RU2575095C2 - Anti-beta-amyloid oligomer humanised antibody - Google Patents
Anti-beta-amyloid oligomer humanised antibody Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575095C2 RU2575095C2 RU2012108610/10A RU2012108610A RU2575095C2 RU 2575095 C2 RU2575095 C2 RU 2575095C2 RU 2012108610/10 A RU2012108610/10 A RU 2012108610/10A RU 2012108610 A RU2012108610 A RU 2012108610A RU 2575095 C2 RU2575095 C2 RU 2575095C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- replaced
- amino acid
- acid sequence
- lys
- leu
- Prior art date
Links
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 490
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 490
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 29
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010057668 Cognitive disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 832
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 claims description 13
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 7
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 206010012271 Dementia Alzheimer's type Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 65
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 465
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 210
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 189
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 187
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 185
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 184
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 158
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 156
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 148
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 119
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 116
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 102
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 72
- 125000002041 N(2)-L-arginino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 59
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 49
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 45
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 36
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 36
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 36
- 102100009178 RUNX1T1 Human genes 0.000 description 32
- 101710034060 RUNX1T1 Proteins 0.000 description 32
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 31
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 22
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 17
- 210000004408 Hybridomas Anatomy 0.000 description 17
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 16
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 15
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 15
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000002609 media Substances 0.000 description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 229940021015 I.V. solution additive Amino Acids Drugs 0.000 description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 210000000225 Synapses Anatomy 0.000 description 6
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000000628 Antibody-Producing Cells Anatomy 0.000 description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 4
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 4
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 4
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 102100003292 CDA Human genes 0.000 description 3
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 3
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 3
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-Acetylglucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 3
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 3
- 230000002887 neurotoxic Effects 0.000 description 3
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003767 Alanine Drugs 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 229920001276 Ammonium polyphosphate Polymers 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101710007887 DHFR Proteins 0.000 description 2
- 230000035687 Dissociation Rate Constant Effects 0.000 description 2
- 230000036947 Dissociation constant Effects 0.000 description 2
- 101700044513 FUT8 Proteins 0.000 description 2
- 102100012684 FUT8 Human genes 0.000 description 2
- 210000002683 Foot Anatomy 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 2
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 2
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 229960004452 Methionine Drugs 0.000 description 2
- 229950006780 N-Acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N Pathocidin Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 229940093430 Polyethylene Glycol 1500 Drugs 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229960002429 Proline Drugs 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 229960004441 Tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N [N-]=C=S Chemical compound [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N [[5-(2-amino-6-oxo-3H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] (3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl) hydrogen phosphate Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O1 LQEBEXMHBLQMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 acridinium ester Chemical class 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002828 effect on organs or tissue Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2S)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N (2S)-2-amino-4,4-dimethylpentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)C[C@H](N)C(O)=O LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 2,3-Diaminopropionic acid Chemical compound [NH3+]C[C@H](N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- YOFPFYYTUIARDI-UHFFFAOYSA-N 2-aminooctanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCCCC(O)=O YOFPFYYTUIARDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-BKLSDQPFSA-N 3-hydroxy-L-proline Chemical compound OC1CCN[C@@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-BKLSDQPFSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 150000005168 4-hydroxybenzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940024546 Aluminum Hydroxide Gel Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 Aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014303 Amyloid beta-Protein Precursor Human genes 0.000 description 1
- 108010079054 Amyloid beta-Protein Precursor Proteins 0.000 description 1
- 229940064004 Antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N Bute hydrocarbon Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLNSPJMIYWEWNF-UHFFFAOYSA-N CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C.CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C.CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C QLNSPJMIYWEWNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229960002433 Cysteine Drugs 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100005838 DHFR Human genes 0.000 description 1
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 240000006245 Dichrostachys cinerea Species 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001441 Fragaria vesca Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229960002449 Glycine Drugs 0.000 description 1
- 101710015954 HVA1 Proteins 0.000 description 1
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 Hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N L-2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCC[C@H](N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-2-aminohexanoic acid zwitterion Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid zwitterion Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N L-Asparagine Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 101700065814 LEA2 Proteins 0.000 description 1
- 101700021338 LEC Proteins 0.000 description 1
- 101700077545 LECC Proteins 0.000 description 1
- 101700028499 LECG Proteins 0.000 description 1
- 101700063913 LECT Proteins 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 240000006217 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710017500 MitHPPK/DHPS Proteins 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000201593 Nihon Species 0.000 description 1
- KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N O-methylserine Chemical compound COC[C@H](N)C(O)=O KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229960003104 Ornithine Drugs 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710034340 Os04g0173800 Proteins 0.000 description 1
- XAPRFLSJBSXESP-UHFFFAOYSA-N Oxycinchophen Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=C(O)C=1C1=CC=CC=C1 XAPRFLSJBSXESP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700003795 PDZD2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 1
- 229940072417 Peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 108090000437 Peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229940066827 Pertussis Vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 229940005550 Sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229960004799 Tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000019568 aromas Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000000055 blue native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase family Proteins 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase family Human genes 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013080 embryo development ending in birth or egg hatching Effects 0.000 description 1
- 230000013144 embryo development ending in seed dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000002996 emotional Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin family Proteins 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700036391 lecA Proteins 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 101700001016 mbhA Proteins 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000006678 peppermint Nutrition 0.000 description 1
- 235000015132 peppermint Nutrition 0.000 description 1
- 235000007735 peppermint Nutrition 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000003638 reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- AVJBELCJSGWQNV-UHFFFAOYSA-O rhodamine B 6-isothiocyanate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C(O)=O AVJBELCJSGWQNV-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 231100000197 serious side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M sodium 3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].OC1OC(C([O-])=O)C(O)C(O)C1O MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N trans-L-hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N α-Aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N α-Aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с олигомером β-амилоидного белка (далее обозначенного как «Аβ») и к его применению.The present invention relates to an antibody that specifically binds to an oligomer of a β-amyloid protein (hereinafter referred to as “Aβ”) and its use.
Уровень техникиState of the art
Основываясь на различных данных, было сделано предположение, что снижение памяти при болезни Альцгеймера (далее обозначенной как «AD») происходит результатом дисфункции синапсов, возникающей за счет растворимых олигомеров β-амилоидного белка (далее β-амилоидный белок обозначен как «Аβ» и олигомер β-амилоидного белка обозначен как «Аβ-олигомер») (непатентные документы 1 и 2).Based on various data, it was suggested that memory loss in Alzheimer's disease (hereinafter referred to as “AD”) occurs as a result of synapse dysfunction resulting from soluble oligomers of the β-amyloid protein (hereinafter, the β-amyloid protein is designated as “Aβ” and the oligomer β-amyloid protein is designated as “β-oligomer") (
Следовательно, существует вероятность, что избыточное накопление или отложение Аβ-олигомеров в мозге «запускает» серию патологических каскадов, которые могут привести к развитию AD. Это определяет возможность эффективности медикаментозного лечения, направленного на Аβ-олигомеры, для замедления или профилактики начала и прогрессирования клинического проявления AD.Therefore, it is likely that excessive accumulation or deposition of Aβ-oligomers in the brain “triggers” a series of pathological cascades that can lead to the development of AD. This determines the possibility of the effectiveness of drug treatment aimed at Aβ-oligomers to slow down or prevent the onset and progression of the clinical manifestation of AD.
Однако информация, касающаяся нейродегенерации, вызванной молекулами, лежащими в основе гипотезы амилоидного каскада в качестве основного фактора, в частности, Аβ-олигомерами, была в основном получена в экспериментах in vitro (непатентный документ 3) и не была подтверждена непосредственно in vivo.However, information regarding neurodegeneration caused by the molecules underlying the hypothesis of the amyloid cascade as the main factor, in particular Aβ oligomers, was mainly obtained in in vitro experiments (non-patent document 3) and was not directly confirmed in vivo.
Поскольку структуры, специфические для Аβ-олигомеров, не изучались в опытах in vivo, о которых сообщалось ранее (непатентный документ 4), то токсичность эндогенных Аβ-олигомеров для синапсов не исследовалась.Since the structures specific for Aβ oligomers were not studied in the in vivo experiments reported previously (Non-Patent Document 4), the toxicity of endogenous Aβ oligomers for synapses was not studied.
Кроме того, несмотря на то, что проводились опыты на различных моделях AD на мышах, ранее не была выявлена нейрональная токсичность Аβ-олигомеров в мозге пациентов, страдающих AD.In addition, despite the fact that experiments were conducted on various models of AD in mice, neuronal toxicity of Aβ oligomers in the brain of patients suffering from AD was not previously detected.
Кроме того, ранее не было установлено, почему образование нейрофибриллярного узла (далее обозначен как «NFT») и потеря нервных клеток имеют место до патологического формирования сенильных бляшек в энториальной области коры и каким образом Аβ-олигомеры связаны с дегенерацией ткани и возникновением дисфункций.In addition, it has not been previously established why the formation of a neurofibrillary node (hereinafter referred to as “NFT”) and the loss of nerve cells occur before the pathological formation of senile plaques in the entorial region of the cortex and how Aβ-oligomers are associated with tissue degeneration and the occurrence of dysfunctions.
В качестве антител против Аβ-олигомеров известны моноклональные антитела мышей против Аβ-олигомеров NAB61 (непатентный документ 4), 1A9, 2C3, E12, 1C10 и 4D3 (патентный документ 1).Monoclonal antibodies of mice against the Aβ oligomers NAB61 (Non-Patent Document 4), 1A9, 2C3, E12, 1C10 and 4D3 (Patent Document 1) are known as antibodies against Aβ-oligomers.
В общих чертах известно, что когда антитело, отличное от антитела человека, такое как антитело мыши, вводят человеку, то оно распознается как чужеродное вещество таким образом, что в организме человека индуцируется образование антител человека на антитело мыши (антимышиные антитела человека: HAMA). Известно, что HAMA взаимодействуют с введенным антителом мыши, вызывая побочные реакции (непатентные документы 5-8), ускоряя выведение антитела мыши из организма (непатентные документы 6, 9 и 10) и снижая терапевтический эффект антитела мыши (непатентные документы 11 и 12).In general, it is known that when an antibody other than a human antibody, such as a mouse antibody, is administered to a human, it is recognized as a foreign substance in such a way that the formation of a human antibody to a human antibody is induced in the human body (anti-mouse human antibodies: HAMA). HAMA is known to interact with the introduced mouse antibody, causing adverse reactions (non-patent documents 5-8), accelerating the elimination of the mouse antibody from the body (
Для решения этих проблем предпринимались попытки получить рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека и гуманизированное антитело из антитела, отличного от антитела человека, с использованием методов генетической рекомбинации.To solve these problems, attempts have been made to obtain a recombinant antibody, such as a chimeric human antibody and a humanized antibody from an antibody other than a human antibody, using genetic recombination methods.
Химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное имеет различные преимущества для клинического применения антитела человека по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши. Например, сообщалось, что его иммуногенность снижалась, и его период полураспада удлинялся в опыте на обезьянах по сравнению с антителом мыши (непатентный документ 13).A chimeric human antibody, a humanized antibody and the like has various advantages for the clinical use of a human antibody compared to an antibody other than a human antibody, such as a mouse antibody. For example, it was reported that its immunogenicity was reduced, and its half-life was prolonged in the experiment on monkeys compared with mouse antibodies (non-patent document 13).
То есть, поскольку химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное реже вызывают побочные эффекты у человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, предполагается, что их терапевтический эффект будет сохраняться в течение длительного периода времени.That is, since a human chimeric antibody, a humanized antibody, and the like is less likely to cause side effects in humans compared to antibodies other than human antibodies, it is contemplated that their therapeutic effect will last for a long period of time.
Также, поскольку рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека, гуманизированное антитело и антитело человека готовят с использованием рекомбинантных методов, то его можно получить в различных молекулярных формах.Also, since a recombinant antibody, such as a chimeric human antibody, a humanized antibody, and a human antibody is prepared using recombinant methods, it can be obtained in various molecular forms.
Например, подкласс γ1 можно использовать в качестве константной области (далее обозначена как «С-область») тяжелой цепи (далее обозначена как «Н-цепь») антитела человека (С-область Н-цепи обозначена как «СН») для получения рекомбинантного антитела, обладающего высокими эффекторными функциями, такими как антителозависимая клеточная цитотоксичность (далее обозначена как «ADCC-активность»). Кроме того, подкласс γ2 или γ4 можно использовать в качестве тяжелой цепи для получения рекомбинантного антитела, которое обладает пониженной эффекторной функцией и, как полагается, обладает пролонгированным периодом полураспада в крови по сравнению с антителами мыши (непатентный документ 14).For example, subclass γ1 can be used as a constant region (hereinafter referred to as the "C-region") of the heavy chain (hereinafter referred to as the "H-chain") of a human antibody (the C-region of the H-chain is designated as "CH") to obtain recombinant antibodies with high effector functions, such as antibody-dependent cellular cytotoxicity (hereinafter referred to as "ADCC activity"). In addition, a subclass of γ2 or γ4 can be used as a heavy chain to produce a recombinant antibody that has reduced effector function and is believed to have a prolonged half-life in blood compared to mouse antibodies (Non-Patent Document 14).
В частности, поскольку цитотоксичность, такая как комплемент-зависимая цитотоксичность (далее обозначена как «CDC-активность») и ADCC-активность опосредуются через Fc-область антитела (область, находящаяся после шарнирной области тяжелой цепи антитела) являются важными для проявления терапевтической эффективности, то химерное антитело человека, гуманизированное антитело или антитело человека являются предпочтительными по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши (непатентные документы 15 и 16).In particular, since cytotoxicity, such as complement-dependent cytotoxicity (hereinafter referred to as “CDC activity”) and ADCC activity are mediated through the Fc region of the antibody (the region after the hinge region of the antibody heavy chain) are important for therapeutic efficacy, then a chimeric human antibody, a humanized antibody, or a human antibody is preferred over an antibody other than a human antibody, such as a mouse antibody (Non-Patent
Кроме того, используя недавние достижения в области инженерии белков и генной инженерии, также можно получить рекомбинантное антитело в виде фрагмента антитела, обладающего меньшей молекулярной массой, такого как Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечное антитело (далее обозначено как «scFv») (непатентный документ 17), фрагмент димеризованной V-области (далее обозначен как «диатело») (непатентный документ 18), фрагмент стабилизированной дисульфидной связью V-области (далее обозначен как «dsFv») (непатентный документ 19) и пептид, содержащий CDR (непатентный документ 20). Эти фрагменты антител обладают преимуществом в переносе к тканям-мишеням по сравнению с молекулами цельного антитела (непатентный документ 21).In addition, using recent advances in protein and genetic engineering, it is also possible to obtain a recombinant antibody in the form of a fragment of an antibody having a lower molecular weight, such as Fab, Fab ', F (ab') 2 , single chain antibody (hereinafter referred to as " scFv ") (non-patent document 17), a fragment of the dimerized V region (hereinafter referred to as" diatelo ") (non-patent document 18), a fragment of a stabilized disulfide bond V-region (hereinafter referred to as" dsFv ") (non-patent document 19) and a peptide containing CDR (Non-Patent Doc cop 20). These antibody fragments have an advantage in transferring to target tissues compared to whole antibody molecules (Non-Patent Document 21).
Вышеприведенные факты указывают, что химерное антитело человека, гуманизированное антитело, антитело человека или фрагмент антитела являются более предпочтительными для использования при лечении человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, такими как антитело мыши.The above facts indicate that a chimeric human antibody, a humanized antibody, a human antibody, or an antibody fragment is more preferable for use in treating a person compared to antibodies other than human antibodies, such as a mouse antibody.
Перечень источниковList of sources
Патентный документ 1: WO 2009/051220Patent Document 1: WO 2009/051220
Непатентная литератураNon-Patent Literature
Непатентный документ 1: Klein W.L., Trends Neurosci., 24:219-224, 2011.Non-Patent Document 1: Klein W. L., Trends Neurosci., 24: 219-224, 2011.
Непатентный документ 2: Selkoe D.J., Science, 298:789-791, 2002.Non-Patent Document 2: Selkoe D.J., Science, 298: 789-791, 2002.
Непатентный документ 3: Hass C. et al., Nature Review 8:101-112, 2007.Non-Patent Document 3: Hass C. et al., Nature Review 8: 101-112, 2007.
Непатентный документ 4: Lee E.B. et al., J. Biol. Chem., 281:4292-4299, 2006.Non-Patent Document 4: Lee E.B. et al., J. Biol. Chem., 281: 4292-4299, 2006.
Непатентный документ 5: J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984).Non-Patent Document 5: J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984).
Непатентный документ 6: Blood, 65, 1349 (1985).Non-Patent Document 6: Blood, 65, 1349 (1985).
Непатентный документ 7: J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988).Non-Patent Document 7: J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988).
Непатентный документ 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242 (1985).Non-Patent Document 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1242 (1985).
Непатентный документ 9: J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985).Non-Patent Document 9: J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985).
Непатентный документ 10: J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988).Non-Patent Document 10: J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988).
Непатентный документ 11: J. Immunol., 135, 1530 (1985).Non-Patent Document 11: J. Immunol., 135, 1530 (1985).
Непатентный документ 12: Cancer Res., 46, 6489 (1986).Non-Patent Document 12: Cancer Res., 46, 6489 (1986).
Непатентный документ 13: Cancer Res., 56, 1118 (1996).Non-Patent Document 13: Cancer Res., 56, 1118 (1996).
Непатентный документ 14: Immunol., 85, 668 (1995).Non-Patent Document 14: Immunol., 85, 668 (1995).
Непатентный документ 15: J. Immunol., 144, 1382 (1990).Non-Patent Document 15: J. Immunol., 144, 1382 (1990).
Непатентный документ 16: Nature, 322, 323 (1988). Non-Patent Document 16: Nature, 322, 323 (1988).
Непатентный документ 17: Science, 242, 423 (1988).Non-Patent Document 17: Science, 242, 423 (1988).
Непатентный документ 18: Nature Biotechnol., 15, 629 (1997).Non-Patent Document 18: Nature Biotechnol., 15, 629 (1997).
Непатентный документ 19: Molecular Immunol., 32, 249 (1995).Non-Patent Document 19: Molecular Immunol., 32, 249 (1995).
Непатентный документ 20: J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996).Non-Patent Document 20: J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996).
Непатентный документ 21: Cancer Res., 52, 3402 (1992).Non-Patent Document 21: Cancer Res., 52, 3402 (1992).
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Техническая проблема, решаемая изобретениемTechnical Problem Solved by the Invention
В вышеприведенном непатентном документе 4 и патентном документе 1 описаны антитела к Аβ-олигомерам. Однако данные антитела связываются не только с Аβ-олигомером, но также с Аβ-мономером. Следовательно, существует проблема, связанная с серьезными побочными эффектами антитела во время лечения пациентов с AD антителами, которые направлены на патологию в мозге. The above
По этой причине настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое не связывается с Аβ-мономером и специфически связывается только с Аβ-олигомером, и к его применению. Более конкретно, изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с Аβ-олигомером, к способу определения Аβ-олигомера с использованием антитела, к способу диагностики AD с использованием антитела и к лекарственному препарату, содержащему антитело.For this reason, the present invention relates to a humanized antibody that does not bind to an Aβ monomer and specifically binds only to an Aβ oligomer, and to its use. More specifically, the invention relates to antibodies that specifically bind to an Aβ oligomer, to a method for determining an Aβ oligomer using an antibody, to a method for diagnosing AD using an antibody, and to a medicament containing the antibody.
Средства для решение проблемыMeans for solving the problem
В результате интенсивных размышлений по поводу вышеуказанной проблемы заявители настоящего изобретения обнаружили гуманизированное антитело, которое не связывается с Аβ-мономером, а специфически связывается только с Аβ-олигомером, и на этом основании было создано настоящее изобретение.As a result of intense reflection on the above problem, the applicants of the present invention discovered a humanized antibody that does not bind to the Aβ monomer, but specifically binds only to the Aβ oligomer, and the present invention was created on this basis.
Таким образом, в настоящем изобретении описано следующее:Thus, the present invention describes the following:
1. Гуманизированное антитело, которое не связывается с мономером β-амилоидного белка, но связывается с олигомером β-амилоидного белка, и которое содержит следующую (а) вариабельную область тяжелой цепи и (b) вариабельную область легкой цепи:1. Humanitariannet antibody that does not bind to the monomer of β-amyloid protein, but binds to the oligomer of β-amyloid protein, and which contains the following (a) the variable region of the heavy chain and (b) the variable region of the light chain:
(а) вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Lys, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(a) an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence in which at least one amino acid modification has been performed to replace Lys at
(b) вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Ile в положении 2 на Val, Pro в положении 15 на Leu, Gln в положении 50 на Lys и Tyr в положении 92 на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14. (b) the variable region of the light chain of the antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence in which at least one modification of the amino acid modifications is carried out to replace Ile at
2. Гуманизированное антитело по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или 15, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 16 или 17.2. The humanized antibody according to
3. Средство против когнитивной дисфункции, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.3. An agent against cognitive dysfunction containing a humanized antibody according to
4. Лекарственный препарат для лечения болезни Альцгеймера, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.4. A drug for the treatment of Alzheimer's disease, containing the humanized antibody according to
5. Средство для подавления образования сенильных бляшек, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.5. A tool for suppressing the formation of senile plaques containing a humanized antibody according to
6. Ингибитор образования β-амилоидных волокон, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.6. An inhibitor of the formation of β-amyloid fibers containing the humanized antibody according to
7. Способ по меньшей мере профилактики и/или лечения когнитивной дисфункции, включающий введение гуманизированного антитела по п.п. 1 или 2.7. A method for at least preventing and / or treating cognitive dysfunction, comprising administering a humanized antibody according to
8. Способ по меньшей мере для одного из профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.8. A method for at least one of the prophylaxis and / or treatment of Alzheimer's disease, comprising administering a humanized antibody according to
9. Способ подавления прогрессирования болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.9. A method of suppressing the progression of Alzheimer's disease, comprising the introduction of a humanized antibody according to
Преимущественные эффекты изобретенияAdvantageous Effects of the Invention
Предполагается, что антитело по настоящему изобретению будет использоваться в способах профилактики и лечения AD и в качестве диагностического маркера на ранней стадии заболевания за счет направленного воздействия на Аβ-белок, который является вызывающей AD молекулой.It is anticipated that the antibody of the present invention will be used in methods for the prevention and treatment of AD and as a diagnostic marker at an early stage of the disease by targeting the Aβ protein, which is an AD-causing molecule.
Существует проблема относительно внутрицеребрального переноса антитела во время лечения пациентов с AD антителом, направленным на патологию в мозге. Однако имеется вероятность того, что антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения в клинике путем введения в периферическую вену, и можно полагать, что прогресс в лечении AD антителом будет очевиден сразу же. There is a problem regarding intracerebral antibody transfer during the treatment of patients with an AD antibody directed to a pathology in the brain. However, there is a possibility that the antibody of the present invention can be used for treatment in a clinic by injection into a peripheral vein, and it can be assumed that progress in the treatment of AD antibody will be immediately apparent.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
[Фиг.1] На фиг.1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области Н-цепи HV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 и HV12. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области Н-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают замещенную аминокислоту (представлена однобуквенным кодом). [Fig. 1] Fig. 1 shows the amino acid sequence of the HV0 H chain variable region and modified amino acid residues from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 in HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 and HV12. The first and second lines in the figure indicate the amino acid numbers in the variable region of the H chain, and the letters on the other corresponding lines indicate the substituted amino acid (represented by a single-letter code).
[Фиг.2] На фиг.2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области L-цепи LV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 в LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV3 и LV4. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области L-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают модифицированную аминокислоту (представлена одной буквой). [Figure 2] Figure 2 shows the amino acid sequence of the variable region of the L chain of the LV0 chain and the modified amino acid residues from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 in LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV3 and LV4. The first and second lines in the figure indicate the amino acid numbers in the variable region of the L chain, and the letters on the other corresponding lines indicate the modified amino acid (represented by one letter).
[Фиг.3] На фиг.3 приведены сенсограммы, полученные при оценке связывающей активности каждого гуманизированного антитела против Аβ-олигомера для Аβ-мономеров с использованием системы Biacore. [Fig. 3] Fig. 3 shows sensograms obtained by evaluating the binding activity of each humanized anti-Aβ oligomer antibody for Aβ monomers using the Biacore system.
Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments
Гуманизированное антитело против Аβ-олигомера по настоящему изобретению (далее также обозначено как «антитело по настоящему изобретению» или «гуманизированное антитело по настоящему изобретению») представляет собой гуманизированное антитело, отличающееся тем, что оно не связывается с Аβ-мономером. Антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой выделенное антитело, очищенное антитело или композицию антитела.The humanized anti-Aβ oligomer antibody of the present invention (hereinafter also referred to as the “antibody of the present invention” or the “humanized antibody of the present invention”) is a humanized antibody, characterized in that it does not bind to the Aβ monomer. The antibody of the present invention is preferably an isolated antibody, a purified antibody, or an antibody composition.
Выделенное антитело, очищенное антитело и композиция антитела представляют собой антитела, которые по существу содержат 100% желаемого антитела и не содержат каких-либо примесей, таких как загрязняющие белки, появление которых возможно при получении антитела из антитело-продуцирующих клеток, тканей, антитело-продуцирующих животных и тому подобное.An isolated antibody, a purified antibody, and an antibody composition are antibodies that essentially contain 100% of the desired antibody and do not contain any impurities, such as contaminating proteins, which can occur when antibodies are produced from antibody-producing cells, tissues, antibody-producing animals and the like.
Антитело является гетеротетрамерным белком, состоящим из двух тяжелых цепей (Н-цепи) и двух легких цепей (L-цепи). Антитело классифицируется как поликлональное антитело и моноклональное антитело, которые распознают один и тот же антиген.An antibody is a heterotetrameric protein consisting of two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains). An antibody is classified as a polyclonal antibody and a monoclonal antibody that recognize the same antigen.
Поликлональное антитело представляет собой смесь антител, которые распознают один и тот же антиген. Примеры поликлонального антитела включают антисыворотку животного-хозяина, иммунизированного антигеном.A polyclonal antibody is a mixture of antibodies that recognize the same antigen. Examples of a polyclonal antibody include the antiserum of an animal host immunized with an antigen.
Моноклональное антитело представляет собой антитело, секретированное одним клоном антитело-продуцирующих клеток, и которое распознает только один эпитоп (также называемый антигенной детерминантой) и обладает однородностью в аминокислотной последовательности (первичной структуре).A monoclonal antibody is an antibody secreted by one clone of antibody-producing cells and which recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant) and has uniformity in amino acid sequence (primary structure).
Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Примеры моноклонального антитела по настоящему изобретению включают моноклональное антитело, в котором гипервариабельные участки 1-3 (далее обозначены как «CDR») тяжелой цепи антитела (далее обозначена как «Н-цепь») содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-2, и CDR 1-3 в L-цепи содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6; моноклональное антитело, в котором вариабельная область Н-цепи антитела (далее обозначена как «VH») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельная область L-цепи (далее обозначена как «VL») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 и моноклональное антитело мыши против Аβ-олигомера 6Е4.The antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody. Examples of the monoclonal antibody of the present invention include a monoclonal antibody in which the hypervariable regions 1-3 (hereinafter referred to as "CDRs") of the antibody heavy chain (hereinafter referred to as "H chain") respectively comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-2, and CDR 1-3 in the L chain respectively contain the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4-6; a monoclonal antibody in which the variable region of the H chain of the antibody (hereinafter referred to as "VH") contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and the variable region of the L chain (hereinafter referred to as "VL") contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and a monoclonal antibody of the mouse against the β-oligomer 6E4.
В качестве примера эпитопа можно привести одну аминокислотную последовательность, которая распознается и связывается моноклональным антителом, конформацию, содержащую вышеприведенную аминокислотную последовательность, вышеприведенную аминокислотную последовательность, с которой связана сахарная цепь, и конформацию, содержащую вышеприведенные аминокислотные последовательности, с которыми связаны сахарные цепи.An example of an epitope is a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a conformation containing the above amino acid sequence, the above amino acid sequence to which the sugar chain is linked, and a conformation containing the above amino acid sequences to which sugar chains are linked.
Эпитоп для распознавания антителом по настоящему изобретению может представлять собой любой белок, при условии, что он включает по меньшей мере один Аβ-белок и его фрагмент, и он находится на Аβ-олигомере, с которым образует комплекс.The antibody recognition epitope of the present invention may be any protein, provided that it comprises at least one Aβ protein and fragment thereof and is located on the Aβ oligomer with which it forms a complex.
Примеры эпитопа, с которым связывается антитело по настоящему изобретению, включают эпитоп, содержащий первичную аминокислотную последовательность Аβ, которая находится на Аβ-олигомере, эпитоп, содержащий конформацию Аβ-олигомера и тому подобное.Examples of the epitope to which the antibody of the present invention binds include an epitope containing the primary amino acid sequence of Aβ that is on the Aβ oligomer, an epitope containing the conformation of the Aβ oligomer and the like.
Известно, что Аβ-белок, являющийся основным компонентом амилоида, представляет пептид, содержащий 40-42 аминокислоты и образуется из белка-предшественника, называемого предшественником белка амилоида (далее обозначен как «APP») под действием протеазы.It is known that the Aβ protein, which is the main component of amyloid, is a peptide containing 40-42 amino acids and is formed from a precursor protein called the amyloid protein precursor (hereinafter referred to as “APP”) under the action of a protease.
Молекулы амилоида, образующиеся из АРР, включают нефибриллярный полимер растворимых мономеров и растворимых олигомеров в дополнении к амилоидным волокнам, находящимся в осадке при ультрацентрифугировании.Amyloid molecules formed from APP include a non-fibrillar polymer of soluble monomers and soluble oligomers in addition to amyloid fibers precipitated by ultracentrifugation.
В настоящем изобретении Аβ-олигомер представляет собой нефибриллярный полимер, и он является Аβ-олигомером, который содержит по меньшей мере один из Аβ-белков и его фрагмент, и образует комплекс.In the present invention, the Aβ oligomer is a non-fibrillar polymer, and it is an Aβ oligomer that contains at least one of the Aβ proteins and its fragment, and forms a complex.
В частности, примеры Аβ-олигомера включают Аβ40(Аβ1-40)олигомер, Аβ42(Аβ1-42)олигомер и Аβ-олигомер, содержащий по меньшей мере один из Аβ40 и Аβ42.In particular, examples of an Aβ oligomer include an Aβ40 (Aβ1-40) oligomer, an Aβ42 (Aβ1-42) oligomer, and an Aβ oligomer containing at least one of Aβ40 and Aβ42.
Кроме того, примеры Аβ-олигомера по настоящему изобретению также включают Аβ-олигомер, содержащий Аβ-фрагмент без N-конца Аβ по меньшей мере в одном из Аβ40 и Аβ42. In addition, examples of the Aβ oligomer of the present invention also include an Aβ oligomer containing an Aβ fragment without the N terminus of Aβ in at least one of Aβ40 and Aβ42.
В частности, Аβ42-олигомер по настоящему изобретению представляет молекулы с молекулярной массой 45-160 кДа по данным SDS-PAGE и молекулярной массой 22,5-1,035 кДа по данным Blue Native-PAGE.In particular, the Aβ42 oligomer of the present invention is a molecule with a molecular weight of 45-160 kDa according to SDS-PAGE and a molecular weight of 22.5-1.035 kDa according to Blue Native-PAGE.
Аβ42-олигомер выделяют в основном до >100 кДа, удерживая жидкость в молекулярном сите. Кроме того, Аβ-олигомер является смесью конфигураций, которая состоит из молекул в форме частиц, каплевидных молекул и круглых молекул с высотой 1,5-3,1 нм под атомно-силовым микроскопом.The β42-oligomer is isolated mainly up to> 100 kDa, retaining the liquid in a molecular sieve. In addition, the β-oligomer is a mixture of configurations, which consists of molecules in the form of particles, drop-shaped molecules and round molecules with a height of 1.5-3.1 nm under an atomic force microscope.
Кроме того, вышеуказанный Аβ42-олигомер элюируется в истинной объемной фракции 8, соответствующей молекулярной массе 680 кДа или выше, и во фракции 15, соответствующей молекулярной массе 17-44 кДа, при использовании гель-фильтрации.In addition, the above Aβ42 oligomer elutes in a
Антитело по настоящему изобретению можно использовать при условии, что оно является гуманизированным антителом, которое связывается с Аβ-олигомером и не связывается с Аβ-мономером, и его источник и форма не ограничиваются.The antibody of the present invention can be used provided that it is a humanized antibody that binds to an Aβ oligomer and does not bind to an Aβ monomer, and its source and form are not limited.
Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению не распознает растворимый β-амилоидный (Аβ) мономер, который является физиологической молекулой, и взаимодействует только с растворимым Аβ-олигомером.Preferably, the antibody of the present invention does not recognize a soluble β-amyloid (Aβ) monomer, which is a physiological molecule, and only interacts with a soluble Aβ oligomer.
В настоящем изобретении связывание только с растворимым Аβ-олигомером без связывания с растворимым Аβ-мономером означает, что среди Аβ-мономеров и Аβ-олигомеров, которые разделяются ультрафильтрацией и молекулярным ситом, антитело не распознает мономеры (примерно 4,5 кДа), но специфически распознает растворимый Аβ-олигомер, который аналогичен или крупнее Аβ-димеров. Следовательно, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению специфически связывалось с растворимым Аβ-олигомером, который аналогичен или крупнее Аβ-димера.In the present invention, binding only to a soluble Aβ oligomer without binding to a soluble Aβ monomer means that among the Aβ monomers and Aβ oligomers that are separated by ultrafiltration and a molecular sieve, the antibody does not recognize monomers (about 4.5 kDa), but specifically recognizes a soluble Aβ oligomer that is similar or larger than Aβ dimers. Therefore, it is preferred that the antibody of the present invention specifically binds to a soluble Aβ oligomer that is similar or larger than the Aβ dimer.
Антитело по настоящему изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере одной активностью из следующего (1)-(5):The antibody of the present invention preferably has at least one of the following (1) to (5) activities:
(1) активностью против нейротоксичности;(1) activity against neurotoxicity;
(2) способностью подавлять образование Аβ-амилоидных волокон;(2) the ability to suppress the formation of Aβ-amyloid fibers;
(3) специфичностью распознавать только Аβ-олигомер;(3) only Aβ oligomer is recognized by specificity;
(4) способностью захватывать Аβ-олигомер в мозге пациентов с AD;(4) the ability to capture the β-oligomer in the brain of patients with AD;
(5) способностью предупреждать AD-подобный патогенез (снижение памяти, накопление Аβ в мозге) у APPswe-трансгенных мышей (Tg2576).(5) the ability to prevent AD-like pathogenesis (memory loss, Aβ accumulation in the brain) in APPswe-transgenic mice (Tg2576).
Активность антитела по настоящему изобретению, относящиеся к вышеприведенным (1)-(5), можно подтвердить с использованием способа, описанного в международной заявке WO 2009/051220.The activity of the antibodies of the present invention related to the above (1) to (5) can be confirmed using the method described in international application WO 2009/051220.
Антитело по настоящему изобретению можно получить в виде рекомбинантного антитела. В настоящем изобретении рекомбинантное антитело включает антитела, полученные рекомбинантной технологией, такие как химерное антитело человека, гуманизированное антитело (или антитело с трансплантированным CDR), антитело человека и фрагмент антитела.The antibody of the present invention can be obtained in the form of a recombinant antibody. In the present invention, a recombinant antibody includes antibodies obtained by recombinant technology, such as a chimeric human antibody, a humanized antibody (or a transplanted CDR antibody), a human antibody, and an antibody fragment.
Рекомбинантное антитело, имеющее свойства моноклональных антител, обладающее низкой иммуногенностью и длительным периодом полураспада, является предпочтительным в качестве лекарственного препарата. Примеры рекомбинантного антитела включают антитело, полученное модификацией моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием рекомбинантной технологии.A recombinant antibody having the properties of monoclonal antibodies, having low immunogenicity and a long half-life, is preferred as a drug. Examples of a recombinant antibody include an antibody obtained by modifying a monoclonal antibody of the present invention using recombinant technology.
Химерное антитело человека представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (далее обозначено как «VH») и вариабельную область легкой цепи (далее обозначено как «VL») антитела животного, отличного от человека, и константную область тяжелой цепи (далее обозначено как «CH») и константную область легкой цепи (далее обозначено как «CL») антитела человека.A human chimeric antibody is an antibody comprising a variable region of a heavy chain (hereinafter referred to as “VH”) and a variable region of a light chain (hereinafter referred to as “VL”) of a non-human animal antibody and a constant region of a heavy chain (hereinafter referred to as “CH ") And the constant region of the light chain (hereinafter referred to as" CL ") human antibodies.
Химерное антитело человека можно получить с помощью кДНК, кодирующих вышеуказанные VH и VL, из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфически связывается с Аβ-олигомером, путем встраивания кДНК в вектор экспрессии животной клетки, содержащий ДНК, кодирующие CH и CL, тем самым конструируя вектор для экспрессии химерного антитела человека, и затем введением вектора в животную клетку для экспрессии антитела.A human chimeric antibody can be obtained using cDNA encoding the above VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to an Aβ oligomer by inserting cDNA into an animal cell expression vector containing DNA encoding CH and CL, thereby constructing a vector for expressing a chimeric human antibody, and then introducing the vector into an animal cell to express the antibody.
В качестве вышеприведенной СН химерного антитела человека можно использовать любые СН, при условии, что они относятся к иммуноглобулину человека (далее обозначено как «hIgG»), и которые относятся к классу hIgG, являются предпочтительными, и можно использовать любой из подклассов, относящихся к классу hIgG, такой как hIgG1, hIgG2, hIgG3 и hIgG4.As the above CH of a human chimeric antibody, any CH can be used, provided that they are human immunoglobulins (hereinafter referred to as “hIgG”), and which belong to the hIgG class, are preferred, and any of the subclasses belonging to the class can be used hIgG, such as hIgG1, hIgG2, hIgG3 and hIgG4.
В качестве вышеприведенной CL химерного антитела человека можно использовать любые CL, при условии, что они относятся к классу hIg, и которые относятся к классу κ или классу λ.Any CL can be used as the above CL of a chimeric human antibody, provided that they belong to the class hIg and which belong to the class κ or class λ.
Гуманизированное антитело по настоящему изобретению представляет антитело, в котором аминокислотные последовательности CDR VH и VL антитела, полученные у животного, отличного от человека, пересаживают в соответствующие положения VH и VL антитела человека.The humanized antibody of the present invention is an antibody in which the amino acid sequences of the CDRs of VH and VL antibodies obtained from a non-human animal are transplanted to the corresponding positions of the VH and VL human antibodies.
Гуманизированное антитело можно получить конструированием аминокислотной последовательности V-областей, в которых аминокислотные последовательности CDR обеих VH и VL моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой животного, отличного от человека, и специфически связывается с Аβ-олигомером, пересаживаются в каркасные области (далее обозначены как «FR») VH и VL любого антитела человека соответственно, конструированием кДНК, кодирующих V-области, вставкой каждой из них в вектор экспрессии животных клеток, содержащих гены, кодирующие CH и CL антитела человека, тем самым получив вектор для экспрессии гуманизированного антитела, и его введением в животную клетку для экспрессии и продукции гуманизированного антитела.A humanized antibody can be obtained by constructing the amino acid sequence of V regions in which the CDR amino acid sequences of both VH and VL of a monoclonal antibody, which is produced by a hybridoma of a non-human animal and specifically binds to an Aβ oligomer, are transplanted into framework regions (hereinafter referred to as “FR” ") VH and VL of any human antibody, respectively, by constructing cDNA encoding V regions, inserting each of them into the expression vector of animal cells containing genes encoding e CH and CL of a human antibody, thereby obtaining a vector for expression of humanized antibody, and introducing it into an animal cell for the expression and production of humanized antibodies.
В качестве аминокислотных последовательностей FR VH и VL гуманизированного антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности, при условии, что они являются аминокислотными последовательностями VH и VL, соответственно, полученными из антитела человека.As amino acid sequences of the FR VH and VL of the humanized antibody, any amino acid sequence can be used, provided that they are the amino acid sequences of VH and VL, respectively, obtained from a human antibody.
Примеры включают аминокислотные последовательности FR VH и VL антител человека, зарегистрированных в базе данных, такой как Protein Data Bank, обычные аминокислотные последовательности каждой подгруппы FR VH и VL антител человека, описанных в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) и тому подобное.Examples include the amino acid sequences of FR VH and VL human antibodies registered in a database such as Protein Data Bank, the usual amino acid sequences of each subgroup of FR VH and VL human antibodies described in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) and the like.
Примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают гуманизированное антитело, в котором CDR 1-3 в VH антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:1-3, и CDR 1-3 в VL антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:4-6.Examples of a humanized antibody of the present invention include a humanized antibody in which CDR 1-3 in VH antibodies contain amino acid sequences, respectively SEQ ID NO: 1-3, and CDR 1-3 in VL antibodies contain amino acid sequences, respectively SEQ ID NO: 4 -6.
Гуманизированное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой гуманизированное антитело, содержащее по меньшей мере одну из следующих (а) VH и (b) VL. Кроме того, в следующих (а) и (b) число введенных замен не ограничивается: (а) VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещен другим аминокислотным остатком;The humanized antibody of the present invention is preferably a humanized antibody comprising at least one of the following (a) VH and (b) VL. In addition, in the following (a) and (b), the number of substitutions introduced is not limited to: (a) a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Lys at
(b) VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещен другим аминокислотным остатком.(b) a VL containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Ile at
Предпочтительные примеры VH, входящей в состав гуманизированного антитела по настоящему изобретению, включают, например, VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.Preferred examples of the VH included in the humanized antibody of the present invention include, for example, VH containing the amino acid sequence in which Lys at
Кроме того, VH, выбранная из следующих (1)-(9), также является предпочтительной в качестве VH, входящей в гуманизированное антитело по настоящему изобретению:In addition, a VH selected from the following (1) to (9) is also preferred as the VH included in the humanized antibody of the present invention:
(1) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(1) a VH containing the amino acid sequence in which Lys at
(2) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(2) a VH containing the amino acid sequence in which Lys at
(3) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(3) a VH containing the amino acid sequence in which Lys at
(4) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(4) a VH containing an amino acid sequence in which Gln at position 39, Leu at
(5) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(5) a VH containing the amino acid sequence in which Leu at
(6) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(6) the VH containing the amino acid sequence in which Gln at position 39, Leu at
(7) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(7) the VH containing the amino acid sequence in which Leu at
(8) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;(8) a VH containing the amino acid sequence in which Leu at
(9) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.(9) A VH comprising an amino acid sequence in which Leu at
Примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотную последовательность, в которую введена по меньшей мере одна модификация, выбранная из модификаций замещением Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Val, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12. Examples of the VH amino acid sequence include the amino acid sequence into which at least one modification is selected, selected from the modifications by substituting Lys at
Более конкретные примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотные последовательности, в которые введено от 12 до 1 следующих замен.More specific examples of the VH amino acid sequence include amino acid sequences in which 12 to 1 of the following substitutions are introduced.
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 12 замен, включают аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.Specific examples of the VH amino acid sequence into which 12 substitutions are introduced include the amino acid sequence in which Lys at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 11 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(12):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 11 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (12):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Val at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Lys at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Lys at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Lys at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Lys at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Lys at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Lys at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Lys at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Lys at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) the amino acid sequence in which Lys at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) the amino acid sequence in which Lys at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(12) the amino acid sequence in which Lys at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 10 замен, включают, например, следующие аминокислотные последовательности (1)-(66):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 10 substitutions are introduced include, for example, the following amino acid sequences (1) to (66):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Val at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Val at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Val at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Val at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Val at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Val at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Val at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) the amino acid sequence in which Val at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) the amino acid sequence in which Val at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(12) the amino acid sequence in which Lys at
(13) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(13) the amino acid sequence in which Lys at
(14) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(14) the amino acid sequence in which Lys at
(15) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(15) the amino acid sequence in which Lys at
(16) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(16) the amino acid sequence in which Lys at
(17) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(17) the amino acid sequence in which Lys at
(18) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(18) the amino acid sequence in which Lys at
(19) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(19) the amino acid sequence in which Lys at
(20) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(20) the amino acid sequence in which Lys at
(21) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(21) the amino acid sequence in which Lys at
(22) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(22) the amino acid sequence in which Lys at
(23) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(23) the amino acid sequence in which Lys at
(24) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(24) the amino acid sequence in which Lys at
(25) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(25) the amino acid sequence in which Lys at
(26) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(26) the amino acid sequence in which Lys at
(27) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(27) the amino acid sequence in which Lys at
(28) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(28) the amino acid sequence in which Lys at
(29) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(29) the amino acid sequence in which Lys at
(30) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положеии 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(30) the amino acid sequence in which Lys at
(31) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(31) the amino acid sequence in which Lys at
(32) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(32) the amino acid sequence in which Lys at
(33) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(33) the amino acid sequence in which Lys at
(34) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(34) the amino acid sequence in which Lys at
(35) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(35) the amino acid sequence in which Lys at
(36) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(36) the amino acid sequence in which Lys at
(37) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(37) the amino acid sequence in which Lys at
(38) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(38) the amino acid sequence in which Lys at
(39) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(39) the amino acid sequence in which Lys at
(40) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(40) the amino acid sequence in which Lys at
(41) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(41) the amino acid sequence in which Lys at
(42) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(42) the amino acid sequence in which Lys at
(43) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(43) the amino acid sequence in which Lys at
(44) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(44) the amino acid sequence in which Lys at
(45) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(45) the amino acid sequence in which Lys at
(46) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(46) the amino acid sequence in which Lys at
(47) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(47) the amino acid sequence in which Lys at
(48) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(48) the amino acid sequence in which Lys at
(49) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(49) the amino acid sequence in which Lys at
(50) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(50) the amino acid sequence in which Lys at
(51) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(51) the amino acid sequence in which Lys at
(52) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(52) the amino acid sequence in which Lys at
(53) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(53) the amino acid sequence in which Lys at
(54) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(54) the amino acid sequence in which Lys at
(55) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(55) the amino acid sequence in which Lys at
(56) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(56) the amino acid sequence in which Lys at
(57) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(57) the amino acid sequence in which Lys at
(58) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(58) the amino acid sequence in which Lys at
(59) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(59) the amino acid sequence in which Lys at
(60) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(60) the amino acid sequence in which Lys at
(61) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(61) the amino acid sequence in which Lys at
(62) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(62) the amino acid sequence in which Lys at
(63) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(63) the amino acid sequence in which Lys at
(64) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(64) the amino acid sequence in which Lys at
(65) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(65) the amino acid sequence in which Lys at
(66) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(66) the amino acid sequence in which Lys at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 9 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(10):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 9 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (10):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Lys at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Lys at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Lys at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Lys at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Lys at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Lys at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Lys at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Lys at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(10) the amino acid sequence in which Lys at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 8 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(47):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 8 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (47):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Leu at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Met at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 67 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) the amino acid sequence in which Lys at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) the amino acid sequence in which Lys at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(12) the amino acid sequence in which Lys at
(13) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(13) the amino acid sequence in which Lys at
(14) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(14) the amino acid sequence in which Lys at
(15) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(15) the amino acid sequence in which Lys at
(16) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(16) the amino acid sequence in which Lys at
(17) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(17) the amino acid sequence in which Lys at
(18) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(18) the amino acid sequence in which Lys at
(19) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(19) the amino acid sequence in which Lys at
(20) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(20) the amino acid sequence in which Lys at
(21) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(21) the amino acid sequence in which Lys at
(22) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(22) the amino acid sequence in which Lys at
(23) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(23) the amino acid sequence in which Lys at
(24) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(24) the amino acid sequence in which Lys at
(25) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(25) the amino acid sequence in which Lys at
(26) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(26) the amino acid sequence in which Lys at
(27) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(27) the amino acid sequence in which Lys at
(28) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(28) the amino acid sequence in which Lys at
(29) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(29) the amino acid sequence in which Lys at
(30) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(30) the amino acid sequence in which Lys at
(31) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(31) the amino acid sequence in which Lys at
(32) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(32) the amino acid sequence in which Lys at
(33) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(33) the amino acid sequence in which Lys at
(34) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(34) the amino acid sequence in which Lys at
(35) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(35) the amino acid sequence in which Lys at
(36) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(36) the amino acid sequence in which Lys at
(37) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(37) the amino acid sequence in which Lys at
(38) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(38) the amino acid sequence in which Lys at
(39) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(39) the amino acid sequence in which Lys at
(40) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(40) the amino acid sequence in which Lys at
(41) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(41) the amino acid sequence in which Lys at
(42) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(42) the amino acid sequence in which Lys at
(43) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(43) the amino acid sequence in which Lys at
(44) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(44) the amino acid sequence in which Lys at
(45) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(45) the amino acid sequence in which Lys at
(46) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(46) the amino acid sequence in which Lys at
(47) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(47) the amino acid sequence in which Lys at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 7 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(22):Specific examples of the amino acid sequence VH, which introduced 7 substitutions, include the following amino acid sequences (1) to (22):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Lys at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Lys at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Lys at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Lys at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Lys at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Val at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Val at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Val at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) the amino acid sequence in which Val at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) the amino acid sequence in which Val at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(12) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(13) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(13) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(14) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(14) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(15) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(15) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(16) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(16) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(17) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(17) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(18) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(18) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(19) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(19) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(20) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(20) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(21) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замешен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(21) the amino acid sequence in which Leu at
(22) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(22) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 6 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(7):Specific examples of the VH amino acid sequence in which 6 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (7):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен ан Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(7) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 5 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(8):Specific examples of the VH amino acid sequence in which 5 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (8):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Leu at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Leu at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Leu at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(8) the amino acid sequence in which Leu at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 4 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(9):Specific examples of the VH amino acid sequence in which 4 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (9):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Leu at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Leu at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Leu at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Leu at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(9) the amino acid sequence in which Leu at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 3 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(19):Specific examples of the VH amino acid sequence in which 3 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (19):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) the amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Leu at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Leu at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) the amino acid sequence in which Leu at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Leu at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Leu at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) the amino acid sequence in which Leu at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) the amino acid sequence in which Lys at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(12) the amino acid sequence in which Val at
(13) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(13) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys, Leu at
(14) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(14) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu, Leu at
(15) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(15) the amino acid sequence in which Leu at
(16) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(16) the amino acid sequence in which Leu at
(17) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(17) the amino acid sequence in which Leu at
(18) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(18) the amino acid sequence in which Leu at
(19) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(19) the amino acid sequence in which Leu at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 2 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(66):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 2 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (66):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Val в положении 20 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) an amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) an amino acid sequence in which Lys at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) an amino acid sequence in which Lys at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) an amino acid sequence in which Lys at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Lys at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) the amino acid sequence in which Lys at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) an amino acid sequence in which Lys at
(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) the amino acid sequence in which Lys at
(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) an amino acid sequence in which Lys at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) an amino acid sequence in which Lys at
(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) an amino acid sequence in which Lys at
(12) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(12) an amino acid sequence in which Val at
(13) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(13) the amino acid sequence in which Val at
(14) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(14) the amino acid sequence in which Val at
(15) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(15) the amino acid sequence in which Val at
(16) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(16) the amino acid sequence in which Val at
(17) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(17) the amino acid sequence in which Val at
(18) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(18) the amino acid sequence in which Val at
(19) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(19) the amino acid sequence in which Val at
(20) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(20) the amino acid sequence in which Val at
(21) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(21) an amino acid sequence in which Val at
(22) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(22) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Gln at position 39 is replaced by Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(23) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(23) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Leu at
(24) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(24) an amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Met at
(25) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(25) an amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Arg at position 67 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(26) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(26) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Val at position 68 is replaced by Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(27) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(27) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Ile at
(28) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(28) an amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Ala at position 72 is replaced by Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(29) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(29) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Thr at position 74 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(30) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(30) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys and Ala at position 97 is replaced by Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(31) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(31) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Leu at
(32) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(32) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Met at
(33) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(33) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Arg at position 67 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(34) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (34) an amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Val at position 68 is replaced by Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(35) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (35) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Ile at
(36) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (36) an amino acid sequence in which Gln at position 39 is substituted with Leu and Ala at position 72 is substituted with Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(37) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (37) the amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu and Thr at position 74 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(38) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (38) an amino acid sequence in which Gln at position 39 is substituted with Leu and Ala at position 97 is substituted with Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(39) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (39) the amino acid sequence in which Leu at
(40) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(40) the amino acid sequence in which Leu at
(41) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(41) the amino acid sequence in which Leu at
(42) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(42) the amino acid sequence in which Leu at
(43) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(43) the amino acid sequence in which Leu at
(44) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(44) the amino acid sequence in which Leu at
(45) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(45) the amino acid sequence in which Leu at
(46) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(46) the amino acid sequence in which Met at
(47) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(47) the amino acid sequence in which Met at
(48) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(48) the amino acid sequence in which Met at
(49) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(49) an amino acid sequence in which Met at
(50) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(50) the amino acid sequence in which Met at
(51) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(51) an amino acid sequence in which Met at
(52) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(52) the amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys and Val at position 68 is replaced by Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(53) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(53) the amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys and Ile at
(54) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(54) an amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys and Ala at position 72 is replaced by Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(55) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(55) an amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys and Thr at position 74 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(56) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(56) an amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys and Ala at position 97 is substituted by Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(57) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(57) the amino acid sequence in which Val at position 68 is replaced by Ala and Ile at
(58) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(58) an amino acid sequence in which Val at position 68 is substituted with Ala and Ala at position 72 is substituted with Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(59) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(59) the amino acid sequence in which Val at position 68 is replaced by Ala and Thr at position 74 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(60) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(60) an amino acid sequence in which Val at position 68 is substituted with Ala and Ala at position 97 is substituted with Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(61) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(61) the amino acid sequence in which Ile at
(62) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(62) the amino acid sequence in which Ile at
(63) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(63) the amino acid sequence in which Ile at
(64) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(64) an amino acid sequence in which Ala at position 72 is substituted with Val and Thr at position 74 is replaced with Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(65) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(65) an amino acid sequence in which Ala at position 72 is substituted with Val and Ala at position 97 is substituted with Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(66) аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(66) the amino acid sequence in which Thr at position 74 is replaced by Lys and Ala at position 97 is replaced by Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введена 1 замена, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(12):Specific examples of the VH amino acid sequence into which 1 substitution is introduced include the following amino acid sequences (1) to (12):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(1) an amino acid sequence in which Lys at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(2) the amino acid sequence in which Val at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(3) the amino acid sequence in which Arg at position 38 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(4) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(4) an amino acid sequence in which Gln at position 39 is replaced by Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(5) аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(5) the amino acid sequence in which Leu at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Met в положении 48 замещен на Ile в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(6) an amino acid sequence in which Met at
(7) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 67 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(7) an amino acid sequence in which Arg at position 67 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(8) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 68 замещен на Ala в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(8) an amino acid sequence in which Val at position 68 is substituted with Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(9) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 70 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(9) the amino acid sequence in which Ile at
(10) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 72 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(10) an amino acid sequence in which Ala at position 72 is replaced by Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(11) аминокислотную последовательность, в которой Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;(11) an amino acid sequence in which Thr at position 74 is replaced by Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12;
(12) аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.(12) an amino acid sequence in which Ala at position 97 is substituted with Thr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
Среди приведенных выше аминокислотных последовательностей VH аминокислотная последовательность SEQ ID NO:12, аминокислотная последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, являются предпочтительными.Among the above VH amino acid sequences, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, the amino acid sequence in which Lys at
Гуманизированное антитело по настоящему изобретению предпочтительно включает VL, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50, Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками, и предпочтительные примеры VL по настоящему изобретению также включают VL, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15, Gln в положении 50, Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками.The humanized antibody of the present invention preferably includes a VL containing the amino acid sequence in which Ile at
Кроме того, VL, выбранная из следующих (1)-(4), также является предпочтительной в качестве VL, входящей в состав гуманизированного антитела по настоящему изобретению:In addition, a VL selected from the following (1) to (4) is also preferred as the VL included in the humanized antibody of the present invention:
(1) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;(1) a VL containing an amino acid sequence in which Gln at
(2) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;(2) a VL containing an amino acid sequence in which Ile at
(3) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками;(3) a VL containing an amino acid sequence in which Pro at
(4) VL, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 и Gln в положении 50 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещены другими аминокислотными остатками.(4) A VL containing an amino acid sequence in which Ile at
Аминокислотная последовательность VL включает, например, аминокислотную последовательность, в которую введена по меньшей мере одна модификация, выбранная из модификаций с замещением Ile в положении 2 на Val, Pro в положении 15 на Leu, Gln в положении 50 на Lys и Tyr в положении 92 на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.The amino acid sequence of VL includes, for example, an amino acid sequence into which at least one modification has been selected, selected from modifications with the substitution of Ile at
Более конкретные примеры аминокислотной последовательности VL в антителе по настоящему изобретению, в которую введены вышеуказанные модификации, включают, например, аминокислотную последовательность VL, в которую введено от 4 до 1 следующих замен.More specific examples of the VL amino acid sequence in an antibody of the present invention into which the above modifications are incorporated include, for example, the VL amino acid sequence in which 4 to 1 of the following substitutions are introduced.
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 4 замены, включают аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14. Specific examples of the VL amino acid sequence in which 4 substitutions are introduced include the amino acid sequence in which Ile at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 3 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(4): Specific examples of the VL amino acid sequence in which 3 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (4):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(1) the amino acid sequence in which Ile at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(2) the amino acid sequence in which Ile at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(3) the amino acid sequence in which Ile at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.(4) the amino acid sequence in which Pro at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введено 2 замены, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(6): Specific examples of the VL amino acid sequence into which 2 substitutions are introduced include the following amino acid sequences (1) to (6):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Pro в положении 15 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(1) an amino acid sequence in which Ile at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(2) the amino acid sequence in which Ile at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(3) the amino acid sequence in which Ile at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu и Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(4) the amino acid sequence in which Pro at
(5) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(5) an amino acid sequence in which Pro at
(6) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.(6) the amino acid sequence in which Gln at
Конкретные примеры аминокислотной последовательности VL, в которую введена 1 замена, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(4): Specific examples of the VL amino acid sequence into which 1 substitution is introduced include the following amino acid sequences (1) to (4):
(1) аминокислотную последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(1) an amino acid sequence in which Ile at
(2) аминокислотную последовательность, в которой Pro в положении 15 замещен на Leu в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(2) an amino acid sequence in which Pro at
(3) аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14;(3) an amino acid sequence in which Gln at
(4) аминокислотную последовательность, в которой Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.(4) the amino acid sequence in which Tyr at position 92 is replaced by Phe in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
Среди вышеприведенных аминокислотных последовательностей VL аминокислотная последовательность SEQ ID NO:14, аминокислотная последовательность, в которой Ile в положении 2 замещен на Val, Pro в положении 15 замещен на Leu, Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и аминокислотная последовательность, в которой Gln в положении 50 замещен на Lys и Tyr в положении 92 замещен на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, являются предпочтительными.Among the above VL amino acid sequences, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 14, the amino acid sequence in which Ile at
Конкретные примеры антитела по настоящему изобретению включают любое из антител, каждое из которых получено комбинированием вышеуказанных соответственно VH и VL.Specific examples of the antibodies of the present invention include any of the antibodies, each of which is obtained by combining the above VH and VL, respectively.
Предпочтительные примеры антитела по настоящему изобретению включают, например, следующие антитела (1)-(4):Preferred examples of the antibodies of the present invention include, for example, the following antibodies (1) to (4):
(1) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;(1) a humanized antibody containing VH, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and VL, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(2) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.2;(2) a humanized antibody containing VH, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and VL, which contains the amino acid sequence shown in figure 2;
(3) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;(3) a humanized antibody containing VH, which contains the amino acid sequence shown in figure 1, and VL, which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(4) гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.2.(4) a humanized antibody containing VH, which contains the amino acid sequence shown in figure 1, and VL, which contains the amino acid sequence shown in figure 2.
Среди аминокислотных последовательностей VH, приведенных на фиг.1, 6E4HV0 и HV12 являются предпочтительными. Кроме того, среди аминокислотных последовательностей VL, приведенных на фиг.2, 6E4LV0, LV2a и LV4 являются предпочтительными.Among the amino acid sequences VH shown in FIG. 1, 6E4HV0 and HV12 are preferred. In addition, among the amino acid sequences VL shown in Fig.2, 6E4LV0, LV2a and LV4 are preferred.
Следовательно, в качестве гуманизированного антитела, содержащего VH, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг.1, и VL, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг.2, гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей 6E4HV0 и HV12, и VL, которая содержит любую из аминокислотных последовательностей 6E4LV0, LV2a и LV4, является предпочтительным.Therefore, as a humanized antibody containing VH that contains any of the amino acid sequences shown in FIG. 1, and VL that contains any of the amino acid sequences shown in FIG. 2, a humanized antibody containing VH that contains any of the amino acid sequences 6E4HV0 and HV12, and VL, which contains any of the amino acid sequences 6E4LV0, LV2a and LV4, is preferred.
Более конкретно, примеры включают гуманизированное антитело, содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или 15, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 16 и 17.More specifically, examples include a humanized antibody containing VH that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 15, and VL that contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 and 17.
В качестве комбинации аминокислотной последовательности VH, приведенной на фиг.1, и аминокислотной последовательности VL, приведенной на фиг.2, комбинации HV0 и LV0, HV0 и LV2a, HV0 и LV4, HV12 и LV4 являются предпочтительными.As a combination of the VH amino acid sequence shown in FIG. 1 and the VL amino acid sequence shown in FIG. 2, combinations of HV0 and LV0, HV0 and LV2a, HV0 and LV4, HV12 and LV4 are preferred.
Следовательно, в качестве антитела по настоящему изобретению следующие гуманизированные антитела (1)-(4) являются более предпочтительными:Therefore, as an antibody of the present invention, the following humanized antibodies (1) to (4) are more preferred:
(1) гуманизированное антитело (HV0LV0), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV0 на фиг.2;(1) a humanized antibody (HV0LV0) containing VH that contains the amino acid sequence represented as HV0 in FIG. 1, and VL that contains the amino acid sequence represented as LV0 in FIG. 2;
(2) гуманизированное антитело (HV0LV2a), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV2a на фиг.2;(2) a humanized antibody (HV0LV2a) containing VH that contains the amino acid sequence represented by HV0 in FIG. 1, and VL that contains the amino acid sequence represented by LV2a in FIG. 2;
(3) гуманизированное антитело (HV0LV4), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV0 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV4 на фиг.2;(3) a humanized antibody (HV0LV4) containing VH that contains the amino acid sequence represented by HV0 in FIG. 1, and VL that contains the amino acid sequence represented by LV4 in FIG. 2;
(4) гуманизированное антитело (HV12LV4), содержащее VH, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как HV12 на фиг.1, и VL, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную как LV4 на фиг.2.(4) a humanized antibody (HV12LV4) containing VH that contains the amino acid sequence represented by HV12 in FIG. 1, and VL that contains the amino acid sequence represented by LV4 in FIG. 2.
Конкретные примеры вышеприведенных антител включают гуманизированное антитело, в котором комбинация аминокислотных последовательностей, входящих в состав VH и VL, представляет SEQ ID NO:12 и 14; SEQ ID NO:12 и 16; SEQ ID NO:12 и 17 и SEQ ID NO:15 и 17.Specific examples of the above antibodies include a humanized antibody in which the combination of the amino acid sequences of VH and VL is SEQ ID NO: 12 and 14; SEQ ID NO: 12 and 16; SEQ ID NO: 12 and 17; and SEQ ID NO: 15 and 17.
Кроме того, примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают гуманизированное антитело, которое конкурирует с вышеприведенным антителом в связывании с Аβ-олигомером, и гуманизированным антителом, которое связывается с эпитопом, который является таким же, как эпитоп, распознаваемый вышеприведенным гуманизированным антителом.In addition, examples of a humanized antibody of the present invention include a humanized antibody that competes with the aforementioned antibody in binding to an Aβ oligomer, and a humanized antibody that binds to an epitope that is the same as the epitope recognized by the above humanized antibody.
В настоящем изобретении первоначально антитело человека представляет антитело, находящееся в организме человека, в естественном состоянии, и оно включает антитела, полученные из фаговой библиотеки антител человека, от трансгенного животного, продуцирующего антитела человека, и тому подобное, которые получают на основе последних достижений в генной инженерии, клеточной инженерии и методов инженерии процессов развития.In the present invention, the original human antibody is an antibody present in the human body in a natural state, and it includes antibodies derived from a phage library of human antibodies, from a transgenic animal that produces human antibodies, and the like, which are obtained on the basis of recent advances in gene engineering, cell engineering and methods of engineering development processes.
Антитело, находящееся в организме человека, можно получить, например, выделением лимфоцитов периферической крови человека, их иммортализацией заражением вирусом EB или тому подобное, и затем клонированием с получением лимфоцитов, способных продуцировать антитело, культивированием полученных таким образом лимфоцитов, и выделением антитела из культурального супернатанта.An antibody in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, immortalizing them by infection with EB virus or the like, and then cloning to obtain lymphocytes capable of producing the antibody by culturing the lymphocytes thus obtained and isolating the antibody from the culture supernatant .
Фаговая библиотека антител человека представляет библиотеку, в которой фрагменты антитела, такие как Fab и scFv, экспрессируются на поверхности фага вставкой гена, кодирующего антитело, полученное из линии В-клеток человека, в фаговый ген.The human antibody phage library is a library in which antibody fragments, such as Fab and scFv, are expressed on the surface of a phage by inserting a gene encoding an antibody derived from a human B cell line into a phage gene.
Фаг, экспрессирующий фрагмент антитела, обладающий требуемой антигенсвязывающей активностью, на поверхности клеток, можно выделить из библиотеки, используя его способность связываться с иммобилизованным на поверхности антигеном в качестве показателя. Затем фрагмент антитела можно превратить в молекулу антитела человека, содержащую две полных Н-цепи и две полных L-цепи с использованием методов генной инженерии.A phage expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity on the surface of the cells can be isolated from the library using its ability to bind to the surface-immobilized antigen as an indicator. The antibody fragment can then be converted into a human antibody molecule containing two complete H chains and two full L chains using genetic engineering methods.
Трансгенное животное, продуцирующее антитело человека, является животным, у которого ген антитела человека встроен в клетки. Более конкретно, трансгенное животное, продуцирующее антитело человека, можно получить введением гена, кодирующего антитело человека, в клетку ES мыши, пересадкой клетки ES в эмбрион другой мыши на ранней стадии эмбриогенеза и затем его развитием в полноценное животное.A transgenic animal producing a human antibody is an animal in which a human antibody gene is inserted into cells. More specifically, a transgenic animal producing a human antibody can be obtained by introducing a gene encoding a human antibody into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into another mouse embryo at an early stage of embryogenesis and then developing it into a full-fledged animal.
Антитело человека, полученное у трансгенного животного, продуцирующего антитело человека, можно получить с помощью гибридомы, продуцирующей антитело человека, методом гибридом, что обычно проводят на животных, отличных от человека, культивированием полученной гибридомы и продукцией или накоплением антитела человека в культуральном супернатанте.A human antibody obtained from a transgenic animal producing a human antibody can be obtained using a hybridoma producing a human antibody by the hybridoma method, which is usually carried out on animals other than humans, by culturing the resulting hybridoma and producing or accumulating the human antibody in the culture supernatant.
Антитело или фрагмент антитела, в которых делецирована, замещена, вставлена или добавлена одна или более аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей вышеуказанные антитело или фрагмент антитела, обладающее активностью, аналогичной для вышеуказанного антитела или фрагмента антитела, также входят в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению.An antibody or antibody fragment in which one or more amino acids is deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence comprising the aforementioned antibody or antibody fragment having activity similar to the above antibody or antibody fragment is also included in the antibody or antibody fragment of the present invention .
Число аминокислотных остатков, которые делецированы, замещены, вставлены и/или добавлены, составляет одно или более, и конкретно не ограничивается, но оно находится в пределах, при которых возможна делеция, замена, вставка или добавление с использованием известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез, описанный в Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Willey&Sons (1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) или тому подобное. Например, число находится в пределах от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 и наиболее предпочтительно от 1 до 5. The number of amino acid residues that are deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and is not particularly limited, but it is within the range at which deletion, replacement, insertion or addition is possible using known methods such as site targeted mutagenesis described in Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons (1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) or the like. For example, the number ranges from 1 to 12, preferably from 1 to 20, more preferably from 1 to 10, and most preferably from 1 to 5.
Делеция, замена, вставка или добавление одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности вышеуказанного антитела означают следующее. То есть, это означает делецию, замену, вставку или добавление одного или множества аминокислотных остатков в любых положениях в одной или множестве аминокислотных последовательностей антитела в одной последовательности. Также делеция, замена, вставка или добавление могут иметь место одновременно, и аминокислота, которая заменена, вставлена или добавлена, может быть природного или неприродного типа.Deletion, replacement, insertion or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the above antibodies means the following. That is, it means deletion, substitution, insertion or addition of one or many amino acid residues at any positions in one or many amino acid sequences of an antibody in one sequence. Also, deletion, substitution, insertion or addition may take place simultaneously, and the amino acid that is replaced, inserted or added may be of a natural or non-natural type.
Природные аминокислоты включают L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-аргинин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин, L-валин, L-цистеин и тому подобное.Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine , L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
Предпочтительные примеры взаимозаменяемых аминокислот приведены ниже. Аминокислоты в одной группе являются взаимозаменяемыми аминокислотами.Preferred examples of interchangeable amino acids are given below. Amino acids in one group are interchangeable amino acids.
Группа А: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминомасляная кислота, метионин, О-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, циклогексилаланин.Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutyric acid, methionine, O-methylserine, tert-butyl glycine, tert-butylalanine, cyclohexylalanine.
Группа В: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота, 2-аминосубериновая кислота.Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid.
Группа С: аспарагин, глутамин.Group C: asparagine, glutamine.
Группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминомасляная кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота.Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutyric acid, 2,3-diaminopropionic acid.
Группа Е: пролин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин.Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline.
Группа F: серин, треонин, гомосерин.Group F: serine, threonine, homoserine.
Группа G: фенилаланин, тирозин.Group G: phenylalanine, tyrosine.
Фрагмент антитела по настоящему изобретению включает Fab, F(ab')2, Fab', scFV, диатело, dsFv, пептид, содержащий CDR и тому подобное.A fragment of an antibody of the present invention includes Fab, F (ab ') 2 , Fab', scFV, diabody, dsFv, a peptide containing CDR and the like.
Fab представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, в котором примерно половина N-концевого участка Н-цепи и полная L-цепь, из фрагментов, полученных обработкой молекулы IgG антитела протеазой, папином (расщепленного по аминокислотному остатку в положении 224 Н-цепи), связаны вместе дисульфидной связью.Fab is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, in which about half of the N-terminal portion of the H chain and the full L chain are from fragments obtained by treating the IgG antibody molecule with a protease, papin (cleaved at the amino acid residue at position 224 H chains) linked together by a disulfide bond.
Fab-фрагмент по настоящему изобретению можно получить обработкой моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, протеазой, папаином. Также Fab можно получить вставкой ДНК, кодирующей Fab антитела, в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab.The Fab fragment of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that specifically recognizes an Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, protease, papain. Fab can also be obtained by inserting a DNA encoding the Fab of an antibody into an expression vector for a prokaryote or into an expression vector for a eukaryote, and introducing the vector into a prokaryote or eukaryote to express Fab.
F(ab')2 представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, и содержащий две Fab-области, связанные в шарнирной области, полученный расщеплением нижнего участка двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG ферментом, пепсином.F (ab ') 2 represents an antibody fragment having a molecular weight of approximately 50,000 and having antigen-binding activity, and containing two Fab regions linked in the hinge region, obtained by cleaving the lower portion of two disulfide bonds in the hinge region of the IgG enzyme, pepsin.
F(ab')2-фрагмент по настоящему изобретению можно получить обработкой моноклонального антитела, специфически распознающего Aβ-олигомер и связывающегося с внеклеточным доменом, протеазой, пепсином. Также F(ab')2 можно получить связыванием Fab', описанным ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь.The F (ab ') 2 fragment of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that specifically recognizes an Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, protease, pepsin. Also, F (ab ′) 2 can be prepared by Fab ′ binding described below via a thioether bond or disulfide bond.
Fab' представляет фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, полученный расщеплением дисульфидной связи в шарнирной области вышеуказанного F(ab')2.Fab ′ is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen binding activity obtained by cleavage of a disulfide bond in the hinge region of the above F (ab ′) 2 .
Fab' по настоящему изобретению можно получить обработкой F(ab')2, который специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, восстановителем, дитиотреитолом.The Fab 'of the present invention can be obtained by treating F (ab') 2 , which specifically recognizes the Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, a reducing agent, dithiothreitol.
Также Fab' можно получить вставкой ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.Fab 'can also be obtained by inserting DNA encoding the Fab'-fragment of the antibody in the expression vector for prokaryote or in the expression vector for eukaryotes, and introducing the vector into prokaryotes or eukaryotes for expression of Fab'.
scFv представляет полипептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором цепь VH и цепь VL связаны подходящим пептидным линкером (далее обозначен как «Р») представляет фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью.scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide, in which the VH chain and VL chain are linked by a suitable peptide linker (hereinafter referred to as "P") is an antibody fragment having antigen-binding activity.
scFv по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей scFv, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии scFv.scFv of the present invention can be obtained using cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes an Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, constructing a DNA encoding scFv by inserting the DNA into an expression vector for prokaryote or expression vector for eukaryote, and introducing the vector into prokaryotes or eukaryotes to express scFv.
Диатело представляет фрагмент антитела, в котором scFv димеризован, и оно обладает двухвалентной антигенсвязывающей активностью. При двухвалентной антигенсвязывающей активности два антигена могут быть одинаковыми или различными.The diatelo is a fragment of an antibody in which scFv is dimerized, and it has divalent antigen-binding activity. With divalent antigen binding activity, two antigens may be the same or different.
Диатело по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей scFv, таким образом, чтобы длина аминокислотной последовательности Р равнялась 8 или менее остаткам, вставкой ДНК в вектор экспрессии для прокариотической клетки или в вектор экспрессии для эукариота, и введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии диатела.The diabody of the present invention can be obtained using cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes an Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, constructing a DNA encoding scFv, so that the amino acid sequence P is 8 or less residues, insert DNA into an expression vector for a prokaryotic cell or into an expression vector for a eukaryote, and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryote for expression of a diabody.
dsFv получают связыванием полипептидов, в которых один аминокислотный остаток каждой VH или VL замещен цистеиновым остатком через дисульфидную связь между остатками цистеина. Аминокислотный остаток, предназначенный для замены цистеиновым остатком, можно выбрать, основываясь на установлении трехмерной структуры антитела методом, описанным Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].dsFv is obtained by linking polypeptides in which one amino acid residue of each VH or VL is replaced by a cysteine residue through a disulfide bond between cysteine residues. An amino acid residue intended to be replaced by a cysteine residue can be selected based on the establishment of the three-dimensional structure of the antibody by the method described by Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
dsFv по настоящему изобретению можно получить с помощью кДНК, кодирующих VH и VL моноклонального антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер и связывается с внеклеточным доменом, конструированием ДНК, кодирующей dsFv, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариотичекой клетки или в вектор экспрессии для эукариотической клетки, и затем введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии dsFv.The dsFv of the present invention can be obtained using cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes an Aβ oligomer and binds to the extracellular domain, constructing a DNA encoding dsFv by inserting DNA into an expression vector for a prokaryotic cell or into an expression vector for a eukaryotic cell and then introducing the vector into prokaryotes or eukaryotes to express dsFv.
Пептид, содержащий CDR, получают включением по меньшей мере одного или более CDR VH или VL. Пептид, содержащий множество CDR, можно получить соединением CDR прямо или посредством подходящего пептидного линкера.A peptide containing a CDR is prepared by including at least one or more CDRs of VH or VL. A peptide comprising a plurality of CDRs can be prepared by combining a CDR directly or via a suitable peptide linker.
Пептид, содержащий CDR, по настоящему изобретению можно получить конструированием кДНК, кодирующей CDR VH и VL гуманизированного антитела, которое специфически распознает Aβ-олигомер по настоящему изобретению, встраивая ДНК в вектор экспрессии для прокариота или в вектор экспрессии для эукариота, и затем введением вектора в прокариот или эукариот для экспрессии пептида, содержащего CDR. Также пептид, содержащий CDR, можно получить химическим синтезом, таким как протокол с использованием Fmoc и tBoc.The peptide containing the CDRs of the present invention can be obtained by constructing a cDNA encoding the VH and VL CDRs of a humanized antibody that specifically recognizes the Aβ oligomer of the present invention by inserting DNA into an expression vector for prokaryote or into an expression vector for eukaryote, and then introducing the vector into prokaryotes or eukaryotes for expression of a peptide containing CDR. Also, a peptide containing CDR can be obtained by chemical synthesis, such as a protocol using Fmoc and tBoc.
Антитело по настоящему изобретению включает производное антитела, когда гуманизированное антитело против Aβ-олигомера по настоящему изобретению или фрагмент этого антитела химически или генетически связывают с радиоизотопом, низкомолекулярным агентом, высокомолекулярным агентом, белком, терапевтическим антителом и тому подобное.An antibody of the present invention includes a derivative of an antibody when a humanized anti-Aβ oligomer antibody of the present invention or a fragment of this antibody is chemically or genetically linked to a radioisotope, low molecular weight agent, high molecular weight agent, protein, therapeutic antibody, and the like.
Производное антитела по настоящему изобретению можно получить химической конъюгацией радиоизотопа, низкомолекулярного агента, высокомолекулярного агента, белка, терапевтического антитела и тому подобное с N-концевым или С-концевым участком Н-цепи или L-цепи гуманизированного антитела против Aβ-олигомера или фрагмента этого антитела, с подходящим заместителем или боковой цепью антитела или фрагмента этого антитела, сахарной цепью в антителе или фрагменте этого антитела и тому подобное [Antibody Engineering Handbook, опубликованная Chijiin Shokan].A derivative of an antibody of the present invention can be obtained by chemical conjugation of a radioisotope, low molecular weight agent, high molecular weight agent, protein, therapeutic antibody and the like with the N-terminal or C-terminal portion of the H chain or L chain of a humanized anti-Aβ oligomer antibody or fragment of this antibody with a suitable substituent or side chain of an antibody or fragment of this antibody, a sugar chain in an antibody or fragment of this antibody and the like [Antibody Engineering Handbook published by Chijiin Shokan].
Также производное антитела по настоящему изобретению можно получить генетически связыванием ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к Aβ-олигомеру по настоящему изобретению или фрагмента этого антитела с другой ДНК, кодирующей белок, предназначенный для конъюгации, или с ДНК, кодирующей терапевтическое антитело, включением ДНК в вектор для экспрессии и введением вектора экспрессии в клетку-хозяин.Also, the antibody derivative of the present invention can be obtained by genetically linking a DNA encoding a humanized antibody to an Aβ oligomer of the present invention or a fragment of this antibody with another DNA encoding a protein for conjugation, or with a DNA encoding a therapeutic antibody, by incorporating DNA into a vector for expression and introduction of the expression vector into the host cell.
В случае, когда вышеуказанное антитело используют в качестве детектирующего реагента, реагента для количественного анализа или диагностического агента соответственно для детектирующего способа, количественного способа или диагностического способа, то примеры агента, с которым конъюгируют гуманизированное антитело к Aβ-олигомеру или фрагмент антитела по настоящему изобретению, включают метку, которую обычно применяют в иммунологическом способе детектирования или количественного анализа.In the case where the above antibody is used as a detecting reagent, reagent for a quantitative analysis or a diagnostic agent, respectively, for a detecting method, a quantitative method or a diagnostic method, examples of the agent with which the humanized anti-Aβ oligomer antibody or antibody fragment of the present invention is conjugated, include the label, which is usually used in the immunological method of detection or quantitative analysis.
Метка включает ферменты, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза и люцифераза, люминесцентные вещества, такие как эфир акридиния и лофин, флуоресцентные вещества, такие как изотиоцианат флуоресцеина (FITC) и изотиоцианат тетраметилродамина (RITC).The label includes enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase, luminescent substances such as acridinium ester and lofin, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrodamine isothiocyanate (RITC).
Ниже описан способ получения антитела.The following describes a method for producing antibodies.
1. Получение моноклонального антитела к Аβ-олигомеру.1. Obtaining monoclonal antibodies to Aβ-oligomer.
В настоящем изобретении моноклональное антитело к Аβ-олигомеру можно получить следующим образом.In the present invention, a monoclonal antibody to an Aβ oligomer can be prepared as follows.
(1) Получение антигена(1) Obtaining antigen
В способе получения Аβ-олигомера в качестве антигенов, синтетический Аβ1-42 (Peptide Institute, Inc. Osaka) растворяют в деионизированной дистиллированной воде или в фосфатном буфере 10 ммоль/л и инкубируют при 37°С в течение 18 ч, пептид разделяют в 4-12% SDS-PAGE и полученное вещество визуализируют окрашиванием СВВ, затем отбирают только Аβ1-42-тетрамер без примесей Аβ1-42-мономера и тем самым получают Аβ1-42-олигомеры.In the method for preparing the Aβ oligomer as antigens, synthetic Aβ1-42 (Peptide Institute, Inc. Osaka) is dissolved in deionized distilled water or in 10 mmol / L phosphate buffer and incubated at 37 ° C for 18 h, the peptide is separated into 4 -12% SDS-PAGE and the resulting material were visualized by staining with CBB, then only Aβ1-42 tetramer without impurities of Aβ1-42 monomer was selected, and thereby Aβ1-42 oligomers were obtained.
Можно получить Аβ1-40-олигомеры, содержащие больше олигомеров, химической конъюгацией 6-карбокситетраметилродамина (6-TAMRA) (SIGMA) с N-концом синтезированного Аβ1-40-пептида с использованием обычного метода с последующей полимеризацией синтетического Аβ1-40 (Peptide Institute, Inc. Osaka).Aβ1-40 oligomers containing more oligomers can be obtained by chemical conjugation of 6-carboxytetramethylrodamine (6-TAMRA) (SIGMA) with the N-terminus of the synthesized Aβ1-40 peptide using the conventional method followed by polymerization of synthetic Aβ1-40 (Peptide Institute, Inc. Osaka).
(2) Иммунизация животных(2) Immunization of animals
Вначале 2,5 мкг Аβ1-42-тетрамеров или Аβ1-40-олигомеров эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда. Затем проводят иммунизацию введением антигена в подушечку лапы мышей Balb-c. Затем проводят еще шесть дополнительных иммунизаций. Слияние антигенпродуцирующих клеток и миеломных клеток проводят известным методом, таким как метод Kohler and Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. (1981), 73, 3-46) и тому подобное. В частности, иммуноциты, продуцирующие антитело, получают из паховых лимфатических узлов мыши, иммунизированной антигеном.Initially, 2.5 μg of Aβ1-42-tetramers or Aβ1-40-oligomers are emulsified in complete Freund's adjuvant. Immunization is then carried out by introducing antigen into the paw pad of Balb-c mice. Then another six additional immunizations are given. The fusion of antigen-producing cells and myeloma cells is carried out by a known method such as the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. (1981), 73, 3-46) and the like. In particular, antibody producing immunocytes are obtained from the inguinal lymph nodes of a mouse immunized with an antigen.
Иммунизацию проводят введением антигена животному с помощью подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции вместе с подходящим адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда и комбинация геля гидроксида алюминия и вакцины против коклюша.Immunization is carried out by administering the antigen to the animal by subcutaneous, intravenous or intraperitoneal injection together with a suitable adjuvant, such as Freund's complete adjuvant and a combination of aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
В том случае, когда в качестве антигена используют неполный пептид, то получают конъюгат с белковым носителем, таким как BSA (бычий сывороточный альбумин) и KLH (гемоцианин из морского моллюска) для применения в качестве антигена. In the case where an incomplete peptide is used as an antigen, a conjugate is obtained with a protein carrier such as BSA (bovine serum albumin) and KLH (hemocyanin from a sea mollusk) for use as an antigen.
Животное, иммунизированное антигеном, может представлять собой любое животное, при условии, что можно получить гибридому, и предпочтительно используемыми животными являются мышь, крыса, хомяк, курица, кролик или тому подобное. Также антитело по настоящему изобретению включает антитело, продуцированное гибридомой, полученной слиянием миеломной клетки с клеткой, обладающей антитело-продуцирующей активностью, полученной от такого животного после иммунизации in vitro.An animal immunized with an antigen can be any animal, provided that a hybridoma can be obtained, and preferably the animals used are a mouse, rat, hamster, chicken, rabbit, or the like. The antibody of the present invention also includes an antibody produced by a hybridoma obtained by fusion of a myeloma cell with a cell having antibody-producing activity obtained from such an animal after in vitro immunization.
(3) Получение миеломных клеток(3) Obtaining myeloma cells
В качестве миеломных клеток используют постоянные клеточные линии, полученные от мыши. Примеры включают линию резистентных к 8-азагуанину миеломных клеток мыши (полученную от BALB/c) P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 [J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] и тому подобное.As myeloma cells, constant cell lines derived from mice are used. Examples include the 8-azaguanin-resistant mouse myeloma cell line (obtained from BALB / c) P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)], P3-NS1 / 1- Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 [J. Immunology, 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)] and the like.
Миеломные клетки субкультивируют в обычной среде [среде RPMI1640, содержащей глутамин, 2-меркаптоэтанол, гентамицин, FBS и 8-азагуанин]. Клетки трансфектируют в обычной среде в течение 3-4 суток перед слиянием клеток для гарантии получения титра 2×107 клеток или выше на день проведения слияния.Myeloma cells are subcultured in normal medium [RPMI1640 medium containing glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS and 8-azaguanine]. Cells are transfected in normal medium for 3-4 days before cell fusion to ensure that a titer of 2 × 10 7 cells or higher is obtained on the day of the fusion.
(4) Слияние клеток и получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела(4) Cell fusion and production of hybridomas producing monoclonal antibodies
Гибридому можно получить слиянием клеток, продуцирующих антитело, полученных для слияния на стадии (2), и миеломных клеток, полученных на стадии (3), с использованием полиэтиленгликоля 1500.A hybridoma can be obtained by fusion of antibody producing cells obtained for fusion in step (2) and myeloma cells obtained in step (3) using polyethylene glycol 1500.
После культивирования отбирают порцию культурального супернатанта и подвергают скринингу гибридом с использованием метода, такого как дот-блоттинг и тест оценки связывания для идентификации популяции клеток, продуцирующих антитела, которые реагируют с Aβ-олигомерами, но не с Aβ-мономерами, как описано ниже. Затем дважды проводят клонирование методом ограниченного разведения [используют среду HT (среда HT без аминоптерина) в первом раунде и используют обычную среду во втором раунде], и выбирают гибридому со стабильно высоким титром антител, в качестве гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело.After cultivation, a portion of the culture supernatant is taken and hybridized using a method such as dot blot and binding assay to identify a population of antibody producing cells that react with Aβ oligomers, but not with Aβ monomers, as described below. Clone dilution cloning was then performed twice [using HT medium (HT medium without aminopterin) in the first round and using normal medium in the second round], and a hybridoma with a stable high titer of antibodies was chosen as the hybridoma producing the monoclonal antibody.
(5) Получение очищенных моноклональных антител(5) Obtaining purified monoclonal antibodies
Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, полученные на стадии (4), вводят внутрибрюшинно 8-10-недельным мышам или голым мышам, которых предварительно обрабатывают внутрибрюшинным введением пристана (0,5 мл 2,6,10,14-тетраметилпентадекана (пристана) с последующим содержанием в течение 2 недель).The hybridoma cells producing the monoclonal antibody obtained in step (4) are intraperitoneally administered to 8-10-week-old mice or nude mice, which are pretreated with intraperitoneal administration of pristan (0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristan) with subsequent maintenance for 2 weeks).
В течение 10-21 суток гибридома образует асцитную опухоль. Собирают асцитную жидкость от мышей, центрифугируют для удаления твердых кусочков опухоли, подвергают высаливанию 40-50% сульфатом аммония и затем осаждают каприловой кислотой, пропускают через колонку с DEAE-сефарозой, колонку с белком А или колонку для гель-фильтрации для сбора фракций IgG или IgM в качестве очищенных моноклональных антител.Within 10-21 days, the hybridoma forms an ascites tumor. Collect ascites fluid from mice, centrifuged to remove solid pieces of the tumor, salted out with 40-50% ammonium sulfate and then precipitated with caprylic acid, passed through a column with DEAE-Sepharose, a column of protein A or a column for gel filtration to collect fractions of IgG or IgM as purified monoclonal antibodies.
(6) Отбор моноклональных антител(6) Selection of monoclonal antibodies
В качестве примера метода скрининга антитела, можно привести отбор антитела, в котором используется способность антитела связываться с Aβ-олигомером в качестве показателя.An example of an antibody screening method is the selection of an antibody that uses the ability of an antibody to bind to an Aβ oligomer as an indicator.
Связывающую активность антитела к антигену (Aβ-олигомеру) по настоящему изобретению можно анализировать с использованием по меньшей мере одного из методов, таких как определение поглощения, твердофазный иммуноферментный метод (дот-блоттинг, ELISA), иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммуноанализ (RIA), иммунофлуоресцентный метод и Biacore (Biacore Life Science), используя метод поверхностного плазмонного резонанса (метод SPR).The binding activity of an antibody to an antigen (Aβ-oligomer) of the present invention can be analyzed using at least one of the methods, such as determination of absorption, enzyme-linked immunosorbent assay (dot blot, ELISA), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), radioimmunoassay (RIA) immunofluorescence method and Biacore (Biacore Life Science) using surface plasmon resonance method (SPR method).
Более конкретно, связывание моноклонального антитела к Aβ-олигомеру с Aβ-олигомером можно оценить дот-блоттингом, в котором 2,5 мкл Аβ1-42 (2,5 мкг/дот) предварительно инкубируют в течение 18 ч с последующей иммобилизацией на нитроцеллюлозной мембране. После блокирования неспецифического связывания на мембране раствором фосфатного буфера, содержащим 5% обезжиренного молока, 1% BSA и 0,05% твина-20, мембрану инкубируют с культуральным супернатантом и тем самым можно детектировать способность антитела связываться с Aβ-олигомером в культуральным супернатанте с помощью меченного пероксидазой из хрена овечьего антимышиного F(ab')2 (1:3000; Amersham) с использованием набора для активированной хемилюминесценции (ECL) и LAS3000mini (Fujitsu, Tokyo, Япония) (WO 2009/051220).More specifically, the binding of a monoclonal antibody to an Aβ oligomer to an Aβ oligomer can be evaluated by dot blotting in which 2.5 μl of Aβ1-42 (2.5 μg / dot) is preincubated for 18 hours followed by immobilization on a nitrocellulose membrane. After blocking non-specific binding on the membrane with a solution of phosphate buffer containing 5% skim milk, 1% BSA and 0.05% Tween-20, the membrane is incubated with the culture supernatant and thereby the ability of the antibody to bind to the Aβ oligomer in the culture supernatant can be detected using labeled with horseradish peroxidase from sheep's anti-mouse F (ab ') 2 (1: 3000; Amersham) using an activated chemiluminescence kit (ECL) and LAS3000mini (Fujitsu, Tokyo, Japan) (WO 2009/051220).
ELISA проводят иммобилизацией антитела на планшете, добавлением антигена для антитела на планшет и добавлением пробы, содержащей желаемые антитела, такой как культуральный супернатант клеток, продуцирующих антитело, и очищенное антитело. Затем добавляют вторичное антитело, распознающее первичное антитело, которое является антителом, меченным ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшет инкубируют. После отмывки в планшет вносят субстрат для фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и определяют поглощение для оценки способности антитела связываться с пробой-мишенью.ELISAs are performed by immobilizing the antibody on a plate, adding the antigen for the antibody to the plate, and adding a sample containing the desired antibodies, such as the culture supernatant of the antibody producing cells and a purified antibody. Then add a secondary antibody that recognizes the primary antibody, which is an antibody labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, and the plate is incubated. After washing, a substrate for an enzyme, such as p-nitrophenylphosphate, is added to the plate and absorption is determined to evaluate the ability of the antibody to bind to the target sample.
Кроме того, также можно определить реактивность антитела с использованием твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» с использованием хемилюминесценции (хемилюминесценции-ELISA) для специфического детектирования Aβ-олигомеров, но не Aβ-мономеров в настоящем изобретении (WO 2009/051220).In addition, it is also possible to determine the reactivity of an antibody using a sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay using chemiluminescence (chemiluminescence ELISA) for the specific detection of Aβ oligomers, but not the Aβ monomers in the present invention (WO 2009/051220).
Дополнительно в настоящем изобретении для оценки эффективности моноклонального антитела, которое введено в периферическую кровь мыши in vivo, можно поставить ELISA с HPR-меченным 6E10 (Senetec PLC, Napa, CA, США), специфичным для олимера человека, в целях анализа Aβ-олигомеров в плазме и органах, отобранных от мыши, которой ввели антитело (WO 2009/051220).Additionally, in the present invention, to evaluate the efficacy of a monoclonal antibody that is introduced into the peripheral blood of a mouse in vivo, an ELISA with HPR-labeled 6E10 (Senetec PLC, Napa, CA, USA) specific for human olimer can be provided for the analysis of Aβ oligomers in plasma and organs taken from a mouse injected with an antibody (WO 2009/051220).
Кроме того, возможно определить, насколько гуманизированное антитело против Aβ-олигомера может связываться с Aβ-олигомерами в мозге больных, страдающих AD, посредством иммунопреципитации (Ghiso G. et al., Biochem. J., 1993) с амилоидной фракцией (Matsubara E. et al., Neurobiol. Aging, 2004), содержащей большое количество Aβ-олигомеров (WO 2009/051220).In addition, it is possible to determine how a humanized anti-Aβ oligomer antibody can bind to Aβ oligomers in the brains of patients with AD by immunoprecipitation (Ghiso G. et al., Biochem. J., 1993) with an amyloid fraction (Matsubara E. et al., Neurobiol. Aging, 2004) containing a large number of Aβ oligomers (WO 2009/051220).
(7) Оценка активности антитела против Aβ-олигомера(7) Evaluation of the activity of antibodies against Aβ-oligomer
В настоящем изобретении возможно определить, что антитело против Аβ-олигомера специфически связывается с Aβ-олигомерами и обладает цитопротективной активностью при инкубации с Aβ в тесте с тиофлавином (ThT), в тесте Aβ-индуцированной нейротоксичности и при анализе оценки реактивности против многочисленных Aβ-олигомеров различного размера, фракционированных ультрафильтрацией и гель-фильтрацией, которые все были раскрыты Yamamoto N. et al., J. Biol. Chem., 282:2646-2655, 2007 или WO 2009/051220.In the present invention, it is possible to determine that an anti-Aβ-oligomer antibody specifically binds to Aβ-oligomers and has cytoprotective activity when incubated with Aβ in the thioflavin (ThT) test, in the Aβ-induced neurotoxicity test and in the analysis of the assessment of reactivity against multiple Aβ-oligomers various sizes, fractionated by ultrafiltration and gel filtration, all of which were disclosed by Yamamoto N. et al., J. Biol. Chem., 282: 2646-2655, 2007 or WO 2009/051220.
Кроме того, можно оценить активность подавлять образование Aβ-амилоидных волокон с использованием теста ThT и электронной микроскопии.In addition, one can evaluate the activity of inhibiting the formation of Aβ-amyloid fibers using the ThT test and electron microscopy.
В настоящем изобретении можно определить способность захватывать Aβ-олигомеры в мозге больных, страдающих AD, по наличию SDS-стабильного 4-,5-,8-,12-мера при иммунопреципитации с использованием гуманизированного антитела к Aβ-олигомеру.In the present invention, it is possible to determine the ability to capture Aβ oligomers in the brain of patients suffering from AD by the presence of an SDS-stable 4-, 5-, 8-, 12-measure in immunoprecipitation using a humanized antibody to Aβ-oligomer.
Кроме того, в настоящем изобретении примеры способа оценки способности антитела профилактировать AD-подобный патогенез у APPswe-трансгенных мышей (Tg2576) включают способ, в котором гуманизированное антитело по настоящему изобретению вводят мыши для установления того, насколько оно можно предупредить или нет развитие признаков AD-подобного патогенеза, таких как потеря памяти, сенильные бляшки, дисфункция синапсов и Аβ-накопление (WO 2009/051220).In addition, in the present invention, examples of a method for evaluating the ability of an antibody to prevent AD-like pathogenesis in APPswe-transgenic mice (Tg2576) include a method in which a humanized antibody of the present invention is administered to mice to determine whether it can prevent or not develop AD- similar pathogenesis, such as memory loss, senile plaques, synapse dysfunction, and Aβ accumulation (WO 2009/051220).
2. Получение рекомбинантного антитела2. Obtaining a recombinant antibody
Можно получить трансформант для стабильной экспрессии рекомбинантного антитела и рекомбинантное антитело, как описано ниже.A transformant for stable expression of a recombinant antibody and a recombinant antibody can be prepared as described below.
(1) Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного антитела(1) Construction of a vector for expression of a recombinant antibody
Вектор для экспрессии рекомбинантного антитела представляет собой вектор экспрессии животной клетки, в которую встроены ДНК, кодирующие CH и CL антитела человека, и его конструируют клонированием каждой ДНК, кодирующей CH и CL антитела человека, в вектор экспрессии животной клетки.A recombinant antibody expression vector is an animal cell expression vector into which DNA encoding human CH and CL antibodies are inserted and is constructed by cloning each DNA encoding human CH and CL antibody into an animal cell expression vector.
С-область антитела человека может представлять CH и CL любого антитела человека. Примеры включают СН, относящуюся к γ1 подклассу, CL, относящуюся к κ классу и тому подобное. В качестве ДНК, кодирующих CH и CL антитела человека, можно использовать хромосомную ДНК, содержащую экзон и интрон, или кДНК.The C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody. Examples include CH, belonging to the γ1 subclass, CL, belonging to the κ class, and the like. As DNA encoding human CH and CL antibodies, chromosomal DNA containing exon and intron, or cDNA, can be used.
В качестве вектора экспрессии животной клетки можно использовать любой вектор экспрессии при условии, что ген, кодирующий С-область антитела человека, можно вставить в него и экспрессировать. Примеры включают ppAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 91981)], pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)] и тому подобное.As the expression vector of the animal cell, any expression vector can be used, provided that the gene encoding the C region of a human antibody can be inserted into and expressed. Examples include ppAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 91981)], pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)] and the like.
Примеры промотора и энхансера, используемых для вектора экспрессии животной клетки, включают ранний промотор SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], LTR вируса лейкоза мышей Молони [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], промотор Н-цепи иммуноглобулина [Cell, 41, 479 (1985)] и энхансер [Cell, 33, 717 (1983)] и тому подобное.Examples of the promoter and enhancer used for the animal cell expression vector include the SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], LTR of Moloni mouse leukemia virus [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], an immunoglobulin H chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)] and the like.
Вектор для экспрессии рекомбинантного антитела может быть вектором любого типа, когда ген, кодирующий Н-цепь антитела и ген, кодирующий L-цепь антитела, находятся в отдельных векторах или в векторе типа, когда оба гена находятся в одном векторе (тандемный тип). С учетом простоты конструирования вектора для экспресиии рекомбинантного антитела, простоты введения в животные клетки и баланса между уровнем экспрессии H-цепи и L-цепи в животных клетках, то тандемный тип вектора для экспрессии рекомбинантного антитела является более предпочтительным [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994].The vector for expression of the recombinant antibody can be any type of vector when the gene encoding the antibody H chain and the gene encoding the antibody L chain are in separate vectors or in a type vector when both genes are in the same vector (tandem type). Given the simplicity of constructing a vector for expression of a recombinant antibody, the ease of introduction into animal cells and the balance between the expression level of the H chain and L chain in animal cells, the tandem type of vector for expression of the recombinant antibody is more preferred [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994).
Примеры векторов тандемного типа для экспрессии рекомбинантного антитела включают pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] и тому подобное.Examples of tandem type vectors for the expression of a recombinant antibody include pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] and the like.
(2) Получение кДНК, кодирующей V-область антитела, полученного у животного, отличного от человека, и анализ аминокислотной последовательности(2) Obtaining cDNA encoding the V region of an antibody obtained from a non-human animal, and amino acid sequence analysis
Фракцию мРНК экстрагируют из гибридомных клеток, продуцирующих антитело, полученное от животного, отличного от человека, для синтеза кДНК. Синтезированную кДНК клонируют в вектор и проводят секвенирование с использованием ДНК-секвенатора для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих VH и VL. The mRNA fraction is extracted from hybridoma cells producing an antibody obtained from a non-human animal for the synthesis of cDNA. The synthesized cDNA is cloned into a vector and sequenced using a DNA sequencer to determine the nucleotide sequences encoding VH and VL.
Насколько полученные кДНК кодируют полноразмерные аминокислотные последовательности VL и VH антитела, содержащего последовательность секреторного сигнала, можно подтвердить установлением полноразмерных аминокислотных последовательностей VH и VL из определенной нуклеотидной последовательности и сравнением их с полноразмерными аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].The extent to which the obtained cDNA encodes the full-length amino acid sequences of the VL and VH antibodies containing the secretory signal sequence can be confirmed by establishing full-sized amino acid sequences of VH and VL from a specific nucleotide sequence and comparing them with the full-sized amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Длину последовательности секреторного сигнала и N-концевой аминокислотной последовательности можно определить сравнением полноразмерных аминокислотных последовательностей VH и VL антитела, содержащего последовательность секреторного сигнала, с полноразмерными аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], и также можно узнать подгруппу, к которой они относятся.The length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be determined by comparing the full-sized amino acid sequences of the VH and VL antibodies containing the secretion signal sequence with the full-sized amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], and you can also find out the subgroup to which they belong.
Кроме того, можно определить аминокислотную последовательность каждого CDR VH и VL сравнением полученных аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями VH и VL известных антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].In addition, the amino acid sequence of each VH and VL CDR can be determined by comparing the obtained amino acid sequences with the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
(3) Конструирование вектора для экспрессии химерного антитела человека(3) Construction of a vector for the expression of a chimeric human antibody
кДНК, кодирующие VH и VL антитела животного, отличного от человека, клонируют слева от генов, кодирующих CH или CL антитела человека, в вектор для экспрессии рекомбинантного антитела со стадии (1) для конструирования вектора для экспрессии химерного антитела человека.cDNAs encoding the non-human animal VH and VL antibodies are cloned to the left of the human CH or CL antibody encoding genes into a vector for expressing the recombinant antibody of step (1) to construct a vector for expressing a human chimeric antibody.
Например, кДНК, кодирующие VH и VL, составляют и конструируют для включения линкерных последовательностей, кодирующих соответствующие аминокислоты и содержащих соответствующие сайты узнавания рестриктаз, для обеспечения таким образом соединения между 3'-концом кДНК VH и VL из антитела животного, отличного от человека, и 5'-концом CH или CL из антитела человека.For example, cDNAs encoding VH and VL are designed and constructed to include linker sequences encoding the corresponding amino acids and containing the corresponding restriction enzyme recognition sites, to thereby provide a connection between the 3'-end of the VH and VL cDNA from a non-human animal antibody, and 5'-end of CH or CL from human antibodies.
Каждую полученную кДНК, кодирующую VH и VL, клонируют таким образом, чтобы каждая из них экспрессировалась в соответствующей форме слева от гена, кодирующего CH или CL антитела человека из вектора для экспрессии гуманизированного антитела, со стадии (1), для конструирования вектора для экспрессии химерного антитела человека.Each obtained cDNA encoding VH and VL is cloned so that each of them is expressed in appropriate form to the left of the gene encoding CH or CL human antibodies from the vector for the expression of a humanized antibody, from step (1), to construct a vector for expression of the chimeric human antibodies.
Кроме того, кДНК, кодирующую VH и VL от животного, отличного от человека, амплифицируют ПЦР с использованием синтетической ДНК, содержащей последовательность узнавания соответствующей рестриктазы на обоих концах, и каждую из них клонируют в вектор для экспрессии рекомбинантного антитела со стадии (1).In addition, cDNA encoding VH and VL from an animal other than human is amplified by PCR using synthetic DNA containing the recognition sequence for the corresponding restriction enzyme at both ends, and each of them is cloned into a vector for expression of the recombinant antibody from step (1).
(4) Конструирование кДНК, кодирующей V-область гуманизированного антитела(4) Construction of cDNA Encoding the V Region of the Humanized Antibody
кДНК, кодирующие VH и VL гуманизированного антитела, можно получить следующим образом.cDNA encoding the VH and VL of a humanized antibody can be obtained as follows.
Вначале, отбирают аминокислотные последовательности каркасной области (далее обозначена как «FR») в VH и VL антитела человека, на которые трансплантируют аминокислотные последовательности CDR в VH и VL, полученные из антитела животного, отличного от человека. Можно использовать любые аминокислотные последовательности FR в VH и VL антитела человека при условии, что они происходят от человека.First, the amino acid sequences of the framework region (hereinafter referred to as “FR”) in human VH and VL antibodies are selected, onto which the amino acid sequences of CDRs in VH and VL obtained from a non-human animal antibody are transplanted. You can use any amino acid sequence of FR in VH and VL of human antibodies, provided that they are derived from humans.
Примеры включают аминокислотные последовательности FR в VH и VL антител человека, зарегистрированных в базе данных Protein Data Bank, и аминокислотные последовательности, общие для подгрупп FR в VH и VL антител человека [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] и тому подобное.Examples include the amino acid sequences of FR in VH and VL of human antibodies registered in the Protein Data Bank database, and amino acid sequences common to subgroups of FR in VH and VL of human antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] and the like.
Для ингибирования связывающей активности антитела выбирают аминокислотные последовательности, обладающие высокой гомологией (по меньшей мере, 60% или выше) с аминокислотной последовательностью FR в VH и VL исходного антитела.To inhibit the binding activity of an antibody, amino acid sequences having high homology (at least 60% or higher) with the amino acid sequence FR in the VH and VL of the parent antibody are selected.
Затем аминокислотные последовательности CDR VH и VL исходного антитела пересаживают на выбранную аминокислотную последовательность FR в VH и VL антитела человека соответственно для конструирования каждой аминокислотной последовательности VH и VL гуманизированного антитела.The amino acid sequences of the VH and VL CDRs of the parent antibody are then transplanted onto the selected FR amino acid sequence in the human VH and VL antibodies, respectively, to construct each amino acid sequence of the humanized antibody VH and VL.
Сконструированные аминокислотные последовательности превращают в ДНК-последовательности с учетом частоты использования кодонов, установленной в нуклеотидных последовательностях генов антител [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] и конструируют ДНК-последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность VH и VL гуманизированного антитела.The constructed amino acid sequences are converted into DNA sequences, taking into account the codon frequency used in the nucleotide sequences of antibody genes [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] and construct a DNA sequence encoding the amino acid sequence VH and VL of a humanized antibody.
(5) Модификация аминокислотной последовательности V-области гуманизированного антитела(5) Modification of the amino acid sequence of the V region of a humanized antibody
Известно, что когда гуманизированное антитело получают просто пересадкой только CDR в VH и VL антитела, полученного у животного, отличного от человека, в FR VH и VL антитела человека, то его антигенсвязывающая активность снижается по сравнению с исходным антителом, полученным у животного, отличного от человека [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].It is known that when a humanized antibody is obtained simply by transplanting only CDR in a VH and VL antibody obtained from a non-human animal into a FR VH and VL human antibody, its antigen-binding activity is reduced compared to the original antibody obtained from an animal other than human [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
В гуманизированных антителах среди аминокислотных последовательностей FR в VH и VL антитела человека идентифицируют аминокислотные остатки, которые непосредственно ассоциированы со связыванием антигена, аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с аминокислотным остатком в CDR и аминокислотные остатки, которые поддерживают трехмерную структуру антитела и опосредованно ассоциированы со связыванием антигена, и модифицируют в аминокислотные остатки, обнаруженные в исходном антителе от животного, отличного от человека, тем самым, повысив антигенсвязывающую активность, которая была снижена.In humanized antibodies, among the amino acid sequences FR in VH and VL, human antibodies identify amino acid residues that are directly associated with antigen binding, amino acid residues that interact with the amino acid residue in the CDR and amino acid residues that support the three-dimensional structure of the antibody and are indirectly associated with antigen binding, and modify to amino acid residues found in the original antibody from an animal other than human, thereby ysiv antigen binding activity which has been reduced.
Для идентификации аминокислотных остатков, связанных с антигенсвязывающей активностью в FR, конструируют трехмерную структуру антитела рентгеновской кристаллографией [J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)], компьютерным моделированием [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] или тому подобное.To identify the amino acid residues associated with antigen binding activity in FR, a three-dimensional antibody structure is constructed by X-ray crystallography [J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)], computer simulations [Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] or the like.
Кроме того, модифицированное гуманизированное антитело, обладающее антигенсвязывающей активностью, можно идентифицировать, повторяя различные попытки получить несколько видов модификации каждого антитела и исследуя корреляцию между каждым из модифицированных антител и его антигенсвязывающей активностью. In addition, a modified humanized antibody having antigen-binding activity can be identified by repeating various attempts to obtain several types of modifications of each antibody and examining the correlation between each of the modified antibodies and its antigen-binding activity.
Модификацию аминокислотной последовательности FR в VH и VL антитела человека можно осуществить с использованием различных синтетических ДНК для модификации с помощью ПЦР, как описано на стадии (4). Нуклеотидную последовательность амплифицированного ПЦР продукта определяют согласно методу, описанному на стадии (2), для подтверждения того, что предполагаемая модификация имела место.Modification of the amino acid sequence of FR in VH and VL of a human antibody can be carried out using various synthetic DNAs for modification by PCR, as described in step (4). The nucleotide sequence of the amplified PCR product is determined according to the method described in step (2) to confirm that the proposed modification has taken place.
(6) Конструирование вектора для экспрессии гуманизированного антитела(6) Construction of a vector for the expression of a humanized antibody
Вектор для экспрессии гуманизированного антитела можно сконструировать клонированием каждой кДНК, кодирующей VH или VL в сконструированном рекомбинантном антителе, слева от каждого гена, кодирующего CH или CL антитела человека в векторе для экспрессии рекомбинантного антитела, как описано на стадии (1).A vector for expressing a humanized antibody can be constructed by cloning each cDNA encoding VH or VL in the engineered recombinant antibody to the left of each gene encoding a human CH or CL antibody in the vector for expressing the recombinant antibody as described in step (1).
Например, последовательности узнавания соответствующих рестриктаз вводят в 5'-конец синтетических ДНК, располагая их на обоих концах синтетических ДНК, использованных для конструирования VH или VL гуманизированного антитела со стадий (4) и (5), для обеспечения клонирования VH или VL слева от каждого гена, кодирующего CH или CL антитела человека в вектор экспрессии для гуманизированного антитела, как описано выше на стадии (1), для экспрессии в соответствующей форме.For example, recognition sequences for the corresponding restriction enzymes are introduced at the 5'-end of the synthetic DNA, positioning them at both ends of the synthetic DNA used to construct the VH or VL of the humanized antibody from steps (4) and (5) to allow for cloning of VH or VL to the left of each a gene encoding a human CH or CL antibody into an expression vector for a humanized antibody, as described above in step (1), for expression in an appropriate form.
(7) Временная экспрессия рекомбинантного антитела (7) Transient expression of a recombinant antibody
Для эффективной оценки антигенсвязывающей активности различных полученных гуманизированных антител, рекомбинантные антитела можно временно экспрессировать с использованием вектора для экспрессии рекомбинантного антитела, как описано выше на стадиях (3) и (6), или их модифицированного вектора экспрессии.To effectively evaluate the antigen-binding activity of the various humanized antibodies produced, recombinant antibodies can be temporarily expressed using a recombinant antibody expression vector as described above in steps (3) and (6), or a modified expression vector thereof.
Любую клетку можно использовать в качестве клетки-хозяина для интродукции вектора экспрессии при условии, что клетка-хозяин может экспрессировать реокмбинантное антитело. Как правило, используют клетки COS-7 (ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)]. Примеры способов введения вектора экспрессии в клетки COS-7 включают DEAE-декстрановый метод [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)], липофекцию [Proc. Natl. Aacad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] и тому подобное.Any cell can be used as a host cell to introduce an expression vector, provided that the host cell can express a re-recombinant antibody. COS-7 cells (ATCC CRL1651) are typically used [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)]. Examples of methods for introducing an expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Research, CRC Press, 283 (1991)], lipofection [Proc. Natl. Aacad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
(8) Установление трансформанта, который стабильно экспрессирует рекомбинантное антитело и получение рекомбинантного антитела(8) Establishment of a transformant that stably expresses a recombinant antibody and obtaining a recombinant antibody
Трансформант со стабильной экспрессией рекомбинантного антитела можно получить введением вектора для экспрессии рекомбинантного антитела, описанного на стадиях (3) и (6), в соответствующую клетку-хозяин.A transformant with stable expression of the recombinant antibody can be obtained by introducing the vector for expression of the recombinant antibody described in steps (3) and (6) into the corresponding host cell.
Примеры метода введения вектора экспрессии в клетку-хозяин включают электропорацию [опубликованная, не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] и тому подобное.Examples of a method for introducing an expression vector into a host cell include electroporation [published, unexamined Japanese Patent Application No. 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
В качестве клетки-хозяина, в которую вводят вектор для экспрессии рекомбинантного антитела, можно использовать любую клетку, при условии, что она является клеткой-хозяином, которая может экспрессировать рекомбинантное антитело. Примеры включают клетки CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUKXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat. No. 11619), клетки крысы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (в дальнейшем также относящиеся к YB2/0; ATCC CRL1662), клетки мышиной миеломы NS0, мышиной миеломы SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), клетки мыши P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), клетки СНО, дефектные по гену дигидрофолатредуктазы (далее обозначены как «dhfr») [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], резистентная к лектину линия Lec13 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)], клетки СНО, дефектные по гену α1,6-фукозилтрансферазы (WO 2005/35586, WO 02/31140) и тому подобное.Any cell may be used as the host cell into which the vector for expression of the recombinant antibody is introduced, provided that it is a host cell that can express the recombinant antibody. Examples include CHO-K1 cells (ATCC CCL-61), DUKXB11 (ATCC CCL-9096), Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat. No. 11619), rat cells YB2 / 3HL .P2.G11.16Ag.20 (hereinafter also referred to as YB2 / 0; ATCC CRL1662), NS0 mouse myeloma cells, SP2 / 0-Ag14 mouse myeloma (ATCC CRL1581), mouse cells P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580) , CHO cells defective in the dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as “dhfr") [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], lectin-resistant Lec13 line [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)], CHO cells defective in α1,6-fucosyltransferase gene (WO 2005/35586, WO 02 / 31140) and the like.
Кроме того, также можно использовать клетки-хозяева, в которых снижена или делецирована активность белка, такого как фермент, связанный с синтезом внутриклеточного сахар-содержащего нуклеотида, GDP-фукозы, белка, такого как фермент, связанный с модификацией сахарной цепи, в которой положение 1 фукозы связано с положением 6 в N-ацетилглюкозамине в редуцирующем конце через α-связь в N-гликозид-связанной сахарной цепи сложного типа, или белка, связанного с транспортом внутриклеточного сахар-содержащего нуклеотида, GDP-фукозы к тельцам Гольджи, такие как клетки СНО, которые являются дефектными по гену α1,6-фукозилтрансферазы, описанные в WO 2005/35586, WO 02/31140.In addition, host cells can also be used in which the activity of a protein is reduced or deleted, such as an enzyme associated with the synthesis of an intracellular sugar-containing nucleotide, GDP-fucose, a protein, such as an enzyme associated with a sugar chain modification in which 1 fucose is linked to
После интродукции вектора экспрессии отбирают трансформанты, стабильно экспрессирующие рекомбинантное антитело, культивированием в среде для культивирования животных клеток, содержащей агент, такой как G418 (далее обозначен как «G418») (опубликованная, не прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № 257891/90).After the introduction of the expression vector, transformants stably expressing the recombinant antibody are selected by culturing in an animal cell culture medium containing an agent such as G418 (hereinafter referred to as "G418") (published, unexamined Japanese Patent Application No. 257891/90).
Примеры среды для культивирования клеток животных включают среду RPMI1640 (производства Invitrogen), среду GIT (производства Nihon Pharmaceutical), среду EX-CELL301 (производства JRH), среду IMDM (производства Invitrogen), среду Hybridoma-SFM (производства Invitrogen), производные сред, содержащие различные добавки, такие как FBS.Examples of animal cell culture media include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nihon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma-SFM medium (manufactured by Invitrogen), derived media, containing various additives such as FBS.
Рекомбинантное антитело можно получить и накопить в культуральном супернатанте культивированием отобранных трансформантов в среде. Можно определить уровень экспрессии и антигенсвязывающую активность рекомбинантного антитела в культуральном супернатанте с использованием ELISA или тому подобное.A recombinant antibody can be obtained and accumulated in the culture supernatant by culturing selected transformants in the medium. The expression level and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be determined using ELISA or the like.
Также в трансформанте можно повысить уровень экспрессии рекомбинантного антитела при использовании DHFR амплификационной системы или тому подобное согласно способу, раскрытому в опубликованной, не прошедшей экспертизу заявке на патент Японии № 257891/90.Also, in a transformant, the expression level of a recombinant antibody can be increased using a DHFR amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Published, Unexamined Patent Application No. 257891/90.
Рекомбинантное антитело можно выделить из культурального супернатанта трансформанта на колонке с белком А [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].The recombinant antibody can be isolated from the culture supernatant of the transformant on a protein A column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
Например, рекомбинантное антитело можно выделить комбинацией гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, ультрафильтрации и тому подобное.For example, a recombinant antibody can be isolated by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration, and the like.
Молекулярную массу Н-цепи или L-цепи очищенного рекомбинантного антитела или молекулы антитела обычно определяют электрофорезом в полиакриламидном геле (далее обозначен как «SDS-PAGE») [Nature, 227, 680 (1970)], вестерн-блоттингом [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] и тому подобное.The molecular weight of the H chain or L chain of a purified recombinant antibody or antibody molecule is usually determined by polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as "SDS-PAGE") [Nature, 227, 680 (1970)], Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third Edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] and the like.
3. Способ регуляции эффекторной активности антитела3. Method for the regulation of antibody effector activity
В качестве способа регуляции эффекторной активности гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению известен способ регуляции количества фукозы (далее обозначена как «кор фукоза»), которая связана α1,6-связью с N-ацетилглюкозамином (GlcNAc), находящимся в редуцирующем конце N-связанной сахарной цепи сложного типа, которая соединена с аспарагином (Asn) в положении 297 Fc-области антитела (WO 2005/035586, WO 2002/31140 и WO 00/61739); способ регуляции эффекторной активности моноклонального антитела модификацией аминокислотной группы(п) Fc-области антитела; способ конструирования подкласса антитела и тому подобное. Эффекторную активность гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению можно регулировать с использованием любого из способов.As a method for regulating the effector activity of a humanized anti-Aβ oligomer antibody of the present invention, there is known a method for regulating the amount of fucose (hereinafter referred to as “core fucose”), which is linked by the α1,6-bond to the N-acetylglucosamine (GlcNAc) located at the reducing end of N a linked complex type sugar chain that is coupled to asparagine (Asn) at position 297 of the antibody Fc region (WO 2005/035586, WO 2002/31140 and WO 00/61739); a method for regulating the effector activity of a monoclonal antibody by modifying the amino acid group (p) of the Fc region of an antibody; a method for constructing a subclass of an antibody and the like. The effector activity of a humanized anti-Aβ oligomer antibody of the present invention can be controlled using any of the methods.
«Эффекторная активность» означает антителозависимую активность, которая опосредуется Fc-областью антитела. В качестве эффекторной активности известны антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC-активность), комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC-активность), антителозависимый фагоцитоз (ADP-активность), которые осуществляют фагоцитарные клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки и тому подобное."Effector activity" means antibody-dependent activity that is mediated by the Fc region of an antibody. As the effector activity, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity), complement-dependent cytotoxicity (CDC activity), antibody-dependent phagocytosis (ADP activity), which carry out phagocytic cells such as macrophages and dendritic cells and the like, are known.
Регулируя содержание кор фукозы в N-связанной сахарной цепи сложного типа Fc-области антитела, можно повысить или снизить эффекторную активность антитела. Что касается способа снижения содержания фукозы, связанной с N-связанной сахарной цепью сложного типа Fc-области антитела, то можно получить антитело без фукозы, экспрессией антитела с использованием клеток СНО, дефектных по гену, кодирующему α1,6-фукозилтрансферазу. Антитело без фукозы обладает высокой ADCC-активностью.By adjusting the content of cor fucose in the N-linked sugar chain of a complex type of the Fc region of an antibody, the effector activity of the antibody can be increased or decreased. As for the method of reducing the content of fucose associated with the N-linked sugar chain of a complex type of the Fc region of an antibody, it is possible to obtain an antibody without fucose by expressing the antibody using CHO cells defective in the gene encoding α1,6-fucosyl transferase. An antibody without fucose has high ADCC activity.
С другой стороны, согласно способу повышения содержания фукозы, связанной с N-связанной сахарной цепи сложного типа Fc-области антитела, антитело с фукозой, можно получить экспрессией антитела с использованием клеток-хозяев, в которые введен ген, кодирующий α1,6-фукозилтрансферазу. Антитело с фукозой обладает более низкой ADCC-активностью по сравнению с антителом без фукозы.On the other hand, according to a method for increasing the content of fucose bound to the N-linked sugar chain of a complex type of an Fc region of an antibody, an antibody with fucose can be obtained by expression of the antibody using host cells into which a gene encoding α1,6-fucosyl transferase has been introduced. An antibody with fucose has lower ADCC activity than an antibody without fucose.
Кроме того, модификацией аминокислотного остатка(в) в Fc-области антитела можно повысить или снизить ADCC-активность или CDD-активность. Например, CDD-активность антитела можно повысить, используя аминокислотную последовательность Fc-области, описанной в заявке на патент США US2007/0148165. Кроме того, ADCC-активность или CDD-активность можно повысить или снизить модификацией аминокислоты, как описано в патентах США № 6737056, 7297775 или 7317091.In addition, by modifying the amino acid residue (c) in the Fc region of an antibody, it is possible to increase or decrease ADCC activity or CDD activity. For example, the CDD activity of an antibody can be enhanced using the amino acid sequence of the Fc region described in US patent application US2007 / 0148165. In addition, ADCC activity or CDD activity can be increased or decreased by modification of the amino acid, as described in US patent No. 6737056, 7297775 or 7317091.
Кроме того, известно, что среди членов подкласса IgG человека эффекторная функция подклассов IgG2 и IgG4 ниже, чем для подклассов IgG1 и IgG3. Следовательно, можно получить антитело, обладающее более низкой эффекторной функцией, замещением Fc-области на другую, имеющуюся в подклассе антител с более низкой эффекторной функцией.In addition, it is known that among the members of the human IgG subclass, the effector function of the IgG2 and IgG4 subclasses is lower than for the IgG1 and IgG3 subclasses. Therefore, it is possible to obtain an antibody having a lower effector function, replacing the Fc region with another, which is in the subclass of antibodies with a lower effector function.
Что касается стабилизации антитела подклассов IgG2 и IgG4, то можно получить стабильное IgG2 и IgG4 антитело, в котором эффекторная функция контролируется, с использованием способов, описанных в международных заявках WO 2006/075668, WO 2006/035586 и тому подобное.With regard to the stabilization of antibodies of subclasses IgG2 and IgG4, it is possible to obtain a stable IgG2 and IgG4 antibody in which effector function is controlled using the methods described in international applications WO 2006/075668, WO 2006/035586 and the like.
Кроме того, возможно получить антитело, в котором эффекторная активность антитела регулируется с использованием комбинации вышеуказанных способов для одного антитела.In addition, it is possible to obtain an antibody in which the effector activity of an antibody is regulated using a combination of the above methods for a single antibody.
4. Способ лечения с использованием антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению4. The method of treatment using antibodies against Aβ-oligomer of the present invention
Было высказано предположение, что снижение памяти при болезни Альцгеймера возникает за счет дисфункции синапсов, вызванной растворимыми Аβ-олигомерами [Klein W.L., 2001. Trends Neuroscience; Selkoe D.J., 2002, Science]. Следовательно, имеется вероятность того, что избыточное накопление Аβ-олигомеров запускает сложный каскад слева, который и приводит к развитию AD. It has been suggested that memory loss in Alzheimer's disease occurs due to synapse dysfunction caused by soluble Aβ oligomers [Klein W.L., 2001. Trends Neuroscience; Selkoe D.J., 2002, Science]. Therefore, it is likely that excessive accumulation of Aβ oligomers triggers a complex cascade on the left, which leads to the development of AD.
В настоящем изобретении лечение не обязательно оказывает полные терапевтические эффекты или профилактические эффекты на орган или ткань, где имеются симптомы расстройства или заболевания, но оно может быть частью данных эффектов.In the present invention, treatment does not necessarily have complete therapeutic effects or prophylactic effects on an organ or tissue where there are symptoms of a disorder or disease, but it may be part of these effects.
Лечение AD по настоящему изобретению означает устранение по меньшей мере одного симптома, который может появиться в результате AD. Примеры включают устранение или подавление когнитивной дисфункции, устранение или подавление образования сенильных бляшек, устранение или подавление дисфункции синапсов и снижение или подавление аккумуляции Аβ в мозговой ткани, крови или тому подобное.Treatment of AD of the present invention means the elimination of at least one symptom that may result from AD. Examples include the elimination or suppression of cognitive dysfunction, the elimination or suppression of senile plaque formation, the elimination or suppression of synapse dysfunction, and the reduction or suppression of Aβ accumulation in brain tissue, blood, or the like.
В данном случае когнитивная дисфункция включает, например, нарушенную долгосрочную/краткосрочную память, нарушенную память узнавания объекта, нарушенную пространственную память и нарушенную эмоциональную память.In this case, cognitive dysfunction includes, for example, impaired long-term / short-term memory, impaired object recognition memory, impaired spatial memory, and impaired emotional memory.
Кроме того, что касается терапевтического способа с использованием гуманизированного антитела против Аβ-олигомера по настоящему изобретению, то его примеры включают способ подавления когнитивной дисфункции, способ подавления AD, способ подавления прогрессирования AD, способ подавления образования сенильных бляшек, способ подавления аккумуляции Аβ, способ нейтрализации (подавления) нейротоксичности, способ подавления образования Аβ-амилоидных волокон и способ нейтрализации (подавления) токсической активности синапсов. In addition, with regard to the therapeutic method using the humanized anti-Aβ oligomer antibody of the present invention, examples thereof include a method for suppressing cognitive dysfunction, a method for suppressing AD, a method for suppressing the progression of AD, a method for inhibiting the formation of senile plaques, a method for suppressing Aβ accumulation, a method for neutralizing (suppression) of neurotoxicity, a method of suppressing the formation of Aβ-amyloid fibers and a method of neutralizing (suppressing) the toxic activity of synapses.
Кроме того, примеры других конфигураций включают способ по меньшей мере одного из профилактики и лечения когнитивной дисфункции, и способ по меньшей мере одного из профилактики и лечения AD.In addition, examples of other configurations include a method of at least one of the prevention and treatment of cognitive dysfunction, and a method of at least one of the prevention and treatment of AD.
Лекарственное средство, содержащее моноклональное антитело или фрагмент антитела, или его производное, может состоять только из антитела или фрагмента антитела, или его производного в качестве активного ингредиента, и предпочтительно его формулируют в виде фармацевтической композиции, полученной соответствующим способом, хорошо известным в области фармации, смешением его с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями.A medicament containing a monoclonal antibody or antibody fragment or derivative thereof may consist only of an antibody or antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient, and is preferably formulated as a pharmaceutical composition prepared by an appropriate method well known in the art of pharmacy, mixing it with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
Примеры пути введения включают пероральное введение и парентеральное введение, такое как буккальное, трахеальное, ректальное, подкожное, внутримышечное или внутривенное введение.Examples of the route of administration include oral administration and parenteral administration, such as buccal, tracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
Примеры лекарственной формы включают спреи, капсулы, таблетки, порошок, гранулы, сиропы, эмульсии, суппозитории, инъекции, мази, клейкие ленты и тому подобное.Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powder, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, adhesive tapes and the like.
Фармацевтический препарат, подходящий для перорального введения, включает эмульсии, сиропы, капсулы, таблетки, порошки, гранулы и тому подобное.A pharmaceutical preparation suitable for oral administration includes emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
Жидкие препараты, такие как эмульсии и сиропы, можно получить, используя в качестве вспомогательных веществ, воду; сахара, такие как сахароза, сорбит и фруктоза; гликоли, такие как полиэтиленгликоль и пропиленгликоль; масла, такие как кунжутное масло, оливковое масло и соевое масло; антисептики, такие как эфиры п-гидроксибензойной кислоты; вкусовые вещества, такие как вкусовое вещество с ароматом и вкусом земляники и перечной мяты и тому подобное. Liquid preparations, such as emulsions and syrups, can be prepared using water as excipients; sugars such as sucrose, sorbitol and fructose; glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol; oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil; antiseptics such as p-hydroxybenzoic acid esters; flavors such as flavors and aromas of strawberries and peppermint and the like.
Капсулы, таблетки, порошки, гранулы и тому подобное можно приготовить, используя в качестве вспомогательных веществ, наполнители, такие как лактоза, глюкоза, сахароза и маннит; разрыхлители, такие как крахмал и альгинат натрия; смазочные вещества, такие как стеарат магния и тальк; связующие вещества, такие как поливиниловый спирт, гидроксипропилцеллюлоза и желатин; поверхностно-активные вещества, такие как эфиры жирных кислот; пластификаторы, такие как глицерин и тому подобное.Capsules, tablets, powders, granules and the like can be prepared using excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol as excipients; disintegrants such as starch and sodium alginate; lubricants such as magnesium stearate and talc; binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; plasticizers such as glycerin and the like.
Фармацевтический препарат, подходящий для парентерального введения, включает инъекционные препараты, суппозитории, спреи и тому подобное.A pharmaceutical preparation suitable for parenteral administration includes injectable preparations, suppositories, sprays and the like.
Инъекционные препараты можно приготовить, используя носитель, такой как солевой раствор, раствор глюкозы и их смеси.Injectable preparations can be prepared using a carrier such as saline, glucose solution, and mixtures thereof.
Суппозитории можно получить, используя носитель, такой как какао-масло, гидрогенизированный жир или карбоновую кислоту.Suppositories may be prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat, or carboxylic acid.
Спреи можно приготовить, используя антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению как таковые или используя вместе с носителем, который не раздражает слизистые ротовой полости или дыхательных путей пациента и может облегчать всасывание соединения, диспергируя его в виде мелких частиц.Sprays can be prepared using the antibody or antibody fragment of the present invention as such or using a carrier that does not irritate the patient’s mucous membranes or respiratory tract and can facilitate the absorption of the compound by dispersing it in the form of fine particles.
Носитель включает лактозу, глицерин и тому подобное. Можно приготовить фармацевтические препараты, такие как аэрозоли и сухие порошки.The carrier includes lactose, glycerin and the like. Pharmaceutical preparations such as aerosols and dry powders can be prepared.
Кроме того, компоненты, приведенные в качестве примера вспомогательных веществ для препаратов, которые вводят перорально, также можно добавить к препаратам для парентерального введения.In addition, the components shown as an example of adjuvants for drugs that are administered orally, can also be added to drugs for parenteral administration.
Пример 1Example 1
Получение гуманизированного антитела против Аβ-олигомераObtaining a humanized antibody against Aβ-oligomer
(1) Конструирование аминокислотных последовательностей VH и VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4(1) Construction of the amino acid sequences of VH and VL of a humanized anti-Aβ oligomer 6E4 antibody
Аминокислотную последовательность VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 конструировали следующим образом.The amino acid sequence VH of the humanized anti-Aβ oligomer 6E4 antibody was constructed as follows.
Вначале, определяли CDR-последовательность аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:8) в качестве VH в моноклональном антителе мыши против Аβ-олигомера 6Е4, которое получили в ссылочном примере, основываясь на сообщении Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. В результате аминокислотные последовательности CDR 1-3 VH были установлены на последовательностях SEQ ID NO:1-3.Initially, the CDR sequence of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) was determined as VH in a monoclonal mouse antibody against the Aβ oligomer 6E4, which was obtained in the reference example based on a report by Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. As a result, the amino acid sequences of CDR 1-3 VH were established on the sequences of SEQ ID NO: 1-3.
Затем конструировали аминокислотную последовательность гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 следующим образом. Для трансплантации аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:1-3) CDR 1-3 VH выбирали аминокислотную последовательность FR VH в гуманизированном антителе.The amino acid sequence of the humanized anti-Aβ-oligomer 6E4 antibody was then constructed as follows. For transplantation of amino acid sequences (SEQ ID NO: 1-3) CDR 1-3 VH, the amino acid sequence FR VH in a humanized antibody was selected.
Kabat et al. систематизировали VH различных известных антител человека в подгруппы (HSG I-III), основываясь на гомологии их аминокислотных последовательностей, и вывели общие последовательности для каждой из подгрупп [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. Kabat et al. systematized the VH of various known human antibodies into subgroups (HSG I-III) based on the homology of their amino acid sequences, and derived the common sequences for each of the subgroups [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Таким образом, проводили поиск по гомологии аминокислотных последовательностей FR в общих последовательностях подгрупп I-III VH антитела человека и аминокислотных последовательностей FR 6У4VH. В результате поиска гомология HSGI, HSGII и HSGIII составила 75,9; 54,0 и 57,5%, соответственно. Следовательно, аминокислотная последовательность FR 6E4VH имела наиболее высокую гомологию в подгруппе I.Thus, we searched for homology of the amino acid sequences of FR in the general sequences of subgroups I-III VH of human antibodies and amino acid sequences of FR 6Y4VH. As a result of the search, the homology of HSGI, HSGII and HSGIII was 75.9; 54.0 and 57.5%, respectively. Therefore, the amino acid sequence of FR 6E4VH had the highest homology in subgroup I.
Основываясь на этом результате, каждую из аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:1-3) CDR 6E4VH пересаживали в соответствующие положения в аминокислотной последовательности FR общей последовательности подгруппы I VH антитела человека. Таким образом, сконструировали аминокислотную последовательность 6E4VH (SEQ ID NO:12) VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4. Based on this result, each of the amino acid sequences (SEQ ID NO: 1-3) of the CDR 6E4VH was transplanted to the corresponding positions in the amino acid sequence FR of the general sequence of the human antibody subgroup I VH sequence. Thus, the amino acid sequence 6E4VH (SEQ ID NO: 12) VH of the humanized anti-Aβ oligomer 6E4 antibody was constructed.
Затем аналогично, как это выполняли для Н-цепи, определяли последовательности CDR 1-3 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:10) VL в виде аминокислотных последовательностей соответственно SEQ ID NO:4-6 и конструировали аминокислотную последовательность VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4 следующим образом.Then, similarly to the H chain, the CDR 1-3 sequences of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) VL were determined as amino acid sequences, respectively, of SEQ ID NO: 4-6, and the amino acid sequence VL of the humanized anti-Aβ oligomer antibody was constructed 6E4 as follows.
Для трансплантации аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:4-6) CDR 1-3 VL антитела 6Е4 соответственно выбирали аминокислотную последовательность FR VL в антителе человека.For transplantation of amino acid sequences (SEQ ID NO: 4-6) CDR 1-3 VL of antibody 6E4, the amino acid sequence FR VL in a human antibody was respectively selected.
Kabat et al. систематизировали VL различных известных антител человека в подгруппы (HSG I-IV), основываясь на гомологии их аминокислотных последовательностей, и вывели общие последовательности для каждой из подгрупп [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].Kabat et al. systematized the VL of various known human antibodies into subgroups (HSG I-IV) based on the homology of their amino acid sequences, and derived the common sequences for each of the subgroups [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Таким образом, проводили поиск по гомологии аминокислотных последовательностей FR в общих последовательностях подгрупп I-IV VL антитела человека и аминокислотных последовательностей FR 6У4VH. В результате поиска гомология HSGI, HSGII, HSGIII и HSG IV составила 67,5; 86,3; 68,8 и 76,5%, соответственно. Следовательно, аминокислотная последовательность FR 6E4VH имела наиболее высокую гомологию в подгруппе II.Thus, we searched for homology of the amino acid sequences of FR in the general sequences of subgroups I-IV VL of human antibodies and amino acid sequences of FR 6Y4VH. As a result of the search, the homology of HSGI, HSGII, HSGIII and HSG IV was 67.5; 86.3; 68.8 and 76.5%, respectively. Therefore, the amino acid sequence of FR 6E4VH had the highest homology in subgroup II.
Основываясь на этом результате, каждую из аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO:4-6) CDR 6E4VL пересаживали в соответствующие положения в аминокислотной последовательности FR общей последовательности подгруппы II VL антитела человека. Based on this result, each of the amino acid sequences (SEQ ID NO: 4-6) of the CDR 6E4VL was transplanted to the corresponding positions in the amino acid sequence FR of the general sequence of the human antibody subgroup II VL sequence.
Однако Leu в положении 110 аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:10) 6E4VL не является аминокислотным остатком, который используется наиболее часто, но аминокислотный остаток, который используется с относительно более высокой частотой в соответствующих сайтах в аминокислотных последовательностях FR антител человека, приводится в качестве примера Kabat et al.However, Leu at
Следовательно, использовали аминокислотный остаток, наблюдаемый в аминокислотной последовательности вышеприведенного антитела 6Е4. Как описано выше, сконструировали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:14) VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера 6Е4, 6E4LV0.Therefore, the amino acid residue observed in the amino acid sequence of the above 6E4 antibody was used. As described above, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of the VL of the humanized anti-Aβ oligomer 6E4, 6E4LV0 antibody was constructed.
Сконструированные аминокислотная последовательность 6E4LV0 VH и аминокислотная последовательность 6E4LV0 VL в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера 6Е4 представляют последовательности, полученные пересадкой только аминокислотных последовательностей CDR мышиного моноклонального анти-Аβ-олигомер-антитела 6Е4 на аминокислотную последовательность выбранного FR антитела человека.The constructed amino acid sequence 6E4LV0 VH and amino acid sequence 6E4LV0 VL in a humanized anti-Aβ oligomer 6E4 antibody are sequences obtained by transplanting only the CDR amino acid sequences of the murine monoclonal anti-Aβ oligomer 6E4 antibody onto the amino acid sequence of a selected human FR antibody.
Однако в целом при конструировании гуманизированного антитела во многих случаях связывающая активность становится ниже, когда аминокислотные последовательности CDR антитела мыши просто трансплантируют на FR антитела человека.However, in general, when constructing a humanized antibody, in many cases, binding activity becomes lower when the amino acid sequences of mouse CDRs are simply transplanted onto FR human antibodies.
По этой причине для предупреждения снижения связывающей активности проводят модификацию аминокислотных остатков, которые как полагают, оказывают влияние на связывающую активность среди аминокислотных остатков, расположенных в FR антитела человека и отличных от таковых в антителе мыши, вместе с трансплантатом аминокислотных последовательностей CDR.For this reason, to prevent a decrease in binding activity, a modification of amino acid residues is carried out, which is believed to affect the binding activity among amino acid residues located in the FR of a human antibody and different from those in a mouse antibody, together with a transplant of CDR amino acid sequences.
Таким образом, в данном примере идентифицировали аминокислотные остатки FR, которые как полагают, оказывают влияние на связывающую активность, следующим образом.Thus, in this example, the amino acid residues of FR were identified which are thought to influence binding activity, as follows.
Вначале, с помощью компьютерного моделирования строили трехмерную структуру V-области антитела (далее обозначено как «HV0LV0»), содержащую аминокислотную последовательность 6E4HV0 VH и аминокислотную последовательность 6E4LV0 VL в полученном гуманизированном антителе против Аβ-олигомера 6Е4, как описано выше.First, a three-dimensional structure of the antibody V region (hereinafter referred to as “HV0LV0”) was constructed using computer simulation, containing the amino acid sequence 6E4HV0 VH and the amino acid sequence 6E4LV0 VL in the resulting humanized antibody against 6E4 Aβ oligomer as described above.
Определение координат трехмерной структуры и расположение трехмерной структуры проводили с использованием Discovery Studio (Accelrys, Inc.) с инструкциям, прилагаемым к программе. Также строили компьютерную модель трехмерной структуры V-области моноклонального антитела мыши к Аβ-олигомеру 6Е4 аналогичным образом.The coordinates of the three-dimensional structure and the location of the three-dimensional structure were determined using Discovery Studio (Accelrys, Inc.) with the instructions attached to the program. A computer model was also constructed of the three-dimensional structure of the V region of the monoclonal mouse antibody to the β-oligomer 6E4 in a similar manner.
Кроме того, отбирали аминокислотные остатки, которые отличаются от остатков в антителе 6Е4 среди аминокислотных последовательностей FR в VH и VL HV0LV0, получали аминокислотную последовательность 6Е4 с модификацией аминокислотных остатков и аналогично конструировали модель трехмерной структуры.In addition, amino acid residues that differ from the residues in the 6E4 antibody were selected among the FR amino acid sequences in VH and VL HV0LV0, the 6E4 amino acid sequence was obtained with the modification of amino acid residues, and a model of a three-dimensional structure was similarly constructed.
Проводили сравнительный анализ полученных трехмерных структур V-областей в 6Е4, HV0LV0 и модифицированных формах, и идентифицировали аминокислотные остатки, которые как полагали, оказывают влияние на связывающую активность антитела.A comparative analysis of the obtained three-dimensional structures of V-regions in 6E4, HV0LV0 and modified forms was carried out, and amino acid residues that were believed to affect the binding activity of the antibodies were identified.
В результате в качестве аминокислотных остатков, которые как полагают, модифицируют трехмерную структуру антигенсвязывающих сайтов и оказывают влияние на связывающую активность антитела среди аминокислотных остатков FR в HV0LV0, выбрали Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в 6E4HV0 и Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в 6E4LV0 соответственно.As a result, as the amino acid residues, which are believed to modify the three-dimensional structure of antigen-binding sites and affect the binding activity of the antibody among the amino acid residues FR at HV0LV0, Lys at
По меньшей мере, одну аминокислотную последовательность среди данных выбранных аминокислотных остатков модифицировали в аминокислотные остатки, присутствующие в том же сайте в антителе 6Е4, и тем самым конструировали VH и VL гуманизированного антитела, которое содержит аминокислотную последовательность, включающую различные модификации.At least one amino acid sequence among these selected amino acid residues was modified to the amino acid residues present at the same site in antibody 6E4, and thereby the VH and VL of a humanized antibody that contains an amino acid sequence including various modifications were constructed.
Конкретнее, в VH вводили по меньшей мере одну модификацию из аминокислотных модификаций, в которых Lys в положении 12 замещали на Val, Val в положении 20 замещали на Leu, Arg в положении 38 замещали на Lys, Gln в положении 39 замещали на Leu, Leu в положении 45 замещали на Phe, Met в положении 48 замещали на Ile, Arg в положении 67 замещали на Lys, Val в положении 68 замещали на Ala, Ile в положении 70 замещали на Leu, Ala в положении 72 замещали на Val, Thr в положении 74 замещали на Lys и Ala в положении 97 замещали на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.More specifically, at least one amino acid modification was introduced in VH in which Lys at
В дополнении в VL вводили по меньшей мере одну модификацию из аминокислотных модификаций, в которых Ile в положении 2 замещали на Val, Pro в положении 15 замещали на Leu, Gln в положении 50 замещали на Lys и Tyr в положении 92 замещали на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.In addition, at least one amino acid modification was introduced in VL in which Ile at
В качестве V-области гуманизированного анти-Аβ-олигомер- антитела 6Е4, в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток в FR в HV0LV0 модифицирован, конструировали HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV2b, HV0LV2c, HV0LV2d, HV0LV3, HV0LV4, HV2LV0, HV2LV2a, HV2LV2b, HV2LV2c, HV2LV2d, HV2LV3, HV2LV4, HV3LV0, HV3LV2a, HV3LV2b, HV3LV2c, HV3LV2d, HV3LV3, HV3LV4, HV4LV0, HV4LV2a, HV4LV2b, HV4LV2c, HV4LV2d, HV4LV3, HV4LV4, HV5LV0, HV5LV2a, HV5LV2b, HV5LV2c, HV5LV2d, HV5LV3, HV5LV4, HV7aLV0, HV7aLV2a, HV7aLV2b, HV7aLV2c, HV7aLV2d, HV7aLV3, HV7aLV4, HV7bLV0, HV7bLV2a, HV7bLV2b, HV7bLV2c, HV7bLV2d, HV7bLV3, HV7bLV4, HV9LV0, HV9LV2a, HV9LV2b, HV9LV2c, HV9LV2d, HV9LV3, HV9LV4, HV12LV0, HV12LV2a, HV12LV2b, HV12LV2c, HV12LV2d, HV12LV3 и HV12LV4.As the V region of a humanized anti-Aβ oligomer antibody 6E4, in which at least one amino acid residue in FR in HV0LV0 is modified, HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV2b, HV0LV2c, HV0LV2d, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LVV, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2, HV0LV2 HV2LV2c, HV2LV2d, HV2LV3, HV2LV4, HV3LV0, HV3LV2a, HV3LV2b, HV3LV2c, HV3LV2d, HV3LV3, HV3LV4, HV4LV0, HV4LV2a, HV4LV2b, HV4LV2c, HV4LV2d, HV4LV3, HV4LV4, HV5LV0, HV5LV2a, HV5LV2b, HV5LV2c, HV5LV2d, HV5LV3, HV5LV4, HV7aLV0, HV7aLV2a, HV7aLV2b, HV7aLV2c, HV7aLV2d, HV7aLV3, HV7aLV4, HV7bLV0, HV7bLV2a, HV7bLV2b, HV7bLV2c, HV7bLV2d, HV7bLV3, HV7bLV4, HV9LV0, HV9LV2a, HV9LV2b, HV9LV2c, HV9LV2d, HV9LV3, HV9LV4, HV12LV0, HV12LV2a, HV12LV2b, HV12LV2c, HV12LV2d, HV12LV3 and HV12LV4.
На фиг.1 и 2 приведены аминокислотные последовательности вариабельных областей Н-цепи соответственно HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 и HV12 и аминокислотные последовательности вариабельных областей L-цепи соответственно LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV2d, LV3 и LV4.Figures 1 and 2 show the amino acid sequences of the variable regions of the H chain, respectively HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 and HV12 and the amino acid sequences of the variable regions of the L chain, respectively LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV2d, LV3 and LV4.
(2) Получение гуманизированного антитела против Аβ-олигомера(2) Obtaining a humanized antibody against Aβ-oligomer
Конструировали ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области гуманизированного антитела против Аβ-олигомера с кодонами, используемыми в ДНК (SEQ ID NO:7 и 9), кодирующих аминокислотные последовательности 6E4VH и 6E4VL. При модификации аминокислот ДНК конструировали с кодонами, часто используемыми в клетках млекопитающих.A DNA was constructed encoding the amino acid sequence of the variable region of a humanized anti-Aβ oligomer antibody with codons used in DNA (SEQ ID NOs: 7 and 9) encoding the amino acid sequences 6E4VH and 6E4VL. When amino acids were modified, DNA was constructed with codons often used in mammalian cells.
ДНК-последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности 6E4HV0 и 6E4LV0 в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведены соответственно как SEQ ID NO:11 и 13. Кроме того, использовали кодоны в ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности 6E4VH и 6E4VL для конструирования вариабельной области с аминокислотной модификацией.DNA sequences encoding the amino acid sequences 6E4HV0 and 6E4LV0 in a humanized anti-Aβ oligomer antibody are shown as SEQ ID NOS: 11 and 13. In addition, codons in DNA encoding the amino acid sequences 6E4VH and 6E4VL were used to construct the variable region with the amino acid modification .
Используя данные ДНК-последовательности, конструировали вектор экспрессии гуманизированного антитела и экспрессировали гуманизированное антитело.Using these DNA sequences, the expression vector of the humanized antibody was constructed and the humanized antibody was expressed.
(3) Конструирование кДНК, кодирующей VH гуманизированного антитела против Аβ-олигомера (3) Construction of cDNA Encoding VH of a Humanized Antibody Against Aβ Oligomer
Общим химическим синтезом получали кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность 6E4HV0 VH в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведенную как SEQ ID NO:12, которую конструировали, как описано выше на стадии (1), и HV12, приведенную на фиг.1, конструировали, как описано выше на стадии (2).By general chemical synthesis, cDNA was obtained that encodes the amino acid sequence 6E4HV0 VH in a humanized anti-Aβ oligomer antibody, shown as SEQ ID NO: 12, which was constructed as described above in step (1), and the HV12 shown in FIG. 1 was constructed, as described above in step (2).
(4) Конструирование кДНК, кодирующей VL гуманизированного антитела против Аβ-олигомера(4) Construction of a cDNA Encoding a VL of a Humanized Anti-Aβ Oligomer Antibody
Общим химическим синтезом получали кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность 6E4LV0 VL в гуманизированном антителе против Аβ-олигомера, приведенную как SEQ ID NO:14, которую конструировали, как описано выше на стадии (1), и LV2a и LV4, приведенные на фиг.2, конструировали, как описано выше на стадии (2).By general chemical synthesis, cDNA was obtained that encodes the amino acid sequence 6E4LV0 VL in a humanized anti-Aβ oligomer antibody shown as SEQ ID NO: 14, which was constructed as described above in step (1), and LV2a and LV4 shown in FIG. 2, constructed as described above in step (2).
(5) Конструирование векторов экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера(5) Construction of expression vectors of a humanized anti-Aβ oligomer antibody
кДНК, кодирующую 6E4LV0 или HV12 и кДНК, кодирующую одно из 6E4LV0, LV2a и LV4, полученные выше на стадиях (3) и (4), вставляли в соответствующие положения в вектор экспрессии гуманизированного антитела pKANTEX93, раскрытый в международной заявке WO 97/10354, для конструирования различных векторов экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера.cDNA encoding 6E4LV0 or HV12 and cDNA encoding one of 6E4LV0, LV2a and LV4 obtained above in steps (3) and (4) were inserted into the corresponding positions in the expression vector of the humanized antibody pKANTEX93 disclosed in international application WO 97/10354, for constructing various expression vectors of a humanized anti-Aβ oligomer antibody.
(6) Экспрессия гуманизированного антитела против Аβ-олигомера с использованием животных клеток (6) Expression of a humanized anti-Aβ oligomer antibody using animal cells
Экспрессию гуманизированного антитела против Аβ-олигомера проводили в животных клетках с использованием обычного способа [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)], используя векторы экспрессии гуманизированного антитела против Аβ-олигомера, полученные выше на стадии (5), с получением трансформанта для продукции гуманизированного антитела против Аβ-олигомера (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4).The expression of a humanized anti-Aβ oligomer antibody was performed in animal cells using a conventional method [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)] using the expression vectors of a humanized anti-Aβ oligomer antibody obtained in step (5) above to obtain a transformant for the production of a humanized anti-Aβ oligomer antibody (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4).
В качестве линии клеток животных использовали клеточную линию CHO/DG44, полученную двойным нокаутом гена α1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) (далее обозначено как «клетки СНО с нокаутом FUT8»). Известно, что фукозу не добавляли к кор- части N-связанной сахарной цепи сложного типа антитела, экспрессированного с данным штаммом клеток-хозяев (WO 2002/31140).The CHO / DG44 cell line obtained by double knockout of the α1,6-fucosyltransferase gene (FUT8) (hereinafter referred to as “CHO cells with FUT8 knockout”) was used as the animal cell line. It is known that fucose was not added to the core of the N-linked sugar chain of a complex type of antibody expressed with this strain of host cells (WO 2002/31140).
(7) Получение очищенного гуманизированного антитела против Аβ-олигомера(7) Obtaining purified humanized antibodies against Aβ-oligomer
После культивирования трансформанта, полученного на стадии (6) с использованием обычного метода культивирования, собирали клеточную суспензию. Затем проводили центрифугирование в течение 20 мин при 3000 об/мин при 4°С. После сбора культуральный супернатант стерилизовали пропусканием через фильтр Millex GV с размером пор 0,22 мкм.After culturing the transformant obtained in step (6) using a conventional cultivation method, a cell suspension was collected. Then centrifugation was carried out for 20 min at 3000 rpm at 4 ° C. After harvesting, the culture supernatant was sterilized by passing through a Millex GV filter with a pore size of 0.22 μm.
После нанесения 0,5 мл Prosep vA High Capacity (производства Millipore Corporation) на колонку с диаметром 0,8 см, последовательно пропускали 5,0 мл очищенной воды и 5,0 мл буфера PBS (рН 7,4) для уравновешивания носителя.After applying 0.5 ml of Prosep vA High Capacity (manufactured by Millipore Corporation) to a 0.8 cm diameter column, 5.0 ml of purified water and 5.0 ml of PBS buffer (pH 7.4) were sequentially passed to balance the support.
Затем после пропускания культурального супернатанта колонку промывали 5,0 мл буфера PBS (рН 7,4). После промывания антитело, адсорбированное на носителе, элюировали 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 5,0), 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,5) и 2,0 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) в указанном порядке.Then, after passing the culture supernatant, the column was washed with 5.0 ml PBS buffer (pH 7.4). After washing, the antibody adsorbed on the support was eluted with 2.0 ml of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 5.0), 2.0 ml of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.5), and 2.0 ml of 0.1 mol / L citrate buffer (pH 3.0) in that order.
Элюирование давало 500 мкл в 4 фракциях. Затем проводили SDS-PAGE с данными полученными очищенными фракциями. Собирали фракции, в которых детектировали белок-мишень, и диализовали в течение целого дня и ночи при 4°С с использованием 150 ммоль/л NaCl и 10 ммоль/л цитрата Na (рН 6,0).Elution gave 500 μl in 4 fractions. Then, SDS-PAGE was performed with the obtained purified fractions. The fractions in which the target protein was detected were collected and dialyzed over the whole day and night at 4 ° C. using 150 mmol / L NaCl and 10 mmol / L Na citrate (pH 6.0).
После диализа собирали раствор гуманизированного антитела против Аβ-олигомера и подвергали стерилизации пропусканием через фильтр Millex GV (Millipore Corporation) с размером пор 0,22 мкм. Определяли поглощение при 280 нм (OD280 нм) с использованием прибора, измеряющего поглощение (SHIMADZU UV-1700) для расчета плотности соответствующих очищенных гуманизированных антител против Аβ-олигомера.After dialysis, a solution of a humanized anti-Aβ oligomer antibody was collected and sterilized by passing through a Millex GV filter (Millipore Corporation) with a pore size of 0.22 μm. Absorbance was determined at 280 nm (OD280 nm) using an absorption measuring instrument (SHIMADZU UV-1700) to calculate the density of the corresponding purified humanized antibodies against the Aβ oligomer.
В результате получали 4 типа гуманизированных антител против Аβ-олигомера, соответственно включающих HV0LV0, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и 6E4LV0 в качестве VL антитела, HV0LV2a, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и LV2 в качестве VL антитела, HV0LV4, содержащего 6E4HV0 в качестве VH и LV4 в качестве VL антитела и HV12LV4, содержащего HV12 в качестве VH и LV4 в качестве VL антитела.As a result, 4 types of humanized antibodies against the Aβ oligomer were obtained, respectively comprising HV0LV0 containing 6E4HV0 as VH and 6E4LV0 as VL antibodies, HV0LV2a containing 6E4HV0 as VH and LV2 as VL antibodies, HV0LV4 containing VEHE6 LV4 as a VL antibody and HV12LV4 containing HV12 as VH and LV4 as a VL antibody.
Пример 2Example 2
Получение антигенаAntigen Production
(1) Получение Аβ-олигомеров(1) Preparation of Aβ Oligomers
β-Амилоидный белок, человеческий 1-42 пептид (производства Peptide Institute, Inc.) растворяли в 1 ммоль/л гексафторизопропанола. После обработки ультразвуком в течение 10 мин полученный раствор высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение ночи.The β-amyloid protein, a human 1-42 peptide (manufactured by Peptide Institute, Inc.) was dissolved in 1 mmol / L hexafluoroisopropanol. After sonication for 10 min, the resulting solution was dried in air at room temperature overnight.
Затем добавляли 4 мкл диметилсульфоксида и в течение 3 мин обрабатывали ультразвуком. В полученный раствор добавляли 200 мкл уксусной кислоты (рН 4,5) и полученное вещество хранили в течение ночи стационарно при 4°С с получением Аβ-олигомеров.Then, 4 μl of dimethyl sulfoxide was added and sonicated for 3 minutes. 200 μl of acetic acid (pH 4.5) was added to the resulting solution, and the obtained substance was stored overnight stationary at 4 ° C to obtain Aβ-oligomers.
(2) Получение Аβ-мономеров(2) Preparation of Aβ Monomers
Биотин-бета-амилоид, человеческий 1-40 (производства AnaSpec, Inc.) растворяли в 250 мкмоль/л с использованием 0,1% аммиачной воды. После обработки полученного раствора ультразвуком в течение 5 мин, полученный продукт центрифугировали при 16000 об/мин и 4°С в течение 60 мин. Таким образом, собрав супернатант, получали Аβ-мономеры.Human Biotin Beta-Amyloid 1-40 (manufactured by AnaSpec, Inc.) was dissolved in 250 μmol / L using 0.1% ammonia water. After treating the resulting solution with ultrasound for 5 minutes, the resulting product was centrifuged at 16,000 rpm and 4 ° C for 60 minutes. Thus, by collecting the supernatant, Aβ monomers were obtained.
Пример 3Example 3
Оценка активности гуманизированного антитела против Аβ-олигомераEvaluation of the activity of a humanized antibody against Aβ oligomer
(1) Оценка связывающей активности гуманизированного анти-Аβ-олигомер-антитела для Аβ-олигомеров с использованием Biacore(1) Evaluation of the binding activity of a humanized anti-Aβ oligomer antibody for Aβ oligomers using Biacore
Для анализа связывающей активности каждого из гуманизированных антител к Аβ-олигомеру (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) для Аβ-олигомеров по химической кинетике, связывающую активность определяли с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса (метод SPR).To analyze the binding activity of each of the humanized antibodies to the Aβ oligomer (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4) for Aβ oligomers by chemical kinetics, the binding activity was determined using the surface plasmon resonance method (SPR method).
Все последующие операции проводили с использованием системы Biacore T100 (производства GE Healthcare Bio-sciences). Аβ-олигомеры, полученные на стадии (1) в примере 2, иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare Bio-sciences), используя реакцию сочетания аминов.All subsequent operations were performed using the Biacore T100 system (manufactured by GE Healthcare Bio-sciences). The β oligomers obtained in step (1) in Example 2 were immobilized on a CM5 sensor chip (GE Healthcare Bio-sciences) using an amine coupling reaction.
В чип с иммобилизованнами Аβ-олигомерами вводили пробы с 8 уровнями плотности, полученными последовательным разведением от 30 мкг/мл каждый раз в два раза (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4), и анализировали, начиная от самой низкой плотности, основываясь на автоматической программе по мультикинетике.Samples with 8 density levels obtained by serial dilution from 30 μg / ml every two times (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4) were injected into a chip with immobilized Aβ oligomers and analyzed from the lowest density based on an automatic program on multikinetics.
С использованием программного обеспечения, присоединенного к устройству, Biacore T100 Evaluation (производства GE Healthcare Bio-sciences), проводили анализ с модулем Bivalent Analyte для расчета константы скорости ассоциации ka, константы скорости диссоциации kd1 и константы диссоциации KD (kd1/kd1) для каждого антитела для Аβ-олигомеров.Using software attached to the device, Biacore T100 Evaluation (manufactured by GE Healthcare Bio-sciences), an analysis was performed with the Bivalent Analyte module to calculate the association rate constant ka, the dissociation rate constant kd1, and the dissociation constant KD (kd1 / kd1) for each antibody for Aβ oligomers.
Значения полученных таким образом константы скорости ассоциации ka1, константы скорости диссоциации kd1 и константы диссоциации KD (ka1/kd1) для каждого из антител приведены соответственно в таблице 1.The values of the association rate constant ka1 thus obtained, the dissociation rate constant kd1, and the dissociation constant KD (ka1 / kd1) for each antibody are shown in Table 1, respectively.
Как показано в таблице 1, все гуманизированные антитела против Аβ-олигомера (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) проявляли способность к связыванию с Аβ-олигомерами с аффинностью в пределах от 3×19-7 до 4×10-8 моль/л.As shown in table 1, all humanized antibodies against the Aβ oligomer (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4) showed the ability to bind to Aβ oligomers with affinities ranging from 3 × 19 -7 to 4 × 10 -8 mol / L.
(2) Оценка связывающей активности гуманизированного анти-Аβ-олигомер-антитела для Аβ-мономеров с использованием Biacore(2) Evaluation of the binding activity of a humanized anti-Aβ oligomer antibody for Aβ monomers using Biacore
Для анализа связывающей активности соответствующих гуманизированных антител к Аβ-олигомеру (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) для Аβ-мономеров связывающую активность определяли, как описано на стадии (1) в данном примере.To analyze the binding activity of the corresponding humanized antibodies to the β-oligomer (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4) for the β-monomers, the binding activity was determined as described in step (1) in this example.
Аβ-мономеры, полученные на стадии (2) в примере 2, иммобилизовали на сенсорном чипе SA (производства GE Healthcare Bio-sciences), используя реакцию захвата биотина. В чип с иммобилизованнами Аβ-мономерами вводили пробы с 5 уровнями плотности, полученными последовательным разведением от 30 мкг/мл каждый раз в два раза (6Е10, HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4), и анализировали, начиная от самой низкой плотности, основываясь на автоматической программе по мультикинетике. Сенсограммы приведены на фиг.3.The β monomers obtained in step (2) in Example 2 were immobilized on a SA sensor chip (manufactured by GE Healthcare Bio-sciences) using a biotin capture reaction. Samples with 5 density levels were obtained in a chip with immobilized Aβ monomers, obtained by serial dilution from 30 μg / ml every two times (6E10, HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4), and analyzed starting from the lowest density based on automatic program on multikinetics. Sensograms are shown in figure 3.
Как свидетельствуют данные фиг.3, было установлено, что все 4 вида гуманизированных антител против Аβ-олигомеров (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 и HV12LV4) не проявляли связывающей активности для Аβ-мономеров.As evidenced by the data of FIG. 3, it was found that all 4 types of humanized antibodies against Aβ oligomers (HV0LV0, HV0LV2a, HV0LV4 and HV12LV4) did not exhibit binding activity for Aβ monomers.
Ссылочный примерReference example
1. Получение антигена1. Antigen production
Синтезировали Аβ1-40-пептид для получения соединения, в котором флуоресцентный изотиоцианат 6-карбокситетраметилродамина (6-TAMRA) (SIGMA) химически соединяли с его N-концом. Проводили полимеризацию Аβ1-40-пептида (Peptide Institute, Inc.) и тем самым получали препарат (Аβ1-40-олигомеры), содержащий большое количество олигомеров.Aβ1-40 peptide was synthesized to obtain a compound in which the fluorescent 6-carboxetetramethylrodamine (6-TAMRA) fluorescent isothiocyanate (SIGMA) was chemically coupled to its N-terminus. The Aβ1-40 peptide was polymerized (Peptide Institute, Inc.), and thereby a preparation (Aβ1-40 oligomers) containing a large amount of oligomers was obtained.
2. Получение гибридомы, продуцирующей антитело2. Obtaining a hybridoma producing an antibody
Мышей Balb-c иммунизировали антигеном, полученным, как описано выше, в подушечку лапы, и затем проводили еще шесть дополнительных иммунизаций. Гибридому получали слиянием клеток Sp2/0-Ag14 с использованием паховых лимфатических узлов с использованием полиэтиленгликоля 1500.Balb-c mice were immunized with the antigen obtained as described above in the paw pad, and then six additional immunizations were performed. The hybridoma was obtained by fusion of Sp2 / 0-Ag14 cells using inguinal lymph nodes using polyethylene glycol 1500.
3. Дот-блоттинг3. Dot blotting
Первоначальный скрининг проводили дот-блоттингом, в котором 2,5 мкл Аβ1-42 (2,5 мкг/дот), который предварительно инкубировали в течение 18 ч, иммобилизовали на нитроцеллюлозной мембране. После блокирования неспецифического связывания на мембране раствором фосфатного буфера, содержащим 5% обезжиренного молока, 1% BSA и 0,05% твина-20, сайт неспецифического связывания инкубировали с культуральным супернатантом. Initial screening was performed by dot blotting, in which 2.5 μl of Aβ1-42 (2.5 μg / dot), which had been preincubated for 18 hours, was immobilized on a nitrocellulose membrane. After blocking non-specific binding on the membrane with a phosphate buffer solution containing 5% skim milk, 1% BSA and 0.05% tween-20, the non-specific binding site was incubated with the culture supernatant.
Антитело, связанное с Aβ-олигомером из культурального супернатанта, детектировали с помощью меченного пероксидазой из хрена овечьего антимышиного F(ab')2 (1:3000; Amersham) и визуализировали с использованием набора для активированной хемилюминесценции (ECL) и LAS3000mini (Fujitsu, Токио, Япония) (WO 2009/051220). С помощью такой процедуры устанавливали моноклональное антитело мыши против Аβ-олигомеров 6Е4.The antibody bound to the Aβ oligomer from the culture supernatant was detected using horseradish peroxidase-labeled anti-mouse sheep F (ab ') 2 (1: 3000; Amersham) and visualized using activated chemiluminescence kit (ECL) and LAS3000mini (Fujitsu, Tokyo , Japan) (WO 2009/051220). Using this procedure, a mouse monoclonal antibody was established against 6E4 Aβ oligomers.
Приведенный выше ссылочный пример описан в PCT/JP 2009/52039 (WO 2009/099176).The above reference example is described in PCT / JP 2009/52039 (WO 2009/099176).
Несмотря на то, что изобретение описано подробно и при обращении к конкретным примерам, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что можно сделать различные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема изобретения. Данная заявка основана на предварительной заявке, поданной 7 августа 2009 (№ 61/232038), полное содержание которой включено в данный документ для сведения и все источники, цитированные в данном документе, включены в полном объеме.Despite the fact that the invention is described in detail and when referring to specific examples, it will be understood by those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. This application is based on a provisional application filed on August 7, 2009 (No. 61/232038), the full contents of which are included in this document for information and all sources cited in this document are included in full.
Свободный текст в списке последовательностей: Free text in the sequence list:
SEQ ID NO:1 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR1SEQ ID NO: 1 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of HCDR1
SEQ ID NO:2 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR2SEQ ID NO: 2 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of HCDR2
SEQ ID NO:3 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность HCDR3SEQ ID NO: 3 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of HCDR3
SEQ ID NO:4 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR1SEQ ID NO: 4 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence LCDR1
SEQ ID NO:5 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR2SEQ ID NO: 5 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence LCDR2
SEQ ID NO:6 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность LCDR3SEQ ID NO: 6 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence LCDR3
SEQ ID NO:11 - Описание искусственной последовательности; ДНК-последовательность, кодирующая 6E4HV0SEQ ID NO: 11 — Description of Artificial sequence; DNA sequence encoding 6E4HV0
SEQ ID NO:12 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области 6E4HV0SEQ ID NO: 12 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of the variable region 6E4HV0
SEQ ID NO:13 - Описание искусственной последовательности; ДНК-последовательность, кодирующая вариабельную область 6E4LV0SEQ ID NO: 13 — Description of Artificial sequence; DNA sequence encoding the variable region 6E4LV0
SEQ ID NO:14 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области 6E4HV0SEQ ID NO: 14 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of the variable region 6E4HV0
SEQ ID NO:15 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области HV12SEQ ID NO: 15 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of the variable region of HV12
SEQ ID NO:16 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области LV2aSEQ ID NO: 16 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of the variable region of LV2a
SEQ ID NO:17 - Описание искусственной последовательности; аминокислотная последовательность вариабельной области LV4.SEQ ID NO: 17 — Description of Artificial sequence; amino acid sequence of the variable region of LV4.
Claims (9)
(a) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
(b) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(c) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; и
(d) антитела, имеющего
вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;1. Humanitariannet antibody that does not bind to the monomer of β-amyloid protein and binds to the oligomer of β-amyloid protein, where the antibody is selected from the group consisting of:
(a) an antibody having
an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and
the variable region of the light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
(b) an antibody having
an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and
the variable region of the light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
(c) an antibody having
an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, and
the variable region of the light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and
(d) an antibody having
an antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and
the variable region of the light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17;
культивирование трансформанта в среде с образованием и накоплением указанного гуманизированного антитела в культуре, и
сбор указанного гуманизированного антитела из культуры,
где трансформант содержит рекомбинантный вектор, содержащий ДНК, кодирующую указанное гуманизированное антитело, в клетке-хозяине. 9. A method of obtaining a humanized antibody according to claim 1, including
culturing the transformant in the medium with the formation and accumulation of the specified humanized antibodies in culture, and
collecting the specified humanized antibodies from the culture,
where the transformant contains a recombinant vector containing DNA encoding the specified humanized antibody in the host cell.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23203809P | 2009-08-07 | 2009-08-07 | |
| US61/232038 | 2009-08-07 | ||
| PCT/JP2010/063430 WO2011016567A1 (en) | 2009-08-07 | 2010-08-06 | Humanized anti-amyloid-β oligomer antibody |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012108610A RU2012108610A (en) | 2013-09-20 |
| RU2575095C2 true RU2575095C2 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783528C1 (en) * | 2019-02-01 | 2022-11-14 | Чанчунь Джинсайенс Фармасьютикал Ко., Лтд. | HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST Aβ AND ITS USE |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006055178A2 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-26 | Merck & Co., Inc. | Anti-addl antibodies and uses thereof |
| RU2341533C2 (en) * | 2002-02-20 | 2008-12-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Aβ-PEPTIDE ANTIBODIES AND APPLICATION THEREOF |
| WO2009051220A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Immunas Pharma, Inc. | Antibody capable of specifically binding to aβ oligomer, and use thereof |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2341533C2 (en) * | 2002-02-20 | 2008-12-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Aβ-PEPTIDE ANTIBODIES AND APPLICATION THEREOF |
| WO2006055178A2 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-26 | Merck & Co., Inc. | Anti-addl antibodies and uses thereof |
| US20080175835A1 (en) * | 2004-10-25 | 2008-07-24 | Merck & Co., Inc. | Anti-Addl Antibodies and Uses Thereof |
| WO2009051220A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-23 | Immunas Pharma, Inc. | Antibody capable of specifically binding to aβ oligomer, and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TSIGELNY et al., "Mechanisms of hybrid oligomer formation in the pathogenesis of combined Alzheimer's and Parkinson's diseases", PLoS ONE, v.3, 9, 2008, doi:10.1371/journal.pone.0003135. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2783528C1 (en) * | 2019-02-01 | 2022-11-14 | Чанчунь Джинсайенс Фармасьютикал Ко., Лтд. | HUMANIZED MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST Aβ AND ITS USE |
| RU2816371C2 (en) * | 2019-07-01 | 2024-03-28 | Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. | EphA4 ANTIBODY |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9181332B2 (en) | Anti-A(β) oligomer humanized antibody | |
| JP6022441B2 (en) | Anti-C5a antibodies and methods for use of the antibodies | |
| RU2760875C1 (en) | Antibodies specific to hyperphosphorylated tau-protein and their application methods | |
| AU2008334637B2 (en) | Antigen binding proteins | |
| US8303954B2 (en) | Anti-Aβ oligomer humanized antibody | |
| BR112018004296B1 (en) | humanized anti-cd40 antibodies and their uses | |
| WO2014055967A2 (en) | Compositions and methods for treating diseases of protein aggregation involving ic3b deposition | |
| TW202304974A (en) | Anti-tau antibodies and uses thereof | |
| RU2575095C2 (en) | Anti-beta-amyloid oligomer humanised antibody | |
| CN114945385A (en) | Preventive or therapeutic agent for dementia |