RU2650694C1 - Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization - Google Patents
Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization Download PDFInfo
- Publication number
- RU2650694C1 RU2650694C1 RU2017104903A RU2017104903A RU2650694C1 RU 2650694 C1 RU2650694 C1 RU 2650694C1 RU 2017104903 A RU2017104903 A RU 2017104903A RU 2017104903 A RU2017104903 A RU 2017104903A RU 2650694 C1 RU2650694 C1 RU 2650694C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allografts
- pdms
- substrates
- temperature
- volume
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 54
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000005855 radiation Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000012545 processing Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title abstract 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims abstract description 79
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 68
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims abstract description 5
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 claims description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002826 coolant Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 abstract description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 abstract 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 abstract 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 70
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 66
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 7
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 7
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 6
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- ZWGNFOFTMJGWBF-VZSHSMSCSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid;2-oxopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1.C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZWGNFOFTMJGWBF-VZSHSMSCSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000012414 sterilization procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 2
- 238000009461 vacuum packaging Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000006910 ice nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 description 1
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 210000002321 radial artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003537 radioprotector Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области криобиологии и может быть использовано на лабораторных животных в научных учреждениях.The invention relates to the field of cryobiology and can be used on laboratory animals in scientific institutions.
Данный способ направлен на создание и практическое внедрение протокола безопасной и эффективной криоконсервации сосудистых трансплантатов (аллотрансплантатов), в котором не используются токсичные криопротекторные или витрифицирующие растворы, а также программные методы заморозки, жидкий азот и т.д.; кроме того, предлагаемый нами способ направлен на нивелирование потенциальных рисков, связанных с забором трупного биоматериала и подготовкой его к радиационной стерилизации. В частности, общеизвестно, что радиационная стерилизация донорского биоматериала трупного происхождения в замороженном состоянии позволяет предотвратить структурные повреждения ткани, вызванные экспозицией гамма-облучением в дозе 25 кГр или выше. Под модификацией сосудистых аллотрансплантатов in vitro в данном способе понимается их децеллюляризация - процесс удаления клеточных элементов потенциального трансплантата, выступающих в качестве основных антигенных детерминант.This method is aimed at creating and implementing a protocol for the safe and effective cryopreservation of vascular grafts (allografts), in which toxic cryoprotective or vitrifying solutions are not used, as well as programmed freezing methods, liquid nitrogen, etc .; in addition, our proposed method is aimed at leveling the potential risks associated with the collection of cadaveric biomaterial and preparing it for radiation sterilization. In particular, it is well known that radiation sterilization of donor biomaterial of cadaveric origin in the frozen state prevents structural damage to the tissue caused by exposure to gamma radiation at a dose of 25 kGy or higher. In vitro modification of vascular allografts in this method refers to their decellularization - the process of removing the cellular elements of a potential transplant, which act as the main antigenic determinants.
Актуальность предлагаемого способа связана со все более нарастающей потребностью в качественном и безопасном донорском сосудистом материале, а также в резком увеличении количества трансплантаций как во всем мире, так и в Российской Федерации. Поэтому возможность оперативно и безопасно сохранять (криоконсервировать) и стерилизовать донорские сосудистые трансплантаты, полученные в результате массового забора, будет способствовать улучшению качества оказания медицинских услуг в ближайшей и отдаленной перспективе и позволит снизить финансовые и временные затраты и риски, в частности облегчит и ускорит доступ обслуживающего персонала медицинских центров к донорским сосудам, в т.ч. биоинженерным, для трансплантации без необходимости длительной предварительной подготовки или каких-либо дополнительных манипуляций. Это позволит, как минимум, частично решить проблемы деградации сосудистого доступа для гемодиализа, отсутствия донорского аутологичного сосудистого материала, приемлемого для формирования шунтов, проблемы некротических изменений сосудистых аллотрансплантатов трупного происхождения, связанных с процессами декомпенсации кровообращения и аутолиза тканей и т.д. Отметим, что аутологичные подкожная вена с лучевой артерией и другими сосудами конечностей являются наиболее предпочтительными аллотрансплантатами для создания шунтов, а бедренные артерии маргинального происхождения являются биоматериалом выбора для использования в виде сосудистых аллотрансплантатов. Одной из перспективных альтернатив аутологичному шунтированию является использование децеллюляризованных каркасов кровеносных сосудов; в частности, их преимущество перед синтетическими аналогами состоит в том, что структура нативного сосуда максимально приспособлена к гидродинамическим нагрузкам в условиях физиологического кровотока, а межклеточный матрикс обладает всеми необходимыми свойствами для направленного развития пересаженных клеток, как in vitro, так и in vivo, в сторону формирования сосуда.The relevance of the proposed method is associated with an ever-increasing need for high-quality and safe donor vascular material, as well as a sharp increase in the number of transplants both around the world and in the Russian Federation. Therefore, the ability to quickly and safely save (cryopreserve) and sterilize donor vascular grafts obtained as a result of mass collection will help to improve the quality of medical services in the near and distant future and will reduce financial and time costs and risks, in particular, facilitate and speed up access for the attendant personnel of medical centers to donor vessels, including bioengineering, for transplantation without the need for lengthy preliminary preparation or any additional manipulations. This will allow, at least partially, to solve the problems of vascular access degradation for hemodialysis, the absence of donor autologous vascular material acceptable for the formation of shunts, the problems of necrotic changes in vascular allografts of cadaveric origin, associated with the processes of blood circulation decompensation and tissue autolysis, etc. Note that autologous saphenous vein with a radial artery and other limb vessels are the most preferred allografts for creating shunts, and femoral arteries of marginal origin are the biomaterial of choice for use as vascular allografts. One promising alternative to autologous bypass surgery is the use of decellularized blood vessel frameworks; in particular, their advantage over synthetic analogues is that the structure of the native vessel is maximally adapted to hydrodynamic stresses under physiological blood flow conditions, and the intercellular matrix has all the necessary properties for the directed development of transplanted cells, both in vitro and in vivo, to the side the formation of the vessel.
Что же касается радиационной стерилизации донорских сосудистых трансплантатов, то ее необходимость продиктована главным образом тем, что сосудистые аллотрансплантаты трупного происхождения могут содержать высокорезистентные споровые формы анаэробных и аэробных микроорганизмов, в том числе возбудителей раневой инфекции, сохраняющиеся после физико-химической обработки. Однако большинство современных способов криоконсервации сосудистых трансплантатов имеют ряд ограничений и недостатков, а разработанного безопасного протокола стерилизации применительно к децеллюлялизированным сосудистым аллотрансплантатам в настоящее время не существует.As for the radiation sterilization of donor vascular grafts, its necessity is dictated mainly by the fact that vascular allografts of cadaveric origin can contain highly resistant spore forms of anaerobic and aerobic microorganisms, including pathogens of wound infection that persist after physicochemical treatment. However, most modern methods of cryopreservation of vascular grafts have a number of limitations and disadvantages, and the developed safe sterilization protocol for decellularized vascular allografts does not currently exist.
Так, например, большинство современных способов криоконсервации сосудистых трансплантатов основаны на применении методов контролируемой программной заморозки с длительной многоступенчатой процедурой охлаждения (со средней скоростью 1,5°С/мин.), при этом используют жидкий азот, его пары и устройства для его применения (UA 6417 U, 20050515 RU, и UA 79341 С2, 20070611 RU), а также токсичные криопротекторные смеси с антибиотиками, в частности диметилсульфоксид, глицерол, этиленгликоль, пропиленгликоль и поливинилпирролидон (как компания Cryolife), (BY 14577 С1, 20110630 RU). Отдельно стоит упомянуть способ криоконсервации, осуществляющийся путем сочетания охлаждения до -196°С и гипербарии инертными газами (ксенон, криптон, аргон) при давлении 1,5 атмосфер (RU 2268590 C1, 20060127).For example, most modern methods of cryopreservation of vascular grafts are based on the use of controlled program freezing methods with a long multi-stage cooling procedure (with an average speed of 1.5 ° C / min.), Using liquid nitrogen, its vapor and devices for its use ( UA 6417 U, 20050515 RU, and UA 79341 C2, 20070611 RU), as well as toxic cryoprotective mixtures with antibiotics, in particular dimethyl sulfoxide, glycerol, ethylene glycol, propylene glycol and polyvinylpyrrolidone (as Cryolife), (BY 14577 C1, 20110630 RU). Separately, it is worth mentioning the method of cryopreservation, carried out by combining cooling to -196 ° C and hyperbaric inert gases (xenon, krypton, argon) at a pressure of 1.5 atmospheres (RU 2268590 C1, 20060127).
Недостатками подобных способов являются: отсутствие единого подхода и стандартизации протоколов; использование дорогостоящих программных замораживателей, требующих подготовленного персонала, организации отдельного помещения и подвода жидкого азота; использование токсичных криопротекторных смесей имеющих выраженный цитотоксический эффект, использование которых обуславливает общее ухудшение свойств сосудистых трансплантатов. Рутинно используемый диметилсульфоксид в неполной мере препятствует повреждению клеточных структур в процессе замораживания-отогрева из-за неравномерного распределения. Кроме того, к недостаткам подобных способов криоконсервации можно отнести: высокие температурные градиенты и ими обусловленные градиенты давления во время криоконсервации, неравномерный «фронт кристаллизации»; использование жидкого азота и риски связанные с этим; отсутствие возможности обработки большого объема аллотрансплантатов за единицу времени; зачастую низкая скорость всех процедур; невозможность обработки аллотрансплантатов большой длины, с большим количеством бифуркаций; отсутствие специализированной упаковки и креплений для сосудистых аллотрансплантатов, в том числе для их удобной радиационной стерилизации.The disadvantages of such methods are: the lack of a unified approach and standardization of protocols; the use of expensive software freezers that require trained personnel, the organization of a separate room and the supply of liquid nitrogen; the use of toxic cryoprotective mixtures having a pronounced cytotoxic effect, the use of which causes a general deterioration in the properties of vascular grafts. The routinely used dimethyl sulfoxide does not fully prevent damage to cell structures during freezing-warming due to uneven distribution. In addition, the disadvantages of such methods of cryopreservation include: high temperature gradients and the resulting pressure gradients during cryopreservation, uneven "crystallization front"; the use of liquid nitrogen and the risks associated with this; the inability to process a large volume of allografts per unit time; often low speed of all procedures; the impossibility of processing allografts of large length, with a large number of bifurcations; lack of specialized packaging and fixtures for vascular allografts, including for their convenient radiation sterilization.
Известен также способ, частично совпадающий с предлагаемым нами по принципу криопротекторного действия на сосуды, а именно использование контролируемой ледяной нуклеации, заключающейся в образовании кристаллов льда за пределами биологической ткани (RU 2178865 С2, 20020127 [RU] Способ криоконсервации заготовленной ткани млекопитающих или культивированного эквивалента ткани и устройство для его осуществления). Этот способ основан на использовании т.н. зародышей льда, которые помещаются во внеклеточное пространство, и затем ткань медленно замораживается с скоростью -10°С/мин до температуры -70°С. При этом температуру поддерживают постоянной в течение времени, достаточного для установления физического и биологического равновесия используемого раствора криоконсерванта в указанной ткани.There is also known a method that partially coincides with our proposed principle of cryoprotective action on blood vessels, namely the use of controlled ice nucleation, which consists in the formation of ice crystals outside the biological tissue (RU 2178865 C2, 20020127 [RU] Method of cryopreservation of harvested mammalian tissue or cultured tissue equivalent and device for its implementation). This method is based on the use of so-called ice nuclei that are placed in the extracellular space, and then the tissue is slowly frozen at a rate of -10 ° C / min to a temperature of -70 ° C. In this case, the temperature is kept constant for a time sufficient to establish the physical and biological equilibrium of the cryopreservative solution used in this tissue.
Недостатком данного способа являются: неравномерный «фронт кристаллизации»; сложная обработка большого объема аллотрансплантатов за единицу времени; низкая скорость всех процедур; невозможность обработки аллотрансплантатов большой длины, с большим количеством бифуркаций; отсутствие специализированной упаковки и креплений для аллотрансплантатов, в том числе для их удобной радиационной стерилизации.The disadvantage of this method are: uneven "crystallization front"; complex processing of a large volume of allografts per unit time; low speed of all procedures; the impossibility of processing allografts of large length, with a large number of bifurcations; lack of specialized packaging and fixtures for allografts, including for their convenient radiation sterilization.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ консервирования биологических органов в специальной камере под давлением и с дистиллированной водой. Способ заключается в том, что биологический объект помещают в объем дистиллированной воды и охлаждают до температуры -22°С в течение 1,5 часов под давлением до 2200 атм (0,224 ГПа). Это обеспечивает последовательный переход воды из одного фазового состояния в другое и дальнейшую стабилизацию многофазной системы и мешает образованию экстра- и интрацеллюлярных кристаллов льда, являющихся основным деструктивным фактором при криоконсервировании, и не предполагает применение криопротекторов, оказывающих цитотоксическое воздействие на трансплантат (RU 2362299 С1, МПК A01N 1/02 (2006.01). Способ консервирования биологических органов).The closest in technical essence to the proposed method is a method of preserving biological organs in a special chamber under pressure and with distilled water. The method consists in the fact that the biological object is placed in a volume of distilled water and cooled to a temperature of -22 ° C for 1.5 hours under pressure up to 2200 atm (0.224 GPa). This ensures a sequential transition of water from one phase state to another and further stabilization of the multiphase system and prevents the formation of extra- and intracellular ice crystals, which are the main destructive factor in cryopreservation, and does not involve the use of cryoprotectants that have a cytotoxic effect on the graft (RU 2362299 C1,
Недостатками данного способа являются: отсутствие данных по клиническим испытаниям; необходимость в использовании сложного оборудования; невысокая скорость процесса; ориентированность под паренхиматозные органы; сравнительно невысокая надежность и продолжительность консервации, что можно объяснить недостаточно сниженным клеточным метаболизмом из-за применения температур выше -22°С. Кроме того, для корректного осуществления данного способа требуются точные диаграммы фазовых переходов воды с указанием всех точек перехода и значений основных параметров - температуры и давления, т.е. требуются эмпирические данные, варьирующиеся и зависящие в той или иной степени от дизайна конкретного эксперимента.The disadvantages of this method are: lack of data on clinical trials; the need to use sophisticated equipment; low speed of the process; focus on parenchymal organs; Relatively low reliability and duration of preservation, which can be explained by insufficiently reduced cellular metabolism due to the use of temperatures above -22 ° C. In addition, for the correct implementation of this method, exact diagrams of phase transitions of water are required, indicating all transition points and the values of the main parameters - temperature and pressure, i.e. empirical data are required that vary and depend to one degree or another on the design of a particular experiment.
Техническим результатом предлагаемого нами способа является эффективная и безопасная криоконсервация сосудистых трансплантатов человеческого или животного происхождения, значительно оптимизирующая их дальнейший процессинг - радиационную стерилизацию в замороженном состоянии и последующую децеллюляризацию, при этом не используются токсичные криопротекторные вещества и программные методы заморозки. Способ позволяет оптимизировать временные затраты и позволяет обрабатывать более 10-ти донорских сосудистых аллотрансплантатов (в виде артерий и вен с широким диапазоном внутренних диаметров), в частности, за счет использования схемы фиксации оригинальной конструкции.The technical result of our proposed method is an effective and safe cryopreservation of vascular grafts of human or animal origin, significantly optimizing their further processing - radiation sterilization in the frozen state and subsequent decellularization, without using toxic cryoprotective substances and program freezing methods. The method allows to optimize the time costs and allows you to process more than 10 donor vascular allografts (in the form of arteries and veins with a wide range of internal diameters), in particular, by using the fixation scheme of the original design.
Указанный технический результат достигается тем, что способ основан на использовании одного и того же вещества - полидиметилсилоксана (далее по тексту - ПДМС) в качестве перспективного хладоносителя для замораживания аллотрансплантатов путем погружения в объем ПДМС температурой -80°С со скоростью охлаждения -10°С/сек, в качестве теплоносителя для размораживания аллотрансплантатов в объеме ПДМС температуры +25°С и в качестве нетоксичного криопротектора для защиты от холодового цитолиза и во избежание образования экстрацеллюлярных кристаллов льда; также способ включает в себя схему фиксации сосудистых аллотрансплантатов оригинальной конструкции, в которой используют стерильные одноразовые полые подложки из медицинского пластика или многоразовые подложки из силикона, диаметр которых подбирается исходя из диаметра сосудистого аллотрансплантата, но обязан быть на 15% меньше его внутреннего диаметра; способ включает в себя два варианта упаковки для обработки множества сосудистых аллотрансплантатов от одного донора (для 3-х и 10-ти сосудов) и вариант индивидуальной упаковки для сосудов от разных доноров на подложках; индивидуальная упаковка состоит из специально подготовленной стерильной пробирки (50 мл) с отверстием на дне и с портом в крышке и двух заслонках на концах подложки; упаковка для обработки множества (до 3-х) сосудистых аллотрансплантатов от одного донора в вертикальном расположении состоит из: 1) промежуточного пластикового контейнера (объемом в 50 мл), при этом контейнер имеет крышку с вмонтированным портом для вакуумизации, а на дне контейнера на одинаковом расстоянии друг от друга сделаны три порта для подложек; 2) прозрачной емкости из полиакрила объемом в 1 л в которую и устанавливается промежуточный резервуар с подложками. Для этого варианта упаковки возможно использование любого материала подложек. Элементы упаковки можно сделать самому из доступных материалов, а именно пластиковой емкости для вакуумной фильтрации объемом в 1 литр и пластиковой банки на 50 мл. Для этого все необходимые порты можно высверлить под диаметр закрепляемых подложек, на их концы рекомендуется закреплять крышки, чтобы сосуды не спадали. Если порт для вакуумизации сделать затруднительно, то можно использовать внешний самозапаивающийся пакет для вакуумизации всей упаковки. Упаковка для обработки множества (до 10-ти) сосудистых аллотрансплантатов от одного донора в горизонтальном расположении состоит из двух держателей со специально подготовленными сквозными каналами для подложек и прозрачными крышками для надевания на эти держатели. Использование для данной упаковки пластиковых подложек связано с тем, что они легко и безопасно устанавливаются в держатель и не спадают.The specified technical result is achieved by the fact that the method is based on the use of the same substance - polydimethylsiloxane (hereinafter referred to as PDMS) as a promising refrigerant for freezing allografts by immersion in the volume of PDMS with a temperature of -80 ° C with a cooling rate of -10 ° C / sec, as a coolant for thawing allografts in a volume of PDMS of temperature + 25 ° С and as a non-toxic cryoprotectant for protection against cold cytolysis and to avoid the formation of extracellular crista ice cubs; the method also includes a vascular allograft fixation scheme of the original design, in which sterile disposable hollow medical plastic substrates or silicone reusable substrates are used, the diameter of which is selected based on the diameter of the vascular allograft, but must be 15% less than its internal diameter; the method includes two packaging options for processing multiple vascular allografts from one donor (for 3 and 10 vessels) and an individual packaging option for vessels from different donors on substrates; individual packaging consists of a specially prepared sterile tube (50 ml) with an opening at the bottom and with a port in the lid and two shutters at the ends of the substrate; a package for processing a plurality of (up to 3) vascular allografts from one donor in a vertical arrangement consists of: 1) an intermediate plastic container (50 ml in volume), while the container has a lid with a built-in port for evacuation, and the same at the bottom of the container three ports for substrates are made from each other; 2) a transparent container of polyacryl with a volume of 1 liter into which an intermediate tank with substrates is installed. For this packaging option, any substrate material may be used. You can make packing elements yourself from the available materials, namely a plastic container for vacuum filtration with a volume of 1 liter and a plastic can of 50 ml. To do this, all the necessary ports can be drilled to the diameter of the fixed substrates, it is recommended to fix the caps on their ends so that the vessels do not fall off. If it is difficult to make a port for evacuation, then an external self-sealing bag can be used to evacuate the entire package. A package for processing multiple (up to 10) vascular allografts from a single donor in a horizontal arrangement consists of two holders with specially prepared through channels for substrates and transparent covers for putting on these holders. The use of plastic substrates for this packaging is due to the fact that they are easily and safely installed in the holder and do not fall off.
Описание способаMethod description
Важно отметить, что используемый в способе полидиметилсилоксан разрешен для использования в области медицины и фармакологии, так ПДМС разной вязкости и модификаций широко используется в медицинской практике, в ряде лекарственных препаратов (''Энтеросгель'', ''Эспумизан'', ''Дисфлатил'', ''Демитикон'', ''Adatosil-5000'' и др.). Основные аргументы в пользу применения ПДМС основаны на его сильной гидрофобности, химической инертности, биосовместимости и способности оставаться в жидком состоянии при сверхнизких температурах (до -100°С для ПДМС-1 при температуре стеклования: -128°С). Помимо этого, его отличает газопроницаемость, высокое сопротивление сдвигу и разрыву, устойчивость к радиационной стерилизации в дозах до 30 кГр. Несмотря на то что ПДМС используется для охлаждения и для нагрева сосудистых аллотрансплантатов, тем не менее, в данном способе для этих целей применяют фракции ПДМС разной вязкости - 25 сантистокс для размораживания и 1 сантистокс для заморозки. Это связано с тем, что более вязкая модификация ПДМС может быть подвергнута различным методам стерилизации, в частности, паровой и ультрафиолетовой, тогда как менее вязкий ПДМС позволяет быстрее и равномернее охлаждать сосудистый аллотрансплантат.It is important to note that the polydimethylsiloxane used in the method is approved for use in medicine and pharmacology, since PDMS of various viscosities and modifications is widely used in medical practice and in a number of drugs (Enterosgel, Espumisan, Disflatil ',' 'Demiticon' ',' 'Adatosil-5000' ', etc.). The main arguments in favor of the use of PDMS are based on its strong hydrophobicity, chemical inertness, biocompatibility and the ability to remain in a liquid state at extremely low temperatures (up to -100 ° С for PDMS-1 at a glass transition temperature: -128 ° С). In addition, it is distinguished by gas permeability, high shear and tear resistance, resistance to radiation sterilization in doses up to 30 kGy. Despite the fact that PDMS is used for cooling and for heating vascular allografts, nevertheless, PDMS fractions of different viscosity are used for this purpose - 25 centistokes for defrosting and 1 centistox for freezing. This is due to the fact that a more viscous modification of PDMS can be subjected to various sterilization methods, in particular, steam and ultraviolet, while a less viscous PDMS allows faster and more uniform cooling of a vascular allograft.
1) Забор трупного материала. Для удобства дальнейшей обработки изымаются бедренные артерии с умеренными признаками аутолиза у двух трупных доноров средней возрастной группы в течение 5 часов (до 12 часов) после фиксации летального исхода. После забора проводится морфометрия сосудов и предварительно оценивается на месте их внутренний и внешний диаметр, эластичность, а также наличие атеросклеротических повреждений. Сосуды после морфометрии сортируются по длине и диаметру, а также, при возможности, производится оценка уровня их инициальной контаминации, что позволяет более точно настроить стерилизующую дозу. После этого сосуды помещаются в стерильные контейнеры объемом 100 мл, содержащие раствор Кустодиола (Dr. F. Koehler Chemie GmbH, Германия), охлажденный до температуры 4°С. Описываемый в патенте способ позволяет производить забор сосудов любой длины и диаметра. Обычно критериями исключения являются наличие бифуркаций, атеросклеротических и иных повреждений сосудистой стенки, бляшек и кальцинации на более чем 40% внутренней площади сосуда. Все основные работы с материалом проводятся в течение суток.1) Fence of cadaveric material. For convenience of further processing, femoral arteries with moderate signs of autolysis are removed from two cadaveric donors of the middle age group within 5 hours (up to 12 hours) after fixing the lethal outcome. After sampling, vascular morphometry is performed and their internal and external diameter, elasticity, as well as the presence of atherosclerotic lesions are preliminarily evaluated on site. Vessels after morphometry are sorted by length and diameter, and, if possible, the level of their initial contamination is assessed, which allows more precise adjustment of the sterilizing dose. After that, the vessels are placed in sterile 100 ml containers containing Custodiol solution (Dr. F. Koehler Chemie GmbH, Germany), cooled to a temperature of 4 ° C. The method described in the patent allows the collection of vessels of any length and diameter. Typically, exclusion criteria are the presence of bifurcations, atherosclerotic and other injuries of the vascular wall, plaques, and calcifications in more than 40% of the internal area of the vessel. All basic work with the material is carried out during the day.
2) Подготовка и охлаждение объема ПДМС. Перед началом всех процедур стерилизуется необходимый объем ПДМС-25 (вязкостью в 25 сантистокс) и производится фильтрация нового ПДМС-1 (не рекомендуется повторное использование одного и того же объема). Охлаждение ПДМС жидким азотом или его парами не рекомендуется, так как требует постоянного подливания азота в специальную тару, создает ограничения по времени самого процесса, увеличивает риски внештатных ситуаций и перемораживает сам раствор. Поэтому ПДМС предварительно охлаждается в низкотемпературном морозильнике до температуры -80°С (ориентировочное время охлаждения составляет 30 минут, в зависимости от ряда параметров - вязкости, температуры стеклования и т.д.). Количество охлажденного ПДМС зависит от количества сосудистых аллотрансплантатов и типа их упаковки. В случае проведения основных работ в боксе, необорудованным низкотемпературным морозильником, охлажденный объем ПДМС рекомендуется помещать в криоконтейнер на слой сухого льда и транспортировать в лабораторию с контролем за температурой.2) Preparation and cooling of the volume of PDMS. Before starting all procedures, the required volume of PDMS-25 (with a viscosity of 25 centistokes) is sterilized and a new PDMS-1 is filtered (reuse of the same volume is not recommended). The cooling of PDMS with liquid nitrogen or its vapors is not recommended, as it requires constant pouring of nitrogen into a special container, creates time limits for the process itself, increases the risks of emergency situations and freezes the solution itself. Therefore, PDMS is pre-cooled in a low-temperature freezer to a temperature of -80 ° C (the estimated cooling time is 30 minutes, depending on a number of parameters - viscosity, glass transition temperature, etc.). The amount of chilled PDMS depends on the number of vascular allografts and the type of packaging. In the case of basic work in a box that is not equipped with a low-temperature freezer, it is recommended that the cooled PDMS volume be placed in a cryocontainer on a layer of dry ice and transported to a laboratory with temperature control.
3) Крепление аллотрансплантатов в упаковках. Упакованные сосуды транспортируются в лабораторию и достаются из пробирок, предварительно обработанных спиртом в условиях ламинарного потока. Затем для каждого сосуда подбирается стерильная полая подложка из пластика или силикона (в зависимости от дальнейшей упаковки, допускается также использование медных или алюминиевых подложек, кроме того, подложки могут быть изготовлены из гидрогеля, застывающего при околонулевой температуре) с длиной, равной длине сосудистого аллотрансплантата, но с диаметром на 15% меньше внутреннего диаметра сосуда, т.н. «свободная» подложка. На каждой подложке фиксируется ярлык с информацией о сосуде, времени забора и доноре.3) Attachment of allografts in packages. Packed vessels are transported to the laboratory and taken from tubes pretreated with alcohol under laminar flow conditions. Then, for each vessel, a sterile hollow substrate made of plastic or silicone is selected (depending on the further packaging, the use of copper or aluminum substrates is also possible, in addition, the substrates can be made of hydrogel, solidifying at near zero temperature) with a length equal to the length of the vascular allograft, but with a diameter of 15% less than the inner diameter of the vessel, the so-called "Free" substrate. On each substrate, a label with information about the vessel, the time of sampling and the donor is fixed.
Примечание. Такая «свободная» подложка создает поддерживающий каркас во время заморозки без излишнего напряжения для коллагеновых волокон, не дает аллотрансплантатам спадаться и замерзать в неестественном виде. Во время разморозки «свободная» подложка позволяет снимать аллотрансплантаты уже на первой минуте и мануально промывать со стороны просвета, что сильно ускоряет скорость и равномерность разморозки. Необходимость наличия полости в структуре подложки обусловлена тем, что в таком случае повышается скорость охлаждения на 50% и более (в сравнении с цельной подложкой). Помимо этого, силиконовые подложки могут имитироваться с использованием силиконовых перфузионных трубок, а пластиковые - стерильными пипетками. Также несмотря на то что подложки из меди, алюминия и серебра обладают большей теплопроводностью, они имеют большую удельную теплоемкость, что при условии одинаковых параметров конвективного теплообмена нивелирует их преимущества.Note. Such a “free” substrate creates a supporting framework during freezing without undue stress for collagen fibers, does not allow allografts to fall off and freeze in an unnatural form. During defrosting, the “free” substrate allows you to remove allografts already in the first minute and manually rinse from the side of the lumen, which greatly accelerates the speed and uniformity of defrosting. The need for a cavity in the structure of the substrate is due to the fact that in this case, the cooling rate is increased by 50% or more (in comparison with the whole substrate). In addition, silicone substrates can be simulated using silicone perfusion tubes, and plastic ones using sterile pipettes. Also, despite the fact that copper, aluminum, and silver substrates have a higher thermal conductivity, they have a higher specific heat capacity, which, provided that the convective heat transfer parameters are the same, eliminates their advantages.
3.1) Крепление в упаковке на 10 аллотрансплантатов. После маркировки все сосуды на пластиковых подложках фиксируются на двух пенопластовых держателях со специально подготовленными сквозными каналами для подложек и устанавливают крышки на каждую сторону. На каждой крышке дублируется информация с ярлыков, так чтобы можно было вытаскивать нужный сосуд из упаковки с минимальными манипуляциями. После проверки надежности упаковки берется такой же контейнер, в котором предварительно охлаждается объем ПДМС и заполняется ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс комнатной температуры. Затем в него опускается вся упаковка с подложками и помещается в холодильник на 1 час.3.1) Fastening in a package of 10 allografts. After marking, all vessels on plastic substrates are fixed on two foam holders with specially prepared through channels for substrates and lids are installed on each side. Information on labels is duplicated on each lid, so that you can pull the desired vessel out of the package with minimal manipulation. After checking the reliability of the package, the same container is taken in which the volume of PDMS is pre-cooled and PDMS is filled with a viscosity of 1 centistokes room temperature. Then the entire package with substrates is dropped into it and placed in the refrigerator for 1 hour.
3.2) Крепление в упаковке на 3 аллотрансплантата. Упаковка на три аллотрансплантата предполагает их вертикальное расположение в один ряд, для этого требуется закрепить сосудистые аллотрансплантаты на любых подложках и обязательно установить на нижнюю часть подложки заслонку чтобы аллотрансплантаты не спадали, это можно сделать либо силиконовым кольцом, либо крышкой, либо сквозным проколом. Затем закрепленные аллотрансплантаты устанавливаются в промежуточный контейнер объемом в 50-100 мл через три порта на дне его и подложки соединяются между собой проволочным соединением. При возможности в крышку промежуточного контейнера монтируется порт для вакуумизации, в этом случае крайне важно проверять общую герметичность упаковки на каждом этапе. В конце полученная конструкция опускаются в прозрачную емкость из полиакрила объемом в 1 литр со стерильным / фильтрованным ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс комнатной температуры и помещается в общую камеру медицинского холодильника на 1 час минимум. В случае разных доноров в каждой упаковке следует размещать сосуды только от одного донора.3.2) Fastening in a package of 3 allografts. Packing on three allografts implies their vertical arrangement in one row, for this it is necessary to fix vascular allografts on any substrates and be sure to install a shutter on the bottom of the substrate so that the allografts do not fall off, this can be done either with a silicone ring, or a lid, or a through puncture. Then, fixed allografts are placed in an intermediate container with a volume of 50-100 ml through three ports at the bottom of it and the substrates are connected to each other by a wire connection. If possible, a port for evacuation is mounted in the lid of the intermediate container, in this case it is extremely important to check the overall tightness of the package at each stage. At the end, the resulting structure is lowered into a transparent container of polyacryl with a volume of 1 liter with sterile / filtered PDMS with a viscosity of 1 centistokes room temperature and placed in the general chamber of the medical refrigerator for at least 1 hour. In the case of different donors, vessels from only one donor should be placed in each package.
3.3) Крепление в индивидуальной упаковке аллотрансплантатов. Сосудистые аллотрансплантаты от разных доноров на силиконовых подложках опускаются в предварительные стерильные пробирки без отверстия на дне через порт на их крышках, порт сделан ровно по центру, не допускается чтобы закрепленный аллотрансплантат упирался в дно пробирки и изгибался, требуется максимально ровное его расположение без контакта со стенками пробирки. После этого на нижний конец подложки устанавливается заслонка чтобы аллотрансплантат не спадал во время транспортировки, нижней заслонкой может быть стерильная игла или проволока, проходящая через просвет силиконовой трубки на небольшом расстоянии от аллотрансплантата. Затем устанавливается верхняя заслонка в виде любой подходящей по диаметру крышки или также иглы, или проволоки чтобы вся подложка не опускалась на дно пробирки. В конце на пробирках дублируется информация с ярлыков и в них заливается стерильный / фильтрованный ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс комнатной температуры. Все пробирки с ПДМС предварительно выдерживаются 1 час при температуре +4°С в отдельной камере медицинского холодильника. После выдерживания подложки устанавливаются на окончательные, основные пробирки с отверстием на дне для дальнейшей обработки. По желанию оператора предварительные пробирки могут использоваться для дополнительной медикаментозной обработки аллотрансплантатов любыми криопротекторными и радиопротекторными растворами без объема ПДМС с использованием двойного центрифугирования, для этого также можно сделать два маркера на крышке пробирки с указанием верхней и нижней полусфер.3.3) Fastening individually wrapped allografts. Vascular allografts from different donors on silicone substrates are lowered into pre-sterile tubes without a hole in the bottom through the port on their caps, the port is made exactly in the center, it is not allowed that the fixed allograft rests on the bottom of the tube and bends, its most even arrangement without contact with the walls is required test tubes. After that, a shutter is installed on the lower end of the substrate so that the allograft does not fall off during transportation, the lower shutter may be a sterile needle or wire passing through the lumen of the silicone tube at a small distance from the allograft. Then the upper shutter is installed in the form of any suitable diameter cap or also a needle or wire so that the entire substrate does not fall to the bottom of the tube. At the end, the information from the labels is duplicated on the tubes and sterile / filtered PDMS with a viscosity of 1 centistokes room temperature is poured into them. All tubes with PDMS are pre-conditioned for 1 hour at a temperature of + 4 ° C in a separate chamber of the medical refrigerator. After aging, the substrates are mounted on the final, main tubes with an opening at the bottom for further processing. At the request of the operator, preliminary tubes can be used for additional drug treatment of allografts with any cryoprotective and radioprotective solutions without PDMS volume using double centrifugation, for this you can also make two markers on the tube cover indicating the upper and lower hemispheres.
Примечание. Использование для данной упаковки силиконовых подложек связано с тем, что их легче оптимизировать под фактическую длину аллотрансплантата.Note. The use of silicone substrates for this package is due to the fact that they are easier to optimize for the actual length of the allograft.
Если планируются дальнейшая радиационная стерилизация упаковки, то сосуды размещаются на подложках особым способом в один ряд, не перекрывая друг друга или в два ряда зигзагом перпендикулярно развертке стерилизующего луча, в зависимости от их количества и типа упаковки.If further radiation sterilization of the package is planned, then the vessels are placed on the substrates in a special way in one row, without overlapping each other or in two rows with a zigzag perpendicular to the sweep of the sterilizing beam, depending on their number and type of packaging.
Примечание: выдерживание аллотрансплантатов в объеме ПДМС после их установки в упаковку приводит к тому, что температура сосудов плавно опускается и они покрываются ПДМС так чтобы во время замораживания скорость и равномерность была выше. Тем более что чем ниже стартовая температура замораживания (но до точки замерзания), тем быстрее происходит переход критической отметки в -35°С.Note: keeping allografts in the volume of PDMS after they are placed in the package causes the temperature of the vessels to drop smoothly and they are coated with PDMS so that during freezing the speed and uniformity are higher. Moreover, the lower the starting freezing temperature (but to the freezing point), the faster the transition of the critical mark to -35 ° C.
4) Организация зоны охлаждения. За это время следует организовать зону для охлаждения упаковки в условиях -80°С с минимальными перепадами температур. Для этого отдельную секцию низкотемпературного медицинского морозильника освобождается от любого содержимого.4) Organization of the cooling zone. During this time, it is necessary to organize a zone for cooling the package at -80 ° C with minimal temperature differences. To do this, a separate section of a low-temperature medical freezer is freed from any contents.
Для двух типов упаковки (на три и на один аллотрансплантат), ввиду намного меньшего объема ПДМС и его быстрого нагрева от воздуха комнатной температуры обеспечиваются минимальные перепады температур во избежание образования воздушной ''подушки'' вокруг сосуда и тепловой деформации во время криоконсервации. Для этого в отдельную секцию низкотемпературного медицинского морозильника помещается специально подготовленный короб из теплоизоляционного материала (например, Cryogel-Z) под размер секции морозильника, предварительно охлажденный до -80°С и ниже (при возможности). Во время открытия дверцы морозильника теплоизоляционный короб выдвигается одним из операторов вперед чтобы ограничить приток теплого воздуха из помещения в зону заморозки, также используется короб с передней стенкой в виде крышки, которая может изолировать секцию с упаковкой во время хранения и защищать от притока воздуха во время открытия морозильника.For two types of packaging (for three and one allograft), due to the much smaller volume of PDMS and its rapid heating from room temperature air, minimal temperature differences are ensured to avoid the formation of an air cushion around the vessel and thermal deformation during cryopreservation. To do this, a specially prepared box of heat-insulating material (for example, Cryogel-Z) is placed in a separate section of the low-temperature medical freezer to fit the size of the freezer section, pre-cooled to -80 ° C and below (if possible). During the opening of the freezer door, the heat-insulating box is pushed forward by one of the operators to limit the influx of warm air from the room into the freezing zone. A box with a front wall in the form of a lid is also used, which can isolate the packaging section during storage and protect it from air inflow during opening freezer.
В случае невозможности организации зоны охлаждения и рабочего пространства в морозильнике она создается в ламинарном шкафу с использованием теплоизоляции и охлаждения металлического контейнера по контуру с использованием сухого льда или, что предпочтительнее, жидкого азота с обязательным контролем за температурой с помощью термопары, в этом случае необходимо следить, что температура ПДМС не падала ниже - 100°С и не поднималась выше -70°С. Также следует понимать, что в этом случае сложнее организовать изолированную зону обработки с постоянной температурой и все процедуры следует осуществлять более четко и оперативно.If it is not possible to organize the cooling zone and the working space in the freezer, it is created in a laminar cabinet using thermal insulation and cooling the metal container along the circuit using dry ice or, preferably, liquid nitrogen with mandatory temperature control using a thermocouple, in which case it is necessary to monitor that the temperature of PDMS did not fall below - 100 ° C and did not rise above -70 ° C. It should also be understood that in this case it is more difficult to organize an isolated treatment zone with a constant temperature and all procedures should be carried out more clearly and efficiently.
5) Заморозка5) Freezing
5.1) Заморозка в упаковке на 10 аллотрансплантатов от одного донора. Для данного типа упаковки используется пластиковый или стальной контейнер такого объема, который позволит разместить в нем упаковку с запасом по высоте не менее 5 сантиметров. Контейнер содержит предварительно фильтрованный и охлажденный до -80°С ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс. Контейнер помещается в изолированную зону низкотемпературного медицинского морозильника. Процедуру заморозки рекомендуется осуществлять двум операторам. Упаковка с сосудами берется первым оператором с двух сторон двумя пинцетами или с использованием перчаток для низкотемпературной работы, вторым же оператором регулируется открытие и закрытие дверцы морозильника. Упаковка аккуратно помещается оператором в контейнер с ПДМС в морозильнике так чтобы вещество покрывало все подложки и оставалось не менее 5 сантиметров до поверхности. В первые 30 секунд требуется поднимать и опускать упаковку в объеме ПДМС, не доходя до границы раздела водной и воздушной фаз, в оставшиеся 30 секунд упаковку следует перемещать по объему ПДМС вправо и влево, не поднимая и не касаясь дна.5.1) Freezing in a package of 10 allografts from one donor. For this type of packaging, a plastic or steel container of such a volume is used that will allow you to place the package in it with a margin of at least 5 centimeters in height. The container contains pre-filtered and cooled to -80 ° C PDMS with a viscosity of 1 centistokes. The container is placed in an isolated area of a low-temperature medical freezer. The freezing procedure is recommended for two operators. The packaging with vessels is taken by the first operator on both sides with two tweezers or using gloves for low-temperature work, while the second operator controls the opening and closing of the freezer door. The package is carefully placed by the operator in a container with PDMS in the freezer so that the substance covers all the substrates and remains at least 5 centimeters to the surface. In the first 30 seconds it is required to raise and lower the package in the volume of PDMS, not reaching the interface between the water and air phases, in the remaining 30 seconds, the package should be moved across the volume of PDMS to the right and left, without raising and not touching the bottom.
5.2) Заморозка в упаковке для 3-х аллотрансплантатов от одного донора. Для данного типа упаковки используются две одинаковые емкости из полиакрила, в одну из них, пустую, устанавливается резервуар с аллотрансплантатами на подложках, а во вторую наливается 800 мл охлажденного до -80°С ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс. Вторая емкость помещается в низкотемпературный морозильник, в секцию для охлаждения на 10 минут с открытой крышкой. Затем обе емкости устанавливаются рядом друг с другом в зоне охлаждения морозильника, крышка с подложками раскручивается и аккуратно переносится от одной емкости в другую, устанавливаясь на ней путем медленного закручивания до упора. Емоксть с подложками в объеме ПДМС продвигается вглубь морозильника для хранения или для временного ожидания дальнейшей обработки и при возможности изолируется от остальной секции с обязательной дополнительной маркировкой. Пустая емкость убирается и утилизируется.5.2) Freezing in packaging for 3 allografts from one donor. For this type of packaging, two identical containers of polyacryl are used, one of them is empty, a reservoir with allografts is installed on the substrates, and the second is filled with 800 ml of PDMS cooled to -80 ° C with a viscosity of 1 centistokes. The second container is placed in a low-temperature freezer, in the section for cooling for 10 minutes with the lid open. Then both containers are installed next to each other in the cooling zone of the freezer, the lid with substrates is untwisted and carefully transferred from one container to another, being installed on it by slow twisting until it stops. A container with substrates in the volume of PDMS is moved deep into the freezer for storage or for temporary waiting for further processing and, if possible, isolated from the rest of the section with mandatory additional marking. Empty container is removed and disposed of.
5.3) Заморозка в индивидуальной упаковке аллотрансплантатов. Перед началом работы ПДМС с вязкостью в 1 сантистокс предварительно помещается в пластиковый или в металлический контейнер объемом не менее 5 литров и глубиной не менее 10 сантиметров и охлаждается до нужной температуры в зоне охлаждения. Для заморозки крышка с подложкой достается из предварительной пробирки и оперативно погружается в объем ПДМС в контейнере с использованием охлажденных криоперчаток и перемещается по этому объему плавными волнистыми движениями на глубине не менее 3 сантиметров до поверхности и охватывая всю площадь контейнера в течение 1 минуты. Затем крышка с подложкой сразу же помещается в пустую, основную пробирку с отверстием на дне и завинчивается на ней. В данном случае отверстие на дне необходимо для простоты дальнейшей вакуумизации.5.3) Freezing individually wrapped allografts. Before starting work, PDMS with a viscosity of 1 centistokes is previously placed in a plastic or metal container with a volume of at least 5 liters and a depth of at least 10 centimeters and cooled to the desired temperature in the cooling zone. For freezing, the lid with the substrate is taken out of the preliminary test tube and quickly immersed in the PDMS volume in the container using chilled cryo gloves and moves along this volume in smooth wavy movements at a depth of at least 3 centimeters to the surface and covering the entire area of the container for 1 minute. Then the lid with the substrate is immediately placed in an empty, main tube with a hole at the bottom and screwed on it. In this case, a hole at the bottom is necessary for ease of further evacuation.
Примечание: во всех случаях упаковки процесс замораживания сопровождается интенсивным перемещением аллотрансплантата по объему ПДМС. Это продиктовано тем фактом, что в условиях холодильника наиболее интенсивный теплообмен происходит в первый 40 секунд, далее процесс замедляется, из-за уменьшения разности температур хладноносителя и сосуда снижается эффективность конвективного теплообмена, ввиду низкой теплопроводности тканей аллотрансплантата на нем самом наблюдается значительный градиент температур (на 10-й секунде расчета, он составляет 14°С), в следствии этого значительно уменьшается тепловой поток через внешнюю поверхность сосуда и падает скорость охлаждения. Также важную роль играет интенсивность конвекции, это можно наблюдать на графике температур, до 40 секунды из-за разности температур хладоносителя и его приграничного к аллотрансплантату слоя возникает разность плотностей, отсюда в приграничном слое образуются восходящие потоки хладоносителя, они увеличивают интенсивность теплообмена, с охлаждением поверхности аллотрансплантата, роль данного эффекта уменьшается. После этого необходимо аккуратно продвинуть контейнер вглубь секции морозильника, закрыть дверцу и оставить упаковку на 2 минуты.Note: in all cases of packaging, the freezing process is accompanied by intensive movement of the allograft in the volume of PDMS. This is dictated by the fact that under the conditions of the refrigerator, the most intense heat transfer occurs in the first 40 seconds, then the process slows down, due to a decrease in the temperature difference between the coolant and the vessel, the convective heat transfer efficiency decreases, due to the low thermal conductivity of the allograft tissues, a significant temperature gradient is observed on it (at 10th second of calculation, it is 14 ° C), as a result of this, the heat flux through the outer surface of the vessel is significantly reduced and the cooling rate decreases. The convection intensity also plays an important role, this can be observed on the temperature graph, up to 40 seconds, due to the temperature difference between the coolant and its layer adjacent to the allograft, a difference in densities arises, from here ascending coolant flows form in the boundary layer, they increase the heat transfer rate, with cooling the surface allograft, the role of this effect is reduced. After that, carefully move the container deep into the freezer section, close the door and leave the packaging for 2 minutes.
6) Хранение. После охлаждения упаковки она остается в морозильнике пока не будет подготовлен криоконтейнер с теплоизоляцией для транспортировки к месту радиационной стерилизации, но не более чем на сутки и без открывания крышки морозильника или с установкой листа теплоизоляции так, чтобы он закрывал контейнер от контакта с теплым воздухом при открытии дверцы.6) Storage. After the package has cooled, it remains in the freezer until a cryocontainer with thermal insulation is prepared for transportation to the radiation sterilization site, but for no more than a day and without opening the freezer lid or with installing a thermal insulation sheet so that it closes the container from contact with warm air when opening the door.
Если дальнейшие процедуры необходимо отложить, то упакованные сосуды остаются на хранение в медицинском морозильнике, но предварительно достаются из контейнера с ПДМС и помещаются в самозапаивающийся стерильный пакет. Хранение при температуре -80°С - это более удобный, безопасный и дешевый вариант, чем использование жидкого азота; помимо этого, во время дальнейшего охлаждения аллотрансплантата до -140°С и ниже часто происходят повреждения его структуры из-за фазовых переходов, в частности, коллагена 1-го типа. Аналогичные повреждения могут происходить при перепадах температур и нагреве до -40°С и выше. Хранение же в самом ПДМС показало худшие результаты в сравнении с хранением в открытой пробирке.If further procedures need to be postponed, then the packed vessels are stored in a medical freezer, but first they are taken out of the container with PDMS and placed in a self-sealing sterile bag. Storage at a temperature of -80 ° C is a more convenient, safe and cheaper option than using liquid nitrogen; in addition, during further cooling of the allograft to -140 ° C and below, damage to its structure often occurs due to phase transitions, in particular,
7) Холодовая цепь и подготовка к стерилизации всех типов упаковок.7) Cold chain and preparation for sterilization of all types of packages.
Перед началом стерилизации данные об уровне инициальной контаминации сосудов после их забора и вся информация о возможных происшествиях, способствующих увеличению этого уровня (контакты с потенциально загрязненными поверхностями в случае мануальных процедур или падения) передается оператору. Уровень инициальной контаминации сосудов дает оператору возможность задать нужную стерилизующую дозу на установке линейного ускорителя электронов. Далее разрабатывается, организуется и проверяется холодовую цепь - ряд организационных и практических процедур, обеспечивающих оптимальный температурный режим транспортировки упаковки с сосудами без подъема температуры выше -70°С. А также предварительно проводятся тесты упаковки и криоконтейнера на перепады температур во время транспортировки и во время стерилизации, а также тест на фактический уровень дозовой нагрузки в разных местах криоконтейнера. Ввиду того, что датчики не могут работать при температуре -80°С в криоконтейнере проводится имитация объема сухого льда по весу. Тест на перепады температур делается без датчиков, но с термопарой, которая использует отдельный канал в криоконтейнере для закрепления на уровне выше сухого льда. Термопара вытаскивается перед помещением криоконтейнера на конвейер линейного ускорителя электронов и помещается обратно после прохождения процедуры стерилизации. Так же следует помнить, что время необходимое оператору на запуск систему составляет 30 минут, поэтому время транспортировки следует рассчитывать заранее исходя из этих данных. Индивидуальные упаковки размещаются на одном уровне так чтобы сухой лед не перекрывал прохождение стерилизующего луча. Вакуумизация проходит напрямую через крышку с портом либо с упаковкой в отдельный пакет.Before sterilization begins, data on the level of initial vascular contamination after collection and all information about possible incidents contributing to an increase in this level (contacts with potentially contaminated surfaces in the event of manual procedures or a fall) is transmitted to the operator. The level of initial vascular contamination gives the operator the opportunity to set the desired sterilizing dose at the installation of a linear electron accelerator. Further, a cold chain is developed, organized and tested - a series of organizational and practical procedures that ensure the optimal temperature regime for transporting a package with vessels without raising the temperature above -70 ° C. As well as preliminary tests of packaging and cryocontainer for temperature differences during transportation and during sterilization, as well as a test for the actual dose level in different places of the cryocontainer are carried out. Due to the fact that the sensors cannot operate at a temperature of -80 ° C, a simulation of the volume of dry ice by weight is carried out in the cryocontainer. The temperature difference test is done without sensors, but with a thermocouple, which uses a separate channel in the cryocontainer to fix it at a level above dry ice. The thermocouple is pulled out before the cryocontainer is placed on the conveyor of the linear electron accelerator and placed back after the sterilization procedure. It should also be remembered that the time required for the operator to start the system is 30 minutes, so the transportation time should be calculated in advance based on these data. Individual packages are placed on the same level so that dry ice does not block the passage of the sterilizing beam. Evacuation passes directly through a cover with a port or with packaging in a separate package.
8) Вакуумизация упаковки8) Vacuum packaging
8.1) Вакуумизация для упаковки на 10 и 3 аллотрансплантата. Упаковка оперативно помещается в самозапаивающийся пакет с портом для вакуумизации прямо на слое сухого льда внутри криоконтейнера без присутствия ПДМС в нем. Упаковки на три аллотрансплантата располагаются в один ряд у стенки криоконтейнера, закреплясь так, чтобы они не сбивались в кучу и не падали. В случае упаковки на три аллотрансплантата с портом для вакуумизации пакет не используется.8.1) Vacuumization for packaging on 10 and 3 allografts. The package is quickly placed in a self-sealing bag with a port for evacuation directly on the dry ice layer inside the cryocontainer without the presence of PDMS in it. Packages for three allografts are arranged in a row near the wall of the cryocontainer, secured so that they do not pile up and fall. In the case of packaging for three allografts with a port for evacuation, the package is not used.
8.2) Вакуумизация индивидуальной упаковки. Каждая пробирка упаковывается в стерильный вакуумный пакет, и процедура вакуумизации проводится на слое сухого льда с минимальными потерями температур. Затем пробирка помещается в держатель для пробирок большего диаметра. Все последующие пробирки помещаются туда с вертикальным размещением в один ряд или зигзагом. Пакет для вакуумизации может быть изготовлен самостоятельно с клапаном для отсоса воздуха со стороны дна пробирки. Важность вакуумизация продиктована тем, что в этом случае гарантировано меньшее возникновение свободных радикалов во время стерилизации, отсутствие же ПДМС в жидком виде вокруг сосудов также может способствовать возникновению большого количества нежелательных пузырей воздуха от неизбежного встряхивания контейнера во время транспортировки и перемещения по конвейеру.8.2) Vacuuming individual packaging. Each tube is packaged in a sterile vacuum bag, and the evacuation procedure is carried out on a layer of dry ice with minimal temperature loss. The tube is then placed in a larger diameter tube holder. All subsequent tubes are placed there with vertical placement in a single row or zigzag. The bag for evacuation can be made independently with a valve for suctioning air from the bottom of the tube. The importance of evacuation is dictated by the fact that in this case a lesser occurrence of free radicals during sterilization is guaranteed, the absence of PDMS in liquid form around the vessels can also contribute to the occurrence of a large number of unwanted air bubbles from the inevitable shaking of the container during transportation and movement along the conveyor.
8.3) Стерилизация для всех типов упаковки сосудов.8.3) Sterilization for all types of vessel packaging.
После вакуумизации в криоконтейнер помещается температурный датчик, проводится его герметизация и отправка на процедуру радиационной стерилизации. Рекомендуемый режим работы установки радиационной стерилизации - это облучение в течение 15 минут с энергией электронов 7,5 МэВ и током пучка 700 мкА, при котором поверхностная доза облучения объекта в зависимости от скорости конвейера составляет от 24 до 30 кГр. При одностороннем облучении в отработанном режиме работы установки, описанной в выше, упаковки с сосудами для реализации доз облучения сосудов на глубине 3,5-4,0 г/см2 в диапазоне 15-25 кГр, поверхностная доза облучения упаковки, как показывают расчеты, должна составлять 37 кГр. В свою очередь, при двустороннем облучении упаковки (двойном облучении упаковки сначала с одной стороны, потом с другой) поверхностная доза облучения упаковки должна быть уменьшена как минимум вдвое и не превышать 19 кГр. При этом радиационное воздействие на аллотрансплантаты в дозах 15-25 кГр (Dст - Dмакс) является эффективным для достижения стерильности. При дозах, превышающих 35 кГр, возможна деструкция волокнистого остова биоматериала, исключающая допустимость его применения для трансплантологии, а также возникают риски неконтролируемого возникновения перекрестных сшивок и ухудшения свойств ПДМС, который покрывает все сосуды.After evacuation, a temperature sensor is placed in the cryocontainer, it is sealed and sent to the radiation sterilization procedure. The recommended operating mode of the radiation sterilization unit is irradiation for 15 minutes with an electron energy of 7.5 MeV and a beam current of 700 μA, at which the surface dose of the object, depending on the conveyor speed, is from 24 to 30 kGy. When unilateral irradiation in the operating mode of the installation described above, packaging with vessels for the implementation of doses of blood vessels at a depth of 3.5-4.0 g / cm 2 in the range of 15-25 kGy, the surface dose of the package, as shown by the calculations, should be 37 kGy. In turn, with bilateral irradiation of the package (double irradiation of the package, first on one side, then on the other), the surface dose of the package irradiation should be reduced by at least half and not exceed 19 kGy. At the same time, radiation exposure to allografts in doses of 15-25 kGy (Dst - Dmax) is effective for achieving sterility. At doses exceeding 35 kGy, the destruction of the fibrous skeleton of the biomaterial is possible, excluding the permissibility of its use for transplantation, and there are also risks of uncontrolled cross-linking and deterioration of the properties of PDMS, which covers all vessels.
После стерилизации упаковка с сосудистыми аллотрансплантатами отправляется на хранение в условиях температуры -80°С или же подвергается разморозке для дальнейшей обработки. Сама радиационная стерилизация в замороженном состоянии является безопасной и рутинной процедурой для передовых медицинских компаний, занимающихся криоконсервацией сосудистых аллотрансплантантов и их доставкой по всему миру (Cryolife Inc.). При радиационной стерилизации перечисленные объекты следует рассматривать как медицинские изделия, вопросы радиационной стерилизации которых регламентируются рядом ГОСТов: ГОСТ ISO 11137-1-2011, ГОСТ Р ИСО 11137-2-2008 и т.д.After sterilization, the package with vascular allografts is sent for storage at a temperature of -80 ° C or is thawed for further processing. Frozen radiation sterilization itself is a safe and routine procedure for leading medical companies involved in cryopreservation of vascular allografts and their worldwide delivery (Cryolife Inc.). In radiation sterilization, the listed objects should be considered as medical devices, the radiation sterilization of which is regulated by a number of GOSTs: GOST ISO 11137-1-2011, GOST R ISO 11137-2-2008, etc.
9) Разморозка9) Defrosting
Разморозка стерильных сосудистых аллотрансплантатов проводится в условиях ламинарного потока. Перед началом разморозки подготавливается стерильный контейнер со стерильным ПДМС вязкостью в 25 сантистокс комнатной температуры, магнитную мешалку с якорем, стерильный градусник, нагревательный столик. Криоконтейнер после стерилизации обрабатывается со всех сторон спиртом и помещается на пол ламинарного бокса, после этого вскрывается и по мере обработки достаются и открываются пакеты с упаковками.Defrosting of sterile vascular allografts is carried out under conditions of laminar flow. Before defrosting, a sterile container is prepared with a sterile PDMS with a viscosity of 25 centistokes at room temperature, a magnetic stirrer with an anchor, a sterile thermometer, and a heating table. After sterilization, the cryocontainer is treated with alcohol on all sides and placed on the floor of the laminar box, after which it is opened and, as the processing is completed, bags with packages are taken out and opened.
9.1) Для упаковки на десять аллотрансплантатов. Закрепленные подложки с сосудами достаются по одной штуке и помещаются в контейнер с ПДМС. Подложка фиксируется оператором в перчатке или пинцетом и интенсивно перемещается по объему ПДМС до тех пор, пока сосуд сам не сойдет с подложки, после этого сосуд осторожно достается из контейнера и упаковывается. Приблизительное время разморозки одного сосуда составляет 3-5 минут. Температура ПДМС проверяется оператором после каждой разморозки и при необходимости корректируется с помощью нагрева контейнера на нагревательном столике. Магнитная мешалка не используется для данного типа упаковки. Также по желанию оператора могут доставаться только те сосудистые аллотрансплантаты, которые нужны в данный момент с отправкой остальных на хранение в пакете после его запаивания.9.1) For packaging on ten allografts. The fixed substrates with vessels are taken one at a time and placed in a container with PDMS. The substrate is fixed by the operator with a glove or tweezers and intensively moves along the volume of PDMS until the vessel itself comes off the substrate, after which the vessel is carefully removed from the container and packed. The approximate defrosting time for one vessel is 3-5 minutes. The temperature of the PDMS is checked by the operator after each defrost and, if necessary, is adjusted by heating the container on a heating table. A magnetic stirrer is not used for this type of packaging. Also, at the request of the operator, only those vascular allografts that are currently needed can be delivered with the rest sent for storage in the bag after it has been sealed.
9.2) Для упаковки на ипм аллотрансплантата. Из пакета достается по одной упаковке с тремя аллотрансплантатами и в ламинарном шкафу откручивается крышка с подложками. Затем крышка помещается на такую же емкость с ПДМС комнатной температуры и с магнитным якорем на дне. Емкость устанавливается на магнитную мешалку с ее включением на минимальные обороты. Размораживание в данном типе упаковки протекает в течение 5 минут. После мануальной проверки плотности ткани на подложках аллотрансплантаты снимаются с подложек и упаковываются. Если есть возможность установки дополнительного нагревательного элемента сбоку от емкости или подключения перфузионного насоса для постоянного притока теплого ПДМС и оттока охлажденного, то это рекомендуется сделать.9.2) For packaging on IPM allograft. One package with three allografts is taken from the bag and a lid with substrates is unscrewed in the laminar cabinet. Then the lid is placed on the same container with PDMS room temperature and with a magnetic anchor at the bottom. The capacity is installed on a magnetic stirrer with its inclusion at minimum speed. Defrosting in this type of packaging takes 5 minutes. After manual verification of tissue density on the substrates, allografts are removed from the substrates and packaged. If it is possible to install an additional heating element on the side of the tank or to connect a perfusion pump for a constant influx of warm PDMS and outflow of chilled one, it is recommended to do this.
9.3) Для индивидуальной упаковки аллотрансплантатов. Из пакета, по очереди, оператором достается каждая упаковка, раскручивается крышка с подложкой и вынимается нижняя заслонка. Затем крышка с подложкой помещается в контейнер с ПДМС и начинает интенсивно перемещаться по объему ПДМС до тех пор, пока сосуд сам не сойдет с подложки, после этого сосуд осторожно достается из контейнера и упаковывается. Для всех типов упаковки после размораживания сосудистые аллотрансплантаты помещаются в стерильные пробирки, содержащие стерильный раствор Кустодиола с добавлением 50 U/мл пенициллина - стрептомицина (500 mg/mL) с дублированием всей информации с ярлыка. Размораживание путем прямого контакта аллотрансплантата покрытого и замороженного в ПДМС в объеме такого же ПДМС с другой вязкостью обеспечивает быструю передачу тепла, а активное его перемешивание позволяет создавать постоянные теплопритоки с окружающей средой и играет ключевую роль в ускоренном и безопасном нагреве, а также выполняет опосредованную антиоксидантную функцию. Отдельно требуется сказать, что температура вспышки ПДМС вязкостью в 1 сантистокс, присутствующего в замороженном аллотрансплантате и на его стенках, достигает 38°С, что также влияет на выбор температуры ПДМС-25. После изложенных процедур рекомендуется отдельно отмывать сосудистые аллотрансплантаты от остатков ПДМС.9.3) For individual packaging of allografts. Each package is taken by the operator in turn from the package, each package is untwisted, the lid with the substrate is untwisted and the lower shutter is removed. Then the lid with the substrate is placed in a container with PDMS and begins to move intensively over the volume of PDMS until the vessel itself comes off the substrate, after which the vessel is carefully removed from the container and packed. For all types of packaging, after thawing, vascular allografts are placed in sterile tubes containing sterile Custodiol solution with the addition of 50 U / ml penicillin - streptomycin (500 mg / mL) with duplication of all information from the label. Thawing by direct contact of an allograft coated and frozen in PDMS in the volume of the same PDMS with a different viscosity ensures fast heat transfer, and its active mixing allows the creation of constant heat inflows with the environment and plays a key role in accelerated and safe heating, and also performs an indirect antioxidant function . Separately, it is necessary to say that the flashpoint of PDMS with a viscosity of 1 centistokes present in the frozen allograft and on its walls reaches 38 ° C, which also affects the temperature choice of PDMS-25. After the above procedures, it is recommended to separately wash vascular allografts from PDMS residues.
В случае невозможности подбора подложек под диаметр сосудистого аллотрансплантата рекомендуется использовать следующий дополнительный способ крепления - на концы сосуда следует закрепить наконечники из пластика и растянуть его по всей длине, затем в таком виде аккуратно опустить в объем ПДМС, держа за наконечники пинцетом и затем упаковать в пакет для дальнейшей обработки вакуумизации, стерилизации, хранения. Пакеты с такими замороженными сосудами следует упаковывать в криоконтейнер особенно осторожно, рекомендуется помещать их дополнительно в пластиковые емкости и уже их располагать в ряд в криоконтейнер.If it is not possible to select substrates for the diameter of the vascular allograft, it is recommended to use the following additional method of attachment - plastic tips should be attached to the ends of the vessel and stretched along the entire length, then gently lowered into the PDMS volume, holding the tips with tweezers and then packed in a bag for further processing of vacuumization, sterilization, storage. Packets with such frozen vessels should be packed especially carefully in the cryocontainer, it is recommended to place them additionally in plastic containers and to place them in a row in the cryocontainer.
Пример осуществления способа.An example implementation of the method.
В Центре биомедицинских технологий ФМБЦ им. А.И. Бурназяна была проведена серия экспериментов по криоконсервированию и стерилизации сосудистых аллотрансплантатов трупного происхождения разного диаметра и длины (от 5 до 12 см) от, в обшей сложности, 40-ка доноров средней и старшей возрастных групп обоих полов в течение 5 часов после фиксации летального исхода с последующим проведением гистологического анализа и проверки физико-механических свойств. Критериями исключения из эксперимента были наличие бифуркаций, атеросклеротических и иных повреждений сосудистой стенки, бляшек и кальцинации на более чем 40% внутренней площади сосуда.At the Center for Biomedical Technologies FMBC them. A.I. Burnazyan conducted a series of experiments on cryopreservation and sterilization of vascular allografts of cadaveric origin of different diameters and lengths (from 5 to 12 cm) from, in total, 40 donors of middle and older age groups of both sexes within 5 hours after fixing a fatal outcome subsequent histological analysis and verification of physical and mechanical properties. Exclusion criteria from the experiment were the presence of bifurcations, atherosclerotic and other injuries of the vascular wall, plaques, and calcifications on more than 40% of the inner area of the vessel.
Эксперимент 1
Каждому эксперименту предшествовало математическое моделирование процесса охлаждения и нагрева в разных условиях (на разных типах подложек, полых и сплошных, из алюминия, меди, пластика, медицинской стали с диаметрами 3, 4, 6 мм) в присутствии ПДМС разной вязкости (1, 5, 25 сантисток). Для моделирования была создана модель, используемая в системе автоматизированного проектирования (САПР / CAD) с заданными теплофизическими свойствами сосуда и ПДМС. Моделирование производилось в программном комплексе Ansys. Также были рассмотрены различные условия среды охлаждения, в частности использование металлической и пластиковой емкости для хладоносителя. Было выявлено, что в лучшем случае сосуд охлаждается с комнатной температуры до температуры - 51,8°С за 10 секунд и затем доходит до - 80°С за 15-30 секунд в зависимости от тактики охлаждения и перемещения сосуда по объему ПДМС. Подтверждение данных математического моделирования было осуществлено за счет охлаждения бедренной артерии трупного происхождения с закреплением между слоями сосуда термодатчика и фиксированием скорости охлаждения тканей в объеме ПДМС. В частности, использовались специально смонтированные датчики температуры с кабельным выводом на базе термометров сопротивления Pt100 Honeywell класса «А», ГОСТ 6651-2009 с диапазоном измерений от -100 до +450°С.Each experiment was preceded by mathematical modeling of the cooling and heating process under different conditions (on different types of substrates, hollow and solid, from aluminum, copper, plastic, medical steel with diameters of 3, 4, 6 mm) in the presence of PDMS of different viscosities (1, 5, 25 centiists). For modeling, a model was created that is used in a computer-aided design (CAD / CAD) system with predetermined thermophysical properties of the vessel and PDMS. Modeling was performed in the Ansys software package. Various conditions of the cooling medium were also considered, in particular the use of a metal and plastic container for a coolant. It was found that in the best case, the vessel is cooled from room temperature to a temperature of 51.8 ° C in 10 seconds and then reaches - 80 ° C in 15-30 seconds, depending on the tactics of cooling and movement of the vessel in the volume of PDMS. The confirmation of mathematical modeling data was carried out by cooling the femoral artery of cadaveric origin with fixing between the layers of the vessel of the temperature sensor and fixing the cooling rate of tissues in the volume of PDMS. In particular, specially mounted temperature sensors with a cable outlet based on Pt100 Honeywell class “A” resistance thermometers, GOST 6651-2009 with a measuring range from -100 to + 450 ° C were used.
Эксперимент 2
Перед началом основной серии экспериментов дополнительно оценивались экзоцеллюлярные и эндоцеллюлярные протекторные свойства ПДМС и его цитотоксичность во время криоконсервации путем двух независимых тестов. Для первого использовалось замораживание в парах жидкого азота суспензии мезенхимальных стволовых клеток онтодентального происхождения (в концентрации 1×106 /мл) и контрольной суспензии с использованием рутинного протокола с 10% ДМСО («Sigma Ald.», США) и реополиглюкина («Биохимик», Россия). Проверялось жизнеспособность клеток после замораживания, их метаболическая активность, а также встраиваемость и проникновение ПДМС в клеточную мембрану. Использовалась методика лантаноидного контрастирования клеток с последующей визуализацией на сканирующем электронном микроскопе, а также химическое микрокартирование в программном комплексе AZtec. Для второго теста применялось цикличное замораживание бедренной артерии с проведением гистологического исследования ее среза после каждого цикла. Результаты обоих тестов продемонстрировали отсутствие проникновения ПДМС в мембрану клеток, а, следовательно, и его эндоцеллюлярное действие, однако результаты показали выраженное экзоцеллюлярное протекторное действие ПДМС, подтвержденное электронной микроскопией и гистологическим исследованием. Что касается результатов циклической заморозки, то рутинное гистологическое окрашивание гематоксилином - эозином сегментов бедренной артерии показало отсутствие закономерности между числом циклов замораживания, количеством клеток и целостностью экстрацеллюлярного матрикса, что свидетельствуют об отсутствии ярко выраженного эффекта холодового цитолиза и повреждения слоев сосуда.Before starting the main series of experiments, the exocellular and endocellular protective properties of PDMS and its cytotoxicity during cryopreservation were additionally evaluated by two independent tests. For the former, freezing in a suspension of liquid nitrogen vapor of mesenchymal stem cells of ontodental origin (at a concentration of 1 × 10 6 / ml) and a control suspension using a routine protocol with 10% DMSO (Sigma Ald., USA) and reopoliglukin (Biochemist) was used , Russia). The viability of the cells after freezing, their metabolic activity, as well as the incorporation and penetration of PDMS into the cell membrane were tested. We used the technique of lanthanide contrasting of cells with subsequent visualization using a scanning electron microscope, as well as chemical microcarting in the AZtec software package. For the second test, cyclic freezing of the femoral artery was used with histological examination of its section after each cycle. The results of both tests showed the absence of PDMS penetration into the cell membrane, and, consequently, its endocellular effect, however, the results showed a pronounced exocellular protective effect of PDMS, confirmed by electron microscopy and histological examination. Regarding the results of cyclic freezing, the routine histological staining with hematoxylin - eosin of the femoral artery segments showed the absence of a regularity between the number of freezing cycles, the number of cells and the integrity of the extracellular matrix, which indicates the absence of a pronounced effect of cold cytolysis and damage to the layers of the vessel.
Эксперимент 3
После математического моделирования процесса охлаждения и его тестирования был проведен опыт по изолированной заморозке 30-ти участков бедренных артерий длинной не менее 10 см от 30-ти трупных доноров старшей возрастной группы обоих полов (65-85 лет) в объеме ПДМС вязкостью в 1 сантистокс. После процедуры разморозки в этом же хладоносителе, аллотрансплантаты были подвергнуты проверке их физико-механических свойств на разрывной машине Instron в термостатической камере BioPuls. В каждой группе вычислялись следующие параметры: относительная деформация при физиологическом и хирургическом уровнях напряжения, модуль Юнга при физиологическом и хирургическом уровнях напряжения и максимальное напряжение, возникающее в сосуде до разрыва. По результатам было проведено моделирование режима их стерилизации в замороженном виде. Проверки физико-механических свойств и ограниченное гистологическое исследование показали соответствие параметров, размороженных аллотрансплантатов с нативными сосудами. Была выявлена критическая важность использования подложек, чей диаметр не превышает внутренний диаметр сосудов, а также их хранение в сухом виде без погружения в объем ПДМС.After mathematical modeling of the cooling process and its testing, an experiment was conducted on isolated freezing of 30 sections of the femoral arteries with a length of at least 10 cm from 30 cadaveric donors of the older age group of both sexes (65-85 years) in the volume of PDMS with a viscosity of 1 centistokes. After the defrosting procedure in the same refrigerant, allografts were subjected to verification of their physical and mechanical properties on an Instron tensile testing machine in a BioPuls thermostatic chamber. In each group, the following parameters were calculated: relative deformation at physiological and surgical stress levels, Young's modulus at physiological and surgical stress levels, and maximum stress arising in the vessel before rupture. According to the results, the mode of their sterilization in frozen form was simulated. Checks of physical and mechanical properties and limited histological examination showed the correspondence of parameters of thawed allografts with native vessels. The critical importance of using substrates whose diameter does not exceed the inner diameter of the vessels, as well as their storage in dry form without immersion in the volume of PDMS, was identified.
Эксперимент 4
Сегменты бедренной артерии от 10-ти трупных доноров средней и старшей возрастных групп обоих полов криоконсервировали в объеме ПДМС вязкостью в 1 и 25 сантистокс с температурой -80°С с различными вариациями условий (с и без вакуумизации, с погружением в объем ПДМС и с его покрытием, с дополнительным центрифугированием и без) и подвергали стерилизационному облучению в дозах 30 кГр. В качестве контроля использовались группы с применением коктейля криопротекторов и радиопротекторов на основе ДМСО, глицерина и поливиннилпирролидона. Использовался метод оценки динамической вязкости и прочности оболочек сосудов на разрыв с использованием экспериментального измерительного стенда и разрывной машины Instron. Была выявлена критическая важность вакуумизации упаковки с аллотрансплантатами, предпочтительное использование криоконсервации на подложке с покрытием ПДМС вместо помещения и оставления в его объеме во время транспортировки и стерилизации, важность правильной укладки образцов в криоконтейнер согласно геометрии развертки стерилизующего луча и нецелесообразность центрифугирования для образцов с выраженным аутолизом. В итоге показатели лучшей группы аллотрансплантатов были сравнимы с нативными образцами и в ряде случаев опережали их по пиковым показателям прочности отдельных слоев сосудов. Было продемонстрировано опосредованное радиопротекторное действие ПДМС, а также его эффективность и безопасность для радиационной стерилизации криоконсерванных сосудистых аллотрансплантатов в объеме ПДМС-1 низкой вязкости за счет его гляцифобности, а также скорости и равномерности процесса охлаждения. Также стоит заметить, что протекторный эффект ПДМС-1 во время радиационной стерилизации частично схож с действием глицерола.Femoral artery segments from 10 cadaveric donors of middle and older age groups of both sexes were cryopreserved in PDMS volume of 1 and 25 centistokes viscosity with temperature -80 ° С with various variations of conditions (with and without evacuation, with immersion in and with PDMS volume coating, with additional centrifugation and without) and was subjected to sterilization irradiation in doses of 30 kGy. As a control, we used groups using a cocktail of cryoprotectants and radioprotectors based on DMSO, glycerol and polyvinyl pyrrolidone. We used a method for assessing the dynamic viscosity and tensile strength of vessel shells using an experimental measuring bench and an Instron tensile testing machine. The critical importance of evacuating the package with allografts was revealed, the preferred use of cryopreservation on a PDMS coated substrate instead of being placed in its volume during transportation and sterilization, the importance of proper placement of samples in a cryocontainer according to the geometry of the scanning beam and the inappropriateness of centrifugation for samples with pronounced autolysis. As a result, the indices of the best group of allografts were comparable with native samples and in some cases were ahead of them in terms of peak indices of strength of individual layers of blood vessels. The indirect radioprotective effect of PDMS was demonstrated, as well as its effectiveness and safety for radiation sterilization of cryopreserved vascular allografts in the volume of PDMS-1 of low viscosity due to its glacyphobicity, as well as the speed and uniformity of the cooling process. It is also worth noting that the protective effect of PDMS-1 during radiation sterilization is partially similar to the action of glycerol.
Предлагаемый способ обеспечивает оперативную, безопасную и производительную криоконсервацию сосудистых аллотрансплантатов человеческого или животного происхождения перед их радиационной стерилизацией в замороженном виде и дальнейшей децеллюляризацией.The proposed method provides prompt, safe and productive cryopreservation of vascular allografts of human or animal origin before their radiation sterilization in frozen form and further decellularization.
Под оперативной криоконсервацией понимается скорость процедуры, приближенная к т.н. витрификации в жидком азоте, а именно быстрое одноэтапное охлаждение от комнатной температуры до -80°С в течение 1 минуты. Под безопасной криоконсервацией понимается процедура включающая в себя полное или приемлемое сохранение асептических свойств, механических характеристик, параметров биосовместимости и биологической активности сосудистых аллотрансплантатов после их криоконсервации и размораживания за счет использования в качестве теплоносителя, хладоносителя и непроникающего криопротектора одного и того же вещества - полидиметилсилоксана (ПДМС), который приводит к формированию аморфного межклеточного льда во время криоконсервации - главного деструктивного фактора и отказа от применения криопротекторов, которые в эффективной концентрации оказывают цитотоксическое воздействие на трансплантат, а также жидкого азота и дорогостоящих программных методов заморозки. Под производительной криоконсервацией понимается, то что способ позволяет оптимизировать временные и финансовые затраты и позволяет обрабатывать более 10-ти сосудистых аллотрансплантатов (в виде артерий и вен с широким диапазоном внутренних диаметров) с безопасным и удобным креплением и упаковкой, а также имеет иные решения для крепления и упаковки аллотрансплантатов в зависимости от их количества и типа донорства. Это позволяет сделать рутинный забор сосудов для нужд тканевой инженерии более эффективным, так как создают возможность комплексной одновременной криоконсервации и разморозки большого объема материала и, кроме того, упрощают сам процесс. Способ также имеет адаптацию протоколов криоконсервации, упаковки, крепления и размораживания для удобства и безопасности дальнейшей радиационной стерилизации. Способ позволяет минимизировать повреждающий эффект радиации за счет опосредованного радиопротекторного действия ПДМС и его гидрофобности, условий сверхнизких температур, полученных оперативно и безопасно, наличия вакуумизации упаковки и размораживания с антиоксидантным воздействием. Помимо этого, децеллюляризация сосудистых аллотрансплантатов после их стерилизации предполагает их многоэтапную отмывку и не нуждается в сохранении донорского клеточного материала, поэтому данный способ полностью соответствует заявленным требованиям к материалу для децеллюляризации, даже в случае наличия остатков ПДМС на стенках сосудов после всех процедур. Однако полученные результаты позволяют сохранять и более сложные аллотрансплантаты с клеточным материалом реципиента, что нуждается в проведении дополнительных доклинических исследований.By operational cryopreservation is meant the speed of the procedure, close to the so-called vitrification in liquid nitrogen, namely, rapid one-stage cooling from room temperature to -80 ° C for 1 minute. Safe cryopreservation is understood as a procedure that includes the complete or acceptable preservation of aseptic properties, mechanical characteristics, biocompatibility parameters and biological activity of vascular allografts after their cryopreservation and thawing due to the use of the same substance - polydimethylsiloxane (PD) as a heat carrier, coolant and non-penetrating cryoprotectant ), which leads to the formation of amorphous intercellular ice during cryopreservation - the main dest of the creative factor and the rejection of the use of cryoprotectants, which in effective concentration have a cytotoxic effect on the transplant, as well as liquid nitrogen and expensive program methods of freezing. Productive cryopreservation means that the method allows you to optimize the time and financial costs and allows you to process more than 10 vascular allografts (in the form of arteries and veins with a wide range of internal diameters) with safe and convenient fastening and packaging, and also has other solutions for fastening and packaging of allografts depending on their quantity and type of donation. This allows you to make the routine collection of vessels for tissue engineering more effective, as they create the possibility of complex simultaneous cryopreservation and thawing of a large volume of material and, in addition, simplify the process itself. The method also has the adaptation of cryopreservation protocols, packaging, fastening and thawing for convenience and safety of further radiation sterilization. The method allows to minimize the damaging effect of radiation due to the indirect radioprotective action of PDMS and its hydrophobicity, ultra-low temperature conditions obtained promptly and safely, the presence of vacuum packaging and defrosting with antioxidant effects. In addition, the decellularization of vascular allografts after sterilization implies their multi-stage washing and does not need to preserve donor cellular material, therefore this method fully complies with the stated requirements for the material for decellularization, even if there are PDMS residues on the vessel walls after all the procedures. However, the results obtained make it possible to preserve more complex allografts with the cellular material of the recipient, which requires additional preclinical studies.
Практическая реализация способа способствует улучшению качества оказания медицинских услуг в ближайшей и отдаленной перспективе, в частности доступа обслуживающего персонала частных и государственных медицинских центров к донорскому материалу, в т.ч. биоинженерному, для трансплантации без необходимости в его длительной предварительной подготовки.The practical implementation of the method improves the quality of medical services in the short and long term, in particular, the access of service personnel of private and state medical centers to donor material, including bioengineering, for transplantation without the need for its long preliminary preparation.
При проведении анализа научно-технической литературы и периодики, а также после проведения патентных исследований на территории РФ и за ее пределами не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность технический решений, основанных на использовании ПДМС для охлаждения и разогрева биологических тканей, позволяющая получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, а, следовательно, заявленное изобретение соответствует критерию «новизна».When conducting an analysis of scientific and technical literature and periodicals, as well as after conducting patent research on the territory of the Russian Federation and abroad, a similar set of technical solutions based on the use of PDMS for cooling and warming biological tissues was not found that allows to obtain a technical result that has not previously been achieved by known means, and, therefore, the claimed invention meets the criterion of "novelty."
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
Сущность упаковок и крепления поясняется чертежом, где на фиг. 1 в разрезе приведены три варианта упаковки и крепления аллотрансплантатов.The essence of the packaging and fastening is illustrated by the drawing, where in FIG. 1 is a sectional view illustrating three packaging and attachment options for allografts.
Для схемы крепления аллотрансплантатов от одного донора (до 10-ти)For the scheme of attachment of allografts from one donor (up to 10)
1 - ярлыки с информацией об аллотрансплантатах1 - allograft information labels
2 - сосудистые аллотрансплантаты2 - vascular allografts
3 - держатель из пенопласта для упаковки3 - foam holder for packaging
4 - крышка для держателя из прозрачного пластика4 - cover for holder made of transparent plastic
5 - полая стерильная подложка из пластика5 - hollow sterile plastic substrate
6 - крышка для держателя с ярлыками (вид сбоку)6 - cover for the holder with labels (side view)
Для схемы крепления аллотрансплантатов от одного донора (до 3-х)For the scheme of attachment of allografts from one donor (up to 3)
7 - порт для вакуумизации7 - port for evacuation
8 - крышка и промежуточная емкость8 - cover and intermediate tank
9 - подложки из пластиковых или силиконовых трубок с диаметром меньше на 15% просвета аллотрансплантатов9 - substrates of plastic or silicone tubes with a diameter less than 15% of the clearance of allografts
10 - сосудистые аллотрансплантаты10 - vascular allografts
11 - заслонки для блокировки аллотрансплантата11 - shutters for blocking allograft
Для схемы индивидуального крепления аллотрансплантатов.For the scheme of individual attachment of allografts.
12 - подложка из силиконовой трубки с диаметром меньше на 15% просвета аллотрансплантантов12 - a substrate of silicone tube with a diameter less than 15% of the clearance of allografts
13 - пробирка на 50 мл13 - 50 ml tube
14 - заслонки для блокировки аллотрансплантата14 - shutters for blocking allograft
15 - сосудистый аллотрансплантат15 - vascular allograft
16 - порт для вакуумизации на дне пробирки16 - port for evacuation at the bottom of the tube
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017104903A RU2650694C1 (en) | 2017-02-15 | 2017-02-15 | Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017104903A RU2650694C1 (en) | 2017-02-15 | 2017-02-15 | Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2650694C1 true RU2650694C1 (en) | 2018-04-17 |
Family
ID=61976535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017104903A RU2650694C1 (en) | 2017-02-15 | 2017-02-15 | Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2650694C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783910C2 (en) * | 2021-04-30 | 2022-11-21 | Станислав Евгеньевич Лаук-Дубицкий | Method for producing a homograft of the cardiovascular system by means of cryo-conservation |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU651815A1 (en) * | 1977-01-28 | 1979-03-15 | Астраханский Государственный Медицинский Нститут Им. А.В.Луначарского | Method of sterilizing vascular allotransplants with simultaneous preservation |
| WO1989001286A1 (en) * | 1987-08-21 | 1989-02-23 | Cryolife, Inc. | Device and method for cryopreserving blood vessels |
| RU2134963C1 (en) * | 1997-07-30 | 1999-08-27 | Московский областной научно-исследовательский клинический институт (МОНИКИ) | Method of preservation of venous biological prosthesis |
| WO2000060935A1 (en) * | 1999-04-13 | 2000-10-19 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method of cryopreservation of blood vessels by vitrification |
| RU2178865C2 (en) * | 1995-01-30 | 2002-01-27 | Органодженисис Инк. | Method for cryopreservation of prepared tissue of mammalia or cultivated equivalent of tissue and device for its realization |
| RU2362299C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-27 | Яков Нахманович Львович | Bioorgans curing method |
-
2017
- 2017-02-15 RU RU2017104903A patent/RU2650694C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU651815A1 (en) * | 1977-01-28 | 1979-03-15 | Астраханский Государственный Медицинский Нститут Им. А.В.Луначарского | Method of sterilizing vascular allotransplants with simultaneous preservation |
| WO1989001286A1 (en) * | 1987-08-21 | 1989-02-23 | Cryolife, Inc. | Device and method for cryopreserving blood vessels |
| RU2178865C2 (en) * | 1995-01-30 | 2002-01-27 | Органодженисис Инк. | Method for cryopreservation of prepared tissue of mammalia or cultivated equivalent of tissue and device for its realization |
| RU2134963C1 (en) * | 1997-07-30 | 1999-08-27 | Московский областной научно-исследовательский клинический институт (МОНИКИ) | Method of preservation of venous biological prosthesis |
| WO2000060935A1 (en) * | 1999-04-13 | 2000-10-19 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method of cryopreservation of blood vessels by vitrification |
| RU2362299C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-27 | Яков Нахманович Львович | Bioorgans curing method |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783910C2 (en) * | 2021-04-30 | 2022-11-21 | Станислав Евгеньевич Лаук-Дубицкий | Method for producing a homograft of the cardiovascular system by means of cryo-conservation |
| RU2802139C1 (en) * | 2022-11-04 | 2023-08-22 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") | Method and an apparatus for sterilization of tendon transplants |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10271543B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| US8222027B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| EP2038402B1 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| ES2231804T3 (en) | METHOD AND DESIGN OF ENCAPSULATE FOR CRIOCONSERVATION AND STORAGE OF EQUIVALENTS OF CULTIVATED FABRIC. | |
| CA1310588C (en) | Method for cryopreserving heart valves | |
| Kearney | Guidelines on processing and clinical use of skin allografts | |
| US5879876A (en) | Continuous-multi-step dilution process and apparatus, for the removal of cryoprotectants from cryopreserved tissues | |
| RU2650694C1 (en) | Method of effective and safe cryopreservation of donor vascular grafts, ensuring the optimization of their further processing - radiation sterilization and decellularization | |
| CN112638157A (en) | Effective low-temperature storage device for preventing sample from directly contacting with extracellular ice | |
| JPWO2016111217A1 (en) | Hollow fiber cryopreservation tool and cell cryopreservation method | |
| US20170203002A1 (en) | Method for preparing mammalian tissue for storage, implant, and transplant | |
| Marquez-Curtis et al. | Protocol for cryopreservation of endothelial monolayers | |
| US20160015024A1 (en) | Method for Preparing Adipose Tissue | |
| RU2783910C2 (en) | Method for producing a homograft of the cardiovascular system by means of cryo-conservation | |
| Rendal et al. | Effects of cryopreservation and thawing on the structure of vascular segment | |
| AU2009200073B2 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| Chang et al. | Changes in mechanical, structural integrity and microbiological properties following cryopreservation of human cadaveric iliac arteries | |
| RU2794963C1 (en) | Method for optimizing cryopreservation of ovarian tissue for long-term storage | |
| Fleck et al. | Cell preservation | |
| Hopkins et al. | Allograft valve banking: techniques and technology | |
| Talwar | Semen Cryopreservation and Banking | |
| Hopkins et al. | Techniques and Technology: Storage, Transportation and Distribution, Thawing, Dilution, and Quality Systems | |
| Meana et al. | Cancellous bone homograft storage with aluminium-polyethylene bags | |
| Fatum et al. | Ovarian Tissue Cryopreservation | |
| UA115104U (en) | METHOD OF PREPARATION OF BONE MATRIX |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190216 |