RU2694327C2

RU2694327C2 - Способ культивирования в системе посевных ферментеров (варианты)

Info

Publication number: RU2694327C2
Application number: RU2016151316A
Authority: RU
Inventors: Майкл БРУНИНГОС; Константин Константинов; Бенджамин Райт; Вэйчан ЧЖОУ
Original assignee: Джензим Корпорейшн
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2015-06-08
Publication date: 2019-07-11
Also published as: IL290096B1; HUE047683T2; MX2016016301A; EP3628730A1; KR102416402B1; RU2016151316A3; RU2019119708A; MX2020004073A; TW201610148A; CY1122803T1; JP7360504B2; JP2022120031A; AU2021245116B2; BR112016028891A2; CN111575225B; AU2015274897B2; CN106574249A; JP2021019621A; IL281626B; IL290096B2

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного белка и его выделения (варианты). Способ включает помещение рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду для получения первой культуры клеток, периодическое культивирование, помещение первой культуры клеток в перфузионный биореактор со второй культуральной средой для получения второй культуры клеток, перфузионное культивирование, помещение второй культуры клеток в производственный биореактор с третьей культуральной средой для получения культуры клеток-продуцентов и их перфузионное культивирование в позволяющих рекомбинантным клеткам секретировать рекомбинантный белок условиях. В одном варианте способа используют содержащий рекомбинантные клетки замороженный клеточный банк. При этом рекомбинантный белок выделяют из третьей культуральной среды, удаленной из производственного биореактора. Изобретения обеспечивают снижение числа стадий культивирования, количества времени от начальной культуры клеток до инокуляции производственного биореактора, количества ручных манипуляций, риска контаминации, а также более высокую начальную плотность жизнеспособных клеток в производственном биореакторе. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 пр., 9 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с регистрационным № 62/009553, поданной 9 июня 2014 года; полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам биотехнологии и биологического производства рекомбинантных белков.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Клетки млекопитающих, содержащие нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный белок, часто применяют для получения белков, важных с терапевтической или коммерческой точки зрения. В сложившихся условиях процессов производства различных продуктов биотехнологическим компаниям все в большей степени приходится разрабатывать инновационные решения для очень гибкого и экономически эффективного производства терапевтических средств.

Клетки млекопитающих, содержащие нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный белок, часто культивируют в крупных производственных биореакторах для получения терапевтических белков, представляющих интерес. Процессы культивирования в системе посевных ферментеров применяют для получения таких клеток млекопитающих в количестве, достаточном для инокуляции крупных производственных биореакторов. Традиционные процессы культивирования в системе посевных ферментеров начинаются с размораживания криоконсервированного сосуда из клеточного банка с последующими несколькими стадиями культивирования (например, 5 или более) в постепенно увеличивающихся сосудах для культивирования. Традиционные процессы культивирования в системе посевных ферментеров обладают некоторыми недостатками, включающими необходимость во множестве ручных манипуляций во время каждой стадии, что ставит весь процесс под угрозу контаминации и ошибки оператора. Кроме того, традиционные процессы культивирования в системе посевных ферментеров требуют больших затрат времени вследствие целого ряда стадий культивирования и вследствие низких плотностей клеток, обеспечиваемых на стадии N-1 (культура клеток, предпоследняя перед инокуляцией производственного биореактора), которые могут приводить лишь к начальной плотности клеток, составляющей менее 0,5×10⁶клеток/мл в производственных биореакторах большого масштаба, что предусматривает 5-10-дневную фазу роста с целью достижения плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на разработке процессов культивирования в системе посевных ферментеров, которые приводят к некоторым преимуществам, включающим, например, меньшую сложность, сниженное число стадий культивирования, снижение количества времени от начальной культуры клеток (например, размороженного клеточного банка) до инокуляции производственного биореактора, сниженное количество ручных манипуляций, сниженный риск контаминации, более высокую начальную плотность жизнеспособных клеток в производственном биореакторе и более короткую стадию роста в производственном биореакторе (например, короткий период времени, требуемый для достижения плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе). Предусмотренные процессы культивирования в системе посевных ферментеров включают (a) помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток; (b) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл; (c) помещение некоторого объема первой культуры клеток из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл; (d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл; и (e) помещение некоторого объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,20×10⁶клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл. В данном документе также предусмотрены способы получения рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка), которые включают применение одного из процессов культивирования в системе посевных ферментеров, описанных в данном документе.

В данном документе предусмотрены процессы культивирования в системе посевных ферментеров, которые включают: (a) помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток; (b) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл; (c) помещение некоторого объема первой культуры клеток из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/мл; (d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 5×10⁶клеток/мл до приблизительно 120×10⁶клеток/мл; и (e) помещение некоторого объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления этих способов помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) включает размораживание замороженного клеточного банка и

помещение некоторого объема размороженного клеточного банка в первую культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, замороженный клеточный банк характеризуется диапазоном плотности клеток от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке составляет по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 90%).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) включает помещение некоторого объема третьей культуры клеток, содержащей некоторое количество рекомбинантных клеток млекопитающих, в первую культуральную среду. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают (1)

помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в четвертую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением третьей культуры клеток; (2) периодическое культивирование рекомбинантных клеток млекопитающих из стадии (1) до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, при этом некоторый объем третьей культуры клеток из стадии (2) помещают в первую культуральную среду на стадии (a). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, предусмотренных в данном документе, один или оба из сосуда на стадии (a) или сосуда на стадии (1) представляют собой биореактор одноразового использования (например, биореактор одноразового использования, содержащий пластиковый стерильный мешок).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (1) включает размораживание замороженного клеточного банка и помещение некоторого объема размороженного клеточного банка в четвертую культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, замороженный клеточный банк характеризуется диапазоном плотности клеток от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке составляет по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 90%).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, первая культура клеток на стадии (a) характеризуется диапазоном объема от приблизительно 1,0 л до приблизительно 50 л (например, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10,0 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, вторая культура клеток на стадии (c) характеризуется диапазоном объема от приблизительно 5 л до приблизительно 600 л (например, от приблизительно 10 л до приблизительно 300 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, культура клеток-продуцентов на стадии (e) характеризуется диапазоном объема от приблизительно 50 л до приблизительно 20000 л (например, от приблизительно 100 л до приблизительно 10000 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, четвертая культуральная среда на стадии (1) характеризуется диапазоном объема от приблизительно 500 мл до приблизительно 20 л (например, от приблизительно 500 мл до приблизительно 10 л).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сосуд на стадии (a) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 1,5 л до приблизительно 100 л (например, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 50 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионный биореактор на стадии (c) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 7,5 л до приблизительно 1000 л (например, от приблизительно 50 л до приблизительно 1000 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, производственный биореактор на стадии (e) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 150 л до приблизительно 25000 л (например, от приблизительно 150 л до приблизительно 10000 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сосуд на стадии (1) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 1 л до приблизительно 40 л (например, от приблизительно 1 л до приблизительно 20 л).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионное культивирование на стадии (c) осуществляют с применением перфузионного биореактора, оснащенного устройством для фильтрации в переменном тангенциальном потоке. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, исходная плотность клеток на стадии (e) находится в диапазоне от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, исходная плотность клеток на стадии (e) составляет по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 20%) от плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе.

Также предусмотрены способы получения рекомбинантного белка, которые включают:

(a) помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток; (b) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶клеток/мл; (c) помещение некоторого объема первой культуральной среды с клетками из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/мл; (d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл; (e) помещение некоторого объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл; (f) перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов в условиях, которые позволяют рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок; и (g) сбор рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) включает размораживание замороженного клеточного банка и помещение некоторого объема размороженного клеточного банка в первую культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, замороженный клеточный банк характеризуется диапазоном плотности клеток от приблизительно 10×10⁷клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке составляет по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 90%).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) включает помещение некоторого объема третьей культуры клеток, содержащей некоторое количество рекомбинантных клеток млекопитающих, в первую культуральную среду. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают (1) помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в четвертую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением третьей культуры клеток и (2) периодическое культивирование третьей культуры клеток из стадии (1) до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, при этом некоторый объем третьей культуры клеток из стадии (2) помещают в первую культуральную среду на стадии (a). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, один или оба из сосуда на стадии (a) или сосуда на стадии (1) представляют собой биореактор одноразового использования (например, биореактор одноразового использования, содержащий пластиковый стерильный мешок).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (1) включает размораживание замороженного клеточного банка и помещение некоторого объема размороженного клеточного банка в четвертую культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, замороженный клеточный банк характеризуется диапазоном плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл (например, от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке составляет по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 90%).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сосуд на стадии (a) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 1,5 л до приблизительно 100 л (например, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 50 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионный биореактор на стадии (c) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 7,5 л до приблизительно 1000 л (например, от приблизительно 50 л до приблизительно 1000 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе,

производственный биореактор на стадии (e) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 150 л до приблизительно 25000 л (например, от 150 л до приблизительно 10000 л). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сосуд на стадии (1) характеризуется диапазоном внутреннего объема от приблизительно 1 л до приблизительно 40 л (например, от приблизительно 1 л до приблизительно 20 л).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионное культивирование на стадии (c) осуществляют с применением перфузионного биореактора, оснащенного устройством для фильтрации в переменном тангенциальном потоке. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, исходная плотность клеток на стадии (e) находится в диапазоне от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, исходная плотность клеток на стадии (e) составляет по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 20%) от плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, плотность клеток-продуцентов на стационарной фазе составляет от 5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл (например, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл). В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, перфузионное культивирование на стадии (f) приводит к получению культуры клеток-продуцентов, достигающей плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе за период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 10 дней (например, от приблизительно 2 дней до приблизительно 5 дней).

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, сбор на стадии (g) включает удаление (например, непрерывное удаление) культуральной среды из производственного биореактора. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают выделение рекомбинантного белка из удаленной культуральной среды. В некоторых вариантах осуществления любого из способов, описанных в данном документе, выделение осуществляют с применением интегрированного и непрерывного процесса. Некоторые варианты осуществления любого из способов, описанных в данном документе, дополнительно включают составление выделенного рекомбинантного белка в фармацевтическое средство.

Используемое в данном документе единственное число обозначает одно или несколько из конкретных существительных. Например, выражение "рекомбинантная клетка млекопитающего" обозначает "одну или несколько рекомбинантных клеток млекопитающих".

Термин "клетка млекопитающего" означает любую клетку любого млекопитающего или любую клетку, полученную из любого млекопитающего (например, человека, хомячка, мыши, зеленой мартышки, крысы, свиньи, коровы или кролика). Например, клетка млекопитающего может представлять собой иммортализованную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего представляет собой дифференцированную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего представляет собой недифференцированную клетку. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих описаны в данном документе. Дополнительные примеры клеток млекопитающих известны из уровня техники.

Термин "процесс культивирования в системе посевных ферментеров" известен из уровня техники и означает многостадийный способ, с помощью которого начальное количество клеток (например, рекомбинантные клетки млекопитающих) в первой культуре клеток размножают в культуру клеток N-1, которая содержит количество клеток, достаточное для инокуляции типичного производственного биореактора при исходной плотности клеток, составляющей более 0,25×10⁶клеток/мл.

Термин "практически не содержит" означает композицию (например, жидкую культуральную среду), которая по меньшей мере или приблизительно на 90% очищена (например, по меньшей мере или приблизительно на 95%, 96%, 97%, 98%, или по меньшей мере или приблизительно на 99% очищена, или приблизительно на 100% очищена) от указанного вещества (например, клетки млекопитающего).

Термин "0,5x объем" означает приблизительно 50% объема. Термин "0,6x объем" означает приблизительно 60% объема. Подобным образом, 0,7x, 0,8x, 0,9x и 1,0x означает приблизительно 70%, 80%, 90% или 100% объема, соответственно.

Термин "культивирование" или "культивирование клетки" означает поддержание или пролиферацию клетки млекопитающего (например, рекомбинантной клетки млекопитающего) при контролируемой совокупности физических условий.

Термин "культура клеток млекопитающих" или "культура клеток" означает жидкую культуральную среду, содержащую некоторое количество клеток млекопитающих, которые поддерживаются или пролиферируют при контролируемой совокупности физических условий.

Термин "жидкая культуральная среда" или "культуральная среда" означает текучую среду, которая содержит достаточно питательных веществ, чтобы позволить клетке (например, клетке млекопитающего) расти или пролиферировать in vitro. Например, жидкая культуральная среда может содержать одну или несколько из аминокислот (например, 20 аминокислот), пурина (например, гипоксантин), пиримидина (например, тимидин), холина, инозитола, тиамина, фолиевой кислоты, биотина, кальция, никотинамида, пиридоксина, рибофлавина, тимидина, цианокобаламина, пирувата, липоевой кислоты, магния, глюкозы, натрия, калия, железа, меди, цинка и бикарбоната натрия. В некоторых вариантах осуществления жидкая культуральная среда может содержать сыворотку от млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления жидкая культуральная среда не содержит сыворотку или другой экстракт от млекопитающего (жидкая культуральная среда с определенным составом). В некоторых вариантах осуществления жидкая культуральная среда может содержать следовые количества металлов, гормон роста млекопитающих и/или фактор роста млекопитающих. Другим примером жидкой культуральной среды является минимальная среда (например, среда, содержащая только неорганические соли, источник углерода и воду). Неограничивающие примеры жидкой культуральной среды описаны в данном документе. Дополнительные примеры жидкой культуральной среды известны из уровня техники и являются коммерчески доступными. Жидкая культуральная среда может содержать клетки млекопитающих при любой плотности. Например, как используется в данном документе, некоторый объем жидкой культуральной среды, удаляемой из производственного биореактора, может практически не содержать клеток млекопитающих.

Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая компонентов животного происхождения" означает жидкую культуральную среду, которая не содержит каких-либо компонентов (например, белков или сыворотки), полученных от млекопитающих.

Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая сыворотку" означает жидкую культуральную среду, которая не содержит сыворотку млекопитающего.

Термин "жидкая культуральная среда, содержащая сыворотку" означает жидкую культуральную среду, которая содержит сыворотку млекопитающего.

Термин "жидкая культуральная среда с определенным химическим составом" является термином из области техники и означает жидкую культуральную среду, в которой все химические компоненты известны. Например, жидкая культуральная среда с определенным химическим составом не содержит фетальную бычью сыворотку, альбумин бычьей сыворотки или альбумин человеческой сыворотки, поскольку эти препараты, как правило, содержат сложную смесь альбуминов и липидов.

Термин "жидкая культуральная среда, не содержащая белков" означает жидкую культуральную среду, которая не содержит каких-либо белков (например, каких-либо выявляемых белков).

Термин "перемешивание" означает помешивание или иное перемещение части жидкой культуральной среды в сосуде (например, биореакторе). Его осуществляют, например, для повышения концентрации растворенного O₂ в жидкой культуральной среде в сосуде (например, биореакторе). Перемешивание можно осуществлять с применением любого способа, известного из уровня техники, например, аппарата или винта. Например, перемешивание можно осуществлять путем помещения сосуда на платформу, которая качается и/или вращается. Иллюстративные устройства и способы, которые можно применять для осуществления перемешивания части жидкой культуральной среды в сосуде (например, биореакторе) известны из уровня техники.

Термин "интегрированный процесс" означает процесс, который осуществляют с применением структурных элементов, которые функционируют совместно для обеспечения определенного результата (например, получения выделенного рекомбинантного белка из жидкой культуральной среды).

Термин "непрерывный процесс" означает процесс, с помощью которого текучая среда непрерывно транспортируется через по меньшей мере часть системы.

Термин "иммуноглобулин" означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере из 15 аминокислот (например, по меньшей мере из 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 аминокислот) белка-иммуноглобулина (например, последовательность вариабельного домена, последовательность каркаса или последовательность константного домена). Иммуноглобулин может содержать, например, по меньшей мере 15 аминокислот из легкой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере 15 аминокислот из тяжелой цепи иммуноглобулина. Иммуноглобулин может представлять собой выделенное антитело (например, IgG, IgE, IgD, IgA или IgM). Иммуноглобулин может относиться к подклассу IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Иммуноглобулин может представлять собой фрагмент антитела, например, Fab-фрагмент, F(ab′)₂-фрагмент или scFv-фрагмент. Иммуноглобулин может также представлять собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, или димерное, тримерное или мультимерное антитело, или диатело, Affibody® или Nanobody®. Иммуноглобулин также может представлять собой сконструированный белок, содержащий по меньшей мере один домен иммуноглобулина (например, гибридный белок). Неограничивающие примеры иммуноглобулинов описаны в данном документе, а дополнительные примеры иммуноглобулинов известны из уровня техники.

Термины "фрагмент белка" или "фрагмент полипептида" означают часть полипептидной последовательности длиной по меньшей мере или приблизительно 4 аминокислоты, по меньшей мере или приблизительно 5 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 6 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 7 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 8 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 9 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 10 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 11 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 12 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 13 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 14 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 15 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 16 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 17 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 18 аминокислот, по меньшей мере или приблизительно 19 аминокислот или по меньшей мере или приблизительно 20 аминокислот или длиной более 20 аминокислот. Фрагмент рекомбинантного белка можно получить с применением каких-либо из процессов, описанных в данном документе.

Термин "сконструированный белок" означает полипептид, который в естественных условиях не кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой, находящейся в организме (например, млекопитающем). Примеры сконструированных белков включают ферменты (например, с одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями, вставками или добавлениями, которые приводят к повышенной стабильности и/или каталитической активности сконструированного фермента), гибридные белки, антитела (например, бивалентные антитела, тривалентные антитела или диатело) и антигенсвязывающие белки, которые содержат по меньшей мере одну рекомбинантную последовательность каркаса.

Термин "система для многоколоночной хроматографии" или "MCCS" означает систему из суммарно двух или более взаимосвязанных или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Неограничивающим примером системы для многоколоночной хроматографии является система для периодической противоточной хроматографии (PCC), содержащая суммарно две или более взаимосвязанных или переключающихся хроматографических колонок и/или хроматографических мембран. Дополнительные примеры систем для многоколоночной хроматографии описаны в данном документе и известны из уровня техники.

Термин "захват" означает стадию, осуществляемую для частичной очистки или выделения (например, обеспечения по меньшей мере или приблизительно 5%, например, по меньшей мере или приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или по меньшей мере или приблизительно 95% чистоты по весу), концентрирования и стабилизации рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка) от одного или нескольких других компонентов, находящихся в жидкой культуральной среде или разбавленной жидкой культуральной среде (например, белков культуральной среды или одного или нескольких других компонентов (например, ДНК, РНК или других белков), находящихся к клетке млекопитающего или секретируемых ею). Как правило, захват осуществляют с применением смолы, которая связывает рекомбинантный белок (например, путем применения аффинной хроматографии). Неограничивающие способы захвата рекомбинантного белка из жидкой культуральной среды или разбавленной жидкой культуральной среды описаны в данном документе, а другие известны из уровня техники. Рекомбинантный белок можно захватывать из жидкой культуральной среды с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки и/или хроматографической мембраны (например, любой из хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, описанных в данном документе).

Термин "очистка" означает стадию, осуществляемую для отделения рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка) от одной или более других примесей (например, объемных примесей) или компонентов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок (например, белков жидкой культуральной среды или одного или более других компонентов (например, ДНК, РНК, других белков, эндотоксинов, вирусов и т. д.), находящихся в клетке млекопитающего или секретируемых ею). Например, очистку можно осуществлять во время или после стадии первичного захвата. Очистку можно осуществлять с применением смолы, мембраны или любой другой твердой подложки, которая связывает либо рекомбинантный белок, либо загрязнители (например, путем применения аффинной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, анионо- или катионообменной хроматографии или хроматографии на молекулярных ситах). Рекомбинантный белок можно очищать из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки и/или хроматографической мембраны (например, любой из хроматографических колонок или хроматографических мембран, описанных в данном документе).

Термин "доочистка" является термином из области техники и означает стадию, осуществляемую для удаления оставшихся следовых или небольших количеств загрязнителей или примесей из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок (например, рекомбинантный терапевтический белок), т. е. приближающую ее к окончательной необходимой чистоте. Например, доочистку можно осуществлять пропусканием текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, через хроматографическую колонку(колонки) или мембранный поглотитель(поглотители), которые селективно связываются либо с целевым рекомбинантным белком, либо с небольшими количествами загрязнителей или примесей, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок. В таком примере элюат/фильтрат хроматографической колонки(колонок) или мембранного поглотителя(поглотителей) содержит рекомбинантный белок.

Термин "элюат/фильтрат" является термином из области техники и означает текучую среду, которая выходит из хроматографической колонки или хроматографической мембраны, содержащую выявляемые количества рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка).

Термин "фильтрация" означает удаление по меньшей мере части (например, по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) нежелательных биологических загрязнителей (например, клеток млекопитающего, бактерий, дрожжевых клеток, вирусов или микобактерий) и/или твердых частиц (например, осажденных белков) из жидкости (например, жидкой культуральной среды или текучей среды, находящихся в любой из систем или процессов, описанных в данном документе).

Термины "секретируемый белок" или "секретируемый рекомбинантный белок" означают белок (например, рекомбинантный белок), который изначально содержит по меньшей мере одну сигнальную последовательность секреции при его трансляции внутри клетки млекопитающего, и в результате, по меньшей мере отчасти, ферментативного отщепления данной сигнальной последовательности секреции в клетке млекопитающего он секретируется, по меньшей мере частично, во внеклеточное пространство (например, жидкую культуральную среду). Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что "секретируемый" белок не должен быть полностью отделен от клетки, чтобы считаться секретируемым белком.

Термин "перфузионное культивирование" является термином из области техники и означает культивирование культуры клеток в сосуде (например, биореакторе), где культивирование культуры клеток в сосуде включает периодическое или постоянное удаление жидкой культуральной среды, находящейся в сосуде (например, жидкой культуральной среды, которая практически не содержит клеток), и одновременное или вскоре после этого добавление практически такого же объема замещающей жидкой культуральной среды в сосуд. В некоторых примерах постепенно изменяют (например, повышают или снижают) объем жидкой культуральной среды и объем замещающей культуральной среды, которые удаляют и добавляют в течение дискретных периодов (например, приблизительно 24-часового периода, периода, составляющего от приблизительно 1 минуты до приблизительно 24 часов, или периода, превышающего 24 часа) во время периода культивирования (например, скорость повторной подпитки культуральной средой ежесуточно). Фракция среды, которую удаляют и заменяют каждый день, может изменяться в зависимости от конкретных подлежащих культивированию клеток, исходной плотности посева и плотности клеток в конкретный момент времени. "RV" или "объем реактора" означает объем культуральной среды, имеющийся в начале процесса культивирования (например, общий объем культуральной среды, имеющийся после посева).

Термин "сосуд" известен из уровня техники и означает устройство с внутренним объемом, пригодным для культивирования некоторого количества клеток (например, рекомбинантных клеток млекопитающих) в жидкой культуральной среде при контролируемой совокупности физических условий, которые обеспечивают возможность поддержания или пролиферации клеток. Неограничивающими примерами сосудов являются биореакторы (например, любой из иллюстративных биореакторов, описанных в данном документе или известных из уровня техники).

Термин "перфузионный биореактор" известен из уровня техники и означает биореактор с внутренним объемом для культивирования некоторого количества клеток (например, рекомбинантных клеток млекопитающих) в жидкой культуральной среде, и имеющий средства (например, выпускное отверстие, впускное отверстие, насос или другое такое устройство) для периодического или непрерывного удаления жидкой культуральной среды из биореактора, и имеющий средства (например, выпускное отверстие, впускное отверстие, насос или другое такое устройство) для добавления практически такого же объема замещающей жидкой культуральной среды в биореактор. Добавление замещающей жидкой культуральной среды можно осуществлять практически одновременно или вскоре после удаления жидкой культуральной среды из биореактора. Средства для удаления жидкой культуральной среды из биореактора и средства для добавления замещающей жидкой культуральной среды могут представлять собой одно устройство или систему.

Термин "производственный биореактор" является термином из области техники и означает биореактор большого масштаба (например, с внутренним объемом более 500 л, 1000 л, 5000 л, 10000 л, 20000 л, 50000 л или 100000 л). Например, производственный биореактор может представлять собой перфузионный биореактор.

Термин "плотность клеток-продуцентов на стационарной фазе" является термином из области техники и означает целевую концентрацию жизнеспособных клеток (например, жизнеспособных рекомбинантных клеток млекопитающих) в культуральной среде, которая поддерживается во время перфузионного культивирования в динамике по времени.

Термин "периодическое культивирование" является термином из области техники и означает сосуд (например, биореактор), содержащий некоторое количество клеток (например, клеток млекопитающих) в жидкой культуральной среде, где культивирование клеток, находящихся в сосуде (например, биореакторе), не включает добавление существенного или значительного количества свежей жидкой культуральной среды к культуре клеток и не включает удаление существенного или значительного количества жидкой культуральной среды из культуры клеток во время культивирования.

Термин "периодическое культивирование с подпиткой" является термином из области техники и означает сосуд (например, производственный биореактор), включающий некоторое количество клеток (например, клеток млекопитающих) в жидкой культуральной среде, где культивирование клеток, находящихся в сосуде (например, производственном биореакторе), включает периодическое или постоянное добавление свежей жидкой культуральной среды в сосуд без существенного или значительного удаления жидкой культуральной среды из сосуда во время культивирования. Свежая жидкая культуральная среда может быть такой же, как жидкая культуральная среда, находящаяся в сосуде в момент начала культивирования. В некоторых примерах периодического культивирования с подпиткой свежая жидкая культуральная среда представляет собой концентрированную форму жидкой культуральной среды, находящейся в сосуде в момент начала культивирования. В некоторых примерах периодической культуры с подпиткой свежую культуральную среду добавляют с виде сухого порошка.

Термин "отдельная технологическая операция" является термином из области техники и означает функциональную стадию, которую можно осуществлять в процессе выделения рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка) из жидкой культуральной среды. Например, отдельной функциональной операцией может быть фильтрование (например, удаление контаминирующих бактерий, дрожжей, вирусов или микобактерий, и/или твердых частиц из жидкости, содержащей рекомбинантный белок), захват, удаление эпитопной метки, очистку, выдерживание или хранение, доочистку, инактивацию вирусов, регуляцию концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и удаление нежелательных солей.

"Удельная продуктивность" или "SPR" является термином из уровня техники и, как используется в данном документе, относится к массе или ферментативной активности рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка), вырабатываемого одной клеткой млекопитающего за день. SPR для рекомбинантного антитела обычно измеряется в виде масса/клетка/день. SPR для рекомбинантного фермента обычно измеряется в виде единицы/клетка/день или (единицы/масса)/клетка/день.

"Объемная продуктивность" или "VPR" является термином из области техники и, как используется в данном документе, относится к массе или ферментативной активности рекомбинантного белка (например, рекомбинантного терапевтического белка), вырабатываемого на единицу объема культуры (например, на литр объема биореактора, сосуда или пробирки) за день. VPR для рекомбинантного антитела обычно измеряется в виде масса/л/день. VPR для рекомбинантного фермента обычно измеряется в виде единицы/л/день или масса/л/день.

"Подставка" является термином из области техники и, как используется в данном документе, относится к трехмерной твердой структуре, которая может функционировать в качестве платформы или опоры для системы, описанной в данном документе. Если подставка содержит одну или несколько структур, которые обеспечивают движение (например, колесики, ролики и т. п.), она может придавать подвижность системе или ее части. Неограничивающие примеры подставок описаны в данном документе. Дополнительные примеры подставок известны из уровня техники.

Если не определено иное, вся техническая и научная терминология, используемая в данном документе, имеет то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Способы и материалы описаны в данном документе для использования в настоящем изобретении; при этом также можно использовать и другие подходящие способы и материалы, известные из уровня техники. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, записи в базах данных и другие ссылки, упомянутые данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующих подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 представляет собой схематическое изображение, показывающее традиционный процесс культивирования в системе посевных ферментеров, который заканчивается засевом 500 л производственного перфузионного биореактора (вверху), и схематическое изображение иллюстративного процесса культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренного в данном документе, который заканчивается инокуляцией производственного перфузионного биореактора объемом 500 л (внизу).

Фигура 2 представляет собой схематическое изображение, показывающее традиционный процесс культивирования в системе посевных ферментеров, который заканчивается засевом производственного биореактора объемом 10000 л для периодического культивирования или периодического культивирования с подпиткой (вверху), и схематическое изображение иллюстративного процесса культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренного в данном документе, который заканчивается инокуляцией производственного биореактора объемом 10000 л для периодического культивирования или периодического культивирования с подпиткой (внизу).

Фигура 3 представляет собой график, показывающий плотность жизнеспособных клеток на протяжении стадий иллюстративного процесса культивирования в системе посевных ферментеров, описанного в данном документе: периодическое культивирование 1 л третьей культуры клеток в биореакторе одноразового использования объемом 2 л, периодическое культивирование 7,5 л первой культуры клеток в биореакторе одноразового использования объемом 20 л и перфузионное культивирование 10 л второй культуры клеток в перфузионном биореакторе объемом 15 л.

Фигура 4 представляет собой график плотности жизнеспособных клеток в зависимости от емкости перфузионной культуры клеток N-1 в иллюстративном процессе культивирования в системе посевных ферментеров, описанном в данном документе.

Фигура 5 представляет собой график плотности жизнеспособных клеток (сплошная линия) и процентную долю жизнеспособности клеток (пунктирная линия) в динамике по времени для пробирок Spin, которые инокулировали некоторым объемом культуры клеток N-1 с плотностью жизнеспособных клеток, составляющей 25×10⁶ клеток/мл (голубые линии), 50×10⁶ клеток/мл (зеленые линии) или 100×10⁶ клеток/мл (красные линии) с получением начальной плотности жизнеспособных клеток, составляющей 0,5×10⁶ клеток/мл в пробирках Spin (изображают производственный биореактор). Сплошная и пунктирная линии обозначают среднее значение данных (n=3). Заштрихованные области обозначают ± 2 стандартных отклонения.

Фигура 6 представляет собой график плотности жизнеспособных клеток (сплошная линия) и процентную долю жизнеспособности клеток (пунктирная линия) в динамике по времени для пробирок Spin, которые инокулировали некоторым объемом культуры клеток N-1 с плотностью жизнеспособных клеток, составляющей 25×10⁶ клеток/мл (голубые линии), 50×10⁶ клеток/мл (зеленые линии) или 100×10⁶ клеток/мл (красные линии) с получением начальной плотности жизнеспособных клеток, составляющей 2,5×10⁶ клеток/мл в пробирках Spin (изображают производственный биореактор). Сплошная и пунктирная линии обозначают среднее значение данных (n=3). Заштрихованные области обозначают ± 2 стандартных отклонения.

Фигура 7 представляет собой график плотности жизнеспособных клеток (сплошная линия) и процент жизнеспособности клеток (пунктирная линия) в динамике по времени для пробирок Spin, которые инокулировали некоторым объемом культуры клеток N-1 с плотностью жизнеспособных клеток, составляющей 25×10⁶ клеток/мл (голубые линии), 50×10⁶ клеток/мл (зеленые линии) или 100×10⁶ клеток/мл (красные линии) с получением начальной плотности жизнеспособных клеток, составляющей 5,0×10⁶ клеток/мл в пробирках Spin (изображают производственный биореактор). Сплошная и пунктирная линии обозначают среднее значение данных (n=3). Заштрихованные области обозначают ± 2 стандартных отклонения.

Фигура 8 представляет собой график плотности жизнеспособных клеток в динамике по времени для производственных биореакторов объемом 10 л, которые инокулировали при плотности 0,5×10⁶клеток/мл из перфузионного биореактора N-1 при плотности 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл (n=2) (красные линии), в сравнении с 10 л производственными биореакторами, которые инокулировали при плотности 5,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл из перфузионного биореактора N-1 при плотности 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл (n=2) (зеленые линии). Пунктирная линия обозначает целевую плотность жизнеспособных клеток для режима в стационарной фазе в производственном биореакторе. Сплошная линия обозначает среднее значение данных (n=2). Заштрихованные области обозначают ± 2 стандартных отклонения.

Фигура 9 представляет собой график, показывающий кумулятивную активность продукта (единицы/л) в зависимости от интегральной концентрации жизнеспособных клеток для производственных биореакторов объемом 10 л, которые инокулировали при плотности 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл из перфузионного биореактора N-1 при плотности 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл (красные точки), в сравнении с производственными биореакторами объемом 10 л, которые инокулировали из расчета 5,0×10⁶жизнеспособных клеток/мл из биореактора N-1 при плотности 50×10⁶ клеток/мл (зеленые точки). Точки обозначают средние значения данных (n=2), а "усы" обозначают ± 2 стандартных отклонения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе предусмотрены процессы культивирования в системе посевных ферментеров, которые включают стадии (a) помещения некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду, содержащуюся всосуде, с получением первой культуры клеток; (b) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл; (c) помещение некоторого объема первой культуры клеток из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл; (d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл и (e) помещение некоторого объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл.

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, обеспечивают множество преимуществ. В первом аспекте для процессов культивирования в системе посевных ферментеров по настоящему изобретению требуется меньше стадий культивирования (удаление 1-2 различных стадий культивирования) до получения культуры клеток-продуцентов (например, снижение числа стадий размножения малого масштаба) по сравнению с традиционными процессами культивирования в системе посевных ферментеров, что, в свою очередь, обеспечивает меньшее количество ручных манипуляций с культурой клеток и пониженный риск контаминации культуры клеток-продуцентов. Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, могут обеспечивать культуру клеток N-1 (вторая культура клеток, применяемая для инокуляции культуры клеток-продуцентов) с высокими плотностями жизнеспособных клеток, например, до 100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, за 12 дней без снижения характеристик роста клеток у культуры клеток-продуцентов. Высокие плотности жизнеспособных клеток, обеспечиваемые у культуры N-1 (вторая культура клеток) с применением процессов культивирования в системе посевных ферментеров, описанных в данном документе, обеспечивают возможность боле высокой исходной плотности клеток у культуры клеток-продуцентов в производственном биореакторе. Например, процессы культивирования в системе посевных ферментеров по настоящему изобретению можно применять для обеспечения исходной плотности клеток от приблизительно 0,50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл до 10×10⁶жизнеспособных клеток/мл, что, в свою очередь, приводит к сниженному количеству времени (например, уменьшению на 4-6 дней) для достижения культурой клеток-продуцентов плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе. Это снижение количества времени для достижения культурой клеток-продуцентов плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе может обеспечивать 10% повышение общей продуктивности за 50-дневный цикл производственной культуры. Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренные в данном документе, также могут приводить к культуре клеток-продуцентов, которая характеризуется более высокими объемной продуктивностью и удельной продуктивностью, чем культуры клеток-продуцентов, полученные в результате других процессов культивирования в системе посевных ферментеров.

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров

В данном документе предусмотрены процессы культивирования в системе посевных ферментеров, которые обеспечивают некоторые преимущества относительно других процессов культивирования в системе посевных ферментеров. Неограничивающие аспекты данных процессов культивирования в системе посевных ферментеров описаны в данном документе, и их можно применять в любой комбинации.

Получение первой культуры клеток

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, включают стадию (a) помещения некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих (например, любых рекомбинантных клеток млекопитающих, описанных в данном документе или известных из уровня техники) в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток. В некоторых примерах некоторое количество рекомбинантных клеток млекопитающих, помещенных в первую культуральную среду, может составлять от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 450×10⁷клеток (например, от приблизительно 9,0×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷клеток, от приблизительно 22,5×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷ клеток, от приблизительно 67,5×10⁷ клеток до приблизительно 450×10⁷клеток, от приблизительно 90×10⁷ клеток до приблизительно 450×10⁷клеток, от приблизительно 112,5×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷клеток, от приблизительно 135×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷клеток, от приблизительно 157,5×10⁷клеток до приблизительно 450×10⁷ клеток, от приблизительно 180×10⁷ до приблизительно 450×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷клеток до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 9,0×10⁷клеток до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 45×10⁷до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 67,5×10⁷клеток до приблизительно 405×10⁷ клеток, от приблизительно 90×10⁷ до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 112,5×10⁷до приблизительно 405×10⁷ клеток, от приблизительно 135×10⁷ клеток до приблизительно 405×10⁷ клеток, от приблизительно 157,5×10⁷клеток до приблизительно 405×10⁷клеток, от приблизительно 180×10⁷ клеток до приблизительно 405×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 360×10⁷клеток, от приблизительно 9,0×10⁷ клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 67,5×10⁷клеток до приблизительно 360×10⁷клеток, от приблизительно 90×10⁷ клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 112,5×10⁷клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 135×10⁷клеток до приблизительно 360×10⁷клеток, от приблизительно 157,5×10⁷клеток до приблизительно 360×10⁷клеток, от приблизительно 180×10⁷ клеток до приблизительно 360×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷клеток/мл, от приблизительно 22,5×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷клеток, от приблизительно 67,5×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷клеток, от приблизительно 90×10⁷ клеток до приблизительно 315×10⁷клеток, от приблизительно 112,5×10⁷ клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 135×10⁷ клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 157,5×10⁷ клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 180×10⁷клеток до приблизительно 315×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷клеток, от приблизительно 45×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷клеток, от приблизительно 67,5×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 90×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 112,5×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 135×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 157,5×10⁷ клеток до приблизительно 270×10⁷ клеток, от приблизительно 180×10⁷клеток до приблизительно 270×10⁷клеток, от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷ клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 67,5×10⁷ клеток до приблизительно 225×10⁷клеток, от приблизительно 90×10⁷ клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 112,5×10⁷клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от 135×10⁷клеток до приблизительно 225×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 180×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷ клеток до приблизительно 180×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷до приблизительно 180×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷ клеток до приблизительно 180×10⁷клеток, от приблизительно 67,5×10⁷ до приблизительно 180×10⁷ клеток, от приблизительно 90×10⁷ до приблизительно 180×10⁷ клеток, от приблизительно 4,5×10⁷клеток до приблизительно 135×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷ до приблизительно 135×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 135×10⁷ клеток, от приблизительно 45×10⁷ клеток до приблизительно 135×10⁷клеток, от приблизительно 4,5×10⁷ клеток до приблизительно 90×10⁷ клеток, от приблизительно 9,0×10⁷ клеток до приблизительно 90×10⁷ клеток, от приблизительно 22,5×10⁷ клеток до приблизительно 90×10⁷ клеток или от приблизительно 45×10⁷ до приблизительно 90×10⁷ клеток) и может меняться в зависимости от объема первой культуральной среды, содержащейся в сосуде. Например, некоторого количества клеток, помещенных в первую жидкую культуральную среду, может быть достаточно для получения исходной плотности клеток от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл (например, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,65×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,55×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,35×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,65×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,55×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,35×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,65×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,55×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,65×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,55×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,35×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,65×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,55×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/мл или от приблизительно 0,30×10⁶ до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/мл) в первой культуре клеток.

Как можно понять из уровня техники, сосуд на стадии (a) может иметь целый ряд различных объемов. Например, сосуд на стадии (a), содержащий первую культуральную среду, может иметь внутренний объем от приблизительно 0,50 л до приблизительно 200 л (например, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 180 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 160 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 140 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 120 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 20 л или от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10 л).

Как можно понять из уровня техники, сосуд, который содержит первую культуру клеток, может представлять собой любое устройство, применяемое в уровне техники для целей культивирования клеток млекопитающих (например, колба (например, колба с мешалкой), роллерная пробирка или биореактор). Сосуд может содержать внутренние средства для перемешивания (например, мешалку) или сосуд можно встряхивать внешним образом (например, путем применения вращающей и/или качающей платформы). Сосуд может быть изготовлен из нержавеющей стали или пластика (например, пластиковый стерильный мешок). В некоторых вариантах осуществления сосуд может представлять собой биореактор одноразового использования (например, одноразовый биореактор MilliporeTM Mobius® Cellready объемом 3 л, одноразовый биореактор Pierre Guerin ATM1 NucleoTM объемом 20 л, одноразовый биореактор Sartorius Cultibag STRTM объемом 50 л, биореактор Sartorius Cultibag RMTM объемом 20 л, биореактор Sartorius Cultibag OrbitalTM объемом 50 л, биореактор GE Wave Bioreactor 2/10 System объемом 5 л, биореактор GE Wave Bioreactor 20/50 System объемом 25 л, биореактор GE Wave Bioreactor 200 System объемом 200 л или биореактор GE Wave Bioreactor 500/1000 System объемом 500 л). Внутренняя поверхность сосуда может иметь по меньшей мере одно покрытие (например, по меньшей мере одно покрытие из желатина, коллагена, поли-L-орнитина, полистирола и ламинина) и, как известно из уровня техники, одно или несколько отверстий для барботирования O₂, CO₂ и N₂ в первую жидкую культуральную среду. Сосуд может быть оснащен одним или несколькими сенсорными датчиками. Если сосуд состоит из нежесткого пластического материала (например, пластиковый стерильный мешок), сосуд может быть связан с наружной опорой, которая окружает и поддерживает сосуд.

Первая культура клеток может иметь целый ряд различных объемов, например, первая культура клеток может иметь объем от приблизительно 0,30 л до приблизительно 100 л (например, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 90 л от приблизительно 1,5 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 20 л или от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10 л).

Как можно понять из уровня техники, имеется множество путей, с помощью которых некоторое количество клеток может быть помещено в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде. Например, помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих может включать стадии размораживания замороженного клеточного банка (например, любого из иллюстративных замороженных клеточных банков, описанных в данном документе или известных из уровня техники) и помещения (например, перенесения с помощью стерильной пипетки) некоторого объема размороженного клеточного банка в первую культуральную среду. Замороженный клеточный банк может характеризоваться диапазоном плотности клеток, например, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷клеток/мл (например, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 35×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁷ клеток/мл до приблизительно 100×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 35×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁷ клеток/мл до приблизительно 90×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷ до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 35×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁷ клеток/мл до приблизительно 80×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 35×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁷ клеток/мл до приблизительно 70×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁷ до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 35×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁷ клеток/мл до приблизительно 60×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁷клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл или от приблизительно 30×10⁷ клеток/мл до приблизительно 50×10⁷ клеток/мл). Способы получения таких замороженных клеточных банков известны из уровня техники (см., например, предварительную заявку на патент США с регистрационным № 61/793021, поданную 15 марта 2013 года; заявку на патент США с регистрационным номером 14/212607, поданную 14 марта 2014 года, и международную заявку № PCT/US2014/027757, поданную 14 марта 2014 года). Как хорошо известно из уровня техники, размораживание замороженного клеточного банка можно осуществлять, например, воздействуя на замороженный клеточный банк нагревателем (а не путем воздействия комнатной температуры), например, водной баней или термостатом (например, установленным на 30°C или 37°C). В некоторых примерах размораживание можно осуществлять за период, составляющий от 1 секунды до 1 минуты, от 1 секунды до 55 секунд, от 1 секунды до 50 секунд, от 1 секунды до 45 секунд, от 1 секунды до 40 секунд, от 1 секунды до 35 секунд, от 1 секунды до 30 секунд, от 1 секунды до 25 секунд или от 1 секунды до 20 секунд). Замороженный клеточный банк также можно размораживать, воздействуя на замороженный клеточный банк комнатной температурой (например, приблизительно 25°C). Процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке может составлять, например, по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%). Например, процентная доля жизнеспособных клеток в размороженном клеточном банке может составлять от 60% до приблизительно 98% (например, от приблизительно 60% до приблизительно 95%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 60% до приблизительно 85%, от приблизительно 60% до приблизительно 80%, от приблизительно 60% до приблизительно 75%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 65% до приблизительно 98%, от приблизительно 65% до приблизительно 95%, от приблизительно 65% до приблизительно 90%, от приблизительно 65% до приблизительно 85%, от приблизительно 65% до приблизительно 80%, от приблизительно 65% до приблизительно 75%, от приблизительно 70% до приблизительно 98%, от приблизительно 70% до приблизительно 95%, от приблизительно 70% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 85%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 80% до приблизительно 98%, от приблизительно 80% до приблизительно 95%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 85% до приблизительно 98%, от приблизительно 85% до приблизительно 95%, от приблизительно 90% до приблизительно 98% или от приблизительно 90% до приблизительно 95%).

В некоторых примерах помещение некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду с получением первой культуры клеток может включать стадию помещения некоторого объема третьей культуры клеток, содержащей некоторое количество рекомбинантных клеток млекопитающих, в первую культуральную среду. Например, объем третьей культуры, которую помещают в первую культуральную среду, может составлять, например, от 0,10 мл до приблизительно 10 л (например, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 25 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 10 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 0,50 мл до приблизительно 25 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 0,10 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 1,0 мл до приблизительно 25 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 2,0 мл до приблизительно 25 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 10 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 50 мл, от приблизительно 5,0 мл до приблизительно 25,0 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 10 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 8,0 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 6,0 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 4,0 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 2,0 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 1,0 л, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 800 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 600 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 400 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 200 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 100 мл, от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 50 мл или от приблизительно 10,0 мл до приблизительно 25,0 мл). Плотность клеток в третьей культуре клеток, помещаемой в первую культуральную среду, может представлять собой любую из иллюстративных плотностей клеток или диапазонов плотностей клеток, описанных в данном документе. Как может быть понятно специалисту в данной области, объем третьей культуры клеток, достаточный для получения первой культуры клеток при исходной плотности клеток от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл (или любом из других иллюстративных диапазонов исходных плотностей клеток, перечисленных для первой культуры клеток выше), можно определить, исходя из плотности клеток в третьей культуре клеток и объема первой жидкой культуральной среды, находящейся в сосуде (перед помещением третьей культуры клеток в первую культуральную среду).

Некоторые варианты осуществления, в которых применяется третья культура клеток, могут включать стадии (1) помещения некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в четвертую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением третьей культуры клеток, и (2) периодического культивирования третьей культуры клеток из стадии (1) до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл (например, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15×10⁶ клеток/мл или от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл), при этом некоторый объем третьей культуры клеток на стадии (2) затем помещают в первую культуральную среду для получения первой культуры клеток. Некоторое количество клеток, помещенных в четвертую культуральную среду, может составлять, например, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷клеток (например, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷ клеток, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 5,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 2,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 1,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,10×10⁷ клеток до приблизительно 0,50×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 5,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 2,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 1,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,20×10⁷ клеток до приблизительно 0,50×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 5,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 2,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,40×10⁷ клеток до приблизительно 1,0×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 5×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 2×10⁷ клеток, от приблизительно 0,60×10⁷ клеток до приблизительно 1×10⁷ клеток, от приблизительно 0,80×10⁷ клеток до приблизительно 1,0×10⁷ клеток, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷ клеток, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷ клеток, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток до приблизительно 5,0×10⁷ клеток, от приблизительно 1,0×10⁷ клеток до приблизительно 2,0×10⁷ клеток, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток до приблизительно 20×10⁷ клеток, от приблизительно 5,0×10⁷ клеток до приблизительно 15×10⁷ клеток или от приблизительно 5,0×10⁷ клеток до приблизительно 10×10⁷ клеток) и может меняться в зависимости от объема четвертой культуральной среды, содержащейся внутри сосуда. Например, некоторое количество клеток, помещенных в третью жидкую культуральную среду, может быть достаточным для получения исходной плотности клеток от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл в третьей культуре клеток (например, любой из иллюстративных исходных плотностей клеток или любом из диапазонов исходных плотностей клеток, перечисленных выше для первой культуры клеток).

В некоторых вариантах осуществления стадия помещения некоторого количества рекомбинантных клеток млекопитающих в четвертую культуральную среду с получением третьей культуры клеток может включать стадии размораживания замороженного клеточного банка и помещения некоторого объема размороженного клеточного банка в четвертую культуральную среду. В таких вариантах осуществления замороженный клеточный банк может характеризоваться любой из плотностей клеток или любым из диапазонов плотностей клеток для замороженных клеточных банков, описанных в данном документе. Замороженный клеточный банк можно размораживать с применением любого из способов, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Полученный размороженный клеточный банк может характеризоваться любой процентной долей жизнеспособных клеток или любым из диапазонов процентных доль жизнеспособных клеток для размороженного клеточного банка, описанных в данном документе.

Внутренний объем сосуда, содержащего третью культуру клеток может составлять, например, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 30 л (например, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 2,5 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 2,5 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 2,5 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 30 л или от приблизительно 10 л до приблизительно 20 л). Четвертая культуральная среда может иметь объем, составляющий, например, от приблизительно 0,10 л до приблизительно 20 л (например, от приблизительно 0,10 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,10 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 0,10 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,10 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,20 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 0,50 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,5 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 25 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 5,0 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 15 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 20 л или от приблизительно 10 л до приблизительно 15 л).

Как можно понять из уровня техники, сосуд, который содержит третью культуру клеток, может представлять собой любое устройство, применяемое в уровне техники для целей культивирования клеток млекопитающих (например, колба (например, колба с мешалкой), роллерная пробирка или биореактор). Сосуд может содержать внутренние средства для перемешивания (например, мешалку) или сосуд можно встряхивать внешним образом (например, путем применения вращающей и/или качающей платформы). Сосуд может быть изготовлен из нержавеющей стали или пластика (например, пластиковый стерильный мешок). В некоторых вариантах осуществления сосуд может представлять собой биореактор одноразового использования (например, любой из биореакторов одноразового использования, описанных в данном документе). Внутренняя поверхность перфузионного биореактора может иметь по меньшей мере одно покрытие (например, по меньшей мере одно покрытие из желатина, коллагена, поли-L-орнитина, полистирола и ламинина) и, как известно из уровня техники, одно или несколько отверстий для барботирования O₂, CO₂ и N₂ в третью культуральную среду. Сосуд может быть оснащен одним или несколькими сенсорными датчиками. Если сосуд состоит из нежесткого пластического материала (например, пластиковый стерильный мешок), сосуд может окружать и поддерживать внешняя опора.

Каждую из стадий помещения, описанных в данном документе, можно осуществлять с применением стерильной пипетки (например, перенесением с помощью стерильной пипетки в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха).

Периодическое культивирование первой культуры клеток

После получения первой культуры клеток на стадии (a), процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, включают стадию (b) периодического культивирования первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл (например, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл, от 10,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 17,5×10⁶ клеток/мл или от приблизительно 12,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 15,0×10⁶ клеток/мл). Целый ряд различных способов определения плотности клеток известен из уровня техники (например, применение светового микроскопа и гемоцитометра или применение автоматического цитометра, такого как, например, автоматический цитометр Countess® (Life Technologies), Cellometer® (Nexcelom Bioscience), автоматический цитометр Luna^TM(Logos Biosystems), или анализатора жизнеспособности клеток Vi-Cell®).

Периодическое культивирование первой культуры клеток не предусматривает добавления существенного или значительного количества жидкой культуральной среды к первой культуре клеток и не предусматривает удаления существенного или значительного количества первой среды для культивирования клеток во время культивирования. Периодическое культивирование можно осуществлять с применением любой из иллюстративных температур и/или любого из воздействий газом CO₂, описанных в данном документе. Периодическое культивирование можно осуществлять с применением любого из воздействий газом O₂ и/или N₂, известных из уровня техники. Периодическое культивирование также может предусматривать любой из типов перемешивания, описанных в данном документе. Как будет понятно специалисту в данной области, продолжительность периодического культивирования первой культуры клеток для достижения целевой плотности клеток от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20,0×10⁶ клеток/мл (или любой из других плотностей клеток, или любого из диапазонов плотностей клеток, описанных в данном документе) будет зависеть от скорости роста рекомбинантных клеток млекопитающих и исходной плотности клеток первой культуры клеток. Например, первую культуру клеток можно культивировать в течение периода, составляющего от приблизительно 1 дня до приблизительно 9 дней (например, от приблизительно 1 дня до приблизительно 8 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 7 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 6 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 5 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 4 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 3 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 8 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 4 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 8 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 8 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 6 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 6 дней до приблизительно 9 дней, от приблизительно 6 дней до приблизительно 8 дней или от приблизительно 7 дней до приблизительно 9 дней). Другие иллюстративные параметры периодического культивирования, которые можно применять в способах по настоящему изобретению, описаны в данном документе.

Получение второй культуры клеток

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, дополнительно включают стадию (c) помещения некоторого объема первой культуры клеток из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,8×10⁶ клеток/мл (например, при любой из исходных плотностей клеток или любом из диапазонов исходных плотностей клеток, описанных для первой культуры клеток выше). Как будет понятно специалисту в данной области, соответствующий объем первой культуры клеток для помещения во вторую культуральную среду, чтобы достичь исходную плотность клеток в диапазоне от приблизительно 0,10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл для второй культуры клеток, можно определить исходя из плотности клеток первой культуры клеток и объема второй культуральной среды. Объем первой культуры клеток, помещенной во вторую культуральную среду, может составлять, например, от 0,30 л до приблизительно 100 л (например, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 0,30 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 1,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 2,5 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 10 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 30 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 20 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 40 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 30 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 40 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 40 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 40 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 40 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 40 л до приблизительно 60 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 70 л, от приблизительно 60 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 60 л до приблизительно 90 л, от приблизительно 60 л до приблизительно 80 л, от приблизительно 70 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 70 л до приблизительно 90 л или от приблизительно 80 л до приблизительно 100 л).

Объем второй культуры клеток может составлять, например, от 2,0 л до 800 л (например, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 2,0 л до приблизительно 25 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 25 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 10 л до приблизительно 25 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 15 л до приблизительно 25 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 20 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 25 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 75 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 150 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 250 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 350 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 350 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 450 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 550 л, от приблизительно 450 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 550 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 550 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 550 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 550 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 550 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 650 л, от приблизительно 650 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 650 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 650 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 750 л или от приблизительно 750 л до приблизительно 800 л).

Перфузионный биореактор может быть любым из иллюстративных перфузионных биореакторов, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Например, перфузионный биореактор может быть изготовлен из нержавеющей стали или пластика (например, пластиковый стерильный мешок). Внутренняя поверхность перфузионного биореактора может иметь по меньшей мере одно покрытие (например, по меньшей мере одно покрытие из желатина, коллагена, поли-L-орнитина, полистирола и ламинина) и, как известно из уровня техники, одно или несколько отверстий для барботирования O₂, CO₂ и N₂ в жидкую культуральную среду и устройство для перемешивания жидкой культуральной среды. Перфузионный биореактор также может быть оснащен механическим устройством, которое обеспечивает возможность удаления некоторого объема второй жидкой культуральной среды из биореактора, и, необязательно, фильтром внутри механического устройства, который удаляет клетки из второй жидкой культуральной среды во время процесса выведения второй жидкой культуральной среды из биореактора (например, системой переменного тангенциального потока (ATF), системой для фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) или системой фильтрации, описанной в предварительной заявке на патент США № 61/878502). Биореактор также может быть оснащен одним или несколькими насосами и одним или несколькими резервуарами для хранения удаленной второй культуральной среды и новой культуральной среды, подлежащей перфузии в перфузионный биореактор.

Перфузионный биореактор может иметь внутренний объем который составляет, например, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 2000 л (например, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 5,0 л до приблизительно 50 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 150 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 300 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 300 л до приблизительно 400 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 400 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 600 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 800 л, от приблизительно 600 л до приблизительно 700 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1900 л, от 700 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 700 л до приблизительно 800 л, от 800 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1900 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1800 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1700 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1600 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1400 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1300 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1200 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1100 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 800 л до приблизительно 900 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1750 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 1250 л, от приблизительно 1250 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1250 л до приблизительно 1750 л, от приблизительно 1250 л до приблизительно 1500 л, от приблизительно 1500 л до приблизительно 2000 л, от приблизительно 1500 л до приблизительно 1750 л или от приблизительно 1750 л до приблизительно 2000 л).

Перфузионное культивирование второй культуры клеток

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, дополнительно включают стадию (d) перфузионного культивирования второй культуры клеток до плотности клеток от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл (например, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 10×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 15×10⁶ клеток/мл до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 20×10⁶ клеток/мл до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶клеток/мл, от приблизительно 30×10⁶ клеток/мл до приблизительно 40×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 40×10⁶ клеток/мл до приблизительно 50×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 60×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 60×10⁶ клеток/мл до приблизительно 70×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 70×10⁶ клеток/мл до приблизительно 80×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 90×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 90×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 90×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 90×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 90×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 90×10⁶ клеток/мл до приблизительно 100×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 100×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 100×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 100×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 100×10⁶ клеток/мл до приблизительно 110×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 110×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 110×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 110×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 110×10⁶ клеток/мл до приблизительно 120×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 120×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 120×10⁶ клеток/мл до приблизительно 130×10⁶ клеток/мл или от приблизительно 130×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл).

Перфузионное культивирование хорошо известно из уровня техники и на этой стадии предусматривает удаление (например, непрерывное или периодическое удаление) из перфузионного биореактора некоторого объема жидкой культуральной среды (например, некоторого объема второй жидкой культуральной среды в перфузионном биореакторе, которая практически не содержит клеток) и добавление в перфузионный биореактор приблизительно в то же время или практически то же время некоторого объема замещающей культуральной среды. Удаление и добавление можно проводить одновременно или последовательно, или путем их комбинирования. Кроме того, удаление и добавление можно осуществлять непрерывно (например, со скоростью, при которой удаляется и заменяется объем, составляющий от 0,1% до 800% (например, от 1% до 700%, от 1% до 600%, от 1% до 500%, от 1% до 400%, от 1% до 350%, от 1% до 300%, от 1% до 250%, от 1% до 100%, от 100% до 200%, от 5% до 150%, от 10% до 50%, от 15% до 40%, от 8% до 80% и от 4% до 30%) от объема перфузионного биореактора или исходного объема жидкой культуральной среды в начале культивирования (например, объема второй жидкой культуральной среды) в течение любого указанного периода времени (например, в течение 24-часового периода, в течение дискретного периода времени, составляющего от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов, или в течение дискретного периода времени, превышающего 24 часа)), или периодически (например, раз в каждые три дня, через день, раз в день, дважды в день, три раза в день, четыре раза в день или пять раз в день), или путем любой их комбинации. При периодическом осуществлении объем, который удаляют или заменяют (например, в пределах приблизительно 24-часового периода, в пределах дискретного периода времени, составляющего от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов, или в пределах дискретного периода времени, превышающего 24 часа), может составлять, например, от 0,1% до 800% (например, от 1% до 700%, от 1% до 600%, от 1% до 500%, от 1% до 400%, от 1% до 300%, от 1% до 200%, от 1% до 100%, от 100% до 200%, от 5% до 150%, от 10% до 50%, от 15% до 40%, от 8% до 80% и от 4% до 30%) от объема перфузионного биореактора или объема культуральной среды в биореакторе в начале культивирования (например, объема второй жидкой культуральной среды). В некоторых случаях объем жидкой культуральной среды, удаляемой в течение каждого 24-часового периода (или, в качестве альтернативы, дискретного периода времени, составляющего от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов, или дискретного периода времени, превышающего 24 часа) в течение всего периода культивирования или его части, и объем замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей жидкой культуральной среды), добавляемой в течение такого периода, можно поддерживать примерно одинаковыми. Как известно из уровня техники, скорость, с которой определенный объем жидкой культуральной среды удаляется (объем/единица времени), и скорость, с которой определенный объем замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей второй жидкой культуральной среды) добавляется (объем/единица времени), можно варьировать. Скорость, с которой определенный объем жидкой культуральной среды удаляется (объем/единица времени), и скорость, с которой определенный объем замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей жидкой культуральной среды) добавляется (объем/единица времени), могут быть приблизительно одинаковыми или могут отличаться.

В качестве альтернативы, удаляемый и добавляемый объемы можно изменять (например, постепенно повышать) в течение каждого 24-часового периода (или, в качестве альтернативы, дискретного периода времени от приблизительно 1 часа до приблизительно 24 часов или дискретного периода времени, превышающего 24 часа) во время периода культивирования. Например, объем жидкой культуральной среды, удаляемой в течение каждого 24-часового периода (или, в качестве альтернативы, дискретного периода времени, составляющего от приблизительно 1 часа до более 24 часов, или дискретного периода времени, превышающего 24 часа) в течение периода культивирования, или объем замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей жидкой культуральной среды), добавляемой за такой же период, можно повышать (например, постепенно или путем ступенчатых приращений) в течение периода культивирования от некоторого объема, который составляет от 0,5% до приблизительно 20% от объема биореактора или объема жидкой культуральной среды, присутствующей в начале культивирования (например, объема второй культуральной среды), до приблизительно 25% - приблизительно 300% от объема биореактора или объема жидкой культуральной среды, присутствующей в начале культивирования (например, объема второй жидкой культуральной среды).

Квалифицированные специалисты-практики будут понимать, что удаляемая жидкая культуральная среда и добавляемая замещающая жидкая культуральная среда (например, добавляемая свежая жидкая культуральная среда) могут представлять собой один и тот же тип среды (например, бессывороточная среда или бессывороточная среда с определенным химическим составом, не содержащая белка). В других случаях удаляемая жидкая культуральная среда и добавляемая замещающая жидкая культуральная среда (например, добавляемая свежая жидкая культуральная среда) могут отличаться.

Определенный объем жидкой культуральной среды можно удалять, например, с применением механической системы и/или путем пропускания или гравитационного течения определенного объема через стерильную мембрану с отсечением по молекулярной массе, что исключает клетки млекопитающих, находящиеся в данном объеме.

Определенный объем замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей второй жидкой культуральной среды) можно добавлять в биореактор в автоматическом режиме, например, с помощью перфузионного насоса. В некоторых случаях удаление определенного объема жидкой культуральной среды (например, некоторого объема второй жидкой культуральной среды, которая практически не содержит клеток млекопитающих) и добавление определенного объема замещающей жидкой культуральной среды (например, свежей жидкой культуральной среды) не происходит в пределах по меньшей мере 1 часа (например, в пределах 2 часов, в пределах 3 часов, в пределах 4 часов, в пределах 5 часов, в пределах 6 часов, в пределах 7 часов, в пределах 8 часов, в пределах 9 часов, в пределах 10 часов, в пределах 12 часов, в пределах 14 часов, в пределах 16 часов, в пределах 18 часов, в пределах 24 часов, в пределах 36 часов, в пределах 48 часов, в пределах 72 часов, в пределах 96 часов или после 96 часов) от засева перфузионного биореактора клеткой млекопитающего.

Как будет понятно специалисту в данной области, продолжительность перфузионного культивирования второй культуры клеток для достижения целевой плотности клеток от приблизительно 5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 140×10⁶ клеток/мл (или любой из других плотностей клеток или любого из диапазонов плотностей клеток, описанных в данном документе) будет зависеть от скорости роста рекомбинантных клеток млекопитающих и исходной плотности клеток второй культуры клеток. Например, вторую культуру можно подвергать перфузионному культивированию в течение периода, составляющего от приблизительно 1 дня до приблизительно 9 дней (например, любого из иллюстративных диапазонов периодов времени, перечисленных для периодического культивирования выше). Другие иллюстративные параметры перфузионного культивирования, которые можно применять в способах по настоящему изобретению, описаны в данном документе.

Получение культуры клеток-продуцентов

Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, дополнительно включают стадию (e) помещения некоторого объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶клеток/мл (например, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от 0,50×10⁶клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,0×10⁶клеток/мл, от приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 0,75×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 1,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 3,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 5,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 7,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл, от приблизительно 8,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл или от приблизительно 9,0×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл). В некоторых вариантах осуществления исходная плотность клеток в культуре клеток-продуцентов составляет по меньшей мере приблизительно 8% (например, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 12%, по меньшей мере приблизительно 14%, по меньшей мере приблизительно 16%, по меньшей мере приблизительно 18%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 22%, по меньшей мере приблизительно 24%, по меньшей мере приблизительно 26%, по меньшей мере приблизительно 28%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 32%, по меньшей мере приблизительно 34%, по меньшей мере приблизительно 36%, по меньшей мере приблизительно 38%, по меньшей мере приблизительно 40% или по меньшей мере приблизительно 50%) от плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе. Например, исходная плотность клеток в культуре клеток-продуцентов может составлять от приблизительно 4,0% до приблизительно 30% (например, от приблизительно 4,0% до приблизительно 28%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 26%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 24%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 22%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 20%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 18%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 16%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 14%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 12%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 10%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 8,0%, от приблизительно 4,0% до приблизительно 6,0%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 30%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 28%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 26%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 24%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 22%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 20%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 18%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 16%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 14%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 12%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 10%, от приблизительно 5,0% до приблизительно 8,0%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 10% до приблизительно 28%, от приблизительно 10% до приблизительно 26%, от приблизительно 10% до приблизительно 24%, от приблизительно 10% до приблизительно 22%, от приблизительно 10% до приблизительно 20%, от приблизительно 10% до приблизительно 18%, от приблизительно 10% до приблизительно 16%, от приблизительно 10% до приблизительно 14%, от приблизительно 10% до приблизительно 12%, от приблизительно 15% до приблизительно 30%, от приблизительно 15% до приблизительно 28%, от приблизительно 15% до приблизительно 26%, от приблизительно 15% до приблизительно 24%, от приблизительно 15% до приблизительно 22%, от приблизительно 15% до приблизительно 20%, от приблизительно 15% до приблизительно 18%, от приблизительно 20% до приблизительно 30%, от приблизительно 20% до приблизительно 28%, от приблизительно 20% до приблизительно 26%, от приблизительно 20% до приблизительно 24%, от приблизительно 20% до приблизительно 22%, от приблизительно 25% до приблизительно 30% или от приблизительно 25% до приблизительно 28%) от плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе. Как будет понятно специалисту в данной области, соответствующий объем второй культуры клеток для помещения в третью культуральную среду, чтобы достичь исходную плотность клеток в диапазоне от приблизительно 0,25×10⁶ клеток/мл до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл для культуры клеток-продуцентов, можно определить исходя из плотности клеток второй культуры клеток и объема третьей культуральной среды в производственном биореакторе. Например, объем второй культуры клеток, помещенный в третью среду для культивирования клеток, может составлять, например, от 2,0 л до 800 л (например, любой из иллюстративных диапазонов объемов второй культуры клеток, описанных в данном документе).

Третья культура клеток может иметь объем, например, от приблизительно 50 л до приблизительно 20000 л (например, от приблизительно 50 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 200 л, от приблизительно 50 л до приблизительно 100 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 750 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 2500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 17500 л или от приблизительно 17500 л до приблизительно 20000 л).

Производственный биореактор, применяемый в данных способах, может иметь внутренний объем, например, от 100 л до приблизительно 25000 л (например, от приблизительно 100 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 100 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 500 л, от приблизительно 200 л до приблизительно 250 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 1000 л, от приблизительно 500 л до приблизительно 750 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 5000 л, от приблизительно 1000 л до приблизительно 2500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 5000 л до приблизительно 7500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 7500 л до приблизительно 10000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 10000 л до приблизительно 12500 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 12500 л до приблизительно 15000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 15,000 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 15000 л до приблизительно 17500 л, от приблизительно 17500 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 17500 л до приблизительно 22500 л, от приблизительно 17500 л до приблизительно 20000 л, от приблизительно 20000 л до приблизительно 25000 л, от приблизительно 20000 л до приблизительно 22500 л или от приблизительно 22500 л до приблизительно 25000 л).

Производственный биореактор может представлять собой любой подходящий биореактор (например, перфузионный биореактор крупного масштаба, биореактор для периодического культивирования или биореактор для периодического культивирования с подпиткой), известный из уровня техники. Например, подходящие производственные биореакторы доступны от Xcellerex, Thermo Fisher и GE Healthcare. Например, производственные биореакторы крупного масштаба (например, перфузионные биореакторы, биореакторы для периодического культивирования или периодического культивирования с подпиткой) производят в Holloway American (Спрингфилд, Миссури) и собирают на подставке для биореактора в Cotter Brothers Corporation (Дэнверс, Массачусетс).

Клетки млекопитающих

Рекомбинантная клетка млекопитающего может представлять собой клетку человека, мыши, хомячка или обезьяны. Например, рекомбинантная клетка млекопитающего может происходить из клеточной линии, например, клеток яичника китайского хомячка (CHO) (например, клеток CHO DG44, клеток CHO-K1s, клональных клеток C02.31, клональных клеток A14.13, клональных клеток C02.57 и клональных клеток F05.43), Sp2.0, клеток миеломы (например, NS/0), B-клеток, клеток гибридомы, T-клеток, клеток эмбриональной почки человека (HEK) (например, HEK 293E и HEK 293F), клеток почечного эпителия африканской зеленой мартышки (Vero) или клеток почечного эпителия собаки (кокер-спаниеля) Madin-Darby (MDCK).

Нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, можно вводить в клетку млекопитающего с получением рекомбинантной клетки млекопитающего с применением целого ряда способов, известных в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. Неограничивающие примеры включают трансфекцию (например, липофекцию), трансдукцию (например, инфекцию лентивирусом, аденовирусом или ретровирусом) и электропорацию. В некоторых случаях нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбинантный белок, не интегрирована стабильно в хромосому рекомбинантной клетки млекопитающего (транзиентная трансфекция), в то время как в других рекомбинантных клетках млекопитающих данная нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому. В качестве альтернативы или дополнения, нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок, может находиться в плазмиде и/или в искусственной хромосоме млекопитающего (например, человеческой искусственной хромосоме). В качестве альтернативы или дополнения, нуклеиновую кислоту можно вводить в клетку млекопитающего с помощью вирусного вектора (например, лентивирусного, ретровирусного или аденовирусного вектора). Нуклеиновая кислота может быть функционально связана с промоторной последовательностью (например, сильным промотором, таким как промотор β-актина и промотор CMV, или индуцируемым промотором). Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, может при необходимости также содержать селектируемый маркер (например ген, который придает клетке млекопитающего устойчивость к гигромицину, пуромицину или неомицину).

Жидкая культуральная среда

Жидкие культуральные среды (культуральные среды) известны из уровня техники. Жидкие культуральные среды могут быть дополнены сывороткой млекопитающего (например, эмбриональной телячьей сывороткой и бычьей сывороткой) и/или гормоном роста или фактором роста (например, инсулином, трансферрином и эпидермальным фактором роста). Любая из жидких культуральных сред, описанных в данном документе, может быть выбрана из группы, состоящей из жидкой культуральной среды, не содержащей компонентов животного происхождения, жидкой культуральной среды, не содержащей сыворотку, жидкой культуральной среды, содержащей сыворотку, жидкой культуральной среды с определенным химическим составом и жидкой культуральной среды, не содержащей белков. Неограничивающие примеры жидких культуральных сред с определенным химическим составом, жидких культуральных сред, не содержащих компонентов животного происхождения, жидких культуральных сред, не содержащих сыворотку, и жидких культуральных сред, содержащих сыворотку, являются коммерчески доступными.

Жидкая культуральная среда обычно содержит источник энергии (например углевод, такой как глюкоза), незаменимые аминокислоты (например, набор из двадцати основных аминокислот плюс цистеин), витамины и/или другие органические соединения, требуемые в низких концентрациях, свободные жирные кислоты и/или микроэлементы. Жидкие культуральные среды (например, первую и/или вторую жидкую культуральную среду) можно при необходимости дополнить, например, гормоном или фактором роста млекопитающих (например, инсулином, трансферрином или эпидермальным фактором роста), солями и буферами (например, солями кальция, магния и фосфатами), нуклеозидами и основаниями (например, аденозином, тимидином и гипоксантином), белком и тканевыми гидролизатами и/или любой комбинацией таких добавок.

Из уровня техники известны множество различных жидких культуральных сред, которые можно использовать для культивирования клеток (например, клеток млекопитающих) в любой стадии любого из способов, описанных в данном документе. Компоненты среды, которые также можно использовать в процессах по настоящему изобретению, включают без ограничения гидролизаты с известным химическим составом (CD), например, CD-пептон, CD-полипептиды (две или более аминокислоты) и CD-факторы роста. Дополнительные примеры жидкой культуральной среды для культуры тканей и компонентов среды известны из уровня техники.

Жидкую культуральную среду, полученную из культуры рекомбинантных клеток млекопитающих, можно фильтровать или очищать с получением жидкой культуральной среды, которая практически не содержит клеток и/или вирусов. Способы фильтрации или очистки жидкой культуральной среды с целью удаления клеток известны из уровня техники (например, 0,2 мкм фильтрация, фильтрация с применением системы переменного тангенциального потока (ATF^TM), система фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) или любая из систем, описанных в предварительной заявке на патент США № 61/878502). Рекомбинантные клетки также можно удалять из жидкой культуральной среды с применением центрифугирования и удаления супернатанта, который представляет собой жидкую культуральную среду, которая практически не содержит клеток, или путем обеспечения возможности оседания клеток на гравитационное дно контейнера (например, сосуда), содержащего жидкую культуральную среду, и удаления жидкой культуральной среды (жидкой культуральной среды, которая практически не содержит клеток), которая расположена на некотором расстоянии от рекомбинантных клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько (например, две, три или все) из первой культуральной среды, второй культуральной среды, третьей культуральной среды и четвертой культуральной среды идентичны.

Жидкая культуральная среда, применяемая на любой из стадий в любом из способов, описанных в данном документе, может представлять собой любой из типов жидкой культуральной среды, описанных в данном документе или известных из уровня техники. В любом из иллюстративных способов выделения рекомбинантного белка, описанных в данном документе, жидкую культуральную среду, полученную из культуры клеток-продуцентов, можно разводить путем добавления второй текучей среды (например, буфера) перед загрузкой в первую MCCS (например, первую PCCS).

Жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный белок (например, рекомбинантный терапевтический белок), которая практически не содержит клеток, можно хранить (например, при температуре ниже приблизительно 15°C (например, ниже приблизительно 10°C, ниже приблизительно 4°C, ниже приблизительно 0°C, ниже приблизительно -20°C, ниже приблизительно -50°C, ниже приблизительно -70C° или ниже приблизительно -80°C) в течение по меньшей мере 1 дня (например, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 15 дней, по меньшей мере приблизительно 20 дней или по меньшей мере приблизительно 30 дней) перед выделением рекомбинантного белка (например, перед загрузкой жидкой культуральной среды в первую MCCS (например, первую PCCS)). В качестве альтернативы, в некоторых примерах жидкую культуральную среду, содержащую рекомбинантный белок, которая практически не содержит клеток, загружают в систему, применяемую для выделения рекомбинантного белка (например, загружают в первую MCCS (например, первую PCCS) непосредственно из производственного биореактора (например, загружают в первую MCCS (например, первую PCCS) непосредственно из производственного биореактора после стадии фильтрования или очистки).

Рекомбинантные белки

Рекомбинантный белок может представлять собой рекомбинантный терапевтический белок. Неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые можно получить с помощью способов, представленных в данном документе, включают иммуноглобулины (в том числе легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, антитела или фрагменты антител (например, любой из фрагментов антител, описанных в данном документе), ферменты (например, галактозидаза (например, альфа-галактозидаза), Myozyme® или Cerezyme®), белки (например, эритропоэтин человека, фактор некроза опухоли (TNF) или интерферон альфа или бета), или иммуногенные или антигенные белки или фрагменты белков (например, белки для применения в вакцине). Рекомбинантный терапевтический белок может представлять собой сконструированный антиген-связывающий полипептид, который содержит каркас по меньшей мере одного многофункционального рекомбинантного белка (см., например, рекомбинантные антиген-связывающие белки, описанные в Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; и публикацию заявки на патент США № 2012/0164066 (включенную в данный документ посредством ссылки во всей полноте)). Неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые представляют собой антитела, включают: панитумумаб, омализумаб, абаговомаб, абциксимаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб, алацизумаб, алемтузумаб, алирокумаб, альтумомаб, аматуксимаб, аматуксимаб, анатумомаб, анрукинзумаб, аполизумаб, арцитумомаб, атинумаб, тоцилизумаб, базилизимаб, бектумомаб, белимумаб, бевацизумаб, безилезомаб, безлотоксумаб, бициромаб, канакинумаб, цертолизумаб, цетукцимаб, циксутумумаб, даклизумаб, деносумаб, денсумаб, экулизумаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, эпратузумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, фигитумумаб, голимумаб, ибритутомаб тиуксетан, иговомаб, имгатузумаб, инфликсимаб, инолимомаб, инотузумаб, лабетузумаб, лебрикизумаб, моксетумомаб, натализумаб, обинутузумаб, ореговомаб, паливизумаб, панитумумаб, пертузумаб, ранибизумаб, ритуксимаб, тоцилизумаб, тозитумомаб, тралокинумаб, тукотузумаб, трастузумаб, велтузумаб, залутумумаб и затуксимаб. Дополнительные примеры рекомбинантных терапевтических антител, которые можно получить с помощью способов, описанных в данном документе, известны из уровня техники. Дополнительные неограничивающие примеры рекомбинантных терапевтических белков, которые можно получать с помощью способов по настоящему изобретению, включают: алглюкозидазу альфа, ларонидазу, абатацепт, галсульфазу, лютропин альфа, антигемофилический фактор, агалзидазу бета, интерферон бета-1a, дарбэпоэтин альфа, тенектеплазу, этанерцепт, фактор свертывания крови IX, фолликулостимулирующий гормон, интерферон бета-1a, имиглюцеразу, дорназу альфа, эпоэтин альфа, инсулин или аналоги инсулина, мекасермин, фактор VIII, фактор VIIa, антитромбин III, белок C, человеческий альбумин, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-11, ларонидазу, идурсульфазу, галсульфазу, ингибитор α-1-протеиназы, лактазу, аденозиндезаминазу, тканевой активатор плазминогена, тиреотропин альфа (например, Thyrogen®) и альтеплазу. Дополнительные примеры рекомбинантных белков, которые можно получать с помощью способов по настоящему изобретению, включают кислую α-глюкозидазу, алглюкозидазу альфа (например, Myozyme® и Lumizyme®), α-L-идуронидазу (например, Aldurazyme®), идуронат-сульфатазу, гепаран-N-сульфатазу, галактоза-6-сульфатазу, кислую β-галактозидазу, β-глюкоронидазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазу, α-N-ацетилгалактозаминидазу, кислую липазу, лизосомальную кислую церамидазу, кислую сфингомиелиназу, β-глюкозидазу (например, Cerezyme® и Ceredase®), галактозилцерамидазу, α-галактозидазу-A (например, Fabrazyme®), кислую β-галактозидазу, β-галактозидазу, нейраминидазу, гексозаминидазу A и гексозаминидазу B.

Секретированный растворимый рекомбинантный белок можно извлекать из жидкой культуральной среды путем удаления или иного физического отделения жидкой культуральной среды от клеток (например, клеток млекопитающих). Множество различных способов удаления жидкой культуральной среды от клеток (например, клеток млекопитающих) известны из уровня техники, включая, например, центрифугирование, фильтрацию, перенесение с помощью пипетки и/или аспирацию. Затем секретированный рекомбинантный терапевтический белок можно извлекать и выделять из жидкой культуральной среды с применением различных биохимических методик, в том числе различные типы хроматографии (например, афинную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, катионообменую хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или анионообменную хроматографию) и/или фильтрацию (например, фильтрацию с отсечением по молекулярной массе).

Параметры культивирования

Любую из стадий периодического или перфузионного культивирования, описанных в данном документе, можно осуществлять при температуре от приблизительно 31°C до приблизительно 40°C. Квалифицированным специалистам-практикам будет понятно, что в ходе стадии культивирования температуру можно изменять в определенный момент(ы) времени, например, каждый час или каждые сутки. Например, температуру можно изменять или смещать (например, повышать или понижать) в пределах приблизительно одного дня, двух дней, трех дней, четырех дней, пяти дней, шести дней, семи дней, восьми дней, девяти дней, десяти дней, одиннадцати дней, двенадцати дней, четырнадцати дней, пятнадцати дней, шестнадцати дней, семнадцати дней, восемнадцати дней, девятнадцати дней или приблизительно двадцати дней или более после исходного посева в сосуд (например, биореактор) клеток (например, рекомбинантных клеток млекопитающих). Например, температуру можно смещать в сторону повышения (например, изменение на значение, не превышающее или равное приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или на значение, не превышающее или равное приблизительно 20°C). Например, температуру можно смещать в сторону понижения (например, изменение на значение, не превышающее или равное приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или на значение, не превышающее или равное приблизительно 20°C).

Стадии перфузионного и периодического культивирования, описанные в данном документе, могут дополнительно включать воздействие на жидкую культуральную среду в сосуде, перфузионном биореакторе или производственном биореакторе атмосферой, содержащей не более чем или приблизительно 15% CO₂ (например, не более чем или приблизительно 14% CO₂, 12% CO₂, 10% CO₂, 8% CO₂, 6% CO₂, 5% CO₂, 4% CO₂, 3% CO₂, 2% CO₂ или не более чем или приблизительно 1% CO₂). В сосуде, перфузионном биореакторе или производственном биореакторе можно инкубировать культуру клеток в регулируемой увлажненной атмосфере (например, при влажности более 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%, или влажности 100%). Перфузионный и производственный биореакторы также могут быть оснащены механическим устройством, которое обеспечивает возможность удаления некоторого объема жидкой культуральной среды из биореактора, и, необязательно, фильтром внутри механического устройства, который удаляет клетки из жидкой культуральной среды в ходе процесса выведения жидкой культуральной среды из биореактора (например, системой ATF).

Внутренняя поверхность любого из сосудов, перфузионных биореакторов или производственных биореакторов, описанных в данном документе, может иметь по меньшей мере одно покрытие (например, по меньшей мере одно покрытие из желатина, коллагена, поли-L-орнитина, полистирола и ламинина) и, как известно из уровня техники, одно или несколько отверстий для барботирования O₂, CO₂ и N₂ в жидкую культуральную среду, а также механизм для перемешивания жидкой культуральной среды и один или несколько датчиков (например датчиков растворенного O₂ и растворенного CO₂).

Способы получения рекомбинантного белка

Также предусмотрены способы получения рекомбинантного белка, которые включают любой из иллюстративных процессов культивирования в системе посевных ферментеров, описанных выше, и дополнительные стадии (f) перфузионного культивирования культуры клеток-продуцентов в условиях, которые позволяют рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок, и сбора рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов.

Другие способы получения рекомбинатного белка включают любой из иллюстративных процессов культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренных в данном документе, и дополнительные стадии (f) периодического культивирования или периодического культивирования с подпиткой культуры клеток-продуцентов в условиях, которые позволяют рекомбинантным клеткам секретировать рекомбинантный белок, и сбора рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов.

Перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов можно осуществлять с применением любого из иллюстративных способов перфузионного культивирования, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Например, период времени от получения культуры клеток-продуцентов (после помещения второй культуры клеток в третью культуральную среду) до времени, когда культура клеток-продуцентов достигает плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе составляет от приблизительно 1,5 дня до приблизительно 5,0 дня (например, от приблизительно 1,5 дня до приблизительно 4,0 дня, от приблизительно 1,5 дня до приблизительно 3,5 дня, от приблизительно 1,5 дня до приблизительно 3,0 дня, от приблизительно 1,5 дня до приблизительно 2,5 дня, от приблизительно 1,5 дня до 2,0 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 5,0 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 4,5 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 4,0 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 3,5 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 3,0 дня, от приблизительно 2,0 дня до приблизительно 2,5 дня, от приблизительно 2,5 дня до приблизительно 5 дней, от приблизительно 2,5 дня до приблизительно 4,5 дня, от приблизительно 2,5 дня до приблизительно 4,0 дня, от приблизительно 2,5 дня до приблизительно 3,5 дня, от приблизительно 2,5 дня до приблизительно 3,0 дня, от приблизительно 3,0 дня до приблизительно 5,0 дня, от приблизительно 3,0 дня до приблизительно 4,5 дня, от приблизительно 3,0 дня до приблизительно 4,0 дня, от приблизительно 3,0 дня до приблизительно 3,5 дня, от приблизительно 3,5 дня до приблизительно 5,0 дня, от приблизительно 3,5 дня до приблизительно 4,5 дня, от приблизительно 3,5 дня до приблизительно 4,0 дня, от приблизительно 4,0 дня до приблизительно 5,0 дня, от приблизительно 4,0 дня до приблизительно 4,5 дня или от приблизительно 4,5 дня до приблизительно 5,0 дня). Перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов можно продолжать, например, в течение периода, составляющего, например, от 5,0 дня до 200 дней (например, от 5,0 дня до 190 дней, от 5,0 дня до 180 дней, от 5,0 дня до 170 дней, от 5,0 дня до 160 дней, от 5,0 дня до 150 дней, от 5,0 дня до 140 дней, от 5,0 дня до 130 дней, от 5,0 дня до 120 дней, от 5,0 дня до 110 дней, от 5,0 дня до 110 дней, от 5,0 дня до 100 дней, от 5,0 дня до 90 дней, от 5,0 дня до 80 дней, от 5,0 дня до 70 дней, от 5,0 дня до 60 дня, от 5,0 дня до 50 дней, от 5,0 дня до 40 дней, от 5,0 дня до 30 дней, от 5,0 дня до 20 дней, от 5,0 дня до 10 дней, от 10 дней до 200 дней, от 10 дней до 190 дней, от 10 дней до 180 дней, от 10 дней до 170 дней, от 10 дней до 160 дней, от 10 дней до 150 дней, от 10 дней до 140 дней, от 10 дней до 130 дней, от 10 дней до 120 дней, от 10 дней до 110 дней, от 10 дней до 100 дней, от 10 дней до 90 дней, от 10 дней до 80 дней, от 10 дней до 70 дней, от 10 дней до 60 дней, от 10 дней до 50 дней, от 10 дней до 40 дней, от 10 дней до 30 дней, от 10 дней до 20 дней, от 20 дней до 200 дней, от 20 дней до 190 дней, от 20 дней до 180 дней, от 20 дней до 170 дней, от 20 дней до 160 дней, от 20 дней до 150 дней, от 20 дней до 140 дней, от 20 дней до 130 дней, от 20 дней до 120 дней, от 20 дней до 110 дней, от 20 дней до 100 дней, от 20 дней до 90 дней, от 20 дней до 80 дней, от 20 дней до 70 дней, от 20 дней до 60 дней, от 20 дней до 50 дней, от 20 дней до 40 дней, от 30 дней до 200 дней, от 30 дней до 190 дней, от 30 дней до 180 дней, от 30 дней до 170 дней, от 30 дней до 160 дней, от 30 дней до 150 дней, от 30 дней до 140 дней, от 30 дней до 130 дней, от 30 дней до 120 дней, от 30 дней до 110 дней, от 30 дней до 100 дней, от 30 дней до 90 дней, от 30 дней до 80 дней, от 30 дней до 70 дней, от 30 дней до 60 дней, от 30 дней до 50 дней, от 30 дней до 40 дней, от 40 дней до 200 дней, от 40 дней до 190 дней, от 40 дней до 180 дней, от 40 дней до 170 дней, от 40 дней до 160 дней, от 40 дней до 150 дней, от 40 дней до 140 дней, от 40 дней до 130 дней, от 40 дней до 120 дней, от 40 дней до 110 дней, от 40 дней до 100 дней, от 40 дней до 90 дней, от 40 дней до 80 дней, от 40 дней до 70 дней, от 40 дней до 60 дней, от 40 дней до 50 дней, от 50 дней до 200 дней, от 50 дней до 190 дней, от 50 дней до 180 дней, от 50 дней до 170 дней, от 50 дней до 160 дней, от 50 дней до 150 дней, от 50 дней до 140 дней, от 50 дней до 130 дней, от 50 дней до 120 дней, от 50 дней до 110 дней, от 50 дней до 100 дней, от 50 дней до 90 дней, от 50 дней до 80 дней, от 50 дней до 70 дней, от 50 дней до 60 дней, от 75 дней до 200 дней, от 75 дней до 175 дней, от 75 дней до 150 дней, от 50 дней до 125 дней, от 50 дней до 100 дней, от 50 дней до 75 дней, от 75 дней до 200 дней, от 75 дней до 175 дней, от 75 дней до 200 дней, от 75 дней до 175 дней, от 75 дней до 150 дней, от 75 дней до 125 дней, от 75 дней до 100 дней, от 100 дней до 200 дней, от 100 дней до 175 дней, от 100 дней до 150 дней, от 100 дней до 125 дней, от 125 дней до 200 дней, от 125 дней до 175 дней, от 125 дней до 150 дней, от 150 дней до 200 дней, от 150 дней до 175 дней или от 175 дней до 200 дней).

Культуральную среду можно удалять из производственного биореактора путем непрерывного или периодического удаления (например, с одинаковой или различной частотой в ходе перфузионного культивирования). Культуральную среду можно удалять вручную (например, путем перенесения с помощью пипетки) или с помощью насосной системы (например, системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF) или фильтрации текучей среды с тангенциальным потоком).

Выделение рекомбинантного белка

Способы получения рекомбинатного белка, описанные в данном документе, могут дополнительно включать стадию выделения рекомбинантного белка из культуральной среды, удаленной из производственного биореактора (в ходе перфузионного культивирования). Стадия выделения рекомбинантного белка из культуральной среды, удаленной из производственного биореактора, может включать выполнение одной или нескольких (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи) отдельных технологических операций, выбранных из группы, включающей: захват, очистку, доочистку, инактивацию вирусов, регуляцию концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и фильтрацию. Например, одну или несколько отдельных технологических операций для выделения рекомбинантного белка можно осуществлять путем пропускания текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, через одну или несколько (например, две, три, четыре или пять) систем для многоколоночной хроматографии (MCCS). Стадию выделения рекомбинантного белка из культуральной среды можно осуществлять с применением интегрированного и непрерывного процесса (например, иллюстративные процессы описаны в предварительной заявке на патент США № 61/775060, предварительной заявке на патент США № 61/856390, заявке на патент США с регистрационным № 14/195481, международной заявке на патент № PCT/US2014/019909 и предварительной заявке на патент США № 61/928906, полное содержание каждой из указанных заявок включено в данный документ посредством ссылки). Иллюстративные процессы могут включать получение жидкой культуральной среды, содержащей рекомбинантный белок (например, рекомбинантный терапевтический белок), которая практически не содержит клеток (например, жидкой культуральной среды, удаленной из производственного биореактора и профильтрованной через систему ATF). Некоторые процессы включают непрерывную подачу жидкой культуральной среды (например, жидкой культуральной среды, удаленной из производственного биореактора и профильтрованной через систему ATF) в систему для многоколоночной хроматографии (MCCS), которая включает по меньшей мере одну хроматографическую колонку, при этом данные процессы являются интегрированными и проходят в непрерывном режиме, начиная от жидкой культуральной среды до элюата из MCCS, который представляет собой выделенный рекомбинантный белок. Некоторые процессы включают непрерывную подачу жидкой культуральной среды (например, жидкой культуральной среды, удаленной из производственного биореактора и профильтрованной через систему ATF) в первую MCCS (MCCS1), захват рекомбинантного белка из жидкой культуральной среды с применением MCCS1, получение элюата из MCCS1, который содержит рекомбинантный белок, и непрерывную подачу элюата во вторую MCCS (MCCS2), и впоследствии элюирование рекомбинантного белка (из MCCS2) с получением тем самым выделенного рекомбинантного белка, при этом процессы являются интегрированными и проходят непрерывно, начиная от жидкой культуральной среды до выделенного рекомбинантного белка. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают стадию составления выделенного рекомбинантного белка в фармацевтическое средство.

Неограничивающие аспекты MCCS, которые можно применять в любом из данных процессов (MCCS, MCCS1 и/или MCCS2), описаны в предварительной заявке на патент США № 61/775060, предварительной заявке на патент США № 61/856390, заявке на патент США с регистрационным № 14/195481, международной заявке на патент № PCT/US2014/019909 и предварительной заявке на патент США № 61/928906 (каждая включена в данный документ посредством ссылки). Различные дополнительные аспекты этих иллюстративных процессов описаны ниже, и их можно применять без ограничения в любой комбинации в процессах, представленных в данном документе. Иллюстративные аспекты предусмотренных процессов описаны ниже; тем не менее, специалисту в данной области будет понятно, что дополнительные стадии могут быть добавлены в процессы, описанные в данном документе, и другие материалы можно применять для осуществления любой из стадий процессов, описанных в данном документе.

Иллюстративные процессы, описанные в данном документе, могут включать применение MCCS или двух или более (например, двух, трех, четырех, пяти или шести) систем для многоколоночной хроматографии (MCCS) (например, MCCS1 и MCCS2). MCCS может содержать две или более хроматографических колонок, две или более хроматографических мембран или комбинацию по меньшей мере одной хроматографической колонки и по меньшей мере одной хроматографической мембраны. В неограничивающих примерах MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в любом из процессов по данному документу) может содержать четыре хроматографические колонки, три хроматографические колонки и хроматографическую мембрану, три хроматографические колонки, две хроматографические колонки, две хроматографические мембраны и две хроматографические колонки и одну хроматографическую мембрану. Специалист в данной области без ограничений может представить себе дополнительные примеры комбинаций хроматографических колонок и/или хроматографических мембран для применения в MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в любом из процессов, описанных в данном документе). Отдельные хроматографические колонки и/или хроматографические мембраны, находящиеся в MCCS, могут быть идентичными (например, иметь одинаковую форму, объем, смолу, механизм захвата и отдельную технологическую операцию), или могут быть разными (например, иметь одну или несколько различных форм, объемов, смол, механизмов захвата и/или отдельных технологических операций). Отдельная хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), находящиеся в MCCS (например, MCCS, MCCS1, и/или MCCS2 в любом из процессов, описанных в данном документе), могут выполнять одинаковую отдельную технологическую операцию (например, отдельную технологическую операцию захвата, очистки или доочистки) или различные отдельные технологические операции (например, различные отдельные технологические операции, например, выбранные из группы, включающей захват, очистку, доочистку, инактивацию вирусов, регуляцию концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и фильтрацию). Например, в примерах процессов, описанных в данном документе, по меньшей мере одна хроматографическая колонка и/или хроматографическая мембрана в MCCS или MCCS1 осуществляет отдельную технологическую операцию захвата рекомбинантного белка.

Одна или несколько хроматографических колонок в MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2), применяемых в любом из процессов, описанных в данном документе, могут иметь практически одинаковый объем смолы или могут иметь различные объемы смолы. Один или несколько (например, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три или двадцать четыре) различных типов буферов можно использовать в ходе применения MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в любом из процессов, описанных в данном документе. Как известно из уровня техники, один или несколько типов буферов, применяемых в MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в процессах, описанных в данном документе, будут зависеть от смолы, находящейся в хроматографической колонке(ах) и/или хроматографической мембране(ах) MCCS, MCCS1 и/или MCCS2, биофизических свойств рекомбинантного белка и отдельной технологической операции (например, любой из иллюстративных отдельных технологических операций, описанных в данном документе), осуществляемых в конкретной хроматографической колонке(ах) и/или хроматографических мембранах MCCS, MCCS1 и/или MCCS2. Объем и тип буфера, используемого в ходе применения MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в любом из процессов, описанных в данном документе, также может определить специалист в данной области (например, это обсуждается более подробно ниже). Например, объем и тип(ы) буфера, используемого в ходе применения MCCS, MCCS1, и/или MCCS2 в любом из процессов, описанных в данном документе, могут быть выбраны с целью оптимизации одного или нескольких из следующих свойств выделенного рекомбинантного белка: общего выхода рекомбинантного белка, активности рекомбинантного белка, уровня чистоты рекомбинантного белка, и удаления биологических загрязнителей из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок (например, жидкой культуральной среды) (например, отсутствие активных вирусов, микобактерий, дрожжей, бактерий или клеток млекопитающих).

MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 могут представлять собой систему для периодической противоточной хроматографии (PCCS). PCCS может, например, содержать две или более хроматографических колонок (например, три колонки или четыре колонки), которые можно переключать для обеспечения непрерывного элюирования рекомбинантного белка из двух или более хроматографических колонок. PCCS может содержать две или более хроматографических колонок, две или более хроматографических мембран или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану. Технологическая операция в колонке (цикл) обычно состоит из стадий загрузки, промывки, элюирования и регенерации. В PCCS несколько колонок применяют для проведения тех же стадий по отдельности и непрерывно циклическим образом. Поскольку колонки функционируют последовательно, фильтрат и промывная вода из одной колонки захватывается другой колонкой. Это уникальное свойство PCCS обеспечивает возможность загрузки смолы до значений, близких к ее статической связывающей емкости, а не значений динамической связывающей емкости, типичных в ходе хроматографии в периодическом режиме. В результате непрерывного проведения циклов и элюирования текучая среда, входящая в PCCS, непрерывно обрабатывается, и непрерывно образуется элюат, содержащий рекомбинантный белок.

Стратегию переключения колонок применяют для продвижения от одной стадии к другой в цикле PCCS. Примеры переключения колонок, которые можно применять в PCCS, описаны в предварительной заявке на патент США № 61/775060, предварительной заявке на патент США № 61/856390, заявке на патент США с регистрационным № 14/195481, международной заявке на патент № PCT/US2014/019909 и предварительной заявке на патент США № 61/928906. В PCCS время удержания (RT) рекомбинантного белка в каждой хроматографической колонке и/или на хроматографической мембране, находящейся в PCCS, можно снижать без увеличения размера колонки/мембраны, поскольку белок, прошедший через первую колонку/мембрану может захватываться на другой колонке/мембране в PCCS. Системы для непрерывного процесса можно разрабатывать для обработки жидкой культуральной среды при любой скорости перфузии (D) путем изменения объема колонки/мембраны (V) и RT с применением уравнения: V=D * RT.

Одна или несколько отдельных технологических операций, которые можно осуществлять с помощью MCCS или MCC1 и/или MCCS2, применяемых в описанных в данном документе процессах, включают, например, захват рекомбинантного белка, инактивацию вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок, очистку рекомбинантного белка, доочистку рекомбинантного белка, выдерживание текучей среды, содержащей рекомбинантный белок (например, с применением любой иллюстративной предохранительной емкости(ей), описанной в данном документе), фильтрацию или удаление твердых частиц и/или клеток из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и регуляцию концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок. В некоторых вариантах осуществления MCCS или MCCS1 содержит по меньшей мере одну хроматографическую колонку и/или хроматографическую мембрану, которые осуществляют отдельную технологическую операцию захвата рекомбинантного белка. Отдельную технологическую операцию захвата можно осуществлять с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки и/или хроматографической смолы, например, в которой используется механизм захвата. Неограничивающие примеры механизмов захвата включают механизм захвата путем связывания с белком А, механизм захвата путем связывания с антителом или фрагментом антитела, механизм захвата путем связывания с субстратом, механизм захвата путем связывания с аптамерами, механизм захвата путем связывания с метками (например, механизм захвата на основе метки поли-His) и механизм захвата путем связывания с кофакторами. Захват также можно осуществлять с применением смолы, которую можно использовать для осуществления катион- или анионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматографии гидрофобного взаимодействия. Неограничивающие смолы, которые можно применять для захвата рекомбинантного белка, описаны в данном документе. Дополнительные примеры смол, которые можно применять для захвата рекомбинантного белка, известны из уровня техники.

Отдельную технологическую операцию инактивации вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок, можно осуществлять с применением MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 (например, которые содержат, например, хроматографическую колонку, хроматографическую мембрану или емкость для выдерживания, в которой можно инкубировать текучую среду, содержащую рекомбинантный белок, при pH от приблизительно 3,0 до 5,0 (например, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,25, от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,0, от приблизительно 3,5 до приблизительно 3,8 или приблизительно 3,75) в течение периода, составляющего по меньшей мере 30 минут (например, периода, составляющего от приблизительно 30 минут до 1,5 часа, периода, составляющего от приблизительно 30 минут до 1,25 часа, периода, составляющего от приблизительно 0,75 часа до 1,25 часа или периода, составляющего приблизительно 1 час)).

Отдельную технологическую операцию очистки рекомбинантного белка можно осуществлять с применением одной или нескольких MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2), которые содержат, например, хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, которые содержат смолу, например, в которой используется система захвата. Неограничивающие примеры механизмов захвата включают механизм захвата путем связывания с белком А, механизм захвата путем связывания с антителом или фрагментом антитела, механизм захвата путем связывания с субстратом, механизм захвата путем связывания с аптамерами, механизм захвата путем связывания с метками (например, механизм захвата на основе метки поли-His) и механизм захвата путем связывания с кофакторами. Очистку также можно осуществлять с применением смолы, которую можно использовать для осуществления катион- или анионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматографии гидрофобного взаимодействия. Неограничивающие смолы, которые можно применять для очистки рекомбинантного белка, описаны в данном документе. Дополнительные примеры смол, которые можно применять для очистки рекомбинантного белка, известны из уровня техники.

Отдельную технологическую операцию доочистки рекомбинантного белка можно осуществлять с применением одной или нескольких MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS), которые содержат, например, хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, которые включают смолу, например, которую можно применять для осуществления катионообменной, анионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматографии гидрофобного взаимодействия. Неограничивающие смолы, которые можно применять для доочистки рекомбинантного белка, описаны в данном документе. Дополнительные примеры смол, которые можно применять для доочистки рекомбинантного белка, известны из уровня техники.

Отдельную технологическую операцию фильтрации текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, можно осуществлять с применением MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2), которая включает, например, фильтр, или хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, которые содержат смолу в качестве молекулярного сита. Как известно из уровня техники, в данной области доступны множество фильтров для удаления субмикронных частиц (например, фильтр с размером пор менее 1 мкм, менее 0,5 мкм, менее 0,3 мкм, приблизительно 0,2 мкм, менее 0,2 мкм, менее 100 нм, менее 80 нм, менее 60 нм, менее 40 нм, менее 20 нм или менее 10 нм), которые способны удалять любой осажденный материал и/или клетки (например, осажденный несвернутый белок, осажденные нежелательные белки клетки-хозяина, осажденные липиды, бактерии, дрожжевые клетки, клетки грибов, микобактерии и/или клетки млекопитающих). Известно, что фильтры с размером пор приблизительно 0,2 мкм или менее 0,2 мкм эффективно удаляют бактерии из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок. Как известно из уровня техники, хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, содержащую смолу в качестве молекулярного сита, также можно применять в MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2) для осуществления отдельной технологической операции фильтрации текучей среды, содержащей рекомбинантный белок.

Отдельные технологические операции регуляции концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, можно осуществлять с применением MCCS (например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2), которая содержит и в которой используется резервуар для регуляции буфера (например, встроенный резервуар для регуляции буфера), который обеспечивает добавление нового буферного раствора в текучую среду, содержащую рекомбинантный белок (например, между колонками в пределах MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 или после последней колонки в предпоследней MCCS (например, MCCS1) и перед тем, как текучую среду, содержащую рекомбинантный белок, загружают в первую колонку следующей MCCS (например, MCCS2)).

В иллюстративных процессах, описанных в данном документе, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 могут осуществлять две или более отдельных технологических операций. Например, в каждой из MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 могут осуществляться по меньшей мере следующие отдельные технологические операции: захват рекомбинантного белка и инактивация вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок; захват рекомбинантного белка, инактивация вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок, и регуляция концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей рекомбинантный белок; очистка рекомбинантного белка и доочистка рекомбинантного белка; очистка рекомбинантного белка, доочистка рекомбинантного белка и фильтрация текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, или удаление осадков и/или твердых частиц из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок; и очистка рекомбинантного белка, доочистка рекомбинантного белка, фильтрация текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, или удаление осадков и/или твердых частиц из текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и регуляция концентрации ионов и/или pH жидкости, содержащей рекомбинантный белок.

В иллюстративных процессах, описанных в данном документе, захват рекомбинантного белка из жидкой культуральной среды осуществляют с применением MCCS или MCCS1. Как может быть понятно из уровня техники, для обеспечения захвата рекомбинантного белка по меньшей мере одна хроматографическая колонка или по меньшей мере одна хроматографическая мембрана в MCCS или MCCS1 должна содержать смолу, в которой используется механизм захвата (например, любой из иллюстративных механизмов захвата, описанных в данном документе), или содержать смолу, способную осуществлять катионообменную хроматографию, анионообменную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах или хроматографию гидрофобного взаимодействия. Например, если рекомбинантный белок представляет собой антитело или фрагмент антитела, система захвата может представлять собой механизм захвата путем связывания с белком А или механизм захвата путем связывания с антигеном (при этом захватывающий антиген специфически распознается рекомбинантным антителом или фрагментом антитела). Если рекомбинантный белок представляет собой фермент, в механизме захвата можно использовать антитело или фрагмент антитела, которые специфически связываются с ферментом для захвата рекомбинантного фермента, субстрат фермента для захвата рекомбинантного фермента, кофактор фермента для захвата рекомбинантного фермента или, если рекомбинантный фермент содержит метку, белок, хелат металла или антитело (или фрагмент антитела), которые специфически связываются с меткой, содержащейся в рекомбинантном ферменте. Неограничивающие смолы, которые можно применять для захвата рекомбинантного белка, описаны в данном документе, и дополнительные смолы, которые можно применять для захвата рекомбинантного белка, известны из уровня техники. Одним неограничивающим примером смолы, в которой используется механизме захвата путем связывания с белком А, является смола MabSelect SuRe (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси), JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203 (Саннивейл, Калифорния) и Kaneka KanCap A (Осака, Япония).

В некоторых иллюстративных процессах, описанных в данном документе, MCCS или MCCS1 могут содержать резервуар, который обеспечивает выдерживание текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, при низком pH (например, pH ниже 4,6, ниже 4,4, ниже 4,2, ниже 4,0, ниже 3,8, ниже 3,6, ниже 3,4, ниже 3,2 или ниже 3,0) в течение, например, от приблизительно 1 минуты до 1,5 часа (например, приблизительно 1 часа) и инактивацию вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок. Как будет понятно специалисту в данной области, ряд других средств можно применять для отдельной технологической операции инактивации вирусов. Например, УФ-облучение текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, можно также применять для осуществления отдельной технологической операции инактивации вирусов.

MCCS или MCCS1 могут включать PCCS, содержащие четыре хроматографические колонки, при этом по меньшей мере три из четырех хроматографических колонок осуществляют отдельную технологическую операцию захвата рекомбинантного белка из жидкой культуральной среды (например, с применением MCCS, которая содержит любую из по меньшей мере одной хроматографической колонки, которая содержит смолу, которая способна осуществлять отдельную технологическую операцию захвата (например, любую из описанных в данном документе)). В данных примерах в четвертой колонке PCC может осуществляться отдельная технологическая операция инактивации вирусов в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок (например, в любой из иллюстративных колонок, описанных в данном документе, которые можно применять для обеспечения инактивации вирусов в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок).

MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 в иллюстративных процессах, описанных в данном документе, можно применять для осуществления отдельной технологической операции очистки и доочистки рекомбинантного белка. Например, MCCS2 можно применять для осуществления технологической операции очистки и доочистки рекомбинантного белка и элюата из MCCS2, который представляет собой выделенный рекомбинантный белок. MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 могут содержать по меньшей мере одну (например, две, три или четыре) хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, которые можно применять для осуществления отдельной технологической операции очистки рекомбинантного белка, и по меньшей мере одну (например, две, три или четыре) хроматографическую колонку или хроматографическую мембрану, которые можно применять для осуществления отдельной технологической операции доочистки рекомбинантного белка.

По меньшей мере одна хроматографическая колонка или хроматографическая мембрана, которые можно применять для осуществления отдельной технологической операции очистки рекомбинантного белка, могут содержать смолу, в которой используется механизм захвата (например, любой из механизмов захвата, описанных в данном документе или известных из уровня техники), или смолу, которую можно применять для осуществления анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматография гидрофобного взаимодействия. По меньшей мере одна хроматографическая колонка или хроматографическая мембрана, которые можно применять для осуществления отдельной функциональной операции доочистки рекомбинантного белка, могут включать смолу, которую можно применять для осуществления анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматография гидрофобного взаимодействия (например, любую из иллюстративных смол для осуществления анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, хроматографии на молекулярных ситах или хроматографии гидрофобного взаимодействия, описанных в данном документе или известных из уровня техники). Одна или несколько хроматографических колонок и/или хроматографических мембран, применяемых для осуществления отдельной технологической операции доочистки, могут содержать смолу, которая селективно связывает или задерживает примеси, находящиеся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок.

В некоторых примерах иллюстративных процессов, описанных в данном документе, MCCS2 включает PCCS, содержащую три хроматографические колонки и одну хроматографическую мембрану, например, при этом в трех хроматографических колонках в PCCS осуществляется отдельная технологическая операция очистки рекомбинантного белка (например, с применением по меньшей мере одной хроматографической колонки, которую можно применять для осуществления отдельной функциональной операции очистки белка), и в хроматографической мембране в PCCS осуществляется отдельная технологическая операция доочистки рекомбинантного белка. В данных примерах хроматографическая мембрана в PCCS, которую можно применять для осуществления отдельной технологической операции доочистки рекомбинантного белка, может представлять собой любую из иллюстративных хроматографических мембран, описанных в данном документе, которые можно применять для осуществления отдельной технологической операции доочистки рекомбинантного белка. Любой из способов переключения колонок, описанных в данном документе, можно применять для определения, когда можно переключать первые три хроматографические колонки и хроматографическую мембрану в PCCS в данном примере.

Иллюстративные системы для выделения рекомбинантного белка

Примеры систем биологического производства, применимых для осуществления процессов, описанных в данном документе, и которые содержат MCCS или MCCS1 и MCCS2, описаны в предварительной заявке на патент США с регистрационным № 61/775060, предварительной заявке на патент США № 61/856390, заявке на патент США с регистрационным № 14/195481, международной заявке на патент № PCT/US2014/019909 и предварительной заявке на патент США № 61/928906 (включены посредством ссылки). Вся система может включать, например, в общей сложности четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать хроматографических колонок. Например, MCCS, MCCS1 и/или MCCS2 могут содержать (или каждая может содержать) две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять хроматографических колонок.

Например, применимые системы могут содержать MCCS1, которая содержит впускное отверстие, и MCCS2, которая содержит выпускное отверстие, или MCCS, которая содержит впускное отверстие и выпускное отверстие. В некоторых вариантах осуществления MCCS1 и MCCS2 находятся в гидравлической связи друг с другом. Эти системы также могут быть выполнены таким образом, что текучая среда может входить во впускное отверстие, проходить через MCCS1 и MCCS2 и выходить из производственной системы через выпускное отверстие.

В данных иллюстративных системах MCCS или MCCS1 могут содержать впускное отверстие, через которое текучая среда (например, жидкая культуральная среда из производственного биореактора, которая практически не содержит клеток) может входить в MCCS или MCCS1, соответственно. Впускное отверстие может иметь любую структуру, известную из уровня техники для таких целей. Оно может содержать, например, винтовую резьбу, ребристость или уплотнение, которые позволяют вставлять трубку для текучей среды, так что после вставки трубки для текучей среды во впускное отверстие текучая среда будет входить в MCCS или MCCS1 через впускное отверстие без значительной случайной утечки текучей среды из впускного отверстия. Неограничивающие впускные отверстия, которые можно применять в системах по настоящему изобретению, известны и будут понятны специалистам в данной области.

MCCS или MCCS1 могут содержать по меньшей мере две хроматографические колонки, по меньшей мере две хроматографические мембраны или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану и впускное отверстие. MCCS или MCCS1 могут представлять собой любую из иллюстративных MCCS, описанных в данном документе, или характеризоваться одним или несколькими любыми иллюстративными свойствами MCCS (в любой комбинации), описанными в данном документе. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), находящиеся в MCCS или MCCS1, могут характеризоваться одной или несколькими любыми из иллюстративных форм, размеров, объемов (объемов слоев) и/или отдельной технологической операцией(ями), описанными в данном документе или известными из уровня техники.

Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), находящиеся в MCCS или MCCS1, могут содержать одну или несколько из любых иллюстративных смол, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Например, смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, находящихся в MCCS или MCCS1, может представлять собой смолу, в которой используется механизм захвата (например, механизм захвата путем связывания с белком А, механизм захвата путем связывания с белком G, механизм захвата путем связывания с антителом или фрагментом антитела, механизм захвата путем связывания с субстратом, механизм захвата путем связывания с кофакторами, механизм захвата путем связывания с аптамерами и/или механизм захвата путем связывания с метками). Смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах MCCS или MCCS1, может представлять собой катионообменную смолу, анионообменную смолу, смолу в качестве молекулярного сита или смолу, обеспечивающую гидрофобные взаимодействия, или любую их комбинацию. Дополнительные примеры смол, которые можно применять для очистки рекомбинантного белка, известны из уровня техники и могут содержаться в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, находящихся в MCCS или MCCS1. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографические мембраны, находящиеся в MCCS или MCCS1, могут содержать одинаковую и/или разные смолы (например, любую из смол, описанных в данном документе или известных из уровня техники для применения в очистке рекомбинантного белка).

Две или более хроматографических колонок и/или хроматографических смол, находящихся в MCCS или MCCS1, могут осуществлять одну или несколько отдельных технологических операций (например, захват рекомбинантного белка, очистку рекомбинантного белка, доочистку рекомбинантного белка, инактивацию вирусов, регуляцию концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, или фильтрацию текучей среды, содержащей рекомбинантный белок). В неограничивающих примерах MCCS или MCCS1 могут осуществлять отдельные технологические операции захвата рекомбинантного белка из текучей среды (например, жидкой культуральной среды) и инактивации вирусов, находящихся в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок. MCCS или MCCS1 могут осуществлять любую комбинацию двух или более отдельных технологических операций, описанных в данном документе или известных из уровня техники.

Хроматографическую колонку(и) и/или хроматографическую мембрану(ы), находящиеся в MCCS или MCCS1, можно соединять или перемещать по отношению друг к другу с помощью механизма переключения (например, механизма переключения колонок). MCCS или MCCS1 также могут содержать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) насосов (например, автоматических, например, автоматических перистальтических насосов). События переключения колонок можно запускать при выявлении уровня рекомбинантного белка, выявленного с помощью поглощения УФ-излучения, соответствующего определенному уровню рекомбинантного белка в текучей среде, проходящей через MCCS или MCCS1 (например, входящем потоке и/или элюате из одной или нескольких хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS или MCCS1), конкретному объему жидкости (например, буфера) или конкретному прошедшему времени. Переключение колонок в основном означает механизм, с помощью которого по меньшей мере в двух разных хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах в MCCS или MCCS1 (например, двух или более разных хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, находящихся в MCCS1 или MCCS2) обеспечивается прохождение разной стадии (например, уравновешивания, загрузки, элюирования или промывки) практически в одно и то же время в ходе по меньшей мере части процесса.

MCCS или MCCS1 может представлять собой систему для периодической противоточной хроматографии (PCCS). Например, PCCS, которая представляет собой MCCS или MCCS1 (т.e., PCCS или PCCS1, соответственно) может содержать четыре хроматографические колонки, при этом в первых трех колонках осуществляется отдельная технологическая операция захвата рекомбинантного белка из текучей среды (например, жидкой культуральной среды), а в четвертой колонке PCCS осуществляется отдельная технологическая операция инактивации вирусов в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок. В PCCS, которая представляет собой MCCS или MCCS1, можно использовать механизм переключения колонок. В системе PCC можно использовать модифицированную систему ÄKTA (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которой можно увеличить число колонок, например, до четырех, пяти, шести, семи или восьми колонок или более.

Вторая MCCS (MCCS2) в иллюстративных системах, описанных в данном документе, может содержать по меньшей мере две хроматографические колонки, по меньшей мере две хроматографические мембраны или по меньшей мере одну хроматографическую колонку и по меньшей мере одну хроматографическую мембрану и выпускное отверстие. MCCS2 может представлять собой любую из иллюстративных MCCS, описанных в данном документе, или может характеризоваться одним или несколькими из любых иллюстративных свойств MCCS (в любой комбинации), описанными в данном документе. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы), находящиеся в MCCS2, могут характеризоваться одной или несколькими из любых иллюстративных форм, размеров, объемов (объемов слоев) и/или отдельных технологических операций, описанных в данном документе. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографическая мембрана(ы) могут содержать одну или несколько из любых иллюстративных смол, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Например, смола, содержащаяся в одной или нескольких хроматографических колонках и/или хроматографических мембранах, находящихся в MCCS2, может представлять собой смолу, в которой используется механизм захвата (например, механизм захвата путем связывания с белком А, механизм захвата путем связывания с белком G, механизм захвата путем связывания с антителом или фрагментом антитела, механизм захвата путем связывания с субстратом, механизм захвата путем связывания с кофакторами, механизм захвата путем связывания с метками и/или механизм захвата путем связывания с аптамерами). Применимые смолы включают, например, катионообменную смолу, анионообменную смолу, смолу в качестве молекулярного сита, смолу, обеспечивающую гидрофобные взаимодействия. Дополнительные примеры смол известны из уровня техники. Хроматографическая колонка(и) и/или хроматографические мембраны, находящиеся в MCCS2, могут содержать одинаковую и/или разные смолы (например, любую из смол, описанных в данном документе или известных из уровня техники для применения в очистке рекомбинантного белка).

В хроматографической колонке(ах) и/или хроматографической мембране(ах), находящихся в MCCS2, могут осуществляться одна или несколько отдельных технологических операций (например, любая из отдельных технологических операций, описанных в данном документе, или любая комбинация отдельных технологических операций, описанных в данном документе). В неограничивающих примерах в MCCS2 могут осуществляться отдельные технологические операции очистки рекомбинантного белка из текучей среды и доочистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде, содержащей рекомбинантный белок. В других неограничивающих примерах в MCCS2 могут осуществляться отдельные технологические операции очистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде, доочистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде, и фильтрации текучей среды, содержащей рекомбинантный белок. В другом примере в MCCS2 могут осуществляться отдельные технологические операции очистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде, доочистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде, фильтрации текучей среды, содержащей рекомбинантный белок, и регуляции концентрации ионов и/или pH текучей среды, содержащей рекомбинантный белок. В MCCS2 может осуществляться любая комбинация двух или более отдельных технологических операций, описанных в данном документе или известных из уровня техники.

Хроматографическую колонку(и) и/или хроматографическую мембрану(ы), находящиеся в MCCS2, можно соединять или перемещать по отношению друг к другу с помощью механизма переключения (например, механизма переключения колонок). MCCS2 может также содержать один или несколько (например, два, три, четыре или пять) насосов (например, автоматических, например, автоматических перистальтических насосов). События переключения колонок можно запускать при выявлении уровня рекомбинантного белка, выявленного с помощью поглощения УФ-излучения, соответствующего определенному уровню рекомбинантного белка в текучей среде, проходящей через MCCS2 (например, во входящем потоке и/или элюате из одной или нескольких хроматографических колонок и/или хроматографических мембран в MCCS2), конкретному объему жидкой среды (например, буфера) или конкретному прошедшему времени.

MCCS2 может представлять собой систему для периодической противоточной хроматографии (т. e. PCCS2). Например, PCCS2 может содержать три колонки, в которых осуществляется отдельная технологическая операция очистки рекомбинантного белка из текучей среды, и хроматографическую мембрану, в которой осуществляется отдельная технологическая операция доочистки рекомбинантного белка, находящегося в текучей среде. Например, три колонки, в которых осуществляется отдельная технологическая операция очистки рекомбинантного белка из текучей среды, могут содержать, например, катионообменную смолу, и хроматографическая мембрана, в которой осуществляется отдельная технологическая операция доочистки, может содержать катионообменную смолу. В PCCS2 можно использовать механизм переключения колонок. В системе PCCS2 можно использовать модифицированную систему ÄKTA (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси), в которой можно увеличить число колонок, например, до четырех, пяти, шести, семи или восьми колонок или более.

MCCS2 может содержать выпускное отверстие, через которое выделенный рекомбинантный белок может выходить из системы. Выпускное отверстие может содержать, например, винтовую резьбу, ребристость или уплотнение, которые позволяют вставлять трубку для текучей среды или сосуд, разработанный для удержания и хранения выделенного рекомбинантного белка. Выпускное отверстие может содержать поверхность, которую можно применять для герметичной изоляции сосуда со сниженной биологической нагрузкой или другого такого контейнера для хранения на выпускном отверстии с целью обеспечения потока выделенного рекомбинантного белка непосредственно в сосуд со сниженной биологической нагрузкой или контейнер для хранения. Неограничивающие выпускные отверстия, которые можно применять в системах по настоящему изобретению, известны и будут понятны специалистам в данной области.

Составление выделенного рекомбинантного белка

Выделенный рекомбинантный белок можно дополнительно составлять в фармацевтическое средство с применением способов, известных из уровня техники. Фармацевтические средства составляют так, чтобы они были совместимы с их предполагаемым путем введения (например, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или внутрибрюшинным). Фармацевтические средства могут содержать стерильный разбавитель (например, стерильную воду или солевой раствор), нелетучее масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту, тимеросал и т. п., антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и изотонические средства, такие как сахара (например, декстроза), многоатомные спирты (например, маннит или сорбит) или соли (например, хлорид натрия) или любую их комбинацию. Суспензии липосом также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей (см., например, патент США № 4522811). Препараты фармацевтических средств можно составлять и заключать в ампулы, одноразовые шприцы или сосуды с несколькими дозами. При необходимости (как, например, в случае инъекционных составов) надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, или поверхностно-активного вещества. Всасывание выделенного рекомбинантного белка можно пролонгировать путем включения средства, которое замедляет всасывание (например, моностеарата алюминия и желатина). В качестве альтернативы контролируемое высвобождение можно обеспечивать с помощью имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки, которые могут содержать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочную кислоту; Alza Corporation и Nova Pharmaceutical, Inc.).

Фармацевтические средства, которые содержат один или несколько рекомбинантных белков, можно составлять для парентерального (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или внутрибрюшинного) введения в виде единичной лекарственной формы (т. e. физически дискретных единиц, содержащих заранее определенное количество активного белка для простоты введения и однородности дозирования).

Токсичность и терапевтическую эффективность фармацевтических средств можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или экспериментальных животных (например, обезьянах). Например, специалист может определить LD50 (дозу, летальную для 50% популяции) и ED50 (дозу, терапевтически эффективную у 50% популяции): терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50:ED50. Фармацевтические средства, которые проявляют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Если фармацевтическое средство проявляет нежелательный побочный эффект, следует принять меры с целью минимизации потенциального вреда (т. e. снижения нежелательных побочных эффектов). Токсичность и терапевтическую эффективность можно определять с помощью других стандартных фармацевтических процедур.

Данные, полученные из анализов на культурах клеток и исследований на животных, можно применять при составлении соответствующей дозировки любого данного выделенного рекомбинантного белка для применения у субъекта (например, человека). Эффективность и дозировку любого из фармацевтических средств, описанных в данном документе, может определить специалист в области здравоохранения или специалист в области ветеринарии с применением способов, известных из уровня техники. Определенные факторы могут оказывать влияние на дозировку и выбор момента времени, необходимых для эффективного лечения субъекта (например, тяжесть заболевания или нарушения, предыдущие способы лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других заболеваний).

Настоящее изобретение далее описывается в следующих примерах, которые не ограничивают объем настоящего изобретения, описанного в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Двухстадийные иллюстративные процессы культивирования в системе посевных ферментеров

Эксперименты осуществляли с целью разработки улучшенных процессов культивирования в системе посевных ферментеров. Иллюстративные процессы культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренные в данном документе, показаны на фигурах 1 и 2. По сравнению с традиционными процессами культивирования в системе посевных ферментеров в иллюстративных процессах культивирования в системе посевных ферментеров, представленных в данном документе, устранены две промежуточные стадии культивирования с колбах с мешалками. В иллюстративных процессах культивирования в системе посевных ферментеров, показанных на фигурах 1 и 2, замещают культуры в колбах с мешалкой (например, культуры объемом от 125 мл до 10 л в колбах с мешалкой на фигурах 1 и 2) на культуры в биореакторах Wave (объемом 2 л и 20 л) на фигурах 1 и 2). Замещение нескольких культур в колбах с мешалкой на биореакторы Wave на фигурах 1 и 2 снижает число необходимых манипуляций в вытяжном шкафу с ламинарным потоком и, таким образом, повышает вероятность благоприятного исхода операции путем обеспечения технологической операции в замкнутой системе. Применение перфузионного культивирования на стадии N-1 перфузионного культивирования (например, перфузионный биореактор объемом 50 л с устройством для ATF-фильтрации на фигурах 1 и 2) также позволяет достигать плотностей клеток в культуре ≥ 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Высокие плотности жизнеспособных клеток, достигнутые на стадии N-1 перфузионного культивирования, обеспечивают возможность плотности инокуляции производственного биореактора объемом 500 л, составляющую 5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, которая значительно превышает исходную плотность клеток в производственном биореакторе, достигаемую с помощью традиционных процессов культивирования в системе посевных ферментеров (фигура 1). Более высокая плотность засева производственного биореактора, обеспечиваемая процессами культивирования в системе посевных ферментеров по настоящему изобретению, помогает сократить фазу роста в производственном биореакторе на приблизительно 5 дней с экономией производственного времени предприятия на функционирование производственного биореактора до 50 дней. Материалы и способы, применяемые для тестирования продуктивности иллюстративных процессов культивирования в системе посевных ферментеров, показанных на фигурах 1 и 2, описаны ниже.

Материалы и способы

Линия клеток и среды

Все эксперименты осуществляли с применением коммерчески доступной среды для культивирования клеток с определенным химическим составом (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), дополненной 4 мМ глутамина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), и линии клеток CHO, вырабатывающей рекомбинантный фермент человека.

Периодическое культивирование в системе посевных ферментеров в биореакторах Wave объемом 2 л и 20 л

Сосуд клеточного банка с высокой плотностью (HD) (10×10⁷ жизнеспособных клеток/мл, 4,5 мл/сосуд) размораживали в пакете для культивирования клеток Wave объемом 2 л (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) при рабочем объеме 1 л. Когда плотность жизнеспособных клеток в пакете для культивирования клеток Wave объемом 2 л достигала плотности 3,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, культуру размножали в пакете для культивирования клеток Wave объемом 20 л при рабочем объеме 7,5 л. Систему биореактора Wave (модель 20/50 EHTD) (GE Healthcare) применяли в качестве качающейся платформы для обоих пакетов для культивирования клеток Wave объемом 2 л и объемом 20 л. Культуры поддерживали при температуре 37°C, скорости качания 16 об./мин. и угле качания 7°. Смесь газов с 20% O₂ и 5% CO₂ добавляли в свободное пространство над культурой при скорости потока 0,25 ст. л/мин.

Перфузионное культивирование в системе посевных ферментеров N-1

Стеклянный перфузионный биореактор объемом 15 л (Broadley-James Corporation, Ирвин, Калифорния), оснащенный перфузионным устройством ATF4 (Refine Technology, Пайн Брук, Нью-Джерси), применяли для моделирования стадии культивирования в системе посевных ферментеров N-1 (биореактор объемом 50 л, как показано на фигуре 1). Кислород добавляли через 20 мкм металлокерамический барботер для обеспечения растворенного кислорода на уровне 40%, а азот добавляли посредством барботера с просверленными отверстиями размером 1 мм для обеспечения уровня растворенного CO₂ ниже 120 мм рт. ст. pH культуры в биореакторе поддерживали выше 6,85 с помощью добавления 0,5 M карбоната натрия. 10% раствор пеногасителя (FoamAway, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) добавляли при необходимости для регуляции уровня пены.

Биореактор объемом 15 л при рабочем объеме 10 л засевали из расчета плотности 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и культивирование проводили в периодическом режиме до дня 2, когда начинали перфузию. Скорость перфузии изначально обеспечивали при специфичной для клеток скорости перфузии (CSPR), составляющей 0,2 нл/клетка/день, с применением емкостного датчика, функционирующего в режиме реального времени (Aber Instruments, Аберистуит, Великобритания), и программируемого логического контроллера (DeltaV). Скорость перфузии ограничивали на уровне 4 объемов биореактора в день (RV/день), после того как плотность жизнеспособных клеток достигала 20×10⁶ клеток/мл.

Модель периодического культивирования с повторной подпиткой в пробирке Spin объемом 50 мл для оценки плотности инокуляции

Аликвоту культуры удаляли из биореактора N-1 из системы посевных ферментеров, когда плотность клеток в нем достигала 25×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и 100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, и впоследствии инокулировали в пробирки Spin объемом 50 мл (TPP Techno Plastic Products AG, Тразадинген, Швейцария) при трех различных плотностях инокуляции в трех повторностях: 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл или 5,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в рабочем объеме 10 мл. Повторные подпитки проводили один раз в сутки, поскольку непрерывную перфузию не могли осуществлять при таком масштабе. Повторные подпитки осуществляли, начиная со дня 1, путем удаления пробирок Spin из инкубатора, осаждения клеток при 1100 об./мин. в течение 5 минут, удаления супернатанта и затем добавления свежей среды, чтобы ресуспендировать клетки. Стратегию повторной подпитки разрабатывали с целью обеспечения одинаковой CSPR для разных условий плотности инокуляции. Все пробирки Spin содержали во встряхивателе-инкубаторе Multitron II (HT Infors, Боттминген, Швейцария) при температуре 37°C, скорости качания 160 об./мин., угле качания 45 градусов относительно стеллажа, относительной влажности 80% и 5% концентрации CO₂.

Производственный биореактор

Для имитации производственного биореактора объемом 500 л, показанного на фигуре 1, использовали биореакторы объемом 15 л (Broadley-James Corporation, Ирвин, Калифорния) с рабочим объемом 10 л, функционирующие в режиме перфузии с применением перфузионного устройства ATF4 (Refine Technology, Пайн Брук, Нью-Джерси), с 20 мкм металлокерамическим барботером для обеспечения растворенного кислорода на уровне 40%, а азот добавляли посредством барботера с просверленными отверстиями размером 1 мм для обеспечения уровня CO₂ ниже 120 мм рт. ст. pH поддерживали выше 6,85 с помощью добавления 0,5 M карбоната натрия. 10% раствор пеногасителя (FoamAway, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) добавляли с помощью перистальтического насоса для регуляции уровня пены.

Один набор производственных биореакторов инокулировали при низкой плотности (0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл) из посевного сосуда, который функционировал в периодическом режиме. Перфузию начинали в день 1 из расчета 0,5 RV/день и повышали ежедневно на 0,5 RV/день, пока скорость перфузии не достигала 2 RV/день. Другой набор производственных биореакторов инокулировали при высокой плотности (5,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл) из перфузионного посевного сосуда N-1 объемом 15 л, когда плотность достигала 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл. В связи с высокой плотностью инокуляции перфузию начинали из расчета 2 RV/день непосредственно после инокуляции. Для всех производственных биореакторов плотность жизнеспособных клеток регулировали из расчета 40×10⁶жизнеспособных клеток/мл с применением емкостного датчика, функционирующего в режиме реального времени, и спускного насоса. Все производственные биореакторы функционировали в течение 50 дней.

Аналитические способы

Плотность жизнеспособных клеток определяли с применением анализатора жизнеспособности клеток ViCell XR (Beckman Coulter, Брея, Калифорния). pH и pCO₂ измеряли в рабочем порядке с применением анализатора газов крови RAPIDLab (Siemans, Тарритаун, Нью-Йорк). Эффективность производства белка измеряли с помощью проприетарного фотометрического анализа ферментативной активности.

Результаты и обсуждение

На фигуре 3 показан профиль роста плотности жизнеспособных клеток иллюстративного процесса культивирования в системе посевных ферментеров, описанного в данных примерах, включающего периодическое культивирование в Wave и перфузионное культивирование N-1. Длительность периодического культивирования в Wave объемом 2 л и объемом 20 л составляла 8 дней и 5 дней, соответственно. Перфузионный биореактор N-1 функционировал в течение 12 дней и обеспечивал конечную плотность жизнеспособных клеток 110×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и жизнеспособность клеток > 98%. Плотность жизнеспособных клеток достигала 50×10⁶ клеток/мл в день 9, что являлось плотностью клеток, необходимой для инокуляции биореактора объемом 500 л из расчета 5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл (из биореактора N-1 объемом 50 л).

В случае биореактора N-1 перфузию начинали в день 2 и регулировали для поддержания CSPR 0,2 нл/клетка/день с применением емкостного зонда, функционирующего в режиме реального времени, для автоматического повышения скорости подпитки при повышении плотности клеток. Благоприятный исход данной стратегии контроля скорости перфузии зависит от способности емкостного зонда с высокой степенью точности оценивать плотность жизнеспособных клеток. Данную стратегию применяли только до дня 7, поскольку скорость перфузии ограничивали на уровне 4 RV/день, но зонд был способен с высокой степенью точности оценивать плотность на протяжении всего цикла до дня 12, когда достигалась плотность 110×10⁶ жизнеспособных клеток/мл (фигура 4).

Модель малого масштаба в пробирках Spin применяли для оценки влияния плотности клеток N-1 на рост клеток в производственном биореакторе. Образцы культуры отбирали из биореактора N-1, когда значения плотности клеток составляли 25×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл или 100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, соответственно. Их разделяли на три аликвоты, разводили до 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл или 5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл свежей средой и затем инокулировали в трех повторностях в пробирки Spin (получение модели перфузионного производственного биореактора). Ежедневные повторные подпитки не осуществляли до дня 1, что объясняется разведениями, полученными при разделении культур до их соответствующих плотностей инокуляции. Уровень повторной подпитки регулировали, исходя из плотности инокуляции в пробирки Spin, обеспечивая, чтобы каждое условие плотности инокуляции подвергалось одинаковой CSPR при одинаковых значениях плотности клеток.

Количество клеток и профили жизнеспособности показаны на фигурах 5-7 и нанесены на график таким образом, что можно проводить сравнения между условиями плотности N-1 при каждой плотности инокуляции. Поскольку максимальная скорость перфузии в модели на пробирках Spin составляет 1 RV/день, данные культуры выращивали только до плотности 20×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, чтобы соответствовать CSPR в модели перфузионного биореактора. Отличия в росте у различных условий плотности N-1 для всех трех протестированных плотностях инокуляции отсутствовали.

Для исследования эффектов плотности N-1 и плотности инокуляции на рост и продуктивность клеток в производственном биореакторе биореакторы инокулировали из расчета 5,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл из биореактора N-1 при 50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл и сравнивали с биореакторами, которые инокулировали из расчета 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл из биореактора N-1 при 2,5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Рост клеток при обоих условиях был сравнимым, как показано на фигуре 8. Жизнеспособность клеток сохранялась выше 90% для обоих условий инокуляции на протяжении всего 50-дневного цикла. На фигуре 9 показана кумулятивная продуктивность в зависимости от обобщенной плотности жизнеспособных клеток и показана подобная удельная скорость выработки у разных условий. Что особенно важно, плотность клеток на стационарной фазе, составляющая 40×10⁶жизнеспособных клеток/мл (фигура 8), и необходимый титр для очистки достигались на 4-5 дней раньше в случае условия высокой плотности инокуляции.

Иллюстративные процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, имеют как экономические, так и эксплуатационные преимущества. Например, инокуляция перфузионного производственного биореактора объемом 500 л из расчета 5,0×10⁶ клеток/мл снижает длительность фазы роста на 4-5 дней, повышая продуктивность на 10% для 50-дневного цикла. Дополнительно в перфузионных биореакторах N-1 можно было достигнуть плотности 100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, и теоретически можно было инокулировать биореактор объемом 500 л из расчета 10×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, при этом дополнительно уменьшая длительность фазы роста (например, в общей сложности на 5-6 дней).

Иллюстративные процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, также можно применять для инокуляции производственного биореактора, который функционирует в режиме периодического культивирования или периодического культивирования с подпиткой. В случае 21-дневного процесса периодического культивирования клеток с подпиткой с применением биореактора объемом 500 л, плотность инокуляции, составляющая 5,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, могла бы снизить длительность эксплуатации производственного биореактора на 25%. Все это могло бы обеспечить возможность дополнительных 5-6 партий в год, повышая продуктивность производства на 25%-30%.

В большинстве случаев в процессах периодического культивирования и периодического культивирования с подпиткой, как правило, применяют производственные биореакторы, которые намного больше тех, которые применяют для процессов перфузионного культивирования, так что необходимы несколько стадий культивирования в системе посевных ферментеров, проводимых в биореакторах из нержавеющей стали большого масштаба. На фигуре 2 показан пример традиционного процесса культивирования в системе посевных ферментеров, применяемого для инокуляции биореактора объемом 10000 л, в сравнении с процессом культивирования в системе посевных ферментеров с применением биореактора N-1 объемом 50 л с перфузионным устройством ATF. С применением иллюстративных процессов культивирования в системе посевных ферментеров, описанных в данном документе, биореактор N-1 объемом 50 л при 50-100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл способен обеспечивать инокуляцию биореактора объемом 10000 л из расчета от 0,25×10⁶ жизнеспособных клеток/мл дo 0,50×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, с устранением, таким образом, двух промежуточных стадий культивирования клеток в системе посевных ферментов.

Данные, описанные в этом примере, демонстрируют иллюстративный процесс культивирования в системе посевных ферментеров, включающий получение HD-клеточного банка, технологию с биореакторами одноразового использования и перфузионное культивирование на стадии биореактора N-1. Процессы культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренные в данном документе, снижают сложность традиционных процессов культивирования в системе посевных ферментеров путем сокращения числа стадий культивирования в малом масштабе. Данные, описанные в данном примере, показывают, что при применении перфузионного культивирования на стадии N-1 можно достигнуть плотности жизнеспособных клеток до 100×10⁶ жизнеспособных клеток/мл за 12 дней без снижения характеристик роста клеток после дополнительных стадий размножения. На основании этих данных иллюстративные процессы культивирования в системе посевных ферментеров, описанные в данном документе, можно применять для инокуляции производственного биореактора объемом 500 л при плотности клеток, составляющей 5×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, для уменьшения времени до достижения плотности клеток на стационарной фазе на 4-5 дней и обеспечения 10% повышения общей продуктивности 50-дневного цикла. Для процессов периодического культивирования или периодического культивирования, для которых необходимы производственные биореакторы большего размера, как, например, объемом 10000 л, в процессах культивирования в системе посевных ферментеров, предусмотренных в данном документе, можно устранить 1-2 стадии из процесса размножения путем применения одного перфузионного биореактора объемом 50 л на стадии N-1.

Claims

1. Способ получения рекомбинантного белка, где способ состоит из следующих стадий:

(a) помещение от 4,5×10⁷ до 450×10⁷ рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток;

(b) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от 1,0×10⁶ до 5,0×10⁶ клеток/мл;

(c) помещение объема первой культуры клеток из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от 0,25×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток/мл;

(d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от 5×10⁶ до 120×10⁶ клеток/мл;

(e) помещение объема второй культуры клеток из стадии (d) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от 0,25×10⁶ до 8×10⁶ клеток/мл;

(f) перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов в условиях, позволяющих рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок, и

(g) сбор рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов.

2. Способ по п. 1, где помещение рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) для получения первой культуры клеток включает

размораживание замороженного клеточного банка и

помещение объема размороженного клеточного банка в первую культуральную среду.

3. Способ по п. 1, где помещение рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) для получения первой культуры клеток включает помещение объема третьей культуры клеток, содержащей рекомбинантные клетки млекопитающих, в первую культуральную среду.

4. Способ по п. 1, где

первая культура клеток на стадии (a) характеризуется диапазоном объема от 1,0 до 50 л;

вторая культура клеток на стадии (с) характеризуется диапазоном объема от 5 до 600 л и/или

культура клеток-продуцентов на стадии (e) характеризуется диапазоном объема от 50 до 20000 л.

5. Способ по п. 1, где

сосуд на стадии (a) характеризуется диапазоном внутреннего объема от 1,5 до 100 л;

перфузионный биореактор на стадии (c) характеризуется диапазоном внутреннего объема от 7,5 до 1000 л и/или

производственный биореактор на стадии (e) характеризуется диапазоном внутреннего объема от 150 до 25000 л.

6. Способ по п. 1, где

исходная плотность клеток на стадии (e) находится в диапазоне от 2,0×10⁶ до 8×10⁶ клеток/мл и/или

исходная плотность клеток на стадии (e) составляет по меньшей мере 10% от плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе, которая составляет от 5×10⁶ до 50×10⁶ клеток/мл.

7. Способ по п. 1, где перфузионное культивирование на стадии (f) приводит к получению культуры клеток-продуцентов, достигающей плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе за период от 1 дня до 10 дней.

8. Способ получения рекомбинантного белка, где способ состоит из следующих стадий:

(а) помещение объема замороженного клеточного банка, содержащего рекомбинантные клетки млекопитающих, в четвертую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением третьей культуры клеток;

(b) периодическое культивирование третьей культуры клеток из стадии (a) до диапазона плотности клеток от 1,0×10⁶ до 5,0×10⁶ клеток/мл;

(c) помещение объема третьей культуры клеток из стадии (b), содержащей от 4,5×10⁷ до 450×10⁷ рекомбинантных клеток млекопитающих, в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток;

(d) периодическое культивирование первой культуры клеток до диапазона плотности клеток от 1,0×10⁶ до 5,0×10⁶ клеток/мл;

(e) помещение объема первой культуры клеток из стадии (d) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от 0,25×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток/мл;

(f) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от 5×10⁶ до 120×10⁶ клеток/мл;

(g) помещение объема второй культуры клеток из стадии (f) в третью культуральную среду, содержащуюся в производственном биореакторе, с получением культуры клеток-продуцентов при исходной плотности клеток в диапазоне от 0,25×10⁶ до 8×10⁶ клеток/мл;

(h) перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов в условиях, позволяющих рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок, и

(i) сбор рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов.

9. Способ получения и выделения рекомбинантного белка, где способ состоит из следующих стадий:

(c) помещение объема первой культуральной среды с клетками из стадии (b) во вторую культуральную среду, содержащуюся в перфузионном биореакторе, с получением второй культуры клеток при исходной плотности клеток в диапазоне от 0,25×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток/мл;

(d) перфузионное культивирование второй культуры клеток до диапазона плотности клеток от 5×10⁶ до 60×10⁶ клеток/мл;

(f) перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов в условиях, которые позволяют рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок;

(g) сбор рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов, где сбор включает удаление третьей культуральной среды из производственного биореактора, и

(h) выделение рекомбинантного белка из удаленной третьей культуральной среды из стадии (g).

10. Способ по п. 9, где помещение рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) для получения первой культуры клеток включает

11. Способ по п. 9, где помещение рекомбинантных клеток млекопитающих на стадии (a) для получения первой культуры клеток включает помещение объема третьей культуры клеток, содержащей рекомбинантные клетки млекопитающих, в первую культуральную среду.

12. Способ получения и выделения рекомбинантного белка, где способ состоит из следующих стадий:

(b) периодическое культивирование третьей культуры клеток на стадии (a) до диапазона плотности клеток от 1,0×10⁶ до 5,0×10⁶ клеток/мл,

(c) помещение от 4,5×10⁷ до 450×10⁷ рекомбинантных клеток млекопитающего в первую культуральную среду, содержащуюся в сосуде, с получением первой культуры клеток;

(h) перфузионное культивирование культуры клеток-продуцентов в условиях, позволяющих рекомбинантным клеткам млекопитающих секретировать рекомбинантный белок;

(i) сбор рекомбинантного белка из культуры клеток-продуцентов, где сбор включает удаление третьей культуральной среды из производственного биореактора, и

(h) выделение рекомбинантного белка из удаленной третьей культуральной среды из стадии (i).

13. Способ по п. 9, где

14. Способ по п. 9, где

15. Способ по п. 9, где

16. Способ по п. 9, где перфузионное культивирование на стадии (f) приводит к получению культуры клеток-продуцентов, достигающей плотности клеток-продуцентов на стационарной фазе за период от 1 дня до 10 дней.

17. Способ по п. 9, дополнительно включающий составление выделенного рекомбинантного белка со стадии (h) в фармацевтическое средство.