Arg Glu Glu Phe Ser Asn Ser Asp Ser Lys Ile Gln Ala Thr Ile Arg Glu Glu Phe Ser Asn
1565 1570 1575 1565 1570 1575
Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Arg Ser Ile Ile Asp Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ala His Arg Leu Arg Ser Ile Ile Asp
1580 1585 1590 1580 1585 1590
Tyr Asp Lys Ile Leu Val Met Asp Ala Gly Glu Val Lys Glu Tyr Tyr Asp Lys Ile Leu Val Met Asp Ala Gly Glu Val Lys Glu Tyr
1595 1600 1605 1595 1600 1605
Asp His Pro Tyr Ser Leu Leu Leu Asn Arg Asp Ser Ile Phe Tyr Asp His Pro Tyr Ser Leu Leu Leu Asn Arg Asp Ser Ile Phe Tyr
1610 1615 1620 1610 1615 1620
His Met Cys Glu Asp Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Ile Gln Leu His Met Cys Glu Asp Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Ile Gln Leu
1625 1630 1635 1625 1630 1635
Ala Lys Glu Ser Phe Val Lys Lys Leu Asn Ala Asn Ala Lys Glu Ser Phe Val Lys Lys Leu Asn Ala Asn
1640 1645 1650 1640 1645 1650
<210> 9<210> 9
<211> 320<211> 320
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Bt.GGPPS<223> Synthetic: Bt.GGPPS
<400> 9<400> 9
Met Leu Thr Ser Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Pro Lys Asn Val Gln Met Leu Thr Ser Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Pro Lys Asn Val Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Tyr Gly Lys His Tyr Gln Asn Gly Leu Glu Pro Val Gly Lys Ser Pro Tyr Gly Lys His Tyr Gln Asn Gly Leu Glu Pro Val Gly Lys Ser
20 25 30 20 25 30
Gln Glu Asp Ile Leu Leu Glu Pro Phe His Tyr Leu Cys Ser Asn Pro Gln Glu Asp Ile Leu Leu Glu Pro Phe His Tyr Leu Cys Ser Asn Pro
35 40 45 35 40 45
Gly Lys Asp Val Arg Thr Lys Met Ile Glu Ala Phe Asn Ala Trp Leu Gly Lys Asp Val Arg Thr Lys Met Ile Glu Ala Phe Asn Ala Trp Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Val Pro Lys Asp Asp Leu Ile Val Ile Thr Arg Val Ile Glu Met Lys Val Pro Lys Asp Asp Leu Ile Val Ile Thr Arg Val Ile Glu Met
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu His Ser Ala Ser Leu Leu Ile Asp Asp Val Glu Asp Asp Ser Val Leu His Ser Ala Ser Leu Leu Ile Asp Asp Val Glu Asp Asp Ser Val
85 90 95 85 90 95
Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala Ala His His Ile Tyr Gly Thr Pro Gln Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala Ala His His Ile Tyr Gly Thr Pro Gln
100 105 110 100 105 110
Thr Ile Asn Cys Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Ala Leu Lys Glu Ile Thr Ile Asn Cys Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Ala Leu Lys Glu Ile
115 120 125 115 120 125
Ala Lys Leu Asn Lys Pro Asn Met Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Glu Leu Ala Lys Leu Asn Lys Pro Asn Met Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Met Glu Leu Phe Trp Arg Asp Thr Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Met Glu Leu Phe Trp Arg Asp Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Thr Cys Pro Thr Glu Lys Glu Phe Leu Asp Met Val Asn Asp Lys Leu Thr Cys Pro Thr Glu Lys Glu Phe Leu Asp Met Val Asn Asp Lys
165 170 175 165 170 175
Thr Gly Gly Leu Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Met Gln Glu Ala Ser Thr Gly Gly Leu Leu Arg Leu Ala Val Lys Leu Met Gln Glu Ala Ser
180 185 190 180 185 190
Gln Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Gly Leu Val Ser Lys Ile Gly Ile His Gln Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Gly Leu Val Ser Lys Ile Gly Ile His
195 200 205 195 200 205
Phe Gln Val Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Lys Asn Tyr Ala Phe Gln Val Arg Asp Asp Tyr Met Asn Leu Gln Ser Lys Asn Tyr Ala
210 215 220 210 215 220
Asp Asn Lys Gly Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe Asp Asn Lys Gly Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu Gly Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Ile Ile His Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ser Asn Arg Gln Leu Leu Pro Ile Ile His Ser Ile Arg Ser Asp Pro Ser Asn Arg Gln Leu Leu
245 250 255 245 250 255
Asn Ile Leu Lys Gln Arg Ser Ser Ser Ile Glu Leu Lys Gln Phe Ala Asn Ile Leu Lys Gln Arg Ser Ser Ser Ile Glu Leu Lys Gln Phe Ala
260 265 270 260 265 270
Leu Gln Leu Leu Glu Asn Thr Asn Thr Phe Gln Tyr Cys Arg Asp Phe Leu Gln Leu Leu Glu Asn Thr Asn Thr Phe Gln Tyr Cys Arg Asp Phe
275 280 285 275 280 285
Leu Arg Val Leu Glu Lys Glu Ala Arg Glu Glu Ile Lys Leu Leu Gly Leu Arg Val Leu Glu Lys Glu Ala Arg Glu Glu Ile Lys Leu Leu Gly
290 295 300 290 295 300
Gly Asn Ile Met Leu Glu Lys Ile Met Asp Val Leu Ser Val Asn Glu Gly Asn Ile Met Leu Glu Lys Ile Met Asp Val Leu Ser Val Asn Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
<210> 10<210> 10
<211> 736<211> 736
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Ent-Os.CDPS<223> Synthetic: Ent-Os.CDPS
<400> 10<400> 10
Met Glu His Ala Arg Pro Pro Gln Gly Gly Asp Asp Asp Val Ala Ala Met Glu His Ala Arg Pro Pro Gly Gly Asp Asp Asp Val Ala Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Leu Pro Tyr Met Ile Glu Ser Ile Lys Ser Lys Leu Ser Thr Ser Glu Leu Pro Tyr Met Ile Glu Ser Ile Lys Ser Lys Leu
20 25 30 20 25 30
Arg Ala Ala Arg Asn Ser Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Arg Asn Ser Leu Gly Glu Thr Thr Val Ser Ala Tyr Asp
35 40 45 35 40 45
Thr Ala Trp Ile Ala Leu Val Asn Arg Leu Asp Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ala Trp Ile Ala Leu Val Asn Arg Leu Asp Gly Gly Gly Glu Arg
50 55 60 50 55 60
Ser Pro Gln Phe Pro Glu Ala Ile Asp Trp Ile Ala Arg Asn Gln Leu Ser Pro Gln Phe Pro Glu Ala Ile Asp Trp Ile Ala Arg Asn Gln Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Gly Met Phe Ile Val Gln Asp Arg Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Gly Met Phe Ile Val Gln Asp Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Ile Asn Thr Leu Gly Cys Val Val Ala Leu Ala Thr Trp Gly Val Leu Ile Asn Thr Leu Gly Cys Val Val Ala Leu Ala Thr Trp Gly Val
100 105 110 100 105 110
His Glu Glu Gln Arg Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Gln Asp Asn Leu His Glu Glu Gln Arg Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Ile Gln Asp Asn Leu
115 120 125 115 120 125
Trp Arg Leu Gly Glu Asp Asp Glu Glu Trp Met Met Val Gly Phe Glu Trp Arg Leu Gly Glu Asp Asp Glu Glu Trp Met Met Val Gly Phe Glu
130 135 140 130 135 140
Ile Thr Phe Pro Val Leu Leu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Gly Leu Asp Ile Thr Phe Pro Val Leu Leu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Gly Leu Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Ile Asn Tyr Asp Asp Pro Ala Leu Gln Asp Ile Tyr Ala Lys Arg Gln Ile Asn Tyr Asp Asp Pro Ala Leu Gln Asp Ile Tyr Ala Lys Arg Gln
165 170 175 165 170 175
Leu Lys Leu Ala Lys Ile Pro Arg Glu Ala Leu His Ala Arg Pro Thr Leu Lys Leu Ala Lys Ile Pro Arg Glu Ala Leu His Ala Arg Pro Thr
180 185 190 180 185 190
Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Glu Asn Leu Asp Trp Glu Arg Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Glu Asn Leu Asp Trp Glu Arg
195 200 205 195 200 205
Leu Leu Gln Phe Lys Cys Pro Ala Gly Ser Leu His Ser Ser Pro Ala Leu Leu Gln Phe Lys Cys Pro Ala Gly Ser Leu His Ser Ser Pro Ala
210 215 220 210 215 220
Ala Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Glu Thr Gly Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Glu Thr Gly Asp Lys Glu Leu Leu Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Leu Glu Thr Ala Ile Asn Asn Phe Asp Gly Gly Ala Pro Cys Thr Tyr Leu Glu Thr Ala Ile Asn Asn Phe Asp Gly Gly Ala Pro Cys Thr
245 250 255 245 250 255
Tyr Pro Val Asp Asn Phe Asp Arg Leu Trp Ser Val Asp Arg Leu Arg Tyr Pro Val Asp Asn Phe Asp Arg Leu Trp Ser Val Asp Arg Leu Arg
260 265 270 260 265 270
Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Thr Ser Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Thr Ser Glu Ile Glu Glu Tyr Leu
275 280 285 275 280 285
Glu Tyr Ala Tyr Arg His Leu Ser Pro Asp Gly Met Ser Tyr Gly Gly Glu Tyr Ala Tyr Arg His Leu Ser Pro Asp Gly Met Ser Tyr Gly Gly
290 295 300 290 295 300
Leu Cys Pro Val Lys Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu Leu Cys Pro Val Lys Asp Ile Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ser Val Phe Asn His Phe Leu Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ser Val Phe Asn His Phe
325 330 335 325 330 335
Glu Lys Asp Gly Glu Tyr Phe Cys Phe Ala Gly Gln Ser Ser Gln Ser Glu Lys Asp Gly Glu Tyr Phe Cys Phe Ala Gly Gln Ser Ser Gln Ser
340 345 350 340 345 350
Leu Thr Ala Met Tyr Asn Ser Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Val Phe Pro Leu Thr Ala Met Tyr Asn Ser Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Val Phe Pro
355 360 365 355 360 365
Gly Asp Asp Asp Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Cys Arg Ala Phe Gly Asp Asp Asp Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Cys Arg Ala Phe
370 375 380 370 375 380
Leu Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly Asn Leu Arg Asp Lys Trp Val Ile Leu Glu Glu Arg Arg Ala Thr Gly Asn Leu Arg Asp Lys Trp Val Ile
385 390 395 400 385 390 395 400
Ala Asn Gly Leu Pro Ser Glu Val Glu Tyr Ala Leu Asp Phe Pro Trp Ala Asn Gly Leu Pro Ser Glu Val Glu Tyr Ala Leu Asp Phe Pro Trp
405 410 415 405 410 415
Lys Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Val Tyr Leu Glu Gln Tyr Lys Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Val Tyr Leu Glu Gln Tyr
420 425 430 420 425 430
Gly Ala Ser Glu Asp Ala Trp Ile Gly Lys Gly Leu Tyr Arg Met Thr Gly Ala Ser Glu Asp Ala Trp Ile Gly Lys Gly Leu Tyr Arg Met Thr
435 440 445 435 440 445
Leu Val Asn Asn Asp Leu Tyr Leu Glu Ala Ala Lys Ala Asp Phe Thr Leu Val Asn Asn Asp Leu Tyr Leu Glu Ala Ala Lys Ala Asp Phe Thr
450 455 460 450 455 460
Asn Phe Gln Arg Leu Ser Arg Leu Glu Trp Leu Ser Leu Lys Arg Trp Asn Phe Gln Arg Leu Ser Arg Leu Glu Trp Leu Ser Leu Lys Arg Trp
465 470 475 480 465 470 475 480
Tyr Ile Arg Asn Asn Leu Gln Ala His Gly Val Thr Glu Gln Ser Val Tyr Ile Arg Asn Asn Leu Gln Ala His Gly Val Thr Glu Gln Ser Val
485 490 495 485 490 495
Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Asn Ile Phe Glu Pro Asn Arg Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Asn Ile Phe Glu Pro Asn Arg
500 505 510 500 505 510
Ala Ala Glu Arg Leu Gly Trp Ala Arg Thr Ala Ile Leu Ala Glu Ala Ala Ala Glu Arg Leu Gly Trp Ala Arg Thr Ala Ile Leu Ala Glu Ala
515 520 525 515 520 525
Ile Ala Ser His Leu Arg Gln Tyr Ser Ala Asn Gly Ala Ala Asp Gly Ile Ala Ser His Leu Arg Gln Tyr Ser Ala Asn Gly Ala Ala Asp Gly
530 535 540 530 535 540
Met Thr Glu Arg Leu Ile Ser Gly Leu Ala Ser His Asp Trp Asp Trp Met Thr Glu Arg Leu Ile Ser Gly Leu Ala Ser His Asp Trp Asp Trp
545 550 555 560 545 550 555 560
Arg Glu Ser Asn Asp Ser Ala Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Ala Leu Asp Arg Glu Ser Asn Asp Ser Ala Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Ala Leu Asp
565 570 575 565 570 575
Glu Leu Ile Asp Leu His Ala Phe Gly Asn Ala Ser Asp Ser Leu Arg Glu Leu Ile Asp Leu His Ala Phe Gly Asn Ala Ser Asp Ser Leu Arg
580 585 590 580 585 590
Glu Ala Trp Lys Gln Trp Leu Met Ser Trp Thr Asn Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Lys Gln Trp Leu Met Ser Trp Thr Asn Glu Ser Gln Gly
595 600 605 595 600 605
Ser Thr Gly Gly Asp Thr Ala Leu Leu Leu Val Arg Thr Ile Glu Ile Ser Thr Gly Gly Asp Thr Ala Leu Leu Leu Val Arg Thr Ile Glu Ile
610 615 620 610 615 620
Cys Ser Gly Arg His Gly Ser Ala Glu Gln Ser Leu Lys Asn Ser Glu Cys Ser Gly Arg His Gly Ser Ala Glu Gln Ser Leu Lys Asn Ser Glu
625 630 635 640 625 630 635 640
Asp Tyr Ala Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser Ser Met Cys Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser Ser Met Cys Ser Lys Leu
645 650 655 645 650 655
Ala Thr Lys Ile Leu Ala Gln Asn Gly Gly Ser Met Asp Asn Val Glu Ala Thr Lys Ile Leu Ala Gln Asn Gly Gly Ser Met Asp Asn Val Glu
660 665 670 660 665 670
Gly Ile Asp Gln Glu Val Asp Val Glu Met Lys Glu Leu Ile Gln Arg Gly Ile Asp Gln Glu Val Asp Val Glu Met Lys Glu Leu Ile Gln Arg
675 680 685 675 680 685
Val Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Asp Val Ser Ser Val Thr Arg Gln Thr Val Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Asp Val Ser Ser Val Thr Arg Gln Thr
690 695 700 690 695 700
Phe Leu Asp Val Val Lys Ser Phe Cys Tyr Val Ala His Cys Ser Pro Phe Leu Asp Val Val Lys Ser Phe Cys Tyr Val Ala His Cys Ser Pro
705 710 715 720 705 710 715 720
Glu Thr Ile Asp Gly His Ile Ser Lys Val Leu Phe Glu Asp Val Asn Glu Thr Ile Asp Gly His Ile Ser Lys Val Leu Phe Glu Asp Val Asn
725 730 735 725 730 735
<210> 11<210> 11
<211> 757<211> 757
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Ent-Pg.KS<223> Synthetic: Ent-Pg.KS
<400> 11<400> 11
Met Lys Arg Glu Gln Tyr Thr Ile Leu Asn Glu Lys Glu Ser Met Ala Met Lys Arg Glu Gln Tyr Thr Ile Leu Asn Glu Lys Glu Ser Met Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Glu Leu Ile Leu Arg Ile Lys Arg Met Phe Ser Glu Ile Glu Asn Glu Glu Leu Ile Leu Arg Ile Lys Arg Met Phe Ser Glu Ile Glu Asn
20 25 30 20 25 30
Thr Gln Thr Ser Ala Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Thr Gln Thr Ser Ala Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val
35 40 45 35 40 45
Pro Ser Leu Asp Ser Ser Gln Gln Pro Gln Phe Pro Gln Cys Leu Ser Pro Ser Leu Asp Ser Ser Gln Gln Pro Gln Phe Pro Gln Cys Leu Ser
50 55 60 50 55 60
Trp Ile Ile Asp Asn Gln Leu Leu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Pro Tyr Trp Ile Ile Asp Asn Gln Leu Leu Asp Gly Ser Trp Gly Ile Pro Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Ile Ile Lys Asp Arg Leu Cys His Thr Leu Ala Cys Val Ile Ala Leu Ile Ile Lys Asp Arg Leu Cys His Thr Leu Ala Cys Val Ile Ala
85 90 95 85 90 95
Leu Arg Lys Trp Asn Ala Gly Asn Gln Asn Val Glu Thr Gly Leu Arg Leu Arg Lys Trp Asn Ala Gly Asn Gln Asn Val Glu Thr Gly Leu Arg
100 105 110 100 105 110
Phe Leu Arg Glu Asn Ile Glu Gly Ile Val His Glu Asp Glu Tyr Thr Phe Leu Arg Glu Asn Ile Glu Gly Ile Val His Glu Asp Glu Tyr Thr
115 120 125 115 120 125
Pro Ile Gly Phe Gln Ile Ile Phe Pro Ala Met Leu Glu Glu Ala Arg Pro Ile Gly Phe Gln Ile Ile Phe Pro Ala Met Leu Glu Glu Ala Arg
130 135 140 130 135 140
Gly Leu Gly Leu Glu Leu Pro Tyr Asp Leu Thr Pro Ile Lys Leu Met Gly Leu Gly Leu Glu Leu Pro Tyr Asp Leu Thr Pro Ile Lys Leu Met
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Thr His Arg Glu Lys Ile Met Lys Gly Lys Ala Ile Asp His Met Leu Thr His Arg Glu Lys Ile Met Lys Gly Lys Ala Ile Asp His Met
165 170 175 165 170 175
His Glu Tyr Asp Ser Ser Leu Ile Tyr Thr Val Glu Gly Ile His Lys His Glu Tyr Asp Ser Ser Leu Ile Tyr Thr Val Glu Gly Ile His Lys
180 185 190 180 185 190
Ile Val Asp Trp Asn Lys Val Leu Lys His Gln Asn Lys Asp Gly Ser Ile Val Asp Trp Asn Lys Val Leu Lys His Gln Asn Lys Asp Gly Ser
195 200 205 195 200 205
Leu Phe Asn Ser Pro Ser Ala Thr Ala Cys Ala Leu Met His Thr Arg Leu Phe Asn Ser Pro Ser Ala Thr Ala Cys Ala Leu Met His Thr Arg
210 215 220 210 215 220
Lys Ser Asn Cys Leu Glu Tyr Leu Ser Ser Met Leu Gln Lys Leu Gly Lys Ser Asn Cys Leu Glu Tyr Leu Ser Ser Met Leu Gln Lys Leu Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gly Val Pro Ser Val Tyr Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Arg Ile Ser Asn Gly Val Pro Ser Val Tyr Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Arg Ile Ser
245 250 255 245 250 255
Met Ile Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Leu Ala Arg His Phe Arg Asn Met Ile Asp Arg Leu Gln Arg Leu Gly Leu Ala Arg His Phe Arg Asn
260 265 270 260 265 270
Glu Ile Ile His Ala Leu Asp Asp Ile Tyr Arg Tyr Trp Met Gln Arg Glu Ile Ile His Ala Leu Asp Asp Ile Tyr Arg Tyr Trp Met Gln Arg
275 280 285 275 280 285
Glu Thr Ser Arg Glu Gly Lys Ser Leu Thr Pro Asp Ile Val Ser Thr Glu Thr Ser Arg Glu Gly Lys Ser Leu Thr Pro Asp Ile Val Ser Thr
290 295 300 290 295 300
Ser Ile Ala Phe Met Leu Leu Arg Leu His Gly Tyr Asp Val Pro Ala Ser Ile Ala Phe Met Leu Leu Arg Leu His Gly Tyr Asp Val Pro Ala
305 310 315 320 305 310 315 320
Asp Val Phe Cys Cys Tyr Asp Leu His Ser Ile Glu Gln Ser Gly Glu Asp Val Phe Cys Cys Tyr Asp Leu His Ser Ile Glu Gln Ser Gly Glu
325 330 335 325 330 335
Ala Val Thr Ala Met Leu Ser Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Met Phe Ala Val Thr Ala Met Leu Ser Leu Tyr Arg Ala Ser Gln Ile Met Phe
340 345 350 340 345 350
Pro Gly Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Lys Thr Val Ser Arg Lys Tyr Pro Gly Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Lys Thr Val Ser Arg Lys Tyr
355 360 365 355 360 365
Leu Asp Lys Arg Lys Glu Asn Gly Gly Ile Tyr Asp His Asn Ile Val Leu Asp Lys Arg Lys Glu Asn Gly Gly Ile Tyr Asp His Asn Ile Val
370 375 380 370 375 380
Met Lys Asp Leu Arg Gly Glu Val Glu Tyr Ala Leu Ser Val Pro Trp Met Lys Asp Leu Arg Gly Glu Val Glu Tyr Ala Leu Ser Val Pro Trp
385 390 395 400 385 390 395 400
Tyr Ala Ser Leu Glu Arg Ile Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Asp Gln Tyr Tyr Ala Ser Leu Glu Arg Ile Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Asp Gln Tyr
405 410 415 405 410 415
Gly Val Asn Asp Thr Trp Ile Ala Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Pro Cys Gly Val Asn Asp Thr Trp Ile Ala Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Pro Cys
420 425 430 420 425 430
Ile Ser Asn Asp Leu Phe Leu Ala Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Ile Ile Ser Asn Asp Leu Phe Leu Ala Leu Ala Lys Gln Asp Tyr Asn Ile
435 440 445 435 440 445
Cys Gln Ala Ile Gln Gln Lys Glu Leu Arg Glu Leu Glu Arg Trp Phe Cys Gln Ala Ile Gln Gln Lys Glu Leu Arg Glu Leu Glu Arg Trp Phe
450 455 460 450 455 460
Ala Asp Asn Lys Phe Ser His Leu Asn Phe Ala Arg Gln Lys Leu Ile Ala Asp Asn Lys Phe Ser His Leu Asn Phe Ala Arg Gln Lys Leu Ile
465 470 475 480 465 470 475 480
Tyr Cys Tyr Phe Ser Ala Ala Ala Thr Leu Phe Ser Pro Glu Leu Ser Tyr Cys Tyr Phe Ser Ala Ala Ala Thr Leu Phe Ser Pro Glu Leu Ser
485 490 495 485 490 495
Ala Ala Arg Val Val Trp Ala Lys Asn Gly Val Ile Thr Thr Val Val Ala Ala Arg Val Val Trp Ala Lys Asn Gly Val Ile Thr Thr Val Val
500 505 510 500 505 510
Asp Asp Phe Phe Asp Val Gly Gly Ser Ser Glu Glu Ile His Ser Phe Asp Asp Phe Phe Asp Val Gly Gly Ser Ser Glu Glu Ile His Ser Phe
515 520 525 515 520 525
Val Glu Ala Val Arg Val Trp Asp Glu Ala Ala Thr Asp Gly Leu Ser Val Glu Ala Val Arg Val Trp Asp Glu Ala Ala Thr Asp Gly Leu Ser
530 535 540 530 535 540
Glu Asn Val Gln Ile Leu Phe Ser Ala Leu Tyr Asn Thr Val Asp Glu Glu Asn Val Gln Ile Leu Phe Ser Ala Leu Tyr Asn Thr Val Asp Glu
545 550 555 560 545 550 555 560
Ile Val Gln Gln Ala Phe Val Phe Gln Gly Arg Asp Ile Ser Ile His Ile Val Gln Gln Ala Phe Val Phe Gln Gly Arg Asp Ile Ser Ile His
565 570 575 565 570 575
Leu Arg Glu Ile Trp Tyr Arg Leu Val Asn Ser Met Met Thr Glu Ala Leu Arg Glu Ile Trp Tyr Arg Leu Val Asn Ser Met Met Thr Glu Ala
580 585 590 580 585 590
Gln Trp Ala Arg Thr His Cys Leu Pro Ser Met His Glu Tyr Met Glu Gln Trp Ala Arg Thr His Cys Leu Pro Ser Met His Glu Tyr Met Glu
595 600 605 595 600 605
Asn Ala Glu Pro Ser Ile Ala Leu Glu Pro Ile Val Leu Ser Ser Leu Asn Ala Glu Pro Ser Ile Ala Leu Glu Pro Ile Val Leu Ser Ser Leu
610 615 620 610 615 620
Tyr Phe Val Gly Pro Lys Leu Ser Glu Glu Ile Ile Cys His Pro Glu Tyr Phe Val Gly Pro Lys Leu Ser Glu Glu Ile Ile Cys His Pro Glu
625 630 635 640 625 630 635 640
Tyr Tyr Asn Leu Met His Leu Leu Asn Ile Cys Gly Arg Leu Leu Asn Tyr Tyr Asn Leu Met His Leu Leu Asn Ile Cys Gly Arg Leu Leu Asn
645 650 655 645 650 655
Asp Ile Gln Gly Cys Lys Arg Glu Ala His Gln Gly Lys Leu Asn Ser Asp Ile Gln Gly Cys Lys Arg Glu Ala His Gln Gly Lys Leu Asn Ser
660 665 670 660 665 670
Val Thr Leu Tyr Met Glu Glu Asn Ser Gly Thr Thr Met Glu Asp Ala Val Thr Leu Tyr Met Glu Glu Asn Ser Gly Thr Thr Met Glu Asp Ala
675 680 685 675 680 685
Ile Val Tyr Leu Arg Lys Thr Ile Asp Glu Ser Arg Gln Leu Leu Leu Ile Val Tyr Leu Arg Lys Thr Ile Asp Glu Ser Arg Gln Leu Leu Leu
690 695 700 690 695 700
Lys Glu Val Leu Arg Pro Ser Ile Val Pro Arg Glu Cys Lys Gln Leu Lys Glu Val Leu Arg Pro Ser Ile Val Pro Arg Glu Cys Lys Gln Leu
705 710 715 720 705 710 715 720
His Trp Asn Met Met Arg Ile Leu Gln Leu Phe Tyr Leu Lys Asn Asp His Trp Asn Met Met Arg Ile Leu Gln Leu Phe Tyr Leu Lys Asn Asp
725 730 735 725 730 735
Gly Phe Thr Ser Pro Thr Glu Met Leu Gly Tyr Val Asn Ala Val Ile Gly Phe Thr Ser Pro Thr Glu Met Leu Gly Tyr Val Asn Ala Val Ile
740 745 750 740 745 750
Val Asp Pro Ile Leu Val Asp Pro Ile Leu
755 755
<210> 12<210> 12
<211> 499<211> 499
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Ps.KO<223> Synthetic: Ps.KO
<400> 12<400> 12
Met Asp Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ser Leu Phe Leu Phe Met Asp Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ser Leu Phe Leu Phe
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Phe Leu Leu Lys Arg Ser Thr His Lys His Ser Lys Leu Ser His Leu Phe Leu Leu Lys Arg Ser Thr His Lys His Ser Lys Leu Ser His
20 25 30 20 25 30
Val Pro Val Val Pro Gly Leu Pro Val Ile Gly Asn Leu Leu Gln Leu Val Pro Val Val Pro Gly Leu Pro Val Ile Gly Asn Leu Leu Gln Leu
35 40 45 35 40 45
Lys Glu Lys Lys Pro His Lys Thr Phe Thr Lys Met Ala Gln Lys Tyr Lys Glu Lys Lys Pro His Lys Thr Phe Thr Lys Met Ala Gln Lys Tyr
50 55 60 50 55 60
Gly Pro Ile Phe Ser Ile Lys Ala Gly Ser Ser Lys Ile Ile Val Leu Gly Pro Ile Phe Ser Ile Lys Ala Gly Ser Ser Lys Ile Ile Val Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Thr Ala His Leu Ala Lys Glu Ala Met Val Thr Arg Tyr Ser Ser Asn Thr Ala His Leu Ala Lys Glu Ala Met Val Thr Arg Tyr Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Ile Ser Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Leu Thr Ile Leu Thr Ser Asp Ile Ser Lys Arg Lys Leu Ser Thr Ala Leu Thr Ile Leu Thr Ser Asp
100 105 110 100 105 110
Lys Cys Met Val Ala Met Ser Asp Tyr Asn Asp Phe His Lys Met Val Lys Cys Met Val Ala Met Ser Asp Tyr Asn Asp Phe His Lys Met Val
115 120 125 115 120 125
Lys Lys His Ile Leu Ala Ser Val Leu Gly Ala Asn Ala Gln Lys Arg Lys Lys His Ile Leu Ala Ser Val Leu Gly Ala Asn Ala Gln Lys Arg
130 135 140 130 135 140
Leu Arg Phe His Arg Glu Val Met Met Glu Asn Met Ser Ser Lys Phe Leu Arg Phe His Arg Glu Val Met Met Glu Asn Met Ser Ser Lys Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Glu His Val Lys Thr Leu Ser Asp Ser Ala Val Asp Phe Arg Lys Asn Glu His Val Lys Thr Leu Ser Asp Ser Ala Val Asp Phe Arg Lys
165 170 175 165 170 175
Ile Phe Val Ser Glu Leu Phe Gly Leu Ala Leu Lys Gln Ala Leu Gly Ile Phe Val Ser Glu Leu Phe Gly Leu Ala Leu Lys Gln Ala Leu Gly
180 185 190 180 185 190
Ser Asp Ile Glu Ser Ile Tyr Val Glu Gly Leu Thr Ala Thr Leu Ser Ser Asp Ile Glu Ser Ile Tyr Val Glu Gly Leu Thr Ala Thr Leu Ser
195 200 205 195 200 205
Arg Glu Asp Leu Tyr Asn Thr Leu Val Val Asp Phe Met Glu Gly Ala Arg Glu Asp Leu Tyr Asn Thr Leu Val Val Asp Phe Met Glu Gly Ala
210 215 220 210 215 220
Ile Glu Val Asp Trp Arg Asp Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Trp Ile Pro Ile Glu Val Asp Trp Arg Asp Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Trp Ile Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Lys Ser Phe Glu Lys Lys Ile Arg Arg Val Asp Arg Gln Arg Lys Asn Lys Ser Phe Glu Lys Lys Ile Arg Arg Val Asp Arg Gln Arg Lys
245 250 255 245 250 255
Ile Ile Met Lys Ala Leu Ile Asn Glu Gln Lys Lys Arg Leu Thr Ser Ile Ile Met Lys Ala Leu Ile Asn Glu Gln Lys Lys Arg Leu Thr Ser
260 265 270 260 265 270
Gly Lys Glu Leu Asp Cys Tyr Tyr Asp Tyr Leu Val Ser Glu Ala Lys Gly Lys Glu Leu Asp Cys Tyr Tyr Asp Tyr Leu Val Ser Glu Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Glu Val Thr Glu Glu Gln Met Ile Met Leu Leu Trp Glu Pro Ile Ile Glu Val Thr Glu Glu Gln Met Ile Met Leu Leu Trp Glu Pro Ile Ile
290 295 300 290 295 300
Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Tyr Glu Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Tyr Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Ala Lys Asp Lys Asn Arg Gln Asp Arg Leu Tyr Glu Glu Leu Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asn Arg Gln Asp Arg Leu Tyr Glu Glu Leu Leu
325 330 335 325 330 335
Asn Val Cys Gly His Glu Lys Val Thr Asp Glu Glu Leu Ser Lys Leu Asn Val Cys Gly His Glu Lys Val Thr Asp Glu Glu Leu Ser Lys Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Tyr Leu Gly Ala Val Phe His Glu Thr Leu Arg Lys His Ser Pro Pro Tyr Leu Gly Ala Val Phe His Glu Thr Leu Arg Lys His Ser Pro
355 360 365 355 360 365
Val Pro Ile Val Pro Leu Arg Tyr Val Asp Glu Asp Thr Glu Leu Gly Val Pro Ile Val Pro Leu Arg Tyr Val Asp Glu Asp Thr Glu Leu Gly
370 375 380 370 375 380
Gly Tyr His Ile Pro Ala Gly Ser Glu Ile Ala Ile Asn Ile Tyr Gly Gly Tyr His Ile Pro Ala Gly Ser Glu Ile Ala Ile Asn Ile Tyr Gly
385 390 395 400 385 390 395 400
Cys Asn Met Asp Ser Asn Leu Trp Glu Asn Pro Asp Gln Trp Ile Pro Cys Asn Met Asp Ser Asn Leu Trp Glu Asn Pro Asp Gln Trp Ile Pro
405 410 415 405 410 415
Glu Arg Phe Leu Asp Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Asp Leu Tyr Lys Thr Glu Arg Phe Leu Asp Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Asp Leu Tyr Lys Thr
420 425 430 420 425 430
Met Ala Phe Gly Gly Gly Lys Arg Val Cys Ala Gly Ser Leu Gln Ala Met Ala Phe Gly Gly Gly Lys Arg Val Cys Ala Gly Ser Leu Gln Ala
435 440 445 435 440 445
Met Leu Ile Ala Cys Thr Ala Ile Gly Arg Leu Val Gln Glu Phe Glu Met Leu Ile Ala Cys Thr Ala Ile Gly Arg Leu Val Gln Glu Phe Glu
450 455 460 450 455 460
Trp Glu Leu Gly His Gly Glu Glu Glu Asn Val Asp Thr Met Gly Leu Trp Glu Leu Gly His Gly Glu Glu Glu Asn Val Asp Thr Met Gly Leu
465 470 475 480 465 470 475 480
Thr Thr His Arg Leu His Pro Leu Gln Val Lys Leu Lys Pro Arg Asn Thr Thr His Arg Leu His Pro Leu Gln Val Lys Leu Lys Pro Arg Asn
485 490 495 485 490 495
Arg Ile Tyr Arg Ile Tyr
<210> 13<210> 13
<211> 500<211> 500
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Sr.KAH<223> Synthetic: Sr.KAH
<400> 13<400> 13
Met Glu Ala Ser Tyr Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Met Glu Ala Ser Tyr Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Tyr Leu Phe Thr Thr Gln Leu Arg Arg Lys Ser Ala Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Phe Thr Thr Gln Leu Arg Arg Lys Ser Ala Asn Leu Pro Pro
20 25 30 20 25 30
Thr Val Phe Pro Ser Ile Pro Ile Ile Gly His Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Val Phe Pro Ser Ile Pro Ile Ile Gly His Leu Tyr Leu Leu Lys
35 40 45 35 40 45
Lys Pro Leu Tyr Arg Thr Leu Ala Lys Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Pro Lys Pro Leu Tyr Arg Thr Leu Ala Lys Ile Ala Ala Lys Tyr Gly Pro
50 55 60 50 55 60
Ile Leu Gln Leu Gln Leu Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ile Ser Ser Ile Leu Gln Leu Gln Leu Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ile Ser Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Pro Ser Ala Ala Glu Glu Cys Phe Thr Asn Asn Asp Val Ile Phe Ala Pro Ser Ala Ala Glu Glu Cys Phe Thr Asn Asn Asp Val Ile Phe Ala
85 90 95 85 90 95
Asn Arg Pro Lys Thr Leu Phe Gly Lys Ile Val Gly Gly Thr Ser Leu Asn Arg Pro Lys Thr Leu Phe Gly Lys Ile Val Gly Gly Thr Ser Leu
100 105 110 100 105 110
Gly Ser Leu Ser Tyr Gly Asp Gln Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala Gly Ser Leu Ser Tyr Gly Asp Gln Trp Arg Asn Leu Arg Arg Val Ala
115 120 125 115 120 125
Ser Ile Glu Ile Leu Ser Val His Arg Leu Asn Glu Phe His Asp Ile Ser Ile Glu Ile Leu Ser Val His Arg Leu Asn Glu Phe His Asp Ile
130 135 140 130 135 140
Arg Val Asp Glu Asn Arg Leu Leu Ile Arg Lys Leu Arg Ser Ser Ser Arg Val Asp Glu Asn Arg Leu Leu Ile Arg Lys Leu Arg Ser Ser Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Pro Val Thr Leu Ile Thr Val Phe Tyr Ala Leu Thr Leu Asn Val Ser Pro Val Thr Leu Ile Thr Val Phe Tyr Ala Leu Thr Leu Asn Val
165 170 175 165 170 175
Ile Met Arg Met Ile Ser Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Ser Gly Asp Arg Ile Met Arg Met Ile Ser Gly Lys Arg Tyr Phe Asp Ser Gly Asp Arg
180 185 190 180 185 190
Glu Leu Glu Glu Glu Gly Lys Arg Phe Arg Glu Ile Leu Asp Glu Thr Glu Leu Glu Glu Glu Gly Lys Arg Phe Arg Glu Ile Leu Asp Glu Thr
195 200 205 195 200 205
Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Asn Val Gly Asp Tyr Leu Pro Ile Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ser Asn Val Gly Asp Tyr Leu Pro Ile Leu
210 215 220 210 215 220
Asn Trp Leu Gly Val Lys Ser Leu Glu Lys Lys Leu Ile Ala Leu Gln Asn Trp Leu Gly Val Lys Ser Leu Glu Lys Lys Leu Ile Ala Leu Gln
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Lys Arg Asp Asp Phe Phe Gln Gly Leu Ile Glu Gln Val Arg Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Phe Gln Gly Leu Ile Glu Gln Val Arg Lys
245 250 255 245 250 255
Ser Arg Gly Ala Lys Val Gly Lys Gly Arg Lys Thr Met Ile Glu Leu Ser Arg Gly Ala Lys Val Gly Lys Gly Arg Lys Thr Met Ile Glu Leu
260 265 270 260 265 270
Leu Leu Ser Leu Gln Glu Ser Glu Pro Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Glu Ser Glu Pro Glu Tyr Tyr Thr Asp Ala Met
275 280 285 275 280 285
Ile Arg Ser Phe Val Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Ser Asp Thr Ser Ile Arg Ser Phe Val Leu Gly Leu Leu Ala Ala Gly Ser Asp Thr Ser
290 295 300 290 295 300
Ala Gly Thr Met Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Val Asn His Pro His Ala Gly Thr Met Glu Trp Ala Met Ser Leu Leu Val Asn His Pro His
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Arg Val Ile Gly Asn Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Arg Val Ile Gly Asn Asn
325 330 335 325 330 335
Arg Leu Ile Asp Glu Ser Asp Ile Gly Asn Ile Pro Tyr Ile Gly Cys Arg Leu Ile Asp Glu Ser Asp Ile Gly Asn Ile Pro Tyr Ile Gly Cys
340 345 350 340 345 350
Ile Ile Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ile Ile Asn Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Gly Pro Leu Leu Phe
355 360 365 355 360 365
Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Val Ile Ser Gly Tyr Asn Ile Pro Pro His Glu Ser Ser Ala Asp Cys Val Ile Ser Gly Tyr Asn Ile Pro
370 375 380 370 375 380
Arg Gly Thr Met Leu Ile Val Asn Gln Trp Ala Ile His His Asp Pro Arg Gly Thr Met Leu Ile Val Asn Gln Trp Ala Ile His His Asp Pro
385 390 395 400 385 390 395 400
Lys Val Trp Asp Asp Pro Glu Thr Phe Lys Pro Glu Arg Phe Gln Gly Lys Val Trp Asp Asp Pro Glu Thr Phe Lys Pro Glu Arg Phe Gln Gly
405 410 415 405 410 415
Leu Glu Gly Thr Arg Asp Gly Phe Lys Leu Met Pro Phe Gly Ser Gly Leu Glu Gly Thr Arg Asp Gly Phe Lys Leu Met Pro Phe Gly Ser Gly
420 425 430 420 425 430
Arg Arg Gly Cys Pro Gly Glu Gly Leu Ala Ile Arg Leu Leu Gly Met Arg Arg Gly Cys Pro Gly Glu Gly Leu Ala Ile Arg Leu Leu Gly Met
435 440 445 435 440 445
Thr Leu Gly Ser Val Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg Val Gly Asp Thr Leu Gly Ser Val Ile Gln Cys Phe Asp Trp Glu Arg Val Gly Asp
450 455 460 450 455 460
Glu Met Val Asp Met Thr Glu Gly Leu Gly Val Thr Leu Pro Lys Ala Glu Met Val Asp Met Thr Glu Gly Leu Gly Val Thr Leu Pro Lys Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Val Pro Leu Val Ala Lys Cys Lys Pro Arg Ser Glu Met Thr Asn Leu Val Pro Leu Val Ala Lys Cys Lys Pro Arg Ser Glu Met Thr Asn Leu
485 490 495 485 490 495
Leu Ser Glu Leu Leu Ser Glu Leu
500 500
<210> 14<210> 14
<211> 711<211> 711
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: At.CPR<223> Synthetic: At.CPR
<400> 14<400> 14
Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Met Ile Asp Leu Met Ala Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Met Ile Asp Leu Met Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala
20 25 30 20 25 30
Ser Ala Tyr Glu Ser Val Ala Ala Glu Leu Ser Ser Met Leu Ile Glu Ser Ala Tyr Glu Ser Val Ala Ala Glu Leu Ser Ser Met Leu Ile Glu
35 40 45 35 40 45
Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile Ala Val Leu Ile Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile Ala Val Leu Ile
50 55 60 50 55 60
Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Asn Ser Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys Pro Arg Glu Glu Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys Pro Arg Glu Glu
85 90 95 85 90 95
Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln
100 105 110 100 105 110
Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly Glu Glu Ala Lys
115 120 125 115 120 125
Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp Leu Asp Asp Tyr Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp Leu Asp Asp Tyr
130 135 140 130 135 140
Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Asp Val Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Asp Val
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn
165 170 175 165 170 175
Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu
180 185 190 180 185 190
Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln
195 200 205 195 200 205
Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp Asp Ile Leu Val Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp Asp Ile Leu Val
210 215 220 210 215 220
Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp
225 230 235 240 225 230 235 240
Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Pro Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Pro
245 250 255 245 250 255
Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr Ala Val Ala Thr Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr Ala Val Ala Thr
260 265 270 260 265 270
Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser Ile His Asp Ser Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser Ile His Asp Ser
275 280 285 275 280 285
Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Asn Met Ala Asn Gly Asn Gly Tyr Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Asn Met Ala Asn Gly Asn Gly Tyr
290 295 300 290 295 300
Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn Val Ala Val Lys Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn Val Ala Val Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu
325 330 335 325 330 335
Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val
340 345 350 340 345 350
Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg
355 360 365 355 360 365
Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys
370 375 380 370 375 380
Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro
385 390 395 400 385 390 395 400
Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser
405 410 415 405 410 415
Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro
420 425 430 420 425 430
Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp
435 440 445 435 440 445
Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val
450 455 460 450 455 460
Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
485 490 495 485 490 495
Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr
500 505 510 500 505 510
Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp
515 520 525 515 520 525
Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Asn Cys Ser Ser Ala Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Asn Cys Ser Ser Ala
530 535 540 530 535 540
Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser Lys Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser Lys
545 550 555 560 545 550 555 560
Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg
565 570 575 565 570 575
Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu Leu Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu Leu
580 585 590 580 585 590
Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp Phe Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp Phe
595 600 605 595 600 605
Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser Gly Ala Leu Ala Ile Tyr Glu Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser Gly Ala Leu Ala
610 615 620 610 615 620
Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr Val Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr Val
625 630 635 640 625 630 635 640
Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile Ser Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile Ser
645 650 655 645 650 655
Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg
660 665 670 660 665 670
Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser Met Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser Met
675 680 685 675 680 685
Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser Gly Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser Gly
690 695 700 690 695 700
Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp
705 710 705 710
<210> 15<210> 15
<211> 481<211> 481
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: UGT85C2<223> Synthetic: UGT85C2
<400> 15<400> 15
Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln
20 25 30 20 25 30
Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe
35 40 45 35 40 45
Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly
50 55 60 50 55 60
Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu
85 90 95 85 90 95
Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp
100 105 110 100 105 110
Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile
115 120 125 115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu
130 135 140 130 135 140
Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu
145 150 155 160 145 150 155 160
Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr
165 170 175 165 170 175
Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu
195 200 205 195 200 205
Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His
210 215 220 210 215 220
Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu
245 250 255 245 250 255
Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu
260 265 270 260 265 270
His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu
275 280 285 275 280 285
Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr
290 295 300 290 295 300
Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile
325 330 335 325 330 335
Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys
340 345 350 340 345 350
Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His
355 360 365 355 360 365
Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile
370 375 380 370 375 380
Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly
405 410 415 405 410 415
Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val
420 425 430 420 425 430
Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys
435 440 445 435 440 445
Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser
450 455 460 450 455 460
Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg
465 470 475 480 465 470 475 480
Asn Asn
<210> 16<210> 16
<211> 460<211> 460
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: UGT74G1<223> Synthetic: UGT74G1
<400> 16<400> 16
Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys
20 25 30 20 25 30
Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His
35 40 45 35 40 45
Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile
50 55 60 50 55 60
Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser
85 90 95 85 90 95
Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp
100 105 110 100 105 110
Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile
115 120 125 115 120 125
Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val
130 135 140 130 135 140
Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu
165 170 175 165 170 175
Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser
180 185 190 180 185 190
Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val
195 200 205 195 200 205
Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr
210 215 220 210 215 220
Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu
245 250 255 245 250 255
Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro Tyr Lys Ala Asn His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro
260 265 270 260 265 270
Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly
275 280 285 275 280 285
Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val
290 295 300 290 295 300
Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp
325 330 335 325 330 335
Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val
340 345 350 340 345 350
Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val
355 360 365 355 360 365
Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys
370 375 380 370 375 380
Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu
385 390 395 400 385 390 395 400
Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile
405 410 415 405 410 415
Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp Met Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp
420 425 430 420 425 430
Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn
435 440 445 435 440 445
Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala
450 455 460 450 455 460
<210> 17<210> 17
<211> 485<211> 485
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: UGT91D_like3<223> Synthetic: UGT91D_like3
<400> 17<400> 17
Met Tyr Asn Val Thr Tyr His Gln Asn Ser Lys Ala Met Ala Thr Ser Met Tyr Asn Val Thr Tyr His Gln Asn Ser Lys Ala Met Ala Thr Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val Ala Thr Phe Pro Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val Ala Thr Phe Pro
20 25 30 20 25 30
Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln Leu Ser Lys Leu Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln Leu Ser Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser Thr Thr Arg Asn Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser Thr Thr Arg Asn
50 55 60 50 55 60
Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile Asn Val Val Gln Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile Asn Val Val Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp Ala Glu Ala Thr Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp Ala Glu Ala Thr
85 90 95 85 90 95
Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys Lys Ala Ser Asp Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys Lys Ala Ser Asp
100 105 110 100 105 110
Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln His Ser Pro Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln His Ser Pro Asp
115 120 125 115 120 125
Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro Ser Ile Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr Thr Pro Trp Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr Thr Pro Trp Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile Asn Gly Ser Asp Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile Asn Gly Ser Asp
165 170 175 165 170 175
Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro Lys Trp Phe Pro Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro Lys Trp Phe Pro
180 185 190 180 185 190
Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu Ala Arg Leu Val Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu Ala Arg Leu Val
195 200 205 195 200 205
Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg Met Gly Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg Met Gly Leu Val
210 215 220 210 215 220
Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr His Glu Phe Gly Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr His Glu Phe Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln Val Pro Val Val Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln Val Pro Val Val
245 250 255 245 250 255
Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp Glu Lys Asp Glu Pro Val Gly Leu Leu Pro Glu Ile Pro Gly Asp Glu Lys Asp Glu
260 265 270 260 265 270
Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ser Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys Gln Lys Gly Ser
275 280 285 275 280 285
Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Leu Val Ser Gln Thr Glu Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Leu Val Ser Gln Thr Glu
290 295 300 290 295 300
Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Leu Pro Phe Val Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Leu Pro Phe Val
305 310 315 320 305 310 315 320
Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser Asp Ser Val Glu Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser Asp Ser Val Glu
325 330 335 325 330 335
Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg Gly Leu Val Trp Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg Gly Leu Val Trp
340 345 350 340 345 350
Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His Glu Ser Val Cys Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His Glu Ser Val Cys
355 360 365 355 360 365
Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val Glu Gly Leu Met Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val Glu Gly Leu Met
370 375 380 370 375 380
Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Pro Leu Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Pro Leu
385 390 395 400 385 390 395 400
Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile Glu Ile Pro Arg Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile Glu Ile Pro Arg
405 410 415 405 410 415
Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val Ala Arg Ser Leu Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val Ala Arg Ser Leu
420 425 430 420 425 430
Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr Lys Ala Asn Ala Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr Lys Ala Asn Ala
435 440 445 435 440 445
Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val Glu Lys Glu Tyr Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val Glu Lys Glu Tyr
450 455 460 450 455 460
Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala Arg Ala Val Ala Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala Arg Ala Val Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Ile Asp His Glu Ser Ile Asp His Glu Ser
485 485
<210> 18<210> 18
<211> 458<211> 458
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: UGT76G1<223> Synthetic: UGT76G1
<400> 18<400> 18
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30 20 25 30
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45 35 40 45
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60 50 55 60
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95 85 90 95
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110 100 105 110
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125 115 120 125
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu
130 135 140 130 135 140
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
180 185 190 180 185 190
Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile
195 200 205 195 200 205
Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu
210 215 220 210 215 220
Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
245 250 255 245 250 255
Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro
260 265 270 260 265 270
Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp
275 280 285 275 280 285
Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln
290 295 300 290 295 300
Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val
325 330 335 325 330 335
Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala
340 345 350 340 345 350
Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu
355 360 365 355 360 365
Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn
370 375 380 370 375 380
Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val
405 410 415 405 410 415
Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln
420 425 430 420 425 430
Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu
435 440 445 435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu
450 455 450 455
<210> 19<210> 19
<211> 436<211> 436
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: UGT40087<223> Synthetic: UGT40087
<400> 19<400> 19
Met Asp Ala Ser Asp Ser Ser Pro Leu His Ile Val Ile Phe Pro Trp Met Asp Ala Ser Asp Ser Ser Pro Leu His Ile Val Ile Phe Pro Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Ala Phe Gly His Met Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Glu Arg Leu Leu Ala Phe Gly His Met Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Glu Arg Leu
20 25 30 20 25 30
Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile
35 40 45 35 40 45
Ser Arg Leu Arg Pro Val Pro Pro Ala Leu Ala Pro Leu Ile Asp Phe Ser Arg Leu Arg Pro Val Pro Pro Ala Leu Ala Pro Leu Ile Asp Phe
50 55 60 50 55 60
Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Thr Ser Asp Ile Pro Pro Gly Lys Thr Glu Leu His Leu Lys Ala Ala Thr Ser Asp Ile Pro Pro Gly Lys Thr Glu Leu His Leu Lys Ala
85 90 95 85 90 95
Leu Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Cys Leu Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Cys
100 105 110 100 105 110
Ala Asp Gly Ser Thr Asn Lys Val Asp Trp Leu Phe Leu Asp Asn Phe Ala Asp Gly Ser Thr Asn Lys Val Asp Trp Leu Phe Leu Asp Asn Phe
115 120 125 115 120 125
Gln Tyr Trp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp His Lys Ile Pro Cys Ala Gln Tyr Trp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp His Lys Ile Pro Cys Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Asn Leu Thr Phe Ala Ala Ser Thr Ser Ala Glu Tyr Gly Val Pro Leu Asn Leu Thr Phe Ala Ala Ser Thr Ser Ala Glu Tyr Gly Val Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Val Glu Pro Pro Val Asp Gly Ser Thr Ala Ser Ile Leu Gln Arg Arg Val Glu Pro Pro Val Asp Gly Ser Thr Ala Ser Ile Leu Gln Arg
165 170 175 165 170 175
Phe Val Leu Thr Leu Glu Lys Cys Gln Phe Val Ile Gln Arg Ala Cys Phe Val Leu Thr Leu Glu Lys Cys Gln Phe Val Ile Gln Arg Ala Cys
180 185 190 180 185 190
Phe Glu Leu Glu Pro Glu Pro Leu Pro Leu Leu Ser Asp Ile Phe Gly Phe Glu Leu Glu Pro Glu Pro Leu Pro Leu Leu Ser Asp Ile Phe Gly
195 200 205 195 200 205
Lys Pro Val Ile Pro Tyr Gly Leu Val Pro Pro Cys Pro Pro Ala Glu Lys Pro Val Ile Pro Tyr Gly Leu Val Pro Pro Cys Pro Pro Ala Glu
210 215 220 210 215 220
Gly His Lys Arg Glu His Gly Asn Ala Ala Leu Ser Trp Leu Asp Lys Gly His Lys Arg Glu His Gly Asn Ala Ala Leu Ser Trp Leu Asp Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Gln Gln Pro Glu Ser Val Leu Phe Ile Ala Leu Gly Ser Glu Pro Pro Gln Gln Pro Glu Ser Val Leu Phe Ile Ala Leu Gly Ser Glu Pro Pro
245 250 255 245 250 255
Val Thr Val Glu Gln Leu His Glu Ile Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Val Thr Val Glu Gln Leu His Glu Ile Ala Leu Gly Leu Glu Glu Leu Ala
260 265 270 260 265 270
Gly Thr Thr Phe Leu Trp Ala Leu Lys Lys Pro Asn Gly Leu Leu Leu Gly Thr Thr Phe Leu Trp Ala Leu Lys Lys Pro Asn Gly Leu Leu Leu
275 280 285 275 280 285
Glu Ala Asp Gly Asp Ile Leu Pro Pro Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Glu Ala Asp Gly Asp Ile Leu Pro Pro Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg
290 295 300 290 295 300
Asp Arg Gly Leu Val Ala Met Gly Trp Val Pro Gln Pro Ile Ile Leu Asp Arg Gly Leu Val Ala Met Gly Trp Val Pro Gln Pro Ile Ile Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala His Ser Ser Val Gly Ala Phe Leu Thr His Gly Gly Trp Ala Ser Ala His Ser Ser Val Gly Ala Phe Leu Thr His Gly Gly Trp Ala Ser
325 330 335 325 330 335
Thr Ile Glu Gly Val Met Ser Gly His Pro Met Leu Phe Leu Thr Phe Thr Ile Glu Gly Val Met Ser Gly His Pro Met Leu Phe Leu Thr Phe
340 345 350 340 345 350
Leu Asp Glu Gln Arg Ile Asn Ala Gln Leu Ile Glu Arg Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Arg Ile Asn Ala Gln Leu Ile Glu Arg Lys Lys Ala
355 360 365 355 360 365
Gly Leu Arg Val Pro Arg Arg Glu Lys Asp Gly Ser Tyr Asp Arg Gln Gly Leu Arg Val Pro Arg Arg Glu Lys Asp Gly Ser Tyr Asp Arg Gln
370 375 380 370 375 380
Gly Ile Ala Gly Ala Ile Arg Ala Val Met Cys Glu Glu Glu Ser Lys Gly Ile Ala Gly Ala Ile Arg Ala Val Met Cys Glu Glu Glu Ser Lys
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Val Phe Ala Ala Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Val Ser Asp Ser Val Phe Ala Ala Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Val Ser Asp
405 410 415 405 410 415
Arg Asn Cys Gln Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Ile Gln Arg Leu Gly Arg Asn Cys Gln Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Ile Gln Arg Leu Gly
420 425 430 420 425 430
Ser Phe Glu Lys Ser Phe Glu Lys
435 435
<210> 20<210> 20
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 20<400> 20
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 21<210> 21
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 21<400> 21
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 22<210> 22
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 22<400> 22
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 23<210> 23
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 23<400> 23
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 24<210> 24
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 24<400> 24
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 25<210> 25
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 25<400> 25
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 26<210> 26
<211> 4680<211> 4680
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 26<400> 26
atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60atgtcttcac tagaagtggt agatgggtgc ccctatggat accgaccata tccagatagt 60
ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120ggcacaaatg cattaaatcc atgttttata tcagtaatat ccgcctggca agccgtcttt 120
ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180ttcctattga ttggtagcta tcaattgtgg aaactttata agaacaataa agtaccaccc 180
agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240agatttaaga actttcctac attaccaagt aaaatcaaca gtcgacatct aacgcatttg 240
accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300accaatgttt gctttcagtc cacgcttata atttgtgaac tggccttggt atcccaatct 300
agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360agcgataggg tttatccatt tatactaaag aaggctctgt acttgaatct ccttttcaat 360
ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420ttgggtattt ctctccctac tcaatactta gcttatttta aaagtacatt ttcaatgggc 420
aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480aaccagcttt tctattacat gtttcaaatt cttctacagc tcttcttgat attgcagagg 480
tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540tactatcatg gttctagtaa cgaaaggctt actgttatta gcggacaaac tgctatgatt 540
ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600ttagaagtgc tccttctttt caattctgtg gcaattttta tttatgatct atgcattttt 600
gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660gagccaatta acgaattatc tgaatactac aagaaaaatg ggtggtatcc ccccgttcat 660
gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720gtactatcct atattacatt tatctggatg aacaaactga ttgtggaaac ttaccgtaac 720
aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780aagaaaatca aagatcctaa ccagttacca ttgccgccag tagatctgaa tattaagtcg 780
ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840ataagtaagg aatttaaggc taactgggaa ttggaaaaat ggttgaatag aaattctctt 840
tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900tggagggcca tttggaagtc atttggtagg actatttctg tggctatgct gtatgaaacg 900
acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960acatctgatt tactttctgt agtacagccc cagtttctac ggatattcat agatggtttg 960
aacccggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020aacccgggaaa catcttctaa atatcctcct ttaaatggtg tatttattgc tctaaccctt 1020
ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080ttcgtaatca gcgtggtttc tgtgttcctc accaatcaat tttatattgg aatttttgag 1080
gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140gctggtttgg ggataagagg ctctttagct tctttagtgt atcagaagtc cttaagattg 1140
acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200acgctagcag agcgtaacga aaaatctact ggtgacatct taaatttgat gtctgtggat 1200
gtgttaagga tccagcggtt tttcgaaaat gcccaaacca ttattggcgc tcctattcag 12601260
attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320attattgttg tattaacttc cctgtactgg ttgctaggaa aggctgttat tggagggttg 1320
gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380gttactatgg ctattatgat gcctatcaat gccttcttat ctagaaaggt aaaaaagcta 1380
tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440tcaaaaactc aaatgaagta taaggacatg agaatcaaga ctattacaga gcttttgaat 1440
gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500gctataaaat ctattaaatt atacgcctgg gaggaaccta tgatggcaag attgaatcat 1500
gttcgtaatg atatggagtt gaaaaatttt cggaaaattg gtatagtgag caatctgata 15601560
tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620tattttgcgt ggaattgtgt acctttaatg gtgacatgtt ccacatttgg cttattttct 1620
ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680ttatttagtg attctccgtt atctcctgcc attgtcttcc cttcattatc tttatttaat 1680
attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740attttgaaca gtgccatcta ttccgttcca tccatgataa ataccattat agagacaagc 1740
gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800gtttctatgg aaagattaaa gtcattccta cttagtgacg aaattgatga ttcgttcatc 1800
gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860gaacgtattg atccttcagc ggatgaaaga gcgttacctg ctatagagat gaataatatt 1860
acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920acatttttat ggaaatcaaa agaagtatta acatctagcc aatctggaga taatttgagg 1920
acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980acagatgaag agtctattat cggatcttct caaattgcgt tgaagaatat cgatcatttt 1980
gaagcaaaaa ggggtgattt agtttgtgtt gttggtcggg taggagctgg taaatcaaca 20402040
tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctaggga ctcgatacca 2100tttttgaagg caattcttgg tcaacttcct tgcatgagtg gttctagggga ctcgatacca 2100
cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160cctaaactga tcattagatc atcgtctgta gcctactgtt cacaagaatc ctggataatg 2160
aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220aacgcatctg taagagaaaa cattctattt ggtcacaagt tcgaccaaga ttattatgac 2220
ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280ctcactatta aagcatgtca attgctaccc gatttgaaaa tactaccaga tggtgatgaa 2280
actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340actttggtag gtgaaaaggg catttcccta tcaggcggtc agaaggcccg tctttcatta 2340
gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400gccagagcgg tgtactcgag agcagatatt tatttgttgg atgacatttt atctgctgtt 2400
gatgcagaag ttagtaaaaa tattattgaa tatgttttga tcggaaagac ggctttatta 24602460
aaaaataaaa caattatttt aactaccaat actgtatcaa ttttaaaaca ttcgcagatg 25202520
atatatgcgc tagaaaacgg tgaaattgtt gaacaaggga attatgagga tgtaatgaac 25802580
cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640cgtaagaaca atacttcaaa actgaaaaaa ttactagagg aatttgattc tccgattgat 2640
aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700aatggaaatg aaagcgatgt ccaaactgaa caccgatccg aaagtgaagt ggatgaacct 2700
ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760ctgcagctta aagtaactga atcagaaact gaggatgagg ttgttactga gagtgaatta 2760
gaactaatca aagccaattc tagaagagct tctctagcta cgctaagacc tagacccttt 28202820
gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880gtgggagcac aattggattc cgtgaagaaa acggcgcaaa aggccgagaa gacagaggtg 2880
ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940ggaagagtca aaacaaagat ttatcttgcg tatattaagg cttgtggagt tttaggtgtt 2940
gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000gttttatttt tcttgtttat gatattaaca agggttttcg acttagcaga gaatttttgg 3000
ttaaagtact ggtcagaatc taatgaaaaa aatggttcaa atgaaagggt ttggatgttt 30603060
gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120gttggtgtgt attccttaat cggagtagca tcggccgcat tcaataattt acggagtatt 3120
atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180atgatgctac tgtattgttc tattaggggt tctaagaaac tgcatgaaag catggccaaa 3180
tctgtaatta gaagtcctat gactttcttt gagactacac cagttggaag gatcataaac 32403240
aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300aggttctcat ctgatatgga tgcagtggac agtaatctac agtacatttt ctcctttttt 3300
ttcaaatcaa tactaaccta tttggttact gttatattag tcgggtacaa tatgccatgg 33603360
tttttagtgt tcaatatgtt tttggtggtt atctatattt actatcaaac attttacatt 34203420
gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480gtgctatcta gggagctaaa aagattgatc agtatatctt actctccgat tatgtcctta 3480
atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540atgagtgaga gcttgaacgg ttattctatt attgatgcat acgatcattt tgagagattc 3540
atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600atctatctaa attatgaaaa aatccaatac aacgttgatt ttgtcttcaa ctttagatca 3600
acgaatagat ggttatccgt gagattgcaa actattggtg ctacaattgt tttggctact 36603660
gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720gcaatcttag cactagcaac aatgaatact aaaaggcaac taagttcggg tatggttggt 3720
ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780ctactaatga gctattcatt agaggttaca ggttcattga cttggattgt aaggacaact 3780
gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840gtgacgattg aaaccaacat tgtatcagtg gagagaattg ttgagtactg cgaattacca 3840
cctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900ccctgaagcac agtccattaa ccctgaaaag aggccagatg aaaattggcc atcaaagggt 3900
ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960ggtattgaat tcaaaaacta ttccacaaaa tacagagaaa atttggatcc agtgctgaat 3960
aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020aatattaacg tgaagattga gccatgtgaa aaggttggga ttgttggcag aacaggtgca 4020
gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080gggaagtcta cactgagcct ggcattattt agaatactag aacctaccga aggtaaaatt 4080
attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140attattgacg gcattgatat atccgacata ggtctgttcg atttaagaag ccatttggca 4140
attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200attattcctc aggatgcaca agcttttgaa ggtacagtaa agaccaattt ggaccctttc 4200
aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260aatcgttatt cagaagatga acttaaaagg gctgttgagc aggcacattt aaagcctcat 4260
ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320ctggaaaaaa tgctgcacag taaaccaaga ggtgatgatt ctaatgaaga ggatggcaat 4320
gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380gttaatgata ttctggatgt caagattaat gagaacggta gtaacttgtc agtggggcaa 4380
agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440agacaactac tatgtttggc aagagcgctg ctaaaccgtt ccaaaatatt ggtccttgat 4440
gaagcaacgg cttctgtgga tatggaaacc gataaaatta tccaagacac tataagaaga 45004500
gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560gaatttaagg accgtaccat cttaacaatt gcacatcgta tcgacactgt attggacagt 4560
gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620gataagataa ttgttcttga ccagggtagt gtgagggaat tcgattcacc ctcgaaattg 4620
ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680ttatccgata aaacgtctat tttttacagt ctttgtgaga aaggtgggta tttgaaataa 4680
<210> 27<210> 27
<211> 4953<211> 4953
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: nucleic acid sequence<223> Synthetic: nucleic acid sequence
<400> 27<400> 27
atgtcaggtt caaattcgaa ttcaaatcta gatgcaataa gtgattcatg cccattttgg 60atgtcaggtt caaattcgaa ttcaaatcta gatgcaataa gtgattcatg cccattttgg 60
cgctatgatg atattacaga gtgtggaaga gtgcagtata tcaattacta ccttccaata 120cgctatgatg atattacaga gtgtggaaga gtgcagtata tcaattacta ccttccaata 120
acattggtag gcgtttctct cttgtattta ttcaaaaacg cgatccaaca ttattacaga 180acattggtag gcgtttctctcttgtattta ttcaaaaacg cgatccaaca ttattacaga 180
aagcctcaag aaattaagcc tagtgttgct tccgaattat tgggctcaaa tctcacagac 240aagcctcaag aaattaagcc tagtgttgct tccgaattat tgggctcaaa tctcacagac 240
cttccgaatg aaaacaagcc tttactatcg gagagtacac aagcattata cactaatccg 300cttccgaatg aaaacaagcc tttactatcg gagagtacac aagcattata cactaatccg 300
gattcgaata agacaggatt ctctctaaaa gaggagcatt tctctataaa taaagttaca 360gattcgaata agacaggatt ctctctaaaa gaggagcatt tctctataaa taaagttaca 360
cttacggaaa ttcattccaa taagcatgac gctgtgaaga tcgtaaggag aaactggctt 420cttacggaaa ttcattccaa taagcatgac gctgtgaaga tcgtaaggag aaactggctt 420
gaaaaattaa gagtgttctt agaatgggtt ctatgcgcct tacaactttg catctacatt 480gaaaaattaa gagtgttctt agaatggggtt ctatgcgcct tacaactttg catctacatt 480
tcagtctggt cgaaatacac taatacccaa gaggatttcc caatgcacgc atctatctca 540tcagtctggt cgaaatacac taatacccaa gaggatttcc caatgcacgc atctatctca 540
ggtctaatgt tatggtctct actcttgtta gtagtgtcat tgaggttggc aaacatcaac 600ggtctaatgt tatggtctct actcttgtta gtagtgtcat tgaggttggc aaacatcaac 600
cagaatataa gctggatcaa ttcaggaccg ggaaacttat gggccctttc atttgcatgt 660cagaatataa gctggatcaa ttcaggaccg ggaaacttat gggccctttc atttgcatgt 660
tatctatcac tattctgcgg atccgttttg ccattgagat ctatctatat cggtcatatc 720tatctatcac tattctgcgg atccgttttg ccattgagat ctatctatat cggtcatatc 720
acagatgaaa ttgcatcaac attttataag ttgcaatttt acctaagttt gacactattc 780acagatgaaa ttgcatcaac attttataag ttgcaatttt acctaagttt gacactattc 780
ttgttacttt tcacctctca agcgggaaat cggtttgcca ttatctataa aagtacacca 840ttgttacttt tcacctctca agcgggaaat cggtttgcca ttatctataa aagtacacca 840
gatataacac cgtctcctga acctattgtg tcgattgcaa gttatatcac ttgggcatgg 900gatataacac cgtctcctga acctattgtg tcgattgcaa gttatatcac ttgggcatgg 900
gtagataaat ttctttggaa agcgcatcaa aattatatcg aaatgaaaga tgtttggggt 960gtagataaat ttctttggaa agcgcatcaa aattatatcg aaatgaaaga tgtttggggt 960
ctaatggtgg aagactattc cattctcgta ataaagagat tcaatcattt tgttcagaat 1020ctaatggtgg aagactattc cattctcgta ataaagagat tcaatcattt tgttcagaat 1020
aaaaccaagt ctaggacatt ttcatttaac ttaatccact ttttcatgaa atttatcgcc 1080aaaaccaagt ctaggacatt ttcatttaac ttaatccact ttttcatgaa atttatcgcc 1080
attcaaggtg cctgggcaac aatttcgtca gttattagtt ttgttccaac aatgttgctc 1140attcaaggtg cctgggcaac aatttcgtca gttattagtt ttgttccaac aatgttgctc 1140
agacgtattt tggagtatgt tgaagatcaa tcaactgctc cattaaattt ggcttggatg 1200agacgtattt tggagtatgt tgaagatcaa tcaactgctc cattaaattt ggcttggatg 1200
tatatttttc ttatgttcct tgccagaatt ttaactgcca tatgtgctgc tcaggcgcta 1260tatatttttc ttatgttcct tgccagaatt ttaactgcca tatgtgctgc tcaggcgcta 1260
tttttaggga gaagggtttg tatcagaatg aaggctatca taatttctga aatctactcc 1320tttttagggga gaagggtttg tatcagaatg aaggctatca taatttctga aatctactcc 1320
aaggctttga gaagaaaaat ttctccaaat tccactaagg agccaactga tgtcgttgat 13801380
ccacaggaat taaatgacaa acaacacgtt gatggagatg aagaatcagc aaccactgca 1440ccacaggaat taaatgacaa acaacacgtt gatggagatg aagaatcagc aaccactgca 1440
aatcttggtg ctatcattaa tttgatggcg gtggatgctt tcaaagtatc cgaaatatgt 1500aatcttggtg ctatcattaa tttgatggcg gtggatgctt tcaaagtatc cgaaatatgt 1500
gcgtatttgc actcctttat agaggcgatc atcatgacca ttgttgcatt attcctttta 15601560
tatcggttaa taggctggtc tgctttagtt ggtagtgcaa tgattatttg cttcttacca 1620tatcggttaa taggctggtc tgctttagtt ggtagtgcaa tgattatttg cttcttacca 1620
ttgaacttca aacttgccag cttgttaggg acactccaaa agaaatcctt ggcaatcaca 1680ttgaacttca aacttgccag cttgttaggg acactccaaa agaaatcctt ggcaatcaca 1680
gataaaagaa ttcagaaact aaacgaagct ttccaggcca ttcgtattat caaattcttc 1740gataaaagaa ttcagaaact aaacgaagct ttccaggcca ttcgtattat caaattcttc 1740
tcttgggaag agaattttga aaaggacata caaaacacaa gggatgaaga attaaatatg 1800tcttgggaag agaattttga aaaggacata caaaacacaa gggatgaaga attaaatatg 1800
cttttaaaaa ggtctatcgt ttgggctctt tcttctcttg tttggttcat taccccctct 1860cttttaaaaa ggtctatcgt ttgggctctt tcttctcttg tttggttcat taccccctct 1860
attgtcacat ccgcttcttt tgcagtctat atttatgtgc aaggccaaac tttaactact 1920attgtcacat ccgcttcttt tgcagtctat atttatgtgc aaggccaaac tttaactact 1920
ccggtagcat ttactgcact atctctattt gctctactaa gaaatccgtt agacatgctt 1980ccggtagcat ttactgcact atctctattt gctctactaa gaaatccgtt agacatgctt 1980
tctgatatgt tgtcttttgt tattcaatcc aaggtctctt tggatagagt ccaagaattt 2040tctgatatgt tgtcttttgt tattcaatcc aaggtctctt tggatagagt ccaagaattt 2040
ttaaatgaag aggagacgaa aaagtatgag caattaaccg tatcaagaaa taaacttggg 2100ttaaatgaag aggagacgaa aaagtatgag caattaaccg tatcaagaaa taaacttggg 2100
ttgcaaaacg ctacttttac atgggataaa aataatcaag atttcaagtt aaaaaaccta 2160ttgcaaaacg ctacttttac atgggataaa aataatcaag atttcaagtt aaaaaaccta 2160
actattgatt tcaaaattgg gaaattaaac gttattgtag gtccaactgg atctggtaaa 2220actattgatt tcaaaattgg gaaattaaac gttattgtag gtccaactgg atctggtaaa 2220
acatcattgt taatgggatt attgggtgaa atggagctat tgaacggaaa agttttcgtc 2280acatcattgt taatgggatt attgggtgaa atggagctat tgaacggaaa agttttcgtc 2280
ccttcgctca atcctaggga agagttggtt gtagaggccg atggaatgac taattcaatc 2340ccttcgctca atcctaggga agagttggtt gtagaggccg atggaatgac taattcaatc 2340
gcgtactgct cccaagctgc ctggttgcta aatgatactg tcaggaacaa tattctattc 2400gcgtactgct cccaagctgc ctggttgcta aatgatactg tcaggaacaa tattctattc 2400
aatgcgcctt ataatgagaa tagatataat gccgtcatct ctgcgtgtgg tttgaaacgc 2460aatgcgcctt ataatgagaa tagatataat gccgtcatct ctgcgtgtgg tttgaaacgc 2460
gacttcgaga tcttaagcgc tggtgatcag acagagattg gcgaaaaggg tataacactt 2520gacttcgaga tcttaagcgc tggtgatcag acagagattg gcgaaaaggg tataacactt 2520
tctggtggtc aaaaacaaag agtctcgttg gccagatcat tgtattcttc atcaagacat 2580tctggtggtc aaaaacaaag agtctcgttg gccagatcat tgtattcttc atcaagacat 2580
ttgctgttag atgattgttt gagtgccgta gactcgcaca cggccttatg gatctacgaa 2640ttgctgttag atgattgttt gagtgccgta gactcgcaca cggccttatg gatctacgaa 2640
aattgtataa caggcccatt aatggaagga agaacatgtg tattggtttc tcacaatgtt 2700aattgtataa caggcccatt aatggaagga agaacatgtg tattggtttc tcacaatgtt 2700
gcattaactt taaaaaatgc agattgggtt atcattatgg aaaatggtag agtaaaagaa 27602760
caaggcgaac cagtagaatt gctacagaag gggtcccttg gggatgactc catggtgaaa 2820caaggcgaac cagtagaatt gctacagaag gggtcccttg gggatgactc catggtgaaa 2820
tcatcaattt tgtcccgtac ggcgtcctca gttaatattt cagaaactaa cagtaagatt 2880tcatcaattt tgtcccgtac ggcgtcctca gttaatattt cagaaactaa cagtaagatt 2880
tctagtggtc cgaaggctcc agcggaatcg gataatgcca atgaggagtc caccacctgt 2940tctagtggtc cgaaggctcc agcggaatcg gataatgcca atgaggagtc caccacctgt 2940
ggagatcgtt caaagtcaag cggcaagcta atcgctgaag aaacaaaatc aaacggtgtt 3000ggagatcgtt caaagtcaag cggcaagcta atcgctgaag aaacaaaatc aaacggtgtt 3000
gtttccctgg acgtctataa gtggtatgcc gtgtttttcg gtggatggaa gatgatatca 3060gtttccctgg acgtctataa gtggtatgcc gtgtttttcg gtggatggaa gatgatatca 3060
tttttgtgtt tcattttctt gtttgcccaa atgatcagta tttcacaggc ctggtggttg 3120tttttgtgtt tcattttctt gtttgcccaa atgatcagta tttcacaggc ctggtggttg 3120
cgtgcttggg cctccaacaa cactctaaaa gttttctcca accttggatt gcaaacaatg 3180cgtgcttggg cctccaacaa cactctaaaa gttttctcca accttggatt gcaaacaatg 3180
aggccattcg ctttgtcctt acaaggaaaa gaagcttctc ctgtgactct tagtgctgtt 3240aggccattcg ctttgtcctt acaaggaaaa gaagcttctc ctgtgactct tagtgctgtt 3240
ttcccaaatg gcagtctaac aacagccacg gaaccaaatc actcgaacgc gtattatcta 3300ttcccaaatg gcagtctaac aacagccacg gaaccaaatc actcgaacgc gtattatcta 3300
tcaatatatt tgggtattgg tgtattccag gctttatgtt catcttcgaa agcaattata 33603360
aactttgtgg ccggtattag agcttccagg aaaatattca atttattgtt gaaaaatgtg 34203420 aactttgtgg ccggtattag agcttccagg
ttatacgcca agctgagatt ttttgattct actccaatag gaagaataat gaacagattt 34803480
tctaaagaca tcgaatcaat agatcaagaa ttgactcctt atatggaagg tgcatttggt 3540tctaaagaca tcgaatcaat agatcaagaa ttgactcctt atatggaagg tgcatttggt 3540
tccttaatac aatgtgtttc cacaattatc gtcattgcat acattactcc ccaatttttg 3600tccttaatac aatgtgtttc cacaattatc gtcattgcat acattactcc ccaatttttg 3600
attgtcgcgg cgattgtcat gttattgttt tattttgttg cctactttta catgtcagga 3660attgtcgcgg cgattgtcat gttattgttt tattttgttg cctactttta catgtcagga 3660
gcaagagaat taaagcgtct tgaatcgatg tcacgctctc ctattcatca gcacttctct 3720gcaagagaat taaagcgtct tgaatcgatg tcacgctctc ctattcatca gcacttctct 3720
gagactcttg tgggtatcac gactattcga gcattttctg acgagcggcg ttttctggtt 3780gagactcttg tgggtatcac gactattcga gcattttctg acgagcggcg ttttctggtt 3780
gataatatga agaaaattga tgataataat aggcctttct tttacttatg ggtctgtaat 38403840
agatggctat cttacagaat cgagctgata ggcgccctta ttgttttggc tgcaggtagt 3900agatggctat cttacagaat cgagctgata ggcgccctta ttgttttggc tgcaggtagt 3900
ttcatcttat tgaacataaa atcgatcgat tctggtttgg ccggtatttc attgggtttc 3960ttcatcttat tgaacataaa atcgatcgat tctggtttgg ccggtatttc attgggtttc 3960
gctatacaat ttaccgatgg tgccctttgg gttgttaggt tatattccaa cgttgaaatg 4020gctatacaat ttaccgatgg tgccctttgg gttgttaggt tatattccaa cgttgaaatg 4020
aatatgaatt ccgtcgaaag gttaaaagag tacaccacca tcgagcaaga accttctaac 4080aatatgaatt ccgtcgaaag gttaaaagag tacaccacca tcgagcaaga accttctaac 4080
gttggtgcct tggtacctcc ttgcgaatgg ccacaaaatg gtaaaatcga agtcaaggat 4140gttggtgcct tggtacctcc ttgcgaatgg ccacaaaatg gtaaaatcga agtcaaggat 4140
ttatctttac gctatgcagc tggtctacca aaggttataa aaaatgtcac attcaccgtc 4200ttatctttac gctatgcagc tggtctacca aaggttataa aaaatgtcac attcaccgtc 4200
gattcaaagt gtaaagtagg tattgttggc aggactggtg ctggtaaatc tactattatc 4260gattcaaagt gtaaagtagg tattgttggc aggactggtg ctggtaaatc tactattatc 4260
acagcccttt tcagattctt agaccctgaa actggttata tcaaaatcga tgacgttgat 4320acagcccttt tcagattctt agaccctgaa actggttata tcaaaatcga tgacgttgat 4320
ataacaacca ttggtttaaa acgtttgcgc caatctatca ctattattcc acaggaccca 4380ataacaacca ttggtttaaa acgtttgcgc caatctatca ctattattcc acaggaccca 4380
acccttttca ccggtacttt gaaaaccaat ctcgatccat acaacgaata ttcggaagct 4440acccttttca ccggtacttt gaaaaccaat ctcgatccat acaacgaata ttcggaagct 4440
gaaattttcg aagctctaaa acgtgtcaac cttgtttcct cagaagaact tggtaatcct 4500gaaattttcg aagctctaaa acgtgtcaac cttgtttcct cagaagaact tggtaatcct 4500
tctacttcgg attcaacctc ggtacattca gcaaatatga ataagttttt ggatttggaa 4560tctacttcgg attcaacctc ggtacattca gcaaatatga ataagttttt ggatttggaa 4560
aatgaagtca gtgaaggtgg ttccaacctc tcacaaggac aacgtcaatt gatatgtttg 4620aatgaagtca gtgaaggtgg ttccaacctc tcacaaggac aacgtcaatt gatatgtttg 4620
gcccgttcat tattgcggtg tccaaaggta attctacttg atgaagccac agcttcaatc 4680gcccgttcat tattgcggtg tccaaaggta attctacttg atgaagccac agcttcaatc 4680
gattataact cagactctaa aatccaggct actataaggg aagaattcag taatagtacc 4740gattataact cagactctaa aatccaggct actataaggg aagaattcag taatagtacc 4740
attctcacga ttgctcatcg tttacgatca attattgatt atgataaaat acttgttatg 4800attctcacga ttgctcatcg tttacgatca attattgatt atgataaaat acttgttatg 4800
gatgctgggg aggttaaaga atatgatcat ccttactcct tattgttgaa tcgtgatagt 4860gatgctgggg aggttaaaga atatgatcat ccttactcct tattgttgaa tcgtgatagt 4860
atattctatc atatgtgtga agatagtgga gaattagaag tcttgataca attagccaaa 4920atattctatc atatgtgtga agatagtgga gaattagaag tcttgataca attagccaaa 4920
gaatcatttg tcaaaaagct caatgcaaat tga 4953gaatcatttg tcaaaaagct caatgcaaat tga 4953
<210> 28<210> 28
<211> 1381<211> 1381
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Fungal_5_muA<223> Synthetic: Fungal_5_muA
<400> 28<400> 28
Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe
20 25 30 20 25 30
Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp
50 55 60 50 55 60
Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala
100 105 110 100 105 110
Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn
115 120 125 115 120 125
Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe
130 135 140 130 135 140
Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val
165 170 175 165 170 175
Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly
180 185 190 180 185 190
Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile
195 200 205 195 200 205
Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala
210 215 220 210 215 220
Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr
245 250 255 245 250 255
Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile
260 265 270 260 265 270
Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn
275 280 285 275 280 285
Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile
290 295 300 290 295 300
Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu
325 330 335 325 330 335
Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro
370 375 380 370 375 380
Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val
405 410 415 405 410 415
Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp
450 455 460 450 455 460
Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe
465 470 475 480 465 470 475 480
Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu
485 490 495 485 490 495
Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser
500 505 510 500 505 510
Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys
515 520 525 515 520 525
Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly
530 535 540 530 535 540
Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu
545 550 555 560 545 550 555 560
Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly
565 570 575 565 570 575
Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys
580 585 590 580 585 590
Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg
595 600 605 595 600 605
Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met
610 615 620 610 615 620
Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala
645 650 655 645 650 655
Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly
675 680 685 675 680 685
Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala
690 695 700 690 695 700
Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met
725 730 735 725 730 735
Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala
740 745 750 740 745 750
Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln
755 760 765 755 760 765
Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Arg Ala Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Glu Arg Ala
770 775 780 770 775 780
Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly
785 790 795 800 785 790 795 800
Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu
805 810 815 805 810 815
Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe
820 825 830 820 825 830
Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly
835 840 845 835 840 845
Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu
850 855 860 850 855 860
Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn
865 870 875 880 865 870 875 880
Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp
885 890 895 885 890 895
Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp
900 905 910 900 905 910
Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro
915 920 925 915 920 925
Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro
930 935 940 930 935 940
Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Pro Phe Thr Phe Ile Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Pro Phe Thr Phe Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala
965 970 975 965 970 975
Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly
980 985 990 980 985 990
Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys
995 1000 1005 995 1000 1005
Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys
1115 1120 1125 1115 1120 1125
His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Val Phe Ser His Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Val Phe Ser His
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val
1370 1375 1380 1370 1375 1380
<210> 29<210> 29
<211> 1381<211> 1381
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Fungal_5_muA2<223> Synthetic: Fungal_5_muA2
<400> 29<400> 29
Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe
20 25 30 20 25 30
Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp
50 55 60 50 55 60
Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala
100 105 110 100 105 110
Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn
115 120 125 115 120 125
Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe
130 135 140 130 135 140
Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val
165 170 175 165 170 175
Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly
180 185 190 180 185 190
Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile
195 200 205 195 200 205
Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala
210 215 220 210 215 220
Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr
245 250 255 245 250 255
Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile
260 265 270 260 265 270
Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn
275 280 285 275 280 285
Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile
290 295 300 290 295 300
Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu
325 330 335 325 330 335
Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro
370 375 380 370 375 380
Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val
405 410 415 405 410 415
Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp
450 455 460 450 455 460
Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe
465 470 475 480 465 470 475 480
Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu
485 490 495 485 490 495
Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser
500 505 510 500 505 510
Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys
515 520 525 515 520 525
Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly
530 535 540 530 535 540
Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu
545 550 555 560 545 550 555 560
Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly
565 570 575 565 570 575
Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys
580 585 590 580 585 590
Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg
595 600 605 595 600 605
Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met
610 615 620 610 615 620
Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala
645 650 655 645 650 655
Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly
675 680 685 675 680 685
Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala
690 695 700 690 695 700
Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met
725 730 735 725 730 735
Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala
740 745 750 740 745 750
Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln
755 760 765 755 760 765
Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Arg Ala Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Glu Arg Ala
770 775 780 770 775 780
Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly
785 790 795 800 785 790 795 800
Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu
805 810 815 805 810 815
Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe
820 825 830 820 825 830
Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly
835 840 845 835 840 845
Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu
850 855 860 850 855 860
Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn
865 870 875 880 865 870 875 880
Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp
885 890 895 885 890 895
Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp
900 905 910 900 905 910
Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro
915 920 925 915 920 925
Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro
930 935 940 930 935 940
Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Pro Phe Thr Phe Ile Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Pro Phe Thr Phe Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala
965 970 975 965 970 975
Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly
980 985 990 980 985 990
Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys
995 1000 1005 995 1000 1005
Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys
1115 1120 1125 1115 1120 1125
His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val
1370 1375 1380 1370 1375 1380
<210> 30<210> 30
<211> 1381<211> 1381
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Synthetic: Fungal_5_muA3<223> Synthetic: Fungal_5_muA3
<400> 30<400> 30
Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp Met Thr Ser Pro Gly Ser Glu Lys Cys Thr Pro Arg Ser Asp Glu Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe Leu Glu Arg Ser Glu Pro Gln Leu Gln Arg Arg Leu Leu Thr Pro Phe
20 25 30 20 25 30
Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys Leu Leu Ser Lys Lys Val Pro Pro Ile Pro Lys Glu Asp Glu Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp Pro Tyr Pro Tyr Leu Lys Thr Asn Pro Leu Ser Gln Ile Leu Phe Trp
50 55 60 50 55 60
Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro Trp Leu Asn Pro Leu Leu Arg Val Gly Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr Asn Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu His Ser Gln Asp Ile Glu Thr Thr Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala Ser Asn Tyr Glu Met His Leu Ala Arg Ile Leu Glu Lys Asp Arg Ala
100 105 110 100 105 110
Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn Lys Ala Arg Ala Lys Asp Pro Thr Leu Thr Asp Glu Asp Leu Lys Asn
115 120 125 115 120 125
Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe Arg Glu Tyr Pro Lys Asn Ala Val Ile Lys Ala Leu Phe Leu Thr Phe
130 135 140 130 135 140
Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile Lys Trp Lys Tyr Leu Trp Ser Ile Phe Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ile
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val Val Leu Val Leu Asn Pro Leu Leu Ser Lys Ala Leu Ile Asn Phe Val
165 170 175 165 170 175
Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly Asp Glu Lys Met Tyr Asn Pro Asp Met Ser Val Gly Arg Gly Val Gly
180 185 190 180 185 190
Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile Tyr Ala Ile Gly Val Thr Phe Met Leu Gly Thr Ser Gly Ile Leu Ile
195 200 205 195 200 205
Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala Asn His Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Thr Val Gly Ala His Cys Lys Ala
210 215 220 210 215 220
Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Met Asn Lys Ser Phe Arg Ala Ser Ala Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr Ser Lys His Glu Tyr Pro Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Met Ser Thr
245 250 255 245 250 255
Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile Asp Leu Ala Arg Ile Asp Leu Ala Ile Gly Phe Gln Pro Phe Ala Ile
260 265 270 260 265 270
Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn Thr Val Pro Val Pro Ile Gly Val Ala Ile Ala Leu Leu Ile Val Asn
275 280 285 275 280 285
Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile Ile Gly Val Ser Ala Leu Ala Gly Ile Ala Val Phe Leu Val Cys Ile
290 295 300 290 295 300
Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly Val Val Ile Ser Ala Ser Ser Lys Ser Leu Leu Lys Met Arg Lys Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu Ala Asn Gln Tyr Thr Asp Ala Arg Ile Ser Tyr Met Arg Glu Ile Leu
325 330 335 325 330 335
Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu Gln Asn Met Arg Ile Ile Lys Phe Tyr Ser Trp Glu Asp Ala Tyr Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys Lys Ser Val Val Thr Glu Arg Asn Ser Glu Met Ser Ile Ile Leu Lys
355 360 365 355 360 365
Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro Met Gln Ser Ile Arg Asn Phe Leu Leu Ala Leu Ser Leu Ser Leu Pro
370 375 380 370 375 380
Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn Ala Ile Ile Ser Met Val Ala Phe Leu Val Leu Tyr Gly Val Ser Asn
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val Asp Lys Asn Pro Gly Asn Ile Phe Ser Ser Ile Ser Leu Phe Ser Val
405 410 415 405 410 415
Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Gln Gln Thr Met Met Leu Pro Met Ala Leu Ala Thr Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly Asp Ala Lys Ile Gly Leu Glu Arg Leu Arg Gln Tyr Leu Gln Ser Gly
435 440 445 435 440 445
Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp Asp Ile Glu Lys Glu Tyr Glu Asp His Glu Lys Pro Gly Asp Arg Asp
450 455 460 450 455 460
Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe Val Val Leu Pro Asp Asn Val Ala Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Phe
465 470 475 480 465 470 475 480
Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu Ile Trp Glu Lys Phe Asp Asp Ala Asp Asp Asn Asp Gly Asn Ser Glu
485 490 495 485 490 495
Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser Lys Thr Lys Glu Val Val Val Thr Ser Lys Ser Ser Leu Thr Asp Ser
500 505 510 500 505 510
Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys Ser His Ile Asp Lys Ser Thr Asp Ser Ala Asp Gly Glu Tyr Ile Lys
515 520 525 515 520 525
Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly Ser Val Phe Glu Gly Phe Asn Asn Ile Asn Leu Thr Ile Lys Lys Gly
530 535 540 530 535 540
Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Glu Phe Val Ile Ile Thr Gly Pro Ile Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu
545 550 555 560 545 550 555 560
Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly Leu Val Ala Leu Ala Gly Phe Met Lys Lys Thr Ser Gly Thr Leu Gly
565 570 575 565 570 575
Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys Val Asn Gly Thr Met Leu Leu Cys Gly Gln Pro Trp Val Gln Asn Cys
580 585 590 580 585 590
Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg Thr Val Arg Asp Asn Ile Leu Phe Gly Leu Glu Tyr Asp Glu Ala Arg
595 600 605 595 600 605
Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met Tyr Asp Arg Val Val Glu Val Cys Ala Leu Gly Asp Asp Leu Lys Met
610 615 620 610 615 620
Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu Phe Thr Ala Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Thr Leu
625 630 635 640 625 630 635 640
Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala Ser Gly Gly Gln Lys Ala Arg Ile Asn Leu Ala Arg Ala Val Tyr Ala
645 650 655 645 650 655
Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala Asn Lys Asp Ile Ile Leu Leu Asp Asp Ala Leu Ser Ala Val Asp Ala
660 665 670 660 665 670
Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly Arg Val Gly Lys Leu Ile Val Asp Asp Cys Leu Thr Ser Phe Leu Gly
675 680 685 675 680 685
Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala Asp Lys Thr Arg Ile Leu Ala Thr His Gln Leu Ser Leu Ile Glu Ala
690 695 700 690 695 700
Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly Ala Asp Arg Val Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Ile His Ile Gly
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met Thr Val Gln Glu Leu Leu Glu Ser Asn Glu Gly Phe Leu Lys Leu Met
725 730 735 725 730 735
Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala Glu Phe Ser Arg Lys Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Asp Val Glu Ala
740 745 750 740 745 750
Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln Ala Asn Glu Lys Asp Val Ser Leu Gln Lys Ala Val Ser Val Val Gln
755 760 765 755 760 765
Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Arg Ala Glu Gln Asp Ala His Ala Gly Val Leu Ile Gly Gln Glu Glu Glu Arg Ala
770 775 780 770 775 780
Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly Val Asn Gly Ile Glu Trp Asp Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu His Glu Gly
785 790 795 800 785 790 795 800
Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu Arg Gly Lys Leu Gly Ile Phe Ala Ile Pro Thr Ile Ile Met Leu Leu
805 810 815 805 810 815
Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe Val Leu Asp Val Phe Thr Ser Ile Phe Val Asn Val Trp Leu Ser Phe
820 825 830 820 825 830
Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly Trp Ile Ser His Lys Phe Lys Ala Arg Ser Asp Gly Phe Tyr Ile Gly
835 840 845 835 840 845
Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu Leu Tyr Val Met Phe Val Ile Leu Ser Val Ile Trp Ile Thr Ala Glu
850 855 860 850 855 860
Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn Phe Val Val Met Gly Asn Phe Ser Ser Thr Ala Ala Arg Arg Leu Asn
865 870 875 880 865 870 875 880
Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp Leu Lys Ala Met Lys Arg Val Leu His Thr Pro Met His Phe Leu Asp
885 890 895 885 890 895
Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Leu Asn Arg Phe Thr Lys Asp Thr Asp
900 905 910 900 905 910
Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro Val Leu Asp Asn Glu Ile Gly Glu Gln Ala Arg Met Phe Leu His Pro
915 920 925 915 920 925
Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro Ala Ala Tyr Val Ile Gly Val Leu Ile Leu Cys Ile Ile Asn Ile Pro
930 935 940 930 935 940
Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Leu Phe Thr Phe Ile Trp Phe Ala Ile Ala Ile Pro Pro Leu Ala Ile Leu Phe Thr Phe Ile
945 950 955 960 945 950 955 960
Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala Thr Asn Phe Tyr Ile Ala Ser Ser Arg Glu Val Lys Arg Ile Glu Ala
965 970 975 965 970 975
Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly Ile Gln Arg Ser Leu Val Tyr Asn Asn Phe Asn Glu Val Leu Asn Gly
980 985 990 980 985 990
Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys Leu Gln Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Ala Thr Ser Arg Phe Met Glu Lys
995 1000 1005 995 1000 1005
Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val Asn Lys Arg Leu Leu Asn Arg Met Asn Glu Ala Tyr Leu Leu Val
1010 1015 1020 1010 1015 1020
Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser Ile Ala Asn Gln Arg Trp Ile Ser Val Asn Leu Asp Leu Val Ser
1025 1030 1035 1025 1030 1035
Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Phe Leu Ile Ser Met Leu Ser Val Phe Arg Val
1040 1045 1050 1040 1045 1050
Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val Phe Asp Ile Asn Ala Ser Ser Val Gly Leu Val Val Thr Ser Val
1055 1060 1065 1055 1060 1065
Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Leu Met Ser Leu Ile Met Arg Ala Tyr Thr
1070 1075 1080 1070 1075 1080
Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr Thr Val Glu Asn Glu Met Asn Ser Val Glu Arg Leu Cys His Tyr
1085 1090 1095 1085 1090 1095
Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr Ala Asn Lys Leu Glu Gln Glu Ala Pro Tyr Ile Met Asn Glu Thr
1100 1105 1110 1100 1105 1110
Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys Lys Pro Arg Pro Thr Trp Pro Glu His Gly Ala Ile Glu Phe Lys
1115 1120 1125 1115 1120 1125
His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys His Ala Ser Met Arg Tyr Arg Glu Gly Leu Pro Leu Val Leu Lys
1130 1135 1140 1130 1135 1140
Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys Asp Leu Thr Ile Ser Val Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Ile Cys
1145 1150 1155 1145 1150 1155
Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Tyr
1160 1165 1170 1160 1165 1170
Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val Arg Leu Thr Glu Leu Ala Glu Gly Ser Ile Thr Ile Asp Gly Val
1175 1180 1185 1175 1180 1185
Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala Glu Ile Ser Gln Leu Gly Leu Tyr Asp Leu Arg Ser Lys Leu Ala
1190 1195 1200 1190 1195 1200
Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys Ile Ile Pro Gln Asp Pro Val Leu Phe Arg Gly Thr Ile Arg Lys
1205 1210 1215 1205 1210 1215
Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gln Asn Asp Asp Glu Thr Leu Trp Asp
1220 1225 1230 1220 1225 1230
Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr Ala Leu Arg Arg Ser Gly Leu Val Glu Gly Ser Ile Leu Asn Thr
1235 1240 1245 1235 1240 1245
Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His Ile Lys Ser Gln Ser Lys Asp Asp Pro Asn Phe His Lys Phe His
1250 1255 1260 1250 1255 1260
Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly Leu Asp Gln Thr Val Glu Asp Glu Gly Ala Asn Phe Ser Leu Gly
1265 1270 1275 1265 1270 1275
Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser Glu Arg Gln Leu Ile Ala Leu Ala Arg Ala Leu Val Arg Asn Ser
1280 1285 1290 1280 1285 1290
Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu Lys Ile Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ser Val Asp Tyr Glu
1295 1300 1305 1295 1300 1305
Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His Thr Asp Ser Lys Ile Gln Lys Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ser His
1310 1315 1320 1310 1315 1320
Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr Cys Thr Ile Leu Cys Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Thr
1325 1330 1335 1325 1330 1335
Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe Tyr Asp Arg Ile Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu Val Glu Glu Phe
1340 1345 1350 1340 1345 1350
Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln Asp Thr Pro Arg Val Leu Tyr Ser Lys Asn Gly Val Phe Arg Gln
1355 1360 1365 1355 1360 1365
Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val Met Cys Glu Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Asp Phe Val
1370 1375 1380 1370 1375 1380
<---<---
Claims (36)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/796,228 | 2019-01-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021124655A RU2021124655A (en) | 2023-02-27 |
RU2795855C2 true RU2795855C2 (en) | 2023-05-12 |
Family
ID=
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008034648A1 (en) * | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
WO2016055578A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Steviol glycoside production |
WO2017025362A1 (en) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
RU2016120635A (en) * | 2013-11-01 | 2017-12-06 | Конаджен Инк. | RECOMBINANT PRODUCTION OF STEVIOL-GLYCOSIDES |
WO2018031955A2 (en) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | Amyris, Inc. | Udp-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides |
US10017804B2 (en) * | 2013-02-11 | 2018-07-10 | Evolva Sa | Efficient production of steviol glycosides in recombinant hosts |
WO2018211032A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008034648A1 (en) * | 2006-04-05 | 2008-03-27 | Metanomics Gmbh | Process for the production of a fine chemical |
US10017804B2 (en) * | 2013-02-11 | 2018-07-10 | Evolva Sa | Efficient production of steviol glycosides in recombinant hosts |
RU2016120635A (en) * | 2013-11-01 | 2017-12-06 | Конаджен Инк. | RECOMBINANT PRODUCTION OF STEVIOL-GLYCOSIDES |
WO2016055578A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Steviol glycoside production |
WO2017025362A1 (en) * | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
WO2018031955A2 (en) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | Amyris, Inc. | Udp-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides |
WO2018211032A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11866738B2 (en) | UDP-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides | |
JP7487099B2 (en) | Pea (Pisum sativum) kaurene oxidase for highly efficient production of rebaudioside | |
JP7518838B2 (en) | ABC transporters for highly efficient production of rebaudioside | |
RU2795855C2 (en) | Abc transporters for highly efficient production of rebaudiosides | |
US20210371892A1 (en) | Stevia rebaudiana kaurenoic acid hydroxylase variants for high efficiency production of rebaudiosides | |
US12065685B1 (en) | UDP-glycosyltransferase variants and uses thereof | |
RU2795550C2 (en) | Application of pisum sativum kaurenoxidase for highly efficient production of rebaudiosides | |
RU2777901C2 (en) | Udp-dependent glycosyl transferase for highly effective production of rebaudiosides | |
US20220282228A1 (en) | Kaurenoic acid 13-hydroxylase (kah) variants and uses thereof |