RU2770490C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY - Google Patents
RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY Download PDFInfo
- Publication number
- RU2770490C1 RU2770490C1 RU2021120739A RU2021120739A RU2770490C1 RU 2770490 C1 RU2770490 C1 RU 2770490C1 RU 2021120739 A RU2021120739 A RU 2021120739A RU 2021120739 A RU2021120739 A RU 2021120739A RU 2770490 C1 RU2770490 C1 RU 2770490C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- survivin
- obelin
- surv
- pet19b
- hybrid protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 101000982586 Obelia longissima Obelin Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 41
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 abstract 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N Pro-Thr-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FDMCIBSQRKFSTJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 4
- XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XKWABWFMQXMUMT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 4
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 4
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Coelenterazine Natural products C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 3
- 241001521365 Renilla muelleri Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N Ala-Asp-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KIUYPHAMDKDICO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CVHJIWVKTFNGHT-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CVHJIWVKTFNGHT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 2
- BHTBAVZSZCQZPT-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N BHTBAVZSZCQZPT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N Ala-Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O JJHBEVZAZXZREW-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KTXKIYXZQFWJKB-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 2
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- RVDVDRUZWZIBJQ-CIUDSAMLSA-N Arg-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RVDVDRUZWZIBJQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N Arg-Glu-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QAODJPUKWNNNRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- PZVMBNFTBWQWQL-DCAQKATOSA-N Arg-His-Cys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PZVMBNFTBWQWQL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OCDJOVKIUJVUMO-SRVKXCTJSA-N Arg-His-Gln Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N OCDJOVKIUJVUMO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N Arg-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N RKQRHMKFNBYOTN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N Arg-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JOADBFCFJGNIKF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N Asn-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOWSBIOUKIUWLO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N Asn-Pro-Arg Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O QXOPPIDJKPEKCW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N Asp-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- UWOPETAWXDZUJR-ACZMJKKPSA-N Asp-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UWOPETAWXDZUJR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N Asp-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NRIFEOUAFLTMFJ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N Asp-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O KPNUCOPMVSGRCR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 2
- CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CTWCFPWFIGRAEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WOPJVEMFXYHZEE-SRVKXCTJSA-N Asp-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WOPJVEMFXYHZEE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N Asp-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LTCKTLYKRMCFOC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CVOZXIPULQQFNY-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Cys Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O CVOZXIPULQQFNY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- DCJNIJAWIRPPBB-CIUDSAMLSA-N Cys-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N DCJNIJAWIRPPBB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZQHQTSONVIANQR-BQBZGAKWSA-N Cys-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N ZQHQTSONVIANQR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- TXGDWPBLUFQODU-XGEHTFHBSA-N Cys-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TXGDWPBLUFQODU-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N Gln-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- OUBUHIODTNUUTC-WDCWCFNPSA-N Gln-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O OUBUHIODTNUUTC-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N Glu-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O UTKUTMJSWKKHEM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N Glu-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ATRHMOJQJWPVBQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N Glu-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YYOBUPFZLKQUAX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QLPYYTDOUQNJGQ-AVGNSLFASA-N Glu-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QLPYYTDOUQNJGQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-Leu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QNJNPKSWAHPYGI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- HAGKYCXGTRUUFI-RYUDHWBXSA-N Glu-Tyr-Gly Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O HAGKYCXGTRUUFI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N Gly-Phe-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQGCNWWLGGMTJO-ULQDDVLXSA-N His-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N LQGCNWWLGGMTJO-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N Ile-Arg-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ser-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)O)N ZLFNNVATRMCAKN-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JNLSTRPWUXOORL-MMWGEVLESA-N Ile-Ser-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N JNLSTRPWUXOORL-MMWGEVLESA-N 0.000 description 2
- RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N Ile-Ser-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- RZHLIPMZXOEJTL-AVGNSLFASA-N Lys-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N RZHLIPMZXOEJTL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PGBPWPTUOSCNLE-JYJNAYRXSA-N Lys-Gln-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PGBPWPTUOSCNLE-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N Lys-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN LPAJOCKCPRZEAG-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- PGLGNCVOWIORQE-SRVKXCTJSA-N Lys-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PGLGNCVOWIORQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- SLQJJFAVWSZLBL-BJDJZHNGSA-N Lys-Ile-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN SLQJJFAVWSZLBL-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N Lys-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N Lys-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- OHXUUQDOBQKSNB-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OHXUUQDOBQKSNB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IUYCGMNKIZDRQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001102657 Obelia geniculata Species 0.000 description 2
- CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N Phe-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N Phe-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KYYMILWEGJYPQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- HTXVATDVCRFORF-MGHWNKPDSA-N Phe-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N HTXVATDVCRFORF-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 2
- LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LRBSWBVUCLLRLU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Cys Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- KWMUAKQOVYCQJQ-ZPFDUUQYSA-N Pro-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KWMUAKQOVYCQJQ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N Ser-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QJKPECIAWNNKIT-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QJKPECIAWNNKIT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ZUXQFMVPAYGPFJ-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZUXQFMVPAYGPFJ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 2
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- KDWZQYUTMJSYRJ-BHYGNILZSA-N Trp-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O KDWZQYUTMJSYRJ-BHYGNILZSA-N 0.000 description 2
- BEWOXKJJMBKRQL-AAEUAGOBSA-N Trp-Gly-Asp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BEWOXKJJMBKRQL-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 2
- ILDJYIDXESUBOE-HSCHXYMDSA-N Trp-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N ILDJYIDXESUBOE-HSCHXYMDSA-N 0.000 description 2
- NLLARHRWSFNEMH-NUTKFTJISA-N Trp-Lys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N NLLARHRWSFNEMH-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- GFUOTIPYXKAPAH-BVSLBCMMSA-N Trp-Pro-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O GFUOTIPYXKAPAH-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 2
- JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N Tyr-Phe-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N FDKDGFGTHGJKNV-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 2
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLOYGOZDPGYWFO-LAEOZQHASA-N Val-Asp-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VLOYGOZDPGYWFO-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N Val-Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XJFXZQKJQGYFMM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010001271 arginyl-glutamyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 2
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N oxidized Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(=O)NC1=NC=C(C=2C=CC(O)=CC=2)N=C1CC1=CC=CC=C1 CJIIERPDFZUYPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000723357 Clytia Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Сконструирована плазмида pET19b-Surv-OL, обеспечивающая в клетках Escherichia coli синтез рекомбинантного гибридного белка сурвивин-обелин, способного связываться с анти-сурвивин антителами и обладающего биолюминесцентной активностью Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и может быть использована в медицине. Указанная плазмида содержит последовательность ДНК SEQ ID NO: 1 Изобретения относятся также к белку Surv-OL, выделенный из клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой pET19b-Surv-OL, с молекулярной массой 39,7 кДа; состоящий из сурвивина, коннекторного пептида - LEENLYFQGTA и апофотопротеина обелина Obelia longissima, имеющего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology, genetic and protein engineering. The pET19b-Surv-OL plasmid was constructed, which provides the synthesis of the recombinant hybrid survivin-obelin protein in Escherichia coli cells, which is capable of binding to anti-survivin antibodies and possessing bioluminescent activity of Ca 2+ -regulated obelin photoprotein and can be used in medicine. Said plasmid contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 The inventions also relate to the Surv-OL protein isolated from Escherichia coli cells transformed with the pET19b-Surv-OL plasmid, with a molecular weight of 39.7 kDa; consisting of survivin, connector peptide - LEENLYFQGTA and Obelia longissima apophotoprotein obelin having the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Сурвивин - низкомолекулярный (16,5 кДа) мультифункциональный белок, способный ингибировать апоптоз, регулировать деление клеток и способствовать ангиогенезу [Mita, A.C. Survivin: Key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics / A.C., Mita, M.M., Mita, S.T., Nawrocki, F.J., Giles // Clin. Cancer Res. - 2008-Vol.14, No.16, - P. - 5000-5005]. Сурвивин практически отсутствует в нормальных тканях, но при этом сверхэкспрессируется практически во всех злокачественных опухолях, в настоящее время его рассматривают как важный диагностический онкомаркер, а также как белок имеющий определенный терапевтический потенциал [Ryan, B.M. Survivin: a new target for anti-cancer therapy / B.M., Ryan, N., O'Donovan, M.J., Duffy, // Cancer Treat. Rev. - 2009 - Vol. 35, No 7, - Р. - 553-562]. Поэтому высокочувствительное выявление этого белка в организме необходимо для диагностики онкологических заболеваний.Survivin is a low molecular weight (16.5 kDa) multifunctional protein capable of inhibiting apoptosis, regulating cell division and promoting angiogenesis [Mita, A.C. Survivin: Key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics / A.C., Mita, M.M., Mita, S.T., Nawrocki, F.J., Giles // Clin. Cancer Res. - 2008-Vol.14, No.16, - P. - 5000-5005]. Survivin is practically absent in normal tissues, but overexpressed in almost all malignant tumors, it is currently considered as an important diagnostic oncomarker, as well as a protein with a certain therapeutic potential [Ryan, B.M. Survivin: a new target for anti-cancer therapy / B.M., Ryan, N., O'Donovan, M.J., Duffy, // Cancer Treat. Rev. - 2009 - Vol. 35, No 7, - R. - 553-562]. Therefore, highly sensitive detection of this protein in the body is necessary for the diagnosis of oncological diseases.
Са2+-регулируемый фотопротеин обелин Obelia longissima представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина (одноцепочечного полипептида с молекулярной массой 22.2 кДа) и молекулы 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно иммобилизованной в гидрофобной полости белка. При присоединении ионов Са2+ происходит декарбоксилирование субстрата с образованием целентерамида в возбужденном состоянии. Переход этого соединения в основное состояние сопровождается излучением света в видимом диапазоне (λmax=482 нм).The Ca2+ -regulated photoprotein obelin of Obelia longissima is a stable enzyme-substrate complex consisting of an apophotoprotein (single-chain polypeptide with a molecular weight of 22.2 kDa) and a 2-hydroperoxycelenterazine molecule firmly but noncovalently immobilized in the hydrophobic cavity of the protein. When Ca 2+ ions are added, the substrate is decarboxylated to form coelenteramide in an excited state. The transition of this compound to the ground state is accompanied by light emission in the visible range (λmax=482 nm).
Ген, кодирующий фотопротеин обелин был клонирован и далее получен и изучен рекомбинантный обелин дикого типа [Illarionov, B.A. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. / B.A., Illarionov, L.A., Frank V.A., Illarionova, V.S., Bondar, E.S., Vysotski, J.R., Blinks // Meth. Enzymol. - 2000 - Vol. 227, - P. - 223-249]. В литературе описаны бифункциональные гибридные белки на основе обелина, слитого с другими белками, например, стрептавидином [Bashmakova, E.E. Hybrid minimal core streptavidin-obelin as a versatile reporter for bioluminescence-based bioassay / E.E., Bashmakova, V.V., Krasitskaya, A.N., Kudryavtsev, V.G., Grigorenko, L.A., Frank // Photochem. Photobiol. - 2017 - Vol. 93, No 2, - Р. - 548-552], который используется как высокочувствительная биолюминесцентная метка для выявления биотинилированных соединений; фрагментом ZZ иммуноглобулин-связывающего домена белка А [Krasitskaya, V.V. The hybrid protein ZZ-OL as an analytical tool for biotechnology research. / V.V., Krasitskaya, E.E., Bashmakova, A.N., Kudryavtsev, M.A., Vorobjeva, E.A., Shatunova, L.A., Frank // J. Bioorg. Chem. -2020- Vol. 46, - Р. - 1004-1010] которые используются как высокочувствительная метка для выявления антител, оценки их аффинности; зеленым флуоресцентным белком (GFP) медузы Clytia [Eremeeva, E.V. Ca2+-regulated photoprotein obelin as N-terminal partner in the fusion proteins / E.V., Eremeeva, L.A., Frank, S.V., Markova, E.S. Vysotski // Journal of SFU. Biology. - 2010- Vol. 3, No 4, - Р. - 4372-4383], который использовали для научных исследований.The gene encoding the photoprotein obelin was cloned and further obtained and studied wild-type recombinant obelin [Illarionov, BA Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. / BA, Illarionov, LA, Frank VA, Illarionova, VS, Bondar, ES, Vysotski, JR, Blinks // Meth. Enzymol. - 2000 - Vol. 227, - P. - 223-249]. The literature describes bifunctional hybrid proteins based on obelin fused with other proteins, for example, streptavidin [Bashmakova, EE Hybrid minimal core streptavidin-obelin as a versatile reporter for bioluminescence-based bioassay / EE, Bashmakova, VV, Krasitskaya, AN, Kudryavtsev, VG, Grigorenko, LA, Frank // Photochem. photobiol. - 2017 - Vol. 93,
Наиболее близким аналогом - прототипом к заявляемой группе изобретений является рекомбинантная плазмидная ДНК pG1-Rm7, обеспечивающая синтез гибридного белка G1-Rm7 в клетках Escherichia coli, который связывает фактор некроза опухолей человека и обладает биолюминесцентной активностью люциферазы Renilla muelleri, где указанная плазмидная ДНК с физической картой, представленной на фиг. 1, имеет размер 6161 п.о., молекулярную массу 3.69 МДа, уникальные сайты рестрикции HindIII (235), SfiI (328), NcoI (332), AvaI (2939), PstI (986), NotI (1076), BamHI (1737), ClaI (2045) и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую гибридный белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, состоящий из одноцепочечного антитела против фактора некроза опухолей, пептида GGSGGS и модифицированной люциферазы Renilla muelleri.The closest analogue - prototype to the claimed group of inventions is the recombinant plasmid DNA pG1-Rm7, which provides the synthesis of the G1-Rm7 hybrid protein in Escherichia coli cells, which binds human tumor necrosis factor and has the bioluminescent activity of Renilla muelleri luciferase, where the specified plasmid DNA with a physical map shown in FIG. 1, has a size of 6161 bp, a molecular weight of 3.69 MDa, unique restriction sites HindIII (235), SfiI (328), NcoI (332), AvaI (2939), PstI (986), NotI (1076), BamHI ( 1737), ClaI (2045) and includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding a fusion protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of a single-chain anti-tumor necrosis factor antibody, a GGSGGS peptide, and a modified Renilla muelleri luciferase.
И гибридный белок G1-Rm7, связывающий фактор некроза опухолей человека и обладающий биолюминесцентной активностью, полученный из клеток Escherichia coli, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК pG1-Rm7, имеющий молекулярную массу 65,4 кДа, состоящий из одноцепочечного антитела против фактора некроза опухолей, пептида GGSGGS и модифицированной люциферазы Renilla muelleri, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, представленную на фиг. 2 [п. 2513686, МПК C12N15/62, C12N15/13, опубл. 20.04.2014, бюл. №11].And a G1-Rm7 fusion protein that binds human tumor necrosis factor and has bioluminescent activity, obtained from Escherichia coli cells transformed with pG1-Rm7 recombinant plasmid DNA, having a molecular weight of 65.4 kDa, consisting of a single-chain antibody against tumor necrosis factor, peptide GGSGGS and a modified Renilla muelleri luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 2 [p. 2513686, IPC C12N15/62, C12N15/13, publ. 04/20/2014, bul. No. 11].
Технический результатом группы изобретений является получение бифункционального гибридного белка, состоящего из рекомбинантного сурвивина, обладающего способностью связываться с соответствующими антителами к сурвивину и одновременно биолюминесцентной активностью, как потенциального высокочувствительного биолюминесцентного репортера для выявления онкомаркера сурвивина методом биолюминесцентного иммуноанализа конкурентного типа.The technical result of the group of inventions is to obtain a bifunctional hybrid protein consisting of recombinant survivin, which has the ability to bind to the corresponding antibodies to survivin and at the same time bioluminescent activity, as a potential highly sensitive bioluminescent reporter for detecting the tumor marker survivin by competitive type bioluminescent immunoassay.
Указанный технический результат достигается тем, что рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL обеспечивающая синтез гибридного белка Surv-OL имеющая молекулярную массу 4 МДа и размер 6766 п.о. и содержащая в соответствии с физической и генетической картой плазмиды приведенной на Фиг. 1 сайты рестрикции NcoI, XhoI, BamHI, фрагмент ДНК NcoI-XhoI размером 427 п.о., представляющий собой последовательность, кодирующую сурвивин, фрагмент ДНК XhoI-BamHI размером 614 п.о., представляющий собой последовательность, кодирующую обелин и линкер, SEQ ID No.1; фрагмент amp - ген ампициллин- резистентности (ген β-лактамазы), определяющий резистентность к ампициллину при трансформации E. coli, плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.1 представленную на фиг. 2.The specified technical result is achieved by the fact that the recombinant plasmid DNA pET19b-Surv-OL providing the synthesis of the hybrid protein Surv-OL having a molecular weight of 4 MDa and a size of 6766 p. and containing, in accordance with the physical and genetic map of the plasmid shown in Fig. 1 restriction sites NcoI, XhoI, BamHI, 427 bp NcoI-XhoI DNA fragment, which is the sequence encoding survivin, 614 bp XhoI-BamHI DNA fragment, which is the sequence encoding obelin and linker, SEQ ID No.1; fragment amp - ampicillin resistance gene (β-lactamase gene), which determines resistance to ampicillin during the transformation of E. coli, plasmid DNA pET19b-Surv-OL has the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown in Fig. 2.
Указанный технический результат достигается также и тем, что гибридный белок сурвивин-обелин (Surv-OL), обладающий способностью связываться с антителами к сурвивину и одновременно биолюминесцентной активностью, полученный из клеток Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3), трансформированных плазмидной ДНК pET19b-Surv-OL, имеющий молекулярную массу 39,7 кДа, состоящий из сурвивина, коннекторного пептида - LEENLYFQGTA и фотопротеина обелина Obelia longissima, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO.2, представленную на фиг. 3.This technical result is also achieved by the fact that the hybrid protein survivin-obelin (Surv-OL), which has the ability to bind to antibodies to survivin and at the same time bioluminescent activity, obtained from Escherichia coli BL21-Codon Plus (DE3) cells transformed with plasmid DNA pET19b- Surv-OL, having a molecular weight of 39.7 kDa, consisting of survivin, a connector peptide - LEENLYFQGTA and Obelia longissima obelin photoprotein, having the amino acid sequence of SEQ ID NO.2 shown in FIG. 3.
Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку образует единый изобретательский замысел, т.к. один из заявляемых объектов - рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL, предназначена для получения гибридного белка сурвивин-обелин (Surv-OL), полученного из клеток Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3), трансформированных плазмидной ДНК pET19b-Surv-OL, при этом оба объекта группы изобретений направлены на получение единого технического результата.The claimed group of inventions meets the requirement of unity of invention, since it forms a single inventive concept, since one of the claimed objects - recombinant plasmid DNA pET19b-Surv-OL, is intended for obtaining a hybrid protein survivin-obelin (Surv-OL) obtained from Escherichia coli BL21-Codon Plus (DE3) cells transformed with plasmid DNA pET19b-Surv-OL, at the same time, both objects of the group of inventions are aimed at obtaining a single technical result.
Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для каждого из заявляемых объектов группы, изложенных в формулах. Следовательно, каждый из объектов группы изобретений соответствует критерию «новизна».A comparative analysis with the prototype made it possible to identify a set of distinguishing features that are significant in relation to the technical result for each of the claimed objects of the group set forth in the formulas. Therefore, each of the objects of the group of inventions corresponds to the criterion of "novelty".
В доступных источниках информации не обнаружено сведений о рекомбинантных белках, состоящих из сурвивна, который распознается анти-сурвивин антителами и при этом обладающих Са2+-зависимой биолюминесцентной активностью.In the available sources of information, no information was found on recombinant proteins consisting of survivin, which is recognized by anti-survivin antibodies and at the same time possessing Ca 2+ -dependent bioluminescent activity.
Конструирование, получение и использование гибридных белков для иммуноанализа сурвивина конкурентного типа с применением фотопротеина обелина Obelia longissima или его аналогов в качестве репортеров в литературе также не описано, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».The construction, production and use of hybrid proteins for the immunoassay of competitive survivin using the Obelia longissima photoprotein or its analogues as reporters is also not described in the literature, which allows us to conclude that the proposed solution meets the "inventive step" criterion.
Сущность группы изобретений заключается в следующем.The essence of the group of inventions is as follows.
Генно-инженерными методами получают плазмидную ДНК pET19b- Surv-OL, несущую фрагмент ДНК, кодирующий сурвивин, коннекторный пептид LEENLYFQGTA и апофотопротеин обелин.Genetic engineering methods are used to obtain plasmid DNA pET19b-Surv-OL carrying a DNA fragment encoding survivin, a LEENLYFQGTA connector peptide, and apophotoprotein obelin.
Гибридный белок сурвивин - обелин, состоящий из белка сурвивина, способного связываться с анти-сурвивин антителами и апофотопротеина обелина, обладающего биолюминесцентной активностью после активации субстратом - целентеразином получают синтезом в клетках Е. coli BL21-Codon Plus(DE3), трансформированных вышеуказанной плазмидой с последующим выделением из телец включения и хроматографической очистки.The hybrid protein survivin - obelin, consisting of the survivin protein capable of binding to anti-survivin antibodies and the apophotoprotein obelin, which has bioluminescent activity after activation with the substrate - coelenterazine, is obtained by synthesis in E. coli BL21-Codon Plus (DE3) cells transformed with the above plasmid followed by isolation from inclusion bodies and chromatographic purification.
Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды pET19b- Surv-OL являются:The initial genetic material for constructing the pET19b-Surv-OL recombinant plasmid is:
а) плазмидный вектор pET-19b (Novagen), обеспечивающий встраивание гена, кодирующего сурвивин;a) plasmid vector pET-19b (Novagen) providing insertion of the gene encoding survivin;
б) ДНК плазмиды pMAL-c5X-Surv (Evrogen) - источник гена, кодирующего полноразмерный сурвивин.b) DNA of plasmid pMAL-c5X-Surv (Evrogen) - the source of the gene encoding full-length survivin.
в) ДНК плазмиды pET19b-OL8 [7], кодирующей фотопротеин обелинc) DNA of plasmid pET19b-OL8 [7], encoding the obelin photoprotein
Полученная в результате плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL характеризуется следующими признаками:The resulting pET19b-Surv-OL plasmid DNA is characterized by the following features:
имеет молекулярную массу 4,4 МДа и размер 6766 п.о.has a molecular weight of 4.4 MDa and a size of 6766 p.
кодирует гибридный белок сурвивин-обелин;encodes a survivin-obelin fusion protein;
состоит из следующих элементов:consists of the following elements:
фрагмент ДНК NcoI-XhoI размером 427 п.о., представляющий собой последовательность, кодирующую сурвивин;DNA fragment NcoI-XhoI size 427 p. O., which is a sequence encoding survivin;
фрагмент ДНК XhoI-BamHI размером 614 п.о., представляющий собой последовательность, кодирующую обелин и коннекторный пептид; a 614 bp XhoI-BamHI DNA fragment, which is a sequence encoding obelin and a connector peptide;
содержащий генетический маркер: amp - ген ампициллин- резистентности (ген β-лактамазы), определяющий резистентность к ампициллину при трансформации E. coli.containing a genetic marker: amp - ampicillin resistance gene (β-lactamase gene), which determines resistance to ampicillin during the transformation of E. coli.
Для получения продуцента полноразмерного стрептавидина компетентные клетки Е. coli BL21-Codon Plus(DE3) - RIPL (Novagen) трансформируют сконструированной плазмидой pET19b-Surv-OLTo obtain a full-length streptavidin producer, competent E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL cells (Novagen) are transformed with the engineered plasmid pET19b-Surv-OL
Штамм Е. coli BL21-Codon Plus(DE3)/pET19b-Surv-OL обеспечивает индуцируемый изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) синтез белка полноразмерного стрептавидина. Индикацию экспрессии определяют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (SDS-PAGE). Уровень экспрессии и степень очистки определяют с помощью денситометрии полиакриламидного геля, окрашенного Кумасси-R-250 с помощью системы гель-документации AlphaImager с соответствующим программным обеспечением (AlphaInnotech, США). Уровень экспрессии составляет 70 % от суммарного клеточного белка.E. coli strain BL21-Codon Plus(DE3)/pET19b-Surv-OL provides isopropylthiogalactoside (IPTG)-induced protein synthesis of full-length streptavidin. Expression indication is determined by denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE). The level of expression and the degree of purification are determined using polyacrylamide gel densitometry stained with Coomassie-R-250 using the AlphaImager gel documentation system with the appropriate software (AlphaInnotech, USA). The expression level is 70% of the total cellular protein.
Весь целевой белок локализован в тельцах включения. Его препарат высокой степени очистки (98%) получают с помощью ионообменной хроматографии. Инкубированием в растворе с субстратом - целентеразином с последующей ионообменной хроматографией получают гибридный белок обладающий Са2+- зависимой биолюминесцентной активностью. Степень очистки определяют сканированием геля прибором AlphaImager (AlphaInnotech, США). Концентрацию белка определяют спектрофотометрически, с помощью набора DC Protein Assay (Bio-Rad, США) по протоколу производителя.All of the target protein is localized in inclusion bodies. Its preparation of high purity (98%) is obtained using ion-exchange chromatography. Incubation in solution with a substrate - celenterazine, followed by ion-exchange chromatography, produces a hybrid protein with Ca 2+ - dependent bioluminescent activity. The degree of purification is determined by scanning the gel with an AlphaImager (AlphaInnotech, USA). The protein concentration is determined spectrophotometrically using the DC Protein Assay kit (Bio-Rad, USA) according to the manufacturer's protocol.
Биолюминесцентную активность определяли с помощью кюветного люминометра (модель БЛМ 8802, СКБ Наука, Красноярск) в буфере следующего состава: 50 мМ Трис-HCl рН 7.0, 5 мМ ЭДТА сразу после внесения CaCl2 (0.1 М растворав 50 мМ Трис-HCl рН 7.0). При проведении биолюминесцентного иммуноанализа измерения проводили с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 (Berthold, Германия). Биолюминесценцию инициировали внесением вышеуказанного раствора CaCl2.Bioluminescent activity was determined using a cuvette luminometer (model BLM 8802, SKB Nauka, Krasnoyarsk) in a buffer of the following composition: 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 5 mM EDTA immediately after adding CaCl 2 (0.1 M solution in 50 mM Tris-HCl pH 7.0) . During the bioluminescent immunoassay, the measurements were performed using a Mithras LB 940 plate luminometer (Berthold, Germany). Bioluminescence was initiated by adding the above solution of CaCl 2 .
Полученный гибридный белок обладает способностью специфично связываться с анти-сурвивин антителами, что было показано с помощью прямого твердофазного биолюминесцентного иммуноанализа.The resulting fusion protein has the ability to specifically bind to anti-survivin antibodies, which was shown using a direct solid-phase bioluminescent immunoassay.
Таким образом впервые получена плазмида pET19b-Surv-OL, содержащую в одной рамке считывания ген, кодирующий сурвивин, способного связываться с анти-сурвивин антителами, последовательность, кодирующую пептид LEENLYFQGTA и ген, кодирующий апофотопротеин обелин; получен гибридный белок - сурвивин-обелин (Surv - OL), который связывается с анти-сурвивин антителами и одновременно обладает биолюминесцентной активностью, который обеспечивает выявление онкомаркера сурвивина биолюминесцентным иммуноанализом конкурентного типа.Thus, the plasmid pET19b-Surv-OL was obtained for the first time, containing in one reading frame the gene encoding survivin capable of binding to anti-survivin antibodies, the sequence encoding the LEENLYFQGTA peptide and the gene encoding the apophotoprotein obelin; obtained hybrid protein - survivin-obelin (Surv - OL), which binds to anti-survivin antibodies and simultaneously has bioluminescent activity, which ensures the detection of tumor marker survivin bioluminescent immunoassay competitive type.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.The invention is illustrated in the following drawings.
Фиг. 1 Общая схема структурной организации плазмиды pET19b-Surv-OL. Обозначения: Surv - ген, кодирующий сурвивин; OL - ген, кодирующий обелин; T7lac - область промотора; amp - ген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции.Fig. 1 General scheme of the structural organization of plasmid pET19b-Surv-OL. Designations: Surv - gene encoding survivin; OL - gene encoding obelin; T7lac - promoter region; amp, ampicillin resistance gene; some restriction sites are indicated.
Фиг. 2 Нуклеотидная последовательность кодирующая гибридный белок сурвивин-обелин SEQ ID NO.1Fig. 2 Nucleotide sequence encoding survivin-obelin fusion protein SEQ ID NO.1
Фиг. 3. Аминокислотная последовательность гибридного белка сурвивин-обелин SEQ ID NO.2Fig. 3. Amino acid sequence of the fusion protein survivin-obelin SEQ ID NO.2
Фиг. 4 (а) Электрофоретический анализ фракций при получении гибридного белка сурвивин-апообелин в 12.5% SDS-PAGE, где дорожки: 1,2 - лизат рекомбинантных клеток до и после индукции ИПТГ; 3 - цитоплазматическая фракция; 4 - фракция телец включения (раствор в 6М мочевине); 5 - стандартные белки.Fig. 4 (a) Electrophoretic analysis of fractions upon receipt of the hybrid protein survivin-apoobelin in 12.5% SDS-PAGE, where lanes: 1,2 - lysate of recombinant cells before and after IPTG induction; 3 - cytoplasmic fraction; 4 - fraction of inclusion bodies (solution in 6M urea); 5 - standard proteins.
(б) Электрофоретический анализ полученного препарата гибридного белка сурвивин-обелин после хроматографической очистки: 1 - стандартные белки 2 - образец гибридного белка сурвивин-обелин. Молекулярная масса стандартов показана цифрами.(b) Electrophoretic analysis of the resulting survivin-obelin fusion protein preparation after chromatographic purification: 1 - standard proteins; 2 - survivin-obelin fusion protein sample. The molecular weight of the standards is shown in numbers.
Фиг. 5 Анализ взаимодействия гибридного белка сурвивин-обелин с антителами к сурвивину, сорбированными на поверхности иммунологического микропланшета. Обозначения: Surv-OL - гибридный белок сурвивин-обелин, abSurv- коммерческий препарат антител к сурвивину (ab469, Abcam, Великобритания).Fig. 5 Analysis of the interaction of the survivin-obelin hybrid protein with antibodies to survivin adsorbed on the surface of an immunological microplate. Designations: Surv-OL - fusion protein survivin-obelin, abSurv - commercial preparation of antibodies to survivin (ab469, Abcam, UK).
Фиг. 6 Биолюминесцентный твердофазный иммуноанализ сурвивина конкурентного типа. Surv - сурвивин; Surv-OL - гибридный белок сурвивин-обелин. L/L0 - отношение биолюминесцентного сигнала от данного образца к сигналу от образца, не содержащего сурвивин.Fig. 6 Bioluminescent solid phase competitive survivin immunoassay. Surv - survivin; Surv-OL is a survivin-obelin fusion protein. L/L 0 is the ratio of the bioluminescent signal from a given sample to the signal from a sample that does not contain survivin.
Для понимания сущности группы изобретений они иллюстрируются следующими примерами.To understand the essence of the group of inventions, they are illustrated by the following examples.
Пример 1. Конструирование плазмидной ДНК pET19b-S.Example 1 Construction of pET19b-S plasmid DNA.
Последовательность гена, кодирующего сурвивин, оптимизированная для бактериальной экспрессии была синтезирована и клонирована в вектор pMALc5x (NEB, Великобритания) фирмой Евроген, Россия.The survivin gene sequence optimized for bacterial expression was synthesized and cloned into the pMALc5x vector (NEB, UK) by Evrogen, Russia.
Фрагмент ДНК, кодирующий сурвивин (427 п.о.) с сайтами рестрикции на 5'- (NcoI) и 3'- (XhoI) концах, получают ПЦР с использованием Pfu-ДНК-полимеразы (SibEnzyme, Россия) и следующих праймеров:A DNA fragment encoding survivin (427 bp) with restriction sites at the 5'- (NcoI) and 3'- (XhoI) ends was obtained by PCR using Pfu-DNA polymerase (SibEnzyme, Russia) and the following primers:
Up 5'-GCACCATGGGTGCACCGACCCTTCCG-3'Up 5'-GCA CCATGG GTGCACCGACCCTTCCG-3'
Dn 5'-GCACTCGAGTTAGTCCATCGCTGCCAGCTGTTCAA-3'Dn 5'-GCA CTCGAG TTAGTCCATCGCTGCCAGCTGTTCAA-3'
Условия ПЦР: 95°С в течение 30 сек; 25 циклов (95°С - 30 с, 66°С - 30 с, 72°С - 1 мин); 72°С в течение 7 мин.PCR conditions: 95°C for 30 sec; 25 cycles (95°C - 30 s, 66°C - 30 s, 72°C - 1 min); 72°C for 7 min.
Последовательность ДНК, кодирующую обелин (OL) и линкер (614 п.о.) с сайтами рестрикции на 5'- (XhoI) и 3'- (BamHI) концах, синтезировали ПЦР, где в качестве матрицы использовали плазмиду pET19b-OL8 [Markova, S.V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins / S.V. Markova, E.S. Vysotski, J.R. Blinks, L.P. Burakova, B.C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2002. - V. 41, - P. 2227-2236.] и следующие праймерыThe DNA sequence encoding obelin (OL) and a linker (614 bp) with restriction sites at the 5'- (XhoI) and 3'- (BamHI) ends was synthesized by PCR, where plasmid pET19b-OL8 [Markova , S.V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins / S.V. Markova, E.S. Vysotski, J.R. Blinks, L.P. Burakova, B.C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2002. - V. 41, - P. 2227-2236.] and the following primers
Up 5'- CAGCTCGAGGAAAACCTGTATTTTCAGGGTACCGCTTCAAAATACG-3'Up 5'- CAG CTCGAG GAAAACCTGTATTTTTCAGGGTACCGCTTCAAAATACG-3'
Dn 5'- TTCGGATCCTTAGGGAACTCCGTTGCCAT-3').Dn 5'-TTC GGATCC TTAGGGAACTCCGTTGCCAT-3').
Условия ПЦР: 95°С в течение 30 сек; 25 циклов (95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 1 мин); 72°С в течение 7 мин.PCR conditions: 95°C for 30 sec; 25 cycles (95°C - 30 s, 60°C - 30 s, 72°C - 1 min); 72°C for 7 min.
Продукты амплификации расщепляют ферментами рестрикции NcoI и XhoI и BamHI в реакционной смеси, содержащей 10mM Трис-HCl, pH 8.6, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и по 20 ед. активности соответствующих ферментов. Реакцию проводят в течение 2 часов при 37°C, заключительная стадия - 20 минут при 65°C.Amplification products are digested with restriction enzymes NcoI and XhoI and BamHI in a reaction mixture containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.6, 10 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) and 20 U . activity of the corresponding enzymes. The reaction is carried out for 2 hours at 37°C, the final stage - 20 minutes at 65°C.
Обработку ДНК векторной плазмиды pET-19b (Novagen) проводят рестриктазами NcoI и BamHI в аналогичных условиях, после чего дефосфорилируют щелочной фосфатазой CIP (NEB, США) в течение 1 часа при 37°C.DNA treatment of the vector plasmid pET-19b (Novagen) is carried out with restriction enzymes NcoI and BamHI under similar conditions, after which it is dephosphorylated with alkaline phosphatase CIP (NEB, USA) for 1 hour at 37°C.
Далее ПЦР-фрагменты и линеаризованный вектор очищают электрофоретически в 1% агарозном геле с последующим выделением ДНК набором QIAquick™ Gel Extraction Kit (Quiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Next, the PCR fragments and the linearized vector were electrophoretically purified in 1% agarose gel, followed by DNA extraction using the QIAquick™ Gel Extraction Kit (Quiagen, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations.
Лигирование проводят в стандартном буфере. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli XL1Blue. С помощью полимеразной цепной реакции отбирают клоны, содержащие вставку нужного размера. Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают как pET19b-Surv-OL. Схема плазмидной ДНК pET19b- Surv-OL представлена на Фиг. 1.Ligation is carried out in a standard buffer. The resulting ligation mixture is used to transform Escherichia coli XL1Blue cells. Using the polymerase chain reaction, clones containing an insert of the desired size are selected. The target plasmid thus obtained is designated pET19b-Surv-OL. The pET19b-Surv-OL plasmid DNA scheme is shown in FIG. one.
Последовательность клонированных фрагментов подтверждена секвенированием Фиг. 2.The sequence of the cloned fragments was confirmed by sequencing of FIG. 2.
Пример 2 Получение штамма Е. coli BL21-Codon Plus(DE3)/pET19b-Surv-OL и экспрессия гибридного белка сурвивин-апообелин.Example 2 Preparation of E. coli strain BL21-Codon Plus(DE3)/pET19b-Surv-OL and expression of the survivin-apoobelin fusion protein.
Клетки Е. coli BL21-Codon Plus(DE3) трансформируют плазмидой pET19b-Surv-OL, инкубируют в колбах при активном перемешивании в LB среде с добавлением 200 мМ ампициллина при температуре 37°C до оптической плотности ОД600= 0.6-0.8. и добавляют индуктор изопропил-β-D-тио-галактопиранозид (ИПТГ) до концентрации 1 мМ. Через 4 ч клетки осаждают центрифугированием. Осадок ресуспендируют в буфере 20 мМ Трис-HCl рН 7.0, 6 М мочевина и 5 мМ CaCl2 и хроматографируют на колонке DEAE-Sepharose FF (GE Healthcare), уравновешенной тем же буфером в градиенте концентрации NaOAc (0- 0.5 М ). Полученную после очистки фракцию белка разводили в 10 раз активационным буфером (20 мМ Трис-HCl рН 7.0, 5 мМ EDTA, 10 мМ дитиотреитол), добавляли 1.2 молярный избыток синтетического целентеразина (NanoLight Technologies, США), инкубировали в течение ночи при 8°C и очищали ионообменной хроматографией на колонке Mono Q HP в градиенте NaCl (0- 0.7 М) в 20 мМ Tris-HCl pH 7.0, 5 мМ ЭДТА.E. coli BL21-Codon Plus(DE3) cells are transformed with the pET19b-Surv-OL plasmid, incubated in flasks with active stirring in LB medium supplemented with 200 mM ampicillin at 37°C to an optical density of OD 600 = 0.6-0.8. and add the inducer isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside (IPTG) to a concentration of 1 mm. After 4 hours, the cells are pelleted by centrifugation. The pellet was resuspended in 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 6 M urea and 5 mM CaCl 2 buffer and chromatographed on a DEAE-Sepharose FF column (GE Healthcare) equilibrated with the same buffer in a NaOAc concentration gradient (0-0.5 M). The protein fraction obtained after purification was diluted 10 times with an activation buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 5 mM EDTA, 10 mM dithiothreitol), a 1.2 molar excess of synthetic coelenterazine (NanoLight Technologies, USA) was added, and incubated overnight at 8°C and purified by ion exchange chromatography on a Mono Q HP column with a gradient of NaCl (0-0.7 M) in 20 mM Tris-HCl pH 7.0, 5 mM EDTA.
Состав белков во фракциях при получении гибридного белка анализировали с помощью гель-электрофореза (Фиг. 4а). Чистоту финального препарата гибридного белка Surv-OL анализировали так же (Фиг. 4б).The composition of the proteins in the fractions upon receipt of the hybrid protein was analyzed using gel electrophoresis (Fig. 4a). The purity of the final Surv-OL fusion protein preparation was analyzed in the same way (FIG. 4b).
Пример 3 Взаимодействие гибридного белка с антителами к сурвивинуExample 3 Interaction of Fusion Protein with Antibodies to Survivin
В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора антител к сурвивину (ab469, Abcam, Великобритания) в концентрациях 1000, 333.3, 111.1, 37, 12.4, 4.1 и 0 (контрольные лунки) нг/мл (в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.0, 0.15 М NaCl, - PBS) и инкубировали 1 ч при 37°С. После промывки (трижды, PBS, 0.1% Tween20, 5 мМ ЭДТА) блокировали не занятые места на поверхности 1% раствором BSA в PBS (1 ч при 37°С). После промывки в лунки вносили по 60 мкл раствора гибридного белка Surv-OL (260 нг/мл) в 20 мМ Трис-HCl, pH 7.0, 0.15 М NaCl, 5мМ ЭДТА. Инкубировали планшет в течение часа со встряхиванием (350 об/мин) при 23°С, затем промывали. Биолюминесцентный сигнал связавшегося белка Surv-OL измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 (Berthold, Германия), сразу после впрыска 100 мкл раствора CaCl2 (0.1 М CaCl2, 0.1 М Трис-HCl, pH 8.8) в течение 5 с. Все эксперименты проводили в 2-х повторностях. Усредненный сигнал от контрольных лунок вычитали от усредненных сигналов рабочих лунок. Результат проведенного эксперимента показан на Фиг. 5.100 μl of an antibody solution to survivin (ab469, Abcam, UK) was added to the wells of the plate at concentrations of 1000, 333.3, 111.1, 37, 12.4, 4.1, and 0 (control wells) ng/ml (in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0, 0.15 M NaCl, - PBS) and incubated for 1 h at 37°C. After washing (three times, PBS, 0.1% Tween20, 5 mM EDTA), unoccupied spots on the surface were blocked with 1% BSA solution in PBS (1 h at 37°C). After washing, 60 µL of Surv-OL hybrid protein solution (260 ng/mL) in 20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA were added to the wells. The plate was incubated for one hour with shaking (350 rpm) at 23°C, then washed. The bioluminescent signal of the bound Surv-OL protein was measured using a Mithras LB 940 plate luminometer (Berthold, Germany) immediately after the injection of 100 µl of CaCl2 solution (0.1 M CaCl2 , 0.1 M Tris-HCl, pH 8.8) for 5 s. All experiments were carried out in 2 replicates. The average signal from the control wells was subtracted from the average signal from the working wells. The result of the experiment is shown in Fig. 5.
Пример 4 Конкурентный анализ сурвивина в модельных растворахExample 4 Competitive analysis of survivin in model solutions
В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора антител к сурвивину (ab469, Abcam, Великобритания) в концентрации 1 мкг/мл (в PBS) и инкубировали при 4°C в течение ночи. После промывки (трижды, PBS, 0.1% Tween20, 5 мМ ЭДТА) вносили растворы, содержащие рекомбинантный сурвивин [5] в концентрациях от 666,7 пг/мл до 2,7 пг/мл и 0 пг/мл - контрольные лунки, а также гибридный белок Surv-OL в концентрации 390 пг/мл в 20 мМ Трис-HCl, pH 7.0, 0.15М NaCl, 5мМ ЭДТА, 0.1% BSA. Инкубировали планшет 40 мин со встряхиванием (600 об/мин) при 23°C, затем тщательно промывали. Биолюминесценцию сформированных на поверхности комплексов измеряли с помощью планшетного люминометра Mithras LB 940 (Berthold, Германия), сразу после впрыска 100 мкл раствора 0.1 М CaCl2, 0.1 М Трис-HCl, pH 8.8 в течение 5 с. Все эксперименты проводили в 2-х повторностях. Для построения зависимости сигнала от концентрации сурвивина по оси ординат откладывали отношение значения усредненного биолюминесцентного сигнала от рабочих лунок к усредненному сигналу от нулевых лунок. Обратную зависимость биолюминесцентного сигнала от содержания свободного сурвивина наблюдали в диапазоне концентраций последнего от 666,7 до 2,7 пг/мл. Результат проведенного эксперимента показан на Фиг. 6.100 μl of an antibody solution to survivin (ab469, Abcam, UK) at a concentration of 1 μg/ml (in PBS) was added to the wells of the plate and incubated at 4°C overnight. After washing (three times, PBS, 0.1% Tween20, 5 mM EDTA), solutions containing recombinant survivin [5] at concentrations from 666.7 pg/ml to 2.7 pg/ml and 0 pg/ml were added to control wells, and also Surv-OL fusion protein at 390 pg/ml in 20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% BSA. The tablet was incubated for 40 min with shaking (600 rpm) at 23°C, then washed thoroughly. The bioluminescence of the complexes formed on the surface was measured using a Mithras LB 940 plate luminometer (Berthold, Germany) immediately after the injection of 100 μL of a solution of 0.1 M CaCl2, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.8 for 5 s. All experiments were carried out in 2 replicates. To build the dependence of the signal on the concentration of survivin, the ratio of the value of the average bioluminescent signal from the working wells to the average signal from the zero wells was plotted along the y-axis. An inverse dependence of the bioluminescent signal on the content of free survivin was observed in the concentration range of the latter from 666.7 to 2.7 pg/ml. The result of the experiment is shown in Fig. 6.
Таким образом впервые получена плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL, содержащая ген гибридного белка сурвивин-обелин; обеспечивающая синтез в клетках бактерий E.coli белка сурвивин-апообелин; рекомбинантный гибридный белок-сурвивин-обелин (Surv-OL), обладающий способностью связываться с антителами к сурвивину и биолюминесцентной активностью, что делает возможным его применение в качестве репортера при выявлении онкомаркера сурвивина в твердофазном иммуноанализе конкурентного типа.Thus, plasmid DNA pET19b-Surv-OL containing the gene for the survivin-obelin hybrid protein was obtained for the first time; providing synthesis of survivin-apoobelin protein in E. coli bacteria cells; recombinant hybrid protein-survivin-obelin (Surv-OL), which has the ability to bind to antibodies to survivin and bioluminescent activity, which makes it possible to use it as a reporter in the detection of the oncomarker survivin in a competitive solid-phase immunoassay.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES
1. Mita, A.C. Survivin: Key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics / A.C., Mita, M.M., Mita, S.T., Nawrocki, F.J., Giles // Clin. Cancer Res. - 2008-Vol.14, No.16, - P. - 5000-5005.1. Mita, A.C. Survivin: Key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics / A.C., Mita, M.M., Mita, S.T., Nawrocki, F.J., Giles // Clin. Cancer Res. - 2008-Vol.14, No.16, - P. - 5000-5005.
2. Ryan, B.M. Survivin: a new target for anti-cancer therapy / B.M., Ryan, N., O'Donovan, M.J., Duffy, // Cancer Treat. Rev. - 2009 - Vol. 35, No 7, - Р. - 553-562.2. Ryan, B.M. Survivin: a new target for anti-cancer therapy / B.M., Ryan, N., O'Donovan, M.J., Duffy, // Cancer Treat. Rev. - 2009 - Vol. 35, No 7, - R. - 553-562.
3. Illarionov, B.A. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. / B.A., Illarionov, L.A., Frank V.A., Illarionova, V.S., Bondar, E.S., Vysotski, J.R., Blinks // Meth. Enzymol. - 2000 -Vol. 227, - P.- 223-249.3. Illarionov, B.A. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. / B.A., Illarionov, L.A., Frank V.A., Illarionova, V.S., Bondar, E.S., Vysotski, J.R., Blinks // Meth. Enzymol. - 2000 -Vol. 227, - P. - 223-249.
4. Bashmakova, E.E. Hybrid minimal core streptavidin-obelin as a versatile reporter for bioluminescence-based bioassay / E.E., Bashmakova, V.V., Krasitskaya, A.N., Kudryavtsev, V.G., Grigorenko, L.A., Frank // Photochem. Photobiol. - 2017- Vol. 93, No 2, - Р. - 548-552.4. Bashmakova, E.E. Hybrid minimal core streptavidin-obelin as a versatile reporter for bioluminescence-based bioassay / E.E., Bashmakova, V.V., Krasitskaya, A.N., Kudryavtsev, V.G., Grigorenko, L.A., Frank // Photochem. photobiol. - 2017-Vol. 93,
5. Krasitskaya, V.V. The hybrid protein ZZ-OL as an analytical tool for biotechnology research. / V.V., Krasitskaya, E.E., Bashmakova, A.N., Kudryavtsev, M.A., Vorobjeva, E.A., Shatunova, L.A., Frank // J. Bioorg. Chem. -2020- Vol. 46, - Р. - 1004-1010.5. Krasitskaya, V.V. The hybrid protein ZZ-OL as an analytical tool for biotechnology research. / V.V., Krasitskaya, E.E., Bashmakova, A.N., Kudryavtsev, M.A., Vorobjeva, E.A., Shatunova, L.A., Frank // J. Bioorg. Chem. -2020-Vol. 46, - R. - 1004-1010.
6. Eremeeva, E.V. Ca2+-regulated photoprotein obelin as N-terminal partner in the fusion proteins / E.V., Eremeeva, L.A., Frank, S.V., Markova, E.S. Vysotski // Journal of SFU. Biology. - 2010 - Vol. 3, No 4, - Р. - 4372-4383.6. Eremeeva, EV Ca 2+ -regulated photoprotein obelin as N-terminal partner in the fusion proteins / EV, Eremeeva, LA, Frank, SV, Markova, ES Vysotski // Journal of SFU. Biology. - 2010 - Vol. 3, No 4, - R. - 4372-4383.
7. Markova, S. V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins / S.V. Markova, E.S. Vysotski, J.R. Blinks, L. P. Burakova, B.C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2002. - V. 41, - P. 2227-2236.7. Markova, S. V. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins / S.V. Markova, E.S. Vysotski, J.R. Blinks, L.P. Burakova, B.C. Wang, J. Lee // Biochemistry. - 2002. - V. 41, - P. 2227-2236.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение <110> Federal state budgetary scientific institution
«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный "Federal Research Center" Krasnoyarsk Scientific
центр Сибирского отделения Российской академии наук» Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences"
<120> Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL, обеспечивающая <120> Recombinant plasmid DNA pET19b-Surv-OL providing
синтез гибридного белка сурвивин-обелин, штамм бактерий Escherichia synthesis of hybrid protein survivin-obelin, bacterial strain Escherichia
coli - продуцент гибридного белка сурвивин-обелин coli is a producer of the hybrid protein survivin-obelin
<160> Номер SEQ ID NO 1<160>
<210> 1<210> 1
<211> 1041<211> 1041
<212> DNA<212> DNA
<213> Obelia longissima, Homo sapiens<213> Obelia longissima, Homo sapiens
<400> 1<400> 1
atg ggt gca ccg acc ctt ccg cca gcg tgg caa ccg ttt ctg aaa 45atg ggt gca ccg acc ctt ccg cca gcg tgg caa ccg ttt ctg
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu LysMet Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys
1 5 10 151 5 10 15
gat cat cgc atc agc acc ttc aag aac tgg ccg ttt ctg gaa ggt 90gat cat cgc atc agc acc ttc aag aac tgg ccg ttt ctg
Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu GlyAsp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly
20 25 30 20 25 30
tgt gcg tgc act cca gaa cgc atg gct gaa gca ggc ttc att cac 135tgt gcg tgc act cca gaa cgc atg gct gaa gca ggc
Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile HisCys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His
35 40 45 35 40 45
tgt ccg acc gaa aac gaa cca gat ctt gcg cag tgt ttc ttc tgc 180tgt ccg acc gaa aac gaa cca gat ctt gcg cag tgt
Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe CysCys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys
50 55 60 50 55 60
ttc aaa gaa ctg gaa ggc tgg gaa ccg gac gat gat ccg att gag 225ttc aaa gaa ctg gaa ggc tgg gaa ccg gac gat gat ccg att
Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile GluPhe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu
65 70 75 65 70 75
gaa cac aag aaa cac agc tct ggc tgt gcg ttt ctg agc gtg aag 270gaa cac aag aaa cac agc tct ggc tgt gcg ttt ctg agc gtg aag 270
Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val LysGlu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys
80 85 90 80 85 90
aaa cag ttt gag gaa ctg acc ctt ggt gag ttt ctg aaa ctc gat 315aaa cag ttt gag gaa ctg acc ctt ggt gag ttt ctg
Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu AspLys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp
95 100 105 95 100 105
cgt gaa cgt gcg aag aac aag att gcg aaa gag acg aac aac aag 360cgt gaa cgt gcg aag aac aag att gcg aaa gag acg
Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn LysArg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys
110 115 120 110 115 120
aag aaa gag ttc gaa gag act gcg aag aaa gtt cgt cgt gcg att 405aag aaa gag ttc gaa gag act gcg aag aaa gtt cgt
Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala IleLys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile
125 130 135 125 130 135
gaa cag ctg gca ccg atg gaa ctc gag gaa aac ctg tat ttt cag 450gaa cag ctg gca ccg atg gaa ctc gag gaa aac ctg
Glu Gln Leu Ala Pro Met Glu Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe GlnGlu Gln Leu Ala Pro Met Glu Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
140 145 150 140 145 150
ggt acc gct tca aaa tac gca gtt aaa ctc aag act gac ttt gat 495ggt acc gct tca aaa tac gca gtt aaa ctc aag act gac ttt gat 495
Gly Thr Ala Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Gly Thr Ala Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp
155 160 165 155 160 165
aat cca cga tgg atc aaa aga cac aag cac atg ttt gat ttc ctc 540aat cca cga tgg atc aaa aga cac aag cac atg ttt gat
Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu
170 175 180 170 175 180
gac atc aat gga aat gga aaa atc acc ctc gat gaa att gtg tcc 585gac atc aat gga aat gga aaa atc acc ctc gat gaa att gtg tcc 585
Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser
185 190 195 185 190 195
aag gca tct gat gac ata tgt gcc aag cta gaa gcc aca cca gaa 630aag gca tct gat gac ata tgt gcc aag cta gaa gcc aca cca gaa 630
Lys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Glu Ala Thr Pro GluLys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Glu Ala Thr Pro Glu
200 205 210 200 205 210
caa aca aaa cgc cat caa gtt tgt gtt gaa gct ttc ttt aga gga 675caa aca aaa cgc cat caa gtt tgt gtt gaa gct ttc ttt
Gln Thr Lys Arg His Gln Val Cys Val Glu Ala Phe Phe Arg GlyGln Thr Lys Arg His Gln Val Cys Val Glu Ala Phe Phe Arg Gly
215 220 225 215 220 225
tgt gga atg gaa tat ggt aaa gaa att gcc ttc cca caa ttc ctc 720tgt gga atg gaa tat ggt aaa gaa att gcc ttc cca
Cys Gly Met Glu Tyr Gly Lys Glu Ile Ala Phe Pro Gln Phe Leu Cys Gly Met Glu Tyr Gly Lys Glu Ile Ala Phe Pro Gln Phe Leu
230 235 240 230 235 240
gat gga tgg aaa caa tta gcg act tca gaa ctc aag aaa tgg gca 765gat gga tgg aaa caa tta gcg act tca gaa ctc aag aaa tgg gca 765
Asp Gly Trp Lys Gln Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Asp Gly Trp Lys Gln Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala
245 250 255 245 250 255
aga aac gaa cct act ctc att cgt gaa tgg gga gat gct gtc ttt 810aga aac gaa cct act ctc att cgt gaa tgg gga gat gct gtc ttt 810
Arg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val PheArg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe
260 265 270 260 265 270
gat att ttc gac aaa gat gga agt ggt aca atc act ttg gac gaa 855gat att ttc gac aaa gat gga agt ggt aca atc act ttg gac
Asp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp GluAsp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp Glu
275 280 285 275 280 285
tgg aaa gct tat gga aaa atc tct ggt atc tct cca tca caa gaa 900tgg aaa gct tat gga aaa atc tct ggt atc tct cca
Trp Lys Ala Tyr Gly Lys Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu
290 295 300 290 295 300
gat tgt gaa gcg aca ttt cga cat tgc gat ttg gac aac agt ggt 945gat tgt gaa gcg aca ttt cga cat tgc gat ttg gac
Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly
305 310 315 305 310 315
gac ctt gat gtt gac gag atg aca aga caa cat ctt gga ttc tgg 990gac ctt gat gtt gac gag atg aca aga caa cat ctt gga
Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe TrpAsp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp
320 325 330 320 325 330
tac act ttg gac cca gaa gct gat ggt ctc tat ggc aac gga gtt 1035tac act ttg gac cca gaa gct gat ggt ctc tat ggc
Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val
335 340 345 335 340 345
ccc taa 1041ccc taa 1041
Pro Och*Pro Och*
<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение <110> Federal state budgetary scientific institution
«Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный "Federal Research Center" Krasnoyarsk Scientific
центр Сибирского отделения Российской академии наук» Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences"
<120> Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-Surv-OL, обеспечивающая <120> Recombinant plasmid DNA pET19b-Surv-OL providing
синтез гибридного белка сурвивин-обелин, штамм бактерий Escherichia synthesis of hybrid protein survivin-obelin, bacterial strain Escherichia
coli - продуцент гибридного белка сурвивин-обелин, гибридный coli - producer of the hybrid protein survivin-obelin, hybrid
белок - сурвивин-обелин, связывающийся с антителами к сурвивину и protein - survivin-obelin, which binds to antibodies to survivin and
обладающий биолюминесцентной активностью bioluminescent
<160> Номер SEQ ID NO 2 <160>
<210> 2<210> 2
<211> 456<211> 456
<212> PRT<212> PRT
<213> Obelia longissima, Homo sapiens<213> Obelia longissima, Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu LysMet Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys
1 5 10 151 5 10 15
Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu GlyAsp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly
20 25 30 20 25 30
Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile HisCys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His
35 40 45 35 40 45
Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe CysCys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys
50 55 60 50 55 60
Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile GluPhe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu
65 70 75 65 70 75
Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val LysGlu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys
80 85 90 80 85 90
Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu AspLys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp
95 100 105 95 100 105
Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn LysArg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys
110 115 120 110 115 120
Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala IleLys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile
125 130 135 125 130 135
Glu Gln Leu Ala Pro Met Glu Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe GlnGlu Gln Leu Ala Pro Met Glu Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
140 145 150 140 145 150
Gly Thr Ala Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp Gly Thr Ala Ser Lys Tyr Ala Val Lys Leu Lys Thr Asp Phe Asp
155 160 165 155 160 165
Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu Asn Pro Arg Trp Ile Lys Arg His Lys His Met Phe Asp Phe Leu
170 175 180 170 175 180
Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser Asp Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Thr Leu Asp Glu Ile Val Ser
185 190 195 185 190 195
Lys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Glu Ala Thr Pro GluLys Ala Ser Asp Asp Ile Cys Ala Lys Leu Glu Ala Thr Pro Glu
200 205 210 200 205 210
Gln Thr Lys Arg His Gln Val Cys Val Glu Ala Phe Phe Arg GlyGln Thr Lys Arg His Gln Val Cys Val Glu Ala Phe Phe Arg Gly
215 220 225 215 220 225
Cys Gly Met Glu Tyr Gly Lys Glu Ile Ala Phe Pro Gln Phe Leu Cys Gly Met Glu Tyr Gly Lys Glu Ile Ala Phe Pro Gln Phe Leu
230 235 240 230 235 240
Asp Gly Trp Lys Gln Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala Asp Gly Trp Lys Gln Leu Ala Thr Ser Glu Leu Lys Lys Trp Ala
245 250 255 245 250 255
Arg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val PheArg Asn Glu Pro Thr Leu Ile Arg Glu Trp Gly Asp Ala Val Phe
260 265 270 260 265 270
Asp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp GluAsp Ile Phe Asp Lys Asp Gly Ser Gly Thr Ile Thr Leu Asp Glu
275 280 285 275 280 285
Trp Lys Ala Tyr Gly Lys Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu Trp Lys Ala Tyr Gly Lys Ile Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gln Glu
290 295 300 290 295 300
Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly Asp Cys Glu Ala Thr Phe Arg His Cys Asp Leu Asp Asn Ser Gly
305 310 315 305 310 315
Asp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe TrpAsp Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His Leu Gly Phe Trp
320 325 330 320 325 330
Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Thr Leu Asp Pro Glu Ala Asp Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val
335 340 345 335 340 345
ccc taa ccc taa
Pro Och*Pro Och*
346346
<---<---
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021120739A RU2770490C1 (en) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021120739A RU2770490C1 (en) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2770490C1 true RU2770490C1 (en) | 2022-04-18 |
Family
ID=81255466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021120739A RU2770490C1 (en) | 2021-07-14 | 2021-07-14 | RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2770490C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340629C2 (en) * | 2002-10-21 | 2008-12-10 | Аксам С.Р.Л. | Photoprotein with increased bioluminescence |
| RU2343195C2 (en) * | 2003-03-24 | 2009-01-10 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Dna-vaccine against tumoral growth and ways of their application |
| RU2513686C2 (en) * | 2012-08-24 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | RECOMBINANT PLASMID DNA pG1-Rm7, FACILITATING SYNTHESIS OF HYBRID PROTEIN G1-Rm7, AND HYBRID PROTEIN BINDING TUMOUR NECROSIS FACTOR AND HAVING BIOLUMINESCENCE |
-
2021
- 2021-07-14 RU RU2021120739A patent/RU2770490C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2340629C2 (en) * | 2002-10-21 | 2008-12-10 | Аксам С.Р.Л. | Photoprotein with increased bioluminescence |
| RU2343195C2 (en) * | 2003-03-24 | 2009-01-10 | Дзе Скриппс Рисерч Инститьют | Dna-vaccine against tumoral growth and ways of their application |
| RU2513686C2 (en) * | 2012-08-24 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | RECOMBINANT PLASMID DNA pG1-Rm7, FACILITATING SYNTHESIS OF HYBRID PROTEIN G1-Rm7, AND HYBRID PROTEIN BINDING TUMOUR NECROSIS FACTOR AND HAVING BIOLUMINESCENCE |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Illarionov, B.A. et al. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator. Meth. Enzymol. Vol. 227, 2000, P. 223-249. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | The WW domain of Yes-associated protein binds a proline-rich ligand that differs from the consensus established for Src homology 3-binding modules. | |
| Improta et al. | Transcription factor ISGF-3 formation requires phosphorylated Stat91 protein, but Stat113 protein is phosphorylated independently of Stat91 protein. | |
| Lindsley et al. | Proteolysis patterns of epitopically labeled yeast DNA topoisomerase II suggest an allosteric transition in the enzyme induced by ATP binding. | |
| Hupp et al. | Small peptides activate the latent sequence-specific DNA binding function of p53 | |
| Chen et al. | p21Cip1/Waf1 disrupts the recruitment of human Fen1 by proliferating-cell nuclear antigen into the DNA replication complex. | |
| Robinson et al. | Macromolecular assemblage of aminoacyl-tRNA synthetases: quantitative analysis of protein-protein interactions and mechanism of complex assembly | |
| Taylor et al. | An RNA-binding protein associated with Src through its SH2 and SH3 domains in mitosis | |
| Gao et al. | τ Binds and organizes Escherichia coli replication proteins through distinct domains: partial proteolysis of terminally tagged τ to determine candidate domains and to assign domain V as the α binding domain | |
| CN103459415B (en) | designed repeat protein that binds to serum albumin | |
| CN100400657C (en) | Phosphokinases and their applications | |
| Kitamura et al. | Molecular cloning of p125Nap1, a protein that associates with an SH3 domain of Nck | |
| Cooper et al. | In vivo binding properties of SH2 domains from GTPase-activating protein and phosphatidylinositol 3-kinase | |
| Craig et al. | Disruption of coiled-coil domains in Fer protein-tyrosine kinase abolishes trimerization but not kinase activation | |
| Sawma et al. | Evidence for new homotypic and heterotypic interactions between transmembrane helices of proteins involved in receptor tyrosine kinase and neuropilin signaling | |
| Bauch et al. | Interaction of the CD5 cytoplasmic domain with the Ca2+/calmodulin‐dependent kinase IIδ | |
| WO2021185360A1 (en) | Novel truncated sortase variants | |
| US7786261B2 (en) | Coiled-coil fusion proteins comprising cell receptor domains | |
| US6187552B1 (en) | Method for identifying inhibitors of JAK2/cytokine receptor binding | |
| RU2770490C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pET19b-SurvOL, WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF A HYBRID PROTEIN SURVIVIN-OBELIN (SurvOL) AND A HYBRID PROTEIN BOUND BY ANTI-SURVIVIN ANTIBODIES AND POSSESSING BIOLUMINESCENT ACTIVITY | |
| KR102014826B1 (en) | Novel peptide for enhancing expression efficiency and fusion protein including the same | |
| Lee et al. | The Dac-tag, an affinity tag based on penicillin-binding protein 5 | |
| Manzanera et al. | Mutational analysis of the highly conserved C-terminal residues of the XylS protein, a member of the AraC family of transcriptional regulators | |
| WO2004012660A2 (en) | Mk2 interacting proteins | |
| US11692179B2 (en) | Compositions and methods involving engineered p27 | |
| US7223742B2 (en) | Enhanced solubility of recombinant proteins |