RU2697005C2

RU2697005C2 - Method of producing l-amino acids

Info

Publication number: RU2697005C2
Application number: RU2018101060A
Authority: RU
Inventors: Дзун Ок МООН; Санг Дзо ЛИМ; До Хиун КВОН; Кванг Хо ЛИ; Хиун Вон БАЕ
Original assignee: СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРП.
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2019-08-08
Also published as: RU2018101060A; RU2018101060A3

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Disclosed is a method of producing L-threonine, involving culturing a recombinant coryneform microorganism capable of producing L-threonine, where the recombinant coryneformic microorganism is transformed by inserting a promoter which is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, below the stop codon of the target gene on the chromosome, and where the target gene is a gene which codes dihydrodipicolinate synthase.

EFFECT: invention increases production of L-threonine by 50 % using said recombinant microorganism in the presence of acetate in comparison with the parent microorganism.

1 cl, 2 dwg, 12 tbl, 13 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

По настоящей заявке испрашивается приоритет по патентной заявке Кореи № 10-2013-0121090, зарегистрированной 11 октября 2013 года, и патентной заявке Кореи № 10-2014-0091307, зарегистрированной 18 июля 2014 года, в Korean Intellectual Property Office, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.This application claims priority for Korean Patent Application No. 10-2013-0121090, registered October 11, 2013, and Korean Patent Application No. 10-2014-0091307, registered July 18, 2014, in the Korean Intellectual Property Office, the description of which is included in this description as links in full.

Один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения относятся к способу получения L-аминокислот с использованием способа ингибирования транскрипции генов.One or more embodiments of the present invention relates to a method for producing L-amino acids using a method for inhibiting gene transcription.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Пируват, получаемый посредством гликолиза различных источников углерода в коринеформных микроорганизмах, превращается в аспартат через оксалоацетат. Аспартат превращается в аминокислоты, такие как треонин, метионин, изолейцин и лизин, с помощью различных путей биосинтеза (фиг. 1). Таким образом, экспрессию генов, находящихся в каждой узловой точке процессов биосинтеза аминокислот, можно ингибировать для снижения образования побочных продуктов и повышения продукции целевых аминокислот.Pyruvate, obtained by glycolysis of various carbon sources in coryneform microorganisms, is converted to aspartate via oxaloacetate. Aspartate is converted into amino acids, such as threonine, methionine, isoleucine and lysine, using various biosynthesis pathways (Fig. 1). Thus, the expression of genes located at each nodal point of amino acid biosynthesis processes can be inhibited to reduce the formation of by-products and increase the production of target amino acids.

Как описано выше, для получения штамма микроорганизма, способного к высокоактивной продукции целевых материалов, с использованием генетической инженерии и метаболической инженерии необходимо избирательно контролировать экспрессию генов, связанных с различными метаболическими процессами микроорганизма. Недавно сообщали о технологии ослабления экспрессии генов, названной "искусственная конвергентная транскрипция" (Krylov et al., J Mol Microbiol Biotechnol, 18:1-13, 2010). Искусственная конвергентная транскрипция является технологией ослабления экспрессии гена-мишени посредством инсерции промотора в нижележащую область терминатора транскрипции гена-мишени таким образом, что противоположное направление промотора вызывает столкновение комплексов РНК-полимеразы, происходящих из каждого промотора в течение транскрипции.As described above, in order to obtain a strain of a microorganism capable of highly active production of target materials, using genetic engineering and metabolic engineering, it is necessary to selectively control the expression of genes associated with various metabolic processes of the microorganism. Recently, a technology for attenuating gene expression called “artificial convergent transcription” has been reported (Krylov et al., J Mol Microbiol Biotechnol, 18: 1-13, 2010). Artificial convergent transcription is a technology for attenuating expression of a target gene by inserting a promoter into the downstream region of the target gene transcription terminator in such a way that the opposite direction of the promoter causes a collision of RNA polymerase complexes originating from each promoter during transcription.

Авторы настоящего изобретения разрабатывали технологию избирательного ингибирования экспрессии гена-мишени в присутствие ацетата посредством инсерции ацетат-индуцибельного промотора в направлении, противоположном транскрипции гена-мишени, и эффективно применяли технологию для ингибирования экспрессия генов, находящихся в узловых точках в коринеформном микроорганизме. Затем авторы настоящего изобретения подтверждали получение коринеформного микроорганизма, продуцирующего L-аминокислоту с высоким выходом, с использованием технологии и осуществляли настоящее изобретение.The inventors of the present invention developed a technology for selectively inhibiting expression of a target gene in the presence of acetate by inserting an acetate-inducible promoter in the opposite direction to transcription of the target gene, and effectively used technology to inhibit the expression of genes located at nodal points in a coryneform microorganism. Then, the inventors of the present invention confirmed the preparation of a coryneform microorganism producing an L-amino acid in high yield using technology and the present invention was carried out.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМАTECHNICAL PROBLEM

Целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислот с использованием ацетат-индуцибельного промотора для ингибирования транскрипции гена-мишени.An object of the present invention is to provide a method for producing L-amino acids using an acetate-inducible promoter to inhibit transcription of a target gene.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу получения L-аминокислот, включающемуOne of the embodiments of the present invention relates to a method for producing L-amino acids, including

1) культивирование рекомбинантного коринеформного микроорганизма, способного продуцировать L-аминокислоты, где рекомбинантный коринеформный микроорганизм трансформируют посредством инсерции ацетат-индуцибельного промотора ниже стоп-кодона гена-мишени в хромосоме; и1) the cultivation of a recombinant coryneform microorganism capable of producing L-amino acids, where the recombinant coryneform microorganism is transformed by insertion of an acetate-inducible promoter below the stop codon of the target gene in the chromosome; and

2) добавление ацетата при культивировании для ослабления экспрессии гена-мишени и усиления способности рекомбинантного коринеформного микроорганизма продуцировать L-аминокислоты.2) the addition of acetate during cultivation to weaken the expression of the target gene and enhance the ability of the recombinant coryneform microorganism to produce L-amino acids.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫSOLUTION TO THE PROBLEM

Далее будут подробно описаны варианты осуществления, примеры которых проиллюстрированы в сопутствующих чертежах, где на всем протяжении подобные номера позиций относятся к подобным элементам. В связи с этим, настоящие варианты осуществления могут иметь различные формы, и их не следует истолковывать как ограничение описаний, изложенных в настоящей заявке. Таким образом, варианты осуществления лишь описаны ниже со ссылкой на фигуры для объяснения аспектов настоящего описания. Выражения, такие как "по меньшей мере один", предшествующие списку элементов, модифицируют весь список элементов и не модифицируют отдельные элементы списка.Embodiments will be described in detail below, examples of which are illustrated in the accompanying drawings, where throughout these like reference numbers refer to like elements. In this regard, the present embodiments may take various forms and should not be construed as limiting the descriptions set forth in this application. Thus, embodiments are only described below with reference to the figures to explain aspects of the present description. Expressions such as “at least one” preceding the list of items modify the entire list of items and do not modify individual items in the list.

Далее в настоящем описании подробно описывают настоящее изобретение.Further in the present description, the present invention is described in detail.

Термин "ацетат-индуцибельный промотор", используемый в настоящем описании, относится к промотору, имеющему активность, индуцирующую экспрессию генов в присутствие ацетата.The term “acetate-inducible promoter”, as used herein, refers to a promoter having an activity inducing gene expression in the presence of acetate.

В коринеформном микроорганизме ацетат превращается ацетаткиназой (ackA, NCgl2656) и фосфотрансацетилазой (pta, NCgl2657) или сукцинил-КоА:ацетат-КоА-трансферазой (actA, NCgl2480) в ацетил-КоА, а затем метаболизируется изоцитратлиазой (aceA, NCgl2248) в глиоксилатном цикле. У Escherichia coli ацетат превращается в ацетил-КоА ацетил-КоА-синтазой (acs, b4069) (Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104:99-122, 2003). Экспрессия указанных генов, участвующих в метаболизме ацетата, индуцируется в присутствие ацетата. Таким образом, при использовании промоторов генов экспрессию гена можно специально индуцировать в присутствие ацетата.In the coryneform microorganism, acetate is converted by acetate acetate kinase (ackA, NCgl2656) and phosphotransacetylase (pta, NCgl2657) or succinyl-CoA: acetate-CoA-transferase (actA, NCgl2480) to acetyl-CoA, and then metabolized by isocytrate lyoxylate 24-cycloisylate glyoxylate acetylase glyoxylate . In Escherichia coli, acetate is converted to acetyl-CoA by acetyl-CoA synthase (acs, b4069) (Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104: 99-122, 2003). Expression of these genes involved in the metabolism of acetate is induced in the presence of acetate. Thus, when using gene promoters, gene expression can be specifically induced in the presence of acetate.

Ацетат-индуцибельные промоторы включают промотор гена, кодирующего изоцитратлиазу (aceA, NCgl2248), или промотор оперона гена, кодирующего ацетаткиназу (ackA, NCgl2656), и гена, кодирующего фосфотрансацетилазу (pta, NCgl2657), являющегося вышележащим промотором гена pta. Более конкретно, среди описываемых выше ацетат-индуцибельных промоторов, промотор гена aceA представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 и включает 486 пар оснований выше гена aceA и 36 пар оснований от N-конца открытой рамки считывания (ORF).Acetate-inducible promoters include the promoter of the gene encoding isocitratlyase (aceA, NCgl2248), or the promoter of the operon of the gene encoding acetate kinase (ackA, NCgl2656), and the gene encoding phosphotransacetylase (pta, NCgl2657), which is an upstream promoter. More specifically, among the acetate-inducible promoters described above, the aceA promoter is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and includes 486 base pairs above the aceA gene and 36 base pairs from the N-terminus of the open reading frame (ORF).

Вышележащий промотор гена pta, являющийся другим ацетат-индуцибельным промотором, представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 и включает 340 пар оснований выше гена pta.The upstream pta gene promoter, which is another acetate inducible promoter, is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and includes 340 base pairs above the pta gene.

Кроме того, очевидно, что в объем настоящего изобретения можно включать любой промотор, способный индуцировать экспрессию гена-мишени посредством ацетата. Например, ацетат-индуцибельные промоторы могут включать нуклеотидную последовательность, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2 или включающую консервативную последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, и один или множество нуклеотидов (конкретно - от 2 до 20, более конкретно - от 2 до 10, еще более конкретно - от 2 до 5 нуклеотидов в зависимости от стерической конформации аминокислотных остатков белка), подвергнутых замене, делеции, инсерции, добавлению или инверсии в одном или нескольких положениях. При условии, что функцию индуцибельного промотора сохраняют или усиливают, он может включать нуклеотидную последовательность, имеющую более 80% гомологии по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, конкретно - более 90%, более конкретно - более 95%, еще более конкретно - более 97%. При условии, что функцию индуцибельного промотора сохраняют, подвергнутая замене, делеции, инсерции, добавлению или инверсии нуклеотидная последовательность может включать спонтанно-мутантную последовательность или даже искусственную мутантную последовательность.In addition, it is obvious that any promoter capable of inducing expression of the target gene via acetate can be included in the scope of the present invention. For example, acetate-inducible promoters may include a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 or comprising the conservative nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, and one or more nucleotides (specifically, from 2 to 20, more specifically - from 2 to 10, more specifically, from 2 to 5 nucleotides, depending on the steric conformation of the amino acid residues of the protein) subjected to substitution, deletion, insertion, addition or inversion in one or more positions. Provided that the function of the inducible promoter is maintained or enhanced, it may include a nucleotide sequence having more than 80% homology with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, specifically more than 90%, more specifically more than 95%, even more specifically, more than 97%. Provided that the function of the inducible promoter is maintained, replaced, deleted, inserted, added or inverted, the nucleotide sequence may include a spontaneous mutant sequence or even an artificial mutant sequence.

Термин "гомология", используемый в настоящем описании относится к идентичности между двумя различными нуклеотидными последовательностями. Гомологию можно определять известным в этой области способом с использованием программного обеспечения BLAST 2.0, с помощью которого вычисляют такие параметры, как балл, идентичность и сходство. Однако способ определения гомологии не ограничен указанным выше.The term “homology” as used herein refers to the identity between two different nucleotide sequences. Homology can be determined in a manner known in the art using BLAST 2.0 software, which calculates parameters such as score, identity and similarity. However, the method for determining homology is not limited to the above.

Если в настоящем описании не указано иначе, термин "вышележащий" относится к 5'-направлению, и термин "нижележащий" относится к 3'-направлению. Как правило, направлением транскрипции является 5'-3' таким образом, что положение промотора, как правило, находится выше (5') гена-мишени.Unless otherwise specified in the present description, the term “overlying” refers to the 5'-direction, and the term “underlying” refers to the 3'-direction. Typically, the direction of transcription is 5'-3 'such that the position of the promoter is typically above (5') the target gene.

В настоящем описании ген-мишень на хромосоме может являться геном, участвующим в процессе биосинтеза аминокислот, таких как треонин, метионин, изолейцин и лизин, из различных источников углерода, в частности, геном, находящимся в узловой точке пути биосинтеза.In the present description, the target gene on the chromosome can be a gene involved in the biosynthesis of amino acids, such as threonine, methionine, isoleucine and lysine, from various carbon sources, in particular, a gene located at the nodal point of the biosynthesis pathway.

Например, что касается лизина, в узловых точках пути биосинтеза находятся ген субъединицы E1 пируватдегидрогеназы (aceE, NCgl2167), участвующей в превращении пирувата в ацетил-КоА, ген гомосериндегидрогеназы (hom, NCgl1136), продуцирующей гомосерин из аспартата, и ген УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигазы (murE, NCgl2083), использующей мезо-2,6-диаминопимелат, являющийся предшественником лизина в соматическом синтезе.For example, with regard to lysine, at the nodal points of the biosynthesis pathway are the E1 subunit gene of pyruvate dehydrogenase (aceE, NCgl2167), which is involved in the conversion of pyruvate to acetyl-CoA, the homoserine dehydrogenase gene (hom, NCgl1136), and the UDF-N gene acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (murE, NCgl2083) using meso-2,6-diaminopimelate, which is a precursor of lysine in somatic synthesis.

Кроме того, что касается треонина, в узловой точке находится ген дигидродипиколинатсинтазы (dapA, NCgl1896), участвующей в продукции лизина из аспартата, и, что касается метионина, в узловой точке находится ген гомосеринкиназы (thrB, NCgl1137), участвующей в продукции треонина из гомосерина. Что касается аланина и валина, являющихся аминокислотами, образующимися из пирувата, в узловой точке находится ген субъединицы E1 пируватдегидрогеназы (aceE, NCgl2167), участвующей в превращении пирувата в ацетил-КоА.In addition, with regard to threonine, at the nodal point is the dihydrodipicolinate synthase gene (dapA, NCgl1896), which is involved in the production of lysine from aspartate, and, with regard to methionine, at the nodal point is the homoserine kinase gene (thrB, NCgl1137), which is involved in the production of threonine from homoserine . As for alanine and valine, which are amino acids formed from pyruvate, at the nodal point is the gene of the E1 subunit of pyruvate dehydrogenase (aceE, NCgl2167), which is involved in the conversion of pyruvate to acetyl-CoA.

Таким образом, ген-мишень, в качестве неограничивающих примеров, можно выбирать из группы, состоящей из гена, кодирующего субъединицу E1 пируватдегидрогеназы (aceE, NCgl2167), гена, кодирующего гомосериндегидрогеназу (hom, NCgl1136), гена, кодирующего УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигазу (murE, NCgl2083), и гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу (dapA, NCgl1896).Thus, the target gene, as non-limiting examples, can be selected from the group consisting of a gene encoding the E1 subunit of pyruvate dehydrogenase (aceE, NCgl2167), a gene encoding homoserine dehydrogenase (hom, NCgl1136), a gene encoding UDF-N-acetylmuramoilanilan D-glutamate-2,6-diaminopimelate lipase (murE, NCgl2083), and a gene encoding dihydrodipicolinate synthase (dapA, NCgl1896).

Конкретно, субъединица E1 пируватдегидрогеназы (aceE, NCgl2167) является одной из белковых субъединиц комплекса пируватдегидрогеназы (PDHC), участвующей в поступлении пирувата, являющегося конечным метаболитом гликолиза цикла трикарбоновых кислот (цикла TCA). Таким образом, ослабление экспрессии гена aceE может снижать поступление источников углерода в цикл TCA и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина для повышения продукции лизина.Specifically, the pyruvate dehydrogenase E1 subunit (aceE, NCgl2167) is one of the protein subunits of the pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) involved in the delivery of pyruvate, which is the final metabolite of the glycolysis of the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle). Thus, attenuation of aceE gene expression can decrease the supply of carbon sources to the TCA cycle and increase the supply of carbon sources to the lysine biosynthesis pathway to increase lysine production.

Гомосериндегидрогеназа (hom, NCgl1136) является ферментом, синтезирующим гомосерин из полуальдегида аспартата. Т.к. полуальдегид аспартата является одним из промежуточных предшественников в пути биосинтеза лизина, ослабление активности гена hom может снижать поступление источников углерода в путь биосинтеза гомосерина и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина для повышения продукции лизина.Homoserine dehydrogenase (hom, NCgl1136) is an enzyme that synthesizes homoserine from aspartate semi-aldehyde. Because aspartate semi-aldehyde is one of the intermediate precursors in the pathway of lysine biosynthesis; weakening the activity of the hom gene can decrease the supply of carbon sources to the pathway of homoserine biosynthesis and increase the supply of carbon sources to the pathway of lysine biosynthesis to increase lysine production.

УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигаза (murE, NCgl2083) использует мезо-2,6-диаминопимелат для соматического синтеза. Т.к. мезо-2,6-диаминопимелат также используется в качестве предшественника для биосинтеза лизина, ослабление активности гена murE может снижать поступление источников углерода в соматический синтез и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина для повышения продукции лизина.UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (murE, NCgl2083) uses meso-2,6-diaminopimelate for somatic synthesis. Because Meso-2,6-diaminopimelate is also used as a precursor for lysine biosynthesis; weakening of murE gene activity can reduce the supply of carbon sources to somatic synthesis and increase the supply of carbon sources to the lysine biosynthesis pathway to increase lysine production.

Дигидродипиколинатсинтаза (dapA, NCgl1896) является ферментом, участвующим в продукции лизина с использованием полуальдегида аспартата. Т.к. полуальдегид аспартата является одним из промежуточных предшественников в пути биосинтеза лизина, ослабление активности гена dapA может снижать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза треонина для повышения продукции треонина.Dihydrodipicolinate synthase (dapA, NCgl1896) is an enzyme involved in the production of lysine using aspartate semi-aldehyde. Because aspartate semi-aldehyde is one of the intermediate precursors in the lysine biosynthesis pathway, the weakening of the dapA gene activity can reduce the supply of carbon sources to the lysine biosynthesis pathway and increase the supply of carbon sources to the threonine biosynthesis pathway to increase threonine production.

Термин "стоп-кодон", используемый в настоящем описании, относится к кодонам, не кодирующим аминокислоту в мРНК, а действующим в качестве сигнала для терминации синтеза белка. Общепринято в качестве стоп-кодонов используют три кодона, включающих UAA, UAG и UGA.The term “stop codon,” as used herein, refers to codons that do not encode an amino acid in mRNA but act as a signal for terminating protein synthesis. It is generally accepted that three codons are used as stop codons, including UAA, UAG, and UGA.

Термин "терминатор транскрипции", используемый в настоящем описании, относится к GC-богатой последовательности инвертированного повтора. Терминатор транскрипции образует петлю-шпильку для терминации транскрипции генов.The term "transcription terminator", as used herein, refers to a GC-rich inverted repeat sequence. The transcription terminator forms a hairpin for terminating gene transcription.

В настоящем изобретении для ослабления экспрессии гена-мишени, как описано выше, можно встраивать ацетат-индуцибельный промотор ниже стоп-кодона гена-мишени, конкретно, между стоп-кодоном и выше терминатора транскрипции. Можно использовать ацетат-индуцибельный промотор для вызывания инверсии транскрипции гена-мишени таким образом, что комплексы РНК-полимеразы могут сталкиваться друг с другом с ослаблением экспрессии гена-мишени.In the present invention, to attenuate expression of the target gene, as described above, an acetate-inducible promoter can be inserted below the stop codon of the target gene, specifically, between the stop codon and above the transcription terminator. An acetate-inducible promoter can be used to induce inversion of the transcription of the target gene in such a way that RNA polymerase complexes can interfere with each other with a weakening of the expression of the target gene.

Экспрессию гена-мишени можно ослаблять при каждом культивировании. Более конкретно, экспрессию гена-мишени можно ослаблять до культивирования или в течение него.The expression of the target gene can be attenuated with each cultivation. More specifically, expression of the target gene can be attenuated prior to or during cultivation.

Термин "трансформация", используемый в настоящем описании, относится к встраиванию вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий ген-мишень, в клетку-хозяина таким образом, что в клетке-хозяине может экспрессироваться белок, кодируемый полинуклеотидом. При условии, что встраиваемый полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, полинуклеотид можно встраивать в хромосому клетки-хозяина, или он может находиться вне хромосомы. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК или РНК, кодирующую белок-мишень. При условии, что полинуклеотид можно встраивать и экспрессировать в клетке-хозяине, полинуклеотид можно встраивать в любой форме.The term "transformation" as used herein refers to the insertion of a vector comprising a polynucleotide encoding a target gene into a host cell such that a protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. Provided that the inserted polynucleotide can be expressed in the host cell, the polynucleotide can be inserted into the chromosome of the host cell, or it can be located outside the chromosome. In addition, the polynucleotide includes DNA or RNA encoding a target protein. Provided that the polynucleotide can be inserted and expressed in a host cell, the polynucleotide can be inserted in any form.

В варианте осуществления изобретения коринеформный микроорганизм может включать микроорганизмы рода Corynebacterium, рода Brevibacterium, рода Arthrobacter sp. и рода Microbacterium sp. Примеры коринеформного микроорганизма включают Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum и полученные из них варианты, продуцирующие L-аминокислоты. Конкретно, коринеформный микроорганизм может являться, в качестве неограничивающих примеров, Corynebacterium glutamicum.In an embodiment of the invention, the coryneform microorganism may include microorganisms of the genus Corynebacterium , genus Brevibacterium , genus Arthrobacter sp. and the genus Microbacterium sp. Examples of the coryneform microorganism include Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium thermoaminogenes , Brevibacterium flavum , Brevibacterium lactofermentum, and L-amino acid producing variants derived from them. Specifically, a coryneform microorganism may be, but not limited to, Corynebacterium glutamicum .

Более конкретно, коринеформные микроорганизмы в настоящем изобретении могут включать Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (прежний регистрационный №: KFCC10881, ссылка на патент Кореи №: 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (ссылка на патент Кореи №: 10-0924065), и Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (прежний регистрационный №: KFCC10750, ссылка на патент Кореи №: 10-0073610).More specifically, coryneform microorganisms in the present invention may include Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (old registration №: KFCC10881, Korean Patent Reference №: 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P ( reference to Korean Patent №: 10-0924065), and Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (former registration number: KFCC10750, reference to the Korean patent No.: 10-0073610).

В настоящем изобретении коринеформные микроорганизмы также могут включать Corynebacterium glutamicum CJ3P. Согласно статье Binder et al. (Binder et al., Genome Biology, 13:R40, 2012), можно получать CJ3P, имеющий способность продуцировать лизин, посредством встраивания мутации в три гена, вносящих свой вклад в эффективность продукции лизина (pyc(P458S), hom(V59A) и lysC(T311I)), в родительском штамме Corynebacterium glutamicum дикого типа (ATCC13032).In the present invention coryneform microorganisms may also includeCorynebacterium glutamicum CJ3P. According to an article by Binder et al. (Binder et al., Genome Biology, 13: R40, 2012), it is possible to obtain CJ3P having the ability to produce lysine by embedding mutations in three genes that contribute to the efficiency of lysine production (pyc (P458S), hom (V59A) and lysC (T311I)), in the parent strainCorynebacterium glutamicum wild type (ATCC13032).

Кроме того, в настоящем изобретении другим коринеформным микроорганизмом может являться Corynebacterium glutamicum KCCM11222P, являющийся L-треонин-продуцирующим штаммом (ссылка на патент Кореи №: 10-1335853).In addition, in the present invention, another coryneform microorganism may be Corynebacterium glutamicum KCCM11222P, which is an L-threonine-producing strain (reference to Korean Patent No.: 10-1335853).

По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения во всех коринеформных микроорганизмах, в которые встраивали промотор, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, повышали продукцию L-лизина или L-треонина по сравнению с таковой у родительского штамма.According to one embodiment of the present invention, in all coryneform microorganisms in which the promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 was inserted, the production of L-lysine or L-threonine was increased compared to that of the parent strain.

Что касается способа, представленного в настоящем изобретении, культивирование коринеформного микроорганизма можно осуществлять с использованием любых условий культивирования и способа культивирования, известных в этой области.Regarding the method presented in the present invention, the cultivation of coryneform microorganism can be carried out using any cultivation conditions and cultivation method known in this field.

Среда для культивирования, которую можно использовать в культивировании штамма коринеформного микроорганизма, может являться, например, средами для культивирования, описываемыми в Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).A culture medium that can be used in the cultivation of a strain of a coryneform microorganism can be, for example, the culture media described in Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Источники углерода, которые можно использовать в среде для культивирования, могут включать углевод, такой как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза, масло или липид, такой как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло, жирную кислоту, такую как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирт, такой как глицерин и этанол, и органическую кислоту, такую как уксусная кислота. Эти вещества могут находиться отдельно или в виде смеси.Sources of carbon that can be used in the culture medium may include carbohydrate, such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose, oil or lipid, such as soybean oil, sunflower oil, castor oil and coconut oil, fatty an acid such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, an alcohol such as glycerin and ethanol, and an organic acid such as acetic acid. These substances may be present separately or as a mixture.

Источники азота, которые можно использовать в среде для культивирования, могут включать пептон, дрожжевой экстракт, говяжий экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, сою и мочевину и неорганический источник азота, такой как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота также могут находиться отдельно или в виде смеси.Sources of nitrogen that can be used in the culture medium may include peptone, yeast extract, beef extract, malt extract, corn extract, soy and urea, and an inorganic source of nitrogen such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and nitrate ammonium These nitrogen sources may also be present separately or as a mixture.

Источники фосфора, которые можно использовать в среде для культивирования, могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат дикалия и их натрийсодержащую соль. Кроме того, среда для культивирования может включать соль металла, такую как сульфат магния и сульфат железа, необходимые для роста. Помимо описываемых выше веществ, можно использовать вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в среде для культивирования можно использовать подходящие предшественники. В культуральный раствор можно добавлять сырьевые материалы периодическим способом или непрерывным способом в течение культивирования.Sources of phosphorus that can be used in the culture medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and their sodium salt. In addition, the culture medium may include a metal salt, such as magnesium sulfate and iron sulfate, necessary for growth. In addition to the substances described above, substances necessary for growth, such as amino acids and vitamins, can be used. In addition, suitable precursors may be used in the culture medium. Raw materials can be added to the culture solution in a batch manner or in a continuous manner during cultivation.

В течение культивирования микроорганизма можно корректировать pH среды для культивирования посредством добавления основного соединения, такого как гидроксид аммония, гидроксид калия и аммиак, или кислого соединения, такого как фосфорная кислота и серная кислота, в среду для культивирования подходящим способом. Кроме того, можно подавлять образование пузырьков с использованием пеногасителя, такого как сложный эфир жирной кислоты и полигликоля. Для поддержания аэробных условий в среду для культивирования можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура среды для культивирования, как правило, может составлять от приблизительно 20°C до приблизительно 45°C, конкретно - от приблизительно 25°C до приблизительно 40°C. Можно продолжать культивирование до получения желаемого количества L-аминокислоты, но подходящее время культивирования может составлять от приблизительно 10 до 160 часов.During the cultivation of the microorganism, the pH of the culture medium can be adjusted by adding a basic compound, such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide and ammonia, or an acidic compound, such as phosphoric acid and sulfuric acid, to the culture medium in a suitable manner. In addition, bubble formation can be suppressed using an antifoam such as a fatty acid ester and polyglycol. To maintain aerobic conditions, oxygen or an oxygen-containing gas (e.g., air) can be introduced into the culture medium. The temperature of the culture medium, as a rule, can be from about 20 ° C to about 45 ° C, specifically from about 25 ° C to about 40 ° C. Cultivation may continue until the desired amount of L-amino acid is obtained, but a suitable culture time may be from about 10 to 160 hours.

Что касается способа, представленного в настоящем изобретении, культивирование можно осуществлять непрерывным способом или периодическим способом, таким как периодический способ, периодический способ с подпиткой и периодический способ с повторной подпиткой. Эти способы культивирования известны в этой области, и можно использовать любой из способов культивирования.Regarding the method presented in the present invention, the cultivation can be carried out in a continuous way or in a batch method, such as a batch method, a batch method with recharge and a batch method with recharge. These cultivation methods are known in the art, and any of the cultivation methods can be used.

Термин "культивирование", используемый в настоящем описании, может включать получение среды для культивирования и время в течение роста микроорганизмов.The term "cultivation", as used in the present description, may include obtaining a medium for cultivation and time during the growth of microorganisms.

Что касается способа, представленного в настоящем изобретении, он может включать дополнительный этап очистки или выделения. Целевую L-аминокислоту можно очищать или выделять из культурального раствора с использованием подходящего способа, известного в этой области, в соответствии со способом, таким как периодическое культивирование, непрерывное культивирование и периодическое культивирование с подпиткой.As for the method presented in the present invention, it may include an additional purification or isolation step. The desired L-amino acid can be purified or isolated from the culture solution using a suitable method known in the art, in accordance with a method such as batch cultivation, continuous cultivation and batch culture with water.

L-аминокислота, продуцируемая при культивировании по настоящему изобретению, может являться аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из треонина, метионина, изолейцина, лизина, валина и аланина, конкретно, лизина или треонина.The L-amino acid produced by cultivation of the present invention may be an amino acid selected from the group consisting of threonine, methionine, isoleucine, lysine, valine and alanine, specifically lysine or threonine.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Эти и/или другие аспекты станут очевидными и более понятными из следующего описания вариантов осуществления, представленных в комбинации с сопутствующими чертежами, в которых:These and / or other aspects will become apparent and more apparent from the following description of embodiments presented in combination with the accompanying drawings, in which:

На фиг. 1 показаны узловые точки процесса биосинтеза аминокислот в коринеформном микроорганизме; иIn FIG. 1 shows the nodal points of the process of biosynthesis of amino acids in a coryneform microorganism; and

Фиг. 2 является схематическим изображением, на котором показано ингибирование экспрессии гена aceE посредством инсерции промотора гена aceA (a) между стоп-кодоном и терминатором транскрипции выше гена aceE или (b) ниже терминатора транскрипции в направлении, противоположном направлению транскрипции гена aceE.FIG. 2 is a schematic diagram showing inhibition of aceE gene expression by insertion of the aceA gene promoter (a) between the stop codon and the transcription terminator above the aceE gene or (b) below the transcription terminator in the opposite direction of the aceE gene transcription.

Способ по изобретениюThe method according to the invention

Далее в настоящем описании настоящее изобретение будет более подробно описано со ссылкой на примеры. Эти примеры представлены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем настоящего изобретения.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These examples are presented for illustrative purposes only and do not limit the scope of the present invention.

ПримерыExamples

Пример 1: Выбор ацетат-индуцибельного промотораExample 1: Selection of an acetate-inducible promoter

Изоцитратлиаза (aceA, NCgl2248) является ключевым ферментом глиоксилатного цикла, и ген, кодирующий изоцитратлиазу, экспрессируется в присутствие ацетата. Кроме того, ацетаткиназа (ackA, NCgl2656) и фосфотрансацетилаза (pta, NCgl2657), являющиеся ферментами, участвующими в процессе метаболизма ацетата, образуют оперон, и их экспрессия усиливается в присутствие ацетата. Промоторные области гена aceA и оперон pta-ackA уже известны (Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003).Isocytratliase (aceA, NCgl2248) is a key enzyme in the glyoxylate cycle, and the gene encoding isocytratliase is expressed in the presence of acetate. In addition, acetate kinase (ackA, NCgl2656) and phosphotransacetylase (pta, NCgl2657), which are enzymes involved in the metabolism of acetate, form an operon, and their expression is enhanced in the presence of acetate. The promoter regions of the aceA gene and the pta-ackA operon are already known (Gerstmeir et al., J Biotechnol, 104, 99-122, 2003).

В примере 1 для ингибирования транскрипции гена-мишени в присутствие ацетата выбирали промотор гена aceA и промотор оперона pta-ack, являющийся вышележащей промоторной областью гена pta. На основе гена aceA, зарегистрированного в US NIH GenBank (регистрационный № NCBI: NCgl2248), получали нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1), включающую 486 пар оснований выше гена aceA и 36 пар оснований от N-конца открытой рамки считывания (ORF). Кроме того, на основе гена pta, зарегистрированного в US NIH GenBank (регистрационный № NCBI: NCgl2657), получали нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 2), включающую 340 пар оснований выше гена pta.In Example 1, the aceA gene promoter and the pta-ack operon promoter, which is the upstream promoter region of the pta gene, were selected to inhibit the transcription of the target gene in the presence of acetate. Based on the aceA gene registered in the US NIH GenBank (Registration No. NCBI: NCgl2248), a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) was obtained comprising 486 base pairs above the aceA gene and 36 base pairs from the N-terminus of the open reading frame (ORF) . In addition, based on the pta gene registered in the US NIH GenBank (Registration No. NCBI: NCgl2657), a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) was obtained comprising 340 base pairs above the pta gene.

Пример 2: Получение вектора для ингибирования экспрессии гена aceEExample 2: Preparation of a vector for inhibiting aceE gene expression

Субъединица E1 пируватдегидрогеназы (aceE, NCgl2167) является одной из белковых субъединиц комплекса пируватдегидрогеназы (PDHC), участвующей в поступлении пирувата, являющегося конечным метаболитом гликолиза в цикле TCA. Таким образом, ослабление экспрессии гена aceE может снижать поступление источников углерода в цикл TCA и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина для повышения продукция лизина (Blombach et al., Appl Microbiol Biotechnol, 76(3):615-23, 2007).The pyruvate dehydrogenase E1 subunit (aceE, NCgl2167) is one of the protein subunits of the pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) involved in the delivery of pyruvate, which is the final glycolysis metabolite in the TCA cycle. Thus, attenuation of aceE gene expression can decrease the supply of carbon sources to the TCA cycle and increase the supply of carbon sources to the lysine biosynthesis pathway to increase lysine production (Blombach et al., Appl Microbiol Biotechnol, 76 (3): 615-23, 2007).

Для избирательного ингибирования экспрессии гена aceE в присутствие ацетата промотор гена aceA встраивали ниже гена aceE таким образом, что транскрипция с этого промотора может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена aceE (фиг. 2).To selectively inhibit the expression of the aceE gene in the presence of acetate, the aceA gene promoter was inserted below the aceE gene so that transcription from this promoter can occur in a direction opposite to the original direction of transcription of the aceE gene (Fig. 2).

Сначала, для прогнозирования терминатора транскрипции гена aceE использовали программное обеспечение CLC main workbench (CLC Bio, Denmark). Терминатор транскрипции является GC-богатой последовательностью инвертированного повтора и образует петлю-шпильку для терминации транскрипции генов. Результат прогнозирования терминатора транскрипции гена aceE свидетельствует о том, что 36 пар оснований, с 21-ой пары оснований до 56-ой пары оснований ниже стоп-кодона гена aceE, образуют петлю-шпильку в качестве терминатора транскрипции. С учетом этого результата получали два вектора для встраивания промотора aceE выше или ниже, соответственно, терминатора транскрипции гена aceE таким образом, что транскрипция с этого промотора может происходить в направлении, противоположном исходному.First, CLC main workbench software (CLC Bio, Denmark) was used to predict the aceE gene transcription terminator. The transcription terminator is a GC-rich inverted repeat sequence and forms a hairpin loop for terminating gene transcription. The result of predicting the aceE gene transcription terminator indicates that 36 base pairs, from the 21st base pair to the 56th base pair below the stop codon of the aceE gene, form a hairpin loop as a transcription terminator. Based on this result, two vectors were obtained for embedding the aceE promoter higher or lower, respectively, of the aceE gene transcription terminator so that transcription from this promoter can occur in the opposite direction to the original one.

<2-1> Получение вектора pDZ-aceE1-PaceA для ингибирования экспрессии гена aceE<2-1> Preparation of pDZ-aceE1-PaceA vector for inhibiting aceE gene expression

Вектор получали посредством инсерции промотора гена aceA ниже стоп-кодона гена aceE, находящегося между стоп-кодоном и вышележащим терминатором транскрипции.The vector was obtained by insertion of the aceA gene promoter below the stop codon of the aceE gene located between the stop codon and the upstream transcription terminator.

Для получения фрагмента гена aceE Corynebacterium glutamicum использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы для синтеза праймеров (SEQ ID NO: 3 и 4), сконструированных содержащими участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 3'-конце фрагмента. Осуществляли ПЦР с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 296 пар оснований от 2474-го нуклеотида от инициаторного кодона гена aceE до 2769-го нуклеотида, стоп-кодона гена aceE. Кроме того, синтезировали праймеры (SEQ ID NO: 5 и 6), сконструированные содержащими участок распознавания SpeI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания XbaI на 3'-конце фрагмента, и осуществляли ПЦР с использованием праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 300 пар оснований ниже стоп-кодона гена aceE. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу PfuUltra™ High-Fidelity (Stratagene) и осуществляли ПЦР с 30 циклами денатурации при 95°C в течение 30 секунд; отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 30 секунд, а затем полимеризацией при 72°C в течение 7 минут.To obtain the aceE gene fragment of Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA was used as a template for the synthesis of primers (SEQ ID NOs: 3 and 4) designed to contain the XbaI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the Spe restriction enzyme recognition site 3 for Spe 'is the end of the fragment. PCR was performed using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 296 base pairs from the 2474th nucleotide from the aceE initiation codon to the 2769th nucleotide, aceE stop codon. In addition, primers were synthesized (SEQ ID NOs: 5 and 6) constructed with SpeI recognition at the 5'-end of the fragment and XbaI recognition at the 3'-end of the fragment, and PCR was performed using primers to produce a DNA fragment of 300 base pairs below the stop codon of the aceE gene. PfuUltra ™ High-Fidelity (Stratagene) DNA polymerase was used as polymerase and PCR was performed with 30 denaturation cycles at 95 ° C for 30 seconds; annealing at 55 ° C for 30 seconds and polymerizing at 72 ° C for 30 seconds, and then polymerizing at 72 ° C for 7 minutes.

Два продукта ПЦР-амплификации и вектор pDZ (ссылка на патент Кореи №: 10-0924065) для встраивания в хромосому, уже полученный посредством расщепления ферментом рестрикции XbaI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-aceE1.Two PCR amplification products and a pDZ vector (reference to Korean patent No. 10-0924065) for incorporation into a chromosome already obtained by XbaI restriction enzyme digestion were cloned using the In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ vector -aceE1.

SEQ ID NO: 3: SEQ ID NO: 3:

aceE-P1F 5'-ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc-3'aceE-P1F 5'-ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc-3 '

SEQ ID NO: 4: aceE-P1R 5'-ttgagactagttattcctcaggagcgtttg-3'SEQ ID NO: 4: aceE-P1R 5'-ttgagactagttattcctcaggagcgtttg-3 '

SEQ ID NO: 5: aceE-P2F 5'-gaataactagtctcaagggacagataaatc-3'SEQ ID NO: 5: aceE-P2F 5'-gaataactagtctcaagggacagataaatc-3 '

SEQ ID NO: 6: SEQ ID NO: 6:

aceE-P2R 5'-gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag-3'aceE-P2R 5'-gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag-3 '

Для получения фрагмента промотора гена aceA Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце и на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 7 и 8). Осуществляли ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированных праймеров для амплификации промоторной области из приблизительно 500 пар оснований, представленных нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Продукт ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки pDZ-aceE1 ферментом рестрикции SpeI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-aceE1-PaceA.To obtain the aceA gene promoter fragment of Corynebacterium glutamicum , primers were synthesized designed containing the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5 ′ end and 3 ′ end of the fragment (SEQ ID NOs: 7 and 8). PCR was performed using Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA as a template and synthesized primers to amplify the promoter region from approximately 500 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. PCR amplification product and DNA fragment obtained by treatment with pDZ-aceE1 restriction enzyme SpeI, cloned using the In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ-aceE1-PaceA vector.

SEQ ID NO: 7: SEQ ID NO: 7:

PaceA-P3F 5'-gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg-3'PaceA-P3F 5'-gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg-3 '

SEQ ID NO: 8: SEQ ID NO: 8:

PaceA-P3R 5'-ctgaggaataactagtttcctgtgcggtacgtggc-3'PaceA-P3R 5'-ctgaggaataactagtttcctgtgcggtacgtggc-3 '

<2-2> Получение вектора pDZ-aceE2-PaceA для ингибирования экспрессии генов aceE<2-2> Preparation of pDZ-aceE2-PaceA vector for inhibiting aceE gene expression

Вектор получали посредством инсерции промотора гена aceA ниже терминатора транскрипции гена aceE.The vector was obtained by inserting the aceA gene promoter below the aceE gene transcription terminator.

Для получения фрагмента гена aceE Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и использовали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 9 и 10). Осуществляли ПЦР с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 294 пар оснований от 2538-го нуклеотида от инициаторного кодона гена aceE до 62-го нуклеотида ниже стоп-кодона. Кроме того, праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 11 и 12), использовали для осуществления ПЦР для получения фрагмента ДНК, включающего 294 пар оснований от 69-го нуклеотида ниже стоп-кодона гена aceE до 362-го нуклеотида. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу PfuUltra™ High-Fidelity (Stratagene) и осуществляли ПЦР с 30 циклами денатурации при 95°C в течение 30 секунд; отжига при 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 30 секунд, а затем полимеризацией при 72°C в течение 7 минут.To obtain the aceE gene fragment of Corynebacterium glutamicum , the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum KCCM11016P was used as a template and primers designed containing the XbaI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the SpeI restriction enzyme recognition site at the 3'-NO end of the fragment ( 9 and 10). PCR was performed using the synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 294 base pairs from the 2538th nucleotide from the initiating codon of the aceE gene to the 62nd nucleotide below the stop codon. In addition, primers designed to contain the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the XbaI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the fragment (SEQ ID NO: 11 and 12) were used to perform PCR to obtain a DNA fragment comprising 294 base pairs from the 69th nucleotide below the stop codon of the aceE gene to the 362nd nucleotide. PfuUltra ™ High-Fidelity (Stratagene) DNA polymerase was used as polymerase and PCR was performed with 30 denaturation cycles at 95 ° C for 30 seconds; annealing at 55 ° C for 30 seconds and polymerizing at 72 ° C for 30 seconds, and then polymerizing at 72 ° C for 7 minutes.

Два продукта ПЦР-амплификации и вектор pDZ для встраивания в хромосому, уже полученный посредством расщепления ферментом рестрикции XbaI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-aceE2.Two PCR amplification products and a pDZ vector for insertion into the chromosome, already obtained by XbaI restriction enzyme digestion, were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ-aceE2 vector.

SEQ ID NO: 9: SEQ ID NO: 9:

aceE-P4F 5'-ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc-3'aceE-P4F 5'-ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc-3 '

SEQ ID NO: 10: SEQ ID NO: 10:

aceE-P4R 5'-gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta-3'aceE-P4R 5'-gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta-3 '

SEQ ID NO: 11: SEQ ID NO: 11:

aceE-P5F 5'-gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc-3'aceE-P5F 5'-gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc-3 '

SEQ ID NO: 12: SEQ ID NO: 12:

aceE-P5R 5'-gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac-3'aceE-P5R 5'-gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac-3 '

Для получения фрагмента промотора гена aceA Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце и на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 13 и 14). ПЦР осуществляли с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированных праймеров для амплификации промоторной области из приблизительно 500 пар оснований, представленных нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Продукт ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки вектора pDZ-aceE2 ферментом рестрикции SpeI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-aceE2-PaceA.To obtain the aceA gene promoter fragment of Corynebacterium glutamicum , primers were synthesized designed containing the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5 ′ end and 3 ′ end of the fragment (SEQ ID NOs: 13 and 14). PCR was performed using Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA as a template and synthesized primers for amplification of the promoter region from approximately 500 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. PCR amplification product and DNA fragment obtained by processing the vector pDZ-aceE2 enzyme restriction SpeI, cloned using the In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the vector pDZ-aceE2-PaceA.

SEQ ID NO: 13: SEQ ID NO: 13:

PaceA-P6F 5'-aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg-3'PaceA-P6F 5'-aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg-3 '

SEQ ID NO: 14: SEQ ID NO: 14:

PaceA-P6R 5'-gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc-3'PaceA-P6R 5'-gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc-3 '

Пример 3: Получение штаммов, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена aceEExample 3: Preparation of strains in which the aceA promoter was inserted below the aceE gene

Векторы pDZ-aceE1-PaceA и pDZ-aceE2-PaceA, полученные в примере 2, встраивали соответствующим образом посредством электропорации в Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, являющийся L-лизин-продуцирующим штаммом (способ трансформации описан в Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol, 52:541-545, 1999). Выбирали соответствующие штаммы, в которых промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена aceE на хромосоме таким образом, что транскрипция с этого промотора может происходить в направлении, противоположном исходному направлению, осуществляя ПЦР для получения L-лизин-продуцирующего штамма. Выбранные штаммы называли Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA и Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE2-PaceA, соответственно. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA находился на международном депонировании под названием Corynebacterium glutamicum CA01-2271 в Korean Culture Center of Microorganism (KCCM) на 12 июня 2013 года с регистрационным № KCCM11432P. Проверяли полученные штаммы, анализируя нуклеотидную последовательность полученной области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6 в качестве праймеров для KCCM11016P::aceE1-PaceA и SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12 в качестве праймеров для KCCM11016P::aceE2-PaceA.The vectors pDZ-aceE1-PaceA and pDZ-aceE2-PaceA obtained in Example 2 were inserted by electroporation into Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, which is an L-lysine-producing strain (the transformation method is described in Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52: 541-545, 1999). The appropriate strains were selected in which the aceA promoter was inserted below the stop codon of the aceE gene on the chromosome so that transcription from this promoter can occur in the direction opposite to the original direction, by PCR to obtain an L-lysine-producing strain. The selected strains were named Corynebacterium glutamicum KCCM11016P :: aceE1-PaceA and Corynebacterium glutamicum KCCM11016P :: aceE2-PaceA, respectively. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P :: aceE1-PaceA was internationally deposited under the name Corynebacterium glutamicum CA01-2271 at the Korean Culture Center of Microorganism (KCCM) on June 12, 2013 with registration number KCCM11432P. The obtained strains were checked by analyzing the nucleotide sequence of the obtained target region by PCR using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 as primers for KCCM11016P :: aceE1-PaceA and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12 as primers for KCCM11016P :: aceE2-PaceA.

Пример 4: Сравнение продукции лизина штаммами, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена aceEExample 4: Comparison of lysine production by strains in which the aceA promoter was inserted below the aceE gene

Штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, используемый в качестве родительского штамма, и Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE1-PaceA и Corynebacterium glutamicum KCCM11016P::aceE2-PaceA, являющиеся L-лизин-продуцирующими штаммами, полученными в примере 3, культивировали описываемым ниже способом.The strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, used as the parent strain, and Corynebacterium glutamicum KCCM11016P :: aceE1-PaceA and Corynebacterium glutamicum KCCM11016P :: aceE2-PaceA, which are the L-lysing examples described below.

Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P::aceE1-PaceA и KCCM11016P::aceE2-PaceA инокулировали соответствующим образом в 25 мл описываемой ниже среды для посева в колбах с дефлекторами емкостью 250 мл с последующим культивированием со встряхиванием при 200 об./мин при 30°C в течение 20 часов. 1 мл раствора посевной культуры добавляли в колбу с дефлекторами емкостью 250 мл, содержащую 24 мл описываемой ниже продукционной среды, с последующим культивированием со встряхиванием при 200 об./мин при 30°C в течение 72 часов. Соответствующие композиции среды для посева и продукционной среды описывают ниже. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P :: aceE1-PaceA and KCCM11016P :: aceE2-PaceA were inoculated respectively in 25 ml of the following medium for seeding in 250 ml baffles, followed by shaking at 200 ° C / min. within 20 hours. 1 ml of the seed culture solution was added to a 250 ml baffle flask containing 24 ml of the production medium described below, followed by cultivation with shaking at 200 rpm at 30 ° C for 72 hours. Appropriate composition of the medium for sowing and production environment are described below.

<Среда для посева (pH 7,0)><Sowing medium (pH 7.0)>

Глюкоза 20 г, пептон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, мочевина 1,5 г, KH₂PO₄ 4 г, K₂HPO₄ 8 г, MgSO₄∙7(H₂O) 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин HCl 1000 мкг, пантотенат кальция 2000 мкг, никотинамид 2000 мкг (на 1 л дистиллированной воды).Glucose 20 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH ₂ PO ₄ 4 g, K ₂ HPO ₄ 8 g, MgSO ₄ ∙ 7 (H ₂ O) 0.5 g, biotin 100 μg , thiamine HCl 1000 μg, calcium pantothenate 2000 μg, nicotinamide 2000 μg (per 1 liter of distilled water).

<Продукционная среда (pH 7,0)><Production medium (pH 7.0)>

Глюкоза 100 г, (NH₄)₂SO₄ 40 г, соевый белок 2,5 г, твердый кукурузный экстракт 5 г, мочевина 3 г, KH₂PO₄ 1 г, MgSO₄∙7(H₂O) 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин HCl 1000 мкг, пантотенат кальция 2000 мкг, никотинамид 3000 мкг, CaCO₃ 30 г (на 1 л дистиллированной воды).Glucose 100 g, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 40 g, soy protein 2.5 g, solid corn extract 5 g, urea 3 g, KH ₂ PO ₄ 1 g, MgSO ₄ ∙ 7 (H ₂ O) 0.5 g, biotin 100 μg, thiamine HCl 1000 μg, calcium pantothenate 2000 μg, nicotinamide 3000 μg, CaCO ₃ 30 g (per 1 liter of distilled water).

После культивирования с использованием ВЭЖХ измеряли концентрацию L-лизина. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-лизина в культуральных растворах Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P::aceE1-PaceA и KCCM11016P::aceE2-PaceA представлена в таблице 1.After cultivation using HPLC, the concentration of L-lysine was measured. For cases where acetate was not added, the concentration of L-lysine in culture solutions of Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, KCCM11016P :: aceE1-PaceA and KCCM11016P :: aceE2-PaceA is presented in Table 1.

Таблица 1
Различия продукции L-лизина (ацетат не добавляли)Table 1
Differences in L-lysine production (no acetate added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 43,543.5 43,143.1 43,443,4 KCCM11016P:: aceE1-PaceAKCCM11016P :: aceE1-PaceA 43,743.7 43,243,2 43,643.6 KCCM11016P:: aceE2-PaceAKCCM11016P :: aceE2-PaceA 43,343.3 43,443,4 43,743.7

Кроме того, штаммы культивировали тем же способом, за исключением, что для сравнения продукции L-лизина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-лизина в культуральных растворах представлена в таблице 2.In addition, the strains were cultured in the same way, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-lysine. The concentration of L-lysine in the culture solutions is presented in table 2.

Таблица 2
Различия продукции L-лизина (добавляли 5 г/л ацетата)table 2
Differences in L-Lysine Production (5 g / L Acetate Added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 45,645.6 45,345.3 45,845.8 KCCM11016P:: aceE1-PaceAKCCM11016P :: aceE1-PaceA 47,247.2 47,147.1 47,447.4 KCCM11016P:: aceE2-PaceAKCCM11016P :: aceE2-PaceA 46,746.7 46,546.5 47,047.0

Как показано в таблице 1, в отсутствие ацетата продукция L-лизина штаммами KCCM11016P::aceE1-PaceA и KCCM11016P::aceE2-PaceA не отличалась от родительского штамма KCCM11016P.As shown in table 1, in the absence of acetate, the production of L-lysine by strains KCCM11016P :: aceE1-PaceA and KCCM11016P :: aceE2-PaceA did not differ from the parent strain KCCM11016P.

Однако, как показано в таблице 2, в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::aceE1-PaceA была на 3,6% выше, чем у родительского штамма KCCM11016P, а штаммом KCCM11016P::aceE2-PaceA - на 2,5% выше, чем у родительского штамма KCCM11016P.However, as shown in Table 2, in the presence of acetate, L-lysine production by strain KCCM11016P :: aceE1-PaceA was 3.6% higher than that of the parent strain KCCM11016P, and strain KCCM11016P :: aceE2-PaceA was 2.5% higher than the parent strain KCCM11016P.

Кроме того, сравнение штамма KCCM11016P::aceE1-PaceA и штамма KCCM11016P::aceE2-PaceA показало, что продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::aceE1-PaceA, в котором промотор aceA встраивали выше терминатора транскрипции гена aceE, находящегося между стоп-кодоном и вышележащей областью терминатора транскрипции, являлась более эффективной. Это свидетельствует о том, что область между стоп-кодоном и вышележащей областью терминатора транскрипции можно использовать для более эффективного ингибирования экспрессия генов.In addition, a comparison of the KCCM11016P :: aceE1-PaceA strain and the KCCM11016P :: aceE2-PaceA strain showed that L-lysine production by the KCCM11016P :: aceE1-PaceA strain, in which the aceA promoter was inserted above the aceE gene transcription terminator between the stop codon and the overlying area of the transcription terminator, was more effective. This suggests that the region between the stop codon and the overlying region of the transcription terminator can be used to more effectively inhibit gene expression.

Пример 5: Получение вектора pDZ-aceE-Ppta для ингибирования экспрессии гена aceEExample 5: Preparation of pDZ-aceE-Ppta vector for inhibiting aceE gene expression

Ацетаткиназа (ackA, NCgl2656) и фосфотрансацетилаза (pta, NCgl2657), являющиеся ферментами, участвующими в процессе метаболизма ацетата, образуют оперон, и их экспрессия усиливается в присутствие ацетата. Таким образом, при использовании промоторов генов экспрессию гена можно специально индуцировать в присутствие ацетата.Acetate kinase (ackA, NCgl2656) and phosphotransacetylase (pta, NCgl2657), which are enzymes involved in the metabolism of acetate, form an operon, and their expression is enhanced in the presence of acetate. Thus, when using gene promoters, gene expression can be specifically induced in the presence of acetate.

В примере 5 для ингибирования экспрессии гена aceE в присутствие ацетата получали вектор для использования промотора оперона pta-ack, являвшегося вышележащей промоторной областью гена pta.In Example 5, to inhibit aceE gene expression in the presence of acetate, a vector was prepared for using the pta-ack operon promoter, which was the upstream promoter region of the pta gene.

Для ингибирования экспрессии гена aceE конструировали вектор, который может содержать промотор гена pta ниже стоп-кодона гена aceE, находящегося между стоп-кодоном и вышележащей областью терминатора транскрипции, таким образом, что транскрипция с промотора гена pta может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена aceE.To inhibit the expression of the aceE gene, a vector was constructed that can contain the pta gene promoter below the stop codon of the aceE gene located between the stop codon and the overlying region of the transcription terminator, so that transcription from the pta gene promoter can occur in the direction opposite to the original direction of transcription aceE gene.

Для получения фрагмента гена aceE Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P для получения вектора pDZ-aceE1 тем же способом, что и в примере 2.To obtain the aceE gene fragment of Corynebacterium glutamicum , the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum KCCM11016P was used as a template to obtain the pDZ-aceE1 vector in the same manner as in Example 2.

Для получения фрагмента промотора гена pta Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце и на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16). Для осуществления ПЦР для амплификации промоторной области из приблизительно 340 пар оснований, представленной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированные праймеры. Продукт ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки вектора pDZ-aceE1 ферментом рестрикции SpeI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-aceE1-Ppta.To obtain the pta Corynebacterium glutamicum pta gene promoter fragment, primers were synthesized designed containing the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5 ′ end and 3 ′ end of the fragment (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16). To perform PCR to amplify the promoter region of approximately 340 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA was used as a template and synthesized primers. The PCR amplification product and DNA fragment obtained by treating the pDZ-aceE1 vector with SpeI restriction enzyme were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ-aceE1-Ppta vector.

SEQ ID NO: 15: SEQ ID NO: 15:

Ppta-P7F 5'-gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg-3'Ppta-P7F 5'-gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg-3 '

SEQ ID NO: 16: SEQ ID NO: 16:

Ppta-P7R 5'-ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3'Ppta-P7R 5'-ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3 '

Пример 6: Получение штаммов, в которых промотор гена pta встраивали ниже гена aceE, и сравнение продукции ими лизинаExample 6: Preparation of strains in which the pta gene promoter was inserted below the aceE gene, and comparison of their production of lysine

Corynebacterium glutamicum KCCM11016P трансформировали с использованием вектора pDZ-aceE1-Ppta, полученного в примере 5, тем же способом, что и в примере 3. Выбирали штамм, в котором промотор гена pta встраивали ниже стоп-кодона гена aceE на хромосоме таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена aceE, осуществляя ПЦР для получения L-лизин-продуцирующего штамма, названного KCCM11016P::aceE1-Ppta. Проверяли полученный штамм KCCM11016P::aceE1-Ppta, анализируя полученную нуклеотидную последовательность области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6 в качестве праймеров. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P was transformed using the pDZ-aceE1-Ppta vector obtained in Example 5 in the same manner as in Example 3. A strain was selected in which the pta gene promoter was inserted below the stop codon of the aceE gene on the chromosome so that transcription can occur in the opposite direction to the original direction of transcription of the aceE gene, by performing PCR to obtain an L-lysine-producing strain called KCCM11016P :: aceE1-Ppta. The resulting KCCM11016P :: aceE1-Ppta strain was checked by analyzing the obtained nucleotide sequence of the target region by PCR using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 as primers.

Полученный штамм культивировали тем же способом, что и в примере 4, и измеряли концентрацию L-лизина, выделенного из культурального раствора. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-лизина в культуральном растворе представлена в таблице 3.The resulting strain was cultured in the same manner as in Example 4, and the concentration of L-lysine isolated from the culture solution was measured. For cases where acetate was not added, the concentration of L-lysine in the culture solution is presented in table 3.

Таблица 3
Различия продукции L-лизина (ацетат не добавляли)Table 3
Differences in L-lysine production (no acetate added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 42,942.9 43,543.5 43,443,4 KCCM11016P:: aceE1-PptaKCCM11016P :: aceE1-Ppta 43,243,2 43,343.3 43,643.6

Кроме того, культивировали штамм тем же способом, за исключением того, что для сравнения продукции L-лизина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-лизина в культуральном растворе представлена в таблице 4.In addition, the strain was cultured in the same manner, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-lysine. The concentration of L-lysine in the culture solution is presented in table 4.

Таблица 4
Различия продукции L-лизина (добавляли 5 г/л ацетата)Table 4
Differences in L-Lysine Production (5 g / L Acetate Added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 45,545.5 45,745.7 45,345.3 KCCM11016P:: aceE1-PptaKCCM11016P :: aceE1-Ppta 46,746.7 46,546.5 46,646.6

Как показано в таблице 3, в отсутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::aceE1-Ppta не отличалась от продукции родительским штаммом KCCM11016P.As shown in table 3, in the absence of acetate, the production of L-lysine by strain KCCM11016P :: aceE1-Ppta did not differ from the production by the parent strain KCCM11016P.

Однако, как показано в таблице 4, в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::aceE1-Ppta была на 2,4% выше, чем у родительского штамма KCCM11016P.However, as shown in Table 4, in the presence of acetate, L-lysine production by strain KCCM11016P :: aceE1-Ppta was 2.4% higher than that of the parent strain KCCM11016P.

Кроме того, т.к. в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::aceE1-PaceA являлась более высокой, чем у штамма KCCM11016P::aceE1-Ppta, экспрессию гена-мишени можно более эффективно ингибировать с использованием промотора гена aceA, чем с использованием промотора гена pta.In addition, since in the presence of acetate, L-lysine production by strain KCCM11016P :: aceE1-PaceA was higher than that of strain KCCM11016P :: aceE1-Ppta, expression of the target gene can be more effectively inhibited using the aceA gene promoter than using the pta gene promoter.

Пример 7: Получение штаммов, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена aceEExample 7: Preparation of strains in which the aceA promoter was inserted below the aceE gene

Три L-лизин-продуцирующих штамма, являвшихся Corynebacterium glutamicum KFCC10750, KCCM10770P и CJ3P, соответствующим образом трансформировали с использованием вектора pDZ-aceE1-PaceA, полученного в примере 2, тем же способом, что и в примере 3. Выбирали штаммы, в которых промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена aceE на хромосоме таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена aceE, осуществляя ПЦР. Полученными тремя L-лизин-продуцирующими штаммами являлись KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA и CJ3P::aceE1-PaceA. Проверяли полученные штаммы, анализируя полученную нуклеотидную последовательность области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 6 в качестве праймеров.Three L-lysine-producing strains, which were Corynebacterium glutamicum KFCC10750, KCCM10770P and CJ3P, were accordingly transformed using the pDZ-aceE1-PaceA vector obtained in example 2 in the same manner as in example 3. Strains in which the promoter was selected the aceA gene was inserted below the stop codon of the aceE gene on the chromosome so that transcription can occur in the direction opposite to the original direction of transcription of the aceE gene by PCR. The obtained three L-lysine-producing strains were KFCC10750 :: aceE1-PaceA, KCCM10770P :: aceE1-PaceA and CJ3P :: aceE1-PaceA. The obtained strains were checked by analyzing the obtained nucleotide sequence of the target region by PCR using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 6 as primers.

Полученные штаммы культивировали тем же способом, что и в примере 4, и измеряли концентрацию L-лизина, выделенного из культуральных растворов. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-лизина в культуральных растворах представлена в таблице 5.The obtained strains were cultured in the same manner as in example 4, and the concentration of L-lysine isolated from the culture solutions was measured. For cases where acetate was not added, the concentration of L-lysine in the culture solutions is presented in table 5.

Таблица 5
Различия продукции L-лизина (ацетат не добавляли)Table 5
Differences in L-lysine production (no acetate added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KFCC10750KFCC10750 38,338.3 38,038,0 38,438,4 KFCC10750::aceE1-PaceAKFCC10750 :: aceE1-PaceA 38,638.6 38,238,2 38,338.3 KCCM10770PKCCM10770P 47,547.5 47,347.3 47,647.6 KCCM10770P::aceE1-PaceAKCCM10770P :: aceE1-PaceA 47,347.3 47,747.7 47,547.5 CJ3PCj3p 8eight 8,48.4 8,38.3 CJ3P::aceE1-PaceACJ3P :: aceE1-PaceA 8,28.2 8,18.1 8,58.5

Кроме того, штаммы культивировали тем же способом, за исключением того, что для сравнения продукции L-лизина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-лизина в культуральных растворах представлена в таблице 6.In addition, the strains were cultured in the same manner, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-lysine. The concentration of L-lysine in the culture solutions is presented in table 6.

Таблица 6
Различия продукции L-лизина (добавляли 5 г/л ацетата)Table 6
Differences in L-Lysine Production (5 g / L Acetate Added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KFCC10750KFCC10750 39,339.3 39,539.5 39,239.2 KFCC10750::aceE1-PaceAKFCC10750 :: aceE1-PaceA 41,341.3 41,641.6 41,041.0 KCCM10770PKCCM10770P 47,547.5 47,347.3 47,647.6 KCCM10770P::aceE1-PaceAKCCM10770P :: aceE1-PaceA 49,049.0 48,648.6 48,848.8 CJ3PCj3p 8eight 8,48.4 8,38.3 CJ3P::aceE1-PaceACJ3P :: aceE1-PaceA 9,59.5 9,79.7 9,49,4

Как показано в таблице 5, в отсутствие ацетата продукция L-лизина тремя штаммами KFCC10750::aceE1-PaceA, KCCM10770P::aceE1-PaceA, CJ3P::aceE1-PaceA не отличалась от продукции родительским штаммом.As shown in Table 5, in the absence of acetate, L-lysine production by the three strains KFCC10750 :: aceE1-PaceA, KCCM10770P :: aceE1-PaceA, CJ3P :: aceE1-PaceA did not differ from the production by the parent strain.

Однако, как показано в таблице 6, в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KFCC10750::aceE1-PaceA была на 5% выше, чем у родительского штамма, продукция штаммом KCCM10770P::aceE1-PaceA была на 2,8% выше, чем у родительского штамма, и продукция штаммом CJ3P::aceE1-PaceA была на 15% выше, чем у родительского штамма.However, as shown in Table 6, in the presence of acetate, L-lysine production by strain KFCC10750 :: aceE1-PaceA was 5% higher than that of the parent strain, production by strain KCCM10770P :: aceE1-PaceA was 2.8% higher than in the parent strain, and production by strain CJ3P :: aceE1-PaceA was 15% higher than in the parent strain.

Пример 8: Получение вектора для ингибирования экспрессии гена homExample 8: Preparation of a vector for inhibiting hom gene expression

Для повышения продукции L-лизина можно ослаблять путь биосинтеза L-треонина, использующий тот же субстрат, что и путь биосинтеза L-лизина. Примером способов ослабления пути биосинтеза L-треонина является снижение ферментативной активности гомосериндегидрогеназы (hom, NCgl1136), синтезирующей гомосерин из аспартата.To increase the production of L-lysine, one can weaken the pathway of L-threonine biosynthesis using the same substrate as the pathway of L-lysine biosynthesis. An example of ways to weaken the pathway of L-threonine biosynthesis is to reduce the enzymatic activity of homoserine dehydrogenase (hom, NCgl1136), which synthesizes homoserine from aspartate.

У Corynebacterium glutamicum ген hom образует оперон hom-thrB с геном thrB, и терминатор транскрипции гена hom находится ниже гена thrB. Сообщают, что промотор находится выше оперона hom-thrB, находящегося выше гена hom. Кроме того, сообщают о том, что второй промотор находится выше оперона гена thrB (Mateos et al., J Bacteriol, 176:7362-7371, 1994). Таким образом, для избирательного ингибирования экспрессии гена hom в присутствие ацетата промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена hom таким образом, что транскрипция с этого промотора может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена hom. Для сохранения экспрессии гена thrB добавляли последовательность второго промотора выше ORF гена thrB.In Corynebacterium glutamicum, the hom gene forms the hom-thrB operon with the thrB gene, and the hom gene transcription terminator is located below the thrB gene. The promoter is reported to be located above the hom-thrB operon located above the hom gene. In addition, it is reported that the second promoter is located above the operon of the thrB gene (Mateos et al., J Bacteriol, 176: 7362-7371, 1994). Thus, to selectively inhibit the expression of the hom gene in the presence of acetate, the aceA promoter was inserted below the stop codon of the hom gene so that transcription from this promoter can occur in a direction opposite to the original direction of transcription of the hom gene. To preserve thrB gene expression, a second promoter sequence was added above the thrB gene ORF.

В примере 8 рекомбинантный вектор получали посредством инсерции промотора гена aceA между нижележащим стоп-кодоном гена hom и вышележащим геном thrB.In Example 8, a recombinant vector was obtained by inserting the aceA gene promoter between the downstream stop codon of the hom gene and the upstream thrB gene.

Для получения фрагмента гена hom Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 17 и 18). ПЦР осуществляли с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 300 пар оснований между 1039-ым нуклеотидом от инициаторного кодона гена hom и 1338-ым нуклеотидом, являющимся стоп-кодоном. Даже при встраивании aceA между оперонами hom-thrB необходимо сохранять экспрессию гена thrB. Таким образом, когда получали фрагмент ДНК, включающий 300 пар оснований ниже стоп-кодона гена hom, синтезировали праймеры, сконструированные для дополнительного включения последовательности промотора thrB из 32 пар оснований с 5'-стороны (SEQ ID NO: 19 и 20). ПЦР осуществляли с использованием этих праймеров (SEQ ID NO: 19 и 20) для получения фрагмента ДНК из 334 пар оснований, содержащего участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 3'-конце фрагмента. ПЦР осуществляли в тех же условиях, что и в примере 2.To obtain a fragment of the Corynebacterium glutamicum hom gene, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA was used as a template and the primers were synthesized that contain the XbaI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and SpeI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the NO fragment (SE 17 and 18). PCR was performed using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 300 base pairs between the 1039th nucleotide from the initiating codon of the hom gene and the 1338th nucleotide, which is the stop codon. Even when aceA is inserted between hom-thrB operons, thrB gene expression must be maintained. Thus, when a DNA fragment having 300 base pairs below the stop codon of the hom gene was obtained, primers were synthesized designed to further include the thrB promoter sequence of 32 base pairs from the 5 ′ side (SEQ ID NOs: 19 and 20). PCR was performed using these primers (SEQ ID NO: 19 and 20) to obtain a DNA fragment of 334 base pairs containing a SpeI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and an XbaI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the fragment. PCR was carried out under the same conditions as in example 2.

Два продукта ПЦР-амплификации и вектор pDZ для встраивания в хромосому, уже полученный посредством расщепления ферментом рестрикции XbaI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-hom.Two PCR amplification products and a pDZ vector for insertion into the chromosome, already obtained by XbaI restriction enzyme digestion, were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ-hom vector.

SEQ ID NO: 17: SEQ ID NO: 17:

hom-h1F 5'-ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg-3'hom-h1F 5'-ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg-3 '

SEQ ID NO: 18: SEQ ID NO: 18:

hom-h1R 5'-gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg-3'hom-h1R 5'-gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg-3 '

SEQ ID NO: 19: hom-h2F 5'-actagtgatccgcctcgaaagggac-3'SEQ ID NO: 19: hom-h2F 5'-actagtgatccgcctcgaaagggac-3 '

SEQ ID NO: 20: SEQ ID NO: 20:

hom-h2R 5'-gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg-3'hom-h2R 5'-gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg-3 '

Для получения фрагмента промотора ген aceA Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце и на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 21 и 22). ПЦР осуществляли с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированных праймеров для амплификации промоторной области из приблизительно 500 пар оснований, представленных нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Продукт ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки вектора pDZ-hom ферментом рестрикции SpeI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-hom-PaceA.To obtain a promoter fragment, the aceA gene of Corynebacterium glutamicum synthesized primers designed with the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5'-end and 3'-end of the fragment (SEQ ID NOs: 21 and 22). PCR was performed using Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA as a template and synthesized primers for amplification of the promoter region from approximately 500 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. PCR amplification product and DNA fragment obtained by processing the vector with pDZ-hom enzyme restriction SpeI, cloned using the In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the vector pDZ-hom-PaceA.

SEQ ID NO: 21: SEQ ID NO: 21:

PaceA-h3F 5'-gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg-3'PaceA-h3F 5'-gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg-3 '

SEQ ID NO: 22: SEQ ID NO: 22:

PaceA-h3R 5'-aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc-3'PaceA-h3R 5'-aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc-3 '

Пример 9: Получение штаммов, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена hom, и сравнение продукции ими лизинаExample 9: Preparation of strains in which the aceA promoter was inserted below the hom gene and comparison of their production of lysine

Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, являющийся L-лизин-продуцирующим штаммом, трансформировали с использованием вектора pDZ-hom-PaceA, полученного в примере 8, тем же способом, что и в примере 3. Выбирали штамм, в котором промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена hom на хромосоме таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена hom, осуществляя ПЦР для получения L-лизин-продуцирующего штамма, названного KCCM11016P::hom-PaceA. Проверяли полученный штамм KCCM11016P::hom-PaceA, анализируя нуклеотидную последовательность полученной области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 20 в качестве праймеров. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, which is an L-lysine-producing strain, was transformed using the pDZ-hom-PaceA vector obtained in Example 8 in the same manner as in Example 3. A strain was selected in which the aceA promoter was inserted below the stop codon the hom gene on the chromosome in such a way that transcription can occur in the opposite direction to the original direction of transcription of the hom gene by PCR to obtain an L-lysine-producing strain called KCCM11016P :: hom-PaceA. The resulting strain KCCM11016P :: hom-PaceA was checked by analyzing the nucleotide sequence of the obtained target region by PCR using SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 20 as primers.

Штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, используемый в качестве родительского штамма, и полученный штамм KCCM11016P::hom-PaceA культивировали тем же способом, что и в примере 4, и измеряли концентрацию L-лизина, выделенного из культуральных растворов. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-лизина в культуральных растворах штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и KCCM11016P::hom-PaceA представлена в таблице 7.The strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P used as the parent strain and the obtained strain KCCM11016P :: hom-PaceA were cultured in the same manner as in example 4, and the concentration of L-lysine isolated from the culture solutions was measured. For cases where acetate was not added, the concentration of L-lysine in the culture solutions of the strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P and KCCM11016P :: hom-PaceA are presented in table 7.

Таблица 7
Различия продукции L-лизина (ацетат не добавляли)Table 7
Differences in L-lysine production (no acetate added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 43,243,2 43,343.3 43,643.6 KCCM11016P:: hom-PaceAKCCM11016P :: hom-PaceA 43,343.3 43,643.6 43,443,4

Кроме того, штаммы культивировали тем же способом, за исключением того, что для сравнения продукции L-лизина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-лизина в культуральных растворах представлена в таблице 8.In addition, the strains were cultured in the same manner, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-lysine. The concentration of L-lysine in the culture solutions is presented in table 8.

Таблица 8
Различия продукции L-лизина (добавляли 5 г/л ацетата)Table 8
Differences in L-Lysine Production (5 g / L Acetate Added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 44,944.9 45,645.6 45,245,2 KCCM11016P:: hom-PaceAKCCM11016P :: hom-PaceA 46,346.3 46,646.6 46,446,4

Как показано в таблице 7, в отсутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::hom-PaceA не отличалась от продукции родительским штаммом KCCM11016P.As shown in table 7, in the absence of acetate, the production of L-lysine by strain KCCM11016P :: hom-PaceA did not differ from the production by the parent strain KCCM11016P.

Однако, как показано в таблице 8, в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::hom-PaceA была на 2,6% выше, чем у родительского штамма KCCM11016P.However, as shown in Table 8, in the presence of acetate, L-lysine production by strain KCCM11016P :: hom-PaceA was 2.6% higher than that of the parent strain KCCM11016P.

Пример 10: Получение вектора для ингибирования экспрессии гена murEExample 10: Preparation of a vector for inhibiting murE gene expression

УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигаза (murE, NCgl2083) использует мезо-2,6-диаминопимелат, являющийся предшественником для биосинтеза лизина, в соматическом синтезе. Ослабление активности гена murE может снижать поступление источников углерода в путь соматического синтеза и повышать поступление источников углерода в путь биосинтеза лизина для повышения продукции лизина.UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (murE, NCgl2083) uses meso-2,6-diaminopimelate, a precursor for lysine biosynthesis, in somatic synthesis. The weakening of murE gene activity can reduce the supply of carbon sources to the somatic synthesis pathway and increase the supply of carbon sources to the lysine biosynthesis pathway to increase lysine production.

У Corynebacterium glutamicum ген murE (NCgl2083) образует оперон с семью генами от NCgl2076 до NCgl2082. Транскрипция оперона начинается с NCgl2083 murE в направлении гена NCgl2076. Таким образом, терминатор транскрипции находится ниже гена NCgl2076. Таким образом, для избирательного ингибирования экспрессии гена murE в присутствие ацетата промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена murE таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена murE. Для поддержания экспрессии других семи генов за исключением гена murE, локализованного в первой области оперона, дополнительно включали промотор оперона murE выше ORF гена NCgl2082.In Corynebacterium glutamicum, the murE gene (NCgl2083) forms an operon with seven genes from NCgl2076 to NCgl2082. The operon transcription begins with NCgl2083 murE in the direction of the NCgl2076 gene. Thus, the transcription terminator is located below the NCgl2076 gene. Thus, to selectively inhibit murE gene expression in the presence of acetate, the aceA promoter was inserted below the stop codon of the murE gene so that transcription can occur in a direction opposite to the original direction of transcription of the murE gene. To maintain the expression of the other seven genes, with the exception of the murE gene located in the first region of the operon, the murE operon promoter above the ORF of the NCgl2082 gene was additionally included.

В примере 10 рекомбинантный вектор получали посредством инсерции промотора гена aceA ниже стоп-кодона гена murE.In Example 10, a recombinant vector was obtained by inserting the aceA gene promoter below the stop codon of the murE gene.

Для получения фрагмента гена murE Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции XhoI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 23 и 24). ПЦР осуществляли с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 300 пар оснований между 1267-ым нуклеотидом от инициаторного кодона гена murE и 1566-ым нуклеотидом, являвшимся стоп-кодоном. Кроме того, синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XhoI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 25 и 26). ПЦР осуществляли с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 292 пар оснований от 10-го нуклеотида ниже стоп-кодона гена murE. ПЦР осуществляли в тех же условиях, что и в примере 2. Два продукта ПЦР-амплификации и вектор pDZ для встраивания в хромосому, уже полученный посредством расщепления ферментом рестрикции XbaI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-murE.To obtain a murE fragment of the Corynebacterium glutamicum murE gene, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA was used as a template and synthesized primers designed to contain the XbaI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the XhoI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the SEQ ID NO: 23 and 24). PCR was performed using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 300 base pairs between the 1267th nucleotide from the initiator codon of the murE gene and the 1566th nucleotide, which was the stop codon. In addition, primers were synthesized designed containing the XhoI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the XbaI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the fragment (SEQ ID NOs: 25 and 26). PCR was performed using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 292 base pairs from the 10th nucleotide below the stop codon of the murE gene. PCR was carried out under the same conditions as in Example 2. Two PCR amplification products and a pDZ vector for incorporation into the chromosome, already obtained by XbaI restriction enzyme digestion, were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain pDZ-murE vectors.

SEQ ID NO: 23: SEQ ID NO: 23:

mur-m1F 5'-ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc-3'mur-m1F 5'-ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc-3 '

SEQ ID NO: 24: SEQ ID NO: 24:

mur-m1R 5'-ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag-3'mur-m1R 5'-ttgtgatcatctctcgagctatccttcttccgtagtaag-3 '

SEQ ID NO: 25: mur-m2F 5'-agctcgagatgatcacaatgacccttgg -3'SEQ ID NO: 25: mur-m2F 5'-agctcgagatgatcacaatgacccttgg -3 '

SEQ ID NO: 26: SEQ ID NO: 26:

mur-m2R 5'-gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc-3'mur-m2R 5'-gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc-3 '

Для получения фрагмента гена aceA Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XhoI на 5'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 27 и 28). Для осуществления ПЦР для амплификации промоторной области из приблизительно 500 пар оснований, представленной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированные праймеры. Кроме того, для получения промоторной области оперона murE Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XhoI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 29 и 30). ПЦР осуществляли с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 300 пар оснований выше ORF гена murE.To obtain the aceA gene fragmentCorynebacterium glutamicum synthesized primers designed containing the recognition site of the restriction enzyme XhoI at the 5'-end of the fragment (SEQ ID NO: 27 and 28). For PCR to amplify the promoter region of approximately 500 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, chromosomal DNA was usedCorynebacterium glutamicumKCCM11016P as template and synthesized primers. In addition, to obtain the promoter region of the operon murECorynebacterium glutamicum chromosomal DNA was used as a matrixCorynebacterium glutamicum KCCM11016P and synthesized primers designed containing the recognition site of the restriction enzyme XhoI at the 3'-end of the fragment (SEQ ID NO: 29 and 30). PCR was carried out using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 300 base pairs above the murE ORF gene.

Два продукта ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки вектора pDZ-murE ферментом рестрикции XhoI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-murE-PaceA-PmurE.Two PCR amplification products and a DNA fragment obtained by treating the pDZ-murE vector with the XhoI restriction enzyme were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the pDZ-murE-PaceA-PmurE vector.

SEQ ID NO: 27: mur-m3F 5'-tcatcagcagcactctgactacctctg-3'SEQ ID NO: 27: mur-m3F 5'-tcatcagcagcactctgactacctctg-3 '

SEQ ID NO: 28: SEQ ID NO: 28:

mur-m3R 5'-agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc-3'mur-m3R 5'-agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc-3 '

SEQ ID NO: 29: mur-m4F 5'-agagtgctgctgatgatcctcgatttg-3'SEQ ID NO: 29: mur-m4F 5'-agagtgctgctgatgatcctcgatttg-3 '

SEQ ID NO: 30: SEQ ID NO: 30:

mur-m4R 5'-ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg-3'mur-m4R 5'-ttgtgatcatctcggggttttctctcctccacagg-3 '

Пример 11: Получение штаммов, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена murE, и сравнение продукции ими лизинаExample 11: Preparation of strains in which the aceA promoter was inserted below the murE gene, and comparison of their production of lysine

Corynebacterium glutamicum KCCM11016P трансформировали с использованием вектора pDZ-murE-PaceA-PmurE, полученного в примере 10, тем же способом, что и в примере 3. Corynebacterium glutamicum KCCM11016P was transformed using the pDZ-murE-PaceA-PmurE vector obtained in Example 10 in the same manner as in Example 3.

Выбирали штамм, в котором промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена murE на хромосоме таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипция гена murE, осуществляя ПЦР для получения L-лизин-продуцирующего штамма, названного KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE. Проверяли полученный штамм KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE, анализируя нуклеотидные последовательности полученной области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 26 в качестве праймеров.A strain was selected in which the aceA promoter was inserted below the stop codon of the murE gene on the chromosome so that transcription can occur in the direction opposite to the original direction of transcription of the murE gene by PCR to obtain an L-lysine-producing strain called KCCM11016P :: murE -PaceA-PmurE. The resulting strain KCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE was checked by analyzing the nucleotide sequences of the obtained target region by PCR using SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26 as primers.

Штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11016P, используемый в качестве родительского штамма, и полученный штамм KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE культивировали тем же способом, что и в примере 4, и измеряли концентрацию L-лизина, выделенного из культуральных растворов. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-лизина в культуральных растворах штамма Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и штамма KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE представлена в таблице 9.The strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P used as the parent strain and the resulting strain KCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE were cultured in the same manner as in example 4, and the concentration of L-lysine isolated from the culture solutions was measured. For cases where acetate was not added, the concentration of L-lysine in the culture solutions of the strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P and strain KCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE are presented in table 9.

Таблица 9
Различия продукции L-лизина (ацетат не добавляли)Table 9
Differences in L-lysine production (no acetate added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 43,543.5 43,943.9 44,044.0 KCCM11016P:: murE-PaceA-PmurEKCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE 43,743.7 44,144.1 43,843.8

Кроме того, штаммы культивировали тем же способом, за исключением того, что для сравнения продукции L-лизина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-лизина в культуральных растворах представлена в таблице 10.In addition, the strains were cultured in the same manner, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-lysine. The concentration of L-lysine in the culture solutions is presented in table 10.

Таблица 10
Различия продукции L-лизина (добавляли 5 г/л ацетата)Table 10
Differences in L-Lysine Production (5 g / L Acetate Added) ШтаммStrain Лизин (г/л)Lysine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11016PKCCM11016P 45,245,2 45,645.6 45,345.3 KCCM11016P:: murE-PaceA-PmurEKCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE 46,646.6 46,946.9 46,546.5

Как показано в таблице 9, в отсутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE не отличалась от продукции родительским штаммом KCCM11016P.As shown in table 9, in the absence of acetate, the production of L-lysine by strain KCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE did not differ from the production by the parent strain KCCM11016P.

Однако, как показано в таблице 10, в присутствие ацетата продукция L-лизина штаммом KCCM11016P::murE-PaceA-PmurE была на 2,8% выше, чем у родительского штамма KCCM11016P.However, as shown in Table 10, in the presence of acetate, L-lysine production by strain KCCM11016P :: murE-PaceA-PmurE was 2.8% higher than that of the parent strain KCCM11016P.

Пример 12: Получение вектора для ингибирования экспрессии гена dapAExample 12: Preparation of a vector for inhibiting dapA gene expression

Для повышения продукции L-треонина можно ослаблять путь биосинтеза L-лизина, использующий тот же субстрат, что и путь биосинтеза L-треонина. Примером способов ослабления пути биосинтеза L-лизина является снижение ферментативной активности дигидродипиколинатсинтазы (dapA, NCgl1896), участвующей в продукции лизина из аспартата.To increase the production of L-threonine, one can weaken the pathway of L-lysine biosynthesis using the same substrate as the pathway of L-threonine biosynthesis. An example of ways to weaken the pathway of L-lysine biosynthesis is to reduce the enzymatic activity of dihydrodipicolinate synthase (dapA, NCgl1896), which is involved in the production of lysine from aspartate.

У Corynebacterium glutamicum ген dapA образует оперон dapA-ORF4 с геном ORF4 (NCgl1895), и, таким образом, терминатор транскрипции гена dapA находится ниже гена ORF4. Кроме того, сообщают, что промотор находится выше оперона dapA-ORF4, находящегося выше гена dapA, и второй промотор находится выше гена ORF4 (Patek et al., Biotechnology letters, 19:1113-1117, 1997). Таким образом, для избирательного ингибирования экспрессии гена dapA в присутствие ацетата промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена dapA таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена dapA. Для сохранения экспрессии гена ORF4 последовательность промоторной области из приблизительно 100 пар оснований в вышележащем гене ORF4 добавляли в ORF вышележащего гена ORF4.In Corynebacterium glutamicum, the dapA gene forms the dapA-ORF4 operon with the ORF4 gene (NCgl1895), and thus the dapA gene transcription terminator is located below the ORF4 gene. In addition, it is reported that the promoter is located above the dapA-ORF4 operon located above the dapA gene and the second promoter is located above the ORF4 gene (Patek et al., Biotechnology letters, 19: 1113-1117, 1997). Thus, to selectively inhibit the expression of the dapA gene in the presence of acetate, the aceA promoter was inserted below the stop codon of the dapA gene so that transcription can occur in a direction opposite to the original direction of transcription of the dapA gene. To preserve ORF4 gene expression, a promoter region sequence of approximately 100 base pairs in the upstream ORF4 gene was added to the ORF of the upstream ORF4 gene.

В примере 12 рекомбинантный вектор получали посредством инсерции промотора гена aceA ниже стоп-кодона гена dapA.In Example 12, a recombinant vector was obtained by inserting the aceA gene promoter below the stop codon of the dapA gene.

Для получения фрагмента гена dapA Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P и синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 31 и 32). ПЦР осуществляли с использованием синтезированных праймеров для получения фрагмента ДНК, включающего 301 пар оснований между 606-ым нуклеотидом от инициаторного кодона гена dapA и 906-ым нуклеотидом, являвшимся стоп-кодоном. Кроме того, синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце фрагмента и участок распознавания фермента рестрикции XbaI на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 33 и 34). С помощью ПЦР получали фрагмент ДНК, дополнительно включающий последовательность промоторной области из приблизительно 100 пар оснований между 809-ым нуклеотидом от инициаторного кодона гена dapA и 2-ым нуклеотидом в нижележащем стоп-кодоне для сохранения экспрессии гена ORF4 и 213 пар оснований ниже стоп-кодона гена dapA. ПЦР осуществляли в тех же условиях, что и в примере 2. Два продукта ПЦР-амплификации и вектор pDZ для встраивания в хромосому, уже полученный посредством расщепления ферментом рестрикции XbaI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-dapA.To obtain the Corynebacterium glutamicum dapA gene fragment, the Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA was used as a template and the primers were synthesized designed containing the XbaI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the SpeI restriction enzyme recognition site at the 3'-end SEI ID fragment: 31 and 32). PCR was performed using synthesized primers to obtain a DNA fragment comprising 301 base pairs between the 606th nucleotide from the initiating codon of the dapA gene and the 906th nucleotide, which was the stop codon. In addition, primers were synthesized designed containing the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5'-end of the fragment and the XbaI restriction enzyme recognition site at the 3'-end of the fragment (SEQ ID NO: 33 and 34). Using PCR, a DNA fragment was obtained that further included a sequence of the promoter region of approximately 100 base pairs between the 809th nucleotide from the initiating codon of the dapA gene and the 2nd nucleotide in the underlying stop codon to preserve ORF4 gene expression and 213 base pairs below the stop codon dapA gene. PCR was carried out under the same conditions as in Example 2. Two PCR amplification products and a pDZ vector for incorporation into the chromosome, already obtained by XbaI restriction enzyme digestion, were cloned using the Infusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain pDZ-dapA vectors.

SEQ ID NO: 31: SEQ ID NO: 31:

dapA-d1F 5'-ccggggatcctctagatgtttggcttgctttgggc-3'dapA-d1F 5'-ccggggatcctctagatgtttggcttgctttgggc-3 '

SEQ ID NO: 32: SEQ ID NO: 32:

dapA-d1R 5'-gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3'dapA-d1R 5'-gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3 '

SEQ ID NO: 33: SEQ ID NO: 33:

dapA-d2F 5'-ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc-3'dapA-d2F 5'-ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc-3 '

SEQ ID NO: 34: SEQ ID NO: 34:

dapA-d2R 5'-gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag-3'dapA-d2R 5'-gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag-3 '

Для получения фрагмента промотора гена aceA Corynebacterium glutamicum синтезировали праймеры, сконструированные содержащими участок распознавания фермента рестрикции SpeI на 5'-конце и на 3'-конце фрагмента (SEQ ID NO: 35 и 36). ПЦР осуществляли с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum KCCM11016P в качестве матрицы и синтезированных праймеров для амплификации промоторной области из приблизительно 500 пар оснований, представленной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Продукт ПЦР-амплификации и фрагмент ДНК, полученный посредством обработки вектора pDZ-dapA ферментом рестрикции SpeI, клонировали с использованием набора In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) для получения вектора pDZ-dapA-PaceA.To obtain the aceA gene promoter fragment of Corynebacterium glutamicum , primers were synthesized designed containing the SpeI restriction enzyme recognition site at the 5 ′ end and 3 ′ end of the fragment (SEQ ID NOs: 35 and 36). PCR was performed using Corynebacterium glutamicum KCCM11016P chromosomal DNA as a template and synthesized primers for amplification of the promoter region of approximately 500 base pairs represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. PCR amplification product and DNA fragment obtained by processing the vector pDZ-dapA enzyme restriction SpeI, cloned using the In-fusion Cloning Kit (TAKARA, JP) to obtain the vector pDZ-dapA-PaceA.

SEQ ID NO: 35: SEQ ID NO: 35:

PaceA-d3F 5'-acgttgatgcactagtagcactctgactacctctg-3'PaceA-d3F 5'-acgttgatgcactagtagcactctgactacctctg-3 '

SEQ ID NO: 36: SEQ ID NO: 36:

PaceA-d3R 5'-agttctataaactagtttcctgtgcggtacgtggc-3'PaceA-d3R 5'-agttctataaactagtttcctgtgcggtacgtggc-3 '

Пример 13: Получение штаммов, в которых промотор гена aceA встраивали ниже гена dapA, и сравнение продукции ими треонинаExample 13: Obtaining strains in which the aceA promoter was inserted below the dapA gene, and comparison of their production of threonine

Для проверки эффекта ингибирования экспрессии гена dapA в L-треонин-продуцирующем штамме штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11222P (патент Кореи №: 2013-0061570), являющийся L-треонин-продуцирующим штаммом, трансформировали с использованием вектора pDZ-dapA-PaceA, полученного в примере 12, тем же способом, что и в примере 3. Осуществляя ПЦР, выбирали штамм, в котором промотор гена aceA встраивали ниже стоп-кодона гена dapA на хромосоме таким образом, что транскрипция может происходить в направлении, противоположном исходному направлению транскрипции гена dapA, названный KCCM11222P::dapA-PaceA. Проверяли полученный штамм KCCM11222P::dapA-PaceA, анализируя нуклеотидную последовательность полученной области-мишени посредством ПЦР с использованием SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 34 в качестве праймеров.To test the effect of inhibiting the expression of the dapA gene in the L-threonine-producing strain, the Corynebacterium glutamicum strain KCCM11222P (Korean Patent No .: 2013-0061570), which is the L-threonine-producing strain, was transformed using the pDZ-dapA-PaceA vector obtained in Example 12 in the same manner as in Example 3. By performing PCR, a strain was selected in which the aceA promoter was inserted below the stop codon of the dapA gene on the chromosome so that transcription can occur in the direction opposite to the original direction of transcription of the dapA gene, called KCCM11222P : : dapA-PaceA. The resulting strain KCCM11222P :: dapA-PaceA was checked by analyzing the nucleotide sequence of the obtained target region by PCR using SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 34 as primers.

Штамм Corynebacterium glutamicum KCCM11222P, используемый в качестве родительского штамма, и полученный штамм KCCM11222P::dapA-PaceA культивировали описываемым ниже способом.The strain Corynebacterium glutamicum KCCM11222P used as the parent strain and the resulting strain KCCM11222P :: dapA-PaceA were cultured as described below.

Каждый из штаммов соответствующим образом инокулировали в 25 мл среды для посева в колбы с дефлекторами емкостью 250 мл с последующим культивированием со встряхиванием при 200 об./мин при 30°C в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора посевной культуры добавляли в колбу с дефлекторами емкостью 250 мл, содержащую 24 мл продукционной среды, с последующим культивированием со встряхиванием при 200 об./мин при 30°C в течение 48 часов. Соответствующие композиции среды для посева и продукционной среды описаны ниже.Each of the strains was appropriately inoculated in 25 ml of medium for inoculation into flasks with 250 ml baffles, followed by cultivation with shaking at 200 rpm at 30 ° C for 20 hours. Then, 1 ml of the seed culture solution was added to a 250 ml flask with baffles containing 24 ml of production medium, followed by cultivation with shaking at 200 rpm at 30 ° C for 48 hours. The corresponding compositions of the medium for sowing and production environment are described below.

<Среда для посева (pH 7,0)><Sowing medium (pH 7.0)>

<Продукционная среда (pH 7,0)><Production medium (pH 7.0)>

Глюкоза 100 г, (NH₄)₂SO₄ 20 г, соевый белок 2,5 г, твердый кукурузный экстракт 5 г, мочевина 3 г, KH₂PO₄ 1 г, MgSO₄∙7(H₂O) 0,5 г, биотин 100 мкг, тиамин HCl 1000 мкг, пантотенат кальция 2000 мкг, никотинамид 3000 мкг, CaCO₃ 30 г (на 1 л дистиллированной воды).Glucose 100 g, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 20 g, soy protein 2.5 g, solid corn extract 5 g, urea 3 g, KH ₂ PO ₄ 1 g, MgSO ₄ ∙ 7 (H ₂ O) 0.5 g, biotin 100 μg, thiamine HCl 1000 μg, calcium pantothenate 2000 μg, nicotinamide 3000 μg, CaCO ₃ 30 g (per 1 liter of distilled water).

После культивирования концентрацию L-треонина в культуральном растворе измеряли с помощью ВЭЖХ. Для случаев, когда не добавляли ацетат, концентрация L-треонина в культуральных растворах Corynebacterium glutamicum KCCM11222P и KCCM11222P::dapA-PaceA представлена в таблице 11.After cultivation, the concentration of L-threonine in the culture solution was measured by HPLC. For cases where acetate was not added, the concentration of L-threonine in culture solutions of Corynebacterium glutamicum KCCM11222P and KCCM11222P :: dapA-PaceA is presented in table 11.

Таблица 11
Различия продукции L-треонина (ацетат не добавляли)Table 11
Differences in L-threonine production (no acetate added) ШтаммStrain Треонин(г/л)Threonine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11222PKCCM11222P 7,07.0 6,96.9 7,27.2 KCCM11222P:: dapA-PaceAKCCM11222P :: dapA-PaceA 7,17.1 7,37.3 7,07.0

Кроме того, штаммы культивировали тем же способом, за исключением того, что для сравнения продукции L-треонина в продукционную среду добавляли 5 г/л ацетата. Концентрация L-треонина в культуральных растворах представлена в таблице 12.In addition, the strains were cultured in the same way, except that 5 g / L acetate was added to the production medium to compare the production of L-threonine. The concentration of L-threonine in the culture solutions is presented in table 12.

Таблица 12
Различия продукции L-треонина (добавляли 5 г/л ацетата)Table 12
Differences in L-threonine production (5 g / L acetate was added) ШтаммStrain Треонин(г/л)Threonine (g / l) Партия 1Party 1 Партия 2Party 2 Партия 3Party 3 KCCM11222PKCCM11222P 7,67.6 7,47.4 7,77.7 KCCM11222P:: dapA-PaceAKCCM11222P :: dapA-PaceA 11,211.2 11,511.5 11,411,4

Как показано в таблице 11, в отсутствие ацетата продукция L-треонина штаммом KCCM11222P::dapA-PaceA не отличалась от продукции родительским штаммом KCCM11222P.As shown in table 11, in the absence of acetate, the production of L-threonine by strain KCCM11222P :: dapA-PaceA did not differ from the production by the parent strain KCCM11222P.

Однако, как показано в таблице 12, в присутствие ацетата продукция L-треонина штаммом KCCM11222P::dapA-PaceA была на 50% выше, чем у родительского штамма KCCM11222P.However, as shown in Table 12, in the presence of acetate, L-threonine production by strain KCCM11222P :: dapA-PaceA was 50% higher than that of the parent strain KCCM11222P.

[Регистрационный №][Registration No.]

Депозитарное учреждение: Korean Culture Center of Microorganisms (International Depositary Authority)Depository institution: Korean Culture Center of Microorganisms (International Depositary Authority)

Регистрационный №: KCCM11432PRegistration No: KCCM11432P

Дата регистрации: 12 июня 2013 годаRegistration Date: June 12, 2013

Как описано выше, согласно одному или нескольким из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать ацетат-индуцибельный промотор для эффективного получения L-аминокислот, т.к. целевую L-аминокислоту можно получать с высоким выходом, ослабляя экспрессию гена-мишени посредством добавления ацетата в соответствующий момент времени.As described above, according to one or more of the above embodiments of the present invention, an acetate-inducible promoter can be used to efficiently produce L-amino acids, as the target L-amino acid can be obtained in high yield, weakening the expression of the target gene by adding acetate at the appropriate time.

Следует понимать, что примеры вариантов осуществления, представленные в настоящем описании, необходимо истолковывать исключительно в описательном смысле, а не в целях ограничения. Описание признаков или аспектов в каждом варианте осуществления, как правило, следует считать пригодным для других аналогичных признаков и аспектов в других вариантах осуществления.It should be understood that the examples of embodiments presented in the present description, should be interpreted solely in a descriptive sense, and not for purposes of limitation. A description of the features or aspects in each embodiment should generally be considered suitable for other similar features and aspects in other embodiments.

Хотя один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения описаны со ссылкой на фигуры, специалистам в этой области будет понятно, что можно осуществлять различные изменения формы и подробностей без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения.Although one or more embodiments of the present invention are described with reference to the figures, those skilled in the art will understand that various changes in form and detail can be made without departing from the spirit and scope of the present invention as defined in the appended claims.

Claims

1. A method for producing L-threonine, comprising cultivating a recombinant coryneform microorganism capable of producing L-threonine, where the recombinant coryneform microorganism is transformed by the insertion of a promoter that is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, below the stop codon of the target gene on the chromosome, and where the target gene is a gene encoding a dihydrodipicolinate synthase.

2. The method of claim 1, wherein the region below the stop codon is between the stop codon and the region above the transcription terminator of the target gene.