RU2627606C1

RU2627606C1 - Method for lipoaspirate processing

Info

Publication number: RU2627606C1
Application number: RU2016117586A
Authority: RU
Inventors: Константин Валентинович Котенко; Илья Игоревич Еремин; Андрей Алексеевич Пулин; Иван Николаевич Корсаков; Вадим Леонидович Зорин; Ирина Ивановна Наделяева
Original assignee: Константин Валентинович Котенко; Илья Игоревич Еремин; Андрей Алексеевич Пулин; Иван Николаевич Корсаков; Вадим Леонидович Зорин
Priority date: 2016-05-05
Filing date: 2016-05-05
Publication date: 2017-08-09

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method for lipoaspirate processing is proposed. The method comprises addition of 0.25% ketotifen solution at a dose of 1 ml of solution per 20 ml of lipoaspirate prior to the lipoaspirate washing step.

EFFECT: increased adipose tissue cellular fraction viability.

1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для обработки жировой ткани, полученной при липосакции, для дальнейшего использования в качестве источника мезенхимальных стромальных клеток, стромальной васкулярной фракции жировой ткани, для липофилинга или криоконсервирования.The invention relates to medicine, namely to regenerative medicine, and can be used to treat adipose tissue obtained by liposuction, for further use as a source of mesenchymal stromal cells, stromal vascular fraction of adipose tissue, for lipofilling or cryopreservation.

Трансплантация аутологичной жировой ткани нашла широкое применение для заполнения дефектов и увеличения объема мягких тканей (липофилинг), кроме того, жировая ткань является ценным источником мезенхимальных стромальных клеток, которые могут быть использованы для терапевтических целей.Autologous adipose tissue transplantation has been widely used to fill defects and increase soft tissue volume (lipofilling), in addition, adipose tissue is a valuable source of mesenchymal stromal cells that can be used for therapeutic purposes.

Одной из наиболее острых проблем, связанных с использованием жировой ткани, является сохранение жизнеспособности ее клеточной фракции при заготовке, обработке, хранении и использовании ткани. Клеточная фракция жировой ткани представлена преадипоцитами, фибробластами, гладкомышечными клетками, эндотелиоцитами, резидентными моноцитами/макрофагами, лейкоцитами периферической крови и мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани. Существенное негативное влияние на жизнеспособность клеток жировой ткани оказывает механическое воздействие на нее в процессе извлечения, отмывки, подготовки к криоконсервированию, заморозки, разморозки и введения. Влияние различных способов обработки жировой ткани на сохранность жизнеспособности ее клеточной фракции явилось предметом многочисленных исследований, вместе с тем помимо механического повреждения клеток существенное влияние на жизнеспособность клеточной фракции жировой ткани могут оказывать биологические факторы, в частности цитокины, выделяющиеся при дегрануляции тучных клеток.One of the most acute problems associated with the use of adipose tissue is the preservation of the viability of its cell fraction during harvesting, processing, storage and use of tissue. The cellular fraction of adipose tissue is represented by preadipocytes, fibroblasts, smooth muscle cells, endotheliocytes, resident monocytes / macrophages, peripheral blood leukocytes and mesenchymal stromal cells of adipose tissue. A significant negative effect on the viability of adipose tissue cells is exerted by a mechanical effect on it during extraction, washing, preparation for cryopreservation, freezing, defrosting and administration. The influence of various methods of treating adipose tissue on the preservation of the viability of its cell fraction has been the subject of numerous studies, however, in addition to mechanical damage to cells, biological factors, in particular cytokines released during mast cell degranulation, can significantly affect the viability of the cell fraction of adipose tissue.

В настоящее время известно несколько способов первичной обработки липоаспирата, направленных на отделение клеточной фракции жировой ткани от контаминирующих фракций, таких как свободный жир и эритроциты и получение продукта, пригодного для криоконсервирования, немедленного применения для липофилинга или получения из него клеточных продуктов.Currently, there are several known methods of primary processing of lipoaspirate, aimed at separating the cellular fraction of adipose tissue from contaminating fractions, such as free fat and red blood cells and obtaining a product suitable for cryopreservation, immediate use for lipofilling or cell products from it.

Известен способ первичной обработки липоаспирата центрифугированием, способ осуществляют следующим образом: липоаспират помещают в пробирку, содержащую фосфатный буфер и центрифугируют 4 минуты при 500 g. Верхнюю (жир) и нижнюю (эритроциты) фракции удаляют, после чего жировую ткань переносят в мешки для криоконсервации (Chaput В, Orio J, Garrido I, De Bonnecaze G, Espagnolle N, Gadelorge M, Chavoin JP, Grolleau-Raoux JL, Casteilla L, Planat V, Bourin P. A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies. Plast Reconstr Surg. 2014 Apr; 133 (4): 815-26)A known method for the primary treatment of lipoaspirate by centrifugation, the method is as follows: the lipoaspirate is placed in a tube containing phosphate buffer and centrifuged for 4 minutes at 500 g. The upper (fat) and lower (red blood cells) fractions are removed, after which the adipose tissue is transferred to cryopreservation bags (Chaput B, Orio J, Garrido I, De Bonnecaze G, Espagnolle N, Gadelorge M, Chavoin JP, Grolleau-Raoux JL, Casteilla L, Planat V, Bourin P. A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies. Plast Reconstr Surg. 2014 Apr; 133 (4): 815-26)

Способ имеет следующие недостатки:The method has the following disadvantages:

- центрифугирование оказывает существенное механическое повреждающее воздействие на клетки жировой ткани, снижая, таким образом, их жизнеспособность;- centrifugation has a significant mechanical damaging effect on adipose tissue cells, thereby reducing their viability;

- способ не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани от повреждающего воздействия цитокинов, высвобождающихся при дегрануляции тучных клеток, присутствующих в жировой ткани.- the method does not protect the cellular fraction of adipose tissue from the damaging effects of cytokines released during the degranulation of mast cells present in adipose tissue.

Известен способ первичной обработки липоаспирата путем его отстаивания. Способ осуществляют следующим образом: шприцы с липоаспиратом оставляют в вертикальном положении на две минуты для отделения туменесцентной жидкости, после чего последнюю удаляют и оставляют шприцы еще на две минуты до фракционирования липоаспирата (Hoareau L, Bencharif К, Girard AC, Gence L, Delarue P, Hulard O, Festy F, Roche R. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2013 May; 66 (5): 712-9)A known method for the primary treatment of lipoaspirate by sedimentation. The method is as follows: the syringes with lipoaspirate are left in an upright position for two minutes to separate the Tumescence fluid, after which the latter is removed and the syringes are left for another two minutes until the lipoaspirate is fractionated (Hoareau L, Bencharif K, Girard AC, Gence L, Delarue P, Hulard O, Festy F, Roche R. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2013 May; 66 (5): 712-9)

- не обеспечивает полного удаления контаминирующих фракций из жировой ткани;- does not provide complete removal of contaminating fractions from adipose tissue;

- не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани от повреждающего воздействия цитокинов, высвобождающихся при дегрануляции тучных клеток, присутствующих в жировой ткани.- does not protect the cellular fraction of adipose tissue from the damaging effects of cytokines released during the degranulation of mast cells present in adipose tissue.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ первичной обработки липоаспирата путем его промывания. Способ осуществляют следующим образом: липоаспират из шприцев объемом 10 мл, которые использовали для получения липоаспирата, переносят в шприцы объемом 20 мл, в которые дополнительно добавляют изотонический раствор хлорида натрия, для получения жировой ткани, свободной от жира и крови, раствор хлорида натрия меняют один или два раза, после чего удаляют (Khater R, Atanassova Р, Anastassov Y, Pellerin P, Martinot-Duquennoy V. Clinical and experimental study of autologous fat grafting after processing by centrifugation and serum lavage. Aesthetic Plast Surg. 2009 Jan; 33 (1): 37-43).The closest in technical essence to the proposed method is a method of primary processing of lipoaspirate by washing it. The method is as follows: lipoaspirate from 10 ml syringes that were used to obtain lipoaspirate is transferred to 20 ml syringes into which isotonic sodium chloride solution is additionally added, to obtain adipose tissue free of fat and blood, sodium chloride solution is changed one or two times, after which they are removed (Khater R, Atanassova P, Anastassov Y, Pellerin P, Martinot-Duquennoy V. Clinical and experimental study of autologous fat grafting after processing by centrifugation and serum lavage. Aesthetic Plast Surg. 2009 Jan; 33 ( 1): 37-43).

- не обеспечивает защиты клеточной фракции жировой ткани при ее подготовке к замораживанию, размораживании и трансплантации от повреждения, вызванного цитокинами, высвобождающимися при дегрануляции тучных клеток.- does not protect the cellular fraction of adipose tissue in its preparation for freezing, thawing and transplantation from damage caused by cytokines released during mast cell degranulation.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение жизнеспособности клеточной фракции жировой ткани при первичной обработке липоаспирата.The technical result of the proposed method is to increase the viability of the cellular fraction of adipose tissue during the primary treatment of lipoaspirate.

Указанный технический результат достигается тем, что в липоаспират до его отмывки добавляют 0,25% раствор кетотифена в дозе 1 мл раствора на 20 мл липоаспиратаThe specified technical result is achieved by adding a 0.25% ketotifen solution in a dose of 1 ml of solution per 20 ml of lipoaspirate to the lipoaspirate before washing it

Способ осуществляют следующим образом. Через анестезированную кожу делают небольшой (не более 0,5 см) разрез или прокол. После чего в подкожное пространство через канюлю вводят раствор Кляйна. Через 15 минут в подкожное пространство вводят 3-миллиметровую отсасывающую канюлю и аспирируют жировую ткань в шприц объемом 60 мл. Липоаспират сразу перемещают в туми-шприц, содержащий 0,25% раствор кетотифена из расчета 1 мл раствора на 20 мл липоаспирата. Шприц встряхивают 5-6 раз для перемешивания раствора кетотифена и липоаспирата. Липоаспират помещают в политетрафторэтиленовый мешок, в который добавляют 10% раствор реополиглюкина из расчета 100 мл раствора реополиглюкина на 100 мл липоаспирата, липоаспират и раствор реополиглюкина перемешивают путем проглаживания мешка, после чего жидкую фракцию сливают, процедуру повторяют 3 раза.The method is as follows. Through anesthetized skin, a small incision or puncture is made (not more than 0.5 cm). Then, Klein's solution is injected into the subcutaneous space through the cannula. After 15 minutes, a 3 mm suction cannula is inserted into the subcutaneous space and the adipose tissue is aspirated into a 60 ml syringe. The lipoaspirate is immediately transferred to a tumi-syringe containing a 0.25% ketotifen solution at the rate of 1 ml of solution per 20 ml of lipoaspirate. The syringe is shaken 5-6 times to mix a solution of ketotifen and lipoaspirate. The lipoaspirate is placed in a polytetrafluoroethylene bag, to which 10% reopoliglucin solution is added at the rate of 100 ml of reopoliglucin solution per 100 ml of lipoaspirate, the lipoaspirate and reopoliglucin solution are mixed by ironing the bag, after which the liquid fraction is drained, the procedure is repeated 3 times.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.The invention is illustrated by the following example.

Доброволец А., 57 лет. После подписания информированного согласия проводилась шприцевая липосакция в абдоминальной области с эстетической целью. 300 мл липоаспирата были помещены в 60 мл туми-шприцы, 3 из которых содержали по 3 мл 0,25% раствора кетотифена, а другие 3 туми-шприца содержали 3 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Шприцы немедленно транспортировали в лабораторию. В условиях ламинарного шкафа обработанные раствором кетотифена и контрольные образцы жировой ткани переносили в разные политетрафторэтиленовые мешки и отмывали путем добавления 150 мл 10% раствора реополиглюкина. Процедуру отмывки повторяли 3 раза. Отмытую жировую ткань из каждого мешка разделили на 6 равных частей по 25 мл, которые переносили в 50 мл пробирки и выделяли стромально-васкулярную фракцию клеток путем ферментативной обработки 0,15% раствором коллагеназы I типа в течение 30 минут. После этого производили подсчет и оценку жизнеспособности клеток. Стромально-васкулярная фракция клеток жировой ткани, предварительно обработанной раствором кетотифена, содержала 97,3 (96,8-98,1)% (медиана и межквартильный интервал) жизнеспособных клеток, что было значимо (р<0,05, критерий Вилкоксона) выше, чем в контроле, где процент жизнеспособных клеток составил 92,7 (92,3-94,0) (медиана и межквартильный интервал).Volunteer A., 57 years old. After signing the informed consent, syringe liposuction was performed in the abdominal region for aesthetic purposes. 300 ml of lipoaspirate were placed in 60 ml tumi-syringes, 3 of which contained 3 ml of 0.25% ketotifen solution, and the other 3 tumi-syringes contained 3 ml of 0.9% sodium chloride solution. Syringes were immediately transported to the laboratory. Under conditions of a laminar cabinet, ketotifen-treated and control samples of adipose tissue were transferred into different polytetrafluoroethylene bags and washed by adding 150 ml of a 10% reopoliglucin solution. The washing procedure was repeated 3 times. The washed adipose tissue from each bag was divided into 6 equal parts of 25 ml, which were transferred to 50 ml tubes and the stromal-vascular fraction of cells was isolated by enzymatic treatment with 0.15% type I collagenase solution for 30 minutes. After that, counting and assessment of cell viability were performed. The stromal-vascular fraction of adipose tissue cells pretreated with a solution of ketotifen contained 97.3 (96.8-98.1)% (median and interquartile range) of viable cells, which was significant (p <0.05, Wilcoxon test) higher than in the control, where the percentage of viable cells was 92.7 (92.3-94.0) (median and interquartile range).

Применение способа позволит повысить клиническую эффективность применения жировой ткани и полученных из нее продуктов (стромально-васкулярной фракции, мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани).The application of the method will improve the clinical effectiveness of the use of adipose tissue and products derived from it (stromal-vascular fraction, mesenchymal stromal cells of adipose tissue).

Claims

A method of treating a lipoaspirate, including washing the lipoaspirate, characterized in that a 0.25% ketotifen solution in a dose of 1 ml of solution per 20 ml of lipoaspirate is added to the lipoaspirate before washing.