RU2518681C2 - Регулирование продуктивных признаков у птиц - Google Patents
Регулирование продуктивных признаков у птиц Download PDFInfo
- Publication number
- RU2518681C2 RU2518681C2 RU2010100886/10A RU2010100886A RU2518681C2 RU 2518681 C2 RU2518681 C2 RU 2518681C2 RU 2010100886/10 A RU2010100886/10 A RU 2010100886/10A RU 2010100886 A RU2010100886 A RU 2010100886A RU 2518681 C2 RU2518681 C2 RU 2518681C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- rna
- sequence
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 81
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 64
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 43
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 42
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 27
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 9
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 101150078435 dmrt1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004712 air sac Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 15
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 12
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 101150048453 MSTN gene Proteins 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 7
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 7
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102100030068 Doublesex- and mab-3-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 101000864807 Homo sapiens Doublesex- and mab-3-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- -1 8-haloadenin Chemical compound 0.000 description 4
- 101000886557 Gallus gallus Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 101150004578 gdf-8 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100223985 Gallus gallus DMRT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 2
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710175516 14 kDa zinc-binding protein Proteins 0.000 description 1
- WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 2,8-diamino-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N=C(N)N2 WYDKPTZGVLTYPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 5-(trifluoromethyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound FC(F)(F)C1=CNC(=O)NC1=O LMNPKIOZMGYQIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2h-1,2,4-triazin-3-one Chemical compound NC=1C=NNC(=O)N=1 SVXNJCYYMRMXNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLGFIVUFZRGQRP-UHFFFAOYSA-N 7,8-dihydro-8-oxoguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1NC(=O)N2 CLGFIVUFZRGQRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034151 7SK RNA Proteins 0.000 description 1
- PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-6,8-diamine Chemical compound C1=NC(N)=C2NC(N)=NC2=N1 PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000271560 Casuariidae Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108700029720 DMRT1 Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000288049 Perdix perdix Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100021557 Protein kinase C iota type Human genes 0.000 description 1
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000220010 Rhode Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 101100277928 Xenopus laevis dmrt1-a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical group P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004096 skeletal muscle tissue growth Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical class S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000009752 translational inhibition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
- A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ изменения признака пола у птиц. Способ предусматривает введение в яйцо птицы молекулы РНК. Вводимая молекула РНК содержит двухцепочечную область и приводит к уменьшению в яйце уровня молекулы РНК и/или белка, вовлеченных в определение пола у птиц. Изобретение может быть использовано в птицеводстве. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам регулирования признаков, особенно продуктивных признаков, у птиц, таких как куры. В частности, изобретение относится к доставке in ovo молекулы дцРНК (dsRNA), особенно молекул миРНК (siRNA), для регулирования продуктивных признаков у имеющих коммерческое значение птиц.
Предшествующий уровень техники
Человек изменял фенотипические характеристики домашних животных путем селекции племенного поголовья на протяжении многих поколений с тех пор, как животные были одомашнены. Это привело к усовершенствованию количественных параметров продуктивности, таких как размеры тела и мышечная масса. Многие инновации последнего времени в области регулирования продуктивных признаков домашней птицы и/или повышения устойчивости к патогенам были сфокусированы на трансгенных подходах, однако многих потребителей беспокоит использование генетически модифицированных организмов.
Поставщики кур нуждались в эффективном экономичном способе определения пола однодневных цыплят. Различные поставщики использовали определение пола цыплят путем исследования клоаки и путем исследования оперения, однако данные способы оказались крайне экономически невыгодными, поскольку требовали значительных затрат времени и труда при разделении цыплят мужского и женского пола. Использование зондов (US 5508165) также является дорогостоящей процедурой и нецелесообразно с экономической точки зрения. Другим способом определения пола цыплят является просвечивание анальных областей цыплят (US 4417663), однако это тоже дорого и требует затрат времени, поскольку каждого цыпленка берут в руки для проведения процедуры. Используют экспертов, способных определять пол цыпленка по оперению, но такие эксперты обходятся дорого, и определение пола по оперению занимает много времени.
Существует потребность в способах регулирования продуктивных признаков у домашней птицы, которые не приведут к трансформации генома птицы, но могут быть интенсифицированы в процессе осуществления.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что введение подходящей молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область, в яйцо птицы может модифицировать фенотип развивающегося эмбриона.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу изменения признака у птицы, включающему введение в яйцо птицы по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область, где молекула нуклеиновой кислоты приводит к уменьшению уровня по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка в яйце.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изменения признака у птицы, включающему введение в яйцо птицы по меньшей мере одной молекулы РНК, содержащей двухцепочечную область, где молекула РНК приводит к уменьшению уровня по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка в яйце и где способ не включает электропорацию яйца.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу изменения признака у птицы, включающему введение в яйцо птицы по меньшей мере одной молекулы РНК, содержащей двухцепочечную область (дцРНК), где молекула РНК приводит к уменьшению уровня по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка в яйце и где молекулу РНК вводят в воздушный мешок, желточный мешок или аллантоисную жидкость хориона.
В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой дцРНК. Более предпочтительно, дцРНК представляет собой миРНК (siRNA) или мшРНК (shRNA).
В следующем предпочтительном варианте осуществления признак представляет собой продуктивный признак. Примеры продуктивных признаков включают, но не ограничиваются ими, мышечную массу или пол.
В одном из вариантов осуществления продуктивный признак представляет собой пол, и молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном DMRT1.
В одном из вариантов осуществления продуктивный признак представляет собой пол, и молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном WPKCI (ASW).
В другом варианте осуществления продуктивный признак представляет собой мышечную массу, и молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном миостатина.
Предпочтительно, молекулу нуклеиновой кислоты вводят инъекцией.
Птица может принадлежать к любому виду класса Aves. Примеры включают, но не ограничиваются ими, кур, уток, индеек, гусей, бентамок и перепелок. В особенно предпочтительном варианте осуществления птица представляет собой курицу.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к птице, полученной при помощи способа по изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к курице, полученной при помощи способа по изобретению.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной и/или экзогенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область, которая уменьшает уровень по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка при введении в яйцо птицы.
Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу дцРНК. Более предпочтительно, дцРНК представляет собой миРНК или мшРНК.
В одном из вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном DMRT1 или геном миостатина.
Также предложен вектор, кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты, или одну ее цепочку, по изобретению. Такие векторы можно использовать в клетке-хозяине или бесклеточной экспрессионной системе для получения молекул нуклеиновой кислоты, полезных для способа по изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты или одну ее цепочку по изобретению и/или вектор по изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или одну ее цепочку по изобретению, вектор по изобретению и/или клетку-хозяина по изобретению.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к яйцу птицы, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты или одну ее цепочку по изобретению, вектор по изобретению и/или клетку-хозяина по изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты или одну ее цепочку по изобретению, вектор по изобретению, клетку-хозяина по изобретению и/или композицию по изобретению.
Очевидно, что предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта применимы ко многим другим аспектам изобретения.
На протяжении всего описания слово «содержать» или его вариации, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного элемента, числа или этапа либо группы элементов, чисел или этапов, но не исключение любого другого элемента, числа или этапа либо группы элементов, чисел или этапов.
Далее в данном документе изобретение описано при помощи следующих не ограничивающих примеров со ссылками на сопроводительные фигуры.
Краткое описание сопроводительных рисунков
Фигура 1 - ПЦР экспрессионных полигенных кластеров мшРНК. Схематичное изображение стратегии ПЦР, используемой для получения экспрессионных векторов мшРНК. В ПЦР использовали прямые праймеры в паре с обратными праймерами, с включением всех компонентов мшРНК. Все конечные продукты ПЦР состояли из промотора U6 кур, смысловой последовательности мшРНК, петли, антисмысловой последовательности мшРНК, последовательности терминации и сайта XhoI.
Фигура 2 - Тестирование выбранных молекул мшРНК на нокдаун экспрессии слитого гена EGFP-Dmrt1. Средняя интенсивность флуоресценции для каждого состояния трансфекции выражена относительно pEGFP-Dmrt1. Планки погрешностей отражают стандартную ошибку, вычисленную для каждого отдельного эксперимента, выполненного в трех повторах.
Фигура 3 - Тестирование выбранных молекул мшРНК на нокдаун экспрессии слитого гена EGFP-Gdf8. Клетки DF1 трансфицировали: панель 1, только pEGFP-C; панель 2, только транскрипционная слитая конструкция pEGFP-Gdf8; панели 3-6 pEGFP-Gdf8 либо с pshEGFP либо с экспрессионными плазмидами мшРНК, специфических для Gdf8, pshGdf8-258, pshGdf8-913 и pshGdf8-1002. Микроскопическое исследование выполняли с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM LB (Leica Microsystems, Germany) и изображения фиксировали при 50× увеличении, используя цветную цифровую камеру Leica DC300F (Leica Microsystems, Germany) и программное обеспечение для обработки изображений Photoshop 7.0 (Adobe®).
Ключ к списку последовательностей
SEQ ID №:1 - куриный миостатин (Genbank NM_001001461).
SEQ ID №:2 - нуклеотидная последовательность, кодирующая куриный миостатин (Genbank NM_001001461).
SEQ ID №:3 - частичная последовательность куриного белка DMRT1 (Genbank AF 123456).
SEQ ID №:4 - частичная нуклеотидная последовательность, кодирующая куриный DMRT1 (Genbank AF123456).
SEQ ID №:5 - куриный WPKCI (ASW) (Genbank AF148455).
SEQ ID №:6 - нуклеотидная последовательность, кодирующая куриный WPKCI (ASW) (Genbank AF148455).
SEQ ID №: 7 - нуклеотидная последовательность промотора U6-1 кур.
SEQ ID №: 8 - нуклеотидная последовательность промотора U6-3 кур.
SEQ ID №: 9 - нуклеотидная последовательность промотора U6-4 кур.
SEQ ID №: 10 - нуклеотидная последовательность промотора 7SK кур.
SEQ ID №№ 11-98 и 113-122 - последовательности РНК, применимые по изобретению.
SEQ ID №№ 99-112 - олигонуклеотидные праймеры.
Подробное описание изобретения
Общие методы и определения
Если специально не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, следует воспринимать как имеющие общепринятое в данной области значение (например, в культуре клеток, молекулярная генетика, биология птиц, РНК-интерференция и биохимия).
Если специально не указано иное, получение рекомбинантных белков, культивирование клеток и иммунологические методы, используемые по настоящему изобретению, являются стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методы описаны и разъяснены в таких литературных источниках, как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (издатель), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, тома 1 и 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (издатели), DNA Cloning: A Practical Approach, тома 1-4, IRL Press (1995 и 1996) и F.M. Ausubel et al. (издатели), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все переиздания до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (издатели).
Термин «птичий» в данном документе относится к любым видам, подвидам или родам организмов из таксономического класса Aves, таким как, но не ограничиваясь ими, куры, индейки, утки, гуси, перепелки, фазаны, попугаи, вьюрки, ястребы, вороны и бескилевые птицы, включая страуса эму и казуара. Термин охватывает различные известные породы Gallus gallus (куры), например, белый леггорн, бурый леггорн, полосатый плимутрок, суссекс, нью-гемпшир, род-айленд, австралорп, корниш, минорка, амрокс, калифорнийская серая, итальянские куропаточные, а также породы индеек, фазанов, перепелок, уток, страусов и другой домашней птицы, обычно разводимой в коммерчески значимых количествах.
В данном документе термин «яйцо» означает оплодотворенную яйцеклетку, отложенную птицей. Как правило, птичьи яйца состоят из твердой овальной внешней скорлупы, «яичного белка» или альбумина, яичного желтка и различных тонких мембран. Кроме того, «in ovo» означает «в яйце».
Термины «уменьшает», «уменьшение» или их вариации в данном документе означают ощутимое уменьшение количества целевой РНК и/или целевого белка в яйце по сравнению с яйцом того же вида птиц, более предпочтительно, рода или породы птиц, и даже более предпочтительно, той же самой птицы, которой не вводили нуклеиновую кислоту, как определено в данном документе. Термин также относится к ощутимому снижению активности целевого белка. Предпочтительно, уменьшение уровня целевой РНК и/или целевого белка составляет по меньшей мере примерно 10%. Более предпочтительно, уменьшение составляет по меньшей мере примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90% и, даже более предпочтительно, примерно 100%.
В данном документе фраза «молекула нуклеиновой кислоты приводит к уменьшению» или ее вариации означают присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в яйце, которое вызывает деградацию гомологичных молекул РНК в яйце в результате процесса, известного в данной области как «РНК-интерференция» или «выключение гена». Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты напрямую приводит к уменьшению и не транскрибируется in ovo, вызывая желаемый эффект.
«По меньшей мере одна молекула РНК» может представлять собой любой тип РНК, присутствующий в яйце птиц и/или продуцируемый им. Примеры включают, но не ограничиваются ими, мРНК, кяРНК (snRNA), микроРНК и тРНК.
В данном документе термин «продуктивный признак» относится к любому фенотипическому признаку птиц, который имеет коммерческую ценность, такому как мышечная масса, пол и пищевая ценность.
В данном документе термин «мышечная масса» означает вес мышечной ткани. Увеличение мышечной массы можно определять путем взвешивания всей мышечной ткани птицы, которая высижена из яйца, обработанного, как описано в данном документе, по сравнению с птицей из того же вида птиц, более предпочтительно, рода или породы птиц, и даже более предпочтительно, с той же птицей, которой не вводили нуклеиновую кислоту, как указано в данном документе. Альтернативно, специфические мышцы, такие как мышцы грудки и/или лап, можно использовать для выявления увеличения мышечной массы. Предпочтительно, способы по изобретению увеличивают мышечную массу по меньшей мере примерно на 1%, 2,5%, 5%, 7,5% и, даже более предпочтительно, примерно на 10%.
«Вариант» молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению включает молекулы варьирующих размеров и/или с одним или большим количеством отличающихся нуклеотидов, но которые все еще можно использовать для выключения целевого гена. Например, варианты могут содержать дополнительные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4 или более) либо меньшее количество нуклеотидов. Кроме того, несколько нуклеотидов могут быть заменены без влияния на способность нуклеиновой кислоты выключать целевой ген. В одном из вариантов осуществления вариант содержит дополнительные 5' и/или 3' нуклеотиды, которые гомологичны соответствующей целевой молекуле РНК и/или которые повышают стабильность молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты имеют не более чем 4, более предпочтительно, не более чем 3, более предпочтительно, не более чем 2 и, даже более предпочтительно, не более чем 1 различие в нуклеотидах по сравнению с предложенной в данном документе последовательностью. В следующем варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты имеют не более чем 2, и более предпочтительно, не более чем 1, внутренних дополнительных и/или делетированных нуклеотидов по сравнению с последовательностями, предложенными в данном документе.
Под «выделенной молекулой нуклеиновой кислоты» авторы изобретения понимают молекулу нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере частично, отделена от молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она ассоциирована или связана в своем естественном состоянии. Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 60% свободна, предпочтительно, по меньшей мере на 75% свободна и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 90% свободна от других компонентов, с которыми она ассоциирована в естественном состоянии. Кроме того, термин «полинуклеотид» в данном документе используется взаимозаменяемо с термином «нуклеиновая кислота».
Термин «экзогенный» в контексте молекулы нуклеиновой кислоты означает молекулу нуклеиновой кислоты, присутствующую в клетке или в бесклеточной экспрессионной системе в измененных количествах. Предпочтительно, клетка представляет собой клетку, которая обычно не содержит данную молекулу нуклеиновой кислоты. Однако клетка может представлять собой клетку, которая содержит экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты вследствие повышенного количества молекулы нуклеиновой кислоты. Экзогенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые не были отделены от других компонентов рекомбинантной клетки или бесклеточной экспрессионной системы, в которой они присутствуют, и молекулы нуклеиновой кислоты, продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах, которые затем очищают, по меньшей мере, от некоторых других компонентов.
Выключение генов (Gene silencing)
Термины «РНК-интерференция», «РНКи» или «выключение генов», в основном, относятся к процессу, при котором молекула двухцепочечной РНК (дцРНК) (dsRNA) уменьшает экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, с которой молекула двухцепочечной РНК обладает существенной или полной гомологией. Однако недавно показано, что выключения гена можно достичь, используя двухцепочечные молекулы не-РНК (смотрите, например, US 20070004667).
РНК-интерференция (РНКи) особенно полезна для специфического ингибирования продукции конкретной РНК и/или белка. Хотя и без намерения ограничиваться теорией, Waterhouse et al. (1998) предложили модель для механизма, посредством которого дцРНК (дуплексную РНК) можно использовать для уменьшения продукции белка. Данная методика основана на присутствии молекул дцРНК, которые содержат последовательность, которая в основном идентична мРНК интересующего гена или его части, в данном случае мРНК, кодирующей полипептид по изобретению. Удобно получать дцРНК с одного промотора в рекомбинантном векторе или клетке-хозяине, где смысловые и антисмысловые последовательности фланкированы посторонней последовательностью, которая позволяет смысловым и антисмысловым последовательностям гибридизоваться с образованием молекулы дцРНК с посторонней последовательностью, образующей петлевую структуру. Разработка и получение подходящих молекул дцРНК для настоящего изобретения вполне находится в компетенции специалиста в данной области, особенно принимая во внимание Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 и WO 01/34815.
Настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие и/или кодирующие двухцепочечные области для выключения генов. Молекулы нуклеиновой кислоты, как правило, представляют собой РНК, но могут представлять собой ДНК, химически модифицированные нуклеотиды и не нуклеотиды.
Двухцепочечные области должны быть длиной по меньшей мере 19 последовательных нуклеотидов, например примерно 19-23 нуклеотида, либо могут быть длиннее, например 30 или 50 нуклеотидов или 100 нуклеотидов или более. Можно использовать полноразмерную последовательность, соответствующую полному транскрипту гена. Предпочтительно, они составляют примерно от 19 примерно до 23 нуклеотидов в длину.
Степень идентичности двухцепочечной области молекулы нуклеиновой кислоты целевому транскрипту должна составлять по меньшей мере 90% и, более предпочтительно, 95-100%. Процент идентичности молекулы нуклеиновой кислоты определяют при помощи GAP (Needleman and Wunsch, 1970) анализа (программа GCG) со штрафом за создание разрыва в последовательности = 5 и со штрафом за удлинение разрыва = 0,3. Предпочтительно, две последовательности выравнивают по всей их длине.
Безусловно, молекула нуклеиновой кислоты может содержать посторонние последовательности, которые могут служить для стабилизации молекулы.
Термин «малая интерферирующая РНК» или «миРНК» в данном документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит рибонуклеотиды, способные ингибировать или регулировать в сторону уменьшения экспрессию генов, например, опосредуя РНКи специфическим для последовательности образом, в которой двухцепочечная область составляет менее 50 нуклеотидов в длину, предпочтительно, примерно от 19 примерно до 23 нуклеотидов в длину. Например, миРНК может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую самокомплементарные смысловую и антисмысловую области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую целевой последовательности нуклеиновой кислоты или ее части. Молекула миРНК может быть собрана из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна цепочка представляет собой смысловую цепочку, а другая представляет собой антисмысловую цепочку, где антисмысловая и смысловая цепочки являются самокомплементарными.
В данном документе термин миРНК предназначен быть эквивалентным другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны опосредовать специфичную для последовательности РНКи, например, микроРНК (микроРНК), малая [короткая] шпилечная РНК (мшРНК), малый [короткий] интерферирующий олигонуклеотид, малая [короткая] интерферирующая нуклеиновая кислота (миНК) (siNA), малый интерферирующий модифицированный олигонуклеотид, химически модифицированная миРНК, посттранскипционная выключающая ген РНК (птвгРНК) (ptgsRNA) и другие. Кроме того, как используют в данном документе, термин РНКи предназначен быть эквивалентным другим терминам, используемым для описания специфической для последовательности РНК-интерференции, таким как посттранскипционное выключение гена, трансляционное ингибирование или эпигенетика. Например, молекулы миРНК по изобретению можно использовать для эпигенетического выключения генов как на посттранскипционном уровне, так и на претранскрипционном уровне. В не ограничивающем примере эпигенетическая регуляция экспрессии гена при помощи молекул миРНК по изобретению может происходить в результате опосредованной миРНК модификации структуры хроматина для изменения экспрессии гена.
Предпочтительные молекулы малой интерферирующей РНК («миРНК») содержат нуклеотидную последовательность, которая идентична примерно 19-23 последовательным нуклеотидам целевой мРНК. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность целевой мРНК начинается с динуклеотида AA, имеет содержание GC примерно 30-70% (предпочтительно, 30-60%, более предпочтительно, 40-60%, и более предпочтительно, примерно 45%-55%) и не обладает высоким процентом идентичности с любой нуклеотидной последовательностью, отличной от целевой последовательности, в геноме птицы (предпочтительно, кур), которой ее будут вводить, например, как определяют стандартным поиском BLAST.
Под «мшРНК» или «малой шпилечной РНК» подразумевают молекулу миРНК, где менее чем примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно, примерно от 19 примерно до 23 нуклеотидов образуют пары оснований с комплементарной последовательностью, расположенной на той же молекуле РНК, и где указанная последовательность и комплементарная последовательность разделены не спаренной областью из по меньшей мере примерно 4-15 нуклеотидов, которая образует одноцепочечнную петлю над «стеблевой» структурой, созданной двумя областями комплементарных оснований. Примерами последовательностей одноцепочечных петель являются 5' UUCAAGAGA 3' и 5' UUUGUGUAG 3'.
В мшРНК включены двойные или двухпальцевые и многопальцевые шпилечные дцРНК, в которых молекула РНК содержит две или более такие структуры типа «стебель с петлей», разделенные одноцепочечными спейсерными областями.
Существуют устоявшиеся критерии для проектирования миРНК (смотрите, например, Elbashire et al., 2001; Amarzguioui et al., 2004; Reynolds et al., 2004). Подробности можно найти на сайтах некоторых коммерческих поставщиков, таких как Ambion, Dharmacon, GenScript и OligoEngine. Как правило, следует получать и проводить скрининг ряда миРНК для сравнения их эффективности.
После проектирования дцРНК для использования в способе по настоящему изобретению можно получать любым способом, известным в данной области, например путем in vitro транскрипции, рекомбинантными или синтетическими методами. миРНК можно получать in vitro с использованием рекомбинантного фермента, такого как РНК-полимераза T7, и олигонуклеотидных матриц ДНК, либо можно получать in vivo, например, в культивируемых клетках. В предпочтительном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты получают синтетическими методами.
Кроме того, описаны стратегии для получения шпилечных миРНК из векторов, содержащих, например, промотор РНК-полимеразы III. Сконструированы различные векторы для получения шпилечных миРНК в клетках-хозяевах с использованием промотора либо H1-РНК, либо кяU6 (snU6) РНК (смотри SEQ ID №№ 7-9). Молекулу РНК, описанную выше (например, первая часть, связывающая последовательность и вторая часть), можно функционально связывать с таким промотором. При транскрибировании РНК-полимеразой III первая и вторая части образуют дуплексный стебель шпильки, а связывающая последовательность образует петлю. Вектор pSuper (OligoEngines Ltd., Seattle, Wash) также можно использовать для получения миРНК.
Для улучшения свойств молекул нуклеиновой кислоты по изобретению можно вводить модификации или аналоги нуклеотидов. Улучшенные свойства включают повышенную устойчивость к нуклеазе и/или повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Соответственно, термины «молекула нуклеиновой кислоты» и «двухцепочечная молекула РНК» охватывают синтетически модифицированные основания, такие как, но не ограничиваясь ими, инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галоурацил, 5-галоцитозин, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиурацил, 8-галоаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиолалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.
Признаки. Конкретные продуктивные признаки и ответственные за них гены
Способы по изобретению можно использовать для изменения любого признака у видов птиц, особенно признаков, определяемых или подвергающихся влиянию в то время, когда эмбрион развивается в яйце. Предпочтительными признаками, которые можно изменять, являются пол и мышечная масса.
В одном из вариантов осуществления продуктивным признаком является пол, и молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном DMRT1. DMRT1 являлся первой молекулой, вовлеченной в определение пола, которая демонстрирует консервативность последовательности среди таксонометрических типов. Птичий гомолог DMRT1 находится на Z (половой) хромосоме кур и дифференциально экспрессируется в генитальном гребне куриных эмбрионов мужского и женского пола (Raymond et al., 1999; Smith et al., 1999). До настоящего времени DMRT1 является одним из немногочисленных генов, вовлеченных в определение пола у млекопитающих, который, по всей видимости, имеет строго гонадный паттерн экспрессии (Raymond et al., 1999).
Примеры молекул нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для уменьшения уровня куриного белка DMRT1, включают, но не ограничиваются ими, те, которые содержат по меньшей мере одну из следующих нуклеотидных последовательностей:
CCAGUUGUCAAGAAGAGCA (SEQ ID №:11)
GGAUGCUCAUUCAGGACAU (SEQ ID №:12)
CCCUGUAUCCUUACUAUAA (SEQ ID №:13)
GCCACUGAGUCUUCCUCAA (SEQ ID №:14)
CCAGCAACAUACAUGUCAA (SEQ ID №:15)
CCUGCGUCACACAGAUACU (SEQ ID №:16)
GGAGUAGUUGUACAGGUUG (SEQ ID №:17)
GACUGGCUUGACAUGUAUG (SEQ ID №:18)
AUGGCGGUUCUCCAUCCCU (SEQ ID №:19)
или вариант любой из них.
В особенно предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для уменьшения уровня куриного белка DMRT1, содержат последовательность GCCACUGAGUCUUCCUCAA (SEQ ID №: 14) или ее вариант.
Следующим примером гена, который может являться мишенью воздействия для изменения пола как продуктивного признака, является ген WPKCI. Показано, что птичий ген WPKCI высококонсервативно расположен на хромосоме W птиц и активно экспрессируется в курином эмбрионе женского пола перед началом гонадной дифференциации. Предполагают, что WPKCI может играть роль в дифференциации женских гонад, интерферируя с функцией PKCI или проявляя свою уникальную функцию в ядре (Hori et al., 2000). Этот ген также идентифицирован как ASW (птичий специфичный для пола W-связанный) (O'Neill et al., 2000).
В другом варианте осуществления продуктивным признаком является мышечная масса, и молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном миостатина. Миостатин, также называемый «фактором роста и дифференциации 8» (GDF8), представляет собой недавно открытый член суперсемейства TGFβ. Показано, что мРНК и белок миостатина экспрессируется в скелетной мышце, сердце и молочной железе. Целевое разрушение гена миостатина у мышей и мутация в третьем экзоне гена миостатина у массивного крупного рогатого скота породы бельгийская голубая, у которого экспрессируется нефункциональный белок миостатин, приводит к увеличению мышечной массы. Таким образом, миостатин является отрицательным регулятором роста скелетных мышц.
Примеры молекул нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для уменьшения уровня куриного белка миостатина, включают, но не ограничиваются ими, те, которые содержат по меньшей мере одну из следующих нуклеотидных последовательностей:
AAGCUAGCAGUCUAUGUUU (SEQ ID №:20)
GCUAGCAGUCUAUGUUUAU (SEQ ID №:21)
CGCUGAAAAAGACGGACUG (SEQ ID №:22)
AAAGACGGACUGUGCAAUG (SEQ ID №:23)
AGACGGACUGUGCAAUGCU (SEQ ID №:24)
UGCUUGUACGUGGAGACAG (SEQ ID №:25)
UACAAAAUCCUCCAGAAUA (SEQ ID №:26)
AAUCCUCCAGAAUAGAAGC (SEQ ID №:27)
UCCUCCAGAAUAGAAGCCA (SEQ ID №:28)
UAGAAGCCAUAAAAAUUCA (SEQ ID №:29)
GCCAUAAAAAUUCAAAUCC (SEQ ID №:30)
AAAUUCAAAUCCUCAGCAA (SEQ ID №:3l)
AUUCAAAUCCUCAGCAAAC (SEQ ID №:32)
AUCCUCAGCAAACUGCGCC (SEQ ID №:33)
ACUGCGCCUGGAACAAGCA (SEQ ID №:34)
CAAGCACCUAACAUUAGCA (SEQ ID №:35)
GCACCUAACAUUAGCAGGG (SEQ ID №:36)
CAUUAGCAGGGACGUUAUU (SEQ ID №:37)
GCAGCUUUUACCCAAAGCU (SEQ ID №:38)
UUCCUGCAGUGGAGGAGCU (SEQ ID №:39)
CUGAUUGAUCAGUAUGAUG (SEQ ID №:40)
GACGAUGACUAUCAUGCCA (SEQ ID №:41)
CCGAGACGAUUAUCACAAU (SEQ ID №:42)
UGCCUACGGAGUCUGAUUU (SEQ ID №:43)
AUGGAGGGAAAACCAAAAU (SEQ ID №:44)
AACCAAAAUGUUGCUUCUU (SEQ ID №:45)
CCAAAAUGUUGCUUCUUUA (SEQ ID №:46)
AAUGUUGCUUCUUUAAGUU (SEQ ID №:47)
UGUUGCUUCUUUAAGUUUA (SEQ ID №:48)
GUUUAGCUCUAAAAUACAA (SEQ ID №:49)
AAUACAAUAUAACAAAGUA (SEQ ID №:50)
UACAAUAUAACAAAGUAGU (SEQ ID №:51)
UAUAACAAAGUAGUAAAGG (SEQ ID №:52)
CAAAGUAGUAAAGGCACAA (SEQ ID №:53)
AGUAGUAAAGGCACAAUUA (SEQ ID №:54)
AGGCACAAUUAUGGAUAUA (SEQ ID №:55)
UUAUGGAUAUACUUGAGGC (SEQ ID №:56)
GUCCAAAAACCUACAACGG (SEQ ID №:57)
AAACCUACAACGGUGUUUG (SEQ ID №:58)
ACCUACAACGGUGUUUGUG (SEQ ID №:59)
CGGUGUUUGUGCAGAUCCU (SEQ ID №:60)
GCCCAUGAAAGACGGUACA (SEQ ID №:61)
AGACGGUACAAGAUAUACU (SEQ ID №:62)
GAUAUACUGGAAUUCGAUC (SEQ ID №:63)
UUCGAUCUUUGAAACUUGA (SEQ ID №:64)
ACUUGACAUGAACCCAGGC (SEQ ID №:65)
CCCAGGCACUGGUAUCUGG (SEQ ID №:66)
GACAGUGCUGCAAAAUUGG (SEQ ID №:67)
AAUUGGCUCAAACAGCCUG (SEQ ID №:68)
UUGGCUCAAACAGCCUGAA (SEQ ID №:69)
ACAGCCUGAAUCCAAUUUA (SEQ ID №:70)
UCCAAUUUAGGCAUCGAAA (SEQ ID №:71)
UUUAGGCAUCGAAAUAAAA (SEQ ID №:72)
AUAAAAGCUUUUGAUGAGA (SEQ ID №:73)
AAGCUUUUGAUGAGACUGG (SEQ ID №:74)
GCUUUUGAUGAGACUGGAC (SEQ ID №:75)
GAUGGAUUGAACCCAUUUU (SEQ ID №:76)
CCCAUUUUUAGAGGUCAGA (SEQ ID №:77)
ACGGUCCCGCAGAGAUUUU (SEQ ID №:78)
CGGAAUCCCGAUGUUGUCG (SEQ ID №:79)
UCCAGUCCCAUCCAAAAGC (SEQ ID №:80)
GCUUUUGGAUGGGACUGGA (SEQ ID №:81)
AAGAUACAAAGCCAAUUAC (SEQ ID №:82)
GAUACAAAGCCAAUUACUG (SEQ ID №:83)
AGCCAAUUACUGCUCCGGA (SEQ ID №:84)
UUACUGCUCCGGAGAAUGC (SEQ ID №:85)
UGCGAAUUUGUGUUUCUAC (SEQ ID №:86)
CAGGUGAGUGUGCGGGUAU (SEQ ID №:87)
AUACCCGCACACUCACCUG (SEQ ID №:88)
GCAAAUCCCAGAGGUCCAG (SEQ ID №:89)
AUCCCAGAGGUCCAGCAGG (SEQ ID №:90)
GAUGUCCCCUAUAAACAUG (SEQ ID №:91)
ACAUGCUGUAUUUCAAUGG (SEQ ID №:92)
UGGAAAAGAACAAAUAAUA (SEQ ID №:93)
AAGAACAAAUAAUAUAUGG (SEQ ID №:94)
GAACAAAUAAUAUAUGGAA (SEQ ID №:95)
CAAAUAAUAUAUGGAAAGA (SEQ ID №:96)
AUAAUAUAUGGAAAGAUAC (SEQ ID №:97)
UAUAUGGAAAGAUACCAGC (SEQ ID №:98)
CCAGAAUAGAAGCCAUAAA (SEQ ID №:113)
GCACAAUUAUGGAUAUACU (SEQ ID №:114)
GUACAAGAUAUACUGGAAU (SEQ ID №:115)
CCUAUAAACAUGCUGUAUU (SEQ ID №:116)
GCGAAUUUGUGUUUCUACA (SEQ ID №:117)
GAGUAUUGAUGUGAAGACA (SEQ ID №:118)
CCUCCAGAAUAGAAGCCAU (SEQ ID №:119)
GGUCAGAGUUACAGACACA (SEQ ID №:120)
CAGUGGAUUUCGAAGCUUU (SEQ ID №:121)
CAACGGUGUUUGUGCAGAU (SEQ ID №:122)
или вариант любой из них.
В особенно предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для уменьшения уровня куриного белка миостатина, содержат последовательность CAGGUGAGUGUGCGGGUAU (SEQ ID №:87) или ее вариант.
Векторы и клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к вектору, кодирующему молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую двухцепочечную область или ее одну цепочку, по настоящему изобретению. Предпочтительно, вектор представляет собой экспрессионный вектор, способный экспрессировать открытую рамку(ки) считывания, кодирующую дцРНК, в клетке-хозяине и/или бесклеточной системе. Клетка-хозяин может представлять собой клетку любого типа, такие как, но не ограничиваясь ими, клетки бактерий, грибов, растений или животных.
Как правило, вектор по изобретению содержит промотор, функционально связанный с открытой рамкой считывания, кодирующей молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или ее цепочку.
В данном документе термин «промотор» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна направлять транскрипцию функционально связанной молекулы нуклеиновой кислоты и включает, например, промоторы РНК-полимеразы II и РНК-полимеразы III. Данное определение также охватывает такие регуляторные элементы транскрипции (например, энхансеры), которых достаточно для осуществления зависимой от промотора экспрессии гена, контролируемой специфическим для клеточного типа, специфическим для ткани или временным образом, либо которые индуцируются внешними агентами или сигналами.
В данном документе «функционально связанный» означает функциональную взаимосвязь между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Как правило, это означает функциональную взаимосвязь регуляторного элемента транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как открытая рамка считывания, кодирующая двухцепочечную молекулу РНК, описанную в данном документе, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке. В основном, промоторные регуляторные элементы транскрипции, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически расположены рядом с транскрибируемой последовательностью, то есть они действуют в цис-положении. Однако некоторые регуляторные элементы транскрипции, такие как энхансеры, не обязательно должны физически находиться рядом или неподалеку от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они усиливают.
Под «промотором РНК-полимеразы III» или «промотором РНК-пол III» или «промотором полимеразы III» или «промотором пол III» понимают любой промотор беспозвоночных, позвоночных или млекопитающих, например кур, людей, мышей, свиней, крупного рогатого скота, приматов, обезьян и так далее, который в природе в клетке связывается или взаимодействует с РНК-полимеразой III для транскрибирования его функционально связанного гена либо его любого варианта, природного или созданного искусственно, который будет взаимодействовать в выбранной клетке-хозяине с РНК-полимеразой III для транскрибирования функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты. Под промотором U6 (например, U6 кур, U6 человека, U6 мыши), промотором H1 или промотором 7SK понимают любой промотор беспозвоночных, позвоночных или млекопитающих либо полиморфный вариант или мутант, существующий в природе, для взаимодействия с РНК-полимеразой III для транскрибирования продукта его родственной РНК, то есть РНК U6, РНК H1 или РНК 7SK, соответственно. Примеры подходящих промоторов включают cU6-1 (SEQ ID №:7), cU6-3 (SEQ ID №:8), cU6-4 (SEQ ID №:9) и c7SK (SEQ ID №:10).
Если в качестве клетки-хозяина используют E. coli, не существует никаких ограничений, за исключением того, что вектор должен иметь «ori» для амплификации и массовой продукции вектора в E. coli (например, JM109, DH5α, HB101 или XL1Blue) и маркерный ген для отбора трансформированных клеток E. coli (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый при помощи лекарственного средства, такого как ампициллин, тетрациклин, канамицин или хлорамфеникол). Например, можно использовать векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script и тому подобные. pGEM-T, pDIRECT, pT7 и тому подобные также можно использовать для субклонирования и вырезания гена, кодирующего дцРНК, так же, как и векторы, описанные выше.
Что касается экспрессионных векторов для использования в E. coli, то такие векторы включают JM109, DH5α, HB101 или XL1Blue, вектор должен иметь промотор, такой как промотор lacZ, промотор araB или промотор T7, который может эффективно способствовать экспрессии нужного гена в E. coli. Другими примерами векторов являются «QIAexpress system» (Qiagen), pEGFP и pET (для данного вектора в качестве хозяина предпочтительно использовать BL21, штамм, экспрессирующий РНК-полимеразу T7).
Помимо векторов для E. coli, вектор, например, может представлять собой экспрессионный вектор млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS, pEF и pCDM8), экспрессионный вектор из клеток насекомых (например, «бакуловирусная экспрессионная система Bac-to-BAC» (GibcoBRL) и pBacPAK8), экспрессионный вектор из растений (например, pMH1 и pMH2), экспрессионный вектор из вирусов животных (например, pHSV, pMV и pAdexLcw), экспрессионный вектор из ретровирусов (например, pZIPneo), экспрессионный вектор из дрожжей (например, набор «Pichia Expression Kit» (Invitrogen), pNV11 и SP-Q01), экспрессионный вектор из Bacillus subtilis (например, pPL608 и pKTH50).
Для того чтобы экспрессировать молекулы нуклеиновой кислоты в клетках животных, таких как клетки CHO, COS, Vero и NIH3T3, вектор должен иметь промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например промотор SV40, промотор MMLV-LTR, промотор EF1α, промотор CMV и так далее, и, более предпочтительно, он имеет маркерный ген для отбора трансформантов (например, ген устойчивости к лекарственному средству, отбираемый при помощи лекарственного средства (например, неомицина, G418 и так далее)).
Примеры векторов с такими характеристиками включают pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие двухцепочечную область, по настоящему изобретению можно экспрессировать в животных, например, путем встраивания открытой рамки(ок) считывания, кодирующей(их) нуклеиновую кислоту, в соответствующий вектор и введения вектора ретровирусным способом, липосомным способом, катионно-липосомным способом, аденовирусным способом и так далее. Используемые векторы включают, но не ограничиваются ими, аденовирусные векторы (например, pAdexlcw) и ретровирусные векторы (например, pZIPneo). Общие способы манипуляций с генами, такие как встраивание нуклеиновых кислот по изобретению в вектор, можно осуществлять общепринятыми методами.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, в которую введена экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, как правило, в векторе по настоящему изобретению. Клетку-хозяина по данному изобретению можно использовать в качестве, например, продуцирующей системы для продуцирования или экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. Для продукции in vitro можно использовать эукариотические клетки или прокариотические клетки.
Полезными эукариотическими клетками-хозяевами могут являться клетки животных, растений или грибов. В качестве животных клеток можно использовать клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, COS, 3T3, миеломы, почки новорожденного хомячка (BHK), HeLa или клетки Vero, клетки MDCK, клетки DF1, клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus, или клетки насекомых, такие как клетки Sf9, Sf21 или Tn5. Можно использовать клетки CHO, лишенные гена DHFR (dhfr-CHO), или CHO K-1. Вектор можно вводить в клетку-хозяина, например, при помощи кальций-фосфатного способа, ДЭАЭ-декстранового способа, катионно-липосомного способа DOTAP (Boehringer Mannheim), электропорации, липофекции и так далее.
Полезные прокариотические клетки включают клетки бактерий, такие как E. coli, например, JM109, DH5a и HB101, или Bacillus subtilis.
Для клеток млекопитающих можно использовать культуральную среду, такую как DMEM, MEM, RPMI-1640 или IMDM. Культуральную среду можно использовать с сывороточной добавкой, такой как фетальная телячья сыворотка ((FCS), или без нее. Значения pH культуральной среды предпочтительно составляют примерно от 6 до 8. Как правило, клетки культивируют примерно при 30-40°C в течение примерно 15-200 час, и культуральную среду при необходимости можно заменять, аэрировать или перемешивать.
Композиции
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую двухцепочечную область, которые можно вводить в яйцо птиц. Композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую двухцепочечную область, может включать фармацевтически приемлемый носитель, делающий композицию пригодной для введения.
Подходящие фармацевтические носители, эксципиенты и/или разбавители включают, но не ограничиваются ими, лактозу, сахарозу, порошковый крахмал, порошковый тальк, целлюлозные сложные эфиры алкановых кислот, стеарат магния, оксид магния, кристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, желатин, глицерин, альгинат натрия, антибактериальные средства, противогрибковые средства, гуммиарабик, аравийскую камедь, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, поливинилпирролидон и/или поливиниловый спирт, физиологический раствор и воду. В одном из вариантов осуществления носитель, эксципиент и/или разбавитель представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор или воду.
Композиция может также содержать способствующее трансфекции средство. Способствующие трансфекции средства, используемые для облегчения поглощения нуклеиновых кислот живой клеткой, хорошо известны в данной области. Реагенты, усиливающие трансфекцию, включают химические семейства типа поликатионов, дендримеров, ДЭАЭ-декстран, блок-сополимеры и катионные липиды. Предпочтительно, способствующее трансфекции средство представляет собой содержащее липид соединение (или препарат), создающее положительно заряженную гидрофильную область и ацильную гидрофобную область, делающие возможной самосборку в водном растворе в пузырьки, известные как мицеллы или липосомы, а также как липополиамины.
Очевидно, что можно использовать любую общепринятую среду или средство, при условии, что они не являются несовместимыми с композициями или способами по изобретению.
Введение
Введение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область (включая композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую двухцепочечную область), обычно осуществляют путем инъекции в яйцо, и, как правило, путем инъекции в воздушный мешок. Несмотря на то, что воздушный мешок является предпочтительным путем введения in ovo, введение инъекцией можно проводить и в другие области, такие как желточный мешок или аллантоисная жидкость хориона. Если мишенью для введения является не воздушный мешок, показатели вылупляемости могут незначительно снижаться, хотя и не обязательно, в коммерчески неприемлемых масштабах. Механизм введения не является критичным для осуществления на практике настоящего изобретения, хотя предпочтительно, чтобы игла не вызывала чрезмерного повреждения яйца или тканей и органов развивающегося эмбриона или внезародышевых мембран, окружающих эмбрион.
Если продуктивным признаком является пол, предпочтительно вводить молекулу нуклеиновой кислоты в течение четырех дней с момента отложения яйца.
Как правило, подходящим является шприц для подкожных инъекций, снабженный иглой примерно 22 калибра. Способ по настоящему изобретению хорошо приспособлен для использования с автоматическим устройством для инъекций, таким как описанное в US 4903635, US 5056464, US 5136979 и US 20060075973.
Молекулу нуклеиновой кислоты вводят в эффективном количестве, достаточном для того, чтобы по меньшей мере до некоторой степени изменить намеченный признак. Что касается пола, изменение можно выявлять, сравнивая соответствующее число образцов, обработанных способом по настоящему изобретению, с таким же количеством необработанных образцов. Статистически значимое различие в половой принадлежности птиц между двумя группами будет указывать на то, что введено эффективное количество. Другие способы определения эффективного количества для изменения пола или других признаков, находятся в компетенции специалистов в данной области.
Предпочтительно, в яйцо вводят примерно от 1 нг до 100 мкг, более предпочтительно, примерно от 100 нг до 1 мкг нуклеиновой кислоты. Более того, предпочтительно вводить нуклеиновую кислоту в объеме примерно от 1 мкл до 1 мл, более предпочтительно, примерно от 10 мкл до 500 мкл.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Идентификация молекул мшРНК для снижения продукции белка DMRT1 у кур
Выбор последовательностей мшРНК, нацеленных на DMRT1
Используя разработанный Ambion указатель мишени для миРНК (www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html), авторы настоящего изобретения выбрали 30 предсказанных последовательностей миРНК для Dmrt1. Затем 30 последовательностей миРНК подвергали скринингу для отбора мшРНК (таблица 1). Существует несколько алгоритмов, подходящих для отбора потенциальных последовательностей миРНК для специфических целевых генов. Однако показано, что многие из этих предсказанных миРНК не действуют эффективно при процессировании из экспрессированных мшРНК. Taxman et al. (2006) специально разработали алгоритм для предсказания эффективных молекул мшРНК, и авторы изобретения создали собственную модификацию алгоритма для улучшения предсказания мшРНК. Авторы изобретения применили модифицированный алгоритм Taxman к 30 выбранным миРНК так, чтобы выбрать последовательности для тестирования в качестве мшРНК для специфического нокдауна экспрессии гена Dmrt1.
При использовании алгоритма Taxman существует четыре критерия. Три из этих критериев рассчитывают, исходя из максимального числа в 4 балла. Данными критериями являются: 1) C или G на 5'-конце последовательности = 1 балл, A или T на 5'-конце = -1 балл; 2) A или T на 3'-конце = 1 балл, C или G на 3'-конце = -1 балл; 3) 5 или более A или T в семи 3'-основаниях = 2 балла, 4 A или T в семи 3'-основаниях = 1 балл. Предпочтительными являются последовательности мшРНК с максимальным количеством баллов. Четвертый критерий основан на расчете свободной энергии 6 центральных оснований последовательности мшРНК (основания 6-11 смысловой цепочки, гибридизованные с основаниями 9-14 антисмысловой цепочки). Предпочтительными являются мшРНК с ΔG>-12,9 ккал/моль центрального дуплекса. Модификацией алгоритма Taxman является использование иных параметров свободной энергии для предсказания стабильности дуплекса РНК, как описано Freier et al. (1986). Основываясь на алгоритме, авторы изобретения выбрали 6 последовательностей миРНК, предложенных указателем мишени для миРНК, в качестве потенциально эффективных мшРНК для проверки их способности осуществлять нокаут экспрессии гена Dmrt1. Выбранные последовательности выделены жирным шрифтом в таблице 1 и их 5'- 3' последовательность представлена в таблице 2. Эти 6 последовательностей использовали для конструирования плазмид ddРНКи (ddRNAi) для экспрессии 6 мшРНК.
Конструирование плазмид ddРНКи для экспрессии выбранных мшРНК
Промоторы cU6-1 (GenBank входящий номер DQ531567) и cU6-4 (DQ531570) куриной полимеразы III использовали в качестве матриц для конструирования экспрессионных плазмид ddРНКи для выбранных мшРНК для dmrt1 и контроля (EGFP или постороннего белка) посредством одностадийной ПЦР (фигура 1). В ПЦР для конструирования плазмид мшРНК использовали праймер TD175 в паре с TH346 (для мшDmrt1-346), TH461 (мшDmrt1-461), TH566 (мшDmrt1-566), TH622 (мшDmrt1-622), TH697 (мшDmrt1-697), TH839 (мшDmrt1-839) или TD195 (мшEGFP) (смотри таблицу 3 для последовательности праймера и деталей относительно специфических амплифицированных мшРНК). Обратные праймеры в каждой ПЦР конструировали так, чтобы они содержали последние 20 нт (нуклеотидов) каждой промоторной последовательности, смысловую последовательность мшРНК, петлю и антисмысловую последовательность мшРНК, и очищали ВЭЖХ. Полноразмерные амплифицированные продукты экспрессионного полигенного кластера лигировали в pGEM-T Easy и затем секвенировали. Конечные экспрессионные плазмиды мшРНК, использованные в анализах нокаута генов, получили названия pshDmrt1-346, pshDmrt1-461, pshDmrt1-566, pshDmrt1-622, pshDmrt1-697, pshDmrt1-839 и pshEGFP. Также сконструировали постороннюю контрольную плазмиду cU6-1 и использовали ее как проверочную для сравнения в анализах экспрессии генов (смотри ниже). Для этой проверочной плазмиды прямой праймер TD135 использовали в паре с обратным праймером TD149, содержащим последние 20 нт промотора U6-1 кур и все другие компоненты посторонней мшРНК. Продукт ПЦР лигировали в pGEM-T Easy и секвенировали.
|
Таблица 1
Выбор по алгоритму последовательностей мшРНК, нацеленных на Dmrt1 |
|||||
| мшРНК |
5' конец
баллы |
Δ G центра |
3' конец
баллы |
A+T в 3' | Баллы |
|
|
|||||
|
Таблица 2
Последовательность мшРНК для Dmrt1 |
|
| мшРНК | 5'-3' последовательность |
|
|
|
|
Таблица 3
Последовательность и детали использованных праймеров |
||
| Название | Последовательность 5' - 3' |
Расположение/
характеристика |
|
|
||
Каждую плазмиду для ddРНКи конструировали таким образом, чтобы начало каждой последовательности мшРНК находилось в положении +1 природных транскриптов мяРНК (snRNA) U6. Сайт для фермента рестрикции XhoI создавали ниже по ходу транскрипции от сигнала терминации, чтобы иметь возможность скрининга на полноразмерные продукты мшРНК, встроенной в pGEM-T Easy. Все окончательные экспрессионные векторы мшРНК состояли из какого-либо из полноразмерных промоторов U6 кур, смысловой последовательности мшРНК, последовательности петли, антисмысловой последовательности мшРНК, последовательности терминации и сайта XhoI. Последовательность петли, используемая во всех мшРНК, представляла собой 5' UUCAAGAGA 3'.
Тестирование выбранных мшРНК на нокаут экспрессии гена
Dmrt1
Для тестирования мшРНК на выключение Dmrt1 использовали анализ на экспрессию репортерного гена. Репортерный ген представлял собой транскрипционный слитый ген из гена Dmrt1, встроенного ниже по ходу транскрипции от 3' конца гена улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в pEGFP-C (Clontech). Репортерную плазмиду конструировали следующим образом: кДНК Dmrt1 обратно транскрибировали из общей РНК, выделенной из 4-дневного эмбриона, и клонировали в сайт множественного клонирования pCMV-Script (Stratagene). Вставку Dmrt1 удаляли из клонирующего вектора в виде фрагмента NotI - EcoRI и клонировали ниже по ходу транскрипции от гена EGFP в pEGFP-C (Clontech). Полученную плазмиду назвали pEGFP-Dmrt1. Данную плазмиду трансфицировали в клетки DF-1 кур и экспрессию транскрипционного слитого гена подтверждали, измеряя флуоресценцию EGFP методом проточной цитометрии, как описано ниже. Клетки DF-1 представляют собой стабильную клеточную линию куриных эмбриональных фибробластов, происходящую из эмбриона EV-0 (ATCC, CRL-12203), и, таким образом, представляют собой модельную систему для изучения in ovo эффектов РНКи молекул.
Анализы на выключение гена Dmrt1 проводили путем совместной трансфекции клеток DF-1 репортерной плазмидой pEGFP-Dmrt1 и каждой из плазмид ddРНКи, экспрессирующих специфичные для Dmrt1 и контрольные мшРНК. Эксперименты по совместной трансфекции проводили следующим образом: клетки DF-1 (ATCC CRL-12203, куриные фибробласты) поддерживали во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 при 37°C, в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозу, 1,5 г/л бикарбонат натрия, 10% фетальную телячью сыворотку (FCS), 2 мМ L-глютамин с добавлением пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Клетки DF1 пересеивали по мере необходимости, используя 0,25% (масс./об.) смесь трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
Совместную трансфекцию плазмид pEGFP-Dmrt1 и ddРНКи для анализов на выключение слитого гена EGFP-Dmrt1 проводили в клетках DF-1, выращенных до 80-90% конфлюэнтности, в 24-луночных планшетах для культивирования (Nunc) с целью проведения анализа методом проточной цитометрии. Клетки трансфицировали в общей сложности 1 мкг плазмидной ДНК на лунку, используя реагент для трансфекции Lipofectamine™2000 (Invitrogen). Экспрессию EGFP анализировали в трансфицированных клетках DF-1 через 60 часов после трансфекции, используя проточно-цитометрический анализ трансфекций, выполненный в трех повторах. Клетки обрабатывали трипсином, используя 100 мкл 0,25% смеси трипсин-EDTA, осаждали при 2000 об/мин в течение 5 минут, промывали один раз в 1 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора-A (PBSA) (Oxoid), два раза - в 1 мл промывочного раствора FACS (PBSA + 1% FCS) и ресуспендировали в 250 мкл промывочного раствора FACS. Проточно-цитометрический анализ образцов проводили в клеточном сортере с активацией флуоресценции FACScalibur (Becton Dickinson). Сбор данных и расчет средних значений интенсивности флуоресценции (MFI) для образцов совместной трансфекции в трех повторах выполняли при помощи программного обеспечения CELLQuest (Becton Dickinson). Результаты анализа на выключение гена представлены на фигуре 2. pshEGFP использовали в качестве положительного контроля. Известно, что мшРНК, экспрессированная с данной плазмиды, эффективно нацелена на область EGFP слитого транскрипта, и, как показано, снижает репортерную флуоресценцию примерно на 50%. По сравнению с отрицательным контролем, представляющим собой постороннюю мшРНК, экспрессированную с pshIrr, установлено, что специфичные для Dmrt1 молекулы мшРНК подавляют экспрессию репортерного гена в различной степени. мшDmrt1-622 индуцировала максимальное выключение гена, составляющее примерно 60%.
Пример 2 - Идентификация молекул мшРНК для снижения продукции белка миостатина у кур
Выбор последовательностей мшРНК, мишенью которых является миостатин (Gdf8)
Используя разработанный Ambion указатель мишеней для миРНК (www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html), идентифицировали 79 предсказанных последовательностей миРНК для Gdf8 (таблица 4). Дополнительные последовательности миРНК, оптимизированные при помощи алгоритма Taxman, приведены в таблице 5. Авторы изобретения выбрали 3 из этих последовательностей (Gdf8-258, Gdf8-913 и Gdf8-1002) для конструирования плазмид ddРНКи для экспрессии мшРНК (выделены жирным шрифтом в таблице 4).
Конструирование плазмид ddРНКи для экспрессии выбранных мшРНК
Промотор cU6-1 (GenBank входящий номер DQ531567) куриной полимеразы III использовали в качестве матрицы для конструирования экспрессионных плазмид ddРНКи для выбранных мшРНК для Gdf8 и cEGFP посредством одностадийной ПЦР (фигура 1). В ПЦР для конструирования плазмид мшРНК использовали праймер TD135 в паре с DS304 (для мшGdf8-253), DS305 (мшGdf8-913), DS306 (мшGdf8-1002) или TD148 (мшEGFP) (смотри таблицу 6 для последовательности праймера и деталей относительно специфических амплифицированных мшРНК). Обратные праймеры в каждой ПЦР конструировали так, чтобы они содержали последние 20 нт каждой промоторной последовательности, смысловую последовательность мшРНК, петлю и антисмысловую последовательность миРНК, и проводили очистку методом ВЭЖХ. Полноразмерные амплифицированные продукты экспрессионного полигенного кластера лигировали в pGEM-T Easy и затем секвенировали. Конечные экспрессионные плазмиды мшРНК, использованные в анализах нокаута генов, получили названия pshGdf8-253, pshGdf8-913, pshGdf8-1002 и pshEGFP.
|
Таблица 4
Последовательность мшРНК для Gdf8 |
|||
| мшРНК | 5'-3' последовательность | мшРНК | 5'-3' последовательность |
|
|
|||
|
|
|
|
|
Таблица 5
Последовательность миРНК для миостатина, оптимизированная при помощи алгоритма Taxman |
|
| Название | 5' - 3' последовательность |
|
|
|
Каждую плазмиду для ddРНКи конструировали таким образом, чтобы начало каждой последовательности мшРНК находилось в положении +1 природных транскриптов мяРНК (snRNA) U6. Сайт для фермента рестрикции XhoI создавали ниже по ходу транскрипции от сигнала терминации, чтобы иметь возможность скрининга на полноразмерные продукты мшРНК, встроенной в pGEM-T Easy. Все окончательные экспрессионные векторы мшРНК состояли из полноразмерного промотора U6 кур, смысловой последовательности мшРНК, последовательности петли, антисмысловой последовательности мшРНК, последовательности терминации и сайта XhoI. Последовательность петли, используемая во всех мшРНК, представляла собой 5' UUCAAGAGA 3'.
|
Таблица 6
Последовательность и детали использованных праймеров |
||
| Название | Последовательность 5'-3' |
Расположение/
характеристика |
|
|
||
Тестирование выбранных мшРНК на нокаут экспрессии гена Gdf8
Для тестирования трех выбранных мшРНК на выключение гена Gdf8 использовали анализ на экспрессию репортерного гена. Репортерный ген представлял собой транскрипционный слитый ген из гена Gdf8, встроенного ниже по ходу транскрипции от 3' конца гена улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в pEGFP-C (Clontech). Репортерную плазмиду конструировали следующим образом: кДНК Gdf8 обратно транскрибировали из общей РНК, выделенной из 7-дневного эмбриона, и клонировали в сайт множественного клонирования pGEM-T Easy (Promega). Вставку Gdf8 удаляли из клонирующего вектора в виде фрагмента NotI и клонировали ниже по ходу транскрипции от гена EGFP в pEGFP-C (Clontech). Полученную плазмиду назвали pEGFP-Gdf8. Данную плазмиду трансфицировали в клетки DF-1 кур и экспрессию транскрипционного слитого гена подтверждали, измеряя флуоресценцию EGFP методом проточной цитометрии, как описано ниже.
Анализы на выключение гена Gdf8 проводили путем совместной трансфекции клеток DF-1 репортерной плазмидой pEGFP-Gdf8 и каждой из плазмид ddРНКи, экспрессирующих специфичные для Gdf8 или EGFP и контрольные мшРНК. Эксперименты по совместной трансфекции проводили следующим образом: клетки DF-1 (ATCC CRL-12203, куриные фибробласты) поддерживали во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 при 37°C, в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозу, 1,5 г/л бикарбонат натрия, 10% фетальную телячью сыворотку (FCS), 2 мМ L-глютамин с добавлением пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Клетки DF1 пересеивали по мере необходимости, используя 0,25% (масс./об.) смесь трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
Совместную трансфекцию плазмид pEGFP-Gdf8 и ddРНКи для анализов на выключение слитого гена EGFP-Gdf8 проводили в клетках DF-1, выращенных до 80-90% конфлюэнтности, в 8-луночных предметных стеклах (Nunc) с целью проведения анализа методом флуоресцентной микроскопии. Клетки трансфицировали в общей сложности 1 мкг плазмидной ДНК на лунку, используя реагент для трансфекции Lipofectamine™2000 (Invitrogen). Экспрессию EGFP анализировали в трансфицированных клетках DF-1 через 60 часов после трансфекции следующим образом: совместно трансфицированные клетки в 8-луночных предметных стеклах промывали PBSA, обрамление предметных стекол удаляли и покровные стекла помещали на монослой клеток. Микроскопическое исследование проводили при помощи флуоресцентного микроскопа Leica DM LB (Leica Microsystems, Germany) и изображения фиксировали при 50× увеличении, используя цветную цифровую камеру Leica DC300F (Leica Microsystems, Germany) и программное обеспечение для обработки изображений Photoshop 7.0 (Adobe®). Результаты представлены на фигуре 3. мшGdf8-1002 очень эффективно выключала экспрессию слитого транскрипта и, вследствие этого, представляет собой превосходного кандидата для выключения природного транскрипта Gdf8.
Специалистам в данной области следует признать, что возможно осуществлять многочисленные вариации и/или модификации изобретения, представленного в конкретных вариантах осуществления, без изменения сущности и объема изобретения, описанного широко. Вследствие этого настоящие варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.
По настоящей заявке испрашивается приоритет по US 60/943708, поданной 13 июня 2007 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Полное содержание всех публикаций, обсуждаемых или приведенных в качестве ссылки, включено в данный документ.
Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и тому подобного, включенное в настоящее описание, предназначено исключительно для целей создания контекста для настоящего изобретения. Это не следует воспринимать как признание того, что любое или все из перечисленного является частью предшествующего уровня техники, либо представляет собой общие знания в области, относящейся к настоящему изобретению, существующие до даты приоритета каждого пункта формулы изобретения данной заявки.
ЛИТЕРАТУРА
Amarzguioui et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058.
Elbashire et al. (2001) Nature 411: 494-498.
Hori et al. (2000) Mol Biol Cell 11: 3645-3660.
Freier et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 9373-9377.
Needleman and Wunsch (1970) J Mol Biol 48: 443-453.
O'Neill et al. (2000) Dev Genes Evol 210: 243-249.
Raymond et al. (1999) Dev Biol. 215: 208-220.
Reynolds et al. (2004) Nat. Biotech., 22: 326-330.
Smith et al. (1999) Nature 402: 601-602.
Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320.
Taxman et al. (2006) BMC Biotechnol, Jan 24, 6: 7.
Waterhouse et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-13964.
Claims (7)
1. Способ изменения признака у птицы, включающий введение в яйцо птицы по меньшей мере одной молекулы РНК, содержащей двухцепочечную область (дцРНК), где молекула РНК приводит к уменьшению уровня в яйце по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка, вовлеченных в определение пола, и где способ не включает электропорацию яйца, и где признак представляет собой пол.
2. Способ изменения признака у птицы, включающий введение в яйцо птицы по меньшей мере одной молекулы РНК, содержащей двухцепочечную область (дцРНК), где молекула РНК приводит к уменьшению уровня в яйце по меньшей мере одной молекулы РНК и/или белка, вовлеченных в определение пола, и где молекулу РНК вводят в воздушный мешок, желточный мешок или аллантоисную жидкость хориона, и где признак представляет собой пол.
3. Способ по п.1 или 2, где дцРНК представляет собой миРНК или мшРНК.
4. Способ по п.1 или 2, где молекула нуклеиновой кислоты уменьшает уровень белка, кодируемого геном DMRT1.
5. Способ по п.4, где молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из:
CCAGUUGUCAAGAAGAGCA (SEQ ID №:11)
GGAUGCUCAUUCAGGACAU (SEQ ID №:12)
CCCUGUAUCCUUACUAUAA (SEQ ID №:13)
GCCACUGAGUCUUCCUCAA (SEQ ID №:14)
CCAGCAACAUACAUGUCAA (SEQ ID №:15)
CCUGCGUCACACAGAUACU (SEQ ID №:16)
GGAGUAGUUGUACAGGUUG (SEQ ID №:17)
GACUGGCUUGACAUGUAUG (SEQ ID №:18)
AUGGCGGUUCUCCAUCCCU (SEQ ID №:19),
или вариант любой из них.
CCAGUUGUCAAGAAGAGCA (SEQ ID №:11)
GGAUGCUCAUUCAGGACAU (SEQ ID №:12)
CCCUGUAUCCUUACUAUAA (SEQ ID №:13)
GCCACUGAGUCUUCCUCAA (SEQ ID №:14)
CCAGCAACAUACAUGUCAA (SEQ ID №:15)
CCUGCGUCACACAGAUACU (SEQ ID №:16)
GGAGUAGUUGUACAGGUUG (SEQ ID №:17)
GACUGGCUUGACAUGUAUG (SEQ ID №:18)
AUGGCGGUUCUCCAUCCCU (SEQ ID №:19),
или вариант любой из них.
6. Способ по любому из пп.1, 2 или 5, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят инъекцией.
7. Способ по любому из пп.1, 2 или 5, где птицу выбирают из кур, уток, индеек, гусей, бентамок и перепелок.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94370807P | 2007-06-13 | 2007-06-13 | |
| US60/943,708 | 2007-06-13 | ||
| PCT/AU2008/000835 WO2008151364A1 (en) | 2007-06-13 | 2008-06-12 | Modulating production traits in avians |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010100886A RU2010100886A (ru) | 2011-07-20 |
| RU2518681C2 true RU2518681C2 (ru) | 2014-06-10 |
Family
ID=40129126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010100886/10A RU2518681C2 (ru) | 2007-06-13 | 2008-06-12 | Регулирование продуктивных признаков у птиц |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20100306869A1 (ru) |
| EP (1) | EP2167645A4 (ru) |
| JP (1) | JP5554231B2 (ru) |
| CN (1) | CN101802173B (ru) |
| AU (1) | AU2008261604B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0812500A2 (ru) |
| MX (1) | MX2009013532A (ru) |
| RU (1) | RU2518681C2 (ru) |
| WO (1) | WO2008151364A1 (ru) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0923005A2 (pt) * | 2008-12-17 | 2015-08-04 | Commw Scient Ind Res Org | Metodos para modulacao dos exo de aves |
| EP2393351A4 (en) * | 2009-02-08 | 2012-09-26 | Univ Melbourne | DETERMINATION OF THE SEX AND METHODS FOR SPECIFYING |
| CN102041257B (zh) * | 2009-10-13 | 2013-05-22 | 中国农业大学 | 抑制鸡肌肉生成抑制素基因表达的siRNA及其应用 |
| WO2012177639A2 (en) * | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines |
| US10455819B2 (en) | 2012-12-11 | 2019-10-29 | Signify North America Corporation | Methods for controlling sex of oviparous embryos using light sources |
| US11172656B2 (en) | 2012-12-11 | 2021-11-16 | Signify Holding B.V. | Methods for controlling sex of oviparous embryos using light sources |
| US11140879B2 (en) | 2012-12-11 | 2021-10-12 | Signify North America Corporation | Methods for controlling sex of oviparous embryos using light sources |
| KR102302828B1 (ko) | 2012-12-11 | 2021-09-17 | 온스 이노베이션스, 인코포레이티드 | 광을 사용하여 난생 배아의 성별을 제어하는 것 |
| JP6672156B2 (ja) * | 2013-11-11 | 2020-03-25 | サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 親油性部分にコンジュゲートされたミオスタチン低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）の全身性送達 |
| WO2017048769A1 (en) | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Zdenko Grajcar | Promoting biological responses in incubated eggs |
| EP3516062A1 (en) | 2016-09-21 | 2019-07-31 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Myostatin irna compositions and methods of use thereof |
| BR112019025358A2 (pt) * | 2017-05-31 | 2020-07-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | ovo aviário transgênico, ave transgênica, ovo ou progênie aviária, método para detectar um ovo aviário macho, método para produzir um ovo aviário, método para replicar um vírus, vírus produzidos pelo uso de ovo aviário, método para produzir uma composição de vacina, composição da vacina produzida pelo uso do método e método para produzir um ovo aviário transgênico ou uma ave produzida pelo ovo |
| CN110791569B (zh) * | 2018-08-03 | 2022-05-10 | 浙江省农业科学院 | 一种鸭蛋蛋壳颜色相关分子标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2189743C1 (ru) * | 2001-01-30 | 2002-09-27 | Орловский государственный аграрный университет | Способ регуляции пола у животных, например, крупного рогатого скота |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4417663A (en) * | 1981-06-16 | 1983-11-29 | Kiyonobu Suzuki | Apparatus for determining the sex of a chick |
| US4903635A (en) * | 1986-07-02 | 1990-02-27 | Embrex, Inc. | High speed automated injection system for avian embryos |
| US5056464A (en) * | 1990-01-18 | 1991-10-15 | Embrex, Inc. | Automated injection system for avian embryos with advanced fluid delivery system |
| US5508165A (en) * | 1990-09-21 | 1996-04-16 | Zoogen, Inc. | Avian sex determination probe |
| US5136979A (en) * | 1991-09-25 | 1992-08-11 | Embrex, Inc. | Modular injection system for avian embryos |
| WO1993014629A1 (en) * | 1992-01-27 | 1993-08-05 | North Carolina State University | Gene transfer in birds by introduction of dna into muscle in ovo |
| JPH07206705A (ja) * | 1993-11-03 | 1995-08-08 | American Cyanamid Co | 生インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン |
| AU3647799A (en) * | 1998-04-03 | 1999-10-25 | Salk Institute For Biological Studies, The | Ribozyme-mediated control of gene expression |
| US6130365A (en) * | 1998-08-03 | 2000-10-10 | Peterson Farms | Breeding lines of color-sexable day-old chicks and methods for producing the same |
| US6244214B1 (en) * | 1999-01-06 | 2001-06-12 | Embrex, Inc. | Concurrent in ovo injection and detection method and apparatus |
| US8202979B2 (en) * | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
| US7662791B2 (en) * | 2000-08-02 | 2010-02-16 | University Of Southern California | Gene silencing using mRNA-cDNA hybrids |
| AUPR064600A0 (en) * | 2000-10-09 | 2000-11-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genetic control of sex ratio in animal populations |
| MXPA03003700A (es) * | 2000-11-02 | 2004-05-04 | Akzo Nobel Nv | Mutante de nucleoproteina recombinante de virus de enfermedad de newcastle en la forma de una vacuna marcadora. |
| AUPR567401A0 (en) * | 2001-06-14 | 2001-07-12 | University Of Melbourne, The | Circovirus vaccines |
| WO2003022052A1 (en) * | 2001-09-13 | 2003-03-20 | California Institute Of Technology | Method for expression of small rna molecules within a cell |
| ES2401326T3 (es) * | 2001-11-21 | 2013-04-18 | Astellas Pharma Inc. | Procedimiento para inhibir la expresión génica |
| CN1972593A (zh) * | 2003-11-21 | 2007-05-30 | 雷维维科公司 | 干扰rna在生产转基因动物中的用途 |
| US7617795B2 (en) * | 2004-10-13 | 2009-11-17 | Embrex, Inc. | Methods and apparatus for injecting and sampling material through avian egg membranes |
| US20060196428A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-07 | Correa Rafael S | Method for improving chick hatchability |
| BRPI0923005A2 (pt) * | 2008-12-17 | 2015-08-04 | Commw Scient Ind Res Org | Metodos para modulacao dos exo de aves |
-
2008
- 2008-06-12 RU RU2010100886/10A patent/RU2518681C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-06-12 BR BRPI0812500A patent/BRPI0812500A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-06-12 WO PCT/AU2008/000835 patent/WO2008151364A1/en active Application Filing
- 2008-06-12 US US12/664,097 patent/US20100306869A1/en not_active Abandoned
- 2008-06-12 CN CN200880102770.XA patent/CN101802173B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-12 MX MX2009013532A patent/MX2009013532A/es active IP Right Grant
- 2008-06-12 JP JP2010511446A patent/JP5554231B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-06-12 AU AU2008261604A patent/AU2008261604B2/en not_active Ceased
- 2008-06-12 EP EP08756916A patent/EP2167645A4/en not_active Ceased
-
2012
- 2012-09-04 US US13/602,927 patent/US20130067606A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2189743C1 (ru) * | 2001-01-30 | 2002-09-27 | Орловский государственный аграрный университет | Способ регуляции пола у животных, например, крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| (реферат + формула). SATO F. et al., "Gene silencing of myostatin in differentiation of chicken embryonic myoblasts by small interfering RNA", Am J Physiol Cell Physiol. 2006 Sep;291(3):C538-45. Epub 2006 Apr 12. * |
| RAO M. et al., "In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo", Dev Dyn. 2004 Nov;231(3):592-600. DAI F. et al., "RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis", Dev Biol. 2005 Sep 1;285(1):80-90. (реферат). BOURIKAS D. et al., "New tools for gene manipulation in chicken embryos", Oligonucleotides. 2003;13(5):411-9. (реферат). BAERISWYL T. et al., "In ovo RNAi opens new possibilities for temporal and spatial control of gene silencing during development of the vertebrate nervous system", J RNAi Gene Silencing. 2006 Feb 28;2(1):126-35. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2167645A1 (en) | 2010-03-31 |
| WO2008151364A1 (en) | 2008-12-18 |
| MX2009013532A (es) | 2010-03-04 |
| AU2008261604A1 (en) | 2008-12-18 |
| RU2010100886A (ru) | 2011-07-20 |
| US20100306869A1 (en) | 2010-12-02 |
| EP2167645A4 (en) | 2012-04-18 |
| AU2008261604B2 (en) | 2012-05-24 |
| CN101802173B (zh) | 2014-09-24 |
| BRPI0812500A2 (pt) | 2019-09-24 |
| JP5554231B2 (ja) | 2014-07-23 |
| JP2010528667A (ja) | 2010-08-26 |
| CN101802173A (zh) | 2010-08-11 |
| US20130067606A1 (en) | 2013-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2518681C2 (ru) | Регулирование продуктивных признаков у птиц | |
| AU2009328633B2 (en) | Methods of modulating the sex of avians | |
| AU2008250973B2 (en) | Treatment and prevention of influenza | |
| CN102355814A (zh) | 性别决定及指定性别的方法 | |
| WO2013155572A1 (en) | Cell transfection method | |
| AU2024219767A1 (en) | Trait selection in avians | |
| AU2012204092B2 (en) | Modulating production traits in avians | |
| US20140289881A1 (en) | Double-stranded rna | |
| AU2013202277A1 (en) | Methods of modulating the sex of avians | |
| WO2014153590A1 (en) | Rna interference in amoebas | |
| AU2013200109A1 (en) | Treatment and prevention of influenza | |
| Estrada et al. | RNAi in fish and crustaceans. | |
| Lagendijk et al. | Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20120921 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20121023 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170613 |