RU2623869C1

RU2623869C1 - Method of forecasting personsive survivability in patients with breast cancer

Info

Publication number: RU2623869C1
Application number: RU2016131233A
Authority: RU
Inventors: Юлия Георгиевна Кжышковска; Надежда Викторовна Чердынцева; Николай Васильевич Литвяков; Марина Викторовна Завьялова; Елена Михайловна Слонимская; Матвей Михайлович Цыганов; Ирина Валерьевна Митрофанова; Надежда Васильевна Крахмаль
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-06-29

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: determining the level of expression of YKL-39 using TaqMan technology using specific primers and Sense probe 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, PCR analysis of the expression of the YKL-39 protein gene, the relative expression of the YKL-39 protein gene was evaluated using the Pfaffl method in conventional units (CU) relative to the GAPDH referee gene. As the calibrator, normal breast tissue is used, in which, in the same manner as described above, the level of expression of the YKL-39 protein gene is 1 CU. With an expression level of YKL-39, more than 1 CU is predicted to be high, and at a YKL-39 protein expression level less than 1 CU, a low probability of a prolonged period of non-metastatic survival.

EFFECT: higher prediction accuracy.

1 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования безрецидивной выживаемости при раке молочной железы.The invention relates to medicine, specifically to oncology, and relates to methods for predicting relapse-free survival in breast cancer.

Одним из наиболее важных вопросов в онкологии на протяжении многих лет является проблема прогнозирования течения злокачественных новообразований с целью возможного предсказания развития разных форм прогрессии заболевания. В этой связи актуальным и на сегодняшний день остается поиск дополнительных маркеров, позволяющих оценить риск развития рецидива опухоли, а также разных форм метастазирования, в особенности гематогенной диссеминации [1, 2].One of the most important issues in oncology over the years has been the problem of predicting the course of malignant neoplasms in order to possibly predict the development of various forms of disease progression. In this regard, the search for additional markers that assess the risk of developing tumor recurrence, as well as various forms of metastasis, especially hematogenous dissemination, remains relevant today [1, 2].

Установлено, что при раке молочной железы одним из факторов, влияющих на вероятность отдаленного метастазирования, является взаимодействие опухоли с компонентами микроокружения [3, 4, 5, 6, 8]. При этом одним из ключевых компонентов микроокружения выступают макрофаги, которые могут способствовать или препятствовать формированию гематогенных метастазов. Такая возможность определяется свойствами, которыми обладают данные клетки окружающего внеклеточного матрикса. Макрофаги подразделяются на субпопуляции, имеющие разные поверхностные и секретируемые белки. Особенности таких белков и определяют свойства и возможности макрофагальных клеток к созданию условий для формирования отдаленных гематогенных метастазов [7, 9, 10].It has been established that in breast cancer, one of the factors affecting the likelihood of distant metastasis is the interaction of the tumor with the components of the microenvironment [3, 4, 5, 6, 8]. At the same time, macrophages act as one of the key components of the microenvironment, which can promote or inhibit the formation of hematogenous metastases. This possibility is determined by the properties that these cells of the surrounding extracellular matrix possess. Macrophages are divided into subpopulations having different surface and secreted proteins. The features of such proteins determine the properties and capabilities of macrophage cells to create conditions for the formation of distant hematogenous metastases [7, 9, 10].

Одним из таких белков является YKL-39 - хитиназоподобный протеин макрофагов, относящийся к новому классу внеклеточных медиаторов, которые сочетают в себе свойства цитокинов и факторов роста. Уже известно, что большая часть YKL-39 локализуется не в цитоплазматических везикулах, а в ядерных гранулах, это обстоятельство позволяет предположить не только внеклеточную роль YKL-39 как белка, секретируемого макрофагами, но и его регуляторную функцию для «программирования» самих макрофагов. CD68 имеет важное значение в фагоцитарной активности тканевых макрофагов, участвует во внутриклеточном лизосомальном метаболизме и во внеклеточных взаимодействиях «клетка-клетка» и «клетка-патоген», также он может связываться с лектинами и селектинами, что позволяет макрофагу «заякориваться» в определенном участке ткани. Изменение уровня хитиназоподобных белков в тканях и в кровотоке является ценным диагностическим критерием для мониторинга разных типов активации иммунной системы при различных заболеваниях, в том числе при развитии злокачественных новообразований [11, 14]. One of these proteins is YKL-39, a chitinase-like macrophage protein belonging to a new class of extracellular mediators that combine the properties of cytokines and growth factors. It is already known that most of YKL-39 is localized not in cytoplasmic vesicles, but in nuclear granules, this circumstance suggests not only the extracellular role of YKL-39 as a protein secreted by macrophages, but also its regulatory function for “programming” the macrophages themselves. CD68 is important in the phagocytic activity of tissue macrophages, participates in intracellular lysosomal metabolism and in extracellular cell-cell and cell-pathogen interactions, and it can also bind to lectins and selectins, which allows the macrophage to anchor in a specific area of tissue . A change in the level of chitinase-like proteins in tissues and in the bloodstream is a valuable diagnostic criterion for monitoring different types of activation of the immune system in various diseases, including the development of malignant neoplasms [11, 14].

Наиболее близким к настоящему способу является способ прогнозирования отдаленной безрецидивной выживаемости пациентов при раке молочной железы, предложенный Cobleigh M.A. с соав. [12]. Известный способ предназначен для пациенток, больных инвазивным раком молочной железы, у которых диагностирован эстроген-позитивный рецепторный статус (RE+). Способ включает в себя определение уровня экспрессии РНК-транскрипта CD68. CD68 (кластер дифференцировки 68, макросиалин) - это гликопротеин, являющийся интегральным трансмембранным белком, который экспрессируется на поверхности моноцитов и макрофагов. Данный белок широко используют как маркер макрофагов и опухолевых клеток макрофагального происхождения. Способ прогноза безрецидивной выживаемости Cobleigh M.A. заключается в следующем. Из биопсийных образцов ткани опухоли молочной железы выделяют РНК. Уровень РНК-транскриптов CD68 определяется с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR). Экспрессию указанного продукта оценивают иммуногистохимически или с использованием протеомных технологий. Далее производят сравнение нормализованного уровня экспрессии CD68 с нормализованным уровнем экспрессии CD68 в референсных образцах рака молочной железы. Увеличенный нормализованный уровень экспрессии CD68 является индикатором низкой вероятности длительного периода безрецидивной выживаемости. Closest to the present method is a method for predicting long-term disease-free survival of patients with breast cancer, proposed by Cobleigh M.A. et al. [12]. The known method is intended for patients with invasive breast cancer who are diagnosed with estrogen-positive receptor status (RE +). The method includes determining the expression level of an RNA transcript of CD68. CD68 (differentiation cluster 68, macrosialin) is a glycoprotein, which is an integral transmembrane protein that is expressed on the surface of monocytes and macrophages. This protein is widely used as a marker of macrophages and tumor cells of macrophage origin. A method for predicting relapse-free survival of Cobleigh M.A. consists in the following. RNA is isolated from biopsy samples of breast tumor tissue. The level of CD68 RNA transcripts is determined by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) in real time (RT-qPCR). The expression of the specified product is evaluated immunohistochemically or using proteomic technologies. A comparison is made between the normalized level of expression of CD68 and the normalized level of expression of CD68 in reference samples of breast cancer. The increased normalized level of expression of CD68 is an indicator of the low probability of a long period of disease-free survival.

Одним из недостатков указанного способа является то, что объектом исследования является поверхностный маркер макрофагов, ответственный за их связывание с лектинами и селектинами и фагоцитарную активность макрофагов, не способный оказывать дистантное регуляторное действие на опухолевые клетки. Другим недостатком этого способа является ограниченная область применения, обусловленная тем, что он предназначен только для тех больных раком молочной железы, у которых на клетках опухоли обнаружены рецепторы к эстрогенам (эстроген-позитивный рецепторный статус). One of the disadvantages of this method is that the object of the study is a surface marker of macrophages, responsible for their binding to lectins and selectins and the phagocytic activity of macrophages, not capable of exerting a distant regulatory effect on tumor cells. Another disadvantage of this method is its limited scope, due to the fact that it is intended only for those patients with breast cancer who have estrogen receptors (estrogen-positive receptor status) on the tumor cells.

Новый технический результат – повышение точности способа за счет использования новых маркеров и их конкретных числовых показателей, а также расширение показаний для применения способа.A new technical result is an increase in the accuracy of the method through the use of new markers and their specific numerical indicators, as well as the expansion of indications for the application of the method.

Для достижения нового технического результата в способ прогнозирования вероятности безметастатической выживаемости при раке молочной железы путем исследования биопсийных образцов ткани опухоли молочной железы, полученных перед проведением неоадъювантной терапии с последующим выделением РНК и определением уровня гена, экспрессируемого макрофагами с помощью количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени RT-qPCR, определяют уровень экспрессии YKL-39 по технологии ТaqMan с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1, далее проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39, оценивают относительную экспрессию гена белка YKL-39 с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH, причем в качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой при проведении исследования аналогичным вышеописанному способом уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1 (1 УЕ), и при уровне экспрессии YKL-39 более 1 УЕ прогнозируют высокую, а при уровне экспрессии гена белка YKL-39 менее 1 УЕ - низкую вероятность длительного периода безметастатической выживаемости. To achieve a new technical result, a method for predicting the probability of non-metastatic survival in breast cancer by examining biopsy samples of breast tumor tissue obtained before neoadjuvant therapy, followed by RNA isolation and determining the level of the gene expressed by macrophages using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction in real-time RT-qPCR, determine the expression level of YKL-39 using TaqMan technology using specific primers and samples Sense 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3 ', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, then PCR analysis of gene expression is performed, the gene expression of YK is evaluated, YK gene expression 39 is evaluated YKL-39 protein using the Pfaffl method in arbitrary units (CU) relative to the GAPDH referee gene, and normal breast tissue is used as a calibrator, in which when the study is carried out in the same way as described above, the expression level of the YKL-39 protein is 1 (1 CU) , and with an expression level of YKL-39 greater than 1 UE, a high is predicted, and with ur gene expression is protein YKL-39 below 1 CU - low probability of long period Metastasis-free survival.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Для молекулярно-генетических исследований используют биопсийные образцы опухолевой ткани в объеме ~10 мм³, которые берут у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии. Образцы ткани опухоли помещают в раствор RNALater (Ambion, USA) и после 24-часовой инкубации при температуре +4°С сохраняют при температуре 80°С. For molecular genetic studies, biopsy samples of tumor tissue in a volume of ~ 10 mm ^{3 are used} , which are taken from patients under the supervision of an ultrasound method before neoadjuvant chemotherapy. Tumor tissue samples were placed in an RNALater solution (Ambion, USA), and after 24-hour incubation at + 4 ° C, they were stored at 80 ° C.

На следующих этапах выделяют РНК и ДНК. In the next steps, RNA and DNA are isolated.

РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяют с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивают концентрацию и чистоту выделения РНК. Целостность РНК оценивают при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). С полученной РНК осуществляют синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивают при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia) с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1. Далее с полученной ДНК проводят ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительную экспрессию гена белка YKL-39 оценивают с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора используют нормальную ткань молочной железы, в которой уровень экспрессии гена белка YKL-39 составляет 1.RNA from isolated biopsy samples of tumor tissue was isolated using the RNeasy Plus mini Kit containing DNAase I (Qiagen, Germany, # 74134). A NanoDrop-2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) assesses the concentration and purity of RNA isolation. RNA integrity was assessed by capillary electrophoresis on a TapeStation instrument (Agilent Technologies, USA) and an R6K ScreenTape kit (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). With the resulting RNA carry out DNA synthesis. YKL-39 protein gene expression level was assessed by real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) (RT-qPCR) using TaqMan technology on a RotorGene-6000 amplifier (Corbett Research, Australia) using specific Sense primers and probes 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3 ', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagagat-3'-BHQ1. Then, PCR analysis of the expression of the YKL-39 protein gene is carried out with the obtained DNA. The relative expression of the YKL-39 protein gene is evaluated using the Pfaffl method in arbitrary units (UE) relative to the GAPDH referee gene. Normal breast tissue is used as a calibrator, in which the expression level of the YKL-39 protein gene is 1.

Уровень экспрессии YKL-39 в биопсийных образцах ткани опухоли у больных раком молочной железы более 1 УЕ (YKL-39>1) рассматривают как гиперэкспрессию и оценивают как благоприятный критерий, указывающий на низкий риск развития рецидива и гематогенных метастазов, а значит, на высокую вероятность длительного периода безрецидивной выживаемости. Наоборот, уровень экспрессии гена белка YKL-39 ниже 1 УЕ (YKL-39<1) рассматривают как гипоэкспрессию и оценивают как неблагоприятный показатель, указывающий на высокий риск развития рецидива и возникновения гематогенных метастазов и, соответственно, на низкую вероятность длительного периода безрецидивной выживаемости. The level of expression of YKL-39 in biopsy samples of tumor tissue in patients with breast cancer more than 1 UE (YKL-39> 1) is considered as overexpression and assessed as a favorable criterion, indicating a low risk of relapse and hematogenous metastases, which means a high probability a long period of disease-free survival. On the contrary, the expression level of the YKL-39 protein gene below 1 UE (YKL-39 <1) is considered as hypoexpression and assessed as an unfavorable indicator indicating a high risk of recurrence and hematogenous metastases and, accordingly, a low probability of a long period of disease-free survival.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами. The essence of the proposed method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Больная Л., 40 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Мультицентрический рост опухоли, трижды негативный молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. В 8 исследованных лимфатических узлах аксиллярной клетчатки лимфогенных метастазов обнаружено не было. Стадия заболевания Т2N0M0. Проведено 2 курса неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) по схеме монотерапией таксотером. Эффект НАХТ по шкале RECIST – прогрессирование (149%). При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения НАХТ, согласно предлагаемому способу, значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 19,84. Через 60 месяцев динамического наблюдения у пациентки не было зарегистрировано гематогенных метастазов.Example 1. Patient L., 40 years old, with invasive carcinoma of a non-specific type of breast. Multicentric tumor growth, three times negative molecular genetic type. The size of the primary tumor node is 2.5 cm. In 8 examined lymph nodes of the axillary tissue, lymphogenous metastases were not found. Stage of the disease T2N0M0. Conducted 2 courses of neoadjuvant chemotherapy (NAChT) according to the scheme of monotherapy with taxotere. The effect of NACT on the RECIST scale is progression (149%). When conducting molecular genetic studies of tissue samples of breast tumors taken prior to NACT, according to the proposed method, the value of the expression level of the YKL-39 protein gene was 19.84. After 60 months of follow-up, the patient had no hematogenous metastases.

Пример 2. Больная Н., 47 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы. Уницентрический рост опухоли, люминальный В молекулярно-генетический тип. Размер первичного опухолевого узла составляет 2,5 см. В 10 исследованных лимфатических узлах аксиллярной клетчатки лимфогенных метастазов обнаружено не было. Стадия заболевания Т2N0M0. Проведено 2 курса (НАХТ) по схеме монотерапией таксотером. Эффект НАХТ по шкале RECIST – частичная регрессия (84%). При проведении молекулярно-генетического исследования образцов ткани опухоли молочной железы, взятых до проведения НАХТ, согласно предлагаемому способу, значение уровня экспрессии гена белка YKL-39 составило 0,05. Через 37 месяцев динамического наблюдения у пациентки были зарегистрированы гематогенные метастазы в кости и легких.Example 2. Patient N., 47 years old, with invasive carcinoma of a non-specific type of breast. Unicentric tumor growth, luminal B molecular genetic type. The size of the primary tumor node is 2.5 cm. No lymphogenic metastases were found in 10 lymph nodes of the axillary tissue examined. Stage of the disease T2N0M0. Conducted 2 courses (NAHT) according to the scheme of monotherapy with Taxotere. The effect of NACT on the RECIST scale is partial regression (84%). When conducting molecular genetic studies of tissue samples of breast tumors taken before NAChT, according to the proposed method, the value of the expression level of the gene of the protein YKL-39 was 0.05. After 37 months of follow-up, the patient had hematogenous metastases in the bone and lungs.

Предлагаемый способ основан на анализе данных морфологического и молекулярно-генетического исследования биопсийного и операционного материала, анализе амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного. Изучался биопсийный материал от 91 пациентки больных раком молочной железы стадии IIA-IIIC (T1-4N0-3M0) в возрасте от 28 до 68 лет (средний возраст больных составил 47,4±0,8 лет). Все пациентки проходили лечение в отделении общей онкологии Томского НИИ онкологии в период с 2006 по 2010 г. Исследование проходило в соответствии с Хельсинской Декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 годах), а также с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Гистологический тип опухоли молочной железы устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.).The proposed method is based on the analysis of morphological and molecular genetic studies of biopsy and surgical material, the analysis of outpatient records and medical records of an inpatient. Biopsy material was studied from 91 patients with stage IIA-IIIC breast cancer patients (T1-4N0-3M0) aged 28 to 68 years (mean age of patients was 47.4 ± 0.8 years). All patients underwent treatment at the Department of General Oncology of Tomsk Research Institute of Oncology from 2006 to 2010. The study was conducted in accordance with the Helsinki Declaration of 1964 (amended in 1975 and 1983), as well as with the permission of the local ethics committee of the institute, all patients signed informed consent to the study. The histological type of breast tumor was established according to WHO recommendations (Geneva, 2012).

В плане комбинированного лечения все пациентки на предоперационном этапе получили 2-4 курса полихимиотерапии по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м² в 1-й день, адриамицин 50 мг/м² в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м² в 1-й день, внутривенно; проведение курсов через 21 день), по схеме CAX (циклофосфан 100 мг/м² внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м² внутривенно в 1-й и 8-й дни, кселода 1000 мг/м² 2 раза в день, per os, в течение 14 дней; проведение курсов через 21 день) или монотерапию таксотером (100 мг/м² внутривенно, часовая инфузия в день). Оценку эффективности неоадъювантной химиотерапии проводили по шкале RECIST (Response Evaluation Criteriain Solid Tumors от 2000 г.) спустя 14 дней после второго и четвертого курсов химиотерапии на основании результатов клинического осмотра, УЗИ молочных желез и маммографии. Оперативный этап осуществляли через 14-21 день после завершения курсов неоадъювантной химиотерапии. Операцию выполняли в объеме радикальной мастэктомии, радикальной или секторальной резекции молочной железы. В послеоперационном периоде пациенткам по показаниям проводили адъювантную химиотерапию, гормональную и/или лучевую терапию. Сроки наблюдения за больными составили 5 лет (60 месяцев), по истечении которых у 21 пациентки были диагностированы гематогенные метастазы. Наличие гематогенных метастазов у пациенток регистрировали на основании результатов анализа амбулаторных карт и медицинских карт стационарного больного. In terms of combined treatment, all patients at the preoperative stage received 2-4 courses of chemotherapy according to the FAC scheme (5-fluorouracil 500 mg / m ² on day 1, adriamycin 50 mg / m ² on day 1, cyclophosphamide 500 mg / m ² on the 1st day, intravenously; courses after 21 days), according to the CAX scheme (cyclophosphamide 100 mg / m ² intramuscularly for 14 days, adriamycin 30 mg / m ² intravenously on the 1st and 8th days, xeloda 1000 mg / m ² 2 times a day, per os, for 14 days; courses after 21 days) or monotherapy with taxotere (100 mg / m ² intravenously, hourly infusion per day). The effectiveness of neoadjuvant chemotherapy was assessed using the RECIST scale (Response Evaluation Criteriain Solid Tumors from 2000) 14 days after the second and fourth courses of chemotherapy based on the results of a clinical examination, breast ultrasound and mammography. The surgical stage was carried out 14-21 days after completion of neoadjuvant chemotherapy courses. The operation was performed in the amount of radical mastectomy, radical or sectoral resection of the mammary gland. In the postoperative period, according to indications, patients underwent adjuvant chemotherapy, hormonal and / or radiation therapy. The follow-up period for patients was 5 years (60 months), after which 21 patients were diagnosed with hematogenous metastases. The presence of hematogenous metastases in patients was recorded based on the results of an analysis of outpatient records and medical records of an inpatient.

Для морфологического исследования в течение первого часа после выполнения оперативного вмешательства в операционном материале осуществляли взятие образцов опухолевой ткани. Производили вырезку фрагментов ткани новообразования размером 1×0,5×0,5 см. Материал фиксировали в 10-12% растворе рН-нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили верификацию диагноза, гистологический тип опухоли молочной железы устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012 г.). Среди гистологических типов рака молочной железы в исследование были включены инвазивная карцинома неспецифического типа, инвазивный дольковый рак, медуллярный рак, а также другие редкие типы опухоли.For morphological studies within the first hour after performing surgical intervention in the surgical material, samples of tumor tissue were taken. Fragments of neoplasm tissue were cut out with a size of 1 × 0.5 × 0.5 cm. The material was fixed in a 10-12% solution of pH-neutral formalin. Posting the material and the manufacture of histological preparations was carried out according to standard methods. The preparations were stained with hematoxylin and eosin. The diagnosis was verified, the histological type of the breast tumor was established according to the WHO recommendations (Geneva, 2012). Among the histological types of breast cancer, non-specific invasive carcinoma, invasive lobular carcinoma, medullary cancer, and other rare types of tumors were included in the study.

Для молекулярно-генетических исследований были использованы биопсийные образцы опухолевой ткани (~10 мм³), которые были взяты у пациенток под контролем ультразвукового метода исследования до проведения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). Образцы ткани опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре 80°С (после 24-часовой инкубации при температуре +4°С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК. For molecular genetic studies, biopsy samples of tumor tissue (~ 10 mm ³ ) were used, which were taken from patients under the control of an ultrasound method prior to neoadjuvant chemotherapy (NAChT). Tumor tissue samples were placed in an RNALater solution (Ambion, USA) and stored at 80 ° C (after 24-hour incubation at + 4 ° C) for further isolation of RNA and DNA.

РНК из взятых биопсийных образцов опухолевой ткани выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, # 74134). На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составляла от 80 до 250 нг/мкл, А₂₆₀/А₂₈₀ = 1,95-2,05; А₂₆₀/А₂₃₀ = 1,90-2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). RIN составил 5,6-7,8. С полученной РНК осуществляли синтез ДНК. Уровень экспрессии гена белка YKL-39 оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia) с помощью специфичных праймеров и пробы Sense 5’-aacaacaaggttatcatcaaggac-3’, AntiSense 5’-tttgggattcttggttttgag-3’, Probe FAM-5’-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3’-BHQ1. С полученной ДНК проводили ПЦР-анализ экспрессии гена белка YKL-39. Относительная экспрессия гена белка YKL-39 оценивалась с помощью метода Pfaffl в условных единицах (УЕ) относительно гена рефери GAPDH. В качестве калибратора использовали нормальную ткань молочной железы, взятую от 10 пациенток, у которых при морфологическом исследовании материала каких-либо патологических изменений обнаружено не было. Исследование уровня экспрессии гена белка YKL-39 в данных образцах нормальной ткани молочной железы было проведено аналогичным вышеописанному способом. При этом уровень экспрессии гена белка YKL-39 в образцах нормальной ткани молочной железы составил 1.RNA from isolated biopsy samples of tumor tissue was isolated using the RNeasy Plus mini Kit containing DNAase I (Qiagen, Germany, # 74134). Using a NanoDrop-2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA), the concentration and purity of RNA isolation were evaluated. The concentration of RNA ranged from 80 to 250 ng / μl, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ = 1.95-2.05; A ₂₆₀ / A ₂₃₀ = 1.90-2.31. RNA integrity was evaluated by capillary electrophoresis on a TapeStation instrument (Agilent Technologies, USA) and an R6K ScreenTape kit (Agilent Technologies, USA # 5067-5367). The RIN was 5.6-7.8. DNA was synthesized from the obtained RNA. The expression level of the YKL-39 protein gene was assessed using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (PCR) in real time (RT-qPCR) using TaqMan technology on a RotorGene-6000 amplifier (Corbett Research, Australia) using specific primers and Sense probes 5'-aacaacaaggttatcatcaaggac-3 ', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagagat-3'-BHQ1. The obtained DNA was used for PCR analysis of the expression of the YKL-39 protein gene. The relative expression of the YKL-39 protein gene was evaluated using the Pfaffl method in arbitrary units (UE) relative to the GAPDH referee gene. Normal breast tissue taken from 10 patients who did not show any pathological changes during morphological examination of the material was used as a calibrator. The study of the expression level of the YKL-39 protein gene in these samples of normal breast tissue was carried out in a similar way to the above. At the same time, the expression level of the YKL-39 protein gene in samples of normal breast tissue was 1.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью пакета программ «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., США) с применением метода Каплан-Майера, критерия Фишера. Сравнение достоверности различий между группами производили с помощью log-rank теста. Statistical processing of the obtained results was performed using the STATISTICA 8.0 software package (StatSoft Inc., USA) using the Kaplan-Meier method, Fisher's criterion. Comparison of the significance of differences between groups was performed using the log-rank test.

Таким образом, при исследовании частоты встречаемости гематогенных метастазов у пациенток, больных раком молочной железы, в зависимости от уровня экспрессии гена белка YKL-39 в опухолевой ткани были получены следующие результаты. Исследование показало, что наибольшая частота развития, а соответственно, более высокий риск возникновения рецидива гематогенных метастазов (более короткий период безрецидивной выживаемости) у пациенток с раком молочной железы сопряжены с низким уровнем экспрессии гена белка YKL-39 (уровень экспрессии YKL-39<1) в ткани новообразования (р=0,0025) (табл. 1). Thus, when studying the frequency of hematogenous metastases in patients with breast cancer, depending on the level of expression of the YKL-39 protein gene in tumor tissue, the following results were obtained. The study showed that the highest frequency of development, and accordingly, a higher risk of recurrence of hematogenous metastases (a shorter period of relapse-free survival) in patients with breast cancer are associated with a low level of expression of the YKL-39 protein gene (expression level YKL-39 <1) in neoplasm tissue (p = 0.0025) (Table 1).

Таблица 1. Связь гематогенного метастазирования с уровнем экспрессии гена белка YKL-39 у пациенток, больных раком молочной железы Table 1. The relationship of hematogenous metastasis with the level of gene expression of the YKL-39 protein in patients with breast cancer

Для оценки значимости показателя экспрессии гена белка YKL-39 как прогностического маркера высокого риска рецидива и вероятности развития гематогенных метастазов определяли значение отношения шансов (ОR), доверительный интервал, отношения рисков (RR) [15].To assess the significance of the indicator of expression of the YKL-39 protein as a prognostic marker of high risk of relapse and the likelihood of developing hematogenous metastases, the odds ratio (OR), confidence interval, and risk ratio (RR) were determined [15].

Достоинством предлагаемого нами способа прогнозирования является использование маркера, секретируемого макрофагами (YKL-39), который способен осуществлять как внеклеточную регуляцию, в том числе в отношении опухолевых клеток, так и регулировать функции самих макрофагов. Кроме того, данный способ прогнозирования можно применять у пациенток, больных раком молочной железы, с любым гистологическим типом и рецепторным статусом).The advantage of our forecasting method is the use of a marker secreted by macrophages (YKL-39), which is able to carry out both extracellular regulation, including in relation to tumor cells, and regulate the functions of macrophages themselves. In addition, this forecasting method can be used in patients with breast cancer with any histological type and receptor status).

Источники информацииInformation sources

1. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D.L. Page // Am. J. Surg. Pathol. – 1991. – Vol. 15. – P. 334–349. 1. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favored prognostic types / D.L. Page // Am. J. Surg. Pathol. - 1991. - Vol. 15. - P. 334–349.

2. Телегина Н.С. Связь гематогенной диссеминации с лимфогенным метастазированием при различных молекулярно-генетических вариантах рака молочной железы / Н.С. Телегина, О.Д. Брагина, К.Ю. Христенко, М.В. Завьялова, С.В. Вторушин, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, Е.В. Денисов, Н.В. Чердынцева // Бюллетень сибирской медицины. – 2013. – Том 12, №6. – С. 62-66.2. Telegin N.S. The relationship of hematogenous dissemination with lymphogenous metastasis in various molecular genetic variants of breast cancer / N.S. Telegin, O.D. Bragin, K.Yu. Khristenko, M.V. Zavyalova, S.V. Vtorushin, V.M. Perelmuter, E.M. Slonimskaya, E.V. Denisov, N.V. Cherdyntseva // Bulletin of Siberian medicine. - 2013. - Volume 12, No. 6. - S. 62-66.

3. Осинский С.П. Микроокружение опухолевых клеток и опухолевая прогрессия. Факторы стромального микроокружения / С.П. Осинский // Онкология. Здоровье Украины. - Червень. - 2013. – Тематический номер. – С. 36-39.3. Osinsky S.P. Microenvironment of tumor cells and tumor progression. Stromal microenvironment factors / S.P. Osinsky // Oncology. Health of Ukraine. - Worm. - 2013. - Theme number. - S. 36-39.

4. Sleeman J.P. Concept of metastasis in flux: the stromal progression model / J.P. Sleeman, G. Christofori, R. Fodde [et al.] // Seminar in Cancer Biology. – 2012. – Vol. 22. – P. 174-186.4. Sleeman J.P. Concept of metastasis in flux: the stromal progression model / J.P. Sleeman, G. Christofori, R. Fodde [et al.] // Seminar in Cancer Biology. - 2012. - Vol. 22. - P. 174-186.

Smith5. H.A. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells / H. A. Smith, Y. Kang // J. Mol. Med. (Berl). – 2013. – Vol. 91(4). - P. 411–429.Smith5. H.A. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells / H. A. Smith, Y. Kang // J. Mol. Med. (Berl). - 2013 .-- Vol. 91 (4). - P. 411-429.

6. Quail D.F. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis / D.F. Quail, J.A. Joyce // Nat. Med. – 2013. – Vol. 19(11). – P. 1423-1437.6. Quail D.F. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis / D.F. Quail, J.A. Joyce // Nat. Med. - 2013 .-- Vol. 19 (11). - P. 1423-1437.

Mao7. Y. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer / Y. Mao, E.T. Keller, D.H. Garfield et al. // Cancer Metastasis Rev. – 2013. – Vol. 32(1-2). – P. 303-315. Mao7. Y. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer / Y. Mao, E.T. Keller, D.H. Garfield et al. // Cancer Metastasis Rev. - 2013 .-- Vol. 32 (1-2). - P. 303-315.

8. Kerkar S. P. Cellular Constituents of Immune Escape within the Tumor Microenvironment / S.P. Kerkar, N.P. Restifo // Cancer Research Reviews. – 2012. – Vol. 72(13). – P. 3125-3130.8. Kerkar S. P. Cellular Constituents of Immune Escape within the Tumor Microenvironment / S.P. Kerkar, N.P. Restifo // Cancer Research Reviews. - 2012. - Vol. 72 (13). - P. 3125-3130.

9. Finger E.C. Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease / E.C. Finger, A.J. Giaccia // Cancer metastasis reviews. – 2010. – Vol. 29. - P. 285–293.9. Finger E.C. Hypoxia, inflammation, and the tumor microenvironment in metastatic disease / E.C. Finger, A.J. Giaccia // Cancer metastasis reviews. - 2010 .-- Vol. 29. - P. 285–293.

10. Galli S.J. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils / S.J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn // Nature immunology. – 2011. – Vol. 12. – P. 1035-1044.10. Galli S.J. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils / S.J. Galli, N. Borregaard, T.A. Wynn // Nature immunology. - 2011. - Vol. 12. - P. 1035-1044.

11. Areshkov P.A., Kavsan V.M. Chitinase 3-like protein 2 (CHI3L2, YKL-39) activates phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases ERK1/ERK2 in human embryonic kidney (hek293) and human glioblastoma (U87 MG) cells // Цитология и генетика. – 2010. – Vol. 44, No 1. – С. 3-9.11. Areshkov P.A., Kavsan V.M. Chitinase 3-like protein 2 (CHI3L2, YKL-39) activates phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases ERK1 / ERK2 in human embryonic kidney (hek293) and human glioblastoma (U87 MG) cells // Cytology and Genetics. - 2010 .-- Vol. 44, No 1 .-- S. 3-9.

12. Cobleigh M.A. Gene expression markers for breast cancer prognosis / Cobleigh M.A., S. Shak, J.B. Baker, M.T. Cronin // Patent Application Publication. Pub. No: US 2011/0312532 A1. Pub. Date: Dec. 22, 2011.12. Cobleigh M.A. Gene expression markers for breast cancer prognosis / Cobleigh M.A., S. Shak, J.B. Baker, M.T. Cronin // Patent Application Publication. Pub. No: US 2011/0312532 A1. Pub. Date: Dec. 22, 2011.

13. Litviakov N.V. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response / Litviakov N.V. et al. // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. – 2013. – Vol.71, N. 1. – P. 153-163.13. Litviakov N.V. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response / Litviakov N.V. et al. // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. - 2013. - Vol. 71, N. 1. - P. 153-163.

14. Holness C.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins / Holness C.L., Simmons D.L. // Blood. – 1993. – Vol. 81, N. 6. – P.1607–13.14. Holness C.L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins / Holness C. L., Simmons D. L. // Blood. - 1993. - Vol. 81, N. 6. - P.1607–13.

15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва // Медиа Сфера. – Москва. – 2006. – 312 с.15. Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. Application of the software package Statistica / O.Yu. Rebrova // Media Sphere. - Moscow. - 2006. - 312 p.

Claims

A method for predicting relapse-free survival in patients with breast cancer by examining biopsy samples of breast tumor tissue obtained before neoadjuvant therapy, followed by isolation of RNA and determining the level of the gene expressed by macrophages using real-time quantitative reverse transcriptase polymerase polymerase chain reaction RT- qPCR, characterized in that they determine the level of expression of YKL-39 according to TaqMan technology using specific primers and Sense 5'-aacaacaaggttatcatcacagg- 3 ', AntiSense 5'-tttgggattcttggttttgag-3', Probe FAM-5'-agtgaagtgatgctctaccagaccat-3'-BHQ1, then a PCR analysis of the expression of the YKL-39 protein is performed, the relative expression of the YKL-39 protein gene is evaluated using the Pfaffl method arbitrary units (UE) relative to the GAPDH referee gene, moreover, normal breast tissue is used as a calibrator, in which when the study is performed in the same way as described above, the expression level of the YKL-39 protein is 1, and when the expression level of YKL-39 is greater than 1 , and at a gene expression level of the YKL-39 protein less than 1 UE - n viscous probability long period Metastasis-free survival.