RU2663003C1 - Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups - Google Patents
Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663003C1 RU2663003C1 RU2017127677A RU2017127677A RU2663003C1 RU 2663003 C1 RU2663003 C1 RU 2663003C1 RU 2017127677 A RU2017127677 A RU 2017127677A RU 2017127677 A RU2017127677 A RU 2017127677A RU 2663003 C1 RU2663003 C1 RU 2663003C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- tcp
- strains
- serogroups
- cells
- Prior art date
Links
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 title claims abstract description 25
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 241000194314 Vibrio cholerae O139 Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101000651298 Homo sapiens TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Proteins 0.000 description 4
- 102100027651 TRAF-interacting protein with FHA domain-containing protein A Human genes 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150056627 tcp gene Proteins 0.000 description 2
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 101710134191 24 kDa antigen Proteins 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SNLFYGIUTYKKOE-UHFFFAOYSA-N 4-n,4-n-bis(4-aminophenyl)benzene-1,4-diamine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1N(C=1C=CC(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C=C1 SNLFYGIUTYKKOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000005061 Vibrio cholerae O22 Species 0.000 description 1
- 241000025846 Vibrio cholerae non-O1/non-O139 Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000215 hyperchromic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 101150093706 tor gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1239—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Vibrionaceae (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть применено при создании иммуноферментных диагностических тест-систем для идентификации tcp+ штаммов V. cholerae O1 и O139 серогрупп.The present invention relates to biotechnology, in particular hybridoma biotechnology, and can be used to create enzyme-linked immunosorbent diagnostic test systems for the identification of tcp + strains of V. cholerae O1 and O139 serogroups.
В настоящее время в лабораторной диагностике холеры актуальной задачей по-прежнему остается разработка новых диагностических средств, позволяющих своевременно обнаружить антигены V. cholerae O1, O139 в исследуемых образцах. Одним из направлений усовершенствования иммунодиагностических препаратов является использование в качестве детектирующих антител специфических моноклональных иммуноглобулинов (МКА), продуцируемых стабильными гибридными клеточными линиями.Currently, in the laboratory diagnosis of cholera, the development of new diagnostic tools that allow timely detection of V. cholerae O1, O139 antigens in the studied samples remains an urgent task. One of the directions for improving immunodiagnostic drugs is the use of specific monoclonal immunoglobulins (MCAs) produced by stable hybrid cell lines as detecting antibodies.
Известен способ получения кроличьей сыворотки, содержащей антитела к токсин-корегулируемым пилям адгезии (ТКПА) холерных вибрионов O1 серогруппы [1], заключающийся в дифференциации культур V. cholerae по наличию или отсутствию синтеза ТКПА методом иммунодот- и иммуноблот-анализа, при этом для работы сыворотку необходимо адсорбировать двукратно живыми и двукратно убитыми бактериями, не содержащими TCP. Однако сыворотка была протестирована только на штаммах холерного вибриона классического биовара. На штамме Е. coli обнаружены следы присутствия белков, реагирующих с этими сыворотками.There is a method of producing rabbit serum containing antibodies to toxin-corrected adhesion adhesion pills (TAPA) of serogroup O1 cholera vibrios [1], which consists in differentiating V. cholerae cultures by the presence or absence of TKPA synthesis by immunodot and immunoblot analysis, while for work serum must be adsorbed by doubly living and twice killed bacteria that do not contain TCP. However, the serum was tested only on strains of the cholera vibrio of the classic biovar. Traces of the presence of proteins reacting with these sera were detected on E. coli strain.
Известен тест в формате «сэндвич»-ИФА на нитроцеллюлозной мембране [2], где в качестве реагентов используются кроличьи антитела к мембранному белку OmpW, а также два МКА, направленных к рекомбинантному мембранному белку r-OmpW и холерному токсину r-CtxB. Диагностикум позволяет выявлять не менее 60 пг CtxB/мл-1, 104 КОЕ/мл-1 холерных вибрионов, но не предназначен для обнаружения эпидемически значимых штаммов V. cholerae O1 и O139 с генотипом ctx-tcp+.A known sandwich ELISA test on a nitrocellulose membrane [2], where rabbit antibodies against the OmpW membrane protein, as well as two MCAs directed to the recombinant membrane protein r-OmpW and cholera toxin r-CtxB, are used as reagents. The diagnosticum allows detecting at least 60 pg CtxB / ml -1 , 10 4 CFU / ml -1 of cholera vibrios, but is not intended to detect epidemiologically significant strains of V. cholerae O1 and O139 with the ctx genotype - tcp + .
Наиболее близким решением поставленной задачи является способ получения гибридом-продуцентов, синтезирующих МКА к токсин-корегулируемым пилям адгезии [3], в данном исследовании охарактеризовано два МКА - они взаимодействуют с антигеном 24 кДа, продуктом гена tcp El Tor, причем одно из МКА селективно взаимодействует с большой субъединицей пилей (ТерА) вибрионов El Tor и O139, в то время как второе МКА перекрестно реагирует с субъединицей ТсрА классических вибрионов.The closest solution to this problem is a method for producing hybridomas-producers synthesizing MCAs to toxin-regulated adhesion saws [3], two MCAs were characterized in this study — they interact with the 24 kDa antigen, a product of the tcp El Tor gene, and one of the MCAs selectively interacts with a large sub-subunit of pyli (TerA) of the El Tor and O139 vibrios, while the second MCA cross-reacts with the TspA subunit of classical vibrios.
Данный способ предусматривает необходимость получения и очистки рекомбинантной субьединицы ТсрА для проведения иммунизации мышей BALB/c. Специфические МКА не рассматриваются в качестве диагностических реагентов, которые могли быть использованы для анализа широкого набора штаммов холерных вибрионов.This method requires the preparation and purification of a recombinant TcAA subunit to immunize BALB / c mice. Specific MCAs are not considered as diagnostic reagents that could be used to analyze a wide range of cholera vibrio strains.
Технической задачей предлагаемого изобретения является изыскание штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующего диагностически значимые моноклональные антитела к эпитопам мембранного белка холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп.The technical task of the invention is to find a strain of hybrid cultured animal cells of animals Mus musculus L., producing diagnostically significant monoclonal antibodies to epitopes of the membrane protein of cholera vibrios O1 and O139 serogroups.
Поставленная задача достигается получением штамма культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L. ГХ-H2F6/Omp - продуцент моноклональных антител, специфичных к мембранному белку холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, депонированный под номером Н-61 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».The problem is achieved by obtaining a strain of cultured hybrid animal cells Mus. musculus L. GC-H2F6 / Omp is a producer of monoclonal antibodies specific for the membrane protein of cholera vibrios O1 and O139 of serogroups, deposited under the number H-61 in the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures "GKPM-Obolensk".
Способ получения штамма включает несколько этапов.A method of obtaining a strain includes several stages.
I - получение иммунных спленоцитов. Мышей линии BALB/c, иммунизируют взвесью цельных клеток штамма Vibrio cholerae El Tor 13020 (из коллекции Музея живых культур Ростовского-на-дону противочумного института), убитых нагреванием (100°C, 15 мин, проверка на специфическую стерильность). Иммунизацию мышей проводят трехкратно с интервалом 2 недели, вводят внутрибрюшинно 0,2 мл инактивированной взвеси холерных вибрионов (109 кл/мл) в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ, Calbiochem) 1:1, затем с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ, Calbiochem) 1:1, для бустерной иньекции вводят микробную взвесь с физиологическим раствором 1:1. В стерильных условиях извлекают селезенку мышей через 3 дня после заключительной инъекции антигена, растирают в гомогенизаторе и готовят суспензию спленоцитов в бессывороточной среде RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen).I - receiving immune splenocytes. BALB / c mice are immunized with a suspension of whole cells of the strain Vibrio cholerae El Tor 13020 (from the collection of the Museum of Living Cultures of the Rostov-on-Don Plague Institute) killed by heat (100 ° C, 15 min, test for specific sterility). Mice are immunized three times with an interval of 2 weeks, 0.2 ml of inactivated suspension of cholera vibrios (10 9 cells / ml) is administered intraperitoneally in a mixture with Freund's complete adjuvant (PAF, Calbiochem) 1: 1, then with Freund's incomplete adjuvant (NAF, Calbiochem ) 1: 1, for a booster injection, a microbial suspension with physiological saline 1: 1 is injected. Under sterile conditions, the spleen of mice was removed 3 days after the final injection of antigen, triturated in a homogenizer and a suspension of splenocytes was prepared in serum-free RPMI-1640 medium (Gibco, Invitrogen).
II - проведение гибридизации. Клетки перевиваемой миеломы Р3-X63/Ag8.653 (получена из Коллекции культур клеток позвоночных ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) гибридизуют с иммунными клетками селезенки в соотношении 5:1 в 50% растворе полиэтиленгликоля (Mr 1500, Fluka) на среде RPMI 1640 в течение 1 мин совместной инкубации. Взвесь клеток центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин, после этого супернатант декантируют, осадок клеток осторожно ресуспендируют в селективной среде состава: RPMI 1640, 20% сыворотки плода коровы (HyClone, Thermo Scientific), 4 mM 1-глютамина (Amimed), компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина, Gibco).II - hybridization. Cells of transplantable myeloma P3-X63 / Ag8.653 (obtained from the Collection of vertebrate cell cultures, Institute of Cytology RAS, St. Petersburg) hybridize with spleen immune cells in a 5: 1 ratio in 50% solution of polyethylene glycol (Mr 1500, Fluka) on RPMI medium 1640 for 1 min of joint incubation. The cell suspension is centrifuged for 10 min at 1000 rpm, after which the supernatant is decanted, the cell pellet is carefully resuspended in a selective medium of the composition:
III - культивирование гибридом. Суспензию слившихся клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета (Cellstar, Greiner bio-one) на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 клеток на лунку, и культивируют при 37°C в СО2-инкубаторе (Nuaire). Видимые колонии гибридных клеток мышей появляются на 7-10 день. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ. После чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов.III - cultivation of hybridomas. A suspension of fused cells in a GAT medium is poured into 0.1 ml into four 96-well flat-bottomed culture plates (Cellstar, Greiner bio-one) on the feeder layer of pre-seeded (per day) peritoneal macrophages of white mice at a dose of 10,000 cells per well, and cultured at 37 ° C in a CO 2 incubator (Nuaire). Visible colony of mouse hybrid cells appear on day 7-10. The hybridoma is cultivated for 14 days on GAT medium, then 7-10 days on GT medium. Then transferred to the growth medium without selective components.
IV - скрининг гибридом. Культуральные жидкости гибридом периодически отбирают из лунок для тестирования в ИФА.IV - hybridoma screening. Hybridoma culture fluids are periodically sampled from wells for ELISA testing.
V - клонирование. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.V - cloning. The hybridoma is twice cloned by the method of limiting dilutions on a feeder from peritoneal macrophages of white mice. Cloning yields a productive strain of hybrid cultured mouse cells that stably produce MABs of a given specificity.
Штамм ГХ-H2F6/Omp депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора под номером 179 (от 12.12.2016).The strain GC-H2F6 / Omp was deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures ("GKPM-Obolensk") Federal State Budgetary Institution "State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology" Rospotrebnadzor under the number 179 (dated 12.12.2016).
Заявляемый штамм гибридом обладает следующими характеристиками.The inventive strain of hybridomas has the following characteristics.
Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина. В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.Morphological signs. Hybrid cells are large rounded cells with a narrow rim of the basophilic cytoplasm. The nuclei are hyperchromic, irregularly oval, large, with a rough structure of nuclear chromatin. In a significant part of the cells, the cytoplasm has outgrowths.
Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии при 37°C в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 100-150 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800-900 тыс. кл./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, контролируя микроскопически интенсивность роста. Кратность рассева 1:4-1:5. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5%-ного СО2 70-80%-ной влажности. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).Cultural traits are typical of transplanted mouse cells with plasmacytomas. Cells are cultured in the form of a stationary suspension at 37 ° C in a plastic or glass dish at a sowing dose of 100-150 thousand cells / ml for 3-4 days to a saturation density of 800-900 thousand cells / ml. Cells are passaged once every 3-4 days, controlling microscopically the growth rate. Multiplicity of sieving 1: 4-1: 5. Cultivation medium is RPMI-1640 medium supplemented with 15% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin. Cells are cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 70-80% humidity. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies at 10 passages in vitro (observation period).
Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у белых мышей, внутрибрюшинно праймированных пристаном в дозе 0,5 мл/мышь за 14 дней до введения гибридомы, осуществляют путем инокулирования 5-10 млн гибридных клеток на одно животное. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 20-30 дней в объеме 2-5 мл. Культуру клеток поддерживали в течение двух пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения)The cultivation of the strain in the body of experimental animals. The induction of ascites tumors in white mice, intraperitoneally primed with pristan at a dose of 0.5 ml /
Кариологические признаки. Модальное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии P3-X63/Ag 8.653. Кариотип клеток штамма ГХ-H2F6/Omp по видовой принадлежности - мышиный.Karyological signs. The modal number of chromosomes is 87, C-markers of the parent myeloma line P3-X63 / Ag 8.653. The karyotype of cells of the GC-H2F6 / Omp strain is murine by species.
Биотехнологическая характеристика полезного продукта. МКА относятся к изотипу IgG. Методом иммуноблоттинга установлено, что гибридома ГХ-H2F6/Omp продуцирует специфичные моноклональные антитела к термостабильному белковому антигену, общему для tcp+ холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп. Титр специфических иммуноглобулинов в ИФА составляет: в культуральной жидкости (КЖ) 1:800-1:1000, в асцитической жидкости (АЖ) - 1:200000. МКА выявляют эпитоп мембранного белка (м.м. 40 кДа) tcp+ штаммов холерных вибрионов 01 и O139 серогрупп, не давая перекрестных реакций с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов.Biotechnological characteristics of a useful product. MCAs belong to the IgG isotype. Using immunoblotting, it was found that the GC-H2F6 / Omp hybridoma produces specific monoclonal antibodies to the thermostable protein antigen common to tcp + cholera vibrios O1 and O139 serogroups. The titer of specific immunoglobulins in ELISA is: in the culture fluid (CL) 1: 800-1: 1000, in ascitic fluid (AF) - 1: 200000. MCAs reveal the membrane protein epitope (m.m. 40 kDa) of tcp + strains of cholera vibrios 01 and O139 of serogroups, without giving cross-reactions with representatives of closely related and heterologous microorganisms.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмой не выявлено.Contamination. Bacteria and fungi are not detected in cell culture. Mycoplasma infection was not detected.
Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90% и криопротектора диметилсульфоксида - 10%.Cryopreservation. The freezing medium contains fetal calf serum - 90% and cryoprotectant dimethyl sulfoxide - 10%.
Режим криоконсервации и отогрева: гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°C и затем опускают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°C. Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1⋅106. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.Cryopreservation and heating mode: hybrid cells are introduced into cryovials, placed in a foam container and left for 16-24 hours in a kelvinator at a temperature of -70 ° C and then immersed in liquid nitrogen. Defrosting is carried out quickly in a water bath at a temperature of 37 ° C. Ampoules contain 1.0 ml of cryoprotective medium with a concentration of hybrid cells of 1 × 10 6 . The viability of restored hybridomas after cryopreservation is 75-85%.
Исследование специфичности МКА. Моноклональные антитела из КЖ выделяют преципитацией сульфатом аммония [4]. Для определения специфичности МКА, продуцируемых гибридомой, используют набор штаммов холерных вибрионов 01 и O139 серогрупп, (из коллекцииМузея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института) представителей рода Aeromonas, Salmonella spp., штаммы V. cholerae не O1/не O139, Е. coli. В качестве антигенных препаратов в исследуемых серологических реакциях используют убитые кипячением бактериальные клетки холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и близкородственных микроорганизмов.The study of the specificity of MCA. Monoclonal antibodies from QOL are isolated by precipitation with ammonium sulfate [4]. To determine the specificity of MCA produced by the hybridoma, a set of serogroup vibrio 01 and O139 cholera strains is used, (from the collection of the Museum of Living Cultures of the Rostov-on-Don Antiplague Institute) representatives of the genus Aeromonas, Salmonella spp., V. cholerae non O1 / non O139, E .coli. As the antigenic preparations in the studied serological reactions, bacterial cells of cholera vibrios O1 and O139 of serogroups and closely related microorganisms killed by boiling are used.
Пример 1. Получение МКА из штамма гибридом ГХ-H2F6/OmpExample 1. Obtaining MCA from a strain of hybrid GC-H2F6 / Omp
Гибридому выращивают in vitro до конечной концентрации 1⋅106-5⋅105 кл./мл среды. Клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость с содержащимися в ней МКА собирают, клетки используют для последующего пассажа in vitro. Бесклеточный супернатант используют в виде МКА для подтверждения специфической активности на штаммах холерных вибрионов, а также для выделения моноклональных антител путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония, которые можно длительно хранить в условиях низкотемпературного холодильника без потери специфической активности. На их основе представляется возможным разработка новых иммуноглобулиновых препаратов и тест-систем для лабораторной диагностики холеры.The hybridoma is grown in vitro to a final concentration of 1⋅10 6 -5⋅10 5 cells / ml of medium. Cells are pelleted by centrifugation at 1000-1500 rpm for 10 min, the supernatant with the MCA contained in it is collected, the cells are used for subsequent passage in vitro. The cell-free supernatant is used as an MCA to confirm specific activity on cholera vibrio strains, as well as to isolate monoclonal antibodies by precipitation with a saturated solution of ammonium sulfate, which can be stored for a long time in a low-temperature refrigerator without loss of specific activity. Based on them, it seems possible to develop new immunoglobulin preparations and test systems for laboratory diagnosis of cholera.
Пример 2. Подтверждение специфической активности МКА штамма как диагностического реагента в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА)Example 2. Confirmation of the specific activity of the MCA strain as a diagnostic reagent in indirect enzyme-linked immunosorbent assay (TIFA)
МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp специфически взаимодействуют со штаммами V.cholerae El Tor и O139, имеющими ген tcp, что подтверждается при проведении непрямого ИФА. Постановку реакции осуществляют следующим образом: в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа (Greiner bio-one) вносят по 108 микробных клеток V. cholerae O1 13020, убитых кипячением, в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9.0, и выдерживают при температуре 37С° в течение 2 часов или при +4°C в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки супернатант культуральной жидкости гибридомы ГХ-H2F6/Omp (полученный как в примере 1) в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°C в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к IgG белой мыши (BioRad) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°C в течение 40 минут, затем 2 раза отмывают лунки раствором ФСБ-Т и один раз дистиллированной водой. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора на основе тетраметилбензидина (Applichem). Положительную реакцию оценивают по появлению сине-голубого окрашивания. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл 1 М серной кислоты. Учет результатов проводят на спектрофотометре (BioTek, США) для ИФА при длине волны 450 нм (референс-волна 630 нм). Результаты реакции представлены в таблице 1.MCA hybridomas GC-H2F6 / Omp specifically interact with V. cholerae El Tor and O139 strains having the tcp gene, which is confirmed by indirect ELISA. The reaction is carried out as follows: 10 8 microbial cells of V. cholerae O1 13020, killed by boiling, are introduced into wells of a 96-well polystyrene plate for immunoassay (Greiner bio-one) in carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.0, and maintained at 37 ° C. ° for 2 hours or at + 4 ° C for 18 hours. Three times washed with phosphate-buffered saline pH 7.4, containing 0.5% tween-20 (FSB-T). Then, the supernatant of the culture fluid of the GC-H2F6 / Omp hybridoma (obtained as in Example 1) is added to the wells in a volume of 100 μl and incubated at 37 ° C for 1 hour. After this, the wells of the plate are washed three times with a solution of FSB-T and the peroxidase conjugate to white mouse IgG (BioRad) is added to the wells in working dilution. The plate is incubated at 37 ° C for 40 minutes, then the wells are washed 2 times with FSB-T solution and once with distilled water. After that, 100 μl of a tetramethylbenzidine-based indicator solution solution (Applichem) was added to the wells. A positive reaction is assessed by the appearance of blue-blue staining. The reaction is stopped by adding 100 μl of 1 M sulfuric acid to the wells. The results are taken into account on a spectrophotometer (BioTek, USA) for ELISA at a wavelength of 450 nm (reference wave 630 nm). The reaction results are presented in table 1.
Из данных таблицы 1 видно, МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp положительно взаимодействуют со всеми культурами V.cholerae El Tor и O139, имеющими ген tcp+, и не взаимодействуют со штаммами холерных вибрионов 01, O139 серогруппы с генотипом tcp-. Специфичность МКА в отношении холерных вибрионов O1, O139 серогрупп подтверждается отрицательной реакцией в ИФА с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов.As can be seen from the data in Table 1, MCA hybridomas GC-H2F6 / Omp interact positively with all V. cholerae El Tor and O139 cultures with the tcp + gene and do not interact with serogroup cholera vibrios 01, O139 strains with the tcp - genotype. The specificity of MCA with respect to cholera vibrios O1, O139 of serogroups is confirmed by a negative reaction in ELISA with representatives of closely related and heterologous microorganisms.
Пример 3. Определение эпитопной направленности МКА гибридомы ГХ-H2F6/Omp методом иммуноблоттингаExample 3. Determination of the epitope orientation of MCA hybridomas GC-H2F6 / Omp by immunoblotting
Определение эпитопной направленности МКА, продуцируемых штаммом, проводят с использованием в качестве антигена взвесей клеток холерных вибрионов, обеззараженных кипячением. Электрофорез образцов по Laemmli U.K. [5] в пластинах 12,5% полиакриламидного геля размером 70×100×0,7 мм проводят в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) при постоянном напряжении на приборе Mini-Protean Tetra System («Bio-Rad Laboratories, inc.» (США). Полусухой перенос образцов из геля на нитроцеллулозную мембрану (НЦМ) с диаметром пор 0,45 μм осуществляют на приборе Trans-Blot Turbo Transfer System («Bio-Rad Laboratories, inc.», США) с использованием буфера для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин и 20% этанол, рН 8,3), после чего мембраны высушивают. Постановку иммуноблоттинга проводят, как описано Н. Towbin et al. [6]. Свободные сайты НЦМ блокируют 1% раствором БСА (Albumin bovine, Amresco) при 37°C в течение 30 мин. После 3-кратной отмывки ФСБ - Т НЦМ инкубируют 1 час с препаратом МКА в рабочем разведении при комнатной температуре на ротационном встряхивателе. Затем мембрану отмывают и проявляют конъюгатом кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (Invitrogen) - инкубация 40 минут при комн. температуре на ротационном встряхивателе. НЦМ 3-кратно отмывают в ФСБ-Т, затем помещают в хромогенную смесь на основе 3,3-диаминобензидин-4-гидрохлорида (ДАБ) («Serva»). После проявления специфических полос на мембране реакцию останавливают промыванием блота в дистиллированной воде. При проведении электрофореза используют белковые маркеры молекулярных весов от 10 до 250 кДа (BioRad). На фото 1 представлены результаты иммуноблоттинга: 1 - маркеры молекулярных весов (кДа), 2 - V. cholerae El Tor 13020 (ctx+ tcp+), 3 - V. cholerae El Tor 19091 (ctx- tcp-), 4 - V. cholerae O139 16077 (ctx+ tcp+). Вывод: на блотограмме видно, что МКА ГХ-H2F6/Omp выявляют у tcp+ штаммамов V. cholerae O1 и O139 специфический эпитоп в виде интенсивной полосы, локализованной на уровне маркерных белков 38-42 кДа, что соответствует, по данным литературы, белкам наружных мембран OmpT и OmpU (мол. масса 40 и 38 кДа). При этом, у штамма V. cholerae O139 16077 tcp+ выявляются несколько дополнительных полос в диапазоне 20-37 кДа. Специфический для МКА ГХ-H2F6/Omp эпитоп не обнаруживается у штамма V. cholerae El Tor 19091 с генотипом tcp-.The determination of the epitope orientation of MCA produced by the strain is carried out using suspensions of cholera vibrios disinfected by boiling as antigen. Electrophoresis of samples according to Laemmli UK [5] in 12.5% polyacrylamide gel plates 70 × 100 × 0.7 mm in size is carried out under denaturing conditions (SDS-PAGE) at constant voltage using a Mini-Protean Tetra System instrument (Bio-Rad Laboratories , inc. ”(USA). Semi-dry transfer of samples from gel to a nitrocellulose membrane (NCM) with a pore diameter of 0.45 μm was carried out on a Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad Laboratories, inc., USA) using transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine and 20% ethanol, pH 8.3), after which the membranes are dried and immunoblotting is carried out as described by N. Towbin et al. [6]. The SCM sites are blocked with a 1% BSA solution (Albumin bovine, Amresco) at 37 ° C for 30 minutes After 3-time washing of the FSB - T, the SCM is incubated for 1 hour with the MCA preparation in working dilution at room temperature on a rotary shaker. washed and developed with a conjugate of rabbit anti-mouse immunoglobulins with horseradish peroxidase (Invitrogen) - incubation for 40 minutes at room. temperature on the rotary shaker.
Пример 4. Определение специфической активности МКА ГХ-H2F6/Omp в отношении tcp+ штаммов V. cholerae O1 и O139 методом дот-ИФАExample 4. Determination of the specific activity of MCA GC-H2F6 / Omp against tcp + strains of V. cholerae O1 and O139 by dot-ELISA
Постановку реакции осуществляют в несколько этапов: первоначально на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) с диаметром пор 0,2 мкм («Schleicher&Schuelle») наносят обеззараженные кипячением и приготовленные на карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,5) взвеси исследуемых культур (109 м.кл./мл) в объеме 4 мкл на точку. Все манипуляции с мембранами проводят с помощью анатомического пинцета, не касаясь ее руками. Затем высушивают мембрану на воздухе при комнатной температуре с последующей отмывкой НЦМ от несвязавшегося антигена в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ - Т) трехкратно. Следующим этапом блокируют свободные сайты 1%-ным раствором БСА (Albumin bovine, Amresco) в течение 30 мин на ротационном встряхивателе. После этого инкубируют НЦМ в растворе антител в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе, отмывают мембрану трехкратно ФСБ - Т. Инкубируют НЦМ в растворе антимышиного пероксидазного конъюгата в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном встряхивателе, отмывают ФСБ-Т трехкратно. Далее, погружают мембрану в активированный раствор хромогенной смеси на основе 3,3-диаминобензидин 4-гидрохлорида (ДАБ) («Serva») до момента проявления специфических точек-дотов. Останавливают реакцию промыванием мембраны в дистиллированной воде. Визуальный учет реакции: за положительный результат принимают четко окрашенные коричневые пятна (см. фото 2). На фото 2 изображена специфическая активность МКА штамма TX-H2F6/Omp в дот-ИФА: 1-5 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx+ tcp+, 6-10 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx- tcp+, 11-17 - штаммы Vibrio cholerae El Tor ctx- tcp-, 18-22 - Vibrio cholerae O139 ctx+ tcp+, 23-26 - Vibrio cholerae O139 ctx- tcp-, 27 - Vibrio cholerae O22, 28 - Salmonella spp., 29 - E. coll Результаты дот-ИФА позволяют наглядно увидеть, что МКА штамма ГХ-H2F6/Omp только с культурами V.cholerae O1 и O139 tcp+ образуют на НЦМ интенсивно окрашенные пятна. Положительная реакция не регистрируется с холерными вибрионами, не содержащими гена tcp.The reaction is carried out in several stages: initially, nitrocellulose membrane (SCM) with a pore diameter of 0.2 μm (Schleicher & Schuelle) is applied by disinfection by boiling and prepared on carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5) suspension of the studied cultures (10 9 m cells / ml) in a volume of 4 μl per point. All manipulations with the membranes are carried out using anatomical tweezers, without touching it with your hands. Then the membrane is dried in air at room temperature, followed by washing the SCM from the unbound antigen in phosphate-buffered saline with tween (PBS-T) three times. The next step is to block free sites with a 1% solution of BSA (Albumin bovine, Amresco) for 30 minutes on a rotary shaker. After this, the SCM in the antibody solution is incubated for 1 hour at room temperature on a rotary shaker, the membrane is washed three times with FSB-T. The SCM is incubated in the solution of anti-mouse peroxidase conjugate for 1 hour at room temperature on the rotary shaker, the FSB-T is washed three times. Next, immerse the membrane in an activated solution of a chromogenic mixture based on 3,3-diaminobenzidine 4-hydrochloride (DAB) ("Serva") until the manifestation of specific dots. Stop the reaction by washing the membrane in distilled water. Visual recording of the reaction: clearly colored brown spots are taken for a positive result (see photo 2).
Пример 5. Получение пероксидазного конъюгата на основе МКА штамма ГХ-H2F6/Omp. Источником МКА служили культуральные жидкости, накопленные при многократном пассировании гибридомы-продуцента ГХ-H2F6/OmpExample 5. Obtaining peroxidase conjugate based on MCA strain GC-H2F6 / Omp. The source of MCA was culture fluids accumulated during repeated passaging of the hybridoma producer GC-H2F6 / Omp
Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [4] с последующим диализом. В осажденных препаратах определяли концентрацию белка по Лоури. Конъюгацию очищенных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена проводили по методу Nakane Р.К. [7] в соотношении 2:1 соответственно. Рабочий титр полученного конъюгата определяют в прямом ТИФА, используя в качестве антигена обеззараженные кипячением клетки V. cholerae El Tor 13020. Полученные таким образом препараты имеют рабочий титр в прямом ТИФА 1:32-1:64, что позволяет оценивать их как высокоактивные в отношении холерных вибрионов.The isolation of the immunoglobulin fraction from the culture fluids was carried out by precipitation with ammonium sulfate [4] followed by dialysis. In the precipitated preparations, the protein concentration was determined according to Lowry. The conjugation of purified immunoglobulins with horseradish peroxidase was carried out according to the method of Nakane R.K. [7] in a ratio of 2: 1, respectively. The working titer of the obtained conjugate is determined in direct TIFA, using V. cholerae El Tor 13020 cells disinfected by boiling as antigen. The preparations thus obtained have a working titer in direct TIFA of 1: 32-1: 64, which makes it possible to evaluate them as highly active against cholera vibrios.
Таким образом, МКА, секретируемые штаммом гибридных культивируемых клеток TX-H2F6/Omp, могут быть применены как диагностические реагенты для идентификации tcp+ холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп человеческого и водного происхождения в иммунологических реакциях: непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА) и дот-иммуноферментный анализ (дот-ИФА).Thus, MCAs secreted by a strain of hybrid cultured TX-H2F6 / Omp cells can be used as diagnostic reagents for identifying tcp + cholera vibrios O1 and O139 of human and water serogroups in immunological reactions: indirect enzyme-linked immunosorbent assay (TIFA) and dot enzyme immunoassay (dot ELISA).
Кроме того, на основе МКА TX-H2F6/Omp могут быть сконструированы пероксидазные конъюгаты, которые позволяют выявлять эпидемически значимые штаммы V.cholerae О1, O139 с генотипом tcp+ в прямых иммуноферментных реакциях, что значительно сокращает общее время анализа и исключает необходимость использования дорогостоящих антивидовых конъюгатов.In addition, peroxidase conjugates can be constructed on the basis of TX-H2F6 / Omp MCA that allow the detection of epidemiologically significant strains of V. cholerae O1, O139 with the tcp + genotype in direct enzyme-linked immunosorbent reactions, which significantly reduces the total analysis time and eliminates the need for expensive antiviral species conjugates.
Штамм может быть использован при создании иммуноферментных диагностических тест-систем для идентификации эпидемически значимых холерных вибрионов в целях лабораторной диагностики в здравоохранении и для проведения научных исследований.The strain can be used to create enzyme-linked immunosorbent diagnostic test systems for the identification of epidemically significant cholera vibrios for laboratory diagnostics in healthcare and for research.
Источники информацииInformation sources
1. Заднова С.П., Топорков А.В., Новикова О.В., Смирнова Н.И. Получение и использование антител к токсин-корегулируемым пилям адгезии. Биотехнология. 2003; 1: 79-84.1. Zadnova S.P., Toporkov A.V., Novikova O.V., Smirnova N.I. Obtaining and using antibodies to toxin-regulated adhesion adhesion saws. Biotechnology. 2003; 1: 79-84.
2. Tuteja U., Kumar S., Shukla J., Kingston J., Batra H.V. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. J. Med. Microbiol. 2007; 56(Pt 10):1340-5.2. Tuteja U., Kumar S., Shukla J., Kingston J., Batra H.V. Simultaneous direct detection of toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae from rectal swabs and environmental samples by sandwich ELISA. J. Med. Microbiol. 2007; 56 (Pt 10): 1340-5.
3. Falero G., Rodriguez B.L., Rodriguez I., Campos J., Ledon Т., Valle E., Silva Y., Marrero K., Suzarte E., Valmaseda Т., Moreno A., Fando R. Production and characterization of monoclonal antibodies to El Tor toxin co-regulated pilus of Vibrio cholerae. Hybrid Hybridomics. 2003; 22(5):315-20.3. Falero G., Rodriguez BL, Rodriguez I., Campos J., Ledon T., Valle E., Silva Y., Marrero K., Suzarte E., Valmaseda T., Moreno A., Fando R. Production and characterization of monoclonal antibodies to El Tor toxin co-regulated pilus of Vibrio cholerae. Hybrid Hybridomics. 2003; 22 (5): 315-20.
4. Кэтти Д., ред. Антитела: Методы. М.: Мир; 1991; кн. 1.4. Ketty D., ed. Antibodies: Methods. M .: World; 1991; Prince one.
5. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227, №5259: 680-685.5. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227, No. 5259: 680-685.
6. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding - Current status and outlook. J. Immunol. Methods. 1984; 72: 313-340.6. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding - Current status and outlook. J. Immunol. Methods 1984; 72: 313-340.
7. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem Cytochem. 1974; 22: 1084-1091.7. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem Cytochem. 1974; 22: 1084-1091.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017127677A RU2663003C1 (en) | 2017-08-01 | 2017-08-01 | Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017127677A RU2663003C1 (en) | 2017-08-01 | 2017-08-01 | Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2663003C1 true RU2663003C1 (en) | 2018-07-31 |
Family
ID=63142438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017127677A RU2663003C1 (en) | 2017-08-01 | 2017-08-01 | Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2663003C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723705C1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-06-17 | Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства | Recombinant protein for cholera immunization |
| RU2785463C1 (en) * | 2022-04-13 | 2022-12-08 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Strain of cultured animal hybrid cells mus. musculus - producer of monoclonal antibodies to the membrane protein common to typical and atypical serogroup 01 cholera vibrios |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101825577A (en) * | 2010-03-10 | 2010-09-08 | 兰州生物制品研究所 | Method for detecting efficacy of oral Cholera inactivated vaccine and detection kit |
| RU2425875C1 (en) * | 2010-06-07 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF Mus Musculus L ANIMALS - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO LPS OF CHOLERA VIBRIO 0139 SEROGROUP |
-
2017
- 2017-08-01 RU RU2017127677A patent/RU2663003C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101825577A (en) * | 2010-03-10 | 2010-09-08 | 兰州生物制品研究所 | Method for detecting efficacy of oral Cholera inactivated vaccine and detection kit |
| RU2425875C1 (en) * | 2010-06-07 | 2011-08-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF Mus Musculus L ANIMALS - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO LPS OF CHOLERA VIBRIO 0139 SEROGROUP |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ЕВДОКИМОВА В.В. и др. Моноклональные антитела к иммунореактивным антигенам холерных вибрионов El Tor и О139. Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы проблемной комиссии, 2015, 28:164-168. * |
| ЕВДОКИМОВА В.В. и др. Моноклональные антитела к термостабильным поверхностным антигенам холерных вибрионов О1- и О139-серогруппы. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2015, 3: 51-57. * |
| ЕВДОКИМОВА В.В. и др. Моноклональные антитела к термостабильным поверхностным антигенам холерных вибрионов О1- и О139-серогруппы. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2015, 3: 51-57. ЕВДОКИМОВА В.В. и др. Моноклональные антитела к иммунореактивным антигенам холерных вибрионов El Tor и О139. Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы проблемной комиссии, 2015, 28:164-168. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2723705C1 (en) * | 2019-07-15 | 2020-06-17 | Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства | Recombinant protein for cholera immunization |
| RU2785463C1 (en) * | 2022-04-13 | 2022-12-08 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Strain of cultured animal hybrid cells mus. musculus - producer of monoclonal antibodies to the membrane protein common to typical and atypical serogroup 01 cholera vibrios |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smith et al. | Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen | |
| Guthmiller et al. | An efficient method to generate monoclonal antibodies from human B cells | |
| EP1928999B1 (en) | Methods of producing stable b-lymphocytes | |
| CN105467136A (en) | Interleukin-1 alpha ABS and methods of use | |
| CA2652086A1 (en) | A general method for generating human antibody responses in vitro | |
| NO319013B1 (en) | Vaccine comprising type I surface antigens from Staphylococcus epidermidis, as well as hyperimmune globulins and antibody directed against the type I surface antigen. | |
| RU2663003C1 (en) | Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups | |
| Nair et al. | A mouse model of sublethal leptospirosis: protocols for infection with leptospira through natural transmission routes, for monitoring clinical and molecular scores of disease, and for evaluation of the host immune response | |
| Kim et al. | Immunization, hybridoma generation, and selection for monoclonal antibody production | |
| Hope et al. | Development of detection methods for ruminant interleukin (IL)-4 | |
| Sadreddini et al. | Evaluation of EBV transformation of human memory B-cells isolated by FACS and MACS techniques | |
| RU2785463C1 (en) | Strain of cultured animal hybrid cells mus. musculus - producer of monoclonal antibodies to the membrane protein common to typical and atypical serogroup 01 cholera vibrios | |
| JPS63500593A (en) | Monoclonal antibodies and their uses | |
| RU2535982C1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells mus musculus l cchfv vd-1-producer of monoclonal antibody 4g4/b6 to virus of crimean-congo hemorrhagic fever (cchf) | |
| RU2783897C1 (en) | Homo sapiens/mus musculus 1b9c7 hybrid cultured cell strain: producer of human monoclonal antibodies specific to the proteolytic domain of botulinum type a toxin | |
| RU2611359C1 (en) | Method and set for determination of cholera toxin production and differentiation of epidemiologically significant strains of cholera vibrios of classical and el tor biovars | |
| RU2528868C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL MUS MUSCULUS L CCHFV Vd-2-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 1E2/E5 TO VIRUS OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER | |
| RU2265051C1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l, pkkk(p) 679d - producer of monoclonal antibody with specificity to protein-polysaccharide antigen from yersinia enterocolitica o3 and o9 serovars | |
| RU2528869C1 (en) | STRAIN OF CULTIVATED HYBRID CELLS OF ANIMAL MUS MUSCULUS L CCHFV Vd-3-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODY 3H6/F2 TO VIRUS OF CRIMEAN-CONGO HAEMORRHAGIC FEVER | |
| RU2478703C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 5G6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN | |
| RU2451078C1 (en) | Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis | |
| RU2566553C1 (en) | STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B | |
| SU1541254A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells used for producing monoclonal antibodies to thermally stable o-antigen of cholera germ | |
| RU2425875C1 (en) | CULTIVATED HYBRID CELL STRAIN OF Mus Musculus L ANIMALS - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO LPS OF CHOLERA VIBRIO 0139 SEROGROUP | |
| ES2349204B1 (en) | A SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST ANTIGEN H: 1.2 OF SERMONELLA ENTERICA SERPHYPE TYPHIMURIUM THAT PRESENTS REACTIVITY CROSSED WITH SERMONELLA ENTERICA SALMONELLA 4,5,12: I: -, PRODUCTION CELL LINE, AND ITS USE. |