RU2670166C1 - Способ получения слитого белка tnfr-fc с заданным содержанием примесей - Google Patents
Способ получения слитого белка tnfr-fc с заданным содержанием примесей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670166C1 RU2670166C1 RU2017124181A RU2017124181A RU2670166C1 RU 2670166 C1 RU2670166 C1 RU 2670166C1 RU 2017124181 A RU2017124181 A RU 2017124181A RU 2017124181 A RU2017124181 A RU 2017124181A RU 2670166 C1 RU2670166 C1 RU 2670166C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proportion
- chromatographic peak
- tnfr
- hydrophobic
- concentration
- Prior art date
Links
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims abstract description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 68
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 33
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 239000012616 hydrophobic interaction chromatography medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 20
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 10
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 9
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 9
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical group Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ очистки слитого белка TNFR-Fc от примесей с получением белка с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, включающий: (а) внесение образца, содержащего жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, частично очищенного аффинной хроматографией, анионообменной хроматографией или той и другой, в колонку, заполненную средой для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), содержащей ароматическую функциональную группу, предварительно уравновешенной уравновешивающим (EQ) буфером, содержащим хлорид натрия в концентрации от 1 М до 1,4 М или сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М; и (б) сбор элюата путем элюирования белка элюирующим буфером, содержащим хлорид натрия или сульфат аммония в той же концентрации, что и уравновешивающий буфер, где заданная доля гидрофобного хроматографического пика 3 составляет от 9% до 18%. Изобретение также относится к способу коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3 в этанерцепте, включающему: предварительное уравновешивание среды для хроматографии гидрофобного взаимодействия уравновешивающим буфером, содержащим хлорид натрия в концентрации от 1,0 М до 1,5 М или сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М; и внесение образца, содержащего слитый белок TNFR-Fc, подготовленного таким образом, чтобы концентрация солей в нем была такой же, как в предварительно уравновешенной среде для хроматографии гидрофобного взаимодействия, где долю гидрофобного хроматографического пика 3 корректируют в сторону снижения по сравнению с вносимым образцом, и где долю гидрофобного хроматографического пика 3 в образце, в котором доля гидрофобного хроматографического пика 3 превышает 20%, снижают до уровня от 2% до 17%. Изобретение может быть полезным при изготовлении биологических лекарственных средств, содержащих рекомбинантный белок, такой как этанерцепт, полученный из культуры клеток млекопитающих методикой генетической рекомбинации. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения смеси слитого белка TNFR-Fc с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3 и к способу коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3. Конкретно, настоящее изобретение относится к (а) способу получения смеси слитого белка TNFR-Fc с использованием среды для хроматографии гидрофобного взаимодействия, содержащей ароматическую функциональную группу, предварительно уравновешенной уравновешивающим буфером, содержащим хлорид натрия или сульфат аммония, и образца, содержащего жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, и к способу коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3 посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия с использованием уравновешивающего буфера с заранее определенной концентрацией хлорида натрия или сульфата аммония.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Этанерцепт представляет собой биологический модулятор воспаления, действующий как конкурентный ингибитор TNF-α, связывающийся с поверхностным клеточным рецептором TNF-α, ингибируя опосредованные TNF-α иммунные ответы. Этанерцепт является макромолекулой с молекулярной массой 150 кДа и представляет собой гомодимер двух слитых белков, связанных дисульфидной связью, каждый из которых состоит из человеческого растворимого рецептора р75 TNF (фактор некроза опухоли), связанного с Fc-фрагментом человеческого иммуноглобулина G подкласса 1 (Goldenberg, Clinical Therapeutics, 21(1): 75-87, 1999; Moreland et al., Ann. Intern. Med., 130(6): 478-486, 1999).
Типичная форма этого белка была впервые синтезирована Bruce А. Beutler et al. в начале 90-х гг.XX в. в Юго-Западном медицинском центре Техасского университета (University of Texas Southwestern Medical Center) и представлена на рынке компанией Amgen под торговым названием Enbrel® в 2002 г. Этанерцепт является ингибитором TNF-α, используемым для лечения ревматоидного артрита, псориаза и анкилозирующего спондилита и проходящим клинические исследования для лечения васкулита, болезни Альцгеймера и болезни Крона.
Слитый белок TNFR-Fc может быть получен слиянием 235 аминокислот TNFR и 232 аминокислот Fc-области, и при получении методом генетической рекомбинации он существует в форме димера и проявляет биологическую активность. TNFR разделен на 4 домена и трансмембранную область, и из 235 составляющих его аминокислот 22 являются цистеинами, и все эти цистеины образуют дисульфидные связи, формируя трехмерную структуру. Тем не менее, при получении TNFR-Fc из животных клеток, цистеины связываются друг с другом случайным образом и поэтому не образуют дисульфидных связей, идентичных дисульфидным связям нативного белка. TNFR может также быть частично усечен и не способен образовать правильный димер TNFR-Fc. TNFR-Fc с некорректными дисульфидными связями не может проявлять надлежащую биологическую активность из-за значительного снижения способности связываться с TNF-α. Кроме того, при полном или частичном усечении TNFR он также не может проявлять такую биологическую активность.
Поэтому при получении димеров TNFR-Fc с применением технологии рекомбинантных ДНК и методики культивирования животных клеток происходит одновременное образование активных белков, неактивных белков с некорректными дисульфидными связями, агрегатов и усеченных форм, поэтому необходима методика выделения и очистки белков.
Кроме того, согласно патенту США №7294481, где заявителем является Immunex Corporation, разработчик этанерцепта, относящейся к способу получения рекомбинантных белков, было подтверждено, что при хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) присутствуют три пика, и что эти пики последовательно представлены различными формами этанерцепта с очень низкой биологической активностью, содержащими этанерцепт в форме, усеченной по положениям S186 и D235, слитым белком TNFR-Fc в активной форме и агрегатами, TNFR-Fc со скремблированными (scrambled) дисульфидными связями и так далее. Такой же характер пиков раскрыт также в патенте Кореи №10-1454316, относящемуся к способу получения активной формы слитого белка TNFR-Fc с использованием способа получения рекомбинантного белка. В то же время, хроматография гидрофобного взаимодействия, обычно используемая для выделения слитого белка TNFR-Fc, предназначена только для получения высоко чистой активной формы слитого белка TNFR-Fc путем удаления и минимизации количества примесей, за исключением активных форм слитого белка TNFR-Fc, таких как агрегаты, слитый белок TNFR-Fc со скремблированными дисульфидными связями и усеченные формы слитого белка TNFR-Fc.
В то же время, биоаналог представляет собой вещество, эквивалентное существующим утвержденным продуктам по качеству, безопасности и эффективности, и в частности он может быть использован в качестве биомедицинского продукта только в том случае, если его состав аналогичен оригинальному продукту по ингредиентам и содержанию примесей. Например, этанерцепт (Pfizer) содержит приблизительно от 9% до 18% ингредиента, имеющего низкую биологическую активность, раскрытого в предшествующем уровне техники как компонент пика 3 при хроматографии гидрофобного взаимодействия (далее «пик 3»), который может влиять на фармакологические свойства, а также на активность. Соответственно, при разработке биоаналога необходимо корректировать долю пика 3 до уровня, сходного с уровнем в оригинальном продукте. Несмотря на существование способа очистки образца, содержащего TNFR-Fc, полученный с применением HIC обычным способом получения рекомбинантных белков (патент Кореи №10-1454316), этот способ предназначен только для получения высоко чистого ингредиента пика 2, представляющего собой активную форму TNFR-Fc после удаления примесей. Исследований по коррекции доли пика 3, представляющего собой тип примеси с низкой биологической активностью, до уровня, сходного с уровнем в оригинальном продукте, не было.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Техническая задача
Авторы настоящего изобретения предприняли попытку разработать способ получения слитого белка TNFR-Fc с определенной долей пика 3 посредством ее коррекции при получении слитого белка TNFR-Fc с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия. В результате они подтвердили, что слитый белок TNFR-Fc, доля пика 3 в котором скорректирована до уровня, сходного с общепринятыми оригинальными продуктами, может быть получен предварительным уравновешиванием среды для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), содержащей ароматическую функциональную группу, уравновешивающим буфером с заранее определенной концентрацией хлорида натрия, и внесением и элюированием образца, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Техническое решение
Задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения смеси слитого белка TNFR-Fc с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3 и к способу коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3.
Полезные эффекты
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения смеси слитого белка TNFR-Fc с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия, где заданную долю гидрофобного хроматографического пика 3 обеспечивают, корректируя долю гидрофобного хроматографического пика 3 путем проведения хроматографии гидрофобного взаимодействия посредством уравновешивания уравновешивающим буфером с заранее определенной концентрацией хлорида натрия или сульфата аммония. Соответственно, раскрытый способ может быть применен в качестве инструмента получения биомедицинских продуктов, содержащих рекомбинантные белки, такие как этанерцепт, полученный методикой генетической рекомбинации из культуры животных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показана хроматограмма, полученная проточной методикой HIC с использованием смолы Phenyl Sepharose High Performance согласно Примеру настоящего изобретения.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОЕ ВОПЛОЩЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В качестве аспекта настоящего изобретения для решения указанной выше технической проблемы согласно настоящему изобретению предложен способ получения смеси слитого белка TNFR-Fc с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3.
Способ предпочтительно включает: (а) внесение образца, содержащего жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, в колонку, заполненную средой для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), содержащей ароматическую функциональную группу, предварительно уравновешенной уравновешивающим (EQ) буфером, содержащим хлорид натрия или сульфат аммония; и (б) сбор элюата элюированием белка элюирующим буфером, содержащим хлорид натрия или сульфат аммония в той же концентрации, что и уравновешивающий буфер.
При образовании слитого белка TNFR-Fc клеткой-хозяином, трансформированной вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий слитый белок TNFR-Fc, цистеины белка TNFR связываются друг с другом случайным образом, и поэтому они не образуют дисульфидных связей, идентичных дисульфидным связям нативного белка TNFR, или белок TNFR также частично усечен и не способен образовать правильный димер TNFR-Fc, в дополнение к образованию димерной формы слитого белка TNFR-Fc, связывающейся с TNF-α и проявляющей биологическую активность. При гидрофобной хроматографии этим ингредиентам соответствуют отдельные пики, и в проведенных исследованиях их обозначают как пики 1-3, соответственно. Было подтверждено, что эти пики включают усеченную форму белка, активную форму белка и другие агрегаты или ингредиенты с низкой биологической активностью, такие как TNFR-Fc с неправильными дисульфидными связями. Эти слитые белки TNFR-Fc, включая этанерцепт, являются лидерами продаж на фармацевтическом рынке. Тем не менее, в общепринятых продуктах, одобренных для продажи и для клинического применения, доля пика 3 составляет от 9% до 18%, что может влиять на активность и/или фармакологические свойства. В частности, для одобрения биоаналогов, необходимо, чтобы они были эквивалентны существующим одобренным или оригинальным продуктам. Кроме того, различия в содержании примесей, являющиеся результатом препаративных методик, таких как методики выделения и очистки, применяемых для получения биоаналогов, вероятно влияют на эффективность фармацевтических продуктов, и поэтому точная коррекция доли пика 3 при хроматографии гидрофобного взаимодействия крайне важна. Тем не менее, при получении слитых белков TNFR-Fc с применением метода получения рекомбинантных белков доля каждого полученного ингредиента непостоянна и не поддается коррекции. Соответственно, необходим не просто способ удаления ингредиентов с низкой биологической активностью посредством очистки смеси, содержащей различные типы слитых белков TNFR-Fc, но способ коррекции содержания таких ингредиентов до постоянного уровня. Указанный способ по настоящему изобретению может быть применен в качестве инструмента очистки активной формы слитых белков TNFR-Fc, для обеспечения в них заданной доли пика 3 при хроматографии гидрофобного взаимодействия, включая агрегаты, слитые белки TNFR-Fc со скремблированными дисульфидными связями и так далее, при выделении активной формы слитых белков TNFR-Fc из смеси слитых белков TNFR-Fc с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия.
С использованием указанного способа, авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что, в то время как хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) традиционно применяется только для удаления примесей, в случае, когда образец, содержащий жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, уравновешен солями в различных концентрациях, в частности хлоридом натрия, возможна коррекция доли пика 3 при хроматографии гидрофобного взаимодействия до заданного уровня. Ранее об этом не сообщалось.
При использовании здесь термин «белок TNFR (рецептор фактора некроза опухоли)» обозначает рецепторный белок, связывающийся с TNF-α. Белок TNFR включает белок TNFRI(p55) или белок TNFRII(p75), предпочтительно, но без ограничения, он может представлять собой белок TNFRII. TNFRII может быть использован взаимозаменяемо с TNFRSF1B (представитель 1B суперсемейства рецептора фактора некроза опухоли). Белок TNFRII может представлять собой, без ограничения, белок TNFRII, имеющий 4 домена и трансмембранную область и содержащий 235 аминокислот.Информация о белке TNFRI и белке TNFRII может быть получена из известных баз данных, таких как GenBank Национальных институтов здравоохранения США, и например он может представлять собой, без ограничения, белок с регистрационным номером NP_001056 или Р20333.
Белок TNFR обладает биологической активностью по связыванию с TNF-α, сверхэкспрессия которого в организме человека, как известно, приводит к различным заболеваниям, и поэтому он может быть использован для лечения заболеваний, опосредованных TNF-α, таких как аутоиммунные заболевания. Для этого проводят слияние Fc-области иммуноглобулина с белком TNFR, получая слитый белок с увеличенным периодом полувыведения.
При использовании здесь термин «слитый белок TNFR(рецептор фактора некроза опухоли)-Fс» обозначает продукт, полученный в результате связывания всего белка TNFR или его части с Fc-областью иммуноглобулина под действием ферментов или в результате экспрессии двух полипептидов с получением одного полипептида посредством генетических манипуляций. В слитом белке TNFR-Fc белок TNFR и Fc-область иммуноглобулина могут быть связаны друг с другом непосредственно или, без ограничения, через пептидный линкер. Например, слитые белки TNFR-Fc могут содержать этанерцепт.
Слитый белок TNFR-Fc может быть получен слиянием всего белка TNFR или его части с Fc-областью иммуноглобулина и, например, без ограничения, слиянием аминокислот в положениях 1-235 белка TNFRII с 232 аминокислотами Fc-области иммуноглобулина, включая шарнирную область. Кроме того, кодоны слитого белка TNFR-Fc могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках-хозяевах. Например, слитый белок TNFR-Fc может представлять собой, без ограничения, слитый белок TNFR-Fc, кодоны которого оптимизированы для клеток СНО, определенный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Слитый белок TNFR-Fc включает белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и все белки, аминокислотные последовательности которых на 70% или более гомологичны, предпочтительно на 80% или более гомологичны, более предпочтительно на 90% или более гомологичны, намного более предпочтительно на 95% или более гомологичны и наиболее предпочтительно на 98% или более гомологичны этой последовательности, при условии, что эти белки обладают существенной активностью по связыванию с TNF-α. Очевидно, что объем настоящего изобретения может включать любой тип белковых вариантов с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторой последовательности, при условии, что гомологичная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, обладающую биологической активностью, по существу идентичной или соответствующей слитому белку TNFR(рецептор фактора некроза опухоли)-Fс. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий слитый белок TNFR(рецептор фактора некроза oпyxoли)-Fc, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и все нуклеотидные последовательности, на 70% или более гомологичные, предпочтительно на 80% или более гомологичные, более предпочтительно на 90% или более гомологичные, намного более предпочтительно на 95% или более гомологичные и наиболее предпочтительно на 98% или более гомологичные этой последовательности, при условии, что эти нуклеотидные последовательности по существу кодируют белки, обладающие активностью по связыванию с TNF-α. Также очевидно, что объем настоящего изобретения может включать любой тип нуклеотидных последовательностей, кодирующих белковые варианты с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторой последовательности, при условии, что гомологичная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, обладающую биологической активностью, по существу идентичной или соответствующей слитому белку TNFR-Fc. В одном воплощении настоящего изобретения кодоны оптимизированы специально для клеток СНО.
При использовании здесь термин «Fc-область иммуноглобулина (lg)» относится к части иммуноглобулина, содержащей константную область 2 тяжелой цепи (СН2), константную область 3 тяжелой цепи (СН3) и шарнирную область, без вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, константной области 1 тяжелой цепи (СН1) и константной области 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Fc-область иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и последовательности ее производных. Аминокислотная последовательность производного представляет собой последовательность, отличающуюся от нативной аминокислотной последовательности делецией, вставкой, неконсервативной или консервативной заменой одного или более чем одного аминокислотного остатка или их комбинациями. Кроме того, Fc-область иммуноглобулина может представлять собой Fc-область, имеющую происхождение от IgG, IgM, IgE, IgA или IgD, или полученную с использованием их комбинаций или гибридов. Предпочтительно, она имеет происхождение от IgG, который, как известно, увеличивает период полувыведения связывающих белков. Более предпочтительно, но без ограничения, она имеет происхождение от IgG1.
В то же время, при использовании здесь термин «комбинация» означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-области иммуноглобулинов одного и того же происхождения, соединены с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть, возможно получение димера или мультимера из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-области IgG, Fc-области IgA, Fc-области IgM, Fc-области IgD и Fc-области IgE.
При использовании здесь термин «гибрид» означает, что в одноцепочечной Fc-области иммуноглобулина присутствуют
последовательности, кодирующие две или более Fc-области иммуноглобулина разного происхождения. В настоящем изобретении возможны различные типы гибридов. То есть, доменные гибриды могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из СН1, СН2, СН3 и СН4 Fc-области IgG, Fc-области IgM, Fc-области IgA, Fc-области IgE и Fc-области IgD, и могут содержать шарнирную область. С другой стороны, IgG также делят на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды.
Слитый белок TNFR-Fc может быть получен ведением вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий слитый белок, в клетки млекопитающих и последующей экспрессией его в этих клетках.
В настоящем изобретении в качестве репрезентативного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий слитый белок TNFR-Fc, использовали вектор pCUCBin-mSig-TNFcept, и трансформировали им клетки СНО для экспрессии слитого белка TNFR-Fc. Слитые белки TNFR-Fc, полученные указанным выше способом, содержат смесь различных форм слитых белков TNFR-Fc, таких как активный слитый белок TNFR-Fc, усеченные формы слитого белка TNFR-Fc, неактивный слитый белок TNFR-Fc, и/или агрегаты слитого белка TNFR-Fc, и так далее. Таким образом, необходима очистка неактивной формы слитого белка TNFR-Fc, а также его активной формы, чтобы обеспечить их присутствие в заранее определенном соотношении. При использовании способа получения по настоящему изобретению долю пика 3, включая фрагменты, активный слитый белок, очищенные агрегаты и так далее, и таким образом заданную долю пика 3, можно корректировать.
Обычно культуральная жидкость клеток млекопитающих также содержит, помимо заданного белка, различные белки и тому подобное. Для удаления таких белков образец, содержащий смесь слитого белка TNFR-Fc, предпочтительно полученную из клеток млекопитающих, может быть подготовлен посредством частичной очистки аффинной хроматографией и/или анионообменной хроматографией.
В конкретном Примере настоящего изобретения проводили аффинную хроматографию культуральной жидкости трансфицированных клеток СНО и анионообменную хроматографию полученного из нее элюата, и полученный после этого элюат использовали в качестве образца.
В качестве примера, среда, которой заполнена колонка, используемая при хроматографии гидрофобного взаимодействия, может содержать фенильную группу в качестве ароматической функциональной группы. В конкретном Примере настоящего изобретения, без ограничения, используют колонку, заполненную смолой Phenyl Sepgarose High Performance производства GE Healthcare.
В одном воплощении заданная доля гидрофобного хроматографического пика 3 может составлять от 9% до 18%. В качестве конкретного примера, если доля гидрофобного хроматографического пика 3 в смеси слитого белка TNFR-Fc на указанной стадии (а) превышает 20%, доля пика 3 может быть снижена до приблизительно 9%-18% путем использования способа по настоящему изобретению и очисткой.
В одном воплощении указанные уравновешивающий и элюирующий буферы могут содержать от 7 мМ до 15 мМ фосфата натрия. В конкретном Примере настоящего изобретения, без ограничения, используют буфер, содержащий 10 мМ фосфата натрия.
В одном воплощении указанные уравновешивающий и элюирующий буферы могут иметь рН от 6 до 8,5. Буфер, рН которого выходит за пределы указанного диапазона, может приводить к денатурации заданного белка, и, соответственно, его использование в хроматографии гидрофобного взаимодействия рекомбинантного белка может быть затруднительным.
В одном воплощении способ получения по настоящему изобретению характеризуется коррекцией концентрации хлорида натрия в уравновешивающем буфере в соответствии с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, где при заданной доле гидрофобного хроматографического пика 3 от 2% до 17% для уравновешивания используют уравновешивающий буфер, содержащий хлорид натрия в концентрации от 1 М до 1,4 М. В частности, в случае внесения образца с долей пика 3 21% использование уравновешивающего буфера, содержащего 1,1 М хлорида натрия, позволяет снизить долю пика 3 до 5,3%-17%, использование уравновешивающего буфера, содержащего 1,2 М хлорида натрия, позволяет снизить долю пика 3 до 2,9%-15,7%, использование уравновешивающего буфера, содержащего 1,3 М хлорида натрия, позволяет снизить долю пика 3 до 2,5%-14,8%, и использование уравновешивающего буфера, содержащего 1,4 М хлорида натрия, позволяет снизить долю пика 3 до 2,2%-13,7%.
Кроме того, способ получения по настоящему изобретению характеризуется добавлением сульфата аммония в уравновешивающий буфер в соответствии с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, где при доле гидрофобного хроматографического пика 3 в образце более 45% для уравновешивания используют уравновешивающий буфер, содержащий сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М.
В одном воплощении при избыточной доле гидрофобного хроматографического пика 3, например, более 45%, в культуральной жидкости, полученной способом получения рекомбинантных белков, долю гидрофобного хроматографического пика 3 можно снизить приблизительно до 10% проведением хроматографии гидрофобного взаимодействия с использованием указанного выше уравновешивающего буфера, содержащего хлорид натрия, после снижения доли пика 3 до 20%-30% проведением хроматографии гидрофобного взаимодействия с последующим уравновешиванием уравновешивающим буфером, содержащим сульфат аммония.
Хроматография гидрофобного взаимодействия может быть проведена посредством последовательных процессов, состоящих из внесения, уравновешивания, десорбции белков (stripping) и очистки на месте (cleaning in place, CIP).
Процесс десорбции белков проводят для отделения и элюирования всех белков, оставшихся в колонке, и в этом процессе могут быть использованы буферы, состав которых идентичен уравновешивающему буферу, за исключением хлорида натрия и сульфата аммония.
CIP представляет собой процесс безопасного и рентабельного обслуживания устройств при получении биомедицинских продуктов, позволяющий эффективно удалять примеси из среды для хроматографии и использовать ее повторно. CIP может быть проведена с использованием, без ограничения, 0,5 Н раствора гидроксида натрия. Без ограничения, CIP можно повторять столько раз, сколько необходимо.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3 в этанерцепте, включающий: предварительное уравновешивание среды для хроматографии гидрофобного взаимодействия уравновешивающим буфером, содержащим хлорид натрия в концентрации от 1,0 М до 1,5 М или сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М; и внесение образца, содержащего слитый белок TNFR-Fc, подготовленного таким образом, чтобы концентрация солей в нем была такой же, как в предварительно уравновешенной среде для хроматографии гидрофобного взаимодействия.
В одном воплощении, как указано выше, уравновешивающий буфер имеет рН от 6 до 8,5. Способ по настоящему изобретению с использованием уравновешивающего буфера, содержащего хлорид натрия или сульфат аммония, характеризуется коррекцией доли пика 3 в конечном продукте в сторону снижения по сравнению с вносимым образцом.
В одном воплощении использование уравновешивающего буфера, содержащего хлорид натрия, позволяет снизить долю пика 3 в образце, в котором доля пика 3 превышает 20%, до уровня от 2% до 17%.
В одном воплощении использование уравновешивающего буфера, содержащего сульфат аммония, позволяет снизить долю пика 3 в образце, в котором доля пика 3 превышает 45%, до уровня 18% или менее.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Тем не менее, эти Примеры приведены лишь в иллюстративных целях, и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.
Пример 1: Получение этанерцепта и проточная HIC
Для получения этанерцепта клетки СНО трансфицировали вектором pCUCBin-mSig-TNFcept, содержащим ген, кодирующий слитый белок TNFR-Fc, и культивировали, после чего последовательно проводили аффинную хроматографию и анионообменную хроматографию культуральной жидкости клеток СНО, отобранных с использованием МТХ.
Конкретно, аффинную хроматографию проводили следующим образом: колонку ХК26 (GE Healthcare), заполненную MabSelect SuRe™ (GE Healthcare), представляющей собой аффинную смолу, уравновешивали достаточной промывкой буфером, содержащим 20 мМ трис-HCI, рН 8,0, проводили связывание с аффинной смолой посредством промывки подготовленной культуральной жидкостью и затем проводили элюирование элюирующим буфером при рН 3,0-3,4. рН элюата корректировали до рН 7,0-8,0 с использованием 2 М трис.
Анионообменную хроматографию элюата, полученного описанной выше аффинной хроматографией, проводили следующим образом: колонку LRC15 (Pall Life Sciences), заполненную Fractogel EMD TMAE (Merck), представляющим собой анионообменную смолу, уравновешивали достаточной промывкой буфером, содержащим трис при рН 7,5-8,5, проводили связывание с анионообменной смолой посредством промывки элюатом, полученным аффинной хроматографией, и затем проводили элюирование элюирующим буфером с трис, содержащим от 100 мМ до 200 мМ хлорида натрия.
Проточная методика HIC, примененная к элюату, полученному последовательным проведением аффинной хроматографии и анионообменной хроматографии, описана ниже. Полученную в результате долю пика 3 измеряли с применением линейного градиента с буфером А (0,1 М фосфата натрия, рН 6,0, 1,8 М аммония) и буфером В (0,1 М фосфата натрия, рН 6,0).
Экспериментальный пример 1: Коррекция доли пика 3 с использованием хлорида натрия
Для проточной методики НIC готовили EQ-буферы, содержащие от 1,1 М до 1,4 М хлорида натрия в 10 мМ фосфата натрия, и рН EQ-буфера корректировали до 6,3. Кроме того, образцы, вносимые при HIC, были подготовлены таким образом, чтобы концентрация фосфата натрия и хлорида натрия в них была такой же, как в EQ-буфере.
Проточная методика HIC с использованием смолы Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare) состоит из процессов внесения, уравновешивания, удаления белков и CIP, как показано на Фиг. 1, и в качестве буферов для удаления белков и CIP использовали 10 мМ фосфат натрия с рН 6,3 и 0,5 Н гидроксид натрия, соответственно.
Проводили мониторинг элюата, отбирая 50 mAU или более по поглощению при 280 нм для сбора фракций с использованием 5 объемов колонки (CV) EQ-буфера, и в Таблице 1 показаны результаты, полученные при использовании разных концентраций хлорида натрия.
Как показано в Таблице 1, по мере повышения используемой концентрации хлорида натрия, доля пика 3 демонстрировала тенденцию к снижению, и в результате было подтверждено, что доля пика 3 может быть скорректирована до диапазона от 2,2% до 17,0% в соответствии с используемой концентрацией хлорида натрия.
Экспериментальный пример 2: Коррекция доли пика 3 с использованием
сульфата аммония Для проточной методики HIC с использованием сульфата аммония готовили EQ-буфер, содержащий 0,5 М сульфата натрия в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCI при рН 8,0. Кроме того, образцы, вносимые при HIC, были подготовлены таким образом, чтобы они содержали 20 мМ трис-HCI при рН 8,0 и 0,5 М сульфата аммония.
Для проточной методики HIC использовали колонку ХK16 (GE Healthcare), заполненную смолой Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare) до 5 см. Как в Экспериментальном примере 1, методика состоит из процессов внесения, уравновешивания, десорбции белков и CIP, и в качестве буферов для десорбции белков и CIP использовали 20 мМ трис-HCI при рН 7,0 и 0,5 Н гидроксид натрия, соответственно.
Проводили мониторинг элюата, отбирая 50 mAU или более по поглощению при 280 нм для сбора фракций с использованием 5 объемов колонки (CV) EQ-буфера, и в результате при применении проточной методики HIC с долей пика 3 во внесенном образце 46,1% было подтверждено, что после применения методики доля пика 3 была скорректирована до уровня 12%.
Claims (20)
1. Способ очистки слитого белка TNFR-Fc от примесей с получением белка с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, включающий:
(а) внесение образца, содержащего жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, частично очищенного аффинной хроматографией, анионообменной хроматографией или той и другой, в колонку, заполненную средой для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), содержащей ароматическую функциональную группу, предварительно уравновешенной уравновешивающим (EQ) буфером, содержащим хлорид натрия в концентрации от 1 М до 1,4 М или сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М; и
(б) сбор элюата путем элюирования белка элюирующим буфером, содержащим хлорид натрия или сульфат аммония в той же концентрации, что и уравновешивающий буфер,
где заданная доля гидрофобного хроматографического пика 3 составляет от 9% до 18%.
2. Способ по п. 1, где ароматическая функциональная группа представляет собой фенильную группу.
3. Способ по п. 1, где доля гидрофобного хроматографического пика 3 в смеси слитого белка TNFR-Fc, указанной в (а), превышает 20%.
4. Способ по п. 1, где уравновешивающий и элюирующий буферы содержат от 7 мМ до 15 мМ фосфата натрия.
5. Способ по п. 1, где уравновешивающий и элюирующий буферы имеют рН от 6 до 8,5.
6. Способ по п. 1, характеризующийся коррекцией концентрации хлорида натрия в уравновешивающем буфере в соответствии с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, где при доле гидрофобного хроматографического пика 3 в образце от более 20% до менее или равной 45% и заданной доле гидрофобного хроматографического пика 3 от 2% до 17% для уравновешивания используют уравновешивающий буфер, содержащий хлорид натрия в концентрации от 1 М до 1,4 М.
7. Способ по п. 1, характеризующийся добавлением сульфата аммония в уравновешивающий буфер в соответствии с заданной долей гидрофобного хроматографического пика 3, где при доле гидрофобного хроматографического пика 3 в образце более 45% и заданной доле гидрофобного хроматографического пика 3 от 10% до 20% для уравновешивания используют уравновешивающий буфер, содержащий сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М.
8. Способ по п. 1, где клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО (яичника китайского хомячка), трансфицированные вектором pCUCBin-mSig-TNFcept.
9. Способ по п. 1, где образец, содержащий жидкую смесь слитого белка TNFR-Fc, полученную из клеток млекопитающих, частично очищен аффинной хроматографией, анионообменной хроматографией или той и другой.
10. Способ по п. 1, где хроматография гидрофобного взаимодействия состоит из последовательных процессов внесения, уравновешивания, десорбции белков и очистки на месте (cleaning in place, CIP).
11. Способ коррекции доли гидрофобного хроматографического пика 3 в этанерцепте, включающий:
предварительное уравновешивание среды для хроматографии гидрофобного взаимодействия уравновешивающим буфером, содержащим хлорид натрия в концентрации от 1,0 М до 1,5 М или сульфат аммония в концентрации от 0,45 М до 0,55 М; и
внесение образца, содержащего слитый белок TNFR-Fc, подготовленного таким образом, чтобы концентрация солей в нем была такой же, как в предварительно уравновешенной среде для хроматографии гидрофобного взаимодействия,
где долю гидрофобного хроматографического пика 3 корректируют в сторону снижения по сравнению с вносимым образцом, и
где долю гидрофобного хроматографического пика 3 в образце, в котором доля гидрофобного хроматографического пика 3 превышает 20%, снижают до уровня от 2% до 17%.
12. Способ по п. 11, где уравновешивающий буфер, содержащий хлорид натрия, имеет рН от 6 до 8,5.
13. Способ по п. 12, где долю гидрофобного хроматографического пика 3 в образце, в котором доля гидрофобного хроматографического пика 3 превышает 45%, снижают до уровня от 10% до 20%.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2014-0195766 | 2014-12-31 | ||
| KR20140195766 | 2014-12-31 | ||
| PCT/KR2015/014393 WO2016108569A1 (ko) | 2014-12-31 | 2015-12-29 | 목적하는 함량으로 불순물을 포함하는 tnfr-fc 융합 단백질의 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670166C1 true RU2670166C1 (ru) | 2018-10-18 |
Family
ID=56284628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017124181A RU2670166C1 (ru) | 2014-12-31 | 2015-12-29 | Способ получения слитого белка tnfr-fc с заданным содержанием примесей |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10988527B2 (ru) |
| EP (1) | EP3241849A4 (ru) |
| JP (2) | JP6793996B2 (ru) |
| KR (1) | KR102018608B1 (ru) |
| AU (1) | AU2015372801B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017014224A2 (ru) |
| IL (1) | IL253218B (ru) |
| MX (1) | MX2017008633A (ru) |
| RU (1) | RU2670166C1 (ru) |
| SA (1) | SA517381861B1 (ru) |
| WO (1) | WO2016108569A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11952399B2 (en) * | 2018-12-18 | 2024-04-09 | Amgen Inc. | Methods for purifying proteins |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140128577A1 (en) * | 2011-06-24 | 2014-05-08 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Purification of chimeric protein |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7294481B1 (en) * | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
| WO2006126942A1 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Regeneration of a chromatography matrix |
| CA2673771A1 (en) | 2007-01-17 | 2008-07-24 | Merck Serono S.A. | Process for the purification of fc-containing proteins |
| CA2784959C (en) | 2010-01-22 | 2018-06-26 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Chromatographic method for purifying fc-containing proteins |
| CN102382190B (zh) | 2010-09-01 | 2014-04-09 | 山东新时代药业有限公司 | 分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法 |
| EP2678030A4 (en) | 2011-02-25 | 2015-02-18 | Merck Sharp & Dohme | PRODUCTION OF TNFRII-FC N- AND O-SIALYLATED HYBRID PROTEIN IN YEAST |
| EP2729482B1 (en) | 2011-07-08 | 2018-03-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for purifying fc-fusion protein |
| ES2651483T3 (es) * | 2011-08-17 | 2018-01-26 | Ares Trading S.A. | Método para preparar la forma activa de la proteína de fusión TNRF-Fc |
| SI2768525T1 (sl) | 2011-10-18 | 2019-10-30 | Coherus Biosciences Inc | Formulacije etanercepta, stabilizirane z magnezijevimi ioni |
| BR112015005161A2 (pt) * | 2012-09-11 | 2017-07-04 | Coherus Biosciences Inc | etanercepte corretamente dobrado em alta pureza e excelente rendimento |
| WO2014102814A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Intas Biopharmaceuticals Limited | Process for the purification of fc fusion proteins |
-
2015
- 2015-12-29 AU AU2015372801A patent/AU2015372801B2/en active Active
- 2015-12-29 EP EP15875663.5A patent/EP3241849A4/en active Pending
- 2015-12-29 US US15/541,111 patent/US10988527B2/en active Active
- 2015-12-29 MX MX2017008633A patent/MX2017008633A/es unknown
- 2015-12-29 KR KR1020150188455A patent/KR102018608B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-29 IL IL253218A patent/IL253218B/en unknown
- 2015-12-29 BR BR112017014224-4A patent/BR112017014224A2/pt active Search and Examination
- 2015-12-29 WO PCT/KR2015/014393 patent/WO2016108569A1/ko active Application Filing
- 2015-12-29 RU RU2017124181A patent/RU2670166C1/ru active
- 2015-12-29 JP JP2017535373A patent/JP6793996B2/ja active Active
-
2017
- 2017-07-04 SA SA517381861A patent/SA517381861B1/ar unknown
-
2019
- 2019-07-10 JP JP2019128325A patent/JP2019172702A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140128577A1 (en) * | 2011-06-24 | 2014-05-08 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Purification of chimeric protein |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| (DR REDDY'S LABORATORIES LTD). Карабельский А. В., Падкина М. В. Очистка химерного белка Альбурона16 из культуральной среды дрожжей Pichia pastoris //Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. - Vol. 48. - n. 4. - P. 457-457. * |
| Карабельский А. В., Падкина М. В. Очистка химерного белка Альбурона16 из культуральной среды дрожжей Pichia pastoris //Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. - Vol. 48. - n. 4. - P. 457-457. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL253218A0 (en) | 2017-08-31 |
| JP2019172702A (ja) | 2019-10-10 |
| KR20160081827A (ko) | 2016-07-08 |
| IL253218B (en) | 2022-08-01 |
| NZ733388A (en) | 2018-11-30 |
| US10988527B2 (en) | 2021-04-27 |
| EP3241849A4 (en) | 2018-06-20 |
| JP2018503630A (ja) | 2018-02-08 |
| SA517381861B1 (ar) | 2021-09-08 |
| KR102018608B1 (ko) | 2019-09-06 |
| AU2015372801A1 (en) | 2017-07-20 |
| WO2016108569A1 (ko) | 2016-07-07 |
| AU2015372801B2 (en) | 2018-12-20 |
| JP6793996B2 (ja) | 2020-12-02 |
| US20170369553A1 (en) | 2017-12-28 |
| MX2017008633A (es) | 2018-04-26 |
| EP3241849A1 (en) | 2017-11-08 |
| BR112017014224A2 (pt) | 2018-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5777171B2 (ja) | 活性リンフォトキシン−βレセプター免疫グロブリンキメラタンパク質の高レベルの発現およびそれらの精製のための方法 | |
| JP2022081654A (ja) | 低粘度の抗原結合タンパク質およびそれらの作製方法 | |
| EP1689777B1 (en) | Process for the purification of il-18 binding protein | |
| US9279014B2 (en) | Methods for preparing an active TNFR-Fc fusion protein | |
| JP2022501357A (ja) | ヘテロ二量体多重特異性抗体を精製するための方法 | |
| CA3066893A1 (en) | Cation exchange chromatography wash buffer | |
| JP2020531411A (ja) | 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法 | |
| JP2023139142A (ja) | 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ） | |
| JP2020531557A (ja) | タンパク質の精製方法 | |
| RU2670166C1 (ru) | Способ получения слитого белка tnfr-fc с заданным содержанием примесей | |
| RU2698671C2 (ru) | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc | |
| Snyder | Working with a powerful and robust mixed-mode resin for protein purification | |
| WO2001064711A1 (fr) | Procede de separation et de purification de proteine | |
| NZ733388B (en) | Method for preparing tnfr-fc fusion protein containing target content of impurities | |
| KR20150070711A (ko) | 혼합 방식 크로마토그래피를 이용한 침출된 단백질 a 제거 방법 | |
| US20030023043A1 (en) | Method of separating and purifying protein | |
| CN118414350A (zh) | 纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法 |