RU2670946C9

RU2670946C9 - Варианты протеазы и кодирующие их полинуклеотиды

Info

Publication number: RU2670946C9
Application number: RU2016106668A
Authority: RU
Inventors: Франк Винтер Расмуссен; Рольф Томас ЛЕНХАРД; Мигель Дуарте Гильерме Перейра ТОСКАНО; Эсбен Петер ФРИИС; Сигне Эскильсен ЛАРСЕН; Юген Карстен Франц КНЕТЦЕЛЬ; Михель БАУЭР
Original assignee: Новозимс А/С
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2018-11-26
Also published as: RU2016106668A; WO2015014790A2; EP3611260A1; CN117165561A; EP3027748A2; US10150957B2; US10752890B2; US20160208234A1; WO2015014790A3; CN105358686A; CN117904081A; RU2670946C2; US20190040376A1; EP4477734A2; EP3027748B1

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант протеазы, содержащий замену в положении 171 SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75% и меньше чем на 100%, и вариант обладает протеазной активностью, где аминокислота в положении, соответствующем положению 171 SEQ ID NO: 3, выбрана из группы, состоящей из Trp, Lys, Glu и Asn. Предложен способ получения варианта протеазы, включающий введение в исходную протеазу замены в положении 171 SEQ ID NO: 3, где аминокислота в положении, соответствующем положению 171 SEQ ID NO: 3, заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Trp, Lys, Glu и Asn, и где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 3, и извлечение варианта. Группа изобретений позволяет повысить стабильность указанного варианта, обладающего протеазной активностью, в моющем средстве по сравнению с исходной протеазой SEQ ID NO: 3. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 17 табл., 5 пр.

Description

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым вариантам протеазы, характеризующих изменения относительно исходной протеазы в одном или нескольких свойствах, включая: моющую эффективность, стабильность в моющем средстве и/или стабильность при хранении. Варианты настоящего изобретения являются пригодными для применения, например, в композициях чистящего или моющего средства, таких как композиции моющего средства для стирки и композициях для мытья посуды, включая композиции для мытья посуды в автоматической посудомоечной машине. Настоящее изобретение также относится к выделенным последовательностям ДНК, кодирующим варианты, векторам экспрессии, клеткам-хозяевам и способам получения и применения вариантов по настоящему изобретению.

Описание уровня техники

Ферменты, в качестве части моющих составов, применяют в производстве моющих средств уже много десятилетий. Протеазы, с коммерческой точки зрения, представляют собой наиболее значимый фермент в таких составах, но также часто применяют другие ферменты включая липазы, амилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы или смеси ферментов. Для улучшения себестоимости и/или эффективности протеаз ведется непрерывный поиск протеаз с измененными свойствами, к примеру, повышенная активность при низких температурах, повышенная стабильность, повышенная специфическая активность при заданном pH, измененная зависимость от Ca²⁺, повышенная стабильность в присутствии других ингредиентов моющего средства (например, отбеливателя, поверхностно-активных веществ и т. д.) и т. д. Субтилазы, составляющие одно семейство протеаз, которые часто применяют в моющих средствах. Ранее это семейство было дополнительно разделено на 6 разных подгрупп по Siezen RJ and Leunissen JAM, 1997, Protein Science, 6, 501-523. Одну из этих подгрупп представляет собой семейство субтилизина, которое включает субтилазы, к примеру, BPN’, субтилизин 309 (SAVINASE^®, Novozymes A/S), субтилизин Carlsberg (ALCALASE^®,Novozymes A/S), субтилизин S41 (субтилаза из антарктического психрофила Bacillus TA41, Davail S et al. 1994, The Journal of Biological Chemistry, 269(26), 99. 17448-17453) и субтилизин S39 (субтилаза из антарктического психрофила Bacillus TA39, Narinx E et al. 1997, Protein Engineering, 10 (11), pp. 1271-1279). TY145 представляет собой субтилазу из вида Bacillus. TY145, NCIMB 40339, которая впервые была описана в WO 92/17577 (Novozymes A/S) и в позже поданной заявке WO2004/067737 (Novozymes A/S), раскрывающих пространственную структуру и применение белковой инженерии для изменения функциональной возможности TY-145 субтилазы.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам протеазы, содержащим изменение в одном или нескольких (например, некоторых) положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 в SEQ ID NO: 3, где вариант обладает протеазной активностью и где варианты имеют аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична зрелому полипептиду с SEQ ID NO: 2 или с SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение относится к способу получения варианта протеазы, включающему введение в исходную протеазу замены в одном или нескольких положениях 171, 173, 175 или 179 с SEQ ID NO: 3, где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3 и извлечению варианта. Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты; конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, и способам получения вариантов.

Обзор перечня последовательностей

SEQ ID NO: 1 = представляет собой последовательность ДНК протеазы TY-145, выделенной из Bacillus sp.

SEQ ID NO: 2 = представляет собой аминокислотную последовательность, которая выведена с SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 = представляет собой аминокислотную последовательность зрелого TY145.

Определения

Термин "протеаза" определяется в данном документе как фермент, который гидролизирует пептидные связи. Она включает любой фермент, принадлежащий к ферментной группе EC 3.4 (включая каждый из их тринадцати подклассов). Номер EC ссылается на номенклатуру ферментов 1992 с NC-IUBMB, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния, включая дополнения 1-5, опубликованные в Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6 и Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; соответственно. Термин "субтилазы" относится к подгруппе серин-протеазы в соответствии с Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Серин-протеазы или серин-пептидазы представляют собой подгруппу протеаз, которая характеризуется наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы (и серин-протеазы) дополнительно характеризуются наличием, кроме серина, двух активных центров с аминокислотными остатками, а именно остатками гистидина и аспарагиновой кислоты. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т. е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина. Термин “протеазная активность” означает протеолитическую активность (EC 3.4). Протеазы по настоящему изобретению представляют собой эндопептидазы (EC 3.4.21). Существует несколько типов протеазной активности: тремя главными типами активности являются трипсиноподобный, где расщепление амидных субстратов имеет место после Arg или Lys в P1, химотрипсиноподобный, где расщепление происходит после одной из гидрофобных аминокислот в P1 и эластазоподобный с расщеплением после Ala в P1. В рамках настоящего изобретения протеазную активность определяют в соответствии с процедурой, описанной в "Материалах и способах” ниже. Варианты протеазы по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% протеазной активности зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

Термин “исходная молекула” или исходная протеаза означает протеазу над которой совершается изменение для получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Таким образом, исходная молекула представляет собой протеазу, имеющую идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без изменений в одном или нескольких из указанных определенных положений. Следует понимать, что в данном контексте термин “имеющая идентичную аминокислотную последовательность” относится к 100% идентичности последовательности. Исходная молекула может представлять собой встречающийся в естественных условиях полипептид (дикого типа) или его вариант. В конкретном варианте осуществления исходная молекула представляет собой протеазу, последовательность которой по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6% или 100% идентична полипептиду с SEQ ID NO: 3.

Термин “вариант протеазы” означает протеазу обладающую протеазной активностью, содержащую изменение, т. е. замену, вставку и/или делецию, предпочтительно замену в одном или более (или одном или нескольких) положениях по сравнению с ее исходной молекулой, которая представляет собой протеазу, имеющую идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без изменений в одном или нескольких из указанных определенных положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей какое-либо положение, на другую аминокислоту; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей какое-либо положение, и вставка означает добавление аминокислот, например, от 1 до 10 аминокислот, предпочтительно 1-3 аминокислот, примыкающих к аминокислоте, занимающей какое-либо положение.

Термин “выделенный вариант” означает вариант, модифицированный человеком. В одном аспекте вариант является по меньшей мере на 1% чистым, например, по меньшей мере на 5% чистым, по меньшей мере на 10% чистым, по меньшей мере на 20% чистым, по меньшей мере на 40% чистым, по меньшей мере на 60% чистым, по меньшей мере на 80% чистым и по меньшей мере на 90% чистым, по результатам определения с помощью SDS-PAGE.

Термин “выделенный полинуклеотид” означает полинуклеотид, модифицированный человеком. В одном аспекте выделенный полинуклеотид является по меньшей мере на 1% чистым, например, по меньшей мере на 5% чистым, по меньшей мере на 10% чистым, по меньшей мере на 20% чистым, по меньшей мере на 40% чистым, по меньшей мере на 60% чистым, по меньшей мере на 80% чистым, по меньшей мере на 90% чистым и по меньшей мере на 95% чистым, как определенно с помощью агарозного электрофореза. Полинуклеотиды могут являться геномного, кДНК, РНК, полусинтетического, синтетического происхождения или любыми их комбинациями.

Термин “аллельный вариант” означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить в результате к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Термин “практически чистый вариант” означает препарат, который содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% и не более 0,5% по весу отличного от полипептида материала, с которым он связан в своем естественном состоянии или при получении с помощью рекомбинации. Предпочтительно, вариант является по меньшей мере на 92% чистым, например, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% чистым и на 100% чистым по весу от общего материала полипептида, присутствующего в препарате. Варианты по настоящему изобретению предпочтительно присутствуют в практически чистой форме. Этого можно достичь, например, путем получения варианта с помощью хорошо известных рекомбинантных способов или с помощью классических способов очистки.

Термин “протеаза дикого типа” означает протеазу, экспрессируемую организмом, встречающимся в естественных условиях, к примеру, бактерия, археи, дрожжи, гриб, растение или животное, встречающиеся в природе. Пример протеазы дикого типа представляет собой TY-145, т. е. зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, т. е. аминокислоты 1-311 или зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3.

Термин “зрелый полипептид” означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, к примеру, процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д. В одном аспекте зрелый полипептид соответствует аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 3.

Термин “кодирующая зрелый полипептид последовательность” означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий протеазной активностью. В одном аспекте кодирующая последовательность зрелого полипептида представляет собой нуклеотиды 331-1263 с SEQ ID NO: 1, исходя из данных SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)], с помощью которой предсказали, что нуклеотиды 1-81 из SEQ ID NO: 1 представляют собой сигнальный пептид.

Термин "кДНК" означает молекулу ДНК, которую можно получить посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из прокариотической или эукариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт представляет собой предшественника для мРНК, который подвергается процессингу в ходе ряда этапов, в том числе сплайсингу, до того, как станет зрелой сплайсированной мРНК.

Термин “кодирующая последовательность” означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность её полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяют открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со стартового кодона ATG или альтернативных стартовых кодонов, к примеру, GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, например, TAA, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "конструкция нуклеиновой кислоты" означает либо одно-, либо двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из гена, встречающегося в естественных условиях, или модифицированную с тем, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в таком порядке, который в иных случаях не может существовать в естественных условиях, или являющуюся синтетической. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термина “экспрессионная кассета”, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Термин “функционально связанный” означает конфигурацию, при которой регуляторная последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.

Термин “регуляторные последовательности” означает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной или чужеродной относительно полинуклеотида, кодирующего вариант, или нативной или чужеродной относительно другой таковой. Такие регуляторные последовательности включают в себя, без ограничения, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регуляторные последовательности включают в себя промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. В регуляторных последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию регуляторных последовательностей с кодирующим участком полинуклеотида, кодирующего вариант.

Термин "экспрессия" включает любой этап, задействованный в продуцировании варианта, в том числе без ограничения, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Термин “вектор экспрессии” означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, и функционально связана с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают ее экспрессию.

Термин “промотор транскрипции” используют применительно к промотору, который представляет собой участок ДНК, что содействует транскрипции конкретного гена. Промоторы транскрипции, как правило, расположены рядом с генами, которые они регулируют, на той же цепи и выше них (перед 5'-концом смысловой цепи).

Термин “терминатор транскрипции” используется применительно к участку генетической последовательности, который обозначает конец гена или оперона на геномной ДНК для транскрипции.

Термин "клетка-хозяин" означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции и подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин “клетка-хозяин” охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, которые происходят в ходе репликации.

Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают параметром “идентичность последовательности”. Для целей настоящего изобретения степень идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Применяемыми необязательными параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия EMBOSS с BLOSUM62). Выводимые данные в Needle, помеченные как “наиболее длинный идентичный участок” (полученные с применением опции – nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка – общее число гэпов в выравниваемом участке).

Термин "условия высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Термин "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.

Термин "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.

Термин "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.

Термин "условия низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 50°C.

Термин "условия очень низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C.

Термин “улучшенное свойство” означает характеристику, связанную с вариантом, который является улучшенным по сравнению с исходной молекулой, или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3, или по сравнению с протеазой, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без изменений в одном или нескольких указанных определенных положениях. Такие улучшенные свойства включают, но без ограничения, моющую эффективность, протеазную активность, профиль активности при разных температурах, термостабильность, профиль активности в зависимости от pH, стабильность pH, субстратную/кофакторную специфичность, улучшенные поверхностные свойства, субстратную специфичность, специфичность к продукту, повышенную стабильность, улучшенную стабильность в условиях хранения и химическую стабильность.

Термин “улучшенная протеазная активность” определен в данном документе как измененная протеазная активность (как определено выше), например, повышенная конверсия белка варианта протеазы, проявляющего изменение активности относительно (или по сравнению) с активностью исходной протеазы или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3, или относительно протеазы, имеющей идентичную аминокислотную последовательность указанного варианта, но без изменений в одном или нескольких указанных определенных положениях.

Термин “стабильность” включает стабильность при хранении и стабильность в ходе применения, т. е. в ходе процесса мытья, и отображает зависимость стабильности варианта протеазы в соответствии с настоящим изобретением от времени, например, насколько сохраняется активность при выдерживании варианта протеазы в растворе, в частности, в растворе моющего средства. На стабильность влияют многие факторы, например, pH, температура, композиция моющего средства, например, количество средства, усиливающего моющее действие, поверхностно-активных веществ и т.д. Стабильность протеазы можно измерить при помощи анализа, описанного в примере 2. Термин “улучшенная стабильность” или “повышенная стабильность” определен в данном документе, как проявление повышенной стабильности варианта протеазы в растворе, относительно стабильности исходной протеазы, относительно протеазы, имеющей идентичную аминокислотную последовательность указанного варианта, но без изменений в одном или нескольких указанных определенных положениях или относительно SEQ ID NO: 3. Термины “улучшенная стабильность” и “повышенная стабильность” включают “улучшенную химическую стабильность”, “стабильность в моющем средстве” или “улучшенную стабильность в моющем средстве”.

Термин “улучшенная химическая стабильность” определен в данном документе, как проявление сохранения ферментативной активности варианта фермента после периода инкубирования в присутствии химического вещества или химических веществ природного либо синтетического происхождения, которые снижают ферментативную активность исходного фермента. Улучшенная химическая стабильность может также быть следствием вариантов, которые являются более способными катализировать реакцию в присутствие таких химических веществ. В конкретном аспекте настоящего изобретения улучшенная химическая стабильность представляет собой улучшенную стабильность в моющем средстве, в частности, в жидком моющем средстве. Термин “стабильность в моющем средстве” или “улучшенная стабильность в моющем средстве” представляет собой, в частности, улучшенную стабильность протеазной активности, когда вариант протеазы по настоящему изобретению примешивают к составу жидкого моющего средства, особенно к составу жидкого моющего средства согласно таблице 1 и затем хранят при значениях температуры от 15 до 50°C, например, 20°C, 30°C или 40°C.

Термин “улучшенная активность при разных температурах” означает проявление вариантом изменения профиля зависящей от температуры активности при определенной температуре относительно профиля зависящей от температуры активности исходной молекулы, или относительно протеазы с SEQ ID NO: 3. Значение активности при разных температурах относится к мере эффективности варианта в усилении катализа реакции гидролиза в диапазоне температур. Вариант, более активный при разных температурах, приведет к повышению усиления скорости гидролиза субстрата композицией фермента, тем самым уменьшая необходимое время и/или уменьшая необходимую концентрацию активности фермента. Альтернативно, вариант со сниженной активностью при разных температурах будет усиливать ферментативную реакцию при низкой температуре, нежели чем при температурном оптимуме для исходной молекулы, определенный профилем зависящей от температуры активности исходной молекулы.

Термин “улучшенная моющая эффективность” определен в данном документе, как улучшенная моющая эффективность варианта протеазы в соответствии с настоящим изобретением относительно моющей эффективности исходной протеазы, относительно протеазы с SEQ ID NO: 3 или относительно протеазы, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без изменений в одном или нескольких из указанных определенных положений, например, при повышенном удалении пятен. Термин “моющая эффективность” включает моющую эффективность при стирке белья, а также, например, при мытье посуды. Моющую эффективность можно оценивать, как описанное в данном документе определение “моющая эффективность”.

Если не указано иное, термин "композиция моющего средства" включает универсальные средства для мытья или средства для мытья с высокой моющей способностью в форме гранул или порошка, в особенности очищающие моющие средства; универсальные средства для мытья в виде жидкости, геля или пасты, в особенности виды так называемых сверхсильных жидких моющих средств (HDL); жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды с низкой моющей способностью, в особенности тип с обильным пенообразованием; средства для машинного мытья посуды, включая различные таблетированные, гранулированные, жидкие и ополаскивающие типы для применения в быту и общественных учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие средства, включая типы антибактериальных средств для мытья рук, очищающие бруски, бруски мыла, ополаскиватели для полости рта, очищающие средства для зубов, шампуни для машин или ковров, средства для очищения ванной комнаты; шампуни и ополаскиватели для волос; гели для душа, пены для ванны; средства для очищения металлических поверхностей; а также вспомогательные очищающие средства, например, отбеливающие добавки и виды карандашей для удаления пятен или средств для предварительной обработки. Термин "композиция моющего средства" и "состав моющего средства" используют для обозначения смесей, предназначенных для использования в моющей среде для очистки загрязненных объектов. В некоторых вариантах осуществления данный термин используют в отношении стирки тканей и/или одежды (например, "моющие средства для стирки"). В альтернативных вариантах осуществления термин относится к другим моющим средствам, например, применяемым для очистки посуды, столовых приборов и т. д. (например, "моющие средства для мытья посуды"). Подразумеваю, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным составом или композицией моющего средства. Термин “композиция моющего средства” не подразумевает ограничение до композиций, которые содержат поверхностно-активные вещества. Подразумевают, что в дополнение к вариантам в соответствии с настоящим изобретением термин охватывает моющие средства, которые могут содержать, например, поверхностно-активные вещества, средства, усиливающие моющее действие, хелаторы или хелатирующие средства, отбеливающую систему или отбеливающие компоненты, полимеры, кондиционеры для тканей, пенообразователи, подавители образования мыльной пены, красители, отдушку, ингибиторы потускнения, оптические осветлители, бактерициды, фунгициды, средства, суспендирующие загрязнение, антикоррозионные средства, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, трансферазу(трансферазы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, виды синьки и флуоресцентные красители, антиоксиданты и солюбилизаторы.

Термин "ткань" охватывает любой текстильный материал. Следовательно, подразумевается, что термин охватывает одежду, а также ткани, пряжу, волокна, нетканые материалы, природные материалы, синтетические материалы и любой другой текстильный материал.

Термин "текстиль" относится к сотканным тканям, а также штапельным волокнам и нитям, подходящим для преобразования или использования в качестве пряжи, сотканных, трикотажных и нетканых тканей. Термин охватывает пряжу, изготовленную из натуральных, а также синтетических (например, искусственных) волокон. Термин "текстильный материал" является общим термином для волокон, промежуточных продуктов из пряжи, пряжи, тканей и продуктов, изготовленных из тканей (например, одежда или другие изделия).

Термин "композиции моющего средства для любых материалов, кроме ткани" включает композиции моющего средства для любых поверхностей, кроме текстильных, в том числе без ограничения, композиции для очистки твердых поверхностей, к примеру композиции моющего средства для мытья посуды, композиции моющего средства для гигиены полости рта, композиции моющего средства для зубов и очищающие композиции для личной гигиены.

Термин "эффективное количество фермента" относится к количеству фермента, необходимому для достижения ферментативной активности, требуемой в конкретном применении, например, в определенной композиции моющего средства. Специалисты в данной области техники легко определяют такие эффективные количества, которые зависят от многих факторов, например, используемый конкретный фермент, применение для очистки, композиция конкретной композиции моющего средства и независимо от того, требуется ли жидкая или сухая (например, гранулированная, брусочная) композиция и т. п. Термин "эффективное количество" варианта протеазы относится к количеству варианта протеазы, описанного в данном документе ранее, которое достигает необходимого уровня ферментативной активности, например, в определенной композиции моющего средства.

Термин “жесткость воды” или “степень жесткости”, или “dH”, или “°dH”, используемый в данном документе, относят к немецким градусам жесткости. Один градус определяют как 10 миллиграммов на литр воды.

Термин "подходящие условия стирки" используют в данном документе для указания условий, в особенности температуры стирки, времени, техник стирки, концентрации моющего средства, типа моющего средства и жесткости воды, фактически применяемых в домашнем хозяйстве, в сегменте рынка моющих средств.

Термин "вспомогательные материалы" означает любой жидкий, твердый или газообразный материал, выбранный для определенного типа необходимой композиции моющего средства и формы продукта (например, жидкость, гранулы, порошок, брусок, паста, спрей, таблетка, гель или пенная композиция), где материалы также предпочтительно совместимые с ферментом варианта протеазы, применяемого в композиции. В некоторых вариантах осуществления гранулированные композиции имеют "уплотненную" форму, тогда как в других вариантах осуществления жидкая композиция является в "концентрированной" форме.

Термин “пятновыводящий фермент”, используемый в данном документе, описывает фермент, который способствует удалению пятна или загрязнения с ткани или твердой поверхности. Пятновыводящие ферменты действует на специфические субстраты, например, протеаза на белок, амилаза на крахмал, липаза и кутиназа на липиды (жиры и масла), пектиназа на пектин и гемицеллюлазы на гемицеллюлозу. Пятна часто представляют собой осаждения сложных смесей с разными компонентами, которые либо приведут в результате к местному обесцвечиванию материала самого по себе, или которые оставит липкую поверхность на объекте, которая может притягивать загрязнения, растворенные в моющей жидкости, таким образом, что в результате происходит обесцвечивание испачканной области. Когда фермент действует на специфический субстрат, присутствующий в пятне, фермент разрушает или частично разрушает этот субстрат, таким образом, способствуя удалению загрязнений и компонентов пятен, относящихся к субстрату, в течение процесса стирки. Например, когда протеаза действует на пятно от травы, она разрушает белковые компоненты в траве и позволяет зеленому/коричневому цвету высвобождаться во время стирки.

Термин “сниженное количество” в этом контексте означает, что количество компонента является меньшим, чем количество, которое будет применено в контрольном способе при прочих таких же условиях. В предпочтительном варианте осуществления количество снижают, например, по меньшей мере на 5%, к примеру по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20% или иные значения, описанные в других разделах данного документа.

Термин система с “низкой концентрацией моющего средства” предусматривает моющие средства, где в воде для стирки присутствуют менее чем приблизительно 800 ppm компонентов моющего средства. Моющие средства из Азии, например, Японии, как правило, рассматриваются как системы с низкой концентрацией моющего средства.

Термин система со “средней концентрацией моющего средства” предусматривает моющие средства, где в воде для стирки присутствуют от приблизительно 800 ppm и до приблизительно 2000 ppm компонентов моющего средства. Моющие средства из Северной Америки, как правило, рассматриваются как системы со средней концентрацией моющего средства.

Термин система с “высокой концентрацией моющего средства” предусматривает моющие средства, где в воде для стирки присутствуют больше чем приблизительно 2000 ppm компонентов моющего средства. Европейские моющие средства, как правило, рассматриваются как системы с высокой концентрацией моющего средства.

Условные обозначения для указания вариантов

В контексте настоящего изобретения зрелый полипептид, раскрытый в SEQ ID NO: 3, применяется для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой протеазе. Аминокислотную последовательность другой протеазы выравнивают со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 3, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в зрелом полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 3, определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой протеазе можно определить путем выравнивания последовательностей нескольких полипептидов с использованием нескольких компьютерных программ, в том числе без ограничения, MUSCLE (сравнение нескольких последовательностей по log-ожиданию; версия 3.5 или более поздняя; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более поздняя; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) и EMBOSS EMMA, в которой применяется ClustalW (1.83 или более поздняя; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с применением их соответствующих параметров по умолчанию.

Если другой фермент отличается от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3 так, что с помощью традиционного сравнения на основании последовательностей невозможно обнаружить их родство (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), можно применять другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Большей чувствительности поиска на основании последовательности можно достичь с применением программ поиска, которые применяют вероятностные представления семейств полипептидов (профилей) для поиска по базам данных. Например, программа PSI-BLAST создает профили посредством итеративного процесса поиска по базам данных и способна обнаруживать отдаленные гомологи (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большей чувствительности можно достичь, если семейство или суперсемейство для данного полипептида имеет одного или несколько представителей в базах данных структуры белков. Программы, например, GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используют информацию из ряда источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве данных, вводимых в нейронную сеть, с помощью которой предсказывают структурную укладку запрашиваемой последовательности. Подобным образом, способ по Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно применять для выравнивания последовательности с неизвестной структурой с моделями суперсемейств, присутствующими в базе данных SCOP. Эти выравнивая можно, в свою очередь, применять для создания моделей гомологии для полипептида, и точность таких моделей можно оценивать с помощью ряда инструментов, разработанных для этой цели.

Для белков с известной структурой доступны несколько инструментов и ресурсы для отыскания и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков в SCOP были выравнены по структуре, и результаты этих выравниваний находятся в открытом доступе, а также доступны для скачивания. Структуры двух или более белков можно выравнять с применением ряда алгоритмов, например, выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторного удлинения (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и выполнение этих алгоритмов можно дополнительно применять для составления запросов по представляющей интерес структуре в базах данных структуры с целью нахождения возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

При описании вариантов по настоящему изобретению описанная ниже номенклатура адаптирована для простоты упоминания. Используются принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращения для аминокислот. Положения аминокислоты указаны #₁, #_2,и т. д.

Замены. В отношении аминокислотной замены применяют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замена серина в положении #₁ на триптофан обозначается как “Ser#₁Trp” или “S#₁W”. Несколько мутаций разделяют знаками сложения (“+”) или запятыми (,), например, “Ser#₁Trp + “Ser#₂Pro” или S#₁W, S#₂P, которые представляют замены в положениях #₁ и #₂ серина (S) на триптофан(W) и пролин(P), соответственно. Если в заданном положении можно заместить более одной аминокислоты, их перечисляют в скобках, как например, [X] или {X}. Таким образом, если и Trp, и Lys в соответствии с настоящим изобретением можно заменить вместо аминокислоты, занимающей положение #₁, это обозначают как X#₁ {W, K} или X#₂ [W, K], где X указывает на то, что разные протеазы могут быть исходной молекулой, например, такой как протеаза с SEQ ID NO 3 или протеаза, которая по меньшей мере на 70% идентична ей. Таким образом, в некоторых случаях варианты представлены как #₁ {W, K} или X#₂P, указывая на то, что заменяемые аминокислоты варьируют в зависимости от исходной молекулы.

Делеции. В отношении делеции аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция серина в положении #₁ обозначается как “Ser#₁*” или “S#₁*”. Несколько делеций разделяют знаками сложения (“+”) или запятыми, например, “Ser#₁* + Ser#₂*” или “S#₁*, S#₂*”.

Вставки. Вставка дополнительного аминокислотного остатка, такого как, например, лизин после G#₁ может быть указанной как: Gly#₁GlyLys или G#₁GK. Альтернативно, вставка дополнительного аминокислотного остатка, такого как, например, лизин после G#₁ может быть указанной как: *#₁aL. Когда вставляют более одного аминокислотного остатка, такого как, например, Lys и Ala после #₁ это может быть указанным как: Gly#₁GlyLysAla или G#₁GKA. В таких случаях вставленный(ые) аминокислотный(ые) остаток(и) также можно нумеровать путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам), в этом примере: *#₁aK *#₁bA.

Несколько изменений. Варианты, содержащие несколько изменений, разделяют знаками сложения (“+”) или запятыми (,), например, “Ser#₁Trp+Ser#₂Pro” или “S#₁W, S#₂P” представляют замену серина в положениях #₁ и #₂ на триптофан и пролин, соответственно, как описано выше.

Разные изменения. Поскольку разные изменения можно ввести в какое-либо положение, разные изменения разделяют запятой, например, “Ser#₁Trp, Lys” или S#₁W, K представляет замену серина в положении #₁ на триптофан или лизин. Таким образом, “Ser#₁Trp, Lys + Ser#₂Asp” обозначает следующие варианты: “Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”, “Ser#₁Lys+Ser#₂Pro” или S#₁W, K + S#₂D.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение касается вариантов протеазы, содержащих замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75% и менее чем на 100%, и где, вариант обладает протеазной активностью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что варианты протеазы, содержащие одну или несколько замен, соответствующих положениях 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, имеют ранее непредвиденную улучшенную стабильность в моющем средстве по сравнению с протеазой, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замен(ы) в одном или нескольких указанных определенных положениях или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3. Аминокислоты, соответствующие положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, формируют часть петли активного центра, соответствующую положениям 170-180 из SEQ ID NO: 3, которая определяет части субстрат-связывающего кармана S1, см. фигуру 1. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает варианты протеазы, содержащие замену в одном или нескольких (например, некоторых) положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179, где вариант обладает протеазной активностью. Новые варианты протеазы, содержащие одну или несколько замен в 170-180 участке петли (нумерация из SEQ ID NO: 3), получали и исследовали на стабильность в моющем средстве, как описано в “Материалах и способах”, и авторы демонстрировали, что одна или несколько замен одной или нескольких аминокислот в положении, соответствующем положениям 171, 173, 175 или 179 зрелого полипептида SEQ ID NO: 3, значительно улучшали стабильность в моющем средстве по сравнению с протеазой, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замены в одном или нескольких указанных определенных положениях, или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3.

В дополнение к улучшенной стабильности, варианты в соответствии с настоящим изобретением неожиданно могут обладать улучшенной моющей эффективностью. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления варианты в соответствии с настоящим изобретением обладают улучшенной стабильностью в моющем средстве и/или улучшенной моющей эффективностью по сравнению с протеазой, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замены в одном или нескольких указанных определенных положениях, или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO:3. В предпочтительном варианте осуществления вариант протеазы содержит замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант по меньшей мере на 70% идентичен протеазе с SEQ ID NO: 3 (TY145 от Bacillus sp.). Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к варианту протеазы, содержащего замену в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO 3; и извлечению варианта. Таким образом, настоящее изобретение относиться к такому варианту, который содержит замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант ,последовательность которого по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления вариант представляет собой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 70% идентичен кодирующей последовательности зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1 или последовательности, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления вариант в соответствии с настоящим изобретением представляет собой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 70% идентична, например, такая как по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична зрелому полинуклеотиду с SEQ ID NO: 1.

Конкретный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего замену в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант представляет собой исходную протеазу, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, например, по меньшей мере на 75%, например, такую как по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6% или на 100% идентичную SEQ ID NO: 3. В одном предпочтительном варианте осуществления вариант протеазы представляет собой вариант TY-145 (SEQ ID NO 3), содержащий замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к варианту, содержащему замену в двух, трех, четырех или пяти положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175, 179 или 180 в SEQ ID NO: 3. Предпочтительный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 3. Конкретный предпочтительный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего замену одной или нескольких аминокислот в петле, выбранных из группы, состоящей из Cys, Val, Gln, Thr, Glu, His, Lys, Met, Asn, Tyr, Ala, Pro или Trp, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3. Конкретный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего замену одной или нескольких аминокислот в петле, выбранных из группы, состоящей из Cys, Val, Gln, Thr, Glu, His, Lys, Met, Asn, Tyr, Ala, Pro и Trp, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 3. Другой конкретный предпочтительный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из S171{W, K, E, N}; S173P; S175 {A, V, P} или G179{C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%,по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 3. Еще более предпочтительный вариант осуществления касается варианта протеазы, содержащего одну или обе замены из 173P и/или S175P с SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% идентична SEQ ID NO: 3.

В одном аспекте вариант протеазы содержит замену в положении 171, в предпочтительном аспекте вариант содержит замену в положении 171 на W, K, E или N, в другом предпочтительном аспекте вариант содержит W в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171W, где исходная молекула представляет собой зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит K в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171K, где исходная молекула представляет собой зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит E в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171E, где исходная молекула представляет собой зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит N в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171N, где исходная молекула представляет собой зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3

В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 171 на W, K, E или N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит W в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171W, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит K в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171K, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит E в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171E, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит N в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В еще одном дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 171 на W, K, E или N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит W в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171W, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит K в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171K, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит E в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171E, где вариант, последовательность которого по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит N в положении 171, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S171N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В одном аспекте вариант протеазы содержит замену в положении 173, в предпочтительном аспекте вариант содержит замену в положении 173 на P, в другом предпочтительном аспекте вариант содержит замену S173P, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит P в положении 173, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S173P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В еще одном дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 173 на P, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S173P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В одном аспекте вариант протеазы содержит замену в положении 175, в предпочтительном аспекте вариант содержит замену в положении 175 на A, V или P, в другом предпочтительном аспекте вариант содержит A в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175A, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит V в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175V, где исходная молекула представляет собой зрелый полипептид с SEQ ID NO: 3. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит P в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175P, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3.

В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 175 на A, V или P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит A в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175A, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит V в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175V, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит P в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В еще одном дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 175 на A,V или P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит A в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175A, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит V в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175V, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит P в положении 175, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену S175P, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит C в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179C, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на C, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179C, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на C, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179C, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 2, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит V в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179V, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на V, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179V, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на V, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179V, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит Q в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Q, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на Q, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Q, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на Q, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Q, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит S в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179S, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на S, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179S, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на S, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит T в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179T, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на T, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179T, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на T, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179T, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит E в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179E, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на E, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179E, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на E, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179E, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит H в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179H, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на H, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179H, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на H, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179H, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3 или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит K в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179K, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на K, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179K, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на K, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179K, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит M в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179M, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на M, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179M, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на M, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179M, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит N в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179N, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на N, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на N, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179N, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит A в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179A, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на A, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179H, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на A, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179A, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом предпочтительном аспекте вариант содержит Y в положении 179, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Y, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 179 на Y, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Y, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом аспекте вариант содержит замену в положении 179 на Y, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену G179Y, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В одном аспекте вариант протеазы дополнительно содержит замену в положении 180, в предпочтительном аспекте вариант содержит замену в положении 180 на Y, в другом предпочтительном аспекте вариант дополнительно содержит замену F180Y, где исходная молекула представляет собой полипептид с SEQ ID NO: 3. В дополнительном аспекте вариант содержит замену в положении 180 на Y, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену F180Y, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100%. В другом предпочтительном аспекте вариант содержит Y в положении 180, в еще одном предпочтительном аспекте вариант содержит замену F180Y, где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 3, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, но менее чем на 100% и обладает повышенной стабильностью относительно протеазы с SEQ ID NO: 3, или исходной протеазы, аминокислотная последовательность которой идентична указанному варианту, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171 и 173, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171 и 175, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173 и 175, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 175 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 175 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173 и 175, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 175 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 175 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 179 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173, 175 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173, 175 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 175, 179 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 и 179, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 173, 175, 179 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит замены в положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175, 179 и 180, таких как описано выше.

В другом аспекте вариант содержит одну или несколько (некоторые) замен, выбранных из группы, состоящей из S171 {W, K, E, N}, S173 {P}, S175 {A, V, P} или G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y}. В другом аспекте вышеупомянутый вариант дополнительно содержит замену F180Y.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175A + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175V + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175A в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175V в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175P в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175A+ F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175V+ F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S173P + S175P+ F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175AV+ G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175V+ F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175V + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175V + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175V + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175P + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175A + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175V + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171W + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171K + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171E + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант содержит замены S171N + S173P + S175P + G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} + F180Y в полипептиде с SEQ ID NO: 3.

Вариант может дополнительно содержать замену в одном или нескольких (некоторых) других положениях. Например, варианты могут содержать изменение в положении, соответствующем положениям, выбранным из группы, состоящей из 39, 40, 70, 74, 81, 102, 121, 132, 137, 144, 155, 159, 162, 174, 176; 177, 241, 247, 256, 274, 286, 297 с SEQ ID NO 3. В одном варианте осуществления вариант по настоящему изобретению содержит одну из следующих замен: Y39D; T40{D,P}; Q70N; T74M; L81{F,H,V}; A102T; I121{V,T}; G132 {I,E}; I137{M;E}; S144{Q,R}; D155N; G159S; V162R; G174{S,T}; N176G; T177S; T241P; I247M; H256F;S274I; V286Q; T297P, где каждое положение соответствует положению с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте вариант в соответствии с настоящим изобретением содержит замены в одном или нескольких (например, некоторых) положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179. В другом аспекте вариант в соответствии с настоящим изобретением содержит замены в двух положениях, соответствующих любым положениям из 171, 173, 175, 179 и 180. В другом аспекте вариант в соответствии с настоящим изобретением содержит замены в трех положениях, соответствующих любым положениям из 171, 173, 175, 179 и 180. В другом аспекте вариант в соответствии с настоящим изобретением содержит замены в четырех положениях, соответствующих любым положениям из 171, 173, 175, 179 и 180. В другом аспекте вариант в соответствии с настоящим изобретением содержит замены в каждом положении, соответствующем положениям 171, 173, 175, 179 и 180.

Варианты могут дополнительно содержать одно или несколько дополнительных изменений в одном или нескольких (например, некоторых) других положениях. Аминокислотные изменения могут быть незначительного характера, то есть представлять собой консервативные аминокислотные замены или вставки, которые не оказывают существенного влияния на укладку и/или активность белка; небольшие делеции, как правило, 1-30 аминокислот; небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как амино-концевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид до 20-25 остатков или небольшое удлинение, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда или другой функции, такое как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Замены аминокислот, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, в The Proteins, Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Asn/Gln, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Glu/Gln, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

Альтернативно, изменения аминокислот имеют такой характер, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термостабильность полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т. п.

Например, варианты могут содержать замену в положении, соответствующем любому положению из 171, 173, 175 или 179, и дополнительно содержать изменение в любых положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 39, 40, 70, 74, 81, 102, 121, 132, 137, 144, 155, 159, 162, 174, 176; 177, 180, 241, 247, 256, 274, 286, 297. В предпочтительном варианте осуществления изменение в любых положениях, выбранных из группы, состоящей из 39, 40, 70, 74, 81, 102, 121, 132, 137, 144, 155, 159, 162, 174, 176; 177, 180 241, 247, 256, 274, 286, 297, представляет собой замену. В конкретном предпочтительном варианте осуществления варианты в соответствии с настоящим изобретением содержат любые из следующих замен: S171 {W, K, E, N}, S173P, S175 {A, V, P} или G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в SEQ ID NO: 3, где вариант дополнительно содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из: Y39D; T40{D,P}; Q70N; T74M; L81{F,H,V}; A102T; I121{V,T}; G132 {I,E}; I137{M;E}; S144{Q,R}; D155N; G159S; V162R; G174{S,T}; N176G; T177S; F180Y; T241P; I247M; H256F;S274I; V286Q; T297P.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения варианты в соответствии с настоящим изобретением содержат любые из следующих замен по сравнению с SEQ ID NO 3:

S171N S175P

I121V S175P

L81V S175P

A102T S175P

I137E S175P

S175A G179S

I121V S175A

L81F S175A

L81H S175A

L81V S175A

A102T S175A

I137E S175A

S144Q S175P

S144Q S175A

S144R G179Q

I121T S175P

S144R S171N

S173P S274I

I137M S173P

S171N S173P

L81F S173P

L81H S173P

A102T S173P

S144Q S173P

S144R F180Y

I137E S173P

S173P S175P F180Y

S173Y G174S S175A F180Y

S173P G174T S175V T177S F180Y

S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S173P T241P

G179S F180Y G183A A187V

S173Y G174S S175A F180Y T241P

D155N G159S S173Y G174S S175A F180YB

S173Y G174S S175A F180Y S274I

S173Y G174S S175A F180Y V286Q

T40D S173Y G174S S175A F180Y

V162R S173P G174T S175V T177S F180Y

I121V S173P G174T S175V T177S F180Y

L81V S173P G174T S175V T177S F180Y

A102T S173P G174T S175V T177S F180Y

S173P G174T S175V T177S F180Y T241P

I137E S173P G174T S175V T177S F180Y

S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y

Q70N S173P G174T S175V T177S F180Y

D155N G159S S173P G174T S175V T177S F180Y

S173P G174T S175V T177S F180Y S274I

S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q

T40D S173P G174T S175V T177S F180Y

S171N S173P G174T S175V T177S F180Y

V162R S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

I121V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

L81V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

A102T S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P

I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

Q70N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

D155N G159S S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I

S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q

T40D S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

I121V I137E S173Y G174S S175A F180Y

L81V I137E S173Y G174S S175A F180Y

I137E S173Y G174S S175A F180Y T241P

Q70N I137E S173Y G174S S175A F180Y

I137E S173Y G174S S175A F180Y S274I

I137E S173Y G174S S175A F180Y T297P

I121V I137E S173P G174T S175V T177S F180Y

L81V I137E S173P G174T S175V T177S F180Y

I137E S173P G174T S175V T177S F180Y T241P

Q70N I137E S173P G174T S175V T177S F180Y

I137E S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q

I137E S173P G174T S175V T177S F180Y T297P

I137E S171N S173P G174T S175V T177S F180Y

I137E S173P G174T S175A T177S F180Y

I121V I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

Q70N I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I

I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q

I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P

I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

I137E S173P G174K S175A N176G T177S F180Y

V162R S173Y G174S S175A F180Y

A102T S173Y G174S S175A F180Y

G132I S173P G174T S175V T177S F180Y

S173P G174T S175V T177S F180Y T297P

S173P G174T S175A T177S F180Y

S173P S175A

I137E S144Q S173Y G174S S175A F180Y

T40L I137E S173Y G174S S175A F180Y

I137E S173Y S175A F180Y

I137E S173P S175V T177S F180Y

I137E S173P S175P N176G T177S F180Y

S171N S173Y G174S S175A F180Y

S173P G174K S175A N176G T177S F180Y

I137E S173Y G174S S175A F180Y V286Q

I137E S173P G174T S175V T177S F180Y S274I

T74M I137E S173P

T79I I137E S173P

L81G S173P

L34I I137E S173P

Y39D I137E S173P

T40P I137E S173P

I137E S173P I247M

I137E S173P H256F

I137E S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y

I137E S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S173Y G174S S175P F180Y

I137E S173Y G174S S175P F180Y

S173P G174T S175P T177S F180Y

I137E S173P G174T S175P T177S F180Y

I137E S173P G174T S175P T177S F180Y T297P

V162R S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P

I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P

I137E S173P S175P F180Y

V162R S173P S175P F180Y

S173P S175P F180Y S274I

S173P S175P F180Y T241P

S173P S175P F180Y T297P

S173P S175P F180Y V286Q

I137E S173Y G174S S175A F180Y

S144Q S173Y G174S S175A F180Y

Q70N S173Y G174S S175A F180Y

I121V S173Y G174S S175A F180Y

L81V S173Y G174S S175A F180Y

G132I S173P G174K S175P N176G T177S F180Y

S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P

Существенные аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении протеазной активности для идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный центр для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего центра. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Об идентичности существенных аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом. В TY-145 (SEQ ID NO: 3) каталитическая триада, включающая аминокислоты D35, H72 и S251 является существенной для протеазной активности фермента.

В варианте осуществления вариант обладает улучшенной каталитической активностью по сравнению с исходным ферментом.

В варианте осуществления вариант обладает улучшенной каталитической активностью по сравнению с исходным ферментом или по сравнению с протеазой, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замен в одном или нескольких из указанных определенных положений или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3, где стабильность измеряют в примере 2, как описано в “Материалах и способах” в данном документе.

В варианте осуществления вариант в соответствии с настоящим изобретением обладает улучшенной стабильностью по сравнению с исходным ферментом или по сравнению с протеазой, имеющей идентична аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замен в одном или нескольких из указанных определенных положений или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3.

Исходные протеазы

Вариант протеазы

Термин “вариант” и термин “вариант протеазы” определены выше.

Гомологичные последовательности протеазы

Для целей настоящего изобретения гомологию между двумя аминокислотными последовательностями в этом контексте описывают параметром “идентичность”, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша, как описано выше. Выводимые данные при рутинной процедуре, кроме аминокислотного выравнивания представляют расчет "процента идентичности" между двумя последовательностями.

Основываясь на этом описании, специалист в данной области легко определит подходящие гомологичные протеазы, которые в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы.

Практически гомологичные варианты исходных протеаз могут иметь одну или более (несколько) аминокислотных замен, делеций и/или вставок, в данном контексте термин “одну или более” используется взаимозаменяемо с термином “несколько”. Эти изменения предпочтительно являются незначительного характера, то есть представляют собой консервативные аминокислотные замены, как описано выше, или другие замены, которые не оказывают значительного влияния на трехмерную укладку и активность белка или полипептида; небольшие делеции, как правило, размером от 1 до приблизительно 30 аминокислот и небольшие удлинения на амино- или карбокси-конце, такие как метиониновый остаток на амино-конце, небольшие линкерные пептиды размером до 20-25 остатков или небольшое удлинение, которое облегчает очистку (аффинная метка), такое как полигистидиновый участок или белок A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. См. также, в общих чертах, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Хотя описанные выше изменения предпочтительно являются незначительного характера, такие изменения также могут быть существенного характера, такими как слияние более крупных полипептидов до 300 аминокислот или более, в обоих случаях в виде удлинений амино- или карбокси-конца.

Исходная протеаза может содержать или состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или ее аллельного варианта, или их фрагмента обладающего протеазной активностью. В одном аспекте исходная протеаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Исходная протеаза может представлять собой (a) полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична зрелому полипептиду с SEQ ID NO: 3; (b) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной или высокой жесткости с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью с SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2 или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii), или (с) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична кодирующей последовательности зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1.

В одном аспекте исходная протеаза имеет последовательность, идентичную полипептиду с SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6% или на 100%, которая обладает протеазной активностью.

В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной протеазы отличается не более чем 10 аминокислотами, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, от зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте исходная молекула содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В другом аспекте исходная молекула содержит или состоит из аминокислот 1-311 в SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная протеаза кодируется полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень низкой жесткости, условиях низкой жесткости, условиях умеренной жесткости, условиях умеренно-высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii), (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Полинуклеотид с SEQ ID NO: 1 или его подпоследовательность, а также полипептид с SEQ ID NO: 3 или его фрагмент можно использовать для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей исходную молекулу у штаммов разных родов или видов согласно способам, хорошо известным из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки после стандартных процедур Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но должны иметь длину по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, например, имеет длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды, как правило, метят для выявления соответствующего гена (например, ³²P, ³H, ³⁵S, биотином или авидином). Настоящее изобретение охватывает такие зонды.

Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких прочих штаммов, можно подвергнуть скринингу в отношении ДНК, которая гибридизируется с зондами, описанными выше и кодирует исходную молекулу. Геномную или другую ДНК из таких прочих штаммов можно разделить посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести и иммобилизировать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизируются c SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель применяется в Саузерн-блоттинге.

В контексте настоящего изобретения гибридизация означает, что в условиях от очень низкой до очень высокой жесткости полинуклеотид гибридизируется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1; (ii) кодирующей зрелый полипептид последовательностью с SEQ ID NO: 1, (iii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2; (iv) комплементарной ей последовательностью полной длины или (v) ее подпоследовательностью. Молекулы, с которыми в этих условиях гибридизируется зонд на основе нуклеиновой кислоты, можно выявить с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных из уровня техники.

В одном аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую зрелый полипептид последовательность с SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой длинный фрагмент от 80 до 1140 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, например, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или 1100 нуклеотидов в длину. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид с SEQ ID NO: 2; его зрелый полипептид или его фрагмент. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 1 или последовательность, кодирующую зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления исходная молекула кодируется полинуклеотидом, имеющим последовательность, идентичную кодирующей последовательности зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1 или последовательности, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 71%, например, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6% или на 100%.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором участок одного полипептида слит с N-концом или C-концом участка другого полипептида.

Исходная молекула может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида согласно настоящему изобретению. Слитый полипептид получают путем слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Методики получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды с тем, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются посттрансляционно (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; и Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; и Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Исходную молекулу можно получить из организмов любого рода. В контексте настоящего изобретения термин “полученный из”, который используется в данном документе применительно к определенному источнику, будет означать, что исходная молекула, кодируемая полинуклеотидом, продуцируется тем же источником или штаммом, в который был вставлен полинуклеотид из источника. В одном аспекте исходная молекула секретируется за пределы клетки.

Исходная молекула может представлять собой бактериальную протеазу. Например, исходная молекула может представлять собой полипептид грамположительных бактерий, такой как протеаза Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces, полипептид грамотрицательных бактерий, такой как протеаза Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

В одном аспекте исходная молекула представляет собой протеазу Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

В одном аспекте исходная молекула представляет собой протеазу Bacillus sp., например, протеазу с SEQ ID NO: 3 или зрелый полипептид с SEQ ID NO 2.

Штаммы этих видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (ATCC), Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ), Центральное бюро плесневых культур (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований в Северном региональном исследовательском центре (NRRL).

Исходную молекулу можно идентифицировать и получить из других источников, в том числе микроорганизмов, выделенных из природной среды (например, почвы, компостов, воды и т. д.), или образцов ДНК, полученных непосредственно из природных материалов (например, почвы, компостов, воды и т. д.), с использованием вышеупомянутых зондов. Методики выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из естественных сред обитания хорошо известны из уровня техники. Полинуклеотид, кодирующий исходную молекулу, можно затем получить подобным образом путем скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК другого микроорганизма или образца смешанной ДНК. После того как полинуклеотид, кодирующий исходную молекулу, был выявлен зондом(ами), полинуклеотид можно выделить или клонировать с использованием методик, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).

Получение вариантов

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта, обладающего протеазной активностью, включающим: (a) введение в исходную протеазу замены в одном или нескольких (например, некоторых) положениях,, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где вариант обладает протеазной активностью и (b) извлечение варианта.

Варианты можно получить с использованием любой процедуры мутагенеза, известной из уровня техники, такой как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, случайный мутагенез, шаффлинг и т. д.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой методику, в которой одну или несколько (например, некоторое количество) мутаций вводят в один или несколько определенных сайтов в полинуклеотиде, кодирующем исходную молекулу.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vitro с помощью ПЦР, включающей использование олигонуклеотидных праймеров, содержащих необходимую мутацию. Сайт-направленный мутагенез можно также осуществлять in vitro путем кассетного мутагенеза, включающего расщепление рестрикционным ферментом по сайту в плазмиде, содержащей полинуклеотид, кодирующий исходную молекулу, и последующего лигирования олигонуклеотида, содержащего мутацию, в полинуклеотид. Обычно рестрикционный фермент, который расщепляет плазмиду и олигонуклеотид, является одним и тем же, обеспечивающим возможность лигирования друг с другом липких концов плазмиды и вставки. См., например, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955 и Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно также проводить in vivo с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, публикацию заявки на патент США № 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290 и Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

Любую процедуру сайт-направленного мутагенеза можно использовать в настоящем изобретении. Доступны многие коммерческие наборы, которые можно использовать для получения вариантов.

Конструирование синтетического гена включает в себя in vitro синтез молекулы полинуклеотида, предназначенной для кодирования представляющего интерес полипептида. Синтез гена можно осуществлять с использованием ряда методик, таких как мультиплексная микрочиповая технология, описанная Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) и подобных технологий, где олигонуклеотиды синтезируют и собирают на фотопрограммируемых микропотоковых чипах.

Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществить и исследовать при помощи известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, как, например, таковых, раскрытых в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 или WO 95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР с использованием неточной полимеразы, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US 5223409; WO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединить с автоматизированными способами скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов, известных из уровня техники. Эти способы обеспечивают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.

Конструирование полусинтетического гена проводят путем объединения аспектов конструирования синтетических генов, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или случайного мутаганеза, и/или шаффлинга. Полусинтетическая конструкция характеризуется способом, в котором используют фрагменты полинуклеотида, которые синтезируют в сочетании с методиками ПЦР. Определенные участки генов можно, таким образом, синтезировать de novo, в то время как другие участки можно амплифицировать с использованием сайт-специфических мутагенных праймеров, тогда как остальные участки можно подвергнуть амплификации ПЦР с использованием неточной полимеразы или ПЦР без использования неточной полимеразы. Подпоследовательности полинуклеотидов можно затем подвергнуть шаффлингу.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу получения варианта протеазы, включающего введение в исходную протеазу замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3 и извлечению варианта.

Другой вариант осуществления касается способа получения варианта протеазы, включающего замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 в SEQ ID NO: 3, особенно способа, как описано выше, где исходная протеаза выбрана из группы, состоящей из полипептида, содержащего последовательность, которая по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 99,6% идентична SEQ ID NO: 3;

полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной или высокой жесткости с (i) кодирующей зрелый полипептид последовательностью с SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2, или (iii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) или (ii);

полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична кодирующей последовательности зрелого полипептида с SEQ ID NO: 1 или последовательности, кодирующей зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2 и

фрагмента зрелого полипептида с SEQ ID NO: 2, который обладает протеазной активностью.

Следовательно, конкретный аспект касается способа получения варианта протеазы, включающего введение в исходную протеазу замен одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где замену (ы) осуществляют в SEQ ID NO: 3 и где замены выбирают из группы, состоящей из S171 {W, K, E, N}, S173 {P}, S175 {A, V, P} или G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y}. Кроме того, дополнительную замену можно вводить в положение, соответствующее 180 из SEQ ID NO: 3, особенно замену F180Y.

Один аспект настоящего изобретения относится к способам получения вариантов в соответствии с настоящим изобретением, где способ включает замену по меньшей мере одной аминокислоты в петле, соответствующей положениям 171, 173, 175 или 179 из SEQ ID NO: 3, где (a) вариант имеет последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 70% и меньше чем на 100%, и (b) вариант обладает протеазной активностью.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 171 из SEQ ID NO: 3 и дополнительно содержит замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 173, 175, 179 и 180 из SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 173 из SEQ ID NO: 3 и дополнительно содержит замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 175, 179 и 180 из SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 175 из SEQ ID NO: 3 и дополнительно содержит замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 179 и 180 из SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 179 из SEQ ID NO: 3 и дополнительно содержит замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 и 180 из SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 180 из SEQ ID NO: 3 и дополнительно содержит замены в одном или нескольких положениях, соответствующих положениям 171, 173, 175 и 179 из SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 171 из SEQ ID NO: 3 на аминокислоту, выбранную из {W, K, E, N}.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 173 из SEQ ID NO: 3 на P.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 175 из SEQ ID NO: 3 на аминокислоту, выбранную из {A, V, P}.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, содержит замену в положении, соответствующем положению 179 из SEQ ID NO: 3 на аминокислоту, выбранную из {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y}.

В одном варианте осуществления вариант, полученный в соответствии с указанным способом, может дополнительно содержать замену в положении, соответствующем положению 180 из SEQ ID NO: 3 на Y.

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим вариант по настоящему изобретению.

Конструкции нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для регуляторных последовательностей.

С полинуклеотидом можно производить манипуляции рядом способов для обеспечения экспрессии варианта. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы рекомбинантных ДНК, хорошо известны из уровня техники.

Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который узнается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию варианта. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в бактериальной клетке-хозяине являются промоторы, полученные из гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), генов xylA и xylB Bacillus subtilis, гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac-оперон E. coli, trc-промотор E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), ген агаразы Streptomyces coelicolor (dagA) и ген прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а также tac-промотор (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94 и в Sambrook et al., 1989, выше. Примеры тандемных промоторов раскрыты в WO 99/43835.

Регуляторная последовательность может также представлять собой терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином с терминацией транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3’концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно использовать любой терминатор, функционирующий в клетке-хозяине.

Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получают из генов щелочной протеазы Bacillus clausii (aprH), альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL) и рибосомной РНК Escherichia coli (rrnB).

Регуляторная последовательность может также представлять собой участок, стабилизирующий мРНК, расположенный ниже промотора и выше кодирующей последовательности гена, который повышает экспрессию гена.

Примеры подходящих участков, стабилизирующих мРНК, получают из гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) и гена SP82 Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

Регуляторная последовательность может также представлять собой кодирующую область сигнального пептида, , которая кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концом варианта, и направляет вариант по секреторному пути клетки. 5’конец кодирующей последовательности полинуклеотида может по своей природе содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, связанную в естественных условиях в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует вариант. Альтернативно, 5’-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной относительно кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть необходимой в тех случаях, когда кодирующая последовательность в естественных условиях не содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Альтернативно, чужеродной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, можно просто заменить последовательность, кодирующую сигнальный пептид в естественных условиях, с целью повышения секреции варианта. Однако можно использовать любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый вариант по секреторному пути в клетке-хозяине.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Регуляторная последовательность может также представлять собой кодирующую последовательность пропептида, которая кодирует пропептид, расположенный на N-конце варианта. Получаемый в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Прополипептид обычно неактивен и может быть превращен в активный полипептид путем каталитического или автокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Последовательность, кодирующую пропептид, можно получить из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), аспартат-протеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.

В случае, если присутствуют последовательности как сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена возле N-конца варианта, а последовательность сигнального пептида расположена возле N-конца последовательности пропептида.

Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию варианта относительно роста клетки-хозяина. Примерами регулирующих систем являются таковые, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, в том числе на наличие соединения, осуществляющего регуляцию. Регуляторные системы в прокариотических системах включают системы операторов lac, tac и trp.

Векторы экспрессии

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и регуляторные последовательности можно объединить вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может включать в себя один или несколько соответствующих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замены полинуклеотида, кодирующего вариант, по таким сайтам. Альтернативно, полинуклеотид можно экспрессировать посредством вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими регуляторными последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобным образом подвергнуть процедурам с применением рекомбинантной ДНК и который может обеспечивать экспрессию полинуклеотида. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т. е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, при введении в клетку-хозяина вектор может интегрироваться в геном и реплицироваться вместе с хромосомой (хромосомами), в которые он был интегрирован. Более того, можно применять один вектор или плазмиду, или два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина, или транспозон.

Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются dal-гены Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, например, устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину.

Вектор предпочтительно содержит элемент(ы), который обеспечивает интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.

Интеграция вектора в геном клетки-хозяина может зависеть от последовательности полинуклеотида, кодирующей вариант или любого другого элемента вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. Альтернативно, вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для управления интеграцией в геном клетки-хозяина в точном местоположении(местоположениях) в хромосоме(хромосомах) путем гомологичной рекомбинации. Для повышения возможности интеграции в точном местоположении интегрируемые элементы должны содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, например, от 100 до 10000 пар оснований, от 400 до 10000 пар оснований и от 800 до 10000 пар оснований, последовательность которых в высокой степени идентична соответствующей последовательности-мишени для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интегрируемые элементы могут представлять собой любую последовательность, гомологичную последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, что обеспечивает возможность автономной репликации вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Точка начала репликации может представлять собой любой репликатор плазмиды, опосредующий автономную репликацию, который функционирует в клетке. Термин “точка начала репликации” или “репликатор плазмиды” означает полинуклеотид, который обеспечивает возможность репликации плазмиды или вектора in vivo.

Примерами бактериальных точек начала репликации являются точки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177, и pACYC184, обеспечивающие возможность репликации в E. coli, и pUB110, pE194, pTA1060, и pAMß1, обеспечивающие возможность репликации в Bacillus.

В клетку-хозяина для повышения продуцирования варианта можно ввести более чем одну копию полинуклеотида по настоящему изобретению. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достичь путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем внедрения амплифицируемого селектируемого маркерного гена с полинуклеотидом, причем клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена и, следовательно, дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать путем культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.

Процедуры, применяемые для лигирования описанных выше элементов для конструирования рекомбинантных векторов экспрессии по настоящему изобретению, хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием варианта по настоящему изобретению. Конструкцию или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего вариант, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную при рекомбинантном получении варианта, например, прокариота или эукариота.

Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают без ограничения Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus и Streptomyces. Грамотрицательные бактерии включают без ограничения Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella и Ureaplasma.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, в том числе без ограничения клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptococcus, в том числе без ограничения клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptomyces, в том числе без ограничения клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.

Введение ДНК в клетку Bacillus можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см., например, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (см., например, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Введение ДНК в клетку E. coli можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) или электропорации (см., например, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку Streptomyces можно осуществлять путем трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), конъюгации (см., например, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку Pseudomonas можно осуществлять путем электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) или конъюгации (см., например, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Введение ДНК в клетку Streptococcus можно осуществлять путем естественной компетентности (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), трансформации протопластов (см., например, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), электропорации (см., например, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Тем не менее, можно применять любой известный из уровня техники способ введения ДНК в клетку-хозяина.

Способы получения

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта, включающим: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта, и (b) извлечение варианта.

Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для продуцирования варианта с использованием способов, известных из уровня техники. Например, клетку можно культивировать путем культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, подпитываемой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения варианта. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных из уровня техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах американской коллекции типовых культур). Если вариант секретируется в питательную среду, то вариант можно извлечь непосредственно из среды. Если вариант не секретируется, то его можно извлечь из клеточных лизатов.

Вариант можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими для вариантов с протеазной активностью. Эти способы выявления включают без ограничения применение специфичных антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, для определения активности варианта также можно использовать ферментный анализ.

Вариант можно извлечь с использованием способов, известных из уровня техники. Например, вариант можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых процедур, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрования, экстракции, распылительной сушки, испарения или осаждения.

Вариант можно очистить с помощью ряда процедур, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и гель-хроматографии), электрофоретических процедур (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением практически чистых вариантов.

В альтернативном аспекте вариант не извлекают, а вместо этого в качестве источника варианта используют клетку-хозяина по настоящему изобретению, экспрессирующую вариант.

Композиции

В одном конкретном аспекте варианты в соответствии с настоящим изобретением обладают улучшенной стабильностью в моющих средствах по сравнению с исходным ферментом, или по сравнению с протеазой, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замен в одном или нескольких из указанных определенных положений, или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO 3, где стабильность измеряли в примере 2, как описано в “Материалах и способах” в данном документе.

Кроме ферментов, композиции моющего средства могут содержать дополнительные компоненты. Выбор дополнительных компонентов находится в компетенции специалиста в данной области и предусматривает общепринятые ингредиенты, в том числе иллюстративные неограничивающие компоненты, изложенные ниже. При уходе за тканью, выбор компонентов может предусматривать учет типа ткани, которую следует подвергнуть очистке, типа и/или степени загрязнения, температуры, при которой должна происходить очистка и состава продукта моющего средства. Хотя компоненты, упомянутые ниже, разделены на категории согласно общему названию в соответствии с конкретной функциональной возможностью, это не должно быть истолковано как ограничение, так как компонент может включать дополнительные функциональные возможности, что будет понятно специалисту в данной области.

Композиции моющего средства по настоящему изобретению

Варианты по настоящему изобретению можно добавлять к композиции моющего средства в количестве, соответствующем 0,001-100 мг белка, например, 0,01-100 мг белка, предпочтительно 0,005-50 мг белка, более предпочтительно 0,01-25 мг белка, еще более предпочтительно 0,05-10 мг белка, наиболее предпочтительно 0,05-5 мг белка и еще наиболее предпочтительно 0,01-1 мг белка на литр моющего раствора.

Варианты по настоящему изобретению можно стабилизировать с применением стабилизирующих средств, которые можно выбрать из группы, содержащей пропиленгликоль, глицерин, сахар, сахароспирт, молочную кислоту, борную кислоту, борат и производные фенилборной кислоты, например такие, где остаток R в производном фенилборной кислоты представляет собой C₁-C₆-алкильную группу и среди них, наиболее предпочтительно, CH₃, CH₃CH₂ или CH₃CH₂CH₂. Остаток R в производном фенилборной кислоты также может представлять собой водород. Одним примером производного фенилборной кислоты является 4-формилфенилбороновая кислота (4-FPBA) со следующей формулой:

Производные фенилборной кислоты, более того, могут содержать другие химические модификации в фенильном кольце и, в частности, они могут содержать один или несколько метильных, амино-, нитро-, хлор-, фтор-, бром-, гидроксильных, формильных, этильных, ацетильных, трет-бутильных, анизильных, бензильных, трифторацетильных, N-гидроксисукцинимидных, трет-бутилоксикарбонильных, бензоильных, 4-метилбензильных, тиоанизильных, тиокрезильных, бензилоксиметильных, 4-нитрофенильных, бензилоксикарбонильных, 2-нитробензоильных, 2-нитрофенилсульфенильных, 4-толуолсульфонильных, пентафторфенильных, дифенилметильных, 2- хлорбензилоксикарбонильных, 2,4,5-трихлорфенильных, 2-бромбензилоксикарбонильных, 9- флуоренилметилоксикарбонильных, трифенилметильных, 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонильных остатков или групп, или их комбинаций. Все стабилизирующие средства могут присутствовать в композиции моющего средства во всех протонированных или депротонированных формах. Кроме того, все такие соединения, в частности их депротонированные формы, могут связывать катионы. Предпочтительными катионами при этом являются одновалентные или многовалентные, в частности, двухвалентные катионы, в частности, ионы Na (Na⁺), ионы K (K⁺), ионы Li (Li⁺), ионы Ca (Ca²⁺), ионы Mg (Mg²⁺), ионы Mn (Mn²⁺) и ионы Zn (Zn²⁺). Композиции моющего средства могут содержать два или более стабилизирующих средств, например, средств, выбранных из группы, состоящей из пропиленгликоля, глицерина, 4-формилфенилборной кислоты и бората. Одним примером является композиция моющего средства, содержащая 4-формилфенилбороновую кислоту и/или бората. Производное фенилборной кислоты может содержаться в композиции моющего средства в количестве от 0,00001 до 5,0 вес. %, предпочтительно от 0,0001 до 3,0 вес. %, от 0,001 до 2,0 вес. %, от 0,005 до 1,0 вес. %, от 0,01 до 0,5 вес. %, от 0,02 до 0,3 вес. %. Предпочтительно борная кислота/борат содержится в количестве от 0,001 до 5,5 вес. % и в большей степени предпочтительно от 0,01 до 4,5 вес. %, от 0,05 до 3,5 и от 0,1 до 3, 0,4 бис 2,49, 0,5 бис 1,5 вес. % в композиции моющего средства. Было обнаружено, что добавление комбинации бората и 4-формилфенилборной кислоты является особенно эффективным, что приводит к сильному увеличению стабильности фермента в композициях моющего средства. Предпочтительно борная кислота/борат содержится в количестве от 0,001 до 5,5 вес. % и в большей степени предпочтительно от 0,075 до 4,5 вес. %, от 0,09 до 3,5 и от 0,1 до 2,49 вес. %, и производное фенилборной кислоты содержится в количестве от 0,001 до 0,08 вес. % и в большей степени предпочтительно от 0,003 до 0,06 вес. %, от 0,005 до 0,05 вес. %, от 0,007 до 0,03 вес. % и от 0,009 до 0,01 вес. % в композиции моющего средства. Особенно предпочтительным является добавление 4-формилфенилборной кислоты в количестве от 1,0 до 2,0 вес. % в комбинации с 1,0 вес. % бората.

Варианты в соответствии с настоящим изобретением можно также стабилизировать, применяя пептидные альдегиды или кетоны, такие как описанные в WO 2005/105826 и WO 2009/118375. Вариант по настоящему изобретению можно также включать в составы моющих средств, раскрытых в WO 97/07202, которые включены в данный документ посредством ссылки.

Поверхностно-активные вещества

Композиция моющего средства может содержать одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть анионными, и/или катионными, и/или неионными, и/или полуполярными, и/или цвиттер-ионными, или их смесью. В конкретном варианте осуществления композиция моющего средства включает смесь одного или нескольких неионных поверхностно-активных веществ и одного или нескольких анионных поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активное вещество(а) обычно присутствует в количестве от приблизительно 0,1% до 60% по весу, например, от приблизительно 1% до приблизительно 40%, или от приблизительно 3% до приблизительно 20%, или от приблизительно 3% до приблизительно 10%. Поверхностно-активное вещество(а) выбирают исходя из необходимого применения для очистки, и при этом предусматривается любое общепринятое поверхностно-активное вещество(а), известное из уровня техники. Что касается применения в моющих средствах, можно применять любое поверхностно-активное вещество, известное из уровня техники.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу, например, от приблизительно 5% до приблизительно 30%, включая от приблизительно 5% до приблизительно 15% или от приблизительно 20% до приблизительно 25% анионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают сульфаты и сульфонаты, в частности, линейные алкилбензолсульфонаты (LAS), изомеры LAS, разветвленные алкилбензолсульфонаты (BABS), фенилалкансульфонаты, альфа-олефинсульфонаты (AOS), олефинсульфонаты, алкенсульфонаты, алкан-2,3-диилбис(сульфаты), гидроксиалкансульфонаты и дисульфонаты, алкилсульфаты (AS), такие как додецилсульфат натрия (SDS), сульфаты жирных спиртов (FAS), сульфаты первичных спиртов (PAS), эфирсульфаты спиртов (AES, или AEOS, или FES, также известные как этоксисульфаты спиртов или эфирсульфаты жирных спиртов); вторичные алкансульфонаты (SAS), сульфонаты парафина (PS), сульфонаты сложных эфиров, сложные эфиры глицерина и сульфонированных жирных кислот, метиловые сложные эфиры жирных альфа-сульфокислот (альфа-SFMe или SES), включая сульфонат сложного метилового эфира (MES), алкил- или алкенилянтарную кислоту, додеценил/тетрадеценил янтарную кислоту (DTSA), жирнокислотные производные аминокислот, сложные диэфиры и моноэфиры сульфоянтарной кислоты или мыло и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу катионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры катионных поверхностно-активных веществ включают четвертичный алкилдиметилэтаноламин (ADMEAQ), бромид цетилтриметиламмония (CTAB), хлорид диметилдистеариламмония (DSDMAC) и алкилбензилдиметиламмоний, алкильные соединения четвертичного аммония, алкоксилированные соединения четвертичного аммония (AQA), и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% по весу неионного поверхностно-активного вещества, например, от приблизительно 0,5% до приблизительно 30%, в частности, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 3% до приблизительно 10%, например, от приблизительно 3% до приблизительно 5% или от приблизительно 8% до приблизительно 12%. Неограничивающие примеры неионных поверхностно-активных веществ включают этоксилаты спиртов (AE или AEO), пропоксилаты спиртов, пропоксилированные жирные спирты (PFA), алкиловые сложные эфиры алкоксилированных жирных кислот, например, алкиловые сложные эфиры этоксилированных и/или пропоксилированных жирных кислот, алкилфенолэтоксилаты (APE), оксиэтилированные алкилфенолы (NPE), алкилполигликозиды (APG), алкоксилированные амины, моноэтаноламиды жирных кислот (FAM), диэтаноламиды жирных кислот (FADA), моноэтаноламиды этоксилированных жирных кислот (EFAM), моноэтаноламид пропоксилированной жирной кислоты (PFAM), амиды полигидроксиалкильных жирных кислот или N-ацил-N-алкильные производные глюкозамина (глюкамиды, GA или глюкамид жирной кислоты, FAGA), а также продукты, доступные под торговыми марками SPAN и TWEEN и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу полуполярного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры полуполярных поверхностно-активных веществ включают аминоксиды (AO), например, алкилдиметиламиноксид, N-(кокоалкил)-N,N-диметиламиноксид и N-(таллоу-алкил)-N,N-бис(2-гидроксиэтил)аминоксид, алканоламиды жирных кислот и алканоламиды этоксилированных жирных кислот и их комбинации.

При их включении моющее средство обычно будет содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% по весу цвиттерионного поверхностно-активного вещества. Неограничивающие примеры цвиттерионных поверхностно-активных веществ включают бетаин, алкилдиметилбетаин и сульфобетаин и их комбинации.

Гидротропы

Гидротроп представляет собой соединение, которое солюбилизирует гидрофобные соединения в водных растворах (или, в противоположном случае, полярные соединения в неполярной среде). Как правило, гидротропы имеют как гидрофобный, так и гидрофильный характер (так называемые амфифильные свойства, которые известны у поверхностно-активных веществ), тем не менее, молекулярная структура гидротропов обычно не способствует спонтанной аутоагрегации, см., например, обзор Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. У гидротропов не проявляется критическая концентрация, выше которой происходит аутоагрегация, что обнаруживается у поверхностно-активных веществ и липидов, образующих мицеллярные, ламеллярные или другие хорошо выраженные мезофазы. Между тем, у многих гидротропов наблюдается процесс агрегации непрерывного типа, при котором размеры агрегатов растут по мере увеличения концентрации. Тем не менее, многие гидротропы изменяют фазовое поведение, стабильность и коллоидные свойства систем, содержащих вещества полярного и неполярного характера, в том числе смеси воды, масла, поверхностно-активных веществ и полимеров. Гидротропы обычно применяют в отраслях, начиная от фармацевтики, личной гигиены, пищевой промышленности и заканчивая применениями в технике. Применение гидротропов в композициях моющего средства дает, например, более концентрированные составы поверхностно-активных веществ (например, в процессе уплотнения жидких моющих средств путем удаления воды), не вызывая нежелательных явлений, таких как разделения фаз или высокой вязкости.

Моющее средство может содержать 0-5% по весу, например, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5% или от приблизительно 3% до приблизительно 5% гидротропа. Что касается применения в моющих средствах можно применять любой гидротроп, известный из уровня техники. Неограничивающие примеры гидротропов включают бензолсульфонат натрия, p-толуолсульфонат натрия (STS), ксилолсульфонат натрия (SXS), кумолсульфонат натрия (SCS), кумолсульфонат натрия, аминоксиды, спирты и полигликолевые эфиры, гидроксинафтоат натрия, гидроксинафталинсульфонат натрия, этилгексилсульфат натрия и их комбинации.

Средства, усиливающие моющее действие, и средства, способствующие усилению моющего действия

Композиция моющего средства может содержать приблизительно 0-65% по весу, например, от приблизительно 5% до приблизительно 50% средства, усиливающего моющее действие, или средства, способствующего усилению моющего действия, или их смеси в моющем средстве. В моющем средстве для мытья посуды количество средства, усиливающего моющее действие, составляет обычно 40-65%, в частности, 50-65%. Средство, усиливающее моющее действие, и/или средство, способствующее усилению моющего действия, могут представлять собой, в частности, хелатирующее средство, которое образует растворимые в воде комплексы с Ca и Mg. Любое средство, усиливающее моющее действие и/или средство, способствующее усилению моющего действия, известные из уровня техники, можно применять в моющих средствах для стирки, ADW и очистки твердых поверхностей. Неограничивающие примеры средств, усиливающих моющее действие, включают цеолиты, дифосфаты (пирофосфаты), трифосфаты, например, трифосфат натрия (STP или STPP), карбонаты, например, карбонат натрия, растворимые силикаты, например, метасиликат натрия, слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst), этаноламины, например, 2-аминоэтан-1-ол (MEA), иминодиэтанол (DEA) и 2,2',2"-нитрилотриэтанол (TEA), и карбоксиметилинулин (CMI), и их комбинации.

Композиция моющего средства может также содержать 0-65% по весу, например, от приблизительно 5% до приблизительно 40% средства, способствующего усилению моющего действия, или его смеси в моющем средстве. Композиция моющего средства может включать средство, способствующее усилению моющего действия, само по себе, или в сочетании со средством, усиливающим моющее действие, например, средством, усиливающим моющее действие, на основе цеолита. Неограничивающие примеры средств, способствующих усилению моющего действия, включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер акриловой кислоты/малеиновой кислоты (PAA/PMA). Дополнительные неограничивающие примеры включают цитрат, хелаторы, например, аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты, а также фосфонаты и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2"-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарую кислоту (IDS), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутамовую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-диилбис(фосфоновую кислоту) (HEDP), этилендиаминтетракис(метилен)тетракис(фосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновую кислоту) (DTPMPA), N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспарагиновую кислоту-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(2-сульфометил)-аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(2-сульфометил)-глутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил) глутаминовую кислоту (SEGL), N-метилиминодиуксусную кислоту (MIDA), α-аланин-N,N-диуксусную кислоту (α-ALDA), серин-N,N-диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-N,N-диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-N,N-диуксусную кислоту (PHDA), антраниловую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ANDA), сульфаниловую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (SLDA), таурин-N, N-диуксусную кислоту (TUDA) и сульфометил-N,N-диуксусную кислоту (SMDA), N-(гидроксиэтил)-этилидендиаминтриацетат (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), диэтилентриамин-пента-(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMP), аминотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP) и их комбинации и соли. Дополнительные иллюстративные средства, усиливающие моющее действие, и/или средства, способствующие усилению моющего действия, описаны, например, в WO 09/102854, US 5977053.

Отбеливающие системы

Моющее средство может содержать 0-10% по весу, например, от приблизительно 1% до приблизительно 5% отбеливающей системы. Можно применять любую отбеливающую систему, известную из уровня техники, для использования в моющих средствах для стирки, ADW и очистки твердых поверхностей. Компоненты пригодной отбеливающей системы включают катализаторы отбеливания, фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, источники пероксида водорода, такие как перкарбонат натрия и пербораты натрия, предварительно образованные перкислоты и их смеси. Пригодные предварительно образованные перкислоты включают, но без ограничения, пероксикарбоновые кислоты и соли, перугольные кислоты и соли, перимидиновые кислоты и соли, пероксимоносерные кислоты и соли, например, Oxone (R) и их смеси. Неограничивающие примеры отбеливающих систем включают отбеливающие системы на основе пероксида, которые могут содержать, например, неорганическую соль, в том числе соли щелочных металлов, такие как натриевые соли пербората (обычно моно- или тетрагидраты), перкарбонаты, персульфаты, перфосфаты, персиликатные соли в комбинации с активатором отбеливания, образующим перкислоту. В данном документе активатор отбеливания означает соединение, которое реагирует с пероксидным отбеливателем, таким как перекись водорода с образованием перкислоты. Перкислота, полученная таким образом, представляет собой активированный отбеливатель. Подходящие активаторы отбеливания для применения в настоящем изобретении, включают таковые, относящиеся к классу сложных эфиров, амидов, имидов или ангидридов. Подходящими примерами являются тетраацетилэтилендиамин (TAED), 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфонат натрия, дипероксидодекановая кислота, 4-(додеканоилокси)бензолсульфонат (LOBS), 4-(деканоилокси)бензолсульфонат, 4-(деканоилокси)бензоат (DOBS), 4-(3,5,5-триметилгексаноилокси)бензолсульфонат (ISONOBS), тетраацетилэтилендиамин (TAED) и 4-(нонаноилокси)бензолсульфонат (NOBS) и/или те, которые раскрыты в WO98/17767. Конкретное семейство активаторов отбеливания, которое представляет интерес, раскрыто в EP624154 и наиболее предпочтительным в этом семействе является ацетилтриэтилцитрат (ATC). ATC или короткоцепочечный триглицерид, такой как триацин, имеет преимущество, заключающееся в том, что он является экологически безопасным, так как в конечном итоге разрушается до лимонной кислоты и спирта. Кроме того, ацетилтриэтилцитрат и триацетин имеют хорошую гидролитическую стабильность в продукте при хранении и являются эффективными активаторами отбеливания. Наконец, ATC обеспечивает хорошие свойства средства, усиливающего моющее действие, в добавке для стирки. Альтернативно, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Отбеливающая система может дополнительно содержать перкислоты, например, 6-(фталоиламино)перкапроновую кислоту (PAP). Отбеливающая система может дополнительно включать катализатор отбеливания. В некоторых вариантах осуществления отбеливающий компонент может представлять собой органический катализатор, выбранный из группы, состоящей из органических катализаторов со следующими формулами:

(iii) и их смеси, где каждый R¹ независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 24 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от 11 до 24 атомов углерода, предпочтительно каждый R¹ независимо представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от 9 до 18 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от 11 до 18 атомов углерода, более предпочтительно каждый R¹ независимо выбран из группы, состоящей из 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-октадецила, изо-нонила, изо-децила, изо-тридецила и изо-пентадецила. Другие иллюстративные отбеливающие системы описаны, например, в WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259, WO2007/087242. Подходящие фотоотбеливатели могут, например, представлять собой сульфированный фталоцианин цинка.

Полимеры

Моющее средство может содержать 0-10% по весу, например, 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% или 0,2-1% полимера. Для применения в моющих средствах можно использовать любой полимер, известный из уровня техники. Полимер может выполнять функцию средства, способствующего усилению моющего действия, которое упомянуто выше, или может обеспечивать свойства препятствия повторному осаждению, защиты волокон, грязеотталкивания, ингибирования переноса красителя, очистки от жира и/или антивспенивания. Некоторые полимеры могут характеризоваться более чем одним из вышеупомянутых свойств и/или более чем одним из нижеприведенных мотивов. Иллюстративные полимеры включают (карбоксиметил)целлюлозу (CMC), поли(виниловый спирт) (PVA), поли(винилпирролидон) (PVP), поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) (PEG), этоксилированный поли(этиленимин), карбоксиметилинулин (CMI) и поликарбоксилаты, например, PAA, PAA/PMA, полиаспарагиновую кислоту и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты, гидрофобно модифицированную CMC (HM-CMC) и кремнийогранические соединения, сополимеры терефталевой кислоты и олигомерные гликоли, сополимеры поли(этилентерефталата) и поли(оксиэтилентерефталата) (PET-POET), PVP, поли(винилимидазол) (PVI), поли(винилпиридин-N-оксид) (PVPO или PVPNO) и поливинилпирролидон-винилимидазол (PVPVI). Дополнительные иллюстративные полимеры включают сульфированные поликарбоксилаты, полиэтиленоксид и полипропиленоксид (PEO-PPO) и этоксисульфат дикватерния. Другие иллюстративные полимеры раскрыты, например, в WO 2006/130575. Также предполагаются соли вышеупомянутых полимеров.

Окрашивающие средства для тканей

Композиции моющего средства могут также включать окрашивающие средства для тканей, такие как красители или пигменты, которые при составлении в композиции моющего средства могут осаждаться на ткани, при контакте указанной ткани с моющим раствором, содержащим указанные композиции моющего средства, следовательно, изменяятон указанной ткани посредством поглощения/отражения видимого света. Флуоресцентные отбеливающие средства излучают по меньшей мере некоторое количество видимого света. Напротив, окрашивающие средства для тканей изменяют тон поверхности, поскольку они поглощают по меньшей мере часть света видимой части спектра. Подходящие окрашивающие средства для тканей включают красители и конъюгаты краситель-глина, а также они могут включать пигменты. Подходящие красители включают низкомолекулярные красители и полимерные красители. Подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из красителей, попадающих под классификацию по цветовому индексу (C.I.), как прямой синий, конго красный, прямой фиолетовый, кислотный синий, кислотный красный, кислотный фиолетовый, основный синий, основный фиолетовый и основный красный или их смеси, например, как описано в WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 и EP1876226 (тем самым включены с помощью ссылки). Композиция моющего средства предпочтительно содержит от приблизительно 0,00003 вес. % до приблизительно 0,2 вес. %, от приблизительно 0,00008 вес. % до приблизительно 0,05 вес. % или даже от приблизительно 0,0001 вес. % до приблизительно 0,04 вес. % окрашивающего средства для тканей. Композиция может содержать от 0,0001 вес. % до 0,2 вес. % окрашивающего средства для тканей, причем может быть особенно предпочтительным, если композиция присутствует в форме пакета с единичной дозой. Подходящие окрашивающие средства также раскрыты, например, в WO 2007/087257, WO2007/087243.

(Дополнительные) ферменты

В одном варианте осуществления варианты в соответствии с настоящим изобретением объединяют с одним или несколькими ферментами, например, по меньшей мере с двумя ферментами, более предпочтительно по меньшей мере с тремя, с четырьмя или с пятью ферментами. Предпочтительно ферменты имеют разную субстратную специфичность, например, протеолитическую активность, амилолитическую активность, липолитическую активность, гемицеллюлитическую активность или пектолитическую активность.

Добавка моющего средства, как и композиция моющего средства, может содержать один или несколько дополнительных ферментов, таких как ферменты, активные к углеводам, как карбогидраза, пектиназа, маннаназа, амилаза, целлюлаза, арабиназа, галактаназа, ксиланаза или протеаза, липаза, кутиназа, оксидаза, например, лакказа и/или пероксидаза.

В целом, свойства выбранного(ых) фермента(ов) должны быть совместимыми с выбранным моющим средством (т. е. оптимум pH, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т. д.), при этом фермент(ы) должен(ы) присутствовать в эффективных количествах.

Целлюлазы

Пригодные целлюлазы включают целлюлазы бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Пригодные целлюлазы включают целлюлазы из рода Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, грибковые целлюлазы, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, раскрытые в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие положительными эффектами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются такие варианты целлюлаз, как описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и WO99/001544.

Другие целлюлазы представляют собой фермент ендо-бета-1,4-глюканазу, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности от положения 1 до положения 773 в SEQ ID NO:2 из WO 2002/099091, или семейства 44 ксилоглюканаз, в котором ксилоглюканазный фермент содержит последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична положениям 40-559 в SEQ ID NO: 2 из WO 2001/062903.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™ и Carezyme™ (Novozymes A/S), Carezyme Premium™ (Novozymes A/S), Celluclean ™ (Novozymes A/S), Celluclean Classic™ (Novozymes A/S), Cellusoft™ (Novozymes A/S), Whitezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ и Puradax HA™ (Genencor International Inc.) и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Маннаназы

Подходящие маннаназы включают маннаназы бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически или генетически модифицированные мутанты. Маннаназа может представлять собой щелочную маннаназу из семейства 5 или 26. Она может быть дикого типа из Bacillus или Humicola, в частности, B. agaradhaerens, B. licheniformis, B. halodurans, B. clausii или H. insolens. Подходящие маннаназы описаны в WO 1999/064619. Коммерчески доступной маннаназой является Mannaway (Novozymes A/S).

Протеазы

Подходящие протеазы включают протеазы бактериального, грибкового, растительного, вирусного или животного происхождения, например, растительного или микробного происхождения. Микробного происхождения являются предпочтительными. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Это может быть щелочная протеаза, например, серин-протеаза или металлопротеаза. Серин-протеаза может быть, например, представителем семейства S1, таким как трипсин, или семейства S8, таким как субтилизин. Протеазы, относящиеся к металлопротеазам, могут, например, представлять собой термолизин, например, из семейства M4 или другую металлопротеазу, например, из семейств M5, M7 или M8.

Термин "субтилазы" относится к подгруппе серин-протеазы в соответствии с Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Серин-протеазы представляют собой подгруппу протеаз, которая характеризуется наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т. е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина.

Примерами субтилаз являются субтилазы, полученные из Bacillus, например, Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus и Bacillus gibsonii, описанные в US7262042 и WO09/021867, и субтилизин lentus, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, Bacillus licheniformis, субтилизин BPN', субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168, описанные в WO89/06279, и протеаза PD138, описанная в (WO93/18140). Другими пригодными протеазами могут быть протеазы, описанные в WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 и WO02/016547. Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанные в WO 89/06270, WO 94/25583 и WO 05/040372, и химотрипсиновые протеазы, полученные из Cellumonas, описанные в WO05/052161 и WO05/052146.

Дополнительной предпочтительной протеазой является щелочная протеаза из Bacillus lentus DSM 5483, описанная, например, в WO95/23221, и ее варианты, которые описаны в WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 и EP1921148.

Примерами металлопротеаз являются нейтральные металлопротеазы, описанные в WO07/044993 (Genencor Int.), например, металлопротеазы, полученные из Bacillus amyloliquefaciens.

Примерами пригодных протеаз являются варианты, описанные в WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, в частности, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274, при использовании BPN'-нумерации. Более предпочтительно варианты протеаз могут содержать следующие мутации: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (при использовании BPN'-нумерации).

Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают продаваемые под торговыми названиями Alcalase®, Duralase^Tm, Durazym^Tm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® и Esperase® (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz^Tm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, Effectenz^Tm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Opticlean® и Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem^TM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US5352604) и их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) от Kao.

Липазы и кутиназы

Пригодные липазы и кутиназы включают липазы и кутиназы бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные с применением белковой инженерии мутантные ферменты. Примеры включают липазу из Thermomyces, например, из T. lanuginosus (ранее называемая Humicola lanuginosa), которая описана в EP258068 и EP305216, кутиназу из Humicola, например, H. insolens (WO96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них сейчас переименованы в Burkholderia), например, P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp. штамм SD705 (WO95/06720 и WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO10/065455), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO10/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US5389536), липазу из Thermobifida fusca (WO11/084412), липазу Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), липазу из Bacillus subtilis (WO11/084599) и липазу из Streptomyces griseus (WO11/150157) и S. pristinaespiralis (WO12/137147).

Другими примерами являются варианты липаз, например, описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 и WO 09/109500.

Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают Lipolase^TM, Lipex™; Lipolex^TM и Lipoclean^TM (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).

Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией с липазой А Candida antarctica (WO10/111143), ацилтрансферазы из Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO09/67279) и варианты пергидролазы M. smegmatis, в частности вариант S54V, используемый в коммерческом продукте Gentle Power Bleach от Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028).

Амилазы

Подходящие амилазы, которые можно применять совместно с вариантами по настоящему изобретению, могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут быть бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Амилазы включают, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например, специального штамма Bacillus licheniformis, описанного более детально в GB 1296839.

Подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 2 в WO 95/10603 или их варианты, содержащие последовательности, которые на 90% идентичны SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты описаны в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 и SEQ ID NO: 4 из WO 99/019467, например, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 6 в WO 02/010355 или их варианты, содержащие последовательности, которые на 90% идентичны SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами c SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.

Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенные в SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, приведенные в SEQ ID NO: 4 из WO2006/066594, или варианты, содержащие последовательности, которые на 90% идентичны им. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительными вариантами гибридной альфа-амилазы, содержащей остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенные в SEQ ID NO: 6 из WO2006/066594, и остатки 36-483 из SEQ ID NO: 4 представляют собой варианты, имеющие следующие замены:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; или

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Дополнительные амилазы, которые являются подходящими, представляют собой амилазы с SEQ ID NO: 6 в WO 99/019467 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, имеющие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.

Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 из WO 96/023873 или их варианты, содержащие последовательности, которые на 90% идентичны SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476, применяя SEQ ID 2 из WO 96/023873 для нумерации. Более предпочтительными являются варианты, которые имеют делецию в двух положениях, выбранных из 181, 182, 183 и 184, например, 181 и 182, 182 и 183, или положениях 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делеции в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.

Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы с SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 или их варианты, содержащие последовательности, которые на 90% идентичны SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815 или последовательности, которые на 90% идентичны SEQ ID NO: 10 в WO 01/66712. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 10 из WO01/66712 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.

Дополнительными подходящими амилазами являются амилазы с SEQ ID NO: 2 из WO 09/061380 или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180, и/или S181, или T182, и/или G183. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; или

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, где варианты усечены по C-концу и необязательно дополнительно содержат замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.

Дополнительными подходящими амилазами являются амилазы с SEQ ID NO: 1 из WO13184577 или ее варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 и G477. Более предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K и G477K и/или делеции в положении R178 и/или S179 или из T180 и/или G181. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие следующие замены:

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K,

где варианты необязательно дополнительно содержат замену в положении 241, и/или делецию в положении 178, и/или в положении 179.

Дополнительными подходящими амилазами являются амилазы с SEQ ID NO: 1 из WO10104675 или ее варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1. Предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: N21, D97, V128 K177, R179, S180, I181, G182, M200, L204, E242, G477 и G478. Более предпочтительными вариантами с SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K и G478K, и/или делецию в положении R179, и/или S180, или в I181, и/или G182. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 1 являются варианты, имеющие следующие замены:

N21D+D97N+V128I,

где варианты необязательно дополнительно содержат замену в положении 200 и/или делецию в положении 180 и/или в положении 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу с SEQ ID NO: 12 в WO 01/66712 или вариант, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений в SEQ ID NO: 12 из WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, имеющие делецию в D183 и G184 и имеющие замены в R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, причем наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех данных положениях.

Другими примерами являются варианты амилазы, например, варианты, описанные в WO2011/098531, WO2013/001078 и WO2013/001087.

Коммерчески доступные амилазы представляют собой Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM, Stainzyme ^TM, Stainzyme Plus^TM, Natalase^TM, Liquozyme X и BAN^TM (от Novozymes A/S) и Rapidase^TM, Purastar^TM/Effectenz^TM, Powerase, Preferenz S1000, Preferenz S100 и Preferenz S110 (от Genencor International Inc./DuPont).

Пероксидазы/оксидазы

Подходящие пероксидазы/оксидазы включают таковые растительного, бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Примеры пригодных пероксидаз включают пероксидазы из Coprinus, например, из C. cinereus, и их варианты, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.

Коммерчески доступные пероксидазы включают Guardzyme™ (Novozymes A/S).

Другие ферменты

Вариант протеазы в соответствии с настоящим изобретением можно также объединить с дополнительными ферментами, такими как пектатлиазы, например, Pectawash ^TM , хлорофиллазы и т.д. Вариант протеазы по настоящему изобретению можно смешивать с любым дополнительным ферментом.

Фермент(ы) в моющем средстве может быть включен в моющую композицию путем добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или путем добавления комбинированной добавки, содержащей все эти ферменты. Добавку моющего средства, т.е. отдельную добавку или комбинированную добавку, можно составить, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т.д. Предпочтительные составы добавок моющего средства представляют собой грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или взвеси.

Непылящие грануляты можно получать, например, как раскрыто в US 4106991 и 4661452, и на них можно наносить покрытие с применением способов, известных из уровня техники. Примерами восковидных покрывающих материалов являются поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, PEG) со средним молярным весом 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных звеньев; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствует от 15 до 80 этиленоксидных звеньев; жирные спирты; жирные кислоты; а также моно-, и ди-, и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения с помощью методик с применением псевдоожиженного слоя, приведены в GB 1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать путем добавления полиола, например, пропиленгликоля, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты в соответствии с общепризнанными способами. Защищенные ферменты можно получать в соответствии со способом, раскрытым в EP 238216.

Вспомогательные материалы

Также можно применять любые компоненты моющего средства, известные из уровня техники для применения в моющих средствах для стирки. Другие необязательные компоненты моющего средства включают антикоррозионные средства, средства, препятствующие стягиванию, средства, препятствующие повторному осаждению загрязнения, средства, препятствующие сморщиванию, бактерициды, связующие, ингибиторы коррозии, разрыхлители/разрыхляющие средства, красители, стабилизаторы ферментов (в том числе борная кислота, бораты, CMC и/или полиолы, например, пропиленгликоль), кондиционеры для тканей, в том числе глины, наполнители/технологические добавки, флуоресцентные отбеливающие средства/оптические отбеливатели, пенообразователи, регуляторы пенообразования (образования мыльной пены), отдушки, средства, суспендирующие загрязнение, смягчители, подавители образования мыльной пены, ингибиторы потускнения и средства, способствующие капиллярному затеканию, либо отдельно, либо в комбинации. Можно применять любой ингредиент, известный из уровня техники для применения в моющих средствах для стирки. Выбор таких ингредиентов находится в компетенции специалиста в данной области техники.

Диспергирующие средства. Композиции моющего средства могут также содержать диспергирующие средства. В частности, порошкообразные моющие средства могут содержать диспергирующие средства. Подходящие растворимые в воде органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода. Подходящими диспергирующими средствами являются, например, описанные в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

Средства, ингибирующие перенос красителя. Композиции моющего средства также могут включать одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают без ограничения полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Если они присутствуют в представленной композиции, средства, ингибирующие перенос красителя, могут присутствовать в количествах от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или даже от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% по весу композиции.

Флуоресцентное отбеливающие средство. Композиции моющего средства предпочтительно будут также содержать дополнительные компоненты, которые могут очищать изделия с определенным цветовым тоном, например, флуоресцентное отбеливающее средство или оптические отбеливатели. Если он присутствует, то оптический отбеливатель предпочтительно присутствует в количестве от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%. В композиции может применяться любое флуоресцентное отбеливающее средство, подходящее для применения в композиции моющего средства для стирки. Наиболее часто применяемые флуоресцентные отбеливающие средства представляют собой таковые, относящиеся к классам производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты, диарилпиразолиновых производных и бисфенилдистириловых производных. Примеры флуоресцентных отбеливающих средств типа производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты включают натриевые соли 4,4'-бис-(2-диэтаноламино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2,4-дианилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2.2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2-анилино-4(N-метил-N-2-гидроксиэтиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната, 4,4'-бис-(4-фенил-2,1,3-триазол-2-ил)стильбен-2,2'-дисульфоната; 4,4'-бис-(2-анилино-4(1-метил-2-гидроксиэтиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната и 2-(стильбил-4"-нафто-1,2':4,5)-1,2,3-тризол-2"-сульфоната. Предпочтительные флуоресцентные отбеливающие средства представляют собой Tinopal DMS и Tinopal CBS, доступные от Ciba-Geigy AG, Базель, Швейцария. Tinopal DMS представляет собой натриевую соль 4,4'-бис-(2-морфолино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-дисульфоната. Tinopal CBS представляет собой динатриевую соль 2,2'-бис-(фенил-стирил)дисульфоната. Предпочтительными также являются флуоресцентные отбеливающие средства, коммерчески доступные как Parawhite KX, поставляемые Paramount Minerals and Chemicals, Мумбай, Индия. Другие флуоресцирующие вещества, подходящие для применения, включают 1-3-диарилпиразолины и 7-алкиламинокумарины.

Количества подходящего флуоресцентного осветлителя включают нижние значения количества от приблизительно 0,01, от 0,05, от приблизительно 0,1 или даже от приблизительно 0,2 вес. % до верхних значений количества 0,5 или даже 0,75 вес. %.

Грязеотталкивающие полимеры. Композиция моющего средства также может включать один или несколько грязеотталкивающих полимеров, которые способствуют удалению загрязнений с тканей, таких как хлопковых и полиэстеровых тканей, в частности, удалению гидрофобных загрязнений с полиэстеровых тканей. Грязеотталкивающими полимерами могут, например, являться неионные или анионные полимеры на основе терефталата, поливинилкапролактам и родственные сополимеры, виниловые привитые сополимеры, сложные полиэфир-полиамиды, см., например, главу 7 в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Другим типом грязеотталкивающих полимеров являются амфифильные алкоксилированные полимеры для очистки от жира, содержащие сердцевинную структуру и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к этой сердцевинной структуре. Сердцевинная структура может содержать полиалкилениминную структуру или полиалканоламинную структуру, которые подробно описаны в WO 2009/087523 (тем самым включены с помощью ссылки). Более того, статистические привитые сополимеры являются подходящими грязеотталкивающими полимерами. Подходящие привитые сополимеры более подробно описаны в WO 2007/138054, WO 2006/108856 и WO 2006/113314 (тем самым включены с помощью ссылки). Другими грязеотталкивающими полимерами являются замещенные полисахаридные структуры, особенно замещенные целлюлозные структуры, такие как модифицированные производные целлюлозы, к примеру, описанные в EP 1867808 или WO 2003/040279 (обе из которых тем самым включены с помощью ссылки). Подходящие целлюлозные полимеры включают целлюлозу, эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, амиды целлюлозы и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают анионно-модифицированную целлюлозу, неинно-модифицированную целлюлозу, катионно-модифицированную целлюлозу, цвиттерионно-модифицированную целлюлозу и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, сложный эфир карбоксиметилцеллюлозы и их смеси.

Средства, препятствующие повторному осаждению. Композиции моющего средства также могут включать одно или несколько средств, препятствующих повторному осаждению, таких как карбоксиметилцеллюлоза (CMC), поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (PVP), полиоксиэтилен и/или полиэтиленгликоль (PEG), гомополимеры акриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты и малеиновой кислоты и этоксилированные полиэтиленимины. Полимеры на основе целлюлозы, описанные выше как грязеотталкивающие полимеры , могут также выполнять функцию средств, препятствующих повторному осаждению.

Другие подходящие вспомогательные материалы включают без ограничения средства, препятствующие стягиванию, средства, препятствующие сморщиванию, бактерициды, связующие средства, носители, красители, стабилизаторы ферментов, смягчители тканей, наполнители, регуляторы пенообразования, гидротропы, отдушки, пигменты, подавители образования мыльной пены, растворители, структурообразующие средства для жидких моющих средств и/или средства, обеспечивающие эластичность структуры.

Состав продуктов моющего средства

Композиция моющего средства может быть в любой удобной форме, например, бруска, гомогенной таблетки, таблетки с двумя или более слоями, обычного или уплотненного порошка, гранул, пасты, геля или обычной, плотной или концентрированной жидкости.

Формы состава моющего средства: слои (одинаковых или разных фаз), пакеты, по сравнению с формами для автоматической дозирующей единицы.

Пакеты могут быть сконфигурированы с одной или множеством камер. Они могут иметь любую форму, вид и материал, который является подходящим для удерживания композиции, например, без возможности высвобождения композиции из пакета до контакта с водой. Пакет изготовлен из водорастворимой пленки, которая охватывает внутренний объем. Указанный внутренний объем может быть разделен на камеры пакета. Предпочитаемыми пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или слоя. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно, количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере приблизительно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от приблизительно 20000 до приблизительно 150000. Пленки могут также представлять собой смесь композиций, которая содержит гидролитически разлагаемые и водорастворимые полимерные смеси, такие как полилактид и поливиниловый спирт (известный под торговым названием M8630, продаваемый Chris Craft In. Prod. Of Gary, Индиана, США), а также пластификаторы, такие как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую чистящую композицию для стирки или часть компонентов и/или жидкую чистящую композицию или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Камера для жидких компонентов может отличаться по композиции от камер, содержащих твердые вещества. Ссылка: (US2009/0011970 A1).

Ингредиенты моющего средства можно физически отделять друг от друга с помощью камер в водорастворимых пакетах или в различных слоях таблеток. Таким образом можно избежать отрицательного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждой из камер также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.

Определение/характеристики форм

Моющее средство в виде жидкости или геля, которое не является единичной дозой, может быть водным, как правило, содержащим от по меньшей мере 20% по весу и до 95% воды, например, до приблизительно 70% воды, до приблизительно 65% воды, до приблизительно 55% воды, до приблизительно 45% воды, до приблизительно 35% воды. Другие типы жидкостей, в том числе без ограничения алканолы, амины, диолы, эфиры и полиолы могут быть включены в водную жидкость или гель. Моющее средство в виде водной жидкости или геля может содержать 0-30% органического растворителя.

Моющее средство в виде жидкости или геля может быть отличным от водного.

Составы моющих средств в форме гранул

Моющее средство в форме гранул можно составлять, как описано в WO 09/092699, EP 1705241, EP 1382668, WO 07/001262, US 6472364, WO 04/074419 или WO 09/102854. Другие пригодные составы моющих средств описаны в WO09/124162, WO09/124163, WO09/117340, WO09/117341, WO09/117342, WO09/072069, WO09/063355, WO09/132870, WO09/121757, WO09/112296, WO09/112298, WO09/103822, WO09/087033, WO09/050026, WO09/047125, WO09/047126, WO09/047127, WO09/047128, WO09/021784, WO09/010375, WO09/000605, WO09/122125, WO09/095645, WO09/040544, WO09/040545, WO09/024780, WO09/004295, WO09/004294, WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, WO09/074398, WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, WO09/021813, WO09/030632, и WO09/015951.

WO2011025615, WO2011016958, WO2011005803, WO2011005623, WO2011005730, WO2011005844, WO2011005904, WO2011005630, WO2011005830, WO2011005912, WO2011005905, WO2011005910, WO2011005813, WO2010135238, WO2010120863, WO2010108002, WO2010111365, WO2010108000, WO2010107635, WO2010090915, WO2010033976, WO2010033746, WO2010033747, WO2010033897, WO2010033979, WO2010030540, WO2010030541, WO2010030539, WO2010024467, WO2010024469, WO2010024470, WO2010025161, WO2010014395, WO2010044905,

WO2010145887, WO2010142503, WO2010122051, WO2010102861, WO2010099997, WO2010084039, WO2010076292, WO2010069742, WO2010069718, WO2010069957, WO2010057784, WO2010054986, WO2010018043, WO2010003783, WO2010003792,

WO2011023716, WO2010142539, WO2010118959, WO2010115813, WO2010105942, WO2010105961, WO2010105962, WO2010094356, WO2010084203, WO2010078979, WO2010072456, WO2010069905, WO2010076165, WO2010072603, WO2010066486, WO2010066631, WO2010066632, WO2010063689, WO2010060821, WO2010049187, WO2010031607, WO2010000636,

Способы и применения

Варианты протеаз по настоящему изобретению можно добавлять и, таким образом, делать компонентом композиции моющего средства, где указанные варианты содержат замену одной или нескольких аминокислот в петле, соответствующих положениям 171, 173, 175 или 179 в SEQ ID NO: 3, и где вариант содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87% по меньшей мере на 88% по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 99,6% идентична SEQ ID NO: 3. Композиции моющего средства, как правило, используют в способах очистки, таких как, стирка и/или очистка твердых поверхностей, например, мытье посуды. Композиции моющего средства могут содержать по меньшей мере один вариант, где указанный вариант содержит одну или несколько из следующих замен S171 {W, K, E, N}, S173 {P}, S175 {A, V, P} или G179 {C, V, Q, S, T, E, H, K, M, N, A, Y} в SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% идентична, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, например, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5% или по меньшей мере на 99,6% идентична последовательности SEQ ID NO: 3 и вариант обладает протеазной активностью. По меньшей мере один вариант протеазы предпочтительно обладает повышенной стабильностью в моющем средстве относительно исходной молекулы или относительно исходной протеазы, имеющей идентичную аминокислотную последовательность с указанным вариантом, но без замен в одном или нескольких из указанных положений, при исследовании в примере 2, как описано ниже в “Материалах и способах”.

Кроме того, любой из вариантов протеаз, описанных выше, также может содержать замену в положении F180Y.

Композицию моющего средства можно составить, например, в виде композиции моющего средства для ручной или машинной стирки, включающей композицию добавок для стирки, подходящую для предварительной обработки испачканных тканей и выполаскивания добавленной композиции смягчителя тканей, или ее можно составить в виде композиции моющего средства для применения в обычных способах очистки твердых поверхностей в домашнем хозяйстве, или ее можно составить для режимов ручной и машинной мойки посуды.

Способ очистки или способ ухода за текстильным изделием может представлять собой, например, способ стирки, способ мытья посуды или очистки твердых поверхностей, таких как керамической плитки в ванной комнате, полов, верхних поверхностей столов, сточных труб, раковин и умывальников. Способы стирки могут представлять собой, например, как стирку в домашних условиях, но и стирку в промышленных условиях. Способ стирки тканей и/или одежды может представлять собой способ, включающий обработку тканей моющим раствором, содержащим композицию моющего средства и по меньшей мере один вариант протеазы. Способ очистки или способ ухода за текстильным изделием можно осуществлять, например, в способе машинной мойки или в способе ручной мойки. Моющий раствор может представлять собой, например, водный моющий раствор, содержащий композицию моющего средства.

Ткани и/или одежда, подвергаемые стирке, очистке или способу ухода за текстильным изделием, могут представлять собой белье, пригодное для обычной стирки, например, испачканное домашнее белье. Предпочтительно, основная часть белья для стирки представляет собой одежду и ткани, в том числе трикотажные изделия, тканные изделия, изделия из грубой хлопчатобумажной ткани, нетканые изделия, войлочные изделия, пряжа и ткань для полотенец. Ткани могут быть на основе целлюлозы, например, природные целлюлозные полимеры, в том числе хлопок, волокна льна, льняное полотно, джутовая ткань, волокна рами, сизаль или кокосовые волокна, или искусственные целлюлозные полимеры (например, полученные из древесной пульпы), в том числе вискоза/искусственный шелк, волокна рами, волокна из ацетата целлюлозы (триацетатные), лиоцелл, или их смеси. Ткани также могут быть отличными от целлюлозных, например, природные полиамиды, в том числе шерсть, верблюжья шерсть, кашемир, мохер, кроличья шерсть и шелк, или синтетический полимер, например, нейлон, арамид, полиэстер, полимер на основе акрилонитрила, полипропилен и спандекс/эластан, или их смеси, а также смесь волокон на основе целлюлозы и волокон, отличных от целлюлозных. Примерами смесей являются смеси хлопка и/или искусственного шелка/вискозы с одним или несколькими дополнительными материалами, такими как шерсть, синтетические волокна (например, полиамидные волокна, акриловые волокна, полиэфирные волокна, волокна из поливинилового спирта, поливинилхлоридные волокна, полиуретановые волокна, полимочевинные волокна, арамидные волокна) и целлюлозосодержащие волокна (например, искусственный шелк/вискоза, волокна рами, льняная пряжа/льняное полотно, джутовая ткань, волокна из ацетата целлюлозы, лиоцелл).

За последние несколько лет наблюдается повышений интерес к замене компонентов в моющих средствах, которые получены из нефтепродуктов, на возобновляемые биологические компоненты, такие как ферменты или полипептиды без снижения моющей эффективности. Когда в компонентах из композиций моющего средства меняют новую ферментативную активность или меняют на новые ферменты, обладающие альтернативными и/или улучшенными характеристиками, по сравнению, с обычно применяемыми в моющем средстве, ферментами, такими как протеазы, липазы и амилазы, необходимые для достижения похожей или улучшенной моющей эффективности, по сравнению с традиционными композициями моющего средства.

Протеазы и их варианты являются пригодными для применения в способах удаления белкового пятна. Белковые пятна могут представлять собой пятна, такие как пятна от продуктов питания, например, детского питания, кожного жира, какао, яйца, крови, молока, чернил, травы или их комбинации.

Типичные композиции моющего средства включают разные компоненты в дополнение к ферментам, эти компоненты имеют разные эффекты, некоторые компоненты, как поверхностно-активные вещества, снижают поверхностное натяжение в моющем средстве, что позволяет снять и диспергировать очищаемое пятно, а затем смыть, другие компоненты, как отбеливающие системы, выводят изменение цвета часто окислением, и многие отбеливатели также имеют сильные бактерицидные свойства и применяются для дезинфекции и стерилизации. Еще одни компоненты, такие как средство, усиливающее моющее действие, и хелатор смягчают, например, воду для стирки, удаляя ионы металлов из жидкости.

Композиции фермента могут дополнительно содержать по меньшей мере одно или несколько из следующего: поверхностно-активного вещества, средства, способствующего усилению моющего действия, хелатора или хелатирующего средства, отбеливающей системы или отбеливающего компонента для стирки или мытья посуды.

Количество поверхностно-активного вещества, средства, способствующего усилению моющего действия, хелаторов или хелатирующего средства, отбеливающей системы и/или отбеливающего компонента может быть сниженным по сравнению с количеством поверхностно-активного вещества, средства, способствующего усилению моющего действия, хелаторов или хелатирующего средства, отбеливающей системы и/или отбеливающего компонента, применяемого без добавления вариантов протеазы по настоящему изобретению. Предпочтительно по меньшей мере один компонент, который представляет собой поверхностно-активное вещество, средство, способствующее усилению моющего действия, хелатор или хелатирующее средство, отбеливающую систему и/или отбеливающий компонент, присутствует в количестве, которое составляет на 1% меньше, например, на 2% меньше, например, на 3% меньше, например, на 4% меньше, например, на 5% меньше, например, на 6% меньше, например, на 7% меньше, например, на 8% меньше, например, на 9% меньше, например, на 10% меньше, например, на 15% меньше, например, на 20% меньше, например, на 25% меньше, например, на 30% меньше, например, на 35% меньше, например, на 40% меньше, например, на 45% меньше, например, на 50% меньше количества компонента системы без добавления вариантов протеаз по настоящему изобретению, например обычного количества такого компонента. Композиции моющего средства также могут представлять собой композицию, в которой отсутствует по меньшей мере один компонент, который является поверхностно-активным веществом, средством, способствующим усилению моющего действия, хелатором или хелатирующим средством, отбеливающей системой или отбеливающим компонентом и/или полимером.

Способ стирки

Композиции моющего средства идеально подходят для способов применения при стирки белья. Эти способы включают способ для стирки ткани. Способ включает этапы взаимодействия ткани для стирки с моющим раствором для стирки, содержащим композицию моющего средства. Ткань может включать любые ткани, поддающиеся стирке в нормальных условиях применения потребителем. Раствор предпочтительно имеет pH от примерно 5,5 до примерно 11,5. Композиции можно использовать при концентрациях в растворе от приблизительно 100 ppm, предпочтительно 500 ppm, до приблизительно 15,000 ppm. Температуры воды, как правило, находятся в диапазоне от 5ºC до приблизительно 95ºC, включая приблизительно 10ºC, приблизительно 15ºC, приблизительно 20ºC, приблизительно 25ºC, приблизительно 30ºC, приблизительно 35ºC, приблизительно 40ºC, приблизительно 45ºC, приблизительно 50ºC, приблизительно 55ºC, приблизительно 60ºC, приблизительно 65ºC, приблизительно 70ºC, приблизительно 75ºC, приблизительно 80ºC, приблизительно 85ºC и приблизительно 90ºC. Соотношение воды и ткани, как правило, составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.

В конкретных вариантах осуществления способ стирки проводят при pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5 или от приблизительно 6 до приблизительно 10,5, от приблизительно 5 до приблизительно 11, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 5 до приблизительно 9, от приблизительно 5 до приблизительно 8, от приблизительно 5 до приблизительно 7, от приблизительно 5,5 до приблизительно 11, от приблизительно 5,5 до приблизительно 10, от приблизительно 5,5 до приблизительно 9, от приблизительно 5,5 до приблизительно 8, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7, от приблизительно 6 до приблизительно 11, от приблизительно 6 до приблизительно 10, от приблизительно 6 до приблизительно 9, от приблизительно 6 до приблизительно 8, от приблизительно 6 до приблизительно 7, от приблизительно 6,5 до приблизительно 11, от приблизительно 6,5 до приблизительно 10, от приблизительно 6,5 до приблизительно 9, от приблизительно 6,5 до приблизительно 8, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7, от приблизительно 7 до приблизительно 11, от приблизительно 7 до приблизительно 10, от приблизительно 7 до приблизительно 9, или от приблизительно 7 до приблизительно 8, от приблизительно 8 до приблизительно 11, от приблизительно 8 до приблизительно 10, от приблизительно 8 до приблизительно 9, от приблизительно 9 до приблизительно 11, от приблизительно 9 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 11, предпочтительно, от приблизительно 5,5 до приблизительно 11,5.

В конкретных вариантах осуществления способ стирки проводят при степени жесткости от приблизительно 0°dH до приблизительно 30°dH, например, приблизительно 1°dH, приблизительно 2°dH, приблизительно 3°dH, приблизительно 4°dH, приблизительно 5°dH, приблизительно 6°dH, приблизительно 7°dH, приблизительно 8°dH, приблизительно 9°dH, приблизительно 10°dH, приблизительно 11°dH, приблизительно 12°dH, приблизительно 13°dH, приблизительно 14°dH, приблизительно 15°dH, приблизительно 16°dH, приблизительно 17°dH, приблизительно 18°dH, приблизительно 19°dH, приблизительно 20°dH, приблизительно 21°dH, приблизительно 22°dH, приблизительно 23°dH, приблизительно 24°dH, приблизительно 25°dH, приблизительно 26°dH, приблизительно 27°dH, приблизительно 28°dH, приблизительно 29°dH, приблизительно 30°dH. При типичных европейских условиях стирки степень жесткости составляет приблизительно 16°dH, при типичных US условиях стирки - составляет приблизительно 6°dH и при типичных азиатских условиях стирки - приблизительно 3°dH.

Композиции для применения в описанных выше способах могут дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный фермент, как изложено в разделе “другие ферменты” выше, например, фермент, выбранный из группы гидролаз, таких как протеазы, липазы и кутиназы, карбогидразы, таких как амилазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы и пектиназы или их комбинации.

Настоящее изобретение дополнительно описано при помощи следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Примеры

Материалы и способы

Анализ автоматического механического стресса (AMSA) при стирке

Для того, чтобы оценить моющую эффективность, применяли анализ автоматического механического стресса (AMSA) при осуществлении стирки в стиральных экспериментах. С помощью AMSA можно оценить моющую эффективность большого количества маленького объема растворов моющего средства с ферментом. AMSA планшет имеет несколько слотов для исследуемых растворов и крышку, прочно закрывающую образец для стирки, постиранный текстильный материал напротив всех отверстий слотов. В течение периода стирки планшет, исследуемые растворы, текстильный материал и крышку энергично встряхивали для соприкосновения исследуемого раствора с текстильным материалом и создавали механический стресс в регулярной, периодической колебательной манере. Дополнительное описание см. в WO02/42740, в особенности параграф "Special method embodiments" на стр. 23-24.

Моющую эффективность измеряли по яркости цвета постиранного текстильного материала. Яркость также можно выражать, как интенсивность света, отраженного от образца, при облучении белым светом. При испачканном образце интенсивность отраженного света является ниже, чем интенсивность у чистого образца. Следовательно, интенсивность отраженного света можно использовать для измерения моющей эффективности.

Измерения цвета проводили с помощью профессионального планшетного сканера (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brøndby, Denmark), который применялся для фиксации изображения постиранного текстильного материала.

Для получения значения интенсивности света со сканированных изображений значения 24-битного пиксельного изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего цвета (RGB). Значение интенсивности (Int) рассчитывали путем сложения всех значений RGB в качестве векторов и, затем, учетом длины результирующего вектора:

.

Таблица 1. Композиция модельных моющих средств и исследуемых материалов

Модельное моющее средство и исследуемые материалы представляли собой следующее:

Жидкое модельное моющее средство для стирки

0,3-0,5% ксантановая камедь,
0,2-0,4% противовспенивательное средство,
6-7% глицерин, 0,3-0,5% этанол
4-7% FAEOS (эфирсульфат жирного спирта),
24-28% неионные поверхностно-активные вещества,
1% борная кислота, 1-2% цитрат натрия (дегидратированный),
2-4% карбонат натрия, 14-16% кокосовая жирная кислота,
0,5% HEDP (1-гидроксиэтан-(1,1-дифосфоновая кислота)),
0-0,4% PVP (поливинилпирролидон),
0-0,05% оптические отбеливатели,
0-0,001% краситель, остаток - деионизированная вода.

Исследуемый материал

PC-03 (шоколад-молоко/чернила на хлопке/полиэстере)
C-05 (кровь/молоко/чернила на хлопке)

Общие способы молекулярной биологии

Если не указано иное манипуляции с ДНК и трансформации осуществляли, применяя стандартные способы молекулярной биологии (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood and Cutting (1990).

Анализы протеазной активности

1) Анализ активности Suc-AAPF-pNA

Протеолитическую активность можно определить с помощью способа с использованием субстрата Suc-AAPF-PNA. Suc-AAPF-PNA представляет собой аббревиатуру N-сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-p-нитроанилида и является блокированным пептидом, который может быть расщеплен эндо-протеазами. После расщепления высвобождается свободная молекула PNA и она имеет желтый цвет, и, таким образом, может быть измерена спектрофотометром в видимой части спектра при длине волны 405 нм. Субстрат Suc-AAPF-PNA производит Bachem (кат. № L1400, растворенный в DMSO).

Образец протеазы, подлежащий анализу, разводили в буфере для определения остаточной активности (100мМ Tris pH 8,6). Анализ осуществляли путем переноса 60 мкл разведенных образцов фермента в 96-луночный микротитрационный планшет и добавлением 140 мкл рабочего раствора субстрата (0,72мг/мл в 100мМ Tris pH 8,6). Раствор перемешивали при комнатной температуре и измеряли поглощение каждые 20 сек. в течение 5 минут при OD 405 нм.

Наклон (поглощение в минуту) кривой поглощения в зависимости от времени является прямо пропорциональным специфической активности (активности на мг фермента) протеазы при данной комбинации условий. Образец протеазы следовало разбавлять до уровня, при котором наклон становится линейным.

Пример 1. Получение и исследование вариантов протеазы

Получение и экспрессия вариантов

Сайт-специфические варианты конструировали из TY145 протеазы (SEQ ID NO: 3), содержащей специфические вставки/делеции/замены в 170-180 участке со стороны N-конца в соответствии с настоящим изобретением. Варианты получали путем традиционного клонирования ДНК фрагментов (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989), применяя ПЦР вместе с правильно разработанными мутагенными олигонуклеотидами, посредством которых вводили целевые мутации в результирующую последовательность. Мутагенные олигонуклеотиды были синтезированы к соответствующей последовательности ДНК, которая фланкирует необходимый(е) сайт(ы) мутации, отделенный парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены. Таким образом, были сконструированы и получены варианты, перечисленные в таблице 2a ниже.

Ферментация вариантов

Ферментацию можно осуществлять способами, хорошо известными из уровня техники или следующим образом. Штамм B. subtilis, несущий значимую экспрессионную плазмиду, сеяли штрихом на чашке с LB-агаровой средой со значимым антибиотиком (6 мкг/мл хлорамфеникола) и выращивали в течение ночи при 37°C.

Колонии переносили в 100 мл PS-1 среды, дополненной значимым антибиотиком, во встряхиваемую колбу на 500 мл с обогащенной средой (например, PS-1: 100 г/л сахарозы (Danisco кат. № 109-0429), 40 г/л корки сои (соевой муки), 10 г/л Na₂HPO₄.12H₂O (Merck кат. № 6579), 0,1 мл/л Pluronic PE 6100 (BASF 102-3098)). Культивирование обычно осуществляли 4 дня при 30^oC, встряхивая с 220 об/мин. Клетки и другой нерастворимый материал удаляли из ферментативного бульона путем центрифугирования при 4500 об/мин в течение 20-25 минут. Затем супернатант фильтровали с получением чистого раствора.

Пример 2

В этом примере, выше описанный анализ PNA-Suc-AAPF применяли для определения остаточной активности протеазы после инкубации в присутствии жидкого моющего средства. В общем остаточную активность протеазы определяли после инкубации в жидком моющем средстве (конечная концентрация 90%) при указанных температурах и времени инкубации, и активность при этом, сравнивали с активностью при инкубации без действия стрессовых условий, при 4°C. Для определения стабильности протеазы в моющем средстве, исследуемые ферменты доводили до концентрации в 0,15 мг/мл белка фермента с помощью разведения в буфере для разведения фермента (100 мМ Tris pH 8,6, 0,0225% (вес/объем) Brij-35, 2мМ CaCl₂). Переносили 30 мкл раствора протеазы и 270 мкл жидкого моющего средства (модельное жидкое моющее средство) в 96-луночный микротитрационный планшет (Nunc 96U PP) в 4 повторностях. Один небольшой магнит (5 x 2 мм) помещали в каждую лунку и смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре на магнитной мешалке. После перемешивания 20 мкл переносили в 96-луночный микротитрационный планшет и инкубировали при 4°C в течение 24 часов (образец, не подвергнутый стрессовым условиям). Микротитрационный планшет тщательно теплоизолировали с помощью альфоля и инкубировали при указанной температуре в течение 24 часов (образец, подвергнутый стрессовым условиям). После инкубации образцы в планшетах анализировали на протеазную активность, как описано в анализе PNA-Suc-AAPF для определения остаточной активности протеазы. Следует заметить, что в целях уменьшения помех от других ингредиентов моющего средства, отличных от анализируемого фермента, оба образца, которые подвергали и не подвергали стрессовым условиям, разводили до одинаковой концентрации белка.

После инкубации извлекали 20 мкл образца, подвергнутого стрессовым условиям, и добавляли 150 мкл буфера для определения остаточной активности (100 мМ Tris pH 8,6), и смешивали, применяя магнитную мешалку, в течение 5 минут. Переносили 60 мкл разведенного образца в новый 96-луночный микротитрационный планшет. Перед применением, готовили рабочий раствор субстрата PNA-Suc-AAPF в буфере для определения остаточной активности (0,72 мг/мл в 100 мМ Tris pH 8,6). Добавляли 140 мкл рабочего раствора субстрата к разведенному образцу, смешивали и моментально измеряли поглощение при 405 нм в течение 5-10 минут каждые 20 секунд при комнатной температуре. Vmax учитывали только от линейного диапазона кинетической кривой. Повторяли измерение остаточной активности для образца, не подвергнутого стрессовым условиям, добавлением 150 мкл буфера для определения остаточной активности (100 мМ Tris pH 8,6) в микротитрационный планшет с 20 мкл образца, не подвергнутого стрессовым условиям (инкубированного при 4°C), и смешивали применяя магнитную мешалку в течение 5 минут. Переносили 60 мкл разведенного образца в новый 96-луночный микротитрационный планшет. Добавляли 140 мкл рабочего раствора субстрата к разведенному образцу, смешивали и моментально измеряли поглощение при 405 нм в течение 5-10 минут каждые 20 секунд при комнатной температуре. Vmax учитывали только от линейного диапазона кинетической кривой.

Во всех экспериментах обеспечивали, чтобы эталонную протеазу помещали по меньшей мере один раз во все исследуемые микротитрационные планшеты.

Остаточную активность (%RA) рассчитывали как %RA = 100 * Vmax (образца, подвергнутого стрессовым условиям,) / Vmax (образца, не подвергнутого стрессовым условиям).

Период полужизни (T½(h)) рассчитывали: T½ (часов) = T (часов)*LN(0,5)/LN(%RA/100), где T представляет собой время инкубации (часов) и %RA представляет собой остаточную активность.

Таблица 3a. Стабильность вариантов, измеренная при 35°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 35°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	18
G179C	36
G179V	56
G179Q	65
G179S	29
G179Y	67
G179T	31
G179E	28
G179H	79
G179K	47
G179M	29
G179A	82
G179N	37
S171W	28
S171K	23
S171E	23
S175A	44
S175V	30
S175P	108

Таблица 3b. Стабильность вариантов, измеренная при 35°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 35°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	18
I121V S175P	96
S175A G179S	78
L81V S175A	90
A102T S175A	86
S144R G179Q	96
S144R S171N	96
S144R F180Y	70
S171N	40
G179S F180Y G183A A187V	95

Таблица 4a. Стабильность вариантов, измеренная при 42°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 42°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	0
S173P	96
S171N S175P	10
I121V S175P	7
L81V S175P	6
A102T S175P	6
I137E S175P	7
I121V S175A	3
L81F S175A	3
I137E S175A	4
S144Q S175P	6
S144Q S175A	3
I121T S175P	8

Таблица 4b. Стабильность вариантов , измеренная при 42°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 42°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	0
S173Y G174S S175A F180Y	96
I137E S173Y G174S S175A F180Y	11
S144Q S173Y G174S S175A F180Y	9
S173Y G174S S175A F180Y S274I	10
S173Y G174S S175A F180Y V286Q	10
T40D S173Y G174S S175A F180Y	9
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	30
D155N G159S S173Y G174S S175A F180Y	6
I121V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	52
L81V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	41
A102T S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	37
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P	48
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	41
S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	41
Q70N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	59
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	45
T40D S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	32
S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	52
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	44

Таблица 5a. Стабильность вариантов, измеренная при 47°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 47°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	0
S173P	26
S171N S175P	6
I121V S175P	6
L81V S175P	6
A102T S175P	6
I137E S175P	6
I121V S175A	6
L81F S175A	6
I137E S175A	6
S144Q S175P	6
S144Q S175A	6
I121T S175P	6
S173P S274I	29
I137M S173P	30
S171N S173P	38
L81F S173P	28
A102T S173P	26
S144Q S173P	29
I137E S173P	35
S173P T241P	32
S173P S175A	34
L81G S173P	39

Таблица 5b. Стабильность вариантов, измеренная при 47°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 47°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	0
S173P S175P F180Y	96
T74M I137E S173P	26
T79I I137E S173P	27
L34I I137E S173P	36
Y39D I137E S173P	39
T40P I137E S173P	46
I137E S173P I247M	41
I137E S173P H256F	31
S173Y G174S S175A F180Y	22
I137E S173Y S175A F180Y	6
S173Y G174S S175P F180Y	6
I137E S173P S175P F180Y	96
V162R S173P S175P F180Y	96
S173P S175P F180Y S274I	96
S173P G174T S175V T177S F180Y	39
S173Y G174S S175A F180Y T241P	6
I137E S173Y G174S S175A F180Y	6
S144Q S173Y G174S S175A F180Y	6
Q70N S173Y G174S S175A F180Y	6
S173Y G174S S175A F180Y S274I	6
S173Y G174S S175A F180Y V286Q	6
T40D S173Y G174S S175A F180Y	6
V162R S173Y G174S S175A F180Y	6
I121V S173Y G174S S175A F180Y	6
L81V S173Y G174S S175A F180Y	6
A102T S173Y G174S S175A F180Y	6
S173P G174T S175A T177S F180Y	39
I137E S173P S175V T177S F180Y	34
S171N S173Y G174S S175A F180Y	6
I137E S173Y G174S S175P F180Y	7
S173P G174T S175P T177S F180Y	61
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	6
V162R S173P G174T S175V T177S F180Y	68
I121V S173P G174T S175V T177S F180Y	49
L81V S173P G174T S175V T177S F180Y	41
A102T S173P G174T S175V T177S F180Y	42
S173P G174T S175V T177S F180Y T241P	61
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	79
S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y	65
Q70N S173P G174T S175V T177S F180Y	80
S173P G174T S175V T177S F180Y S274I	56
S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	56
T40D S173P G174T S175V T177S F180Y	37
S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	58
I121V I137E S173Y G174S S175A F180Y	6
L81V I137E S173Y G174S S175A F180Y	6
I137E S173Y G174S S175A F180Y T241P	6
Q70N I137E S173Y G174S S175A F180Y	6
I137E S173Y G174S S175A F180Y S274I	6
I137E S173Y G174S S175A F180Y T297P	8
G132I S173P G174T S175V T177S F180Y	45
S173P G174T S175V T177S F180Y T297P	72
I137E S144Q S173Y G174S S175A F180Y	6
T40L I137E S173Y G174S S175A F180Y	6
I137E S173P S175P N176G T177S F180Y	6
S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	6
I137E S173Y G174S S175A F180Y V286Q	6
I137E S173P G174T S175P T177S F180Y	88
D155N G159S S173P G174T S175V T177S F180Y	17
V162R S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	11
I121V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	8
L81V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	7
A102T S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	7
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P	9
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	9
S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	7
Q70N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	8
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	9
T40D S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	7
S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	9
I121V I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	73
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y T241P	90
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	75
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y T297P	96
I137E S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	74
I137E S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	6
G132I S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	6
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	16
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y S274I	64
I137E S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y	56
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	7
I121V I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	13
Q70N I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	13
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	12
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	12
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	23
I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	15
I137E S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	11
V162R S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	16
I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P	22
I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	41

Таблица 6. Стабильность вариантов , измеренная при 52°C

Мутации	Период полужизни T½ (часов) (инкубация при 52°C в течение 24ч. в 90% моющем средстве)
TY-145 (SEQ ID NO 3)	0
I137E S173P	6
S173P S175P F180Y	27
T40P I137E S173P	7
I137E S173P S175P F180Y	39
V162R S173P S175P F180Y	45
S173P S175P F180Y S274I	30
S173P S175P F180Y T241P	31
S173P S175P F180Y V286Q	30
S173P S175P F180Y T297P	46
S173P G174T S175V T177S F180Y	11
V162R S173P G174T S175V T177S F180Y	16
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	15
Q70N S173P G174T S175V T177S F180Y	16
S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	14
S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	15
I137E S173P G174T S175A T177S F180Y	14
S173P G174T S175V T177S F180Y T297P	20
I137E S173P G174T S175P T177S F180Y	37
L81V I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	17
Q70N I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	26
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	16
I137E S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	23
I137E S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y	15
I137E S173P G174T S175P T177S F180Y T297P	96

Пример 3

Моющую эффективность вариантов протеаз исследовали, применяя жидкое моющее средство на 3 разных технических пятнах, с помощью анализа автоматического механического стресса.

Эксперименты проводили, как описано в способе AMSA для стирки, применяя процедуру стирки одного цикла, с композицией моющего средства и образцами ткани, описанными в таблице 1, и условиями эксперимента, указанными в таблице 7 ниже.

Таблица 7. Условия эксперимента для AMSA для таблиц 7a-7f

Исследуемый раствор	4,66 г/л жидкого модельного моющего средства
Объем исследуемого раствора	160 мкл
pH	без изменений
Время стирки	20 минут
Температура	20°C
Жесткость воды	16°dH
Концентрация протеазы	0 (холостой образец), 10 нМ или 30 нМ
Образец ткани	PC-03, C-05

Жесткость воды регулировали до 16°dH путем добавления CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃

(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^2-) = 5:1:6 для PC-03 и 5:1:11 для C-05 в исследуемую систему. После стирки текстильные изделия прополаскивали и высушивали.

Таблица 7a. Моющая эффективность одиночных и двойных вариантов протеаз касательно пятен шоколада, молока, сажи, при эталонном ферменте TY-145 (SEQ ID NO 3)

Мутации	Моющая эффективность относительно SEQ ID NO 3, при 20°C на PC-03
G179S	96
S173P	108
I121V S175A	106
L81V S175A	97
S144Q S175P	112
S144Q S175A	97
S173P S274I	102
L81F S173P	103
S144Q S173P	101
I137E S173P	97
S173P T241P	111
S173P S175A	106

Таблица 7b. Моющая эффективность вариантов протеаз касательно пятен шоколада, молока, сажи, при эталонном ферменте TY-145 (SEQ ID NO 3)

Мутации	Моющая эффективность относительно SEQ ID NO 3, при 20°C на PC-03
S173P S175P F180Y	91
S173Y G174S S175A F180Y	101
S173P G174T S175V T177S F180Y	98
I137E S173Y G174S S175A F180Y	108
S144Q S173Y G174S S175A F180Y	101
S173Y G174S S175A F180Y S274I	117
S173Y G174S S175A F180Y V286Q	94
V162R S173Y G174S S175A F180Y	121
I121V S173Y G174S S175A F180Y	110
S173P G174T S175A T177S F180Y	106
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	98
D155N G159S S173Y G174S S175A F180Y	118
V162R S173P G174T S175V T177S F180Y	125
I121V S173P G174T S175V T177S F180Y	99
L81V S173P G174T S175V T177S F180Y	98
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	112
S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	94
S173P G174T S175V T177S F180Y T297P	94
S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	107
D155N G159S S173P G174T S175V T177S F180Y	116
V162R S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	135
I121V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	117
L81V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	104
A102T S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	110
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	122
S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	107
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	112
S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	125
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	100
I137E S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	106
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	117
D155N G159S S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	99
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	125
I121V I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	189
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	97
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	96
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	128
I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	121

Таблица 7c. Моющая эффективность одиночных и двойных вариантов протеаз касательно пятен крови, молока, чернил, при эталонном ферменте TY-145 (SEQ ID NO 3)

Мутации	Моющая эффективность относящаяся к SEQ ID NO 3, при 20°C на C-05
S173P	110
I121V S175P	113
L81V S175P	105
A102T S175P	100
S175A G179S	95
I121V S175A	111
L81V S175A	101
I137E S175A	95
S144Q S175P	116
S144Q S175A	104
I121T S175P	98
S144R S171N	103
S173P S274I	96
I137M S173P	105
S171N S173P	115
L81F S173P	111
L81H S173P	103
A102T S173P	117
S144Q S173P	108
I137E S173P	120
S173P T241P	129
S173P S175A	100

Таблица 7d. Моющая эффективность вариантов протеаз касательно пятен крови, молока, чернил, при эталонном ферменте TY-145 (SEQ ID NO 3)

Мутации	Моющая эффективность относительно SEQ ID NO 3, при 20°C на C-05
S173P S175P F180Y	98
S173Y G174S S175A F180Y	120
I137E S173Y S175A F180Y	103
S173P G174T S175V T177S F180Y	106
I137E S173Y G174S S175A F180Y	108
S144Q S173Y G174S S175A F180Y	98
Q70N S173Y G174S S175A F180Y	105
S173Y G174S S175A F180Y S274I	95
S173Y G174S S175A F180Y V286Q	112
V162R S173Y G174S S175A F180Y	116
I121V S173Y G174S S175A F180Y	123
L81V S173Y G174S S175A F180Y	116
A102T S173Y G174S S175A F180Y	101
S173P G174T S175A T177S F180Y	111
S171N S173Y G174S S175A F180Y	103
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	107
D155N G159S S173Y G174S S175A F180Y	97
V162R S173P G174T S175V T177S F180Y	124
I121V S173P G174T S175V T177S F180Y	109
L81V S173P G174T S175V T177S F180Y	102
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	104
S144Q S173P G174T S175V T177S F180Y	95
Q70N S173P G174T S175V T177S F180Y	98
S173P G174T S175V T177S F180Y S274I	116
S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	98
S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	101
L81V I137E S173Y G174S S175A F180Y	97
I137E S173Y G174S S175A F180Y S274I	109
I137E S173Y G174S S175A F180Y T297P	100
I137E S173P G174T S175A T177S F180Y	104
S173P G174T S175V T177S F180Y T297P	113
T40L I137E S173Y G174S S175A F180Y	96
S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	112
I137E S173Y G174S S175A F180Y V286Q	98
D155N G159S S173P G174T S175V T177S F180Y	107
V162R S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	113
I121V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	116
L81V S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	114
A102T S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	106
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P	94
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	122
S144Q S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	109
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	99
T40D S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	105
S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	116
L81V I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	100
Q70N I137E S173P G174T S175V T177S F180Y	113
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y V286Q	109
I137E S171N S173P G174T S175V T177S F180Y	102
I137E S173P G174K S175A N176G T177S F180Y	119
G132I S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	107
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	109
I137E S173P G174T S175V T177S F180Y S274I	99
D155N G159S S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	115
S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	106
I121V I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	153
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S274I	100
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y V286Q	113
I137E S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P	126
I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y	122

Пример 4

Моющую эффективность вариантов в моющих средствах определяли, применяя следующие стандартизированные пятна:

A: кровь, молоко, чернила на хлопке: № продукта C-05, который получали из CFT (Центра материалов для исследований) (Center for Testmaterials) B.V., Влардинген, Нидерланды,

B: арахисовое масло, пигмент, впитавшееся молоко на хлопке: № продукта C-10, который получали из CFT (Центра материалов для исследований) (Center for Testmaterials) B.V., Влардинген, Нидерланды,

C: трава на хлопке: № продукта E164, который получали из Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG [Федеральное агентство материалов и исследований, материалы для исследований][Federal materials and testing agency, Testmaterials], Санкт-Галлен, Швейцария.

Жидкое моющее средство со следующей композицией применяли как базовый состав (все значения в проценте по весу): 0-0,5% ксантановая камедь, 0,2-0,4% противовспенивательное средство, 6-7% глицерин, 0,3-0,5% этанол, 0-7% FAEOS (эфирсульфат жирного спирта), 10-28% неионные поверхностно-активные вещества, 0,5-1% борная кислота, 1-2% цитрат натрия (дегидратированный), 2-4% карбонат натрия, 0-16% кокосовая жирная кислота, 0,5% HEDP (1-гидроксиэтан-(1,1-дифосфоновая кислота)), 0-0,4% PVP (поливинилпирролидон), 0-0,05% оптические отбеливатели, 0-0,001% краситель, остаток - деионизированная вода.

На основе этого базового состава получали разные моющие средства с помощью добавления соответствующих протеаз, как указано в таблицах 8a и b. Эталоном являлась протеаза, которая содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 и SEQ ID NO: 3 из WO 03/055713, при этом у эталонной протеазы уже наблюдали хорошую моющую эффективность, особенно в жидком моющем средстве. Протеазы добавляли в одинаковом количестве исходя из общего содержания белка (5 мг/л моющего раствора).

Соотношение дозировок жидкого моющего средства составляло 4,7 грамм на литр моющего раствора и процедуру стирки осуществляли в течение 60 минут при температуре 20°C и 40°C воды, имеющей жесткость воды от 15,5 до 16,5° (немецких градусов жесткости).

Белизну, т. е. отбеливание пятен, определяли фотометрически, как показатель моющей эффективности. Применяли прибор спектрофотометр Minolta CM508d, который предварительно калибровали, применяя стандарт белого, предусмотренный в комплекте.

Полученные результаты являются значениями расхождений от единиц отражения, полученных с моющими средствами и единиц отражения, полученных с моющим средством, содержащим эталонную протеазу. Положительное значение, следовательно, показывает улучшенную моющую эффективность вариантов в моющем средстве. Из таблиц 8a (результаты при 40°C) и 8b (результаты при 20°C) очевидно, что варианты в соответствии с настоящим изобретением показывают улучшенную моющую эффективность.

Таблица 8a. Моющая эффективность вариантов протеаз, которые имеют такую же аминокислотную последовательность как TY-145 (SEQ ID NO: 3), за исключением замен согласно таблице ниже, касательно пятен крови, молока, чернил на хлопке (A); эталоном является протеаза, которая содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 и SEQ ID NO.3 из WO 03/055713

Вариант протеазы	A
I137E + S173P	2,9
S173P + S175P + F180Y (variant 2)	3,2
I137E + S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y	3,5
S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y + S274I	2,6
S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y + T297P	3,6
S173P + S175P + F180Y + V286Q	2,5

Таблица 8b. Моющая эффективность вариантов протеаз касательно пятен крови, молока, чернил на хлопке (A), арахисового масла, пигмента, впитавшегося молока на хлопке (B); травы на хлопке (C); эталоном является протеаза, которая содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2 и SEQ ID NO.3 из WO 03/055713

Вариант протеазы	A	B	C
I137E + S173P	2,5	1,9	0,7
S173P + S175P + F180Y (вариант 2)	1,6	0,8	0,9
I137E + S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y	2,0	2,1	0,6
S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y + S274I	1,5	2,0	1,6
S173P + G174T + S175V + T177S + F180Y + T297P	3,1	1,6	1,2
S173P + S175P + F180Y + V286Q	2,0	0,6	1,0

Пример 5

Стабильность варианта 2, как определенно в примере 4, и фермента, не относящегося к протеазам, (маннаназы) исследовали в композиции жидкого моющего средства, как описано выше в примере 4 и согласно следующему протоколу:

1. Ферментный препарат. Правильный % ферментного препарата добавляли в состав и, затем, состав хранили в течение 8 недель при 30°C.

2. Протеазная активность. Активность фермента можно измерять согласно способам, известным из уровня техники. Анализы активности фермента хорошо известны специалисту в данной области техники и повседневно применяются. Анализы протеазной активности, например, раскрыты в Tenside, volume 7 (1970), стр. 125-132. Протеазную активность дополнительно можно определить, применяя Suc-AAPF-pNA анализ активности, который дает возможность измерить высвобождение пара-нитроанилина (pNA) из субстрата suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-нитроанилида (suc-AAPF-pNA. Высвобождение pNA вызывает увеличение экстинкции при 410 нм, при которой кривая изменений во времени является мерой ферментативной активности (cf. Del Mar et al., 1979). Измерение проводили при температуре в 25°C, при pH 8,6 и длине волны в 410 нм. Период измерений составлял 5 мин с интервалом измерения от 20 с до 60 с. Протеазную активность предпочтительно выражали в PU (протеазных единицах).

3. Маннаназная активность. После хранения остаточную маннаназную активность измеряли, как описано в "Assay of endo-1,4-beta-Mannanase using Beat Annanase Tablets" (Fa. Megazyme). Образцы фермента инкубировали с азурином сшитым с кардо галактоманнаном в 0,2 М Tris HCl pH 8,2. За реакцией следили с помощью спектроскопии при 590 нм.

4. Расчеты. Все показатели активности выражали в величинах относительной активности либо относительно к начальному значению, либо относительно к нормированной активности контрольной, не “разведенной” гранулированной смеси.

Стабильность варианта 2 исследовали в композиции жидкого моющего средства, как описано в примере 4. Для оценки эффекта бората и 4-формилфенилборной кислоты (4-FPBA) на стабильность варианта 2 эти два компонента добавляли в композицию жидкого моющего средства по отдельности или в комбинации в различных концентрациях, как в таблице 9a ниже.

Таблица 9a. Стабильность варианта 2 в композиции жидкого моющего средства, содержащей различные концентрации бората и 4-формилфенилборной кислоты (4-FPBA)

Стабильность вариантов протеазы	Без бората	С 1% вес/вес бората
0,9% вес/вес варианта 2 (2% (вес/вес) 4-FPBA)	65%	79%
0,9% вес/вес варианта 2 (0% (вес/вес) 4-FPBA)	11%	80%
0,9% вес/вес варианта 2 (1% (вес/вес) 4-FPBA)	57%	84%

Стабильность фермента, не относящегося к протеазам, в препарате жидкого моющего средства, содержащего вариант 2, исследовали добавлением 0,00001% активной маннаназы (Mannaway^TM от Novozymes) в композицию.

Таблица 9b. Стабильность маннаназы в композиции жидкого моющего средства, содержащей вариант 2 и различные концентрации бората и 4-формилфенилборной кислоты (4-FPBA)

Стабильность маннаназы	Без бората	С 1% вес/вес бората
0,9% вес/вес варианта 2 (2% (вес/вес) 4-FPBA)	30%	85%
0,9% вес/вес варианта 2 (0% (вес/вес) 4-FPBA)	0%	81%
0,9% вес/вес варианта 2 (1% (вес/вес) 4-FPBA)	15%	85%

Claims

1. Вариант протеазы, содержащий замену в положении 171 SEQ ID NO: 3, где вариант содержит последовательность, которая идентична SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75% и меньше чем на 100%, и вариант обладает протеазной активностью, где аминокислота в положении, соответствующем положению 171 SEQ ID NO: 3, выбрана из группы, состоящей из Trp, Lys, Glu и Asn.

2. Вариант протеазы по п.1, который дополнительно содержит замену в одном или более положениях, соответствующих положениям 173, 175, 179 и 180.

3. Вариант протеазы по п.2, где

a) аминокислота в положении, соответствующем положению 173 в SEQ ID NO: 3, представляет собой Pro, и/или

b) аминокислота в положении, соответствующем положению 175 в SEQ ID NO: 3, представляет собой Ala, Val, Pro, и/или

c) аминокислота в положении, соответствующем положению 179 в SEQ ID NO: 3, выбрана из группы, состоящей из Cys, Val, Gln, Ser, Thr, Glu, His, Lys, Met, Asn, Tyr и Ala.

4. Вариант по любому из пп.1-3, где аминокислота в положении, соответствующем положению 180 в SEQ ID NO: 3, представляет собой Tyr.

5. Вариант по любому из пп.1-4, где аминокислота в положении, соответствующем положению 175 в SEQ ID NO: 3, представляет собой Pro.

6. Вариант по любому из пп.1-5, который дополнительно содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из Y39D; T40{D,P}; Q70N; T74M; L81{F,H,V}; A102T; I121{V,T}; G132 {I,E}; I137{M;E}; S144{Q,R}; D155N; G159S; V162R; G174{S,T}; N176G; T177S; T241P; I247M; H256F; S274I; V286Q; T297P.

7. Вариант по любому из пп.1-6, который обладает улучшенной стабильностью в моющем средстве по сравнению с исходной молекулой или по сравнению с протеазой с SEQ ID NO: 3.

8. Вариант по любому из пп.1-7, где вариант по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 97%, но меньше чем на 100% идентичен по последовательности зрелому полипептиду с SEQ ID NO: 3.

9. Вариант по любому из пп.1-8, где общее число изменений по сравнению с SEQ ID NO: 3 составляет 1-20, например 1-10 или 1-5, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 изменений.

10. Вариант протеазы, содержащий любую из следующих замен по сравнению с SEQ ID NO: 3:

S171N S175P S144R S171N S171N S173P S171N S173P G174T S175V T177S F180Y S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y I137E S171N S173P G174T S175V T177S F180Y I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y S171N S173Y G174S S175A F180Y V162R S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T241P I137E S171N S173P G174K S175P N176G T177S F180Y T297P

11. Способ получения варианта протеазы, включающий введение в исходную протеазу замены в положении 171 SEQ ID NO: 3, где аминокислота в положении, соответствующем положению 171 SEQ ID NO: 3, заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Trp, Lys, Glu и Asn, и где вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 3, и извлечение варианта.

12. Способ по п.11, где замена осуществлена в одном или более положений, соответствующих любому из положений 173, 175, 179 или 180 зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

13. Способ по п.12, где Pro введен путем замены в положении, соответствующем положению 173 зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

14. Способ по п.12 или 13, где Ala, Val или Pro введены путем замены в положении, соответствующем положению 175 зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

15. Способ по любому из пп.12-14, где аминокислота, выбранная из группы, состоящей из Cys, Val, Gln, Ser, Thr, Glu, His, Lys, Met, Asn, Ala и Tyr, введена путем замены в положении, соответствующем положению 179 зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

16. Способ по п.12, где Tyr введен путем замены в положении, соответствующем положению 180 зрелого полипептида с SEQ ID NO: 3.

17. Способ по любому из пп.11-16, где вариант протеазы по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 97%, но меньше чем на 100%, идентичен по последовательности зрелому полипептиду с SEQ ID NO: 3.

18. Способ по любому из пп.11-17, где исходная протеаза по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% идентична по последовательности SEQ ID NO: 3.