RU2670128C2 - Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons - Google Patents
Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670128C2 RU2670128C2 RU2016149678A RU2016149678A RU2670128C2 RU 2670128 C2 RU2670128 C2 RU 2670128C2 RU 2016149678 A RU2016149678 A RU 2016149678A RU 2016149678 A RU2016149678 A RU 2016149678A RU 2670128 C2 RU2670128 C2 RU 2670128C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- genetic
- neurons
- seq
- neurogenesis
- transfection
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000012937 correction Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims abstract description 14
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000000768 catecholaminergic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 1
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015284 positive regulation of neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии для регистрации и коррекции нейрогенеза посредством специфической трансфекции нейронов с целью таргентного контроля внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также может быть использовано в области медицины для терапии нейродегенеративных заболеваний.The invention relates to the field of molecular biology for registration and correction of neurogenesis through specific transfection of neurons with the aim of targeted monitoring of intracellular cascades, in particular, for the study of neurodegenerative diseases, and can also be used in the field of medicine for the treatment of neurodegenerative diseases.
Известно изобретение «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346), содержащее сходное с используемым в заявленном способе химическое соединение, обладающее способностью к стимуляции нейрогенеза и (или) ингибированию нейрональной дегенерации.The invention is known "Method and composition for stimulating neurogenesis and inhibiting neuronal degeneration" (RF patent No. 2440346), containing a chemical compound similar to that used in the claimed method, having the ability to stimulate neurogenesis and (or) inhibit neuronal degeneration.
Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения не представляется возможным стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессировать в нейронах флуоресцентный маркер.The disadvantage of this method is that using the chemical compound described in it, it is not possible to stimulate or inhibit the expression of target genes in populations of brain neurons, as well as to express a fluorescent marker in neurons.
Наиболее близким по технической сущности заявляемому способу, выбранному в качестве прототипа, является «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346, 20.01.2012), при котором используется химическое соединение, обладающее активностью стимуляции образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов.The closest in technical essence of the claimed method, selected as a prototype, is the "Method and composition for stimulating neurogenesis and inhibiting neuronal degeneration" (RF patent No. 2440346, 01/20/2012), which uses a chemical compound with activity to stimulate the formation of nerve tissue and (or) inhibition of neuronal degeneration.
Недостатком этого способа является отсутствие возможности стимуляции или ингибирования экспрессии таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессии в нейронах флуоресцентного маркера.The disadvantage of this method is the inability to stimulate or inhibit the expression of target genes in populations of brain neurons, as well as the expression of a fluorescent marker in neurons.
Задачей заявляемого изобретения является реализация механизма таргентного контроля внутриклеточных каскадов в нейронах с целью стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования нейрональной дегенерации, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний путем специфической трансфекции нейронов генетическими конструкциями, позволяющими визуализировать отдельные типы клеток головного мозга с помощью флуоресцентных маркеров.The objective of the invention is the implementation of the mechanism of targeted monitoring of intracellular cascades in neurons in order to stimulate neurogenesis and (or) inhibit neuronal degeneration, in particular, to study neurodegenerative diseases by specific transfection of neurons with genetic constructs that allow visualization of certain types of brain cells using fluorescent markers.
Поставленная задача решается тем, что в способе генетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции нейронов, для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний, согласно изобретению разрабатывают генетическую конструкцию SEQ ID N4 на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции нейронов, обладающую способностью осуществлять таргетный контроль внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также экспрессировать в них генетически кодируемый кальциевый индикатор.The problem is solved in that in the method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructs for transfection of neurons, to create a new type of therapy for neurodegenerative diseases, according to the invention, a genetic construct SEQ ID N4 based on a lentiviral vector for specific transfection of neurons with the ability to carry out targeted control of intracellular cascades, in particular for the study of neurodegenerative diseases, and also to express they have a genetically encoded calcium indicator.
В разработанной для осуществления способа генетической регистрации и коррекции нейрогенеза генетической конструкции SEQ ID N4 в качестве вектора используют лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1, модифицированный последовательностями SEQ ID N1, кодирующей посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), SEQ ID N2, кодирующей генетически кодируемый кальциевый индикатор (TN-XXL), SEQ ID N3, кодирующей искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8), экспрессия которых приводит клеточно-специфической экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора в катехоламинергических нейронах головного мозга.In the method for genetic registration and correction of neurogenesis of the genetic construct of SEQ ID N4, a HIV-1 based lentiviral vector modified by the sequences of SEQ ID N1 encoding the post-transcriptional regulatory element of marmot hepatitis virus (WPRE), SEQ ID N2 encoding genetically, was used as a vector encoded calcium indicator (TN-XXL), SEQ ID N3, encoding an artificial phenotype-specific neuronal promoter (PRSx8), the expression of which leads to cell-specific expression of genetic eski encoded calcium indicator in catecholaminergic neurons of the brain.
Для эффективного ингибирования экспрессии таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции клеточно-специфических промоторов, обеспечивающих синтез интересующих генов только в определенном типе клеток.To effectively inhibit the expression of target genes, it is envisaged to integrate cell-specific promoters into the sequence of the genetic construct that ensure the synthesis of genes of interest only in a certain type of cell.
Для управляемого стимулирования нейрогенеза и(или) ингибирования таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции генов, экспрессия которых активируется под воздействием химических стимулов, что, в свою очередь, приводит к повышению концентрации определенных веществ, оказывающих влияние на выделение глиотрансмиттеров, которые, в свою очередь, оказывают влияние на жизнедеятельность нейронов и нейрогенез, в частности, а также обеспечивающих возможность визуализировать отдельные клетки головного мозга за счет флуоресцирования.For controlled stimulation of neurogenesis and (or) inhibition of targeted genes, it is envisaged to integrate genes into the sequence of the genetic construct, the expression of which is activated under the influence of chemical stimuli, which, in turn, leads to an increase in the concentration of certain substances that affect the release of glyotransmitters, which, in turn, in turn, they affect the vital activity of neurons and neurogenesis, in particular, as well as providing the ability to visualize individual cells head of the brain due to fluorescence.
Причем, в наиболее близком по технической сущности заявляемому способе используется химическое соединение, отличное по своему строению от вирусного вектора и не способное встраивается в геном клеток мозга.Moreover, in the closest in technical essence of the claimed method uses a chemical compound that is different in structure from the viral vector and is not able to integrate into the genome of brain cells.
На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции на основе лентивирусного вектора, специфически трансфецирующего нейроны. Генетическая конструкция содержит:In FIG. 1 is a schematic representation of a genetic construct based on a lentiviral vector specifically transfecting neurons. Genetic construction contains:
LTR - длинный терминальный повтор лентивируса;LTR - long terminal repeat of lentivirus;
PRSx8 - искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор;PRSx8 - artificial phenotype-specific neuronal promoter;
TN-XXL - последовательность, кодирующая генетически кодируемый кальциевый индикатор TN-XXL;TN-XXL is a sequence encoding a genetically encoded calcium indicator TN-XXL;
WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;WPRE - posttranscriptional regulatory element of the marmot hepatitis virus;
bGH poly(A) сигнал - сигнал полиаденилирования;bGH poly (A) signal - polyadenylation signal;
RRE - rev-отвечающий элемент ВИЧ-1, который обеспечивает Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.RRE is an HIV-1 rev-responsive element that provides Rev-dependent export of mRNA from the nucleus to the cytoplasm.
На фиг. 2 представлена карта плазмиды LVV-PRSx8-TN-XXL, характеризующейся:In FIG. 2 presents a map of plasmid LVV-PRSx8-TN-XXL, characterized by:
5'LTR (1-25) - длинный терминальный повтор лентивируса;5'LTR (1-25) - a long terminal repeat of lentivirus;
PRSx8 (26-262) - искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор;PRSx8 (26-262) - artificial phenotype-specific neuronal promoter;
TN-XXL (288-2147) - последовательность, кодирующая генетически кодируемый кальциевый индикатор TN-XXL;TN-XXL (288-2147) - a sequence encoding a genetically encoded calcium indicator TN-XXL;
ECFP variant (291-1604) - усиленный синий флуоресцентный белок;ECFP variant (291-1604) - enhanced blue fluorescent protein;
EYFP (1626-2141) - усиленный желтый флуоресцентный белок;EYFP (1626-2141) - enhanced yellow fluorescent protein;
WPRE (2154-2771) - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;WPRE (2154-2771) - post-transcriptional regulatory element of the marmot hepatitis virus;
bGH роду(А) сигнал (2972 - 3196) - сигнал полиаденилирования;bGH genus (A) signal (2972 - 3196) - polyadenylation signal;
ori (4540 - 5128) - высоко-копийная точка начала репликации плазмид ColE1/pMB1/pBR322/pUC;ori (4540-5128) is a high copy point of replication of plasmids ColE1 / pMB1 / pBR322 / pUC;
AmpR (5299-6159) - последовательность, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, карбенциллину и др. связанным антибиотикам;AmpR (5299-6159) - a sequence that provides resistance to ampicillin, carbencillin and other related antibiotics;
AmpR промотор (6160-6264) - промотор, обеспечивающий резистентность к ампициллину;AmpR promoter (6160-6264) - a promoter that provides resistance to ampicillin;
bom (6509-6647) - базовый мобильный регион плазмиды pBR322;bom (6509-6647) - the base mobile region of the plasmid pBR322;
RRE (9492-9725) - rev-отвечающий элемент ВИЧ-1, который обеспечивает Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму;RRE (9492-9725) is a rev-responsive HIV-1 element that provides Rev-dependent export of mRNA from the nucleus to the cytoplasm;
3'TR (9726 - 10144) - длинный терминальный повтор лентивируса;3'TR (9726 - 10144) - a long terminal repeat of lentivirus;
10144 bp - длина последовательности плазмиды, равная 10144 нуклеотидам.10144 bp is the length of the plasmid sequence equal to 10144 nucleotides.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Заявляемый способ основан на использовании клеточно-специфического промотора для управления одновременной экспрессией нужного трансгена и сильного искусственного активатора транскрипции для усиления транскрипции посредством связывания специфических сайтов связывания, введенных в последовательность промотора. Таким образом, задействуют два клеточно-специфических промотора: один для транскрипции интересующего трансгена, другой для экспрессии трансактиватора.The inventive method is based on the use of a cell-specific promoter to control the simultaneous expression of the desired transgene and a strong artificial transcription activator to enhance transcription by binding to specific binding sites introduced into the promoter sequence. Thus, two cell-specific promoters are involved: one for transcribing the transgene of interest, and the other for transactivator expression.
Используемые генетические конструкции представляют собой разнонаправленную лентивирусную векторную систему (Фиг. 1), содержащую усиленные в части транскрипционной активности искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8, клеточно-специфический промотор катехоламинергических нейронов). Искусственный активатор транскрипции транскрибирует 5'-конец кассеты. Последовательность кассеты, расположенная по ходу транскрипции, управляет синтезом интересующего гена.The used genetic constructs are a multidirectional lentiviral vector system (Fig. 1), which contains an artificial phenotype-specific neuronal promoter (PRSx8, a cell-specific promoter of catecholaminergic neurons) amplified in terms of transcriptional activity. An artificial transcription activator transcribes the 5'-end of the cassette. The sequence of the cassette located along the transcription controls the synthesis of the gene of interest.
Генетическая конструкция для специфической трансфекции нейронов (Фиг. 2) построена с использованием лентивирусного вектора на основе само-инактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,The genetic construct for specific transfection of neurons (Fig. 2) is constructed using a lentiviral vector based on self-inactivated HIV and includes at least
rev-отвечающий элемент (RRE),rev-response element (RRE),
искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8) для трансфекции катехоламинергических нейронов,artificial phenotype-specific neuronal promoter (PRSx8) for transfection of catecholaminergic neurons,
генетически кодируемый кальциевый индикатор (ГККИ) (TN-XXL) в качестве маркерного гена,genetically encoded calcium indicator (GKKI) (TN-XXL) as a marker gene,
посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.post-transcriptional regulatory element of marmot hepatitis virus (WPRE) to increase vector titer and improve transgene expression.
Лентивирусный вектор LVV-PRSx8-TN-XXL был сконструирован на основе усовершенствованного лентивирусного шаттл-вектора pTYF-SW-Linker.The lentiviral vector LVV-PRSx8-TN-XXL was constructed based on the improved lentiviral shuttle vector pTYF-SW-Linker.
Для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена в структуру шаттл-вектора pTYF-SW-Linker, предварительно гидролизованного по сайтам NotI и ClaI, был клонирован амплифицированный фрагмент пост-транскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE) - последовательность SEQ ID N1.In order to increase the titer of the vector and improve the expression of the transgene into the structure of the pTYF-SW-Linker shuttle vector, previously hydrolyzed at NotI and ClaI sites, an amplified fragment of the marmot hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) was cloned - the sequence of SEQ ID N1.
Для чего нами была проведена полимеразная цепная реакция со специфически подобранными праймерами WPRE_Forw (CCGCTCCCGTTATTT) WPRE_Rev (TTTATTGCCCTCGCC). Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее ГККИ.For this, we carried out a polymerase chain reaction with specifically selected primers WPRE_Forw (CCGCTCCCGTTATTT) WPRE_Rev (TTTATTGCCCTCGCC). The resulting plasmid was produced in preparative quantities for subsequent cloning into it of the GCCI.
С помощью пары праймеров TN-XXL_Forw (CTTTTGCTGGCCTTT) и TN-XXL_Rev (CTTTCGGGCTTTGTT), используя в качестве матрицы плазмиду pRsetB-TN-XXL (Clontech), был амплифицирован ПЦР-продукт длиной 1860 п.о. - последовательность SEQ ID N2, которую клонировали pTYF-SW-Linker-WPRE, предварительно гидролизованный по сайтам BamHI и EcoRI Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее клеточно-специфичного промотора.Using a pair of primers TN-XXL_Forw (CTTTTGCTGGCCTTT) and TN-XXL_Rev (CTTTCGGGCTTTTGTT), using the plasmid pRsetB-TN-XXL (Clontech) as a template, the 1860 bp PCR product was amplified. - the sequence of SEQ ID N2, which was cloned by pTYF-SW-Linker-WPRE, previously hydrolyzed at the BamHI and EcoRI sites. The obtained plasmid was produced in preparative quantities for subsequent cloning into it of a cell-specific promoter.
Для специфической трансфекции катехоламинергических нейронов головного мозга в последовательность генетической конструкции был клонирован искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8). ПЦР-продукт длиной 237 п.о. - последовательность SEQ ID N3 была получена посредством амплификации с помощью пары праймеров PRSx8_Forw (GCACCTTCCAGATCT) и PRSx8_Rev (GGACACGCTGAACTT), используя в качестве матрицы плазмиду рХсХ-PRS-EGFP. Полученный таким образом фрагмент нуклеотидной последовательности был клонирован в pTYF-SW-Linker-WPRE-GCaMP3, предварительно гидролизованный по сайтам BamHI и I-SceI.For specific transfection of catecholaminergic neurons in the brain, an artificial phenotype-specific neuronal promoter (PRSx8) was cloned into the sequence of the genetic construct. 237 bp PCR product - the sequence SEQ ID N3 was obtained by amplification using a pair of primers PRSx8_Forw (GCACCTTCCAGATCT) and PRSx8_Rev (GGACACGCTGAACTT) using the plasmid pXcX-PRS-EGFP as a template. The nucleotide sequence fragment thus obtained was cloned into pTYF-SW-Linker-WPRE-GCaMP3 previously hydrolyzed at the BamHI and I-SceI sites.
Таким образом, нами был получен SEQ ID N4 лентивирусный вектор -LVV-PRSx8-TN-XXL для трансдукции в катехоламинергических нейронах и экспрессирования в них ГККИ TN-XXL.Thus, we obtained SEQ ID N4 lentiviral vector -LVV-PRSx8-TN-XXL for transduction in catecholaminergic neurons and expression of TNC-XXL GKKI in them.
Продуцирование генетической конструкции осуществляется в культуре клеток HEK293FT посредством транзиентной ко-трансфекции сконструированной генетической конструкции, упаковочного вектора pNHP и плазмиды pHEF-VSVG, кодирующей оболочку.The production of the genetic construct is carried out in a HEK293FT cell culture by transient co-transfection of the engineered genetic construct, the pNHP packaging vector and the envelope encoding plasmid pHEF-VSVG.
Трансфецирование культур первичных нейронов, полученных из трехдневных крысят и выращиваемых на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, осуществляют следующим образом: за день до трансфекции клетки высеивали в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×104 на лунку и инкубировали в течение 8-14 часов, после чего клетки астроглии трансфецировали разработанной генетической конструкцией (каждая культура соответствующей конструкцией) в присутствии полибрена (8 мкг/мл), промывали фосфатным буфером и культивировали в течение 40-52 часов в среде DMEM.Transfection of cultures of primary neurons obtained from three-day old rat pups and grown on Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (with 4.5 g / l glucose, glutamine, and pyruvate) with the addition of 10% fetal bovine serum is carried out as follows: the day before transfection the cells were seeded in 24-well culture plates with a cell density of 5 × 10 4 per well and incubated for 8-14 hours, after which the astroglia cells were transfected with the developed genetic construct (each culture with the corresponding construct) in polybrene (8 μg / ml) was washed with phosphate buffer and cultured for 40-52 hours in DMEM.
Использование заявленного изобретения позволяет осуществлять клеточно- и фенотип-специфическую трансфекцию катехоламинергических нейронов с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов, а также осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую генетическую конструкцию генетически кодируемого кальциевого индикатора.The use of the claimed invention allows for cell and phenotype-specific transfection of catecholaminergic neurons with the aim of targeted monitoring of intracellular cascades, as well as visualization of in vitro transfected cells by incorporating a genetically encoded calcium indicator into the genetic construct under development.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149678A RU2670128C2 (en) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149678A RU2670128C2 (en) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016149678A3 RU2016149678A3 (en) | 2018-06-19 |
| RU2016149678A RU2016149678A (en) | 2018-06-19 |
| RU2670128C2 true RU2670128C2 (en) | 2018-10-18 |
Family
ID=62619378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016149678A RU2670128C2 (en) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670128C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005042717A2 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | The Regents Of The University Of California | Primate prokineticin and prokineticin receptor polypeptides, related compositions and methods |
| RU2440346C2 (en) * | 2005-09-19 | 2012-01-20 | Ньюронасент, Инк. | Method and composition for stimulating neurogenesis and inhibiting neuron degeneration |
| RU2521333C2 (en) * | 2007-06-21 | 2014-06-27 | Ньюронасент, Инк. | Methods and compositions for stimulation of neurogenesis and inhibition of neuron degeneration with using isothiazolopyrimidinones |
-
2016
- 2016-12-16 RU RU2016149678A patent/RU2670128C2/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005042717A2 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | The Regents Of The University Of California | Primate prokineticin and prokineticin receptor polypeptides, related compositions and methods |
| RU2440346C2 (en) * | 2005-09-19 | 2012-01-20 | Ньюронасент, Инк. | Method and composition for stimulating neurogenesis and inhibiting neuron degeneration |
| RU2521333C2 (en) * | 2007-06-21 | 2014-06-27 | Ньюронасент, Инк. | Methods and compositions for stimulation of neurogenesis and inhibition of neuron degeneration with using isothiazolopyrimidinones |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016149678A3 (en) | 2018-06-19 |
| RU2016149678A (en) | 2018-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7568513B2 (en) | Fusosome Compositions and Uses Thereof | |
| US11976277B2 (en) | Particle delivery systems | |
| RU2718536C2 (en) | Methods of producing and using populations of multipotent and pluripotent cells resistant to diseases and capable of differentiation | |
| JP6001702B2 (en) | Polyprint lacto modified retroviral vector | |
| CA2879514C (en) | Nucleic acids for down-regulation of gene expression | |
| ES2951857T3 (en) | retroviral vector | |
| CA3076270C (en) | Retroviral vectors | |
| JP2020535805A (en) | Non-integrated DNA vector for gene modification of cells | |
| JP2016521555A5 (en) | ||
| RU2018122636A (en) | STABLE CELL LINES FOR PRODUCING RETRO VIRUSES | |
| JP2022506515A (en) | Vector system for expressing regulatory RNA | |
| JP2022549064A (en) | Enhanced production of lentiviral vectors | |
| JP2019517281A (en) | Gene therapy for neurotheloid lipofuscinosis | |
| JP2022043022A (en) | Bio-production of lentiviral vectors | |
| WO2013060819A2 (en) | Transient expression vectors, preparation and uses thereof | |
| JP2023504593A (en) | Production system | |
| KR20230137399A (en) | Functional nucleic acid molecules and methods | |
| AU2014314079B2 (en) | RNA based method to obtain stably integrated retroviral vectors | |
| JP2019514414A (en) | Particles for capsid formation in genome engineering systems | |
| CN111088323A (en) | Cell SELEX method for screening transmembrane target protein aptamer, transmembrane target protein aptamer and application of transmembrane target protein aptamer | |
| RU2670128C2 (en) | Method of genetic registration and correction of neurogenesis based on genetic constructions for transfection of neurons | |
| RU2630654C2 (en) | Method for neurogenesis chemogenetic recording and correction based on genetic constructions for astrocytes and neurons transfection | |
| Ohashi et al. | A bicistronic lentiviral vector-based method for differential transsynaptic tracing of neural circuits | |
| RU2633691C2 (en) | Method for genetic control of exocytosis based on genetic constructions for astroglia cells transfection | |
| CN107881174B (en) | Method for regulating and controlling translation level gene expression and application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200626 Effective date: 20200626 |