[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2445370C1 - Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction - Google Patents

Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction Download PDF

Info

Publication number
RU2445370C1
RU2445370C1 RU2010143998/10A RU2010143998A RU2445370C1 RU 2445370 C1 RU2445370 C1 RU 2445370C1 RU 2010143998/10 A RU2010143998/10 A RU 2010143998/10A RU 2010143998 A RU2010143998 A RU 2010143998A RU 2445370 C1 RU2445370 C1 RU 2445370C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cattle
primers
leukemia
gag
provirus
Prior art date
Application number
RU2010143998/10A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Наталия Геннадиевна Козырева (RU)
Наталия Геннадиевна Козырева
Михаил Иванович Гулюкин (RU)
Михаил Иванович Гулюкин
Людмила Александровна Иванова (RU)
Людмила Александровна Иванова
Денис Владимирович Колбасов (RU)
Денис Владимирович Колбасов
Содном Жамьянович Цыбанов (RU)
Содном Жамьянович Цыбанов
Исмаил Муссаевич Калабеков (RU)
Исмаил Муссаевич Калабеков
Александр Сергеевич Малоголовкин (RU)
Александр Сергеевич Малоголовкин
Original Assignee
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) filed Critical Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)
Priority to RU2010143998/10A priority Critical patent/RU2445370C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2445370C1 publication Critical patent/RU2445370C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: upstream and downstream oligonucleotide primers are used for separating a pol gene fragment of cattle leukaemia provirus. It is followed by electrophoretic measurement of an amplified fragment of the nucleotide sequence. The oligonucleotides of the following structure PF2 are used as primers: 5'-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3'; PR2: 5'-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG-3', wherein there are found no self-complementary sites inside each primer and between upstream and downstream ones; firing temperature makes 66°C for both oligonucleotides; GC composition is 50% for PF2 and 65% for PR2, and which flank a region of the conservative pol gene of cattle leukaemia virus of size 438 base pairs.
EFFECT: technique is reliable, high-sensitive and high-specific method which can be used to detect an antiviral CLV DNA fragment in a biological material.
3 dwg, 3 tbl, 3 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных, научных исследований в ветеринарии, молекулярной биологии.The present invention relates to the field of biotechnology, molecular genetic diagnosis of animal viral diseases, scientific research in veterinary medicine, molecular biology.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание, вызываемое вирусом лейкоза (ВЛКРС, bovine leukemia virus, BLV), который преимущественно поражает В лимфоциты. Лейкоз крупного рогатого скота наносит существенный экономический ущерб животноводческим хозяйствам РФ.Bovine leukemia is a chronic infectious disease caused by the leukemia virus (VLCC, bovine leukemia virus, BLV), which predominantly affects B lymphocytes. Leukemia in cattle causes significant economic damage to livestock farms of the Russian Federation.

В комплексе мероприятий по оздоровлению стад от лейкоза ведущее место принадлежит диагностике. Проблема своевременной эффективной диагностики лейкоза КРС в связи с крайне неблагополучной эпизоотической ситуацией по данному заболеванию и отсутствием средств специфической профилактики стоит по-прежнему остро.In a set of measures to improve the herds of leukemia, the leading place belongs to diagnostics. The problem of timely effective diagnosis of cattle leukemia due to the extremely unfavorable epizootic situation for this disease and the lack of specific prophylaxis is still acute.

В настоящее время все более актуальным становится совершенствование методов прижизненной диагностики лейкоза КРС. Традиционные методы серологической диагностики ВЛКРС (РИД, ИФА) не всегда позволяют выявить инфицированных животных, что способствует использованию в комплексе с серологическими методами молекулярно-генетических, в частности ПЦР, с помощью которой возможно раннее выявление ВЛКРС в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, а также повышение эффективности и сокращение сроков противолейкозных мероприятий.At present, the improvement of methods for the intravital diagnosis of cattle leukemia is becoming increasingly relevant. Traditional methods of serological diagnosis of VLCC (RID, ELISA) do not always allow the detection of infected animals, which contributes to the use of molecular genetic methods in combination with serological methods, in particular PCR, with which early detection of VLCC in leukemia-deficient farms is possible, as well as an increase in efficiency and reducing the time for anti-leukemia measures.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая является прямым высокочувствительным и высокоспецифичным молекулярно-биологическим методом, способна идентифицировать фрагменты провирусной ДНК ВЛКРС в лимфоцитах периферической крови животного. Принцип метода заключается в многократном увеличении (копировании) определенного участка ДНК выявляемого микроорганизма с помощью фермента ДНК-полимеразы. Специфические праймеры комплементарны последовательностям ДНК провируса, ограничивающим нужный участок ДНК, и ориентированы таким образом - прямой и обратный, что элонгация новой цепи ДНК проходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.The polymerase chain reaction (PCR), which is a direct highly sensitive and highly specific molecular biological method, is able to identify fragments of proviral VLCC DNA in lymphocytes of the peripheral blood of an animal. The principle of the method is to multiply (copy) a certain portion of the DNA of a detected microorganism using the enzyme DNA polymerase. Specific primers are complementary to the provirus DNA sequences that limit the desired DNA region, and are oriented in this way - direct and reverse, that the elongation of a new DNA strand passes only between them. The main parameters for the efficient passage of the amplification reaction, which provide specificity and sensitivity, are the correct choice of the genome region of the identified agent, the structure and temperature regime of annealing of oligonucleotide primers.

Известен способ дифференциации варианта tax гена вируса лейкоза крупного рогатого скота, заключающийся в проведении ПЦР с использованием праймеров, способных выявить полную последовательность tax гена ВЛКРС с целью дальнейшего выявления мутаций в кодируемых этим геном аминокислотных последовательностях и определения вариантов tax гена ВЛКРС. В частности, используются следующие праймеры:There is a method for differentiating a variant of the tax gene of the cattle leukemia virus, which involves PCR using primers capable of identifying the complete sequence of the VLCCR tax gene in order to further identify mutations in the amino acid sequences encoded by this gene and determine variants of the VLCC tax gene. In particular, the following primers are used:

Btax2:5′ AG TCT AGA GCT GAC GTC TCT GTC TG 3′Btax2: 5 ′ AG TCT AGA GCT GAC GTC TCT GTC TG 3 ′

Btax3:5′ ACC TCG AGA TGG CAA GTG TTG TTG GTT GG 3′ [1].Btax3: 5 ′ ACC TCG AGA TGG CAA GTG TTG TTG GTT GG 3 ′ [1].

Известен также способ выявления ДНК провируса лейкоза КРС методами ПЦР в режиме реального времени (RT-PCR) и «гнездовой» ПЦР (nested-PCR). Предлагаемые праймеры, комплементарные области гена роl имеют следующую структуру:There is also a known method for detecting the DNA of cattle leukemia provirus by real-time PCR (RT-PCR) and “nested” PCR (nested-PCR). The proposed primers, complementary regions of the gene ro have the following structure:

Pol (outer, sense) 5′-ATGTTATCAAGCCCTGGCTGC-3′Pol (outer, sense) 5′-ATGTTATCAAGCCCTGGCTGC-3 ′

Pol (outer, antisense) 5′-CTTGGTTGTCAGTCAAGG-3′Pol (outer, antisense) 5′-CTTGGTTGTCAGTCAAGG-3 ′

Pol (nested, sense) 5′-CTACCTTGCAGATCTCATC-3′Pol (nested, sense) 5′-CTACCTTGCAGATCTCATC-3 ′

Pol (nested, antisense) 5′-GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3′Pol (nested, antisense) 5′-GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3 ′

Для использования метода ПЦР в режиме реального времени необходимо вместе с праймерами - Pol (nested, sense) 5′-CTACCTTGCAGATCTCATC-3′ и Pol (nested, antisense) 5′-GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3′ добавлять в реакционную смесь дополнительно синтезированный зонд - Pol (molecular beacon) 5′ (FAM)-CGAGCACACCCACTACCCGCCGGCCGCTCG-dabcyl-3′ с флюоресцентной меткой, благодаря чему и происходит детекция сигнала флюоресценции при применении данного метода. Объем реакционной смеси составляет 100 мкл.To use the real-time PCR method, together with the primers - Pol (nested, sense) 5′-CTACCTTGCAGATCTCATC-3 ′ and Pol (nested, antisense) 5′-GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3 ′, add an additionally synthesized probe - Pol ( molecular beacon) 5 ′ (FAM) -CGAGCACACCCACTACCCGCCGGCCGCTCG-dabcyl-3 ′ with a fluorescent label, due to which the fluorescence signal is detected using this method. The volume of the reaction mixture is 100 μl.

Метод «гнездовой» ПЦР (nested-PCR) подразумевает использование двух пар праймеров (всего четыре праймера) - outer (I раунд) и nested (II раунд). Объем реакционной смеси составляет 50 мкл.The method of "nested" PCR (nested-PCR) involves the use of two pairs of primers (a total of four primers) - outer (I round) and nested (II round). The volume of the reaction mixture is 50 μl.

При постановке ПЦР обоими методами размер продукта на выходе составляет 202 п.н. [2]. Прототип.When setting up PCR by both methods, the output product size is 202 bp. [2]. Prototype.

Известные способы выявления ДНК провируса ВЛКРС: в аналоге не обеспечивали детекцию участка консервативного гена pol провируса ВЛКРС; в прототипе при использовании метода ПЦР в режиме реального времени дополнительно необходим зонд с флюоресцентной меткой, а при использовании метода «гнездовой» ПЦР необходима вторая пара праймеров для обнаружения искомого участка.Known methods for detecting VLCC provirus DNA: in the analogue, they did not provide for the detection of a portion of the conservative VLSC prov pol pol gene; in the prototype, when using the real-time PCR method, a probe with a fluorescent label is additionally required, and when using the “nested” PCR method, a second pair of primers is needed to detect the desired site.

В задачу исследований входило разработать эффективный способ обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР путем конструирования двух специфических олигонуклеотидных праймеров.The research task was to develop an effective method for detecting the DNA of cattle leukemia provirus by PCR by designing two specific oligonucleotide primers.

Поставленную задачу достигают благодаря тому, что для постановки ПЦР в качестве праймеров используют два олигонуклеотида следующей структуры: РF2: 5′-TGA ACG GAC ААА TGG ACT GCT С-3′, РR2: 5′-CCG АСА GAG AGC GAG GAG AG-3′, имеющих следующие характеристики: комплементарность выбранной области гена pol ВЛКРС, отсутствие самокоплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура отжига составляет 66°С для обоих нуклеотидов, GC состав - 50% для РF2 и 65% для РR2, фланкирующих фрагмент консервативного гена pol ВЛКРС размером 438 пар нуклеотидов.The task is achieved due to the fact that two oligonucleotides of the following structure are used as primers for PCR: P F2 : 5′-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3 ′, P R2 : 5′-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG -3 ′, with the following characteristics: complementarity of the selected region of the VLCC pol gene, the absence of self-complementary regions within each primer and between the direct and reverse, the annealing temperature is 66 ° C for both nucleotides, GC composition is 50% for P F2 and 65% for P R2, conservative flanking fragment of the gene pol VLKRS size of 438 base pairs in.

Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы Vector NTI 11 (Invitrogen, США) на основании информации, представленной в базах данных Интернет ресурсов EMBL (Германия), GenBank (США), по генотипам ВЛКРС выбирают референс последовательность - К02120. Для оценки вариабельности и поиска консервативных участков нуклеотидные последовательности различных изолятов выравнивают друг относительно друга с помощью алгоритма ClastalW Multi Sequence Alignment. Поиск в данной последовательности наиболее консервативной области (участка гена pol) и подбор последовательностей, ограничивающих эту область, производят с использованием компьютерной программы BioEdit. Проверка качества, термодинамический анализ выбранных праймеров выполняют с помощью программы OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.4.0. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью web-ресурса Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Оценка специфичности сконструированных праймеров подтвердила гомологичность выбранных праймеров РF2 и PR2 с нуклеотидной последовательностью гена pol и отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 438 пар нуклеотидов.The proposed method consists in the following: using the computer program Vector NTI 11 (Invitrogen, USA) based on the information presented in the Internet resource databases EMBL (Germany), GenBank (USA), the reference sequence K02120 is selected according to the VLCRC genotypes. To assess variability and search for conserved regions, the nucleotide sequences of different isolates are aligned with each other using the ClastalW Multi Sequence Alignment algorithm. Search in this sequence for the most conservative region (pol gene region) and selection of sequences that limit this region are performed using the BioEdit computer program. Quality control, thermodynamic analysis of the selected primers is performed using the OLIGO DNA / RNA primer analysis software, v.4.0. Primers are checked for lack of homology with sequences of other viruses and the human genome by the BLAST program using the web resource of the National Center for Biotechnological Information (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Evaluation of the specificity of the designed primers confirmed the homology of the selected primers P F2 and P R2 with the nucleotide sequence of the pol gene and the absence of significant homology with the nucleotide sequences of other types of viruses. The calculated length of the specific fragment was 438 nucleotide pairs.

При проведении компьютерного анализа выбранных праймеров к участку консервативного провирусного гена pol провируса лейкоза КРС учитывают следующие критерии подбора:When conducting a computer analysis of the selected primers to the site of the conservative proviral pol gene of cattle leukemia provirus, the following selection criteria are taken into account:

- степень гомологии праймеров. Для специфической амплификации участка гена оба праймера (прямой и обратный) должны быть комплементарны выбранной области;- the degree of homology of the primers. For specific amplification of a gene region, both primers (forward and reverse) must be complementary to the selected region;

- отсутствие самокоплементарных участков внутри праймеров и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения очень устойчивых вторичных структур праймера и так называемых «димеров» праймеров, которые блокируют реакцию или приводят к появлению неспецифической амплификации;- the absence of self-complementary regions within the primers and complementarity to each other in order to prevent the emergence of very stable secondary structures of the primer and the so-called "dimers" of the primers that block the reaction or lead to the appearance of non-specific amplification;

- близость значений температуры плавления праймеров. Разница температур отжига прямого и обратного праймеров составляет 3-5°С. Выбор оптимальной температуры отжига праймеров является ключевым параметром среди прочих, влияющих на прохождение реакции амплификации. Завышение Тотж приводит к отсутствию синтеза ампликона и, как следствие - ложноотрицательному результату ПЦР. Занижение Тотж увеличивает вероятность появления неспецифических продуктов амплификации, усложнения анализа результатов ПЦР и интерпретации их как ложноположительных.- the proximity of the melting temperature of the primers. The temperature difference between the annealing of the forward and reverse primers is 3-5 ° C. The choice of the optimal primer annealing temperature is a key parameter among others, affecting the amplification reaction. The overestimation of T otzh leads to the absence of amplicon synthesis and, as a consequence, to the false negative result of PCR. Underestimation of T otzh increases the likelihood of the appearance of nonspecific amplification products, complicating the analysis of PCR results and interpreting them as false positive.

На основании проведенного компьютерного анализа была подобрана пара праймеров: РF2: 5′-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT С-3′, РR2: 5′-CCG АСА GAG AGC GAG GAG AG-3′ для детекции фрагмента гена pol длиной 438 п.н.Based on the computer analysis, a pair of primers was selected: P F2 : 5′-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3 ′, P R2 : 5′-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG-3 ′ for detection of a fragment of the gene pol 438 bp

Характеристика разработанных праймеров приведена в Таблице 1.The characteristics of the designed primers are shown in Table 1.

Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.The synthesis of the developed oligonucleotide primers is ordered at a commercial service center.

Пример 1. Амплификация специфических фрагментов ДНК провируса лейкоза КРС с помощью разработанных праймеров для диагностики лейкоза КРС.Example 1. Amplification of specific DNA fragments of cattle leukemia provirus using developed primers for the diagnosis of cattle leukemia.

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции, с использованием разработанных праймеров. Полимеразную цепную реакции проводят в объеме реакционной смеси - 25 мкл на 1 пробу ДНК. Состав реакционной смеси представлен в Таблице 2. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в Таблице 3.In the process of conducting practical experiments, the optimal conditions for the passage of the polymerase chain reaction are selected using the developed primers. The polymerase chain reaction is carried out in the volume of the reaction mixture - 25 μl per 1 DNA sample. The composition of the reaction mixture is presented in Table 2. The temperature-time regime of the reaction for the Tertsik amplifier (DNA-technology, Russia) is presented in Table 3.

В качестве положительного контроля прохождения полимеразной цепной реакции с использованием разработанных праймеров используют лиофилизированный препарат положительного контрольного антигена (АГ) ВЛ КРС. Препарат получен из вируса, накопленного в вируспродуцирующей культуре клеток почки эмбриона овцы (FLK) (американский штамм вируса - FLK-BLV). Предварительно препарат АГ был испытан в ПЦР анализе с помощью коммерческих наборов для детекции ДНК провируса лейкоза КРС отечественных производителей.As a positive control for the passage of the polymerase chain reaction using the developed primers, a lyophilized preparation of the positive control antigen (AG) of VL cattle is used. The drug was obtained from a virus accumulated in a virus-producing culture of sheep embryonic kidney cells (FLK) (the American strain of the virus is FLK-BLV). Preliminarily, the AH preparation was tested in PCR analysis using commercial kits for the detection of bovine leukemia provirus DNA from domestic manufacturers.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.After the amplification reaction, the PCR products are analyzed by electrophoretic separation in a 1.5% agarose gel with the addition of ethidium bromide.

В процессе ПЦР получены продукты амплификации ДНК провируса лейкоза КРС длиной 438 п.н., что подтверждалось во всех экспериментах. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов. Электрофореграмма результатов полимеразной цепной реакции представлена на Рисунке 1. При учете результатов прохождения ПЦР в первую очередь оценивают контрольные образцы. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю (К+), присутствовала светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность соответствовала длине ампликона 438 п.н. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю (К-), такая полоса отсутствовала. Опытные пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. В электрофоретических дорожках 1-9 присутствовала специфическая полоса на уровне полосы в дорожке К+, что свидетельствовало о наличии провирусной ДНК ВЛКРС.In the PCR process, amplification products of cattle leukemia provirus DNA of 438 bp were obtained, which was confirmed in all experiments. This indicates the reproducibility of the results of the experiments. The electrophoregram of the results of the polymerase chain reaction is shown in Figure 1. When taking into account the results of PCR, the control samples are primarily evaluated. In the electrophoretic track corresponding to the positive control (K +), a luminous band was present. Its electrophoretic mobility corresponded to an amplicon length of 438 bp. In the electrophoretic track corresponding to the negative control (K-), such a band was absent. Experimental samples are evaluated by the presence in the corresponding lane of a specific band, which was located at the same level as the band in the positive control sample. In electrophoretic lanes 1–9, a specific band was present at the level of the band in the K + lane, indicating the presence of proviral VLCRS DNA.

Пример 2. Определение чувствительности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров.Example 2. Determination of the sensitivity of the amplification reaction using the developed specific oligonucleotide primers.

Анализировали пробы ДНК, выделенные из десятикратных разведений суспензии клеток FLK (вируспродуцирующая культура клеток почки эмбриона овцы (FLK), хронически инфицированная вирусом лейкоза КРС). Последним разведением, в котором обнаруживалась специфическая полоса на электрофореграмме, считается разведение 104, что составляет 1,8×104 коп/мл. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на Рисунке 2.DNA samples were analyzed that were isolated from ten-fold dilutions of a suspension of FLK cells (a virus-producing culture of sheep embryonic kidney cells (FLK) chronically infected with cattle leukemia virus). The last dilution in which a specific band was detected on the electrophoregram is considered a dilution of 10 4 , which is 1.8 × 10 4 kopecks / ml. The electrophoregram of the PCR results is shown in Figure 2.

Пример 3. Определение специфичности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров. Example 3. Determination of the specificity of the amplification reaction using the developed specific oligonucleotide primers.

Специфичность проверяли на образцах провирусной ДНК FLK-BLV, выделенной из лиофилизированного препарата положительного контрольного АГ ВЛКРС, который получен из вируса, накопленного в вируспродуцирующей культуре клеток почки эмбриона овцы (FLK) (американский штамм ВЛКРС - FLK-BLV), положительных образцах, содержащих провирусную ДНК вируса иммунодефицита КРС (ВБИ, BIV), а также образцах от интактных и серонегативных коров. Положительный результат в ПЦР получали только с образцами ДНК, при отсутствии продукта амплификации с другими пробами. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на Рисунке 3.Specificity was tested on samples of FLK-BLV proviral DNA isolated from a lyophilized preparation of a positive control VLKRS AG, which was obtained from a virus accumulated in a virus-producing culture of sheep embryonic kidney cells (FLK) (American VLKRS strain - FLK-BLV), positive samples containing proviral Bovine immunodeficiency virus DNA (VBI, BIV), as well as samples from intact and seronegative cows. A positive result in PCR was obtained only with DNA samples, in the absence of an amplification product with other samples. The electrophoregram of the PCR results is shown in Figure 3.

Как видно из вышеописанных примеров, предложенный способ позволяет детектировать на ранних стадиях высококонсервативную область гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота. Выбор высококонсервативной области гена pol позволяет повысить чувствительность способа диагностики лейкоза КРС. Использование предлагаемых специфических праймеров дает возможность в дальнейшем определить первичную нуклеотидную последовательность полученных фрагментов ДНК методом автоматического секвенирования с применением этих же праймеров и для секвенирования.As can be seen from the above examples, the proposed method allows to detect in the early stages of the highly conserved region of the pol gene of provirus leukemia in cattle. The choice of a highly conservative region of the pol gene makes it possible to increase the sensitivity of the method for diagnosing cattle leukemia. Using the proposed specific primers makes it possible to further determine the primary nucleotide sequence of the obtained DNA fragments by automatic sequencing using the same primers for sequencing.

Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является достоверный, высокочувствительный и высокоспецифичный способ выявления фрагмента провирусной ДНК ВЛКРС в биологическом материале в короткие сроки.The technical result to which this invention is directed is a reliable, highly sensitive and highly specific method for detecting a fragment of proviral VLCCR DNA in biological material in a short time.

Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2010 году на 97 пробах ДНК, полученных из крови животных некоторых хозяйств Московской, Ростовской, Вологодской, Калужской, Тульской, Рязанской областей, республики Калмыкия, Алтайского края. Работу проводили на базе лаборатории лейкозологии ГНУ ВНИИЭВ им Я.Р.Коваленко совместно с ГНУ ВНИИВВиМ (г.Покров).The proposed method was tested with positive results and regular reproducibility of these results in 2010 on 97 DNA samples obtained from the blood of animals of some farms in Moscow, Rostov, Vologda, Kaluga, Tula, Ryazan regions, the Republic of Kalmykia, Altai Territory. The work was carried out on the basis of the leukemology laboratory of GNU VNIIEV named after Y.R. Kovalenko together with GNU VNIIIVViM (Pokrov).

Предлагаемый способ может быть использован как в диагностике инфекционных заболеваний животных, так и в научных исследованиях для обнаружения генетического материала вируса лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции в пробах ДНК, выделенных из крови животных.The proposed method can be used both in the diagnosis of infectious diseases of animals and in scientific research for the detection of the genetic material of the cattle leukemia virus by polymerase chain reaction in DNA samples isolated from animal blood.

Источники информацииInformation sources

1. Патент - US 6646116 B1, 11.11.2003, C07/H 21/04.1. Patent - US 6646116 B1, 11.11.2003, C07 / H 21/04.

2. Журнал - Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (J Vet Diagn Invest). 2003, Vol.15, 72-76. USA.2. Journal - Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (J Vet Diagn Invest). 2003, Vol. 15, 72-76. USA

Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация:The invention is illustrated by tables and figures, which display the following information:

Таблица 1Table 1 Характеристика разработанных праймеров для детекции ДНК провируса лейкоза КРСCharacteristics of the developed primers for the detection of cattle leukemia provirus DNA НазваниеTitle 5′-3′ Последовательность5′-3 ′ sequence Тотж. °С /, GC состав, % / кол-во залипанийT otzh. ° C /, GC composition,% / number of sticks Локализация в гене роl (К02120)Localization in the ro gene (K02120) Длина продукта п.н.Product Length РF2 P F2 5′-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT С-3′5′-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3 ′ 66/50/--66/50 / - 4470-44914470-4491 438438 PR2 P R2 5′-CCG АСА GAG AGC GAG GAG AG-3′5′-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG-3 ′ 66/65/--66/65 / - 4888-49074888-4907

Таблица 2table 2 Состав реакционной смесиThe composition of the reaction mixture КомпонентыComponents Объем на 1 реакцию (25 мкл), мклVolume per reaction (25 μl), μl Буфер ПЦР (15 мМ MgCl)PCR buffer (15 mM MgCl) 55 дНТФ(10 мМ)dNTP (10 mm) 1one праймер РF2 (10 пмоль/мкл)primer P F2 (10 pmol / μl) 1one праймер РR2(10 пмоль/мкл)primer P R2 (10 pmol / μl) 1one Полимераза Taq (5 ед./мкл)Taq Polymerase (5 units / μl) 0,20.2 Вода (бидистиллированная)Water (bidistilled) 11,811.8 Проба ДНКDNA sample 55

Таблица 3Table 3 Температурно-временной режим проведения ПЦРTemperature-time regimen for PCR ЭтапыStages Температура,Temperature, ВремяTime Кол-воQty 1one 9595 3 минуты3 minutes 1one 22 9494 20 секунд20 seconds 3535 6262 30 секунд30 seconds 7272 1 минута1 minute 33 7272 3 минуты3 minutes 1one 4four 1010 хранениеstorage

Claims (1)

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции, включающий прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что использует в качестве праймеров олигонуклеотиды следующей структуры - РF2: 5'-TGA ACG GAC ААА TGG ACT GCT С-3'; РR2: 5'-CCG АСА GAG AGC GAG GAG AG-3', которые имеют следующие характеристики: отсутствие самокоплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура отжига составляет 66°С для обоих олигонуклеотидов, GC состав - 50% для РF2 и 65% для РR2 и фланкируют область консервативного гена ро1 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 438 пар нуклеотидов высококонсервативного гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота. A method for the diagnosis of cattle leukemia by polymerase chain reaction, including direct and reverse oligonucleotide primers for detecting a pol gene fragment of the cattle leukemia provirus, electrophoretic determination of the size of the amplified fragment of the nucleotide sequence, characterized in that it uses oligonucleotides of the following structure as primers - P F2 : 5'-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3 '; P R2 : 5'-CCG ACA GAG AGC GAG GAG AG-3 ', which have the following characteristics: the absence of self-complementary regions within each primer and between direct and reverse, the annealing temperature is 66 ° C for both oligonucleotides, GC composition is 50% for P F2 and 65% for P R2 and flank the region of the conserved gene p1 of the leukemia virus of cattle, size 438 pairs of nucleotides of the highly conserved pol gene of the provirus leukemia of cattle.
RU2010143998/10A 2010-10-28 2010-10-28 Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction RU2445370C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010143998/10A RU2445370C1 (en) 2010-10-28 2010-10-28 Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010143998/10A RU2445370C1 (en) 2010-10-28 2010-10-28 Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2445370C1 true RU2445370C1 (en) 2012-03-20

Family

ID=46030122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010143998/10A RU2445370C1 (en) 2010-10-28 2010-10-28 Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2445370C1 (en)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2521330C2 (en) * 2012-06-15 2014-06-27 Государственное научное учреждение Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии) Method for detecting bovine leukemia virus by nucleotide sequences of conserved regions of viral genome
RU2558252C2 (en) * 2013-08-01 2015-07-27 Государственное научное учреждение Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт (УрНИВИ) Method of detecting provirus of cattle leukosis
RU2566071C2 (en) * 2013-07-25 2015-10-20 Государственное науное учреждение Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт (УрНИВИ) Method of preparing biomaterial for pcr diagnostics of bovine leukaemia virus (blv)
RU2615465C2 (en) * 2015-07-31 2017-04-04 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" Diagnostic system for detection of cattle leukemia and immune deficiency provirus dna by multiplex polymerase chain reaction
RU2644233C2 (en) * 2016-03-15 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" Method for leukosis diagnosis in cattle
RU2694617C1 (en) * 2018-05-04 2019-07-16 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Method for diagnosis of cattle leukemia by polymerase chain reaction
RU2700245C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-13 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Method for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv)
RU2700450C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv)
RU2722137C1 (en) * 2018-12-05 2020-05-26 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр"(ФГБНУ "Северо-Кавказский ФНАЦ") Method for diagnosis of cattle leukaemia using pcr in real time

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГЕРИЛОВИЧ А.П., ЛИМАНСКАЯ О.Ю. Разработка праймеров для изучения вариабельности гена pol вируса лейкоза крупного рогатого скота. - Харьков: Ветеринарная медицина, вып.88, с.65-69. ГУЛЮКИН М.И. и др. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления вируса лейкоза КРС. - Харьков: Ветеринарная медицина, вып.92, с.145-150. *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2521330C2 (en) * 2012-06-15 2014-06-27 Государственное научное учреждение Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ЦЭЭРБ Россельхозакадемии) Method for detecting bovine leukemia virus by nucleotide sequences of conserved regions of viral genome
RU2566071C2 (en) * 2013-07-25 2015-10-20 Государственное науное учреждение Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт (УрНИВИ) Method of preparing biomaterial for pcr diagnostics of bovine leukaemia virus (blv)
RU2558252C2 (en) * 2013-08-01 2015-07-27 Государственное научное учреждение Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт (УрНИВИ) Method of detecting provirus of cattle leukosis
RU2615465C2 (en) * 2015-07-31 2017-04-04 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" Diagnostic system for detection of cattle leukemia and immune deficiency provirus dna by multiplex polymerase chain reaction
RU2644233C2 (en) * 2016-03-15 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" Method for leukosis diagnosis in cattle
RU2694617C1 (en) * 2018-05-04 2019-07-16 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" Method for diagnosis of cattle leukemia by polymerase chain reaction
RU2700245C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-13 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Method for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv)
RU2700450C1 (en) * 2018-10-01 2019-09-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" Test system for detecting provirus dna of bovine leukosis virus (blv)
RU2722137C1 (en) * 2018-12-05 2020-05-26 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр"(ФГБНУ "Северо-Кавказский ФНАЦ") Method for diagnosis of cattle leukaemia using pcr in real time

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2445370C1 (en) Diagnostic technique for cattle leukaemia by polymerase chain reaction
Yapar et al. Rapid and quantitative detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus by one-step real-time reverse transcriptase-PCR
CN110791590B (en) Dual real-time fluorescence detection primer probe set, kit and method for genes VP72 and CD2V of African swine fever virus
CN107988325B (en) RAA constant temperature fluorescence detection method and reagent for shrimp liver Enterocytozoon (EHP)
CN101611155B (en) Diagnostic sequences for shrimp pathogens
US11434529B2 (en) PCR assays for specific detection of enterocytozoon hepatopenaei
CN110699489B (en) Real-time fluorescence PCR detection primer probe set, kit and method for African swine fever virus CD2V gene
US10689718B2 (en) HEV Assay
Lew et al. Sensitive and specific detection of proviral bovine leukemia virus by 5′ Taq nuclease PCR using a 3′ minor groove binder fluorogenic probe
CN110699490A (en) RAA constant-temperature fluorescence detection primer probe set, kit and method for African swine fever virus CD2V gene
WO2009098789A1 (en) Method of detecting pathogenic virus in crustacean by lamp method and reagent kit for detection
US9617606B2 (en) Oligonucleotide for HIV detection, HIV detection kit, and HIV detection method
CN101487064B (en) Method and special reagent kit for detecting five zoonosis virus
RU2550257C2 (en) METHOD OF DIFFERENTIATING TYPICAL AND ATYPICAL STRAINS Yersinia pestis OF MEDIEVAL BIOVAR BY PCR METHOD WITH HYBRIDISATION-FLUORESCENT RECORDING RESULTS
Kim et al. Rapid detection of deformed wing virus in honeybee using ultra-rapid qPCR and a DNA-chip
Koiwai et al. Rapid diagnosis of three shrimp RNA viruses using RT-PCR-DNA chromatography
CN111647690B (en) RT-RAA primer pair and diagnostic kit for detecting COVID-19 virus
RU2615465C2 (en) Diagnostic system for detection of cattle leukemia and immune deficiency provirus dna by multiplex polymerase chain reaction
CN101423874B (en) Foot-and-mouth disease virus multiple RT-PCR detection kit, preparation method thereof and application
CN110592269A (en) RAA constant-temperature fluorescence detection method and reagent for grass carp hemorrhagic disease type 2 virus (GCRV-2)
Ren et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of acute viral necrobiotic virus in scallop Chlamys farreri.
KR102076343B1 (en) Composition for detecting adenovirus type 55 using Real-time LAMP and uses thereof
RU2644233C2 (en) Method for leukosis diagnosis in cattle
Agnihotri et al. Comparative evaluation of immunochromatographic and reverse transcriptase polymerase chain reaction based tests for diagnosis of canine distemper
RU2824666C1 (en) Oligonucleotide primers for detecting bovine enzootic leukaemia virus by polymerase chain reaction