RU2420581C1 - Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity - Google Patents
Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420581C1 RU2420581C1 RU2010102872/10A RU2010102872A RU2420581C1 RU 2420581 C1 RU2420581 C1 RU 2420581C1 RU 2010102872/10 A RU2010102872/10 A RU 2010102872/10A RU 2010102872 A RU2010102872 A RU 2010102872A RU 2420581 C1 RU2420581 C1 RU 2420581C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- cells
- activity
- enzyme
- dry
- Prior art date
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
Заявляемое изобретение относится к получению гетерогенных биокатализаторов (БК) на основе бактериальных клеток, а именно биокатализатора на основе клеток Esherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот.The claimed invention relates to the production of heterogeneous biocatalysts (CD) based on bacterial cells, namely, a biocatalyst based on Esherichia coli cells having activity in relation to the synthesis of cephalosporins acids.
Известен способ иммобилизации клеток E.coli, обладающих пенициллинацилазной активностью, состоящий во включении сшитых глутаровым альдегидом клеток со специально повышенной проницаемостью клеточных стенок в пористые сферические шарики полиакриламидного геля [1]. При получении шариков геля полимеризацию инициируют окислительно-восстановительной парой, в которой катализатором процесса служит N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, а инициатором - персульфат аммония [2]. Получают биокатализатор, предназначенный для ферментативного гидролитического расщепления бензилпенициллина (БП) с целью производства 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Его ферментативная активность по гидролизу БП очень низка - менее 8 МЕ/г1 (1 За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту).There is a method of immobilization of E. coli cells with penicillin acylase activity, which consists in incorporating stitched with glutaraldehyde cells with specially increased permeability of cell walls into porous spherical balls of polyacrylamide gel [1]. Upon receipt of the gel beads, polymerization is initiated by a redox pair in which N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine serves as a catalyst, and ammonium persulfate is the initiator [2]. Get biocatalyst intended for enzymatic hydrolytic cleavage of benzylpenicillin (BP) with the aim of producing 6-aminopenicillanic acid (6-APC). Its enzymatic activity for BP hydrolysis is very low - less than 8 IU / g 1 ( 1 The international unit (ME) of the enzymatic activity of the drug in relation to any biocatalytic transformation is taken as an amount of this drug that catalyzes the conversion of 1 μmol of substrate (or the formation of 1 μmol product) in the selected conditions for 1 minute).
Известен способ иммобилизации микробных клеток, в том числе клеток E.coli, путем их ковалентного присоединения к активным группам сшитых полимеров (гелей), получаемых путем сополимеризации различных мономеров, в основном акрилатной природы [3]. При этом клетки приводят в контакт либо с уже готовым полимером, либо с мономерами, которые затем подвергают полимеризации. До контакта с полимером или мономерами клетки могут быть обработаны полифункциональным сшивающим агентом, в том числе глутаровым альдегидом. Полимеризацию мономеров инициируют парой бета-диметиламинопропионитрил - персульфат аммония. Данный патент не содержит примеров получения биокатализатора на основе клеток E.coli, однако описаны способы иммобилизации клеток Proteus rettgeri, содержащих пенициллинацилазу, с целью получения биокатализаторов для получения 6-АПК ферментативным гидролизом БП. Даже лучший из описанных биокатализаторов обладает очень низкой операционной стабильностью, характеризующейся двукратным падением активности за 20 циклов использования в процессе гидролиза БП, что соответствует 60 часам.A known method of immobilization of microbial cells, including E. coli cells, by covalently joining them to active groups of crosslinked polymers (gels) obtained by copolymerization of various monomers, mainly acrylate nature [3]. In this case, the cells are brought into contact with either the finished polymer or with monomers, which are then polymerized. Before contact with the polymer or monomers, the cells can be treated with a polyfunctional crosslinking agent, including glutaraldehyde. The polymerization of monomers is initiated by a pair of beta-dimethylaminopropionitrile - ammonium persulfate. This patent does not contain examples of the preparation of a biocatalyst based on E. coli cells, however, methods are described for immobilizing Proteus rettgeri cells containing penicillin acylase in order to obtain biocatalysts for the production of 6-APC by enzymatic hydrolysis of BP. Even the best of the described biocatalysts has a very low operational stability, characterized by a twofold drop in activity during 20 cycles of use in the process of BP hydrolysis, which corresponds to 60 hours.
Наиболее близким к заявляемому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованных клеток E.coli является способ получения биокатализатора для гидролитического расщепления БП, осуществляемый путем включения в полиакриламидный гель клеток E.coli, содержащих пенициллинамидазу (пенициллинамидогидролазу) [4]. Согласно ближайшему аналогу процедура получения биокатализатора состоит в следующем. Глубинное культивирование штамма E.coli АТСС 9637 осуществляют при 30°C на среде, содержащей органические источники углерода и азота, а также неорганические соли. Процесс биосинтеза проводят в течение 24 часов; использование каких-либо специальных критериев для выбора момента остановки биосинтеза не описано. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля (акриламид и N,N'-метиленбисакриламид) и проводят процесс гелеобразования, добавляя в реакционную смесь катализатор полимеризации (бета-диметиламинопропионитрил) и ее инициатор (персульфат калия). Биомассу клеток используют в количестве, необходимом для создания ее концентрации в полимеризационной смеси (п.см) СБМК=33 мг сух./г п.см. Полученный гель измельчают и промывают.Closest to the claimed method for producing a biocatalyst based on immobilized E. coli cells is a method for producing a biocatalyst for hydrolytic cleavage of BP, carried out by incorporating E. coli cells containing penicillin amidase (penicillin amidohydrolase) into the polyacrylamide gel [4]. According to the closest analogue, the procedure for obtaining a biocatalyst is as follows. The deep cultivation of E. coli strain ATCC 9637 is carried out at 30 ° C in a medium containing organic sources of carbon and nitrogen, as well as inorganic salts. The biosynthesis process is carried out within 24 hours; the use of any special criteria for choosing the moment of stopping biosynthesis is not described. The grown biomass of the cells is suspended in a solution of polyacrylamide gel monomers (acrylamide and N, N'-methylenebisacrylamide) and the gelation process is carried out by adding a polymerization catalyst (beta-dimethylaminopropionitrile) and its initiator (potassium persulfate) to the reaction mixture. The biomass of cells is used in the amount necessary to create its concentration in the polymerization mixture (p.cm) With BMK = 33 mg dry / g p.s. The resulting gel is ground and washed.
Основными недостатками способа согласно ближайшему аналогу являются отсутствие ковалентной фиксации клеток при иммобилизации, влекущее за собой возможность загрязнения целевого продукта ферментативной трансформации примесями органической природы, в первую очередь белками, вымываемыми из биокатализатора, а также низкая активность иммобилизованных по этому способу клеток. Так, биокатализатор, получаемый согласно ближайшему аналогу, в отношении гидролиза БП имеет активность лишь 22 МЕ/г; его активность в отношении синтеза бета-лактамных антибиотиков, в частности в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, не контролировалась.The main disadvantages of the method according to the closest analogue are the lack of covalent fixation of cells during immobilization, which entails the possibility of contamination of the target product of enzymatic transformation with impurities of an organic nature, primarily proteins washed from the biocatalyst, as well as low activity of cells immobilized by this method. So, the biocatalyst obtained according to the closest analogue with respect to the hydrolysis of BP has an activity of only 22 IU / g; its activity with respect to the synthesis of beta-lactam antibiotics, in particular with respect to the synthesis of cephalosporins, was not controlled.
Воспроизведение способа иммобилизации клеток согласно ближайшему аналогу (Пример 3) с использованием штамма E.coli VKPM В-10182, продуцирующего синтетазу цефалоспоринов-кислот, позволило получить биокатализатор, обладающий активностью по синтезу цефазолина около 40 МЕ/г влажн. (300 МЕ/г сух.) при выходе активности процесса иммобилизации 50%. Низкая активность такого биокатализатора не позволяет использовать его для синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторе периодического действия с перемешиванием. Так, для процесса синтеза цефазолина в таком реакторе необходим биокатализатор с активностью не ниже 60 МЕ/г влажн., 330 МЕ/г сух. Стабильность биокатализатора, полученного согласно прототипу, тоже низка. В условиях ускоренной инактивации (40°C, рН 6,5) период его полуинактивации составляет всего 20 часов, что является результатом не только термической инактивации фермента, но и его физического вымывания из гелевой матрицы. Потери синтетазной активности при однократной промывке биокатализатора 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 в мягких условиях (1 г влажного БК в 3 мл буфера, 20°C, 1 час) составляют около 30%. Наблюдается вымывание белка в надосадочную жидкость в количестве 5 мг с 1 г БК. Неизбежное загрязнение целевого продукта процесса биокаталитической трансформации веществами белковой природы делает невозможным использование такого биокатализатора для производства антибиотиков.Reproduction of the method of cell immobilization according to the closest analogue (Example 3) using the E. coli strain VKPM B-10182 producing cephalosporin acid synthetase made it possible to obtain a biocatalyst having a cefazolin synthesis activity of about 40 IU / g wet. (300 IU / g dry) when the activity of the immobilization process is 50%. The low activity of such a biocatalyst does not allow its use for the synthesis of cephalosporins acids in a batch reactor with stirring. So, for the synthesis process of cefazolin in such a reactor, a biocatalyst with an activity of at least 60 IU / g wet., 330 IU / g dry. The stability of the biocatalyst obtained according to the prototype is also low. Under conditions of accelerated inactivation (40 ° C, pH 6.5), the half-inactivation period is only 20 hours, which is the result of not only the thermal inactivation of the enzyme, but also its physical leaching from the gel matrix. Loss of synthetase activity during a single washing of the biocatalyst with 0.1 M phosphate buffer with a pH of 7.5 under mild conditions (1 g of wet BC in 3 ml of buffer, 20 ° C, 1 hour) is about 30%. Protein leaching into the supernatant in an amount of 5 mg with 1 g of CD is observed. The inevitable contamination of the target product of the biocatalytic transformation process with substances of protein nature makes it impossible to use such a biocatalyst for the production of antibiotics.
Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа получения биокатализатора на основе клеток Escherichia coli, иммобилизованных в полиакриламидном геле, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, характеризующегося высокими активностью и стабильностью и не содержащего слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.The objective of the invention is to develop a method for producing a biocatalyst based on Escherichia coli cells immobilized in a polyacrylamide gel, which is active in the synthesis of cephalosporin acids, characterized by high activity and stability and does not contain weakly bound proteins that can contaminate the target product of biocatalytic transformation.
Поставленную задачу решают путем совокупного использования в процессе получения биокатализатора ряда приемов, осуществляемых в выбранных оптимизированных условиях.The problem is solved by the combined use in the process of obtaining a biocatalyst of a number of techniques carried out in the selected optimized conditions.
Согласно заявляемому способу исходным материалом для получения биокатализатора служит штамм E.coli, продуцирующий фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот. Культивирование данного продуцента осуществляют на жидкой ферментационной среде, содержащей органические источники углерода и азота. В качестве критерия остановки процесса используют константу распределения целевого фермента между биомассой клеток (БМК) и внешним раствором Красп, характеризующую прочность связывания фермента с клеточными структурами. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля, модифицируют глутаровым альдегидом, а затем добавляют инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты. Внесение в реакционную смесь катализатора полимеризации не требуется. Полученный гель измельчают и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ (белки, мономеры).According to the claimed method, the starting material for the preparation of the biocatalyst is E. coli strain producing the enzyme cephalosporin acid synthetase. The cultivation of this producer is carried out on a liquid fermentation medium containing organic sources of carbon and nitrogen. As a criterion for stopping the process, the distribution constant of the target enzyme between the cell biomass (BMC) and the external solution K ras , which characterizes the binding strength of the enzyme to the cell structures, is used. The grown cell biomass is suspended in a solution of polyacrylamide gel monomers, modified with glutaraldehyde, and then the polymerization initiator, a salt of sulfuric acid, is added. The introduction of a polymerization catalyst into the reaction mixture is not required. The resulting gel is ground and washed from substances that are not bound during the polymerization process (proteins, monomers).
Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот останавливают в фазе стационарного роста клеток E.coli при константе распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот Красп≥350 и значении рН культуральной жидкости 7,9÷8,2. Временные рамки наступления выбранного оптимального для иммобилизации состояния клеток могут сдвигаться в зависимости от используемого штамма E.coli, что влияет на продолжительность биосинтеза (см. Таблицу 1 в Примере 4). Получаемые в выбранных условиях клетки сочетают высокую активность по целевому ферменту (не менее 1600 МЕ/г сух.) и прочное связывание синтетазы цефалоспоринов-кислот клеточными структурами, остающимися в стационарной фазе интактными. Сохранение естественного клеточного микроокружения целевого фермента предохраняет его от неблагоприятных воздействий процессов иммобилизации и последующей эксплуатации биокатализатора, поэтому иммобилизация клеток E.coli с Kpaсп≥350 обеспечивает получение биокатализатора с высокой активностью по синтезу цефалоспоринов-кислот и хорошей стабильностью. При рН культуральной жидкости ниже 7,9 синтетаза цефалоспоринов-кислот прочно связана с клеточными структурами (Kрасп≥350), однако использование таких клеток для иммобилизации нецелесообразно из-за недостаточно высокой активности получаемой биомассы клеток. Использование для иммобилизации клеток со слабо связанным целевым ферментом (Красп<350, рН>8,2), находящихся в состоянии ограниченного цитолиза (разрушение цитоплазмы клеток) или следующего за ним автолиза (разрушение цитоплазмы и клеточных мембран), приводит к снижению стабильности биокатализатора, а также потерям активности в процессе иммобилизации (Пример 5).The process of biosynthesis of cephalosporin acid synthetase is stopped in the phase of stationary growth of E. coli cells with a distribution constant of cephalosporin acid synthetase K ra ≥ 350 and a pH of the culture fluid of 7.9 ÷ 8.2. The time frame for the onset of the selected optimal state for immobilization of the cells may shift depending on the E. coli strain used, which affects the duration of biosynthesis (see Table 1 in Example 4). The cells obtained under the selected conditions combine high activity on the target enzyme (at least 1600 IU / g dry) and strong binding of cephalosporin acid synthetase to cell structures that remain intact in the stationary phase. Preservation of the natural cellular microenvironment of the target enzyme protects it from the adverse effects of the immobilization processes and subsequent operation of the biocatalyst, therefore, the immobilization of E. coli cells with Kpas ≥ 350 provides a biocatalyst with high activity for the synthesis of cephalosporins acids and good stability. At a culture fluid pH below 7.9, cephalosporin acid synthetase is strongly bound to cell structures (K distribution ≥ 350), however, the use of such cells for immobilization is impractical due to the insufficiently high activity of the obtained cell biomass. The use of immobilized cells with a weakly bound target enzyme (K dis <350, pH> 8.2) that are in a state of limited cytolysis (destruction of the cytoplasm of cells) or subsequent autolysis (destruction of the cytoplasm and cell membranes) leads to a decrease in the stability of the biocatalyst , as well as loss of activity during immobilization (Example 5).
Использование высоких концентраций биомассы клеток (густоты клеточной суспензии) CБМК=100÷150 мг сух./г п.см. (в 3-5 раз выше, чем в методе согласно ближайшему аналогу) позволяет получать высокоактивный биокатализатор, благодаря введению в полимеризационную смесь большого количества активных клеток. Последующая модификация глутаровым альдегидом предотвращает их вымывание из геля в процессе получения и отмывки биокатализатора. Верхний предел густоты клеточной суспензии (150 мг сух./г п.см.) ограничен возможностью внесения в полимеризационную смесь влажной БМК с содержание сухих веществ 20-23% в количестве не более 70% от ее общего веса (Wп.см). Использование густоты суспензии менее 100 мг сух./г п.см. не обеспечивает получение биокатализатора с достаточно высокой активностью (см. Таблицу 2 в Примере 6).The use of high concentrations of cell biomass (cell suspension density) C BMK = 100 ÷ 150 mg dry / g p.s. (3-5 times higher than in the method according to the closest analogue) allows to obtain a highly active biocatalyst, due to the introduction of a large number of active cells into the polymerization mixture. Subsequent modification with glutaraldehyde prevents them from being washed out of the gel during the preparation and washing of the biocatalyst. The upper density limit of the cell suspension (150 mg dry / g bcm) is limited by the possibility of introducing wet BMK into the polymerization mixture with a dry matter content of 20-23% in an amount of not more than 70% of its total weight (W pc.cm ). The use of the density of the suspension is less than 100 mg dry / g p.s. does not provide a biocatalyst with a sufficiently high activity (see Table 2 in Example 6).
Модификация клеток глутаровым альдегидом при осуществлении заявляемого способа имеет два положительных последствия. Во-первых, это приводит к необратимой фиксации в биокатализаторе белкового содержимого клеток, включая целевой фермент. Результатом являются повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток, а также отсутствие вымывания белков из готового биокатализатора. Во-вторых, промежуточные продукты взаимодействия глутарового альдегида с белками выступают катализаторами процесса полимеризации мономеров полиакриламидного геля, что делает ненужным внесение в реакционную смесь обычно используемых для этой цели веществ (бета-диметиламинопропионитрил или N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин). Возможность такой замены была продемонстрирована ранее при иммобилизации свободных белков в акрилатных гелях [5]. Согласно заявляемому способу глутаровый альдегид используют в относительной концентрации СГА=1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, проводя модификацию в течение τмод=5÷30 мин. Использование модификатора в концентрации выше 9·10-3 ммоль/мг белка приводит к получению недостаточно активного биокатализатора, а при концентрации глутарового альдегида ниже 1·10-3 ммоль/мг белка и/или времени модификации меньше 5 мин снижается стабильность биокатализатора и возникает возможность вымывания из него белков. При времени модификации глутаровым альдегидом больше 30 мин в реакционной смеси снижается концентрация промежуточных продуктов взаимодействия белков с глутаровым альдегидом, являющихся катализаторами полимеризации акрилатных мономеров, поэтому последующий процесс гелеобразования протекает медленно, а механические свойства получаемого биокатализатора ухудшаются (см. Таблицу 3 в Примере 7).Modification of cells with glutaraldehyde in the implementation of the proposed method has two positive consequences. Firstly, this leads to irreversible fixation of the protein content of cells, including the target enzyme, in the biocatalyst. The result is an increase in the activity and stability of immobilized cells, as well as the absence of leaching of proteins from the finished biocatalyst. Secondly, intermediate products of the interaction of glutaraldehyde with proteins act as catalysts for the polymerization of polyacrylamide gel monomers, which makes it unnecessary to add to the reaction mixture the substances commonly used for this purpose (beta-dimethylaminopropionitrile or N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine). The possibility of such a replacement was previously demonstrated by immobilization of free proteins in acrylate gels [5]. According to the claimed method, glutaraldehyde is used in a relative concentration With GA = 1 · 10 -3 ÷ 9 · 10 -3 mmol / mg of protein, carrying out the modification for τ mod = 5 ÷ 30 min. The use of a modifier at a concentration above 9 · 10 -3 mmol / mg of protein leads to an insufficiently active biocatalyst, and when the concentration of glutaraldehyde is below 1 · 10 -3 mmol / mg of protein and / or a modification time of less than 5 min, the stability of the biocatalyst decreases and the possibility leaching of proteins from it. When the time of modification with glutaraldehyde for more than 30 min, the concentration of intermediate products of the interaction of proteins with glutaraldehyde, which are catalysts for the polymerization of acrylate monomers, decreases in the reaction mixture, so the subsequent gelation process proceeds slowly, and the mechanical properties of the obtained biocatalyst deteriorate (see Table 3 in Example 7).
Способ в общем видеThe method in General
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот осуществляют путем культивирования штамма E.coli, продуцирующего соответствующий фермент, на жидкой ферментационной среде следующего состава (мас.%): кукурузный экстракт (2% по сухому весу) и тиофен-2-уксусная кислота (0,1%). Ферментацию останавливают при константе связывания целевого фермента Красп≥350 и значении рН культуральной жидкости в диапазоне 7,9÷8,2. Выращенную клеточную биомассу отделяют центрифугированием (5-8 тыс. об/мин), промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 и вновь отделяют центрифугированием в тех же условиях. Осадок, представляющий собой биомассу клеток (БМК), используют для иммобилизации путем включения модифицированных клеток в полиакриламидный гель, получаемый сополимеризацией акриламида (АА) и N.N'-метилен-бис-акриламида (БИС).The biosynthesis of cephalosporin acid synthetase is carried out by culturing an E. coli strain producing the corresponding enzyme in a liquid fermentation medium of the following composition (wt.%): Corn extract (2% by dry weight) and thiophene-2-acetic acid (0.1% ) The fermentation is stopped at the binding constant of the target enzyme K ra ≥ 350 and the pH of the culture fluid in the range of 7.9 ÷ 8.2. The grown cell biomass is separated by centrifugation (5-8 thousand rpm), washed with 0.1 M phosphate buffer with a pH of 7.5 and again separated by centrifugation under the same conditions. The sediment, which is the biomass of cells (BMC), is used for immobilization by incorporating modified cells in a polyacrylamide gel obtained by copolymerization of acrylamide (AA) and N.N'-methylene-bis-acrylamide (BIS).
Биомассу клеток, взятую из расчета СБМК=100÷150 мг сух./г п.см., суспендируют в фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем мономеры полиакриламидного геля в весовом соотношении АА:БИС=20:1 при общей их концентрации в полимеризационной смеси Cмoн=9%. При постоянном перемешивании и охлаждении клеточной суспензии на ледяной бане проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации CГА=1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, содержащимся в клетках. Время модификации глутаровым альдегидом τмод=5÷30 мин. По окончании модификации в реакционную смесь вносят инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты, например персульфат аммония или персульфат калия, в концентрации, необходимой для осуществления гелеобразования в течение 20-120 сек. Полученный блок геля выдерживают на холоду еще 20-30 мин, а затем измельчают, дважды продавливая сквозь металлическое сито с размером ячеек 0,5 мм, и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ. Иммобилизованные клетки отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией на пористом стеклянном фильтре. Получают биокатализатор с активностью в отношении синтеза цефазолина не менее 100 МЕ/г влажн., 600 МЕ/г сух., периодом полуинактивации (τ1/2) не менее 800 часов (40°C и рН 6,5). Биокатализатор устойчив в отношении вымывания из него веществ белковой природы и может быть использован в процессах синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторах периодического действия с перемешиванием.The cell biomass, taken from the calculation of BMK = 100 ÷ 150 mg dry / g bcm, is suspended in phosphate buffer, pH 7.5, containing monomers of polyacrylamide gel in a weight ratio of AA: BIS = 20: 1 at a total concentration of in the polymerization mixture C mon = 9%. With constant stirring and cooling of the cell suspension in an ice bath, cells are modified with glutaraldehyde taken in a relative concentration of C GA = 1 · 10 -3 ÷ 9 · 10 -3 mmol / mg of protein contained in the cells. Modification time with glutaraldehyde τ mod = 5 ÷ 30 min. At the end of the modification, a polymerization initiator — a salt of supra sulfuric acid, for example ammonium persulfate or potassium persulfate — is added to the reaction mixture in the concentration necessary for gelation for 20-120 sec. The resulting block of gel is kept in the cold for another 20-30 minutes, and then crushed, twice forcing through a metal sieve with a mesh size of 0.5 mm, and washed from substances not bound during the polymerization. Immobilized cells are separated from the washings by vacuum filtration on a porous glass filter. A biocatalyst is obtained with cefazolin synthesis activity of at least 100 IU / g wet., 600 IU / g dry., Half-inactivation period (τ 1/2 ) of at least 800 hours (40 ° C and pH 6.5). The biocatalyst is stable against leaching of protein substances from it and can be used in the synthesis of cephalosporins acids in batch reactors with stirring.
Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот (Примеры 1, 2, 6, 7), имеет ряд преимуществ по сравнению с контролем - способом, выполненным согласно ближайшему аналогу и осуществленным с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182 (Пример 3):The inventive method for producing a biocatalyst based on cells of E. coli strains immobilized in a polyacrylamide gel producing cephalosporin acid synthetase (Examples 1, 2, 6, 7) has a number of advantages compared to the control — a method performed according to the closest analogue and carried out using E. coli cultures, VKPM strain B-10182 (Example 3):
- повышение активности получаемого биокатализатора в отношении синтеза цефазолина в 2-3 раза (600÷950 МЕ/г сух. по заявляемому способу и 300 МЕ/г сух. согласно контролю);- increased activity of the obtained biocatalyst in relation to the synthesis of cefazolin by 2-3 times (600 ÷ 950 IU / g dry. by the present method and 300 IU / g dry. according to the control);
- повышение стабильности получаемого биокатализатора в условиях ускоренной инактивации не менее чем в 40 раз (τ1/2=800-2000 час по заявляемому способу и τ1/2=20 час согласно контролю);- increasing the stability of the obtained biocatalyst in the conditions of accelerated inactivation of not less than 40 times (τ 1/2 = 800-2000 hours according to the present method and τ 1/2 = 20 hours according to the control);
- отсутствие вымывания целевого фермента и других белков из биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу, в отличие от биокатализатора, полученного согласно ближайшему аналогу.- the lack of leaching of the target enzyme and other proteins from the biocatalyst obtained according to the claimed method, in contrast to the biocatalyst obtained according to the closest analogue.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления способа получения биокатализатора с использованием двух штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот, а именно VKPM В-10182 из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) и CGMCC No.3508 из Китайской Коллекции Культур Микроорганизмов (CGMCC).The invention is illustrated by the following examples of a method for producing a biocatalyst using two E. coli strains producing cephalosporin acid synthetase, namely VKPM B-10182 from the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) and CGMCC No.3508 from the Chinese Collection of Microorganism Cultures (CGMCC).
Во всех приведенных примерах приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалоспорина-кислоты цефазолина из 3-метил-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) и метилового эфира 1(Н)-теразолилуксусной кислоты (МЭТЗУК). Ее определяют по начальной скорости образования цефазолина в следующих условиях: рН 7,5, температура (30±1)°C, концентрации субстратов - (0,059±0,002) моль/л ММТД-7-АЦК и (0,23 6±0,004) моль/л МЭТЗУК. Содержание цефазолина в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).In all examples cited, the activity of enzyme preparations for the synthesis of cephalosporin-acid cefazolin from 3-methyl-mercapto-5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-7-aminocephalosporanic acid (MMTD-7-ACC) and methyl 1 (H) -therazolylacetic acid ester (METZUK). It is determined by the initial rate of cefazolin formation under the following conditions: pH 7.5, temperature (30 ± 1) ° C, substrate concentrations - (0.059 ± 0.002) mol / L MMTD-7-ACC and (0.23 6 ± 0.004) mol / l MATZUK. The cefazolin content in the reaction mixture is determined by high performance liquid chromatography (HPLC).
Содержание сухих веществ в биомассе клеток и биокатализаторах определяют весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°C до постоянной массы.The solids content in the cell biomass and biocatalysts is determined by the gravimetric method after the preparation is dried at (105 ± 1) ° C to constant weight.
Константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот (Красп) между биомассой клеток и внешним раствором определяют путем анализа ферментативной активности биомассы клеток (АБМК, МЕ/г влажн.) и надосадочной жидкости (Ар-р, МЕ/мл) после суспендирования 1 г влажной БМК в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и рассчитывают по формуле: Красп=АБМК/Ар-р.Constant distribution synthetase cephalosporin acids (K dis) between the biomass of the cell and the outer solution is determined by analyzing the enzymatic activity of cell biomass (A BMC, lU / g wet.) And supernatant (A rr, IU / ml) after slurrying 1 g wet BMK in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 6.5 and calculated by the formula: To rasp = A BMK / A rr .
Содержание белка в биомассе клеток и растворах определяют методом Лоури [6]. За динамикой инактивации биокатализаторов следят, контролируя их остаточную активность после инкубации в течение различного времени в условиях ускоренной инактивации при 40°C и рН 6,5 в 0,1 М фосфатном буфере. Стабильность образцов характеризуют по времени их полуинактивации в данных условиях (τ1/2, час).The protein content in the biomass of cells and solutions is determined by the Lowry method [6]. The dynamics of inactivation of biocatalysts is monitored by monitoring their residual activity after incubation for various times under conditions of accelerated inactivation at 40 ° C and pH 6.5 in 0.1 M phosphate buffer. The stability of the samples is characterized by the time of their half-inactivation under these conditions (τ 1/2 , hour).
Потери белков и целевого фермента при промывке биокатализаторов контролируют путем определения содержание белков и определения синтетазной активности в надосадочной жидкости после суспендирования 1 г влажного биокатализатора в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,5 в течение 1 часа при 20°C.The loss of proteins and the target enzyme during washing of the biocatalysts is controlled by determining the protein content and determining the synthetase activity in the supernatant after suspending 1 g of wet biocatalyst in 3 ml of 0.1 M phosphate buffer at pH 7.5 for 1 hour at 20 ° C.
Пример 1. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182Example 1. The implementation of the proposed method for producing a biocatalyst using a culture of E. coli, strain VKPM B-10182
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli VKPM В-10182 проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих по 100 мл ферментационной среды следующего состава:The biosynthesis of cephalosporin acid synthetase by E. coli VKPM B-10182 culture is carried out in 750 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of fermentation medium of the following composition:
- кукурузный экстракт - 2% (на сухой вес)- corn extract - 2% (on dry weight)
- тиофен-2-уксусная кислота - 0,1%- thiophene-2-acetic acid - 0.1%
- вода водопроводная - до нужного объема.- tap water - to the desired volume.
рН после стерилизации 6,9-7,1.pH after sterilization of 6.9-7.1.
Культивирование продуцента фермента ведут при температуре 25-26°C на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот проводят в течение 18 часов и останавливают при рН 8,1, Красп=380. Выращенную биомассу клеток отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге с охлаждением, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5 и повторно отделяют центрифугированием в тех же условиях.Cultivation of the enzyme producer is carried out at a temperature of 25-26 ° C on a circular rocking chair with a rotation speed of 220-240 rpm. The process of biosynthesis of cephalosporin acid synthetase is carried out for 18 hours and stopped at pH 8.1, K rasp = 380. The grown biomass of the cells is separated by centrifugation at 6000 rpm for 20 minutes in a centrifuge with cooling, washed with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5 and re-separated by centrifugation under the same conditions.
С 3,70 л культуральной жидкости получают 46,6 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:With 3.70 L of culture fluid, 46.6 g of wet biomass of E. coli cells containing cephalosporin acid synthetase and characterized by the following quality indicators are obtained:
- синтетазная активность (АБМК) - 460 МЕ/г влажн.; 2009 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BMK ) - 460 IU / g wet .; 2009 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБМК) - 22,9%;- solids content (β BMK ) - 22.9%;
- содержание белка - 114 мг/г влажн.- protein content - 114 mg / g wet.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм VKPM В-10182, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.The resulting biomass of E. coli cells, strain VKPM B-10182, is used for immobilization by incorporation into a polyacrylamide gel.
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:Immobilization of cell biomass is carried out under the following conditions:
Wп. см=7,0 г; СБМК=37 мг сух./г п.см; СГА=1,7·10-3 ммоль/мг белка; τмод=15 мин; Смон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.W P. cm = 7.0 g; With BMK = 37 mg dry / g p.cm; With GA = 1.7 · 10 -3 mmol / mg protein; τ mod = 15 min; With mon = 9%; the initiator of the polymerization of ammonium persulfate is 0.2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,2 г влажной биомассы клеток суспендируют в 1,4 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,32 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 30 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.The procedure is carried out in a glass beaker placed on a magnetic stirrer in an ice bath. 4.2 g of wet cell biomass are suspended in 1.4 ml of 0.3 M phosphate buffer at pH 7.5, then 1.05 ml of a 60% aqueous solution of acrylamide gel monomers is added (AA: BIS = 20: 1). After obtaining a homogeneous suspension, 0.32 ml of a 25% aqueous solution of glutaraldehyde is added to it and the proteins are modified with a cross-linking agent for 15 minutes with constant stirring. Then, 0.06 ml (60 μl) of a 25% aqueous solution of ammonium persulfate was added to the polymerization mixture with vigorous stirring, and the stirrer was stopped. After 30 seconds, a gel is formed, which is kept in an ice bath for 20 minutes, crushed by successive twisting through a metal sieve with a mesh size of 0.50 mm and washed with distilled water and a 1 M aqueous solution of sodium chloride. The biocatalyst is separated from the washings by vacuum filtration.
Получают 7,01 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:Get 7.01 g of wet biocatalyst, characterized by the following quality indicators:
- синтетазная активность (АБК) - 165 МЕ/г влажн.; 900 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BC ) - 165 IU / g wet .; 900 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБК) - 18,3%;- solids content (β BC ) - 18.3%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 1200 час.- half-inactivation time at 40 ° C, pH 6.5 (τ 1/2 ) - 1200 hours.
Выход активности процесса иммобилизации - 59,9%.The output of the activity of the immobilization process is 59.9%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:Losses when washing the finished biocatalyst buffer:
- синтетазная активность - не обнаружено- synthetase activity - not detected
- белок - не обнаружено.- protein - not detected.
Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры Е. соli, штамм CGMCC No.3508Example 2. The implementation of the proposed method for producing a biocatalyst using a culture of E. coli, strain CGMCC No.3508
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм CGMCC No.3508, осуществляют, как описано в примере 1 для штамма E.coli VKPM В-10182, с той лишь разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 16 часов и останавливают при рН 8,05, Красп=370. Выращенную биомассу клеток отделяют и отмывают в соответствии с описанием, приведенным в примере 1.The biosynthesis of cephalosporin acid synthetase by E. coli culture, strain CGMCC No.3508, is carried out as described in example 1 for strain E. coli VKPM B-10182, with the only difference that the enzyme biosynthesis is carried out for 16 hours and stopped at pH 8.05; To dec = 370. The grown biomass of the cells is separated and washed in accordance with the description given in example 1.
С 1,2 л культуральной жидкости получают 13,1 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:With 1.2 l of culture fluid, 13.1 g of wet biomass of E. coli cells containing cephalosporin acid synthetase and characterized by the following quality indicators are obtained:
- синтетазная активность (АБМК) - 380 ME/г влажн.; 1820 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BMK ) - 380 ME / g wet .; 1820 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБМК) - 23,0%;- solids content (β BMK ) - 23.0%;
- содержание белка - 90 мг/г влажн.- protein content - 90 mg / g wet.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм CGMCC No.3508, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.The resulting biomass of E. coli cells, strain CGMCC No.3508, is used for immobilization by incorporation into a polyacrylamide gel.
Иммобилизацию проводят в следующих условиях:Immobilization is carried out under the following conditions:
Wп.cм=7,0 г; СБМК=145 мг сух./г п.см; СГА=5,0·10-3 ммоль/мг белка; τмод=10 мин; Смон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.W P. cm = 7.0 g; With BMK = 145 mg dry / g p.cm; With GA = 5.0 · 10 -3 mmol / mg protein; τ mod = 10 min; With mon = 9%; the initiator of the polymerization of ammonium persulfate is 0.2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,4 г влажной биомассы клеток суспендируют в 0,7 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,79 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 20 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.The procedure is carried out in a glass beaker placed on a magnetic stirrer in an ice bath. 4.4 g of wet cell biomass is suspended in 0.7 ml of 0.3 M phosphate buffer at pH 7.5, then 1.05 ml of a 60% aqueous solution of acrylamide gel monomers is added (AA: BIS = 20: 1). After obtaining a homogeneous suspension, 0.79 ml of a 25% aqueous solution of glutaraldehyde is added to it and the proteins are modified with a cross-linking agent for 10 minutes with constant stirring. Then, 0.06 ml (60 μl) of a 25% aqueous solution of ammonium persulfate was added to the polymerization mixture with vigorous stirring, and the stirrer was stopped. After 20 seconds, a gel forms, which is kept in an ice bath for 20 minutes, crushed by successive twisting through a metal sieve with a mesh size of 0.50 mm and washed with distilled water and a 1 M aqueous solution of sodium chloride. The biocatalyst is separated from the washings by vacuum filtration.
Получают 6,95 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:Get 6.95 g of wet biocatalyst, characterized by the following quality indicators:
- синтетазная активность (АБК) - 150 МЕ/г влажн.; 840 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BC ) - 150 IU / g wet .; 840 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБК) - 17,8%;- solids content (β BC ) - 17.8%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 1250 час.- half-inactivation time at 40 ° C, pH 6.5 (τ 1/2 ) - 1250 hours.
Выход активности процесса иммобилизации - 62,4%.The output of the activity of the immobilization process is 62.4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:Losses when washing the finished biocatalyst buffer:
- синтетазная активность - не обнаружено- synthetase activity - not detected
- белок - не обнаружено.- protein - not detected.
Пример 3. Осуществление способа получения биокатализатора согласно ближайшему аналогу с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182, (контроль)Example 3. The implementation of the method for producing a biocatalyst according to the closest analogue using E.coli culture, strain VKPM B-10182, (control)
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм VKPM В-10182, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1. Полученную биомассу клеток, охарактеризованную в примере 1, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель согласно процедуре, описанной в ближайшем аналоге.The biosynthesis of cephalosporin acid synthetase by E. coli culture, VKPM strain B-10182, separation and washing of the cell biomass is carried out according to example 1. The obtained cell biomass, described in example 1, is used for immobilization by incorporation into a polyacrylamide gel according to the procedure described in the closest analogue .
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:Immobilization of cell biomass is carried out under the following conditions:
Wп.см=7,0 г; СБМК=33 мг сух./г п.см; Смон=12,7%; катализатор полимеризации бета-диметиламинопропионитрил - 0,36%; инициатор полимеризации персульфат калия - 0,07%.W P. cm = 7.0 g; With BMK = 33 mg dry / g p.cm; With mon = 12.7%; beta-dimethylaminopropionitrile polymerization catalyst - 0.36%; the initiator of the polymerization of potassium persulfate is 0.07%.
1,0 г влажной биомассы клеток суспендируют в 4,0 мл 0,9% раствора хлористого натра, затем растворяют в этой суспензии 0,75 г акриламида и 0,40 г N,N'-метилен-бис-акриламида (АА:БИС=18:1). Последовательно вносят по 0,5 мл 5% раствора бета-диметиламинопропионитрила и 1% раствора персульфата калия. Образовавшийся гель выдерживают 20 минут, затем измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают 0,9% раствора хлористого натра.1.0 g of wet cell biomass is suspended in 4.0 ml of a 0.9% sodium chloride solution, then 0.75 g of acrylamide and 0.40 g of N, N'-methylene-bis-acrylamide are dissolved in this suspension (AA: BIS = 18: 1). 0.5 ml of a 5% solution of beta-dimethylaminopropionitrile and a 1% solution of potassium persulfate are added successively. The resulting gel was incubated for 20 minutes, then crushed by successive two-time punching through a metal sieve with a mesh size of 0.50 mm and washed with 0.9% sodium chloride solution.
Получают 6,20 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:Get 6.20 g of wet biocatalyst, characterized by the following quality indicators:
- синтетазная активность (АБК) - 38 МЕ/г влажн.; 300 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BC ) - 38 IU / g wet .; 300 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБК) - 12,7%;- solids content (β BC ) - 12.7%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 20 час.- half-inactivation time at 40 ° C, pH 6.5 (τ 1/2 ) - 20 hours.
Выход активности процесса иммобилизации - 51,4%.The output of the activity of the immobilization process is 51.4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:Losses when washing the finished biocatalyst buffer:
- смыв синтетазной активности - 11 ME с 1 г БК (29% от исходной активности БК)- flush of synthetase activity - 11 ME with 1 g of CD (29% of the initial activity of CD)
- смыв белка - 5 мг белка с 1 г БК.- protein washout - 5 mg of protein with 1 g of CD.
Пример 4. Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coliExample 4. Dynamics of the biosynthesis of cephalosporin acid synthetase by E. coli culture
Культивирования продуцента E.coli, штамм VKPM В-10182 или CGMCC No.3508, осуществляют в колбах Эрленмейера в условиях согласно примеру 1. По ходу процесса выводят из опыта по две колбы, объединяют содержащуюся в них культуральную жидкость, контролируют в ней значение рН, а затем отделяют биомассу клеток центрифугированием и промывают ее 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5, используемым в количестве 5 мл на 1 г БМК. Анализируют промывные воды и полученную биомассу клеток и рассчитывают константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот Красп. Полученные данные о взаимосвязи рН культуральной жидкости, Красп и активности получаемой биомассы клеток (АБМК, МЕ/г сух.) представлены в Таблице 1.Cultivation of the producer E. coli, strain VKPM B-10182 or CGMCC No.3508, is carried out in Erlenmeyer flasks under the conditions according to example 1. During the process, two flasks are removed from the experiment, the culture fluid contained in them is combined, the pH value is controlled in it, and then the cell biomass is separated by centrifugation and washed with 0.1 M phosphate buffer with a pH of 7.5, used in an amount of 5 ml per 1 g BMK. Wash water and the resulting cell biomass are analyzed and the distribution constant of the cephalosporin acid synthetase K rasp is calculated. The obtained data on the relationship between the pH of the culture fluid, K ras and the activity of the resulting cell biomass (A BMK , IU / g dry.) Are presented in Table 1.
Пример 5. Использование для иммобилизации клеток со слабосвязанным целевым ферментомExample 5. Use for immobilization of cells with loosely coupled target enzyme
Культивирование продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1, с той разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 22,5 часов и останавливают при pH 8,38, Kpacп=320.Cultivation of the producer of cephalosporin acid synthetase, separation and washing of the cell biomass is carried out according to example 1, with the difference that the enzyme biosynthesis is carried out for 22.5 hours and stopped at pH 8.38, K pacp = 320.
С 0,70 л культуральной жидкости получают 8,1 г влажной биомассы клеток E.coli VKPM В-10182, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:With 0.70 l of culture fluid, 8.1 g of wet biomass of E. coli VKPM B-10182 cells containing cephalosporin acid synthetase and characterized by the following quality indicators are obtained:
- синтетазная активность - 440 МЕ/г влажн.; 1900 МЕ/г сух.;- synthetase activity - 440 IU / g wet .; 1900 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ - 23,2%;- solids content - 23.2%;
- содержание белка - 95 мг/г влажн.- protein content - 95 mg / g wet.
Полученную биомассу клеток используют для иммобилизации в полиакриламидном геле, осуществляемой в условиях согласно Примеру 1.The obtained cell biomass is used for immobilization in a polyacrylamide gel, carried out under the conditions according to Example 1.
Получают 6,91 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:Get 6.91 g of wet biocatalyst, characterized by the following quality indicators:
- синтетазная активность (АБК) - 113 МЕ/г влажн.; 750 МЕ/г сух.;- synthetase activity (A BC ) - 113 IU / g wet .; 750 IU / g dry .;
- содержание сухих веществ (βБК) - 15,1%;- solids content (β BC ) - 15.1%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 750 час.- half-inactivation time at 40 ° C, pH 6.5 (τ 1/2 ) - 750 hours.
Выход активности процесса иммобилизации - 42,2%.The output of the activity of the immobilization process is 42.2%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:Losses when washing the finished biocatalyst buffer:
- синтетазная активность - не обнаружено- synthetase activity - not detected
- белок - не обнаружено.- protein - not detected.
Пример 6. Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатораExample 6. The effect of the density of the cell suspension on the properties of the resulting biocatalyst
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя содержание биомассы клеток в полимеризационной смеси (густоту клеточной суспензии) при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера. Для инициирования полимеризации используют различные соли надсерной кислоты. Свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 2.For immobilization, the biomass of E. coli VKPM B-10182 cells obtained according to Example 1 is used. The immobilization procedure is carried out under the conditions of Example 1, varying the content of cell biomass in the polymerization mixture (cell suspension density) while maintaining the total volume of the polymerization mixture due to a corresponding change in the introduced buffer volume. To initiate the polymerization, various salts of sulfuric acid are used. The properties of the obtained biocatalysts are presented in Table 2.
Пример 7. Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатораExample 7. The effect of the concentration of glutaraldehyde and modification time on the properties of the resulting biocatalyst
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя время модификации клеток глутаровым альдегидом, а также его относительную концентрацию (при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера). Времена гелеобразования (полимеризации, τполим, сек) и свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 3.For immobilization, the biomass of E. coli VKPM B-10182 cells obtained according to Example 1 is used. The immobilization procedure is carried out under the conditions according to Example 1, varying the cell modification time with glutaraldehyde and its relative concentration (while maintaining the total volume of the polymerization mixture due to a corresponding change insertion volume of the buffer). The gelation times (polymerization, τ polym , sec) and the properties of the obtained biocatalysts are presented in Table 3.
Таким образом, разработан способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, на основе клеток E.coli, иммобилизованных в полиакриламиднрм геле. Способ позволяет получать стабильный биокатализатор с активностью не менее 600 МЕ/г сух., не содержащий слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.Thus, a method has been developed for the preparation of a biocatalyst having activity with respect to the synthesis of cephalosporins acids based on E. coli cells immobilized in a polyacrylamide gel. The method allows to obtain a stable biocatalyst with an activity of at least 600 IU / g dry, not containing loosely coupled proteins that can contaminate the target product of biocatalytic transformation.
Особенностями способа являются:The features of the method are:
- использование штаммов культуры E.coli, продуцирующих фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот;- the use of E. coli culture strains producing the enzyme cephalosporin acid synthetase;
- выбор момента остановки культивирования продуцента при Красп не менее 350 и значении рН в диапазоне 7,9÷8,2;- the choice of the moment of stopping the cultivation of the producer at K rasp not less than 350 and a pH value in the range of 7.9 ÷ 8.2;
- проведение модификации клеток, суспендированных в растворе мономеров полиакриламидного геля, глутаровым альдегидом в оптимизированных условиях, обеспечивающих фиксацию клеточных белков в биокатализаторе, а также участие промежуточных продуктов взаимодействия глутарового альдегида с белками в процессе гелеобразования в качестве катализатора полимеризации мономеров.- modification of cells suspended in a solution of polyacrylamide gel monomers with glutaraldehyde under optimized conditions that ensure fixation of cellular proteins in the biocatalyst, as well as the participation of intermediate products of the interaction of glutaraldehyde with proteins during gelation as a catalyst for the polymerization of monomers.
Источники информацииInformation sources
1. Prubhune A.A., Rao B.S., Pandle A.V., SivaRaman H.: Immobilization of permeabilized Escherochia coli cells with penicillin acylase activity. Enzyme Microb Technol. 14: 161-163 (1992).1. Prubhune A.A., Rao B.S., Pandle A.V., SivaRaman H .: Immobilization of permeabilized Escherochia coli cells with penicillin acylase activity. Enzyme Microb Technol. 14: 161-163 (1992).
2. Pandle A., Prubhune A., SivaRaman H.: Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. Appi Microbiol Biotechnol 29:426-429 (1988).2. Pandle A., Prubhune A., SivaRaman H .: Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. Appi Microbiol Biotechnol 29: 426-429 (1988).
3. US3957580 "Immobilized microbial cells"; SU608495 «Способ иммобилизации микробных клеток».3. US3957580 "Immobilized microbial cells"; SU608495 "Method for the immobilization of microbial cells."
4. Sato Т., Tosa Т., Chibata I.: Continous production of 6-Aminopenicillanic acid from Penicillin by immobilized microbial cells. European J Appi Microbiol 2:153-160 (1976).4. Sato T., Tosa T., Chibata I .: Continous production of 6-Aminopenicillanic acid from Penicillin by immobilized microbial cells. European J Appi Microbiol 2: 153-160 (1976).
5. RU 1389296 «Способ получения биологически активных веществ, иммобилизованных в акрилатных гелях».5. RU 1389296 "Method for the production of biologically active substances immobilized in acrylate gels."
6. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price С.: Review. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appi Biochem 29: 99-108 (1999).6. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price C .: Review. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appi Biochem 29: 99-108 (1999).
Claims (1)
где Абмк - ферментативная активность биомассы клеток (МЕ/г влажн.);
Ар-р - ферментативная активность надосадочной жидкости (МЕ/мл);
и величину рН культуральной жидкости, прекращая процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот при Красп не менее 350 и значении рН 7,9÷8,2, биомассу клеток в концентрации 100÷150 мг сух./г полимеризационной смеси суспендируют в растворе акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида при весовом отношении 20:1, в течение 5÷30 мин проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации 1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, в качестве инициатора процесса полимеризации используют соль надсерной кислоты. A method for producing a biocatalyst based on bacterial cells of Escherichia coli, which is active in the synthesis of cephalosporin acids, comprising cultivating the producer and immobilizing the grown biomass of cells containing the target intracellular enzyme by suspending it in a solution of polyacrylamide gel monomers followed by gelation under the action of a catalyst and a polymer initiator , characterized in that they use a culture of Escherichia coli, producing the enzyme synthetase of cephalosporin acids, in As the criteria for choosing the moment of termination of the enzyme biosynthesis process, the distribution constant of the target enzyme is used K rasp = A bmk / A rr ,
where A BMK is the enzymatic activity of cell biomass (IU / g wet.);
And rr - the enzymatic activity of the supernatant (IU / ml);
and the pH of the culture fluid, stopping the process of biosynthesis of cephalosporin acid synthetase at a Kp of not less than 350 and a pH value of 7.9 ÷ 8.2, the cell biomass at a concentration of 100 ÷ 150 mg dry / g polymerization mixture is suspended in a solution of acrylamide and N , N'-methylene-bis-acrylamide at a weight ratio of 20: 1, for 5 ÷ 30 min, cells are modified with glutaraldehyde taken in a relative concentration of 1 · 10 -3 ÷ 9 · 10 -3 mmol / mg protein, as the initiator of the polymerization process using a salt of sulfuric acid.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010102872/10A RU2420581C1 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010102872/10A RU2420581C1 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2420581C1 true RU2420581C1 (en) | 2011-06-10 |
Family
ID=44736685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010102872/10A RU2420581C1 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2420581C1 (en) |
-
2010
- 2010-01-29 RU RU2010102872/10A patent/RU2420581C1/en active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Демаков В.А. и др. Иммобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты. // Биотехнология, 2008, №2, с.30-45. Бидей С.П. и др. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Вудворда. - М.: Мир, 1988, с.55-62. TERRENI М. ЕТ AL. Enzymatic synthesis of cephalosporins. The immobilized acylase from Arthrobacter viscosus: A new useful biocatalyst. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, 77:579-587. CRUZ A.J.G. ЕТ AL. Cephalosporin С Production by Immobilized Cephalosporium acremonium Cells in a Repeated Batch Tower Bioreactor. // Biotechnology and bioengineering, vol. 85. no. 1, 2004, 96-102. NYS P.S. ЕТ AL. General principles of immobilized cell biocatalyst design for antibiotic production // Indian Journal of Chemistry, vol. 32B, 1993, 11-15. SATO Т. ЕТ AL. Continuous Production of 6-Aminopenicillanic Acid from Penicillin by Immobilized Microbial Cells. // European J. Appl. Microbiol., 2, 1976, 153-160. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2188864C2 (en) | Nitrilase, strain rhodococcus rhodochrous as producer of nitrilase (variants), method of ammonium acrylate preparing, method of detection of nitrile, method of purification of polymer | |
KR100395275B1 (en) | Method for preserving a suspension of cells or immobilized cells | |
CA2676926A1 (en) | Induction of enzymatic activity in nitrile hydratase-producing bacteria | |
JPS62257386A (en) | Method for preserving nitrile hydrating activity | |
Vojtíšek et al. | Immobilized cells | |
JPS63177791A (en) | Production of immobilized enzyme or immobilized microorganism | |
Chibata et al. | Continuous production of L-aspartic acid: Improvement of productivity by both development of immobilization method and construction of new Escherichia coli strain | |
AU646285B2 (en) | A process for the continuous conversion of cephalosporin derivatives into gluytaryl-7-aminocephalosporanic acid derivatives | |
RU2420581C1 (en) | Method of producing biocatalyst exhibiting cephalosporin acid synthesis activity | |
EP0032987B1 (en) | Thermophilic aspartase, processes for producing, culture used, and l-aspartic acid preparation process using the same | |
Goranov et al. | Lactic acid fermentation with encapsulated Lactobacillus casei ssp. rhamnosus ATCC 11979 (NBIMCC 1013) in alginate/chitosan matrices | |
JP3220839B2 (en) | Production method of cell surface substance by yeast protoplast | |
US5308761A (en) | Process for acetylating seaweed alginate with pseudomonas syringae subsp. phaseoliocola | |
AU666720B2 (en) | Method for the preparation of D-aminoacids or D-aminoacids derivatives | |
RU2174558C1 (en) | Method of l-aspartic acid producing | |
CA2003767A1 (en) | Biocatalysts and processes for the manufacture thereof | |
EP0931142B1 (en) | Method and immobilized biocatalyst for the production of l(-) malic acid | |
Chibata | Production of useful chemicals using cells immobilized with polyacrylamide and carrageenan | |
RU2253677C2 (en) | Immobilized biocatalyst method for production thereof and method for production of lactic acid using the same | |
SU1742330A1 (en) | Method for preparation of biocatalyst in polysaccharide carrier | |
JPH01132394A (en) | Heat treatment of immobilized cell | |
Muyima et al. | Comparative evaluation of pectolytic and proteolytic enzyme production by free and immobilized cells of some strains of the phytopathogenic Erwinia chrysanthemi | |
CN118792280A (en) | Lipase mutant and application thereof in single-cell protein synthesis | |
KR20210052102A (en) | Bead immobilized microbial cell soaked with metal ion and method of preparing the same | |
JPH05168481A (en) | Production of immobilized gel entrapping biological catalyst and its use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |