RU2590592C2 - ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ - Google Patents
ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2590592C2 RU2590592C2 RU2012129910/10A RU2012129910A RU2590592C2 RU 2590592 C2 RU2590592 C2 RU 2590592C2 RU 2012129910/10 A RU2012129910/10 A RU 2012129910/10A RU 2012129910 A RU2012129910 A RU 2012129910A RU 2590592 C2 RU2590592 C2 RU 2590592C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- insecticidal
- plants
- transgenic
- cry1be
- Prior art date
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 209
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 159
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 21
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 94
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 93
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 53
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 38
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 33
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 12
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 8
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 6
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 abstract 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 117
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 101
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 25
- 241000724266 Broad bean mottle virus Species 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 description 11
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 11
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 8
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001012098 Omiodes indicata Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101150078024 CRY2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190714 Gymnosporangium clavipes Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 241000033319 Naganishia diffluens Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000158450 Rhodobacter sp. KYW73 Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001479507 Senecio odorus Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000802194 Targalla delatrix Species 0.000 description 1
- 244000288561 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 235000014681 Torulaspora delbrueckii Nutrition 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003693 cell processing method Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 1
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- -1 fusion Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, устойчивому к кукурузной листовой совке, содержащему ДНК, кодирующую белок Cry1Da, и ДНК, кодирующую белок Cry1Be, его семени, а также к способу снижения развития устойчивости к белкам Cry1Da и Cry1Be у кукурузной листовой совки с его использованием. Также раскрыта совокупность растений на поле, содержащая множество вышеуказанных трансгенных растений и растений, не экспрессирующих белок Bacillus thuringiensis (Bt), и смесь семян, содержащая семена, которые не экспрессируют белок Bacillus thuringiensis и множество вышеуказанных семян. Изобретение также относится к способу борьбы с развитием устойчивости кукурузной листовой совки к белкам Cry1Da и Cry1Be приведением в контакт указанного насекомого с вышеуказанными белками. Изобретение позволяет эффективно бороться с кукурузной листовой совкой. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Люди выращивают кукурузу для использования при производстве пищи и энергии. Люди также выращивают большое количество других видов зерновых, включая сою и хлопок. Насекомые поедают и повреждают растения и тем самым подрывают усилия людей. Миллиарды долларов ежегодно тратятся на контроль насекомых-вредителей, и помимо этого миллиарды долларов теряются в виде ущерба, нанесенного насекомыми. Синтетические органические химические инсектициды являются основным инструментом контроля насекомых-вредителей, но биологические инсектициды, например обладающие инсектицидным действием белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), играют важную роль в тех же областях применения. Возможность получения устойчивых к насекомым растений путем трансформации генами обладающих инсектицидным действием Bt белков совершила революцию в современном сельском хозяйстве и повысила важность и ценность обладающих инсектицидным действием белков и их генов.
Несколько Bt белков были использованы для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени успешно зарегистрированы и выведены на рынок. Указанные белки включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F и Cry3Bb у кукурузы, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка и Cry3A у картофеля.
Коммерческие продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют один белок за исключением случаев, когда желателен комбинированный инсектицидный спектр действия двух белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb у кукурузы комбинируют для обеспечения устойчивости, соответственно, к чешуекрылым насекомым-вредителям и корневым червям) или когда независимое действие белков позволяет использовать их в качестве средства, замедляющего развитие устойчивости в целевой популяции насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab у хлопка комбинируют для обеспечения контроля развития устойчивости у табачной листовертки-почкоеда). См. также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, относящуюся к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для контроля Helicoverpa zea или armigerain. WO 2009/132850 относится к использованию Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для контроля Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США №2008/0311096 частично относится к использованию Cry1Ab для контроля ECB, устойчивого к Cry1F.
Таким образом, некоторые свойства трансгенных растений, устойчивых к насекомым, которые привели к быстрому и широкому внедрению этой технологии, также вызвали опасения, что популяции насекомых-вредителей выработают устойчивость к обладающим инсектицидным действием белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения утилитарности связанных с устойчивостью к насекомым признаков, основанных на Bt, которые включали введение белков в высоких дозах в комбинации с организацией убежищ (рефугий), и поочередное или одновременное введение различных токсинов (McGaughey et al. (1998), “B.t. Resistance Management”, Nature Biotechnol, 16:144-146).
Белки, выбранные для использования в наборе для управления устойчивостью насекомых (IRM), должны проявлять свое инсектицидное действие независимо таким образом, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не вызывала появления устойчивости ко второму белку (т.е. чтобы отсутствовала перекрестная устойчивость к белкам). Например, если популяция насекомого-вредителя, которая отобрана на устойчивость к “Белку А”, является чувствительной к “Белку В”, можно сделать вывод, что перекрестная устойчивость отсутствует и что комбинация Белка А и Белка В будет эффективной для замедления развития устойчивости к Белку А, применяемому изолированно.
При отсутствии обладающих устойчивостью популяций насекомых может быть проведен анализ на основе других характеристик, которые, как предполагается, связаны с механизмом действия и потенциалом развития перекрестной устойчивости. Были выдвинуты предположения, согласно которым для идентификации обладающих инсектицидным действием белков, которые, вероятно, не обладают свойством перекрестной устойчивости, можно использовать опосредованное рецептором связывание (van Mellaert et al., 1999). Ключевой прогнозирующий параметр отсутствия перекрестной устойчивости, естественно присущий такому подходу, заключается в том, что обладающие инсектицидным действием белки не конкурируют за рецепторы у чувствительных к ним видов насекомых.
Если два Bt токсина конкурируют за один и тот же рецептор, то в случае мутации этого рецептора у насекомого, при которой один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, следовательно, больше не обладает инсектицидным действием в отношении этого насекомого, это насекомое может стать устойчивым также и ко второму токсину (который конкурентно связывается с тем же рецептором). При этом насекомое рассматривается как обладающее перекрестной устойчивостью к обоим Bt токсинам. Однако если два токсина связываются с различными рецепторами, это может служить указанием на то, что насекомое может не быть одновременно устойчивым к этим двум токсинам.
Например, белок Cry1Fa применим для контроля многих чешуекрылых насекомых-вредителей, включая мотылька кукурузного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hűbner)) и FAW, и проявляет активность в отношении огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, вырабатываемый в трансгенных растениях кукурузы, содержащих фактор TC1507, является ответственным за развитие устойчивости к доминирующим в данной отрасли насекомым, т.е. для контроля FAW. Cry1Fa также используется в продуктах Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™.
Способность проводить исследования (конкурентного или гомологичного) опосредованного рецептором связывания с использованием белка Cry1Fa ограничена, поскольку большинство доступных методик мечения белков для их обнаружения в анализе опосредованного рецептором связывания инактивируют инсектицидную активность белка Cry1Fa.
Дополнительные Cry токсины перечислены на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время существует примерно 60 основных групп “Cry” токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt токсинами, VIP токсинами и т.п. Многие группы с числовыми обозначениями имеют подгруппы, обозначенные заглавными буквами, а обозначенные заглавными буквами подгруппы имеют подгруппы, обозначенные прописными буквами. (Например, Cry1 имеет подгруппы A-L, а Cry1A имеет подгруппы a-i.)
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, заключающемуся в том, что Cry1Da и Cry1Be не конкурируют за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Специалист в данной области техники поймет, с учетом настоящего раскрытия, что растения, вырабатывающие оба этих белка (включая части полноразмерных белков, обладающих инсектицидным действием), могут замедлить или предотвратить развитие устойчивости к данным обладающим инсектицидным действием белкам по отдельности. Кукуруза и соя представляют собой предпочтительные растения.
Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Cry1Da в комбинации с белком Cry1Be. Растения (и площадь угодий, засеянных такими растениями), которые вырабатывают оба этих белка, включены в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к пакетам или “пирамидам” из трех (или более) токсинов, в которых Cry1Da и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает активность по отношению к FAW в трех местах действия. Некоторые предпочтительные комбинации-пирамиды с “тремя местами действия” включают основную пару белков плюс Cry1Fa, Vip3Ab или Cry1E в качестве третьего белка, воздействующего на FAW. Эти конкретные тройные пакеты согласно настоящему изобретению неожиданно обеспечивают три места действия в отношении FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площади убежищ.
Согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW, так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)), добавление двух дополнительных белков в этот тройной пакет, в котором два дополнительных белка нацелены на ECB, обеспечит три места действия в отношении FAW и три места действия в отношении ECB. Этот добавленный белок (четвертый белок) может быть выбран из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 и Cry1Ab, что дает в результате пакет из четырех белков, имеющих по три места действия у двух насекомых (ECB и FAW).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично относится к неожиданному открытию, заключающемуся в том, что Cry1Da и Cry1Be не конкурируют друг с другом за участки связывания в мембранных препаратах, полученных из клеток кишечника кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Cry1Da может быть использован в комбинации с белком Cry1Be в трансгенной кукурузе (и других растениях, например хлопке и сое) для замедления или предотвращения развития у FAW устойчивости к каждому из указанных белков по отдельности. Рассматриваемая пара белков может быть эффективной при защите растений (таких растений, как маис и соя) от повреждений, наносимых кукурузной листовой совкой, устойчивой к Cry. Другими словами, одна из областей применения настоящего изобретения относится к защите кукурузы и других экономически важных видов растений от повреждений и потери урожая, вызванных популяциями кукурузной листовой совки, у которых может развиться устойчивость к Cry1Da или Cry1Be.
В настоящем изобретении, таким образом, раскрывается пакет для управления устойчивостью насекомыми (IRM), содержащий Cry1Da и Cry1Be, предназначенный для предотвращения или ослабления развития у FAW устойчивости к каждому или обоим этим белкам.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащих клетки, продуцирующие обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da и обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be.
Изобретение также относится к хозяину, трансформированному для продуцирования как обладающего инсектицидным действием белка Cry1Da, так и обладающего инсектицидным действием белка Cry1Be, причем указанный хозяин представляет собой микроорганизм или клетку растения. Рассматриваемый полинуклеотид(ы) предпочтительно находится в генетической конструкции под управлением промотора(ов), не принадлежащих Bacillus thuringiensis. Рассматриваемые полинуклеотиды могут содержать кодоны, используемые для усиленной экспрессии в растениях.
Дополнительно предполагается, что изобретение обеспечивает способ контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, содержащий приведение в контакт указанных насекомых-вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит белок, содержащий ядро токсина Cry1Da, и белок, содержащий ядро токсина Cry1Be.
Один из вариантов осуществления изобретения содержит растение маиса, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da.
Другой вариант осуществления изобретения содержит растение маиса, в котором экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, были введены в указанное растение маиса путем интрогрессии.
Как описано в Примерах, исследования конкурентного связывания с рецептором с использованием меченных радиоактивным изотопом белков Cry1Da и Cry1Be показали, что белок Cry1Be не конкурирует за связывание в тканях FAW, в которых происходит связывание Cry1Da. Эти результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Da и Cry1Be может представлять собой эффективное средство для ослабления развития устойчивости в популяциях FAW к каждому из этих белков. Таким образом, частично основываясь на данных, представленных в настоящем документе, можно предположить, что совместное продуцирование (пакетирование) белков Cry1Be и Cry1Da может быть использовано для получения IRM пакета с высокими дозами для FAW.
К этой паре могут быть добавлены другие белки. Например, рассматриваемое изобретение также частично относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов, где Cry1Da и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды, выбранные токсины имеют три отдельных места действия у FAW. Некоторые предпочтительные комбинации-пирамиды с “тремя местами действия” включают основную пару белков плюс Cry1Fa, Vip3Ab или Cry1E в качестве третьего белка, воздействующего на FAW. Эти конкретные тройные пакеты согласно настоящему изобретению неожиданно обеспечивают три места действия у FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования о площадях убежищ. Под “отдельными местами действия” подразумевается то, что каждый из данных белков не вызывает развития перекрестной устойчивости с другими белками.
Согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa вводят в пакет вместе с парой белков по изобретению (оба белка Cry1Fa и Cry1Be проявляют активность как по отношению к FAW, так и по отношению к мотыльку кукурузному (ECB)); при этом добавление одного дополнительного белка в этот тройной пакет, в котором четвертый дополнительный белок нацелен на ECB, обеспечит три места действия в отношении FAW и три места действия в отношении ECB. Эти добавленные белки (четвертый белок) могут быть выбраны из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 (см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009) и US 2010 00269223) и Cry1Ab (US 2008 0311096). Это дает в результате пакет из четырех белков, имеющих по три места действия в отношении двух насекомых (ECB и FAW).
Таким образом, одна из возможных схем обработки представляет собой использование рассматриваемой пары белков в комбинации с третьим токсином/геном и использование этого тройного пакета для ослабления развития у FAW устойчивости к каждому из этих токсинов. Соответственно, рассматриваемое изобретение также относится к тройным пакетам или “пирамидам”, состоящим из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамиды, выбранные токсины имеют три отдельных места действия в отношении FAW.
Среди прочих схем обработки по настоящему изобретению могут быть использованы два, три или более белков из рассматриваемых белков в регионах произрастания кукурузы, в которых FAW может формировать популяции с развившейся устойчивостью. Например, что касается использования Cry1Fa плюс Cry1D, в заявке на патент США № 61/284252 (подана 16 декабря 2009) показано, что Cry1D активен по отношению к FAW, устойчивой к Cry1F. В этой заявке показано, что Cry1D не конкурирует с Cry1F за связывание в мембранных препаратах FAW. Для рекомендаций в отношении использования Cry1Fa и Cry1Be см. заявку на патент США № 61/284294, а в отношении использования с Vip3Ab см. одновременно поданную заявку, озаглавленную “COMBINED USE OF Vip3Ab AND Cry1Fa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS”. С учетом того, что Cry1Fa активен по отношению к FAW (и мотыльку кукурузному (ECB)), Cry1Da плюс Cry1Ca плюс Cry1Fa неожиданно обеспечивают согласно настоящему изобретению три места действия в отношении FAW. Это может способствовать смягчению или устранению требования к площади убежищ.
Cry1Fa содержится в продуктах Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™. Рассматриваемая пара генов (Cry1Da и Cry1Be) может быть скомбинирована, например, с содержащим Cry1Fa продуктом, таким как Herculex®, SmartStax™ и WideStrike™. Соответственно, рассматриваемая пара белков может играть значительную роль в уменьшении давления отбора на эти и другие коммерчески доступные белки. Рассматриваемая пара белков может быть использована в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопка и сои).
Как уже указывалось выше, согласно настоящему изобретению также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены. Для воздействия на ECB может быть использован Cry2A, Cry1I и/или DIG-3. См. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009). В отношении использования Cry1Ab (для контроля ECB) см. публикацию заявки на патент США № 2008/0311096. В отношении использования Cry1E (для контроля FAW) см. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 декабря 2009).
Растения (и площади угодий, засеянные такими растениями), которые вырабатывают любую из рассматриваемых комбинаций белков, включены в объем настоящего изобретения. Также могут быть добавлены дополнительные токсины/гены; однако обсуждаемые выше конкретные пакеты неожиданно обеспечивают множество мест действия против FAW и ECB. Это может способствовать смягчению или устранению требования о площадях убежищ. Следовательно, поле, засеянное таким образом, площадь которого превышает десять акров, входит в объем настоящего изобретения.
Для получения последовательностей любых генов и белков, обсуждаемых в настоящем документе, также может быть использован GENBANK. См. Приложение А ниже. В патентах также раскрываются релевантные последовательности. Например, патент США № 5188960 и патент США № 5827514 описывают белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые являются подходящими для осуществления настоящего изобретения. Патент США № 6218188 описывает оптимизированные для растений последовательности ДНК, кодирующие белки, содержащие ядро токсина Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении.
Комбинации белков, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей. Взрослые чешуекрылые, например бабочки и мотыльки, в основном питаются цветочным нектаром и являются важными опылителями. Практически все личинки чешуекрылых, т.е. гусеницы, питаются растениями, и многие из них являются важными насекомыми-вредителями. Гусеницы поедают внутреннюю часть листвы, корни или стебель растения, лишая растение возможности получать питательные вещества и часто разрушая физическую опорную структуру растения. Помимо этого гусеницы поедают плоды, ткани и хранящиеся зерно и муку, придавая этим продуктам нетоварный вид или серьезно снижая их ценность. Как используется в настоящем документе, под чешуекрылыми насекомыми-вредителями подразумеваются различные стадии жизненного цикла насекомого-вредителя, включая стадии личинки.
Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению содержат полную N-концевую часть ядра токсина Bt, и в некоторой точке от конца части, содержащей ядро токсина, белок переходит в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевая часть токсина Bt, обладающая инсектицидной активностью, называется “ядром” токсина. Переход от сегмента ядра токсина к сегменту гетерологичного протоксина может находиться приблизительно в месте соединения токсин/протоксин, или в качестве альтернативы, может быть сохранена часть естественного протоксина (простирающаяся за пределы части ядра токсина) с переходом в гетерологичную часть, протоксин, расположенную далее.
В качестве примера, один из химерных токсинов по настоящему изобретению представляет собой часть, относящуюся к ядру токсина Cry1Da (приблизительно от 1 до 601 аминокислоты) и/или гетерологичный протоксин (аминокислоты от 602 до С-конца). В одном из предпочтительных вариантов осуществления часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления часть химерного токсина, содержащую протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.
Специалист в данной области техники признает, что Bt токсины, даже в рамках определенного класса, такого как Cry1Be, немного различаются по длине и точному положению перехода от ядра токсина к части, относящейся к протоксину. Обычно токсины Cry1Be имеют длину от примерно 1150 до примерно 1200 аминокислот. Переход от части, относящейся к ядру токсина, к части, относящейся к протоксину, обычно находится в пределах от 50% до 60% полной длины токсина. Химерный токсин рассматриваемого изобретения полностью включает указанную N-концевую часть ядра токсина. Таким образом, химерный токсин содержит по меньшей мере 50% полной длины белка-токсина Cry1Be, что обычно составляет по меньшей мере 590 аминокислот. Что касается части, относящейся к протоксину, то полная длина части, относящейся к протоксину Cry1Ab, простирается от конца части, относящейся к ядру токсина, до С-конца молекулы.
Гены и токсины. Гены и токсины, используемые по настоящему изобретению, включают не только раскрытые последовательности полной длины, но также фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют характеристики пестицидной активности токсинов, примеры которых приведены в настоящем документе. В настоящем документе термин “варианты” или “вариации” генов относится к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины или которые кодируют токсины-эквиваленты, обладающие пестицидной активностью. В настоящем документе термин “токсины-эквиваленты” относится к токсинам, имеющим такую же или по существу такую же биологическую активность по отношению к целевым насекомым-вредителям, что и заявленные токсины.
В настоящем документе используются следующие ограничительные признаки: примерно 95% (для Cry1Da и Cry1Be), 78% (для Cry1D и Cry1B) и 45% (для Cry1) идентичность последовательностей согласно “Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62:807-813. Эти ограничения применимы только в отношении ядра токсинов.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Конкретные гены или части генов, проиллюстрированные в настоящем документе, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части или варианты также могут быть сконструированы синтетически, например с использованием синтезатора генов. Вариации генов могут быть легко сконструированы стандартными методами для осуществления точечных мутаций. Фрагменты этих генов также могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз согласно стандартным процедурам. Например, для последовательного отщепления нуклеотидов от концов этих генов могут быть использованы такие ферменты, как Bal31, или сайт-направленный мутагенез. Гены, кодирующие активные фрагменты, также могут быть получены с использованием различных рестрикционных ферментов. Для непосредственного получения активных фрагментов указанных белков-токсинов могут быть использованы протеазы.
Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность проиллюстрированных токсинов, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В силу избыточности генетического кода аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем документе, могут кодироваться множеством различных ДНК-последовательностей. Специалисту в данной области техники не составит труда создать альтернативные ДНК-последовательности, кодирующие такие же или по существу такие же токсины. Такие варианты ДНК-последовательностей находятся в пределах объема настоящего изобретения. В настоящем документе “по существу такие же” последовательности обозначают последовательности, имеющие замены, делеции, добавления или вставки, которые существенно не влияют на пестицидную активность. Это определение также охватывает фрагменты генов, кодирующие белки, которые сохраняют пестицидную активность.
Еще один способ идентификации генов, кодирующих токсины, и частей генов, пригодных согласно настоящему изобретению, состоит в использовании олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют собой детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть детектируемыми в силу наличия соответствующей метки или могут быть выполнены с возможностью их естественной флуоресценции, как описано в международной заявке WO93/16094. Как известно из уровня техники, если зонд и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются, формируя сильную связь между двумя указанными молекулами, можно сделать достаточно обоснованное предположение, что зонд и образец являются по существу гомологичными. Предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях методом, хорошо известным из уровня техники, например, описанным в Keller, G. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., p. 169-170. Некоторые примеры комбинаций концентрации соли и температуры являются следующими (в порядке возрастания жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°C. Детектирование зонда обеспечивает средство для определения известным способом, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов, согласно изобретению могут синтезироваться в ДНК-синтезаторе и с помощью стандартных процедур. Данные нуклеотидные последовательности также могут использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по изобретению.
Варианты токсинов. В настоящем документе, в частности, приведены примеры некоторых токсинов по изобретению. Поскольку эти токсины являются всего лишь примерами токсинов по изобретению, очевидно, что настоящее изобретение содержит варианты или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), имеющие пестицидную активность, такую же или аналогичную пестицидной активности токсина, приведенного в качестве примера. Эквивалентные токсины обладают гомологией по аминокислотам с приведенным в качестве примера токсином. Такая гомология по аминокислотам обычно превышает 75%, предпочтительно превышает 90% и наиболее предпочтительно превышает 95%. Гомология по аминокислотам является наибольшей в критических областях, которые ответственны за биологическую активность или участвуют в определении трехмерной конфигурации, которая в конечном счете и отвечает за биологическую активность. В этом отношении определенные аминокислотные замены являются приемлемыми и допустимыми, если эти замены находятся в областях, которые не являются критичными для активности или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не влияют на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть отнесены к следующим классам: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, в которых аминокислота одного класса заменяется аминокислотой из того же класса, находятся в пределах объема настоящего изобретения при условии, что такая замена не изменяет существенно биологическую активность соединения. Ниже приводится список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу.
| Класс аминокислот | Примеры аминокислот |
| неполярные | Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp |
| незаряженные полярные | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
| кислые | Asp, Glu |
| основные | Lys, Arg, His |
В некоторых примерах также могут быть использованы неконсервативные замены. При этом критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно ухудшать биологическую активность токсина.
Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, могут быть введены во множество различных микроорганизмов-хозяев или растений-хозяев. Экспрессия гена токсина приводит в результате, прямо или опосредованно, к внутриклеточному продуцированию и поддержанию пестицида. Для создания штамма Bt, экспрессирующего оба токсина по изобретению, могут быть использованы конъюгационный перенос и рекомбинантный перенос. Один или оба гена токсинов могут быть перенесены также в другие организмы-хозяева, которые могут затем использоваться для получения синергического эффекта. При использовании подходящих микроорганизмов-хозяев, например Pseudomonas, такие микроорганизмы можно применять в местах нахождения насекомого-вредителя, где они будут размножаться и попадать в кишечник насекомого, что приведет в результате к контролю насекомого-вредителя. В качестве альтернативы, микроорганизмы, содержащие ген токсина, могут быть обработаны в условиях, продлевающих активность токсина и стабилизирующих клетку. Затем обработанные клетки, которые сохраняют токсическую активность, вносят в среду обитания целевого насекомого-вредителя.
Если ген Bt токсина вводят с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанный хозяин затем вводят в среду обитания в живом состоянии, то принципиальным моментом является использование определенных микроорганизмов-хозяев. Выбираются такие микроорганизмы-хозяева, в отношении которых известно, что они обитают в “фитосфере” (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более представляющих интерес зерновых культур. Такие микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они обладали способностью успешно конкурировать в конкретной среде обитания (зерновой культуре или других местах обитания насекомых) с дикими типами микроорганизмов, обеспечивали стабильное поддержание и экспрессию полипептида-пестицида и, желательно, обеспечивали улучшенную защиту пестицида от разложения и инактивации под действием окружающей среды.
В отношении огромного количества микроорганизмов известно, что они обитают в филлоплане (поверхности листьев растений) и/или в ризосфере (почве, окружающей корневую систему растения) множества важных зерновых культур. Эти микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, например, относящиеся к родам Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Alcaligenes; грибы, в частности дрожжи, например, относящиеся к видам Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды обитающих в фитосфере бактерий, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, такие виды обитающих в фитосфере дрожжей, как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Существует широкий спектр способов введения Bt генов, кодирующего токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях, обеспечивающих стабильную поддержку и экспрессию этого гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в настоящий документ в виде ссылки.
Обработка клеток. Клетки Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt токсины, могут быть обработаны с целью продления активности токсина и стабилизации клетки. Формируемая микрокапсула с пестицидом содержит Bt токсин или токсины внутри клеточной структуры, которая была стабилизирована и защищает токсин при внесении микрокапсулы в среду обитания целевого насекомого-вредителя. Подходящие клетки-хозяева могут включать либо клетки прокариот, либо эукариот и обычно ограничены только теми клетками, которые не вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее могут быть использованы организмы, вырабатывающие вещества, токсичные для высших организмов, если эти токсичные вещества являются нестабильными или вносимое количество является достаточно низким, настолько, что при этом отсутствует какая-либо вероятность интоксикации млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.
При обработке клетки обычно являются интактными и по существу находятся в пролиферативной форме, а не в форме спор, хотя в некоторых случаях могут быть использованы споры.
Обработка клеток микроорганизмов, т.е. клеток, содержащих ген или гены Bt токсина, может выполняться с использованием химических или физических средств или с использованием комбинации химических и/или физических средств при условии, что эти методы не оказывают негативного влияния на свойства токсина, а также не ухудшают способность клетки защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенирующие агенты, в частности галогены с атомными номерами 17-80. Более точно, можно использовать йод в мягких условиях в течение времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другие подходящие методы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными средствами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридинхлорид; спиртами, такими как изопропиловый спирт и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как Люголь-йод, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Helly (См. Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); или комбинацией физических (тепло) и химических агентов, которые защищают и способствуют пролонгированию активности токсина, продуцируемого в клетке при введении этой клетки животному-хозяину. Примерами физических средств являются коротковолновое излучение, такое как гамма-излучение и рентгеновское излучение, заморозка, УФ-облучение, лиофилизация и прочие. Способы обработки клеток микроорганизмов описаны в патентах США № 4695455 и 4695462, которые включены в настоящий документ в виде ссылки.
Клетки обычно имеют повышенную структурную стабильность, что увеличивает их устойчивость к условиям окружающей среды. Если пестицид находится в проформе, способ обработки клетки следует выбирать таким образом, чтобы патогеном целевого насекомого-вредителя не подавлялся процессинг от проформы к зрелой форме пестицида. Например, формальдегид будет сшивать белки и может подавлять процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки клетки должен способствовать сохранению по меньшей мере существенной доли биодоступности или биоактивности токсина.
Представляющие особый интерес характеристики при выборе клетки-хозяина с целью продуцирования включают легкость введения Bt гена или генов в клетку хозяина, доступность экспрессирующей системы, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в клетке-хозяине и наличие вспомогательных генетических возможностей. Представляющие особый интерес характеристики в случае использования в виде пестицидной микрокапсулы включают защитные свойства в отношении пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или формирование включений; выживание в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающего; привлекательность для поглощения насекомыми-вредителями; легкость в уничтожении и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Также может рассматриваться легкость в создании и обращении, экономичность, стабильность при хранении и тому подобное.
Выращивание клеток. Клетку-хозяина, содержащую инсектицидный Bt ген или гены можно выращивать в любой подходящей питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает селективное преимущество, обеспечивая такую селективную среду, что все или по существу все клетки сохраняют Bt ген. Затем эти клетки могут быть собраны известными методами. С другой стороны, клетки можно обрабатывать до их сбора.
Bt клетки, продуцирующие токсины по изобретению, могут быть культивированы с использованием стандартных сред и методов ферментации, известных в данной области техники. После завершения цикла ферментации бактерии могут быть собраны сначала путем выделения спор и кристаллов Bt из ферментационного бульона способами, хорошо известными в данной области. Восстановленные споры и кристаллы Bt могут быть представлены в составах в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул или в виде других составов с добавлением поверхностно-активных веществ, диспергирующих веществ, инертных наполнителей и других компонентов для облегчения обращения с ними и их применения по отношению к конкретным целевым насекомым-вредителям. Такие составы и процедуры нанесения хорошо известны в данной области.
Составы. Сформированные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины Bt изолятов, или рекомбинантные микробы, содержащие гены, полученные из Bt изолятов, раскрытых в настоящем документе, могут быть внесены в почву. Сформированный продукт также может наноситься в виде покрытия на семена или в процессе обработки корней или обработки всего растения на поздних стадиях цикла развития кукурузы. Обработка растений и почвы Bt клетками может производиться с использованием смачиваемых порошков, гранул или пудры путем смешивания с различными инертными материалами, такими как неорганические минералы (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и т.п.) или растительными материалами (измельченной сердцевины кукурузного початка, рисовой шелухой, ореховой скорлупой и т.п.). Составы могут включать адгезивные адъюванты, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие составы могут быть водными или неводными и могут применяться в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов и т.п. Ингредиенты могут включать реологические агенты, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы или полимеры.
Как хорошо известно специалисту в данной области, пестицидная концентрация может варьировать в широких пределах в зависимости от природы конкретной композиции, в частности от того, будет ли она представлять собой концентрат или будет использоваться непосредственно. Пестицид может присутствовать по меньшей мере в количестве 1 вес.% и может составлять 100% веса композиции. Сухие композиции могут содержать пестицид в количестве примерно от 1 до 95 вес.%, в то время как жидкие составы, как правило, могут содержать примерно от 1 до 60 вес.% твердого вещества в жидкой фазе. Композиции, как правило, могут содержать примерно от 102 до 104 клеток/мг. Эти составы применяются в количестве от примерно 50 мг (в жидком или сухом виде) до 1 кг или более на гектар.
Составы могут наноситься на среде обитания чешуекрылого насекомого-вредителя, например на листву или на почву, путем орошения, опыления, обрызгивания и т.п.
Трансформация растений. Предпочтительным рекомбинантным хозяином для продуцирования обладающих инсектицидным действием белков по изобретению является трансформированное растение. Гены, кодирующие белки Bt токсина, как это раскрыто в настоящем документе, могут быть введены в клетки растения множеством различных методов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, для подготовки к введению чужеродных генов в высшие растения доступно множество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему Escherichia coli и маркер, который обеспечивает возможность отбора трансформированных клеток. В число таких векторов входят, помимо прочих, pBR322, pUC серия, M13mp серия и pACYC184. Соответственно, фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок Bt токсина, может быть вставлен в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученная в результате плазмида используется для трансформации в E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиды выделяют. В качестве способов анализа обычно используют секвенирование, рестрикционный анализ, электрофорез и другие биохимические и молекулярно-биологические способы. После каждой операции использованная ДНК-последовательность может быть отщеплена и присоединена к следующей ДНК-последовательности. Каждая плазмидная последовательность может быть клонирована в тех же или других плазмидах. В зависимости от способа введения в растение желаемых генов также могут быть необходимы другие ДНК-последовательности. Например, если для трансформации клетки растения используются плазмиды Ti или Ri, то по меньшей мере правый конец, а часто как правый, так и левый концы Ti или Ri плазмидной Т-ДНК, должны быть присоединены в качестве фланкирующих областей предназначенных для вставки генов. Использование Т-ДНК для трансформации клеток растений подробно исследовано и исчерпывающе раскрыто в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) и An et al. (1985) и является хорошо известным в данной области техники.
После того как введенная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относительно стабильной. Трансформационный вектор обычно содержит обеспечивающий возможность отбора маркер, который обеспечивает устойчивость трансформированной клетки растения к биоциду или антибиотику, такому как, например, Биалафос, Канамицин, G418, Блеомицин или Гигромицин. Отдельно используемый маркер должен, соответственно, обеспечивать отбор трансформированных клеток, а не тех клеток, которые не содержат вводимую ДНК.
Существует множество способов введения ДНК в растительную клетку-хозяина. Эти способы включают трансформацию с помощью Т-ДНК, используя Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, слияние, инъекцию, биолистику (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные способы. Если для трансформации используются Agrobacteria, предназначенные для введения ДНК должна быть клонирована в специальные плазмиды, а именно либо в промежуточный вектор, либо в бинарный вектор. Промежуточные векторы могут быть встроены в Ti или Ri плазмиду методом гомологичной рекомбинации благодаря последовательностям, которые гомологичны последовательностям в Т-ДНК. Ti или Ri плазмиды также сдержат vir-область, необходимую для переноса Т-ДНК. Промежуточные векторы не могут самореплицироваться в Agrobacteria. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера (конъюгация). Бинарные векторы могут самореплицироваться как в E. coli, так и в Agrobacteria. Они содержат ген маркера селекции и линкер или полилинкер, который ограничен областями правой и левой границ Т-ДНК. Они могут быть трансформированы непосредственно в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacteria, используемые в качестве клетки-хозяина, должны содержать плазмиду, несущую vir-область. Vir-область необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. Также могут содержаться дополнительные Т-ДНК. Трансформированные таким образом бактерии используются для трансформации клеток растения. Для переноса ДНК в клетку растения растительные эксплантанты можно преимущественно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. Затем из инфицированного растительного материала (например, частей листьев, сегментов стебля, корней, а также из протопластов или клеток, культивированных в суспензии) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды для селекции, может быть регенерировано целое растение. Полученные таким образом растения затем могут быть исследованы на наличие внедренной ДНК. В случае инъекции или электропорации к плазмидам не предъявляется никаких дополнительных требований. Возможно использование обычных плазмид, таких как, например, производные от pUC.
Трансформированные клетки растут в растениях обычным образом. Они могут формировать зародышевые клетки и передавать трансформированный признак(и) растениям-потомкам. Такие растения можно выращивать обычным способом и скрещивать с растениями, которые имеют такие же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные в результате гибридные особи обладают соответствующими фенотипическими свойствами.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения трансформируют генами, в которых использование кодона оптимизировано для растений. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящий документ в виде ссылки. Хотя в настоящем документе в качестве примеров приведены укороченные токсины, в области использования Bt хорошо известно, что 130 кДа (полноразмерные) токсины имеют N-концевую половину, которая является ядром токсина, и С-концевую половину, которая представляет собой “хвост” протоксина. Таким образом, с укороченными/ядерными токсинами по настоящему изобретению можно использовать подходящие “хвосты”. См., например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Помимо этого способы создания синтетических Bt генов для использования в растениях известны в данной области техники (Stewart and Burgin, 2007). Одним из неограничивающих примеров трансформированного растения является плодоносное растение маиса, содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry1Da, и дополнительно содержащее экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry1Be.
Перенос (или интрогрессия) признака(ов) определяемого Cry1Da и Cry1Be в инбредные линии маиса может достигаться путем выведения растения на основе рекуррентного отбора, например, путем обратного скрещивания. В этом случае желаемый рекуррентный родитель сначала скрещивается с донорной инбредной особью (нерекуррентным родителем), несущей подходящий ген(ы) для признаков, определяемых Cry1D и Cry1Be. Затем потомство от этого обратного скрещивания спаривают с рекуррентным родителем с последующим отбором полученного потомства на предмет желаемого признака(ов), который должен быть перенесен от нерекуррентного родителя. После трех, предпочтительно четырех, более предпочтительно пяти или более поколений, полученных методом обратного скрещивания с рекуррентным родителем и в результате отбора по желаемому признаку(ам), потомство становится гетерозиготным по локусу, контролирующему переносимый признак(и), но остается подобным рекуррентному родителю по большинству или почти по всем остальным генам (см., например, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1 : Theory and Technique, 360-376).
Стратегии управления устойчивостью насекомых (IRM)
Например, Roush et al. описывает стратегии с двумя токсинами, что также называется созданием “пирамид” или “пакетов”, для управления трансгенными растениями, обладающими инсектицидными свойствами (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
На другом веб-сайте Агентство США по защите окружающей среды (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опубликовало следующие требования для обеспечения нетрансгенных (т.е. не содержащих Bt генов) убежищ (рефугий) (раздел зерновые культуры/кукуруза, не содержащие Bt генов) для использования с трансгенными зерновыми культурами, продуцирующими один Bt белок, активный по отношению к целевым насекомым-вредителям. “Конкретные структурированные требования к кукурузе, защищенной от мотылька кукурузного Bt белками (Cry1Ab или Cry1F), являются следующими:
структурированные убежища: 20% убежище из кукурузы, не имеющей Bt защиты от чешуекрылых в областях, где кукуруза является основной культурой;
50% убежище из растений, не имеющих Bt защиты от чешуекрылых, в областях, где хлопок является основной культурой;
Блоки
Внутренние (т.е. внутри Bt поля).
Внешние (т.е. отдельные поля в пределах 1/2 мили (1/4 мили, если возможно) от Bt поля для обеспечения максимального объема случайного спаривания).
Расположенные на поле полосы
Полосы должны иметь по меньшей мере 4 ряда в ширину (предпочтительно 6 рядов) для уменьшения эффекта перемещения личинок”.
Помимо этого Национальная Ассоциация Производителей Кукурузы на своем веб-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) также представила похожие рекомендации в отношении требований к убежищам. Например:
“Требования в отношении IRM для мотылька кукурузного:
- засевать по меньшей мере 20% от площади посева кукурузы под гибриды-убежища;
- в регионах, выращивающих хлопок, убежища должны составлять 50%;
- посевы необходимо высаживать в пределах 1/2 мили от гибридов-убежищ;
- убежища можно засевать в виде полос внутри Bt поля; полосы-убежища должны составлять по меньшей мере 4 ряда в ширину;
- убежища могут обрабатываться обычными пестицидами только в случае достижения экономического порога, достигаемого для целевого насекомого;
- основанные на Bt распыляемые инсектициды нельзя использовать в отношении кукурузы-убежища;
- подходящие убежища необходимо высаживать на каждой ферме с Bt кукурузой”.
Как указано у Roush et al. (например, на стр. 1780 и 1784, правая колонка), создание пакетов или пирамид из двух различных белков, каждый из которых является активным в отношении целевого насекомого-вредителя, и с малой или без перекрестной устойчивости может обеспечивать возможность использования меньших убежищ. Roush указывает, что для успешно разработанного пакета размер убежища менее чем 10% может обеспечить эффект по управлению устойчивостью, сопоставимый с 50% убежищем для одиночного (на организованного в виде пирамиды) признака. Для доступных в настоящее время Bt продуктов кукурузы Агентство Защиты Окружающей Среды США требует существенно меньшего объема (обычно 5%) высаженных структурированных убежищ кукурузы, не содержащей Bt гены, чем в случае продуктов с единственным признаком (обычно 20%).
Существуют различные способы обеспечения IRM эффектов убежищ, включая различные геометрические паттерны посадок на полях (как уже упоминалось выше) и смешивание семян перед посевом, как обсуждалось у Roush et al. (см. выше) и в патенте США № 6551962.
Приведенные выше процентные соотношения или близкие к ним соотношения убежищ могут использоваться для рассматриваемых двойных и тройных пакетов или пирамид. Для тройных пакетов и тремя местами действия против одного целевого насекомого-вредителя целевым значением является нулевая площадь убежища (или убежище с площадью, например, менее 5%). Это в особенности верно для коммерческих посевных площадей, например, более чем 10 акров.
Все патенты, заявки на патент, предварительные заявки и публикации, на которые приведены ссылки или которые цитируются в настоящем документе, включены в виде ссылки во всей своей полноте в той части, в которой они не противоречат сведениям, в явном виде приводимым в настоящем описании.
За исключением случаев, когда это специально оговорено или следует из контекста, грамматические формы единственного числа следует понимать как означающие “по меньшей мере один”.
Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют способы осуществления изобретения. Эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих. Все процентные соотношения указаны по массе, а соотношения в растворах указаны по объему. Все температуры указаны в градусах Цельсия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 -
125
I мечение Cry белков
Йодирование Cry токсинов. Очищенные укороченные Cry токсины йодировали, используя йодогранулы Iodo-beads или IODOGEN (Pierce). Вкратце, две йодогранулы дважды промывали 500 мкл забуференного фосфатом рассола, PBS (20 мМ фосфата натрия, 0,15 M NaCl, pH 7,5), и помещали в 1,5 мл центрифужную пробирку за свинцовым экраном. Добавляли 100 мкл PBS. В тубус, используя соответствующие способы работы с радиоактивными веществами, в PBS раствор с йодогранулой добавляли 0,5 мКи Na125I (17,4 Ки/мг, Lot 0114, Amersham). Реакцию между компонентами проводили в течение 5 минут при комнатной температуре, затем в этот раствор добавляли 2-25 мкг укороченного Cry белка высокой чистоты и проводили реакцию в течение следующих 3-5 минут. Реакцию завершали путем удаления раствора из йодогранул и введения его в 0,5 мл центрифужную колонку Zeba для обессоливания (InVitrogen), уравновешенную PBS. Йодогранулу дважды промывали по 10 мкл PBS и промывочный раствор также вносили в колонку для обессоливания. Радиоактивный раствор элюировали, используя колонку для обессоливания, центрифугированием при 1000x g в течение 2 мин. В случае Cry1Da для выполнения процедуры по введению радиоактивной метки использовали способ IODOGEN. Используя эту процедуру, токсин Cry в 100 мМ фосфатном буфере (pH 8) сначала очищали от липополисахаридов (ЛПС), пропуская его несколько раз через небольшую 0,5 мл колонку на основе полимиксина. В пробирку IODOGEN (Pierce Chem. Co.) добавляли 20 мкг Cry1Da токсина, не содержащего ЛПС, а затем 0,5 мКи Na125I. Реакционную смесь встряхивали в течение 15 мин при 25°C. Раствор из пробирки удаляли и для завершения реакции добавляли 50 мкл 0,2 М нерадиоактивного NaI. Белок диализовали против PBS 3-ды, меняя буфер, для удаления любого несвязанного 125I.
Радиочистоту йодированных Cry белков определяли методами ДСН-ПААГ электрофореза, формирования изображения на люминесцентном покрытии и подсчета гамма событий. Вкратце, 2 мкл радиоактивного белка выделяли методом ДСН-ПААГ электрофореза. После выделения гели сушили в устройстве для сушки гелей BioRad согласно инструкции производителя. Изображение высушенных гелей получали путем обертывания их пленкой Mylar (толщиной 12 мкм) и экспонирования под люминесцентным экраном с длительным послесвечением Molecular Dynamics (35 см × 43 см) в течение 1 часа. Пластины проявляли на люминесцентном устройстве визуализации Molecular Dynamics Storm 820, и изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant™. Радиоактивную полосу вместе с областями, расположенными непосредственно выше и ниже этой полосы, вырезали из геля лезвием бритвы и осуществляли подсчет событий с помощью гамма-счетчика. Радиоактивность детектировали только в полосе, соответствующей Cry белку, и в областях, расположенных ниже этой полосы. Отсутствие радиоактивности в областях, расположенных выше полосы, указывало на то, что все радиоактивные вещества состояли из компонентов белка, более мелких по сравнению с укороченным Cry белком. Эти компоненты, наиболее вероятно, представляли собой продукты распада.
Пример 2 - Протокол получения BBMV
Получение и фракционирование растворенного BBMV. Личинок Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis или Heleothis zea на последней возрастной стадии выдерживали без пищи всю ночь, а затем утром препарировали после охлаждения на льду в течение 15 минут. Из полости тела удаляли ткань средней кишки, оставляя расположенную сзади заднюю кишку, прикрепленную к наружному покрову. Среднюю кишку помещали в 9X объем охлажденного льдом буфера для гомогенизации (300 мМ маннита, 5 мМ EGTA, 17 мМ основания Трис, pH 7,5), дополненного коктейлем ингибиторов протеаз (Sigma P-2714), разбавленным согласно рекомендациям поставщика. (Конечная концентрация компонентов коктейля (в мкМ) составляет AEBSF (500), ЭДТА (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) и апротинин (0,075).). Ткань гомогенизировали 15 ударами, используя стеклянный гомогенизатор тканей. BBMV получали преципитацией MgCl2 по методу Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ раствора MgCl2 в 300 мМ маннита смешивали с гомогенатом средней кишки, перемешивали в течение 5 минут и выстаивали на льду в течение 15 мин. Раствор центрифугировали при 2500x g в течение 15 мин при 4°C. Супернатант сохраняли, а осадок суспендировали в исходном объеме 0,5-X разведенного буфера для гомогенизации и снова центрифугировали. Два супернатанта объединяли, центрифугировали при 27000x g в течение 30 мин при 4°C для получения фракции BBMV. Осадок суспендировали в 10 мл буфера для гомогенизации, добавляли к ингибиторам протеаз и снова центрифугировали при 27000x g в течение 30 мин при 4°C для промывки BBMV. Полученный осадок суспендировали в буфере для хранения BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% глицерина, pH 7,4) до получения концентрации белка примерно 3 мг/мл. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976), используя бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве стандарта. Перед заморозкой образцов определяли активность щелочной фосфатазы методом анализа Sigma согласно инструкции производителя. Удельная активность маркерного фермента во фракции BBMV, как правило, в 7 раз превышала активность, определенную во фракции гомогената средней кишки. BBMV фасовали по 250 мкл образцов, быстро замораживали в жидком N2 и хранили при -80°C.
Пример 3 - Способ измерения связывания
125
I Cry белков с BBMV белками
Связывание 125I Cry белка с BBMV. Для определения оптимального количества белка BBMV для использования в анализе связывания строили кривую насыщения. 125I-меченный Cry белок (0,5 нМ) инкубировали в течение 1 часа при 28°C с различными количествами белка BBMV в пределах от 0 до 500 мкг/мл в буфере для связывания (8 мМ NaHPO4, 2 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4). Общий объем составлял 0,5 мл. Связанный 125I Cry белок отделяли от несвязанного путем переноса 150 мкл образца реакционной смеси в трех экземплярах из 1,5 мл центрифужной пробирки в 500 мкл центрифужную пробирку и центрифугирования образцов при 14000x g в течение 6 минут при комнатной температуре. Супернатант бережно удаляли, а осадок бережно промывали три раза охлажденным льдом буфером для связывания. Дно центрифужной пробирки с находящимся в нем осадком отрезали и помещали в 13×75-мм стеклянную культуральную пробирку. В каждом образце подсчитывали события гамма-счетчиком в течение 5 минут. Число событий, определенных в образце, вычитали из количества фоновых событий (реакция без какого-либо белка) и наносили на график в зависимости от концентрации белка BBMV. Оптимальное для использования количество белка было определено как равное 0,15 мг/мл BBMV белка.
Для определения кинетических характеристик связывания строили кривую насыщения. Вкратце, BBMV (150 мкг/мл) инкубировали в течение 1 часа при 28°C с 125I Cry токсином с концентрацией, увеличивающейся в пределах от 0,01 до 10 нМ. Общее связывание определяли путем троекратного отбора по 150 мкл каждой концентрации, центрифугирования и подсчета событий, как описано выше. Неспецифическое связывание определяли таким же способом, при этом в реакционную смесь добавляли 1000 нМ гомологичного трипсинизированного нерадиоактивного Cry токсина до насыщения всех неспецифических сайтов связывания с рецепторами. Специфическое связывание вычисляли в виде разницы между общим связыванием и неспецифическим связыванием.
Анализ конкурентного гомологичного и гетерологичного связывания выполняли, используя 150 мкг/мл BBMV белка и 0,5 нМ Cry белка с радиоактивной 125I меткой. Конкурентный немеченный Cry токсин добавляли в реакционную смесь в концентрациях, меняющихся от 0,045 до 1000 нМ, и в то же самое время добавляли радиоактивный лиганд для обеспечения истинного конкурентного связывания. Инкубировали в течение 1 часа при 28°C и измеряли количество 125I Cry белка, связанного с рецептором токсина, как описано выше, с вычитанием неспецифического связывания. Стопроцентное общее связывание определяли в отсутствие всех конкурентных лигандов. Результаты представлены в виде графика с использованием полулогарифмической шкалы в виде зависимости выраженного в процентах общего специфического связывания от концентрации добавленного конкурентного лиганда.
Пример 4 - Краткий обзор результатов
На Фиг. 1 показано выраженное в процентах общее специфическое связывание 125I Cry1Be (0,5 нМ) с BBMV, выделенным из FAW, в зависимости от степени конкуренции с немеченными гомологичным Cry1Be (●) и гетерологичным Cry1Da (○). Кривая замещения для гомологичной конкуренции с Cry1Be имеет вид сигмоидальной кривой, показывающей 50% замещение радиоактивно меченного лиганда при примерно 2 нМ Cry1Be. Cry1Da при концентрации 1000 нМ (в 2000 раз больше, чем концентрация замещаемого 125I Cry1Be) дает в результате замещение менее 50%. Указанные ошибки представляют диапазон значений, полученных при тройном определении.
На Фиг. 2 показано выраженное в процентах общее специфическое связывание 125I Cry1Da (0,5 нМ) с BBMV, выделенным из FAW, в зависимости от степени конкуренции с немеченными гомологичным Cry1Da (○) и гетерологичным Cry1Be (●). Кривая замещения для гомологичной конкуренции с Cry1Da имеет вид сигмоидальной кривой, показывающей 50% замещение радиоактивно меченного лиганда при примерно 1,5 нМ Cry1Da. Cry1Be не смещает специфическое связывание 125I Cry1Da ни при какой из исследованных концентраций, вплоть до 1000 нМ, что в 2000 раз больше концентрации 125I Cry1Da, использованной в анализе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Claims (19)
1. Трансгенное растение, устойчивое к кукурузной листовой совке, содержащее ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Трансгенное растение по п. 1, где указанное растение дополнительно содержит ДНК, кодирующую третий белок, содержащий ядро токсина, при этом указанный третий белок выбирают из группы, состоящей из Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1Ca и Cry1E.
3. Трансгенное растение по п. 2, где указанное растение дополнительно содержит ДНК, кодирующую белок Cry1Fa, и ДНК, кодирующую четвертый белок, выбираемый из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I, DIG-3 и Cry1Ab.
4. Семя растения по любому из пп. 1-3, содержащее ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1, где указанное семя высевают для борьбы с развитием устойчивости у кукурузной листовой совки к обладающим инсектицидным действием белкам Cry1Da и Cry1Be.
5. Совокупность растений на поле, содержащая растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), и множество трансгенных растений по любому из пп. 1-3, устойчивых к кукурузной листовой совке, где упомянутые трансгенные растения содержат ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 5%-40% всех растений упомянутой совокупности, где упомянутая совокупность растений замедляет развитие устойчивости кукурузной листовой совки к белкам Cry1Da и Cry1Be.
6. Совокупность растений по п. 5, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 30% всех растений указанной совокупности.
7. Совокупность растений по п. 5, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 20% всех растений указанной совокупности.
8. Совокупность растений по п. 5, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 10% всех растений указанной совокупности.
9. Совокупность растений по п. 5, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 5% всех растений указанной совокупности.
10. Совокупность растений по п. 5, где указанные растения, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), расположены блоками или полосами.
11. Смесь семян, содержащая семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), и множество семян по п. 4, где указанные семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 5%-40% от всех семян в смеси, где упомянутую смесь семян высевают для борьбы с развитием устойчивости кукурузной листовой совки к обладающим инсектицидным действием белкам Cry1Da и Cry1Be.
12. Смесь семян по п. 11, где указанные семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 30% от всех семян в смеси.
13. Смесь семян по п. 11, где указанные семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 20% от всех семян в смеси.
14. Смесь семян по п. 11, где указанные семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 10% от всех семян в смеси.
15. Смесь семян по п. 11, где указанные семена, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), составляют 5% от всех семян в смеси.
16. Способ снижения развития устойчивости к обладающему инсектицидным действием белку Cry1Da и обладающему инсектицидным действием белку Cry1Be у кукурузной листовой совки, причем указанный способ содержит этап посева семян для создания совокупности растений, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), и трансгенных растений, содержащих ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Da, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 2, и ДНК, кодирующую обладающий инсектицидным действием белок Cry1Be, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1, контактирование упомянутой кукурузной листовой совки с упомянутой совокупностью растений, которые не экспрессируют обладающий инсектицидным действием трансгенный белок Bacillus thuringiensis (Bt), и трансгенных растений.
17. Совокупность растений по любому из пп. 5-10, где указанная совокупность растений занимает более 10 акров.
18. Растение по любому из пп. 1-3, где указанное растение выбирают из группы, состоящей из маиса, кукурузы, сои и хлопка.
19. Способ борьбы с развитием устойчивости кукурузной листовой совки к белкам Cry1Da и Cry1Be, где указанный способ включает приведение в контакт указанного насекомого с обладающим инсектицидным действием белком Cry1Be, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 1, и обладающим инсектицидным действием белком Cry1Da, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 2.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28429009P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
| US28425209P | 2009-12-16 | 2009-12-16 | |
| US61/284,290 | 2009-12-16 | ||
| US61/284,252 | 2009-12-16 | ||
| PCT/US2010/060829 WO2011084630A1 (en) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | Use of cry1da in combination with cry1be for management of resistant insects |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012129910A RU2012129910A (ru) | 2014-01-27 |
| RU2590592C2 true RU2590592C2 (ru) | 2016-07-10 |
Family
ID=44305722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012129910/10A RU2590592C2 (ru) | 2009-12-16 | 2010-12-16 | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9499835B2 (ru) |
| EP (1) | EP2513317B1 (ru) |
| JP (2) | JP5969921B2 (ru) |
| KR (1) | KR101841296B1 (ru) |
| CN (1) | CN102753696A (ru) |
| AR (1) | AR079506A1 (ru) |
| AU (1) | AU2010339919B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012014727B1 (ru) |
| CA (1) | CA2782565A1 (ru) |
| CL (1) | CL2012001623A1 (ru) |
| CO (1) | CO6561806A2 (ru) |
| IL (1) | IL220332A (ru) |
| MX (1) | MX350002B (ru) |
| NZ (1) | NZ601102A (ru) |
| RU (1) | RU2590592C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011084630A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201204925B (ru) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569108C2 (ru) | 2009-12-16 | 2015-11-20 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ |
| JP2014525748A (ja) * | 2011-08-05 | 2014-10-02 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Ｃｒｙ１Ａｂと組み合わせたＤＩＧ３殺虫性結晶タンパク質の使用 |
| US10119149B2 (en) | 2011-08-05 | 2018-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer |
| WO2014055881A1 (en) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects |
| US10968446B2 (en) | 2012-11-01 | 2021-04-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Directed evolution of synthetic gene cluster |
| CA2901316A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Phi-4 polypeptides and methods for their use |
| MX359026B (es) | 2013-08-16 | 2018-09-12 | Pioneer Hi Bred Int | Proteinas insecticidas y metodos de uso. |
| ES2937045T3 (es) | 2013-09-13 | 2023-03-23 | Pioneer Hi Bred Int | Proteínas insecticidas y métodos para su uso |
| CN106232620B (zh) | 2014-02-07 | 2022-05-13 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| BR112016018287A2 (pt) | 2014-02-07 | 2017-10-10 | Du Pont | proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas |
| AR099800A1 (es) | 2014-03-21 | 2016-08-17 | Agrigenetics Inc | Cry1d para controlar el gusano de la mazorca del maíz |
| WO2016000237A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Pioneer Overseas Corporation | Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes |
| CA2963558C (en) | 2014-10-16 | 2023-04-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA2977026A1 (en) | 2015-03-11 | 2016-09-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Insecticidal combinations of pip-72 and methods of use |
| CA2985198A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3310803A1 (en) | 2015-06-16 | 2018-04-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| KR102197507B1 (ko) | 2015-07-13 | 2020-12-31 | 피벗 바이오, 인크. | 식물 형질 개선을 위한 방법 및 조성물 |
| WO2017023486A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| JP2018527931A (ja) | 2015-08-28 | 2018-09-27 | パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド | 植物のオクロバクテリウム（ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介形質転換 |
| EP3359664A4 (en) | 2015-10-05 | 2019-03-20 | Massachusetts Institute Of Technology | NITROGEN FIXATION WITH REINFORCED NIF CLUSTERS |
| CA3002995A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3442994A4 (en) | 2016-04-14 | 2019-11-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | INSECTICIDES POLYPEPTIDES WITH IMPROVED EFFICIENCY SPECTRUM AND USES THEREOF |
| CN109072249B (zh) | 2016-04-19 | 2023-08-18 | 先锋国际良种公司 | 具有改善的活性谱的多肽的杀昆虫组合及其用途 |
| CA3018384A1 (en) | 2016-05-04 | 2017-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CA3022858A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| EP3475430B1 (en) | 2016-06-24 | 2022-06-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| EP3954202A1 (en) | 2016-07-01 | 2022-02-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| US20210292778A1 (en) | 2016-07-12 | 2021-09-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
| AU2017342921B2 (en) | 2016-10-10 | 2023-06-15 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
| CA3038806A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11174295B2 (en) | 2016-12-14 | 2021-11-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| EP3558004A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-10-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| BR112019014378A2 (pt) | 2017-01-12 | 2020-02-11 | Pivot Bio, Inc. | Métodos e composições para o aprimoramento de traços de plantas |
| WO2018140214A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nematicidal protein from pseudomonas |
| CA3052794A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use |
| RU2019140646A (ru) | 2017-05-11 | 2021-06-11 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Инсектицидные белки и способы их применения |
| CN110914438A (zh) | 2017-05-26 | 2020-03-24 | 先锋国际良种公司 | 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途 |
| WO2019074598A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | VIRUS-INDUCED GENETIC SILENCING TECHNOLOGY FOR THE CONTROL OF INSECTS IN MAIZE |
| RU2020116764A (ru) | 2017-10-25 | 2021-11-25 | Пивот Байо, Инк. | Способы и композиции для улучшения сконструированных микроорганизмов, фиксирующих азот |
| EP3755797A1 (en) | 2018-02-22 | 2020-12-30 | Zymergen, Inc. | Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins |
| US20210002657A1 (en) | 2018-03-02 | 2021-01-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant health assay |
| KR20200127180A (ko) | 2018-03-02 | 2020-11-10 | 지머젠 인코포레이티드 | 살충 단백질 발견 플랫폼 및 이로부터 발견된 살충 단백질 |
| CN115850420A (zh) | 2018-03-14 | 2023-03-28 | 先锋国际良种公司 | 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CA3092075A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins from plants and methods for their use |
| CA3096516A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant regulatory elements and methods of use thereof |
| AU2019291824A1 (en) | 2018-06-27 | 2021-01-14 | Pivot Bio, Inc. | Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes |
| MX2021001075A (es) * | 2018-07-30 | 2021-04-12 | Monsanto Technology Llc | Evento transgenico de maiz mon 95379 y metodos para su deteccion y usos. |
| CN112689677B (zh) | 2018-08-29 | 2024-09-03 | 先锋国际良种公司 | 杀昆虫蛋白及其使用方法 |
| CN110317242B (zh) * | 2019-06-12 | 2021-03-26 | 南昌大学 | 可特异性结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用 |
| WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
| WO2021221690A1 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| WO2021222567A2 (en) | 2020-05-01 | 2021-11-04 | Pivot Bio, Inc. | Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| WO2022015619A2 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| CN116096903A (zh) | 2020-08-10 | 2023-05-09 | 先锋国际良种公司 | 植物调节元件及其使用方法 |
| CA3218556A1 (en) | 2021-07-02 | 2023-01-05 | Pivot Bio, Inc. | Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen |
| WO2023164453A2 (en) * | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Multiple disease resistance genes and genomic stacks thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
| US5723758A (en) * | 1991-09-13 | 1998-03-03 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis genes encoding lepidopteran-active toxins |
| RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5188960A (en) * | 1989-06-27 | 1993-02-23 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| US5942664A (en) * | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6218188B1 (en) * | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
| BR0014516A (pt) * | 1999-09-15 | 2002-07-02 | Monsanto Technology Llc | Composições e métodos de uso de delta-endotoxina do bacilo thuringiensis ativo de lepidopteran |
| US20070006340A1 (en) | 2004-03-05 | 2007-01-04 | Lang Bruce A | Combinations of Cry1Ab and Cry1Fa as an insect resistance management tool |
| BRPI0911589A2 (pt) * | 2008-05-01 | 2015-08-04 | Bayer Bioscience Nv | Manejo de resistência do inseto lagarta do cartucho em plantas transgênicas |
| AU2010236944B2 (en) * | 2009-04-17 | 2016-07-21 | Dow Agrosciences Llc | DIG-3 insecticidal Cry toxins |
-
2010
- 2010-12-16 RU RU2012129910/10A patent/RU2590592C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 WO PCT/US2010/060829 patent/WO2011084630A1/en active Application Filing
- 2010-12-16 EP EP10842619.8A patent/EP2513317B1/en active Active
- 2010-12-16 AU AU2010339919A patent/AU2010339919B2/en not_active Ceased
- 2010-12-16 CN CN2010800639087A patent/CN102753696A/zh active Pending
- 2010-12-16 MX MX2012007126A patent/MX350002B/es active IP Right Grant
- 2010-12-16 CA CA2782565A patent/CA2782565A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-16 US US13/516,665 patent/US9499835B2/en active Active
- 2010-12-16 KR KR1020127018336A patent/KR101841296B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 JP JP2012544845A patent/JP5969921B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 NZ NZ601102A patent/NZ601102A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 AR ARP100104679 patent/AR079506A1/es unknown
- 2010-12-16 BR BR112012014727A patent/BR112012014727B1/pt not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-06-12 IL IL220332A patent/IL220332A/en not_active IP Right Cessation
- 2012-06-15 CL CL2012001623A patent/CL2012001623A1/es unknown
- 2012-07-02 ZA ZA2012/04925A patent/ZA201204925B/en unknown
- 2012-07-16 CO CO12119364A patent/CO6561806A2/es not_active Application Discontinuation
-
2016
- 2016-02-08 JP JP2016021704A patent/JP2016154536A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
| US5723758A (en) * | 1991-09-13 | 1998-03-03 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis genes encoding lepidopteran-active toxins |
| RU2210593C2 (ru) * | 1993-09-02 | 2003-08-20 | Новартис Аг | ФРАГМЕНТ ГИБРИДНОГО ТОКСИНА Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, КОДИРУЮЩАЯ ЕГО РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PARDO-LOPEZ L. et al., Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis, Peptides. 2009, Vol.30, N.3, pp. 589-595. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201204925B (en) | 2013-03-27 |
| EP2513317A4 (en) | 2013-10-02 |
| US9499835B2 (en) | 2016-11-22 |
| IL220332A0 (en) | 2012-08-30 |
| JP2016154536A (ja) | 2016-09-01 |
| JP2013514774A (ja) | 2013-05-02 |
| JP5969921B2 (ja) | 2016-08-17 |
| CO6561806A2 (es) | 2012-11-15 |
| KR101841296B1 (ko) | 2018-03-22 |
| EP2513317B1 (en) | 2018-01-24 |
| CN102753696A (zh) | 2012-10-24 |
| WO2011084630A1 (en) | 2011-07-14 |
| IL220332A (en) | 2017-12-31 |
| NZ601102A (en) | 2014-10-31 |
| EP2513317A1 (en) | 2012-10-24 |
| AU2010339919B2 (en) | 2016-01-21 |
| MX350002B (es) | 2017-08-22 |
| CA2782565A1 (en) | 2011-07-14 |
| KR20120115980A (ko) | 2012-10-19 |
| RU2012129910A (ru) | 2014-01-27 |
| AR079506A1 (es) | 2012-02-01 |
| US20120331590A1 (en) | 2012-12-27 |
| AU2010339919A1 (en) | 2012-07-12 |
| MX2012007126A (es) | 2012-11-12 |
| CL2012001623A1 (es) | 2013-01-25 |
| BR112012014727A2 (pt) | 2015-08-25 |
| BR112012014727B1 (pt) | 2019-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2590592C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Be ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ | |
| JP5907892B2 (ja) | 抵抗性昆虫の対応のためのＣｒｙ１Ｂｅと組み合わせたＣｒｙ１Ａｂの使用 | |
| RU2603257C2 (ru) | КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ Cry1Da И Cry1Fa ДЛЯ ВЫРАБАТЫВАНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К НАСЕКОМЫМ | |
| RU2569108C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Da В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ | |
| AU2013326885B2 (en) | Use of Cry1Ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects | |
| US9045766B2 (en) | Combined use of Vip3Ab and Cry1Ab for management of resistant insects | |
| AU2012294678B2 (en) | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with Cry1Ab | |
| US10119149B2 (en) | Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer | |
| JP5913124B2 (ja) | サトウキビでのＣｒｙ抵抗性のシュガーケーンボーラーの防除および昆虫抵抗性管理のためのＣＲＹ１ＦａおよびＣＲＹ１Ａｂタンパク質の併用 | |
| RU2575084C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ Vip3Ab В СОЧЕТАНИИ С Cry1Ca ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫМИ НАСЕКОМЫМИ | |
| NZ621811B2 (en) | Use of dig3 insecticidal crystal protein in combination with cry1ab |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181217 |