RU2667423C1

RU2667423C1 - Mouse hybridoma ykl-39, clone 1b2 g4 is producer of a monoclonal antibody having specificity for cytoplasmic antigen ykl-39

Info

Publication number: RU2667423C1
Application number: RU2017122831A
Authority: RU
Inventors: Алексей Николаевич Грачев; Ольга Владимировна Ковалева; Дарья Викторовна Самойлова; Сергей Николаевич Курочкин
Original assignee: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ПраймБиоМед"
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2018-09-19
Also published as: WO2019004875A1

Abstract

FIELD: biochemistry.SUBSTANCE: invention relates to biochemistry, namely to murine hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4.EFFECT: invention allows to produce monoclonal antibody of IgG2b immunoglobulin.1 cl, 4 dwg, 1 tbl, 3 ex

Description

Мышиная гибридома YKL-39, клон 1B2 G4 - продуцент моноклонального антитела, обладающего специфичностью к хитиназоподобному белку YKL-39 человека.The mouse hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 is a producer of a monoclonal antibody that is specific for the chitinase-like human YKL-39 protein.

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления цитоплазматического белка человека YKL-39 (CHI3L2) в плазме крови онкологических больных методом ИФА, в неопластических клетках и клеточных линиях глиобластомы и др. тканей иммуноцитохимическим, иммуногистохимическим и иммунофлуоресцентным методами, а также методом иммуноблоттинга для научно-исследовательских и клинико-лабораторных целей.The invention relates to biotechnology, biology and medicine, and is intended to detect human cytoplasmic protein YKL-39 (CHI3L2) in the blood plasma of cancer patients by ELISA, in neoplastic cells and cell lines of glioblastoma and other tissues by immunocytochemical, immunohistochemical and immunofluorescence methods, as well as immunoblotting for research and clinical and laboratory purposes.

На сегодняшний день антитела являются мощным инструментом для изучения фундаментальных вопросов, направленных на выяснение функций белков человека в норме и при патологиях.Today, antibodies are a powerful tool for studying fundamental issues aimed at elucidating the functions of human proteins in normal and pathological conditions.

Проблема диагностики, в том числе ранней, онкологических заболеваний, основанная на анализе крови является актуальной последние 20 лет. В качестве маркеров для диагностики используются белки, нуклеиновые кислоты, везикулы, секретируемые опухолевыми клетками и сами опухолевые клетки. Такая диагностика проводится методом иммуноферментного анализа и позволяет выявлять заболевания на начальной стадии. Стандартные иммуноцитохимические методы анализа, с использованием антител к известным белкам-маркерам биоптата опухоли позволяют классифицировать тип новообразований и оценить степень их злокачественности (М.А. Пальцев, Н.М. Аничков. Патологическая анатомия. - М.: Медицина, 2001). Иммуногистохимическая окраска моноклональными антителами высокоспецифичных клеточных белков в сочетании с иммунопероксидазным методом позволяет не только оценивать опухоли низкой степени дифференцировки, опухоли неизвестного происхождения, более точно различать опухоли различного тканевого происхождения (Клиническая онкология: учебное пособие / под ред. П.Г. Брюсова, П.Н. Зубаревой. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 455 с.: ил.), но и позволяет выбрать соответствующие методы лечения. The problem of diagnosis, including early oncological diseases, based on a blood test has been relevant for the past 20 years. As markers for diagnosis, proteins, nucleic acids, vesicles secreted by tumor cells and tumor cells themselves are used. Such diagnostics are carried out by enzyme immunoassay and can detect diseases at the initial stage. Standard immunocytochemical methods of analysis, using antibodies to known marker proteins of tumor biopsy, allow to classify the type of neoplasms and evaluate the degree of their malignancy (M.A. Pal'tsev, N.M. Anichkov. Pathological anatomy. - M .: Medicine, 2001). The immunohistochemical staining of highly specific cellular proteins with monoclonal antibodies in combination with the immunoperoxidase method allows not only to evaluate tumors of a low degree of differentiation, tumors of unknown origin, to more accurately distinguish tumors of different tissue origin (Clinical Oncology: study guide / edited by P.G. Bryusov, P. N. Zubareva. - St. Petersburg: SpetsLit, 2012. - 455 p.: Ill.), But also allows you to choose the appropriate treatment methods.

Хитиназоподобные белки у млекопитающих — белки, образующиеся в зоне воспаления и опухолевого роста. В последнее время отдельные представители семейства изучаются как потенциальные биомаркеры различных заболеваний человека, в том числе солидных опухолей (глиомы, рака предстательной железы и яичников). На сегодняшний̆ день не существует клинически релевантного и доступного метода определения концентраций этих биомаркеров в циркулирующей крови. Одним из охарактеризованных белков является YKL-39. YKL-39, также известный как хитиназа-3-подобный белок 2 (CHI3L2), представляет собой секреторный белок хондроцитов, принадлежащих к семейству гликозилгидролазы 18. Его самая высокая экспрессия наблюдается в хондроцитах, синовиоцитах, легких и сердце, а также макрофагах. На сегодняшний день он может считаться маркером остеоартрита в синовиальной жидкости и сыворотки крови (Hu, B., Trinh, K., Figueira, W. F. and Price, P. A. (1996). Isolation and sequence of a novel human chondrocyte protein related to mammalian members of the chitinase protein family. J Biol Chem 271, 19415-19420; Steck, E., Breit, S., Breusch, S. J., Axt, M. and Richter, W. (2002). Enhanced expression of the human chitinase 3-like 2 gene (YKL-39) but not chitinase 3-like 1 gene (YKL-40) in osteoarthritic cartilage. Biochem Biophys Res Commun 299, 109-115; Knorr, T., Obermayr, F., Bartnik, E., Zien, A. and Aigner, T. (2003). YKL-39 (chitinase 3- like protein 2), but not YKL-40 (chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic chondrocytes. Ann Rheum Dis 62, 995-998). Он не обнаруживается в селезенке, поджелудочной железе и печени. YKL-39 также может экспрессироваться в развивающемся мозге и плаценте. Также повышенный уровень экспрессии гена YKL-39 показан у пациентов с болезнью Альцгеймера и в глиобласомах (Colton, C. A., Mott, R. T., Sharpe, H., Xu, Q., Van Nostrand, W. E. and Vitek, M. P. (2006). Expression profiles for macrophage alternative activation genes in AD and in mouse models of AD. J Neuroinflammation 3, 27). Какую функциональную роль может выполняет данный белок в глиобластомах на данный момент не известно, однако предполагается, что он может отвечать за пролиферативную способность клеток и ремоделирование внеклеточного матрикса (Miyatake, K., Tsuji, K., Yamaga, M., Yamada, J., Matsukura, Y., Abula, K., Sekiya, I. and Muneta, T. (2013). Human YKL39 (chitinase 3-like protein 2), an osteoarthritis- associated gene, enhances proliferation and type II collagen expression in ATDC5 cells. Biochem Biophys Res Commun 431, 52-57). За счет того, что данный белок секретируем, на него возлагают надежды как на потенциальный маркер глиобластом. Существуют публикации, в которых показано, что внесение хитиназоподобных белков в панель маркеров различных тестов приводит к повышению как чувствительности, так и специфичности тестов. Данная характеристика хитиназоподобных белков существенно расширяет их область применения. Chitinase-like proteins in mammals are proteins that form in the area of inflammation and tumor growth. Recently, individual members of the family have been studied as potential biomarkers of various human diseases, including solid tumors (gliomas, prostate and ovarian cancer). To date, there is no clinically relevant and affordable method for determining the concentrations of these biomarkers in circulating blood. One of the characterized proteins is YKL-39. YKL-39, also known as chitinase-3-like protein 2 (CHI3L2), is a secretory protein of chondrocytes belonging to the glycosyl hydrolase 18 family. Its highest expression is observed in chondrocytes, synoviocytes, lungs and the heart, as well as macrophages. Today, it can be considered a marker of osteoarthritis in synovial fluid and blood serum (Hu, B., Trinh, K., Figueira, WF and Price, PA (1996). Isolation and sequence of a novel human chondrocyte protein related to mammalian members of the chitinase protein family. J Biol Chem 271, 19415-19420; Steck, E., Breit, S., Breusch, SJ, Axt, M. and Richter, W. (2002). Enhanced expression of the human chitinase 3-like 2 gene (YKL-39) but not chitinase 3-like 1 gene (YKL-40) in osteoarthritic cartilage. Biochem Biophys Res Commun 299, 109-115; Knorr, T., Obermayr, F., Bartnik, E., Zien , A. and Aigner, T. (2003). YKL-39 (chitinase 3-like protein 2), but not YKL-40 (chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic chondrocytes. Ann Rheum Dis 62, 995-998). It is not found in the spleen, pancreas and liver. YKL-39 can also be expressed in the developing brain and placenta. An increased level of expression of the YKL-39 gene is also indicated in patients with Alzheimer's disease and in glioblasomas (Colton, CA, Mott, RT, Sharpe, H., Xu, Q., Van Nostrand, WE and Vitek, MP (2006). for macrophage alternative activation genes in AD and in mouse models of AD. J Neuroinflammation 3, 27). What functional role this protein can play in glioblastomas is not currently known, but it is assumed that it can be responsible for the proliferative ability of cells and remodeling of the extracellular matrix (Miyatake, K., Tsuji, K., Yamaga, M., Yamada, J. , Matsukura, Y., Abula, K., Sekiya, I. and Muneta, T. (2013). Human YKL39 (chitinase 3-like protein 2), an osteoarthritis-associated gene, enhances proliferation and type II collagen expression in ATDC5 cells. Biochem Biophys Res Commun 431, 52-57). Due to the fact that this protein is secreted, hopes are pinned on it as a potential marker for glioblastomas. There are publications in which it is shown that the introduction of chitinase-like proteins in the panel of markers of various tests leads to an increase in both the sensitivity and specificity of the tests. This characteristic of chitinase-like proteins significantly expands their scope.

Для выявления белка YKL-39 у человека на сегодняшний день существует несколько доступных коммерческих как поликлональных, так и моноклональных антител. Известные мышиные и кроличьи гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену YKL-39 человека, были получены при иммунизации животных как полноразмерным рекомбинантным белком YKL-39 человека, так и различными рекомбинантными и синтетическими полипептидными участками белка YKL-39 человека. К недостаткам описанных клонов относятся дороговизна моноклональных антител, продуцируемых данными гибридомами, ввиду их зарубежного происхождения, а также отсутствие для некоторых из них данных о тестировании в реакциях иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, использующихся в ежедневной клинико-диагностической практике, а также иммуноблоттинге. To identify the YKL-39 protein in humans, there are currently several commercial polyclonal and monoclonal antibodies available. Known murine and rabbit hybridomas producing monoclonal antibodies to the human cytoplasmic antigen YKL-39 were obtained by immunizing animals with both full-sized recombinant human YKL-39 protein and various recombinant and synthetic polypeptide portions of the human YKL-39 protein. The disadvantages of the described clones include the high cost of monoclonal antibodies produced by these hybridomas, due to their foreign origin, as well as the lack of data for some of them on testing in immunohistochemistry, immunofluorescence reactions used in daily clinical diagnostic practice, as well as immunoblotting.

Задачей изобретения является расширение ассортимента моноклональных антител, обладающих специфичностью к белку YKL-39 человека, использующихся для иммунодиагностики и прогностической оценки течения опухолевых заболеваний у человека.The objective of the invention is to expand the assortment of monoclonal antibodies with specificity for the human YKL-39 protein, used for immunodiagnostics and prognostic assessment of the course of tumor diseases in humans.

Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы YKL-39, клон 1B2 G4 - продуцента моноклонального антитела, выявляющего YKL-39 методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга, полученной путем иммунизации мышей линии Balb/c рекомбинантным полноразмерным белком, и слиянием сенсибилизированных спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии sp2/0 с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500.The problem is solved by mouse hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 - producer of a monoclonal antibody that detects YKL-39 by enzyme-linked immunosorbent assay, immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunofluorescence and immunoblotting obtained by immunization of mice with Baltin / recombinant splenocytes of immunized mice with sp2 / 0 mouse myeloma cells using polyethylene glycol with a molecular weight of 1500.

Продуцируемые гибридомой 1B2 G4 моноклональные антитела к белку YKL-39 человека обладают селективной способностью связывать белок YKL-39 человека в иммуноферментном анализе (Таб.1), на иммуноблотах (Фиг.4), на клеточном (Фиг.2, Фиг.3) и тканевом уровнях (на парафиновых срезах) (Фиг.1), и расширяют существующий доступный ассортимент моноклональных антител к белку YKL-39. Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. Моноклональные антитела, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества моноклональных антител к белку YKL-39 человека важно с научной и практической точки зрения.Monoclonal antibodies produced by hybridoma 1B2 G4 to human YKL-39 protein have selective ability to bind human YKL-39 protein in enzyme immunoassay (Table 1), on immunoblots (Figure 4), on cell (Figure 2, Figure 3) and tissue levels (on paraffin sections) (Figure 1), and expand the existing available assortment of monoclonal antibodies to the protein YKL-39. It should also be noted that each newly obtained hybridoma is unique. Monoclonal antibodies produced by different hybridomas differ in their primary structure, in specificity for various antigenic determinants, affinity, and other properties. Therefore, obtaining as many monoclonal antibodies as possible to the human YKL-39 protein is important from a scientific and practical point of view.

Технический результат изобретения заключается в получении линии гибридом мыши 1B2 G4, продуцирующей доступные для отечественных клинико-диагностических лабораторий моноклональные антитела к цитоплазматическому антигену YKL-39 человека, пригодных для иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции, и позволяющие использоваться для диагностики глиобластом. The technical result of the invention is to obtain a line of mouse hybridomas 1B2 G4, producing monoclonal antibodies available to domestic clinical diagnostic laboratories for human cytoplasmic antigen YKL-39, suitable for enzyme immunoassay, immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunoblotting and immunofluorescence for diagnosis and

Мышиную гибридому YKL-39, клон 1B2 G4 получали следующим образом:The mouse hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 was prepared as follows:

Для получения бактериального штамма, экспрессирующего рекомбинантный белок YKL-39, его кодирующая последовательность была заклонирована в вектор pET45b(+). Ген YKL-39 человека (нуклеотидная последовательность кДНК YKL-39 человека доступны в базе данных GeneBank по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ с порядковым номером NM_004000.2) амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии LN229 с использованием ген-специфических праймеров (YKL-39 F3006 Xho ACTTCTCGAGACCATGGGAGCAACCACC, YKL-39 R3006 Hind TAGAAAGCTTCAAGGAGCCAAGGCTTC, встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции XhoI/HindIII). Амплифицированные фрагменты ДНК очищали и клонировали в вектор pET45b(+) по сайтам, созданным эндонуклеазами рестрикции. В результате была получена плазмида, несущая ген белка YKL-39 человека. Плазмиду тестировали на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК. Компетентные клетки E. coli штамм BL21 DE3 химически трансформировали полученной плазмидой pET45b(+)-YKL-39, высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37°С в течение 16 ч. Далее в 50 мл среды LB переносили единичную колонию и наращивали при 37°С в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Далее из ночной культуры экспрессию белков в бактериях E.coli BL21 DE3 стимулировали с помощью IPTG в конечной концентрации 1мМ в течение 4-5 часов при 37ºC. По истечении времени стимуляции клетки бактерий были лизированы, сонифицированы с помощью ультразвука и подвержены процедуре очистки.To obtain a bacterial strain expressing the recombinant protein YKL-39, its coding sequence was cloned into the vector pET45b (+). The human YKL-39 gene (the nucleotide sequence of human YKL-39 cDNA is available in the GeneBank database at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ with serial number NM_004000.2) amplified on a cDNA matrix obtained from LN229 cell mRNA using gene-specific primers (YKL-39 F3006 Xho ACTTCTCGAGACCATGGGAGCAACCACC, YKL-39 R3006 Hind TAGAAAGCTTCAAGGAGCCAAGGCTTC, built-in XhoI / HindIII restriction endonuclease sites). The amplified DNA fragments were purified and cloned into the pET45b (+) vector at the sites created by restriction endonucleases. As a result, a plasmid carrying the human YKL-39 protein gene was obtained. The plasmid was tested for the presence of nucleotide substitutions by automatic DNA sequencing. Competent cells of E. coli strain BL21 DE3 were chemically transformed with the obtained plasmid pET45b (+) - YKL-39, plated on LB agar plates containing 100 μg / ml ampicillin, and incubated at 37 ° C for 16 hours. Next, 50 ml of LB medium was transferred to a single colony and increased at 37 ° C for 16 hours with constant stirring. Further, from an overnight culture, protein expression in E. coli BL21 DE3 bacteria was stimulated with IPTG at a final concentration of 1 mM for 4-5 hours at 37 ° C. After the stimulation time, the bacterial cells were lysed, sonicated by ultrasound and subjected to a cleaning procedure.

На первой стадии тельца включения экстрагировались 5М мочевиной в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре. При этом не происходило растворения целевых белков, однако отделялось множество примесей и наблюдалось значительное уменьшение массы осадка телец включения. In the first stage, the inclusion bodies were extracted with 5M urea in PBST for 1 hour at room temperature. In this case, the target proteins did not dissolve, however, many impurities were separated and a significant decrease in the sediment mass of inclusion bodies was observed.

На второй стадии для лизиса телец включения был использован буфер следующего состава: (Аргинин – 0.5 М, Мочевина – 6 М, Трис – 20 мМ, рН 10.0, Дитиотреитол – 50 мМ, ЭДТА – 5 мМ, Глицин 10 мМ). Лизис осуществляли в течение 12 часов при +4°С. Раствор центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 5 минут при +4°С. Если оставался осадок, его повторно экстрагировали ½ объема лизирующего буфера с последующем центрифугированием и объединением супернатантов. Рефолдинг белков проводили путем перевода гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в буфер следующего состава с последующей инкубацией в течение 12-36 часов при 4°С: (NaCL – 0.5 М, Мочевина 4 (1) М*, Аргинин – 0.5 (0.05) М*, ЭДТА – 1 мМ, Цистеамин – 10 мМ, Имидазол – 2 мМ, PBST – до 50 мл. *- начальные значения (в скобках) по результатам эксперимента были корректированы в сторону увеличения)). Дальнейшую очистку белков производили метал-хелатной хроматографией (IMAC) на колонке IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GEHealthCare, 17-0921-08). Для этого белки переводили гельфильтрацией на колонке Сефадекса G-25 в IMAC-буфер следующего состава: (NaCL – 0.5 М, Мочевина – 1М, Имидазол – 5 мМ, Аргинин – 50 мМ, PBST – до 50 мл). Белок наносили на колонку IMAC Sepharose 6 Fast Flow, уравновешенную буфером, приведенного выше состава. Колонку промывали ступенчатым градиентом концентрации имидазола. Было установлено, что до концентрации имидазола 20 мМ видимой элюции целевого белка не происходит. Эффективная элюция белка YKL-39 с минимальными примесями происходит при 75 мМ имидазола. Полученный в результате процедуры очистки белок YKL-39 был использован в качестве антигена для дальнейшей иммунизации мышей.In the second stage, a buffer of the following composition was used for lysis of inclusion bodies: (Arginine - 0.5 M, Urea - 6 M, Tris - 20 mM, pH 10.0, Dithiothreitol - 50 mM, EDTA - 5 mM, Glycine 10 mM). Lysis was carried out for 12 hours at + 4 ° C. The solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at + 4 ° C. If a precipitate remained, it was re-extracted with ½ volume of lysis buffer, followed by centrifugation and combining of supernatants. Protein refolding was performed by gel filtration on a Sephadex G-25 column into a buffer of the following composition, followed by incubation for 12-36 hours at 4 ° С: (NaCL - 0.5 M, Urea 4 (1) M *, Arginin - 0.5 (0.05) M *, EDTA - 1 mM, Cysteamine - 10 mM, Imidazole - 2 mM, PBST - up to 50 ml. * - the initial values (in brackets) according to the results of the experiment were adjusted upward)). Further protein purification was performed by metal chelate chromatography (IMAC) on an IMAC Sepharose 6 Fast Flow column (GEHealthCare, 17-0921-08). For this, the proteins were transferred by gel filtration on a Sephadex G-25 column to an IMAC buffer of the following composition (NaCL - 0.5 M, Urea - 1 M, Imidazole - 5 mM, Arginine - 50 mM, PBST - up to 50 ml). Protein was applied to an IMAC Sepharose 6 Fast Flow column, equilibrated with the buffer above composition. The column was washed with a stepwise gradient of imidazole concentration. It was found that up to a concentration of imidazole of 20 mm visible elution of the target protein does not occur. Effective elution of YKL-39 protein with minimal impurities occurs at 75 mM imidazole. The resulting YKL-39 protein was used as an antigen for further immunization of mice.

Первичную иммунизацию проводили мышам Balb/c (самкам, 18 гр), вводя около 30 мкг антигена (рекомбинантный белок Ykl-39) с полным адъювантом Фрейнда (1:1) в лапы и в холку. Бустирование антигеном с неполным адъювантом Фрейнда проводили через две недели после первичной иммунизации. Гибридизацию (слияние) спленоцитов мышей с клеточной линией Sp 2/0 делали через 3 дня (на 4-й день) после бустирования с помощью PEG 1500. В среду для посадки гибридом (RPMI-1640 с 15% FetalClone I) добавляли HAT в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные гибридомы были рассажены на три 96-луночные планшета по 150 мкл суспензии в лунку и оставлены на 10 дней после чего были протестированы методом ИФА. В результате тестирования отобран 21 клон, хорошо связывающий антиген. Проведено первое клонирование для всех клонов. По результатам ИФА на взаимодействие с полноразмерным рекомбинантным Ykl-39 отсажено по 3 субклона для 21 клона, а затем отобраны сильные субклоны. В результате отобрано и заморожено 19 клонов. В качестве дополнительных ИФА-тестов были тесты на взаимодействие с неконсервативными последовательностями (NCR) YKL-39, YKL-40, SI-CLP, c N и C-концевыми частями YKL-39, с полноразмерным YKL-40, пептидом 2 YKL-39 (226-241), пептидом 4 SI-CLP (259-276). По результатам ИФА-тестов, показывающих взаимодействие антител с другими антигенами было отобрано для наработки антител и заморозки 4 финальных клона: 1A12A4, 1C12A4, 1D1A1, 1B2G4 (Таб. 1). Primary immunization was performed with Balb / c mice (females, 18 g), introducing about 30 μg of antigen (recombinant protein Ykl-39) with Freund's complete adjuvant (1: 1) into the paws and withers. Freund's antigen incomplete adjuvant boosting was performed two weeks after primary immunization. Hybridization (fusion) of splenocytes of mice with the Sp 2/0 cell line was done 3 days (on the 4th day) after boosting with PEG 1500. HAT was added to the hybrid planting medium (RPMI-1640 with 15% FetalClone I) according to with manufacturer's recommendations. The resulting hybridomas were plated on three 96-well plates with 150 μl of suspension per well and left for 10 days after which they were tested by ELISA. As a result of testing, 21 clones that bind antigen well were selected. The first cloning was performed for all clones. According to the ELISA, 3 subclones for 21 clones were deposited for interaction with full-size recombinant Ykl-39, and then strong subclones were selected. As a result, 19 clones were selected and frozen. As additional ELISA tests, YKL-39, YKL-40, SI-CLP, with N and C-terminal parts of YKL-39, with full-size YKL-40, peptide 2 YKL-39, were tested for interaction with non-conservative sequences (NCR) (226-241), peptide 4 SI-CLP (259-276). According to the results of ELISA tests showing the interaction of antibodies with other antigens, 4 final clones were selected for antibody production and freezing: 1A12A4, 1C12A4, 1D1A1, 1B2G4 (Table 1).

Затем отобранные по ИФА антитела тестировали методом иммуноцитохимии и иммунофлуоресценции. Антиетела всех 4 клонов протестировали на клетках культуры LN229. Только одни антитела показали четкое связывание с антигеном YKL-39 в клетках в виде гранул в цитоплазме – клон 1B2 G4 (Фиг. 2, 3).Then, ELISA antibodies were tested by immunocytochemistry and immunofluorescence. Antibodies of all 4 clones were tested on LN229 culture cells. Only one antibody showed clear binding to the YKL-39 antigen in cells in the form of granules in the cytoplasm - clone 1B2 G4 (Fig. 2, 3).

Антитела к белку YKL-39, клон 1B2 G4 тестировали методом иммуногистохимии на срезах нормальной почки (Фиг. 1). Наблюдалась четкая цитоплазматическая окраска клеток почечных канальцев. Antibodies to protein YKL-39, clone 1B2 G4 were tested by immunohistochemistry on sections of a normal kidney (Fig. 1). A clear cytoplasmic staining of renal tubule cells was observed.

Дополнительно был проведен иммуноблоттинг (Фиг. 4) для проверки антител на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 и показано, что антитела к Ykl-39, клон 1B2 G4 связывают белок Ykl-39. In addition, immunoblotting was performed (Fig. 4) to test antibodies on total lysates of the LN229 glioblastoma cell line and it was shown that antibodies to Ykl-39, clone 1B2 G4 bind Ykl-39 protein.

Таким образом антитела, продуцируемые гибридомой Ykl-39, клон 1B2 G4, тестировали методами иммуноферментного анализа, иммуноцитохимии, непрямой иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга на тотальных лизатах клеточной линии LN229, содержащей белок YKL-39. Антитела связываются с полноразмерным белком Ykl-39, c неконсервативной последовательностью Ykl-39, c N-концевой последовательностью Ykl-39, специфически работают в иммуноцитохимии на клетках LN229, иммуногистохимии на тканях почки и иммуноблоттинге на тотальных лизатах LN229. Thus, antibodies produced by the Ykl-39 hybridoma, clone 1B2 G4, were tested by enzyme-linked immunosorbent assay, immunocytochemistry, indirect immunofluorescence, and immunoblotting on total lysates of the LN229 cell line containing the YKL-39 protein. Antibodies bind to the full-sized protein Ykl-39, to the non-conservative sequence Ykl-39, to the N-terminal sequence of Ykl-39, specifically work in immunocytochemistry on LN229 cells, immunohistochemistry on kidney tissues and immunoblotting on total LN229 lysates.

Мышиная гибридома YKL-39, клон 1B2 G4 - продуцент моноклонального антитела YKL-39 - имеет следующие характеристики:The mouse hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 - producer of the monoclonal antibody YKL-39 - has the following characteristics:

Морфологические признаки: Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.Morphological characteristics: The culture has the form of a suspension, where the cells are collected in conglomerates and loosely attached to the substrate.

Условия рутинного культивирования клеток гибридомы YKL-39, клон 1B2 G4: Среда для культивирования – RPMI-1640 («HyClone», США), 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки FetalClone 1 («HyClone», США), 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Условия культивирования: 37°C, абсолютная влажность и 5% СО₂в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10.Conditions for routine culturing of YKL-39 hybridoma cells, clone 1B2 G4: Culture medium - RPMI-1640 (HyClone, USA), 7.5% fetal calf serum FetalClone 1 (HyClone, USA), 4 mM L-glutamine , 100 μg / ml gentamicin. Cultivation conditions: 37 ° C, absolute humidity and 5% CO ₂ in the atmosphere. The passivation frequency is every 3-4 days, the sieving ratio is 1: 5-1: 10.

Способ криоконсервирования клеток гибридомы YKL-39, клон 1B2 G4. В суспензию клеток в кондиционированной среде добавляют 7-10% ДМСО («ПанЭко», Россия). Криопробирки с суспензией клеток перемешивают и помещают на сутки в холодильник на -80°С, затем переносят в жидкий азот для длительного хранения. Жизнеспособность клеток после размораживания 80%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3·10⁶кл/мл.Method for cryopreservation of hybridoma cells YKL-39, clone 1B2 G4. 7-10% DMSO (PanEco, Russia) is added to the cell suspension in a conditioned medium. Cryovials with a suspension of cells are mixed and placed for a day in a refrigerator at -80 ° C, then transferred to liquid nitrogen for long-term storage. Cell viability after thawing is 80%. After thawing, cells are cultured at a density of 0.2-0.3 · 10 ⁶ cells / ml.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.Bacteria, fungi, yeast and mycoplasma were not found in the culture.

Изотип моноклонального антитела YKL-39, клон 1B2 G4: моноклональное антитело, секретируемое гибридомой 1B2 G4, относится к иммуноглобулинам класса IgG2b.Isotype of monoclonal antibody YKL-39, clone 1B2 G4: the monoclonal antibody secreted by hybridoma 1B2 G4 belongs to the IgG2b class immunoglobulins.

Специфичность моноклонального антитела YKL-39, клон 1B2 G4. Моноклональное антитело выявляет белок YKL-39 в тканях почки человека (Фиг.1), в ряде клеточных линий разного тканевого происхождения, например, в линии LN229 (глиобластома) (Фиг.2, 3). Антитело 1B2 G4 также узнает рекомбинантный YKL-39 в тотальных клеточных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 на иммуноблотах (Фиг.4).The specificity of the monoclonal antibody YKL-39, clone 1B2 G4. The monoclonal antibody detects the YKL-39 protein in the tissues of the human kidney (Figure 1), in a number of cell lines of different tissue origin, for example, in the LN229 line (glioblastoma) (Figure 2, 3). Antibody 1B2 G4 also recognizes recombinant YKL-39 in total cell lysates of the LN229 glioblastoma cell line on immunoblots (Figure 4).

Оптимальные разведения антител YKL-39, клон 1B2 G4, определяемые в супернатанте методом иммуногистохимии – 1:1, методом непрямой иммунофлуоресценции - 1:2, методом иммуноблотов - 1:2.The optimal dilutions of antibodies YKL-39, clone 1B2 G4, determined in the supernatant by the method of immunohistochemistry - 1: 1, by the method of indirect immunofluorescence - 1: 2, by the method of immunoblots - 1: 2.

Продуцируемое гибридомой 1B2 G4 моноклональное антитело рекомендуется для специфического выявления антигена YKL-39 в крови и прочих жидкостях методом иммуноферментного анализа, в тканях, содержащих данный антиген – методом иммуногистохимии, а также в цитоплазме неопластических клеток глиобластомы человека методами иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции, иммуноблоттинга. The monoclonal antibody produced by hybridoma 1B2 G4 is recommended for specific detection of YKL-39 antigen in blood and other fluids by enzyme-linked immunosorbent assay, in tissues containing this antigen by immunohistochemistry, as well as in the cytoplasm of neoplastic human glioblastoma cells by immunocytochemistry, immunofluorescence and immunofluorescence.

Изобретение иллюстрируют следующие фотографии и таблица:The invention is illustrated by the following photographs and table:

Табл. 1. ИФА, показывающий связывание антител к Ykl-39, клон 1B2 G4 помимо полноразмерного Ykl-39 с различными антигенами: неконсервативными последовательностями (NCR) YKL-39, YKL-40, SI-CLP, c N и C-концевыми частями YKL-39, с полноразмерным YKL-40, пептидом 2 YKL-39 (226-241), пептидом 4 SI-CLP (259-276).Tab. 1. ELISA showing the binding of antibodies to Ykl-39, clone 1B2 G4 in addition to full-sized Ykl-39 with various antigens: non-conservative sequences (NCR) YKL-39, YKL-40, SI-CLP, with N and C-terminal parts of YKL- 39, with full-sized YKL-40, peptide 2 YKL-39 (226-241), peptide 4 SI-CLP (259-276).

Фиг. 1. Специфичность антитела YKL-39, клон 1B2 G4, продуцируемого гибридомой 1B2 G4, к белку YKL-39 в клетках почки, выявляемая методом иммуногистохимии. Для детекции связавшихся с антигеном антител, были использованы вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ, как описано в Примере 1. Специфическая гранулярная окраска цитоплазмы клеток канальцев на парафиновом срезе ткани, фиксированном формалином, свидетельствует о наличии клеток, экспрессирующих YKL-39. FIG. 1. The specificity of the antibody YKL-39, clone 1B2 G4 produced by hybridoma 1B2 G4, to the protein YKL-39 in kidney cells, detected by immunohistochemistry. To detect antibodies bound to the antigen, secondary antibodies to mouse immunoglobulins were used, conjugated to polymer horseradish peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and a DAB substrate, as described in Example 1. A specific granular staining of the tubule cell cytoplasm on a paraffin section of tissue fixed form the presence of cells expressing YKL-39.

Фиг. 2. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой 1B2 G4, к белку YKL-39 в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммунофлуоресценции. Стрелками обозначен окрашенный антителом 1B2 G4 YKL-39, располагающийся в везикулах эпителиальных клеток линии LN229. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, США), как описано в Примере 2. FIG. 2. The specificity of the antibody produced by hybridoma 1B2 G4, to the protein YKL-39 in human cells of the line LN229, detected by immunofluorescence. Arrows indicate YKL-39 stained with antibody 1B2 G4, located in the vesicles of epithelial cells of the LN229 line. Secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with Alexa Fluor 488 fluorochrome (Molecular Probes, USA) were used to detect antibodies bound to the antigen, as described in Example 2.

Фиг.3. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой YKL-39, клон 1B2 G4, к белку YKL-39 в клетках человека линии LN229, выявляемая методом иммуноцитохимии. Темные точки представляют собой окрашенный антителом антиген YKL-39, располагающийся в везикулах клеток линии LN229. Для выявления связавшихся с антигеном антител использовались вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) и субстрат ДАБ как описано в Примере 2.Figure 3. The specificity of the antibody produced by the YKL-39 hybridoma, clone 1B2 G4, to the YKL-39 protein in human LN229 cells, detected by immunocytochemistry. Dark spots represent the YKL-39 antigen stained antibody, located on the vesicles of LN229 cell lines. Secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to polymer horseradish peroxidase (PrimeBioMed, Russia) and a DAB substrate as described in Example 2 were used to detect antibodies bound to the antigen.

Фиг. 4. Специфичность антитела, продуцируемого гибридомой YKL-39, клон 1B2 G4, к белку YKL-39 на тотальных лизатах клеточной линии глиобластомы LN229 выявляется на иммуноблотах. Связывание белка YKL-39 антителом 1B2 G4 после переноса белков на мембрану. Белковые лизаты приготовлены, а мембрана проявлена, как описано в Примере 3. Электрофоретическая подвижность белка соответствует расчетной. FIG. 4. The specificity of the antibody produced by the YKL-39 hybridoma, clone 1B2 G4, to the YKL-39 protein on total lysates of the glioblastoma LN229 cell line is detected on immunoblots. Binding of YKL-39 protein by 1B2 G4 antibody after protein transfer to the membrane. Protein lysates are prepared, and the membrane is developed as described in Example 3. The electrophoretic mobility of the protein corresponds to the calculated one.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:The invention is illustrated by the following examples:

Пример 1. Приготовление срезов для иммуногистохимического выявления белка YKL-39.Example 1. The preparation of sections for immunohistochemical detection of protein YKL-39.

Иммуногистохимическое исследование проводят на операционном материале, фиксированном 10%-ным нейтральным формалином, забуференным фосфатным буфером, в течение 24 часов. После гистологической проводки материал заливают в парафин и затем готовят срезы толщиной 2-4 мкм. Срезы монтируют на специальные высокоадгезивные стекла (SuperFrost Plus, ApexLab) и высушивают в течение 18 часов при температуре 37°С.An immunohistochemical study is carried out on an operative material fixed with 10% neutral formalin buffered with phosphate buffer for 24 hours. After histological posting, the material is poured into paraffin and then sections 2-4 μm thick are prepared. Sections are mounted on special highly adhesive glass (SuperFrost Plus, ApexLab) and dried for 18 hours at a temperature of 37 ° C.

Парафин далее удаляют со срезов в трех сменах ксилола, по 10 мин в каждой смене. Проводят срезы через спирты с объемной долей изопропанола 100% (I), 100% (II), 70%, 50% по 5 мин в каждом и промывают в дистиллированной воде. Блокировка эндогенной пероксидазы проводится в 3% перекиси водорода 10 минут. Срезы инкубируют с антителами YKL-39, клон 1B2 G4, а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия). Окрашивание проявляется при добавлении субстрата ДАБ хромогена на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия). Результат представлен на Фиг.1.Paraffin is then removed from the sections in three xylene shifts, 10 min in each shift. Sections were carried out through alcohols with a volume fraction of isopropanol of 100% (I), 100% (II), 70%, 50% for 5 minutes each and washed in distilled water. Blocking endogenous peroxidase is carried out in 3% hydrogen peroxide for 10 minutes. Sections were incubated with YKL-39 antibodies, clone 1B2 G4, and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to polymer horseradish peroxidase (PrimeBioMed, Russia). Staining appears when a substrate of DAB chromogen is added for 5-10 minutes (PrimeBioMed, Russia). The result is shown in FIG.

Пример 2. Способы фиксации клеток для выявления белка YKL-39 в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноцитохимии.Example 2. Methods of cell fixation for the detection of YKL-39 protein in the reaction of indirect immunofluorescence and immunocytochemistry.

Культуру LN229 выращивают на покровных стеклах до достижения 30% конфлуентности. Клетки фиксируют, помещая в 3,7% параформальдегид на 15 мин, с последующей промывкой в PBS (ПанЭко, Россия) на 10 мин. После фиксации и промывок клетки инкубируют с антителом YKL-39, клон 1B2 G4 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Alexa488 (JacksonImmunoresearch, США), или полимерной пероксидазой хрена (ПраймБиоМед, Россия) 40 или 15 мин, соответственно, при комнатной температуре. Для визуализации окрашивания в нефлуоресцентном методе добавляют субстрат ДАБ хромоген на 5-10 минут (ПраймБиоМед, Россия) Препараты заключают в среду для заключения на водной основе и изучают в микроскоп Olympus BX53 (Cheminst, Германия), сопряженный с 2 мп камерой Infinity 2 (Lumenera, США), используя объективы U PlanFL N Ч40/ЧА 0.75 и U PlanFL N Ч100/ЧА 1.30. Для иммунофлуоресценции используются фильтры, U-FUNA и U-FGNA (Olympus, Япония). Результаты представлены на Фиг. 2 и 3.The LN229 culture is grown on coverslips until 30% confluency is achieved. Cells are fixed by placing paraformaldehyde in 3.7% for 15 minutes, followed by washing in PBS (PanEco, Russia) for 10 minutes. After fixation and washing, the cells are incubated with YKL-39 antibody, clone 1B2 G4 for 1 h at room temperature, and then with goat antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with Alexa488 fluorochrome (Jackson Immunoresearch, USA) or horseradish polymer peroxidase (PrimeBioMed Russia, 40) or 15 minutes, respectively, at room temperature. For visualization of staining in the non-fluorescent method, a DAB chromogen substrate is added for 5-10 minutes (PrimeBioMed, Russia). The preparations are enclosed in a water-based imprisonment medium and examined using an Olympus BX53 microscope (Cheminst, Germany) coupled to a 2 MP Infinity 2 camera (Lumenera , USA) using lenses U PlanFL N Ч40 / ЧА 0.75 and U PlanFL N Ч100 / ЧА 1.30. Filters, U-FUNA and U-FGNA (Olympus, Japan) are used for immunofluorescence. The results are presented in FIG. 2 and 3.

Пример 3. Способ получения тотальных клеточных лизатов и выявления нативного белка YKL-39 методом иммуноблоттинга. Example 3. The method of obtaining total cell lysates and the detection of native protein YKL-39 by immunoblotting.

5Ч10⁵ клеток линии LN229 лизируют на льду в буфере, содержащем 50 mМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 mM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона Х-100 и коктейль протеазных ингибиторов (Roche, США). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Бредфорд с помощью Protein Assay Kit (Bio-Rad, США), следуя рекомендациям производителя. ⁵ × 10 ⁵ cells of the LN229 line are lysed on ice in a buffer containing 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100, and a cocktail of protease inhibitors (Roche, USA). The total concentration of proteins in the lysates is determined by the Bradford method using the Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA), following the manufacturer's recommendations.

Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5Ч-ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% додецилсульфата натрия (ДСН), 500 мМ бета-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 95°С 5 мин. В каждую лунку 10% полиакриламидного геля с ДСН (ПААГ-ДСН) наносят лизаты, содержащие не менее 15 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ-ДСН проводят 30 мин при 60 В и 60 мин при 120 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Далее гель инкубируют в буфере для проведения блоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% ДСН и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, Millipore, США) проводят при постоянной силе тока 250 мА 60 мин. Мембрану блокируют 5% молоком (Bio-Rad, США) 1 час, инкубируют с антителами YKL-39, клон 1B2 G4 (ночь при +4°С), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:5000, Abcam, США) -1 час. Сухое молоко (Bio-Rad, США) и антитела разводят в буфере TBST, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus (Millipore, Великобритания) согласно инструкции производителя. Хемилюминесцентную реакцию регистрируют на приборе ChemiDoc MP (Bio-Rad, UK) с последующей обработкой с помощью программы ChemiDoc XRS+ imaging systems. Результаты представлены на Фиг.4.Before electrophoretic separation, 5 × Laemmli buffer containing 250 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (pH 6.8), 50% glycerol, 10% sodium dodecyl sulfate (SDS), 500 mM beta-mercaptoethanol, 0.5% bromophenol blue is added to the prepared lysates . Samples were heat treated at 95 ° C for 5 minutes. In each well of a 10% SDS gel of polyacrylamide (SDS page-SDS), lysates containing at least 15 μg of total protein are applied. Electrophoretic separation of proteins in SDS page-SDS is carried out for 30 minutes at 60 V and 60 minutes at 120 V for further separation in an electrophoresis chamber. Next, the gel is incubated in a blotting buffer containing 50 mM Tris- (hydroxymethyl) aminomethane, 38 mM glycine, 0.1% SDS and 20% methanol. Protein transfer to the nitrocellulose membrane (0.22 μm, Millipore, USA) is carried out at a constant current strength of 250 mA for 60 min. The membrane is blocked with 5% milk (Bio-Rad, USA) for 1 hour, incubated with antibodies YKL-39, clone 1B2 G4 (overnight at + 4 ° C), and then with antibodies to mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase (dilution 1: 5000, Abcam, USA) -1 hour. Powdered milk (Bio-Rad, USA) and antibodies are diluted in TBST buffer containing 20 mM Tris- (hydroxymethyl) aminomethane (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20. The membrane is developed by chemiluminescence using an ECL + Plus kit (Millipore, UK) according to the manufacturer's instructions. The chemiluminescent reaction is recorded on a ChemiDoc MP instrument (Bio-Rad, UK), followed by treatment with the ChemiDoc XRS + imaging systems program. The results are presented in FIG. 4.

Claims

Mouse hybridoma YKL-39, clone 1B2 G4 - producer of a monoclonal antibody that recognizes Ykl-39 protein by enzyme immunoassay, as well as in neoplastic cells of glioblastoma and in cells of other organs containing this antigen, by methods of immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunoblotting and immunofluorescence immunization of Balb / c mice with full-length recombinant human YKL-39 protein and fusion of sensitized splenocytes of immunized mice with sp2 / 0 mouse myeloma cells using a 50% solution and polyethylene glycol with a molecular weight of 1500.