RU2265445C1 - Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases - Google Patents
Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases Download PDFInfo
- Publication number
- RU2265445C1 RU2265445C1 RU2004114504/15A RU2004114504A RU2265445C1 RU 2265445 C1 RU2265445 C1 RU 2265445C1 RU 2004114504/15 A RU2004114504/15 A RU 2004114504/15A RU 2004114504 A RU2004114504 A RU 2004114504A RU 2265445 C1 RU2265445 C1 RU 2265445C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- culture
- biograft
- suspension
- tissue
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение касается приготовления культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток и способа лечения заболеваний пародонта.The invention relates to the preparation of a culture of genetically unmodified chondroprogenic cells and a method for the treatment of periodontal diseases.
Заболевания пародонта продолжают оставаться одной из самых актуальных проблем стоматологии. По данным разных авторов, к 25-30 годам до 50% населения имеют ту или иную форму поражения тканей пародонта. Одной из наиболее распространенных форм является пародонтит, который начинается с инициального поражения краевой части десны, с последующим вовлечением в патологический процесс всех структур пародонта. Хронический пародонтит характеризуется прогрессирующим течением с резорбцией костной ткани альвеолярного отростка, гибелью удерживающего аппарата зуба и выпадением (удалением) последнего. Существующие методы местной противовоспалительной терапии не всегда эффективны и не способствуют восстановлению костной ткани альвеолярных отростков. Следовательно, необходим поиск новых средств для лечения хронического пародонтита, направленных на активную репарацию воспалительно-деструктивных повреждений.Periodontal disease continues to be one of the most pressing problems of dentistry. According to various authors, by 25-30 years, up to 50% of the population have some form of periodontal tissue damage. One of the most common forms is periodontitis, which begins with an initial lesion of the marginal part of the gums, followed by the involvement of all periodontal structures in the pathological process. Chronic periodontitis is characterized by a progressive course with resorption of the bone tissue of the alveolar process, death of the retaining apparatus of the tooth and loss (removal) of the latter. Existing methods of local anti-inflammatory therapy are not always effective and do not contribute to the restoration of bone tissue of the alveolar processes. Therefore, it is necessary to search for new drugs for the treatment of chronic periodontitis, aimed at the active repair of inflammatory and destructive injuries.
Современные методы лечения пародонтита заключаются не только в устранении периодонтальной инфекции, но и в проведении репаративного остеосинтеза с использованием разнообразных остеопластических материалов. Эти методы достаточно широко используются на современном пародонтологическом приеме, для того чтобы добиться эффективной регенерации тканей пародонта, так как существует возможность восстановление цемента корня зуба, пародонтальной связки и альвеолярной кости. К сожалению, добиться полной регенерации тканей пародонта до настоящего времени еще не представлялось возможным.Modern methods of treatment of periodontitis are not only to eliminate periodontal infection, but also to conduct reparative osteosynthesis using a variety of osteoplastic materials. These methods are quite widely used in modern periodontics, in order to achieve effective regeneration of periodontal tissues, since there is the possibility of restoration of cement of the root of the tooth, periodontal ligament and alveolar bone. Unfortunately, to date, complete regeneration of periodontal tissues has not yet been possible.
В последнее время в стоматологической практике, наряду с такими остеопластическими препаратами как гидроксиапатит и коллаген, получает широкое распространение использование клеток-предшественников остеоцитов - мезенхимальных стволовых и хондропрогенеторных клеток в качестве заместительной клеточной терапии, для стимуляции направленной регенерации переодонтальных тканей.Recently, in dental practice, along with osteoplastic drugs such as hydroxyapatite and collagen, the use of osteocyte precursor cells - mesenchymal stem and chondro-progenitor cells as cell replacement therapy, to stimulate directed regeneration of periodontal tissues is widespread.
Лечение различных форм пародонтоза включает в себя консервативные и хирургические методы терапии. Консервативное лечение пародонтоза предусматривает ликвидацию местных патогенных факторов, удаление зубного камня, зубов с подвижностью III-IV степени, замену некачественного наложения пломб, коронок, мостовидных протезов. Для лечения воспаленных тканей десен используются средства, направленные на подавление смешанной патогенной микрофлоры десневых карманов. Значительное место в комплексной терапии пародонтоза отводится хирургическому лечению: кюретажу, гингивотимнии, гингивоэктомии и др. Из существующих в настоящее время методов лечения пародонтита хирургический тактика считается самой эффективной, так как радикально решает проблему, связанную с деструктивными изменениями костной ткани. Такие изменения - результат резорбции из кости солей кальция и следствие воспалительного процесса в пародонтальных карманах. В итоге дефекты костной ткани заполняются патологическими тканями - грануляциями, наличие которых, в свою очередь, приводит к еще более быстрому рассасыванию кости. Ситуация усугубляется тем, что при неблагоприятных условиях грануляции способны перерождаться в пародонтальные кисты. Во время хирургической операции нездоровая ткань удаляется, а костные дефекты заполняются различными остеопластическими материалами. Эти вещества стимулируют костеобразование, значительно улучшают восстановительные процессы в поврежденных тканях, способствуют быстрому заживлению и восстановлению костной структуры, а также обладают противовоспалительным действием.Treatment of various forms of periodontal disease includes conservative and surgical methods of therapy. Conservative treatment of periodontal disease involves the elimination of local pathogenic factors, the removal of tartar, teeth with mobility of the III-IV degree, the replacement of poor-quality fillings, crowns, bridges. For the treatment of inflamed gum tissue, agents are used to suppress the mixed pathogenic microflora of the gingival pockets. A significant place in the complex therapy of periodontal disease is given to surgical treatment: curettage, gingivotymnia, gingiveectomy, etc. Of the currently existing methods of treatment of periodontitis, surgical tactics are considered the most effective, since they radically solve the problem associated with destructive changes in bone tissue. Such changes are the result of resorption of calcium salts from the bone and a consequence of the inflammatory process in periodontal pockets. As a result, defects in bone tissue are filled with pathological tissues - granulations, the presence of which, in turn, leads to even faster bone resorption. The situation is aggravated by the fact that under adverse conditions, granulation can degenerate into periodontal cysts. During surgery, unhealthy tissue is removed, and bone defects are filled with various osteoplastic materials. These substances stimulate bone formation, significantly improve the recovery processes in damaged tissues, contribute to the rapid healing and restoration of bone structure, and also have anti-inflammatory effects.
В настоящие время для регенерации костной ткани широко используются различные биологические и синтетические материалы, в том числе с применением ауто- и аллогенных фибробластов, клеточных элементов костного мозга и др., с целью направленной остеорегенерации (Ashton et al., 1980. Aston et al., 1986. Brittberg et al., 1994). Как показано рядом авторов, используемые биологические и синтетические материалы не вызывают достаточной стимуляции репаративных процессов для восстановления структуры и функции костной ткани пародонта (Coletty et al., 1972. Furukawa et al., 1980).Currently, various biological and synthetic materials are widely used for bone tissue regeneration, including the use of auto- and allogeneic fibroblasts, bone marrow cell elements, etc., for the purpose of directed osteoregeneration (Ashton et al., 1980. Aston et al. , 1986. Brittberg et al., 1994). As shown by several authors, the used biological and synthetic materials do not cause sufficient stimulation of reparative processes to restore the structure and function of periodontal bone tissue (Coletty et al., 1972. Furukawa et al., 1980).
Известные способы получения хондропрогениторных клеток человека из фетальной хрящевой ткани, полученной на разных сроках гестации, включают в себя последовательную механическую и ферментативную дезагрегацию исходной хрящевой ткани с использованием различных ферментных растворов и их комбинации (коллагеназа, проназа, гиалуронидаза, деоксирибонуклеаза и др.) в различных концентрациях. В зависимости от способов дезагрегации можно получать различное количество клеток с необходимым фенотипом и различное количество жизнеспособных клеток от 50 до 80%. Для культивирования хондропрогениторных клеток используются как не покрытые носителями чашки Петри, культуральные флаконы, так и на различных неселективных подложках из коллагена, агарозы и др. (Brittberg et al., 1994. Fuchs et al., 2002). Перечисленные способы культивирования клеток в монослое не позволяют осуществлять более 2-3 пассажей без потери фенотипа хондропрогениторных клеток, которые дедифференцируются в фибробластоподобные клетки. Известны способы культивирование хондропрогениторных клеток в суспензии с использованием различных трехмерных носителей (альгинат, полигликолид, полилактат, ателоколлаген), что позволяет вести культуру более длительное время без потери фенотипа клеток (Kimura et al., 1984. Matsusaki et al., 1998).Known methods for producing human chondroprogenitor cells from fetal cartilage tissue obtained at different gestation periods include sequential mechanical and enzymatic disaggregation of the original cartilage tissue using various enzyme solutions and their combination (collagenase, pronase, hyaluronidase, deoxyribonuclease, etc.) in various concentrations. Depending on the methods of disaggregation, you can get a different number of cells with the necessary phenotype and a different number of viable cells from 50 to 80%. For the cultivation of chondroprogenitor cells, non-coated Petri dishes, culture bottles, and various non-selective substrates from collagen, agarose, etc. are used (Brittberg et al., 1994. Fuchs et al., 2002). The listed methods of culturing cells in a monolayer do not allow for more than 2-3 passages without loss of the phenotype of chondroprogenitor cells, which are dedifferentiated into fibroblast-like cells. Known methods for the cultivation of chondroprogenitor cells in suspension using various three-dimensional carriers (alginate, polyglycolide, polylactate, atelocollagen), which allows you to conduct culture for a longer time without losing the phenotype of the cells (Kimura et al., 1984. Matsusaki et al., 1998).
Хондропрогениторные клетки, получаемые из фетальной хрящевой ткани путем последовательной дезагрегации и культивирования в селективных средах при трансплантации с высокой эффективностью, пролиферируют, мигрируют, встраиваются в очаг повреждения, дифференцируются в остеоциты, в зависимости от микроокружения, синтезируют внеклеточный матрикс, стимулируют ангиогенез (Патент RU 2160112, 12.10.2000).Chondroprogenitor cells obtained from fetal cartilage by sequential disaggregation and cultivation in selective media during transplantation with high efficiency proliferate, migrate, integrate into the lesion, differentiate into osteocytes, depending on the microenvironment, synthesize extracellular matrix, stimulate angiogenesis (Patent RU 21 , 10/12/2000).
Регенерация костной ткани при повреждении и системной резорбции происходит за счет мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые являются предшественниками остеобластов и способствуют формированию ремоделирующих единиц. В настоящее время использование МСК для системной и местной регенерации костной ткани находит все большее применение. Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми (S.J.Forbes et al., 2002). Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.Bone tissue regeneration during damage and systemic resorption occurs due to mesenchymal stem cells (MSCs), which are the precursors of osteoblasts and contribute to the formation of remodeling units. Currently, the use of MSCs for systemic and local regeneration of bone tissue is increasingly used. Mesenchymal stem cells are mainly derived from donor bone marrow, but there are other sources - skeletal muscle, subcutaneous adipose tissue, fetal organs of hematopoiesis (liver, thymus, spleen). MSCs from fetal organs of hematopoiesis and methods for their preparation are practically not studied. The described methods for growing MSCs from bone marrow and lipoaspirates make it possible to obtain heterogeneous populations of stromal cells, only a small percentage of which are stem cells (S. J. Forbes et al., 2002). The cells of the mature stroma do not possess the property of differentiating into different cell lines and, thus, are therapeutically ineffective. After transplantation, stromal cells migrate mainly to the connective tissue and accumulate there. With standard passage at high inoculum doses, the proportion of mature stromal cells increases rapidly.
Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.The use of a homogeneous (at least 80%) population of pluripotent MSCs as a transplant allows to increase the effectiveness of treatment, increase the reproducibility of the results and avoid undesirable effects.
Задачей настоящего изобретения является получение гомогенных культуры мезенхимальных стволовых и хондропрогенеторных клеток для имплантации с целью направленной остеорегенерации при заболеваниях пародонта с целью повышения эффективности лечения.The objective of the present invention is to obtain a homogeneous culture of mesenchymal stem and chondrogenetic cells for implantation with the aim of directed osteoregeneration in periodontal diseases in order to increase the effectiveness of treatment.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.To solve this problem, a group of inventions is proposed, united by a common inventive concept.
Предложен биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, представляющий собой суспензию хондропрогениторных клеток человека, включающую культуру генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека, содержащую аггрекон и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, полученную из гиалиновой хрящевой ткани эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности и селективно размноженную в условиях культивирования.A biotransplant is proposed for the treatment of periodontal diseases, which is a suspension of human chondroprogenitor cells, including a culture of genetically unmodified human chondroprogenitor cells, containing at least 80% aggrecon and collagen II expressing cells, obtained from the hyaline cartilage tissue of human embryos of the 1-2 trimester of pregnancy and selectively propagated under cultivation conditions.
Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.The biograft contains a freshly prepared culture.
Биотрансплантат может содержать клеточную культуру криоконсервированную, с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксид.A biograft can contain a cryopreserved cell culture using dimethyl sulfoxide as a cryoprotectant.
Предложен способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают и ферментативно дезагрегируют в течение 40-90 минут, полученную суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×106 кл/мл и культивируют на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В и факторы роста, при достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина, при этом плотность посева не менее 10×105 кл/мл, а культивирование ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% СО2.A method for producing a biograft for the treatment of periodontal diseases is proposed, consisting in the fact that the cartilage tissue of human embryos of 1-2 trimesters of pregnancy is washed, crushed and enzymatically disaggregated for 40-90 minutes, the resulting suspension of primary dissociated chondrogenic cells is seeded with a density of at least 1 × 10 6 cells / ml and cultured on DMEM / F12 growth medium containing 10% fetal calf serum, 1% ITS (insulin, transferin, selenite), 50 μg / ml ascorbic acid, 10 μg / ml gentamicin, 5 μg / ml ampho tericin B and growth factors, when a cell culture of a confluent state is reached, they are passaged using a trypsin solution, with a seeding density of at least 10 × 10 5 cells / ml, and cultivation is carried out for 18-25 days at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Дезагрегацию ткани проводят путем инкубирования ее ферментом в растворе, содержащем 0,01-0,15% раствор коллагеназы и 0,05-0,1% раствор проназы Е в соотношении 1:1.Tissue disaggregation is carried out by incubating it with an enzyme in a solution containing 0.01-0.15% collagenase solution and 0.05-0.1% pronase E solution in a ratio of 1: 1.
Пассируют культуру не более 2-х раз.Passport culture no more than 2 times.
Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток культивируют на непокрытых носителями чашках Петри.A suspension of primary dissociated cartilage cells is cultured on bare Petri dishes.
Предложен также биотрансплантат для лечения заболеваний пародонта, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, или донорского материала, или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.A biotransplant is also proposed for the treatment of periodontal diseases, containing mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal or donor material, or from the recipient's own tissues, while the tissue is disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended and cultured on a growth medium containing transferrin, insulin, fibroblast growth factor and heparin before mature stroma cells accumulate in the culture.
В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.The following tissues are used as fetal material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue of human embryos of the 1st trimester of pregnancy.
В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.The following tissues are used as donor material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue.
Для получения аутологичных МСК используют ткани: костный мозг, жировая ткань.To obtain autologous MSCs, tissues are used: bone marrow, adipose tissue.
Предложен способ получения биотрансплантата для лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см2 и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO2, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина, и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.A method for producing a biograft for the treatment of periodontal diseases is proposed, namely, mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal, donor or autologous material are enzymatically disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum and 2 mM glutamine, hereinafter seeded at seeding 1-20 million. mononuclear cells per 1 cm 2 and incubated at 37 ° C under 5% CO 2, upon reaching 50% confluence culture monolayer trip iniziruyut and replated at a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in growth medium containing 10 ug / ml transferrin, 1 microgram / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 units / mL heparin, and with increasing seed dose cultivation lead to the accumulation of mature stroma in the culture.
Предложен способ лечения заболеваний пародонта, заключающийся в том, что используют суспензию мезенхимальных стволовых или хондропрогениторных клеток или их комбинацию в соотношении 1:1, содержащей 1-50 млн кл/мл, вводят итралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба и поднадкостнично в пародонтальные участки верхней и нижней челюстей.A method for the treatment of periodontal diseases is proposed, which consists in using a suspension of mesenchymal stem or chondroprogenitor cells or a combination of 1: 1, containing 1-50 million cells / ml, is administered itraligamentally from the lateral and medial sides of each tooth and subperiostally to the periodontal areas upper and lower jaws.
Один из объектов - культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека. Культура получена из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2 триместра беременности и содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток. Второй объект - способ получения хондропрогениторных клеток. Хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течении 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1% раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×106 кл/мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.One of the objects is the culture of genetically unmodified human chondroprogenitor cells. The culture was obtained from the hyaline cartilage of human embryos of 1-2 trimesters of pregnancy and contains aggrecan and collagen II-expressing cells of at least 80% and not more than 20% of impurity cells. The second object is a method for producing chondroprogenitor cells. Cartilage tissue of human embryos of the 1-2 trimester of pregnancy is washed, mechanically crushed and subjected to enzymatic disaggregation for 40-90 minutes in a solution containing 0.01-0.1% type II collagenase solution, 0.05-0.1% pronase solution E. Suspension of primary dissociated chondroprogenitor cells is seeded with a density of at least 1 × 10 6 cells / ml and cultured in a medium containing DMEM / F12 growth medium, 10% fetal calf serum supplemented with growth additives and growth factors.
Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 1×106 кл/мл.The environment is repeatedly changed. Upon reaching the cell culture of the confluent state, passaging is carried out using a trypsin solution to disaggregate the monolayer. Sowing density - 1 × 10 6 cells / ml.
Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% СО2. Пассируют культуру не более двух раз.Cells are cultured for 18-25 days at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Passport culture no more than two times.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Для приготовления биотрансплантата используется фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм3. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.For the preparation of a biograft, fetal abortive material is used, obtained by artificially aborting pregnancy in healthy women previously examined for the presence of viral and bacterial infections. Fetal material is transferred into a sterile vessel with a solution of Hanks and gentamicin (80 mg / l). Further work is done under sterile conditions in a laminar box. The cartilaginous tissue extracted with the help of surgical instruments is thoroughly washed from blood clots, and all soft tissues (skin, fascia, muscles, tendons, ligaments) and bone tissue are maximally separated. The resulting cartilage is crushed to pieces of at least 1 mm 3 . Then subjected to enzymatic and mechanical disaggregation - the release of cellular elements from the tissue matrix.
Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1% раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma), в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течении 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе, последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 оборотов в минуту. Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из фетальной хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит. НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGFβ1 (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05% раствора трипсина для дезагрегации монослоя, той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×105 кл/мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменении фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.The method of disaggregation consists in using a 0.1% type II collagenase solution (Sigma), a 0.05% pronase E solution (Sigma), in one-stage incubation of cartilage tissue pieces for 40-90 min in a two-component (1: 1) enzyme solution, subsequent grinding by repeated pipetting to obtain a unicellular suspension. The resulting suspension is washed three times by centrifugation at 700 rpm. A suspension of primary dissociated cartilage cells obtained from fetal cartilage tissue was cultured on uncovered Petri culture plates in medium containing DMEM + F12 growth medium (1: 1, Gibco BRL), 10% fetal calf serum (NPE PanEco), 1% ITS (insulin, transferrin, selenite. NPE PanEco), 50 μg / ml ascorbic acid (Sigma), 10 μg / ml gentamicin, 5 μg / ml amphotericin B with the addition of growth factors 5-20 ng / ml bFGF (Sigma) and / or 0.1-10 ng / ml TGFβ 1 (Sigma). The environment is replaced every 3 days. When the cell culture reaches a confluent state, passaging should be performed using a 0.05% trypsin solution to disaggregate the monolayer of the same culture medium with a culture density of at least 10 × 10 5 cells / ml. It is possible to carry out no more than two passages due to dedifferentiation and a change in the phenotype (reduction in the number of aggrecan and collagen II-expressing cells) of the resulting cells.
Для приготовления биотрансплантата используются культуры мезенхимальная стволовых клеток. МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань), донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) или аутологичных (косный мозг, жировая ткань) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.Mesenchymal stem cell cultures are used to prepare the biograft. MSCs with a primary ability for osteogenic differentiation are isolated from fetal (bone marrow, thymus, liver, adipose tissue), donor (bone marrow, adipose tissue, thymus) or autologous (oblique, adipose tissue) tissues. To isolate fetal cells using abortive material obtained by artificial termination of pregnancy in healthy women, previously examined for the presence of viral and bacterial infections.
Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см2 в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO2. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см2 и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.The possibility of using biomaterial is achieved at the following gestational periods: liver - 5-8 weeks, thymus - 18-20 weeks, bone marrow - 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue - 17-19 weeks. If the cells are not extracted from aspirates (bone marrow, lipoaspirate), but from dense tissues such as the thymus, the organ is preliminarily crushed and enzymatically disaggregated. The suspension is filtered through a fine mesh stainless steel sieve. The cell suspension (aspirate) is diluted 1: 1 with Hanks saline, centrifuged in 1,500 × g mode, 10 minutes and resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum, selected for cell growth in low density, 2 mm glutamine. A cell suspension is plated on plastic Petri dishes with a diameter of 100 mm. The seeding density of the primary cell suspension is 1-20 million mononuclear cells per 1 cm 2 depending on the source of excretion. After 1 day, non-adherent cells are removed, the growth medium is replaced. The cultures are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . After 6 days, growth of heterogeneous cell populations is observed. Once the culture reaches 50% confluency, the monolayer is trypsinized and replanted onto new plates with a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in a growth medium additionally containing 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin. After 7-10 days, dense colonies of small cells (7-10 microns in diameter) with a large number of mitoses are selected. The selected colonies are seeded in new plates with a density of 20 cells / cm 2 and grown to a state of pre-confluency. The medium is replaced every 2 days. Subsequent passages are made in the same mode. An increase in the seeding dose or a change in the composition of the growth medium leads to the rapid accumulation of mature stroma cells in the culture.
Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов.Experimentally selected conditions, combining the criteria for selecting the initial biomaterial and the cultivation mode, are optimal for achieving the following results.
Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.The system of sequential enzymatic disaggregation of the original tissue allows you to get the maximum number of viable cells of the same phenotype with a small admixture of heterotopic cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток.The cultivation mode and selective culture media allow the maximum increase in the number of aggrecan and collagen II-expressing cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%.The cultivation mode and selective culture media make it possible to obtain a homogeneous cell culture containing at least 80% aggrecan and collagen II-expressing cells.
Система отбора источников получения МСК позволяет получить культуры клеток с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке.The selection system for the sources of MSCs allows to obtain cell cultures with a primary ability for osteogenic differentiation.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.The cultivation mode and selective culture media allow for repeated passage to maximize the homogeneous cell culture of undifferentiated cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.The cultivation mode and selective culture media allow to preserve the pluripotency of cell cultures.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.The cultivation mode and selective culture media allow to obtain a large number of cells for transplantation (series), which ensures reproducibility of treatment results.
В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервировации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.As a biograft, a freshly obtained cell culture is used or after its cryopreservation. As cryoprotectant use 7% dimethyl sulfoxide.
Предложенный способ лечения заключается в проведении трансплантации. В качестве биотрансплантата используются различные объемы суспензий клеток, содержащие 1-50 млн. ХПК в 1 мл, 1-50 млн. МСК в 1 мл, возможно использование комбинации биотрансплантатов, содержащих ХПК и МСК в соотношении 1:1.The proposed method of treatment is transplantation. Various volumes of cell suspensions containing 1-50 million COD in 1 ml, 1-50 million MSC in 1 ml are used as a biograft, a combination of biografts containing COD and MSC in a ratio of 1: 1 can be used.
Непосредственно перед началом трансплантации осуществляется биологическая проба. Раствор, содержащий в 1 мл 1-50 млн. хондропрогениторных или мезенхимальных стволовых клеток, вводится в количестве 0,1 мл в мягкие ткани десны. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются: появление болей - в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.Immediately before the start of transplantation, a biological test is performed. A solution containing in 1 ml of 1-50 million chondroprogenitor or mesenchymal stem cells is injected in an amount of 0.1 ml into the soft tissues of the gums. The recipient finds out complaints about the condition, pain, measure blood pressure and count the pulse. Signs of biological incompatibility are: the appearance of pain in the lumbar, epigastric regions, headaches, chest pains, feelings of fear, the presence of sweat and swelling of the face, decreased blood pressure, increased heart rate. The sample is repeated three times. With a negative result, they begin transplantation.
Осуществляется премедикация седатитвными препаратами по стандартной схеме. С помощью инсулинового шприца несколькими инъекциями суспензию клеток вводят интралигаментарно с латеральной и медиальной сторон каждого зуба верхней и нижней челюсти. Поднадкостнично, в пародонтальные участки верхней и нижних челюстей осуществляется несколько инъекций суспензии клеток, содержащей 1-50 млн. ХПК, МСК или их комбинации.Premedication with sedative drugs is carried out according to the standard scheme. Using an insulin syringe, a suspension of cells is administered intraligamentally from the lateral and medial sides of each tooth of the upper and lower jaw with several injections. Subperiosteally, several injections of a cell suspension containing 1-50 million COD, MSCs, or a combination thereof, are carried out in the periodontal areas of the upper and lower jaws.
В течение 2-4 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение терапевта.Within 2-4 hours after transplantation, the patient must be monitored by a physician.
Эффективность предложенного способа заключается в увеличении плотности костной ткани, направленной остеорегенерации альвеолярных отростков верхней и нижней челюстей.The effectiveness of the proposed method consists in increasing the density of bone tissue, directed osteoregeneration of the alveolar processes of the upper and lower jaws.
В группу наблюдения вошли 18 пациентов, обратившихся в клинику с жалобами на подвижность зубов, кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, невозможность полноценно пережевывать пищу. При клиническом и рентгенологическом исследовании всем поставлен диагноз пародонтит тяжелой формы, сопровождающийся атрофией более 1/2 альвеолярного отростка и подвижностью зубов 2-3 степени. Все больные обследованы следующим образом: общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, иммунологический статус, гормональный статус (Т3, Т4, ТТГ, АТ-ТГ, АТ-ТПО, ФСГ, ЛГ, эстроген, прогестерон, пролактин, тестостерон, инсулин, IGF-I,II), вирусологическое исследование, ПЦР крови и соскоба слизистой полости рта (CMV, Ch.spp, Myc.spp, HPV 16/18, Tox.spp, Herpes 1,2), исследование на наличие ряда распространенных онкомаркеров (ХГТ, СА-125, СА-15.3, СА-19.9, PSA, AFP, СЕА). Всем пациентам проведено УЗИ органов брюшной полости, малого таза, щитовидной железы, рентгенологическое исследование органов грудной клетки с целью исключения острых патологий, онкологических заболеваний, способных осложнить предстоящее вмешательство. Произведена коррекция терапии ряда хронических заболеваний сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящей системы.The observation group included 18 patients who came to the clinic complaining of tooth mobility, gum bleeding, halitosis, and the inability to fully chew food. In clinical and radiological studies, everyone was diagnosed with severe periodontitis, accompanied by atrophy of more than 1/2 of the alveolar bone and 2-3 degrees of tooth mobility. All patients were examined as follows: complete blood count, biochemical blood test, general urinalysis, immunological status, hormonal status (T3, T4, TSH, AT-TG, AT-TPO, FSH, LH, estrogen, progesterone, prolactin, testosterone, insulin, IGF-I, II), a virological study, PCR of blood and scrapings of the oral mucosa (CMV, Ch.spp, Myc.spp, HPV 16/18, Tox.spp, Herpes 1,2), a study for a number of common tumor markers (HGT, CA-125, CA-15.3, CA-19.9, PSA, AFP, CEA). Ultrasound of the abdominal cavity, small pelvis, thyroid gland, X-ray of the chest organs in order to exclude acute pathologies, oncological diseases that could complicate the upcoming intervention were performed for all patients. A correction of the treatment of a number of chronic diseases of the cardiovascular system, gastrointestinal tract, and urinary system has been made.
У большинства пациентов при помощи ПЦР в слизистой полости рта обнаружены Bacteriodes spp., у многих определялись CMV, Mic.spp., EBV, Chl.spp. Производилось соответствующее лечение препаратами, подобранными в соответствии с тропностью к типированному при помощи RT-PCR возбудителю.In most patients, Bacteriodes spp. Was detected using PCR in the oral mucosa, in many, CMV, Mic.spp., EBV, Chl.spp were determined. Appropriate treatment was carried out with drugs selected in accordance with the tropism for the pathogen typed by RT-PCR.
Таким образом, на момент осуществления имплантации стволовых клеток у пациентов отсутствовали онкологические заболевания, аллергические заболевания и реакции, другие хронические заболевания в стадии декомпенсации/обострения, острые воспалительные процессы, исключались наркомании, острые отравления.Thus, at the time of stem cell implantation, patients did not have oncological diseases, allergic diseases and reactions, other chronic diseases in the stage of decompensation / exacerbation, acute inflammatory processes, drug addiction, acute poisoning were excluded.
После местного традиционного лечения пародонтита пациентам имплантировались хондропрогениторные клетки поднадкостнично в пародонтальные участки альвеолярных отростков верхней и нижней челюстей.After local traditional treatment of periodontitis, patients were implanted with subperiostal chondroprogenitor cells in the periodontal areas of the alveolar processes of the upper and lower jaws.
Пациент И., 52 года, обратился в клинику с жалобами на подвижность зубов (по данным осмотра - 2-3 степень), кровоточивость десен, неприятный запах изо рта, невозможность полноценно пережевывать пищу.Patient I., 52 years old, came to the clinic with complaints of tooth mobility (according to the examination - 2–3 degrees), bleeding gums, bad breath, inability to fully chew food.
На основании клинико-рентгенологического обследования поставлен диагноз: пародонтит тяжелой формы с атрофией более 1 альвеолярного отростка, подвижностью зубов 2-3 степени. Сопутствующие соматические заболевания: язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, состояние после холецистэктомии, гипертоническая болезнь начальной склеротической стадии.On the basis of a clinical and radiological examination, the diagnosis was made: severe periodontitis with atrophy of more than 1 alveolar ridge, tooth mobility of 2-3 degrees. Concomitant somatic diseases: gastric and duodenal ulcer, condition after cholecystectomy, hypertension of the initial sclerotic stage.
При клинико-лабораторном обследовании выявлено: лейкоцитоз, гиперхолестеринемия, повышенные фракции триглицеридов, нарушения липидного обмена, нарушение толерантности к глюкозе, гипергликемия. Иммунологический статус - повышение уровня активированных Т-лимфоцитов. Гормональный статус в пределах возрастной нормы.Clinical and laboratory examination revealed: leukocytosis, hypercholesterolemia, elevated fractions of triglycerides, impaired lipid metabolism, impaired glucose tolerance, hyperglycemia. Immunological status - increased level of activated T-lymphocytes. Hormonal status within the age norm.
Пациенту проведено: профессиональная гигиена полости рта; зубы верхней и нижней челюсти шинированы по блокам "Glaspen", избирательно проведен глубокий кюретаж патологических карманов. Произведена художественная реставрация зубов обеих челюстей.Patient conducted: professional oral hygiene; the teeth of the upper and lower jaw are splintered along the "Glaspen" blocks, a deep curettage of pathological pockets is selectively performed. An artistic restoration of the teeth of both jaws was made.
После проведения вышеуказанной терапии на основании добровольного информированного согласия пациента (законодательная база - ст.43 ФЗ "Основы законодательства об охране здоровья граждан РФ") проведена заместительная клеточная терапия - после премедикации поднадкостнично введена культура хондропрогениторных клеток человека для использования в заместительной клеточной терапии (паспорт серия АСН №15-2-150, заключение о соответствии условий изготовления GMP: ГипроНИИМедПром, ЦГСЭН ЮАО г.Москвы 55/3.10 от 13 мая 2002 г.).After the above treatment, based on the voluntary informed consent of the patient (legislative base - Article 43 of the Federal Law "Fundamentals of the Legislation on the Protection of Citizens of the Russian Federation"), cell replacement therapy was carried out - after premedication, a human chondrogenic cell culture was introduced subperiostally for use in cell replacement therapy (passport series ASN No. 15-2-150, the conclusion on the conformity of the manufacturing conditions of GMP: GiproNIIIMedProm, TsGSEN South Administrative District of Moscow 55 / 3.10 dated May 13, 2002).
На следующие сутки после имплантации препарата стволовых клеток пациент отметил исчезновение болей и кровоточивости десен. При локальном осмотре слизистая полости рта бледно-розового цвета, умеренно увлажнена, плотно прилежит к зубам. Общее состояние удовлетворительное. На пятые сутки данных, указывающих на патологические изменения, нет.The day after the implantation of the stem cell preparation, the patient noted the disappearance of pain and bleeding gums. On local examination, the oral mucosa is pale pink, moderately moisturized, and adheres closely to the teeth. General condition is satisfactory. On the fifth day there is no data indicating pathological changes.
Пациент отмечает: повышение работоспособности, повышение активности, уменьшение времени сна, повышение потенции и либидо.The patient notes: increased performance, increased activity, decreased sleep time, increased potency and libido.
Контрольное клинико-лабораторное обследование через 15 сутки: отсутствие лейкоцитоза, нормализация показателей липидного обмена, уменьшение активности Т-лимфоцитов. Общее состояние пациента удовлетворительное, жалоб на челюстно-лицевую область не предъявляет. При локальном осмотре - отмечается положительная динамика, слизистая бледно-розового цвета, плотно прилежит к зубам, кровоточивости десен при зондировании нет. Через шесть месяцев общее состояние пациента удовлетворительное. Клиническая картина локально - без изменений. На ортопантомограмме определяется увеличение оптической плотности кости альвеолярных отростков (по сравнению со снимками до имплантации у всех пациентов в среднем на 49±3%, р=0,05), достоверное увеличение высоты их по осям биомеханической нагрузки.Control clinical and laboratory examination after 15 days: absence of leukocytosis, normalization of lipid metabolism, decrease in T-lymphocyte activity. The general condition of the patient is satisfactory, there are no complaints about the maxillofacial region. At a local examination - there is a positive dynamics, the mucous membrane is pale pink, tightly adjacent to the teeth, there is no bleeding of the gums when probing. After six months, the general condition of the patient is satisfactory. The clinical picture locally is unchanged. An orthopantomogram shows an increase in the optical density of the bone of the alveolar processes (compared with the images before implantation in all patients by an average of 49 ± 3%, p = 0.05), a significant increase in their height along the axes of the biomechanical load.
Таким образом, исследование показало, что имплантация ХПК приводит к осуществлению направленной физиологической регенерации костной ткани альвеолярных отростков во взрослом организме при наличии деструктивно-воспалительных заболеваний тканей пародонта и может являться эффективным способом терапии пародонтита.Thus, the study showed that the implantation of COD leads to the implementation of directed physiological regeneration of bone tissue of the alveolar processes in the adult body in the presence of destructive and inflammatory diseases of periodontal tissues and can be an effective method of treatment of periodontitis.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004114504/15A RU2265445C1 (en) | 2004-05-14 | 2004-05-14 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004114504/15A RU2265445C1 (en) | 2004-05-14 | 2004-05-14 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2265445C1 true RU2265445C1 (en) | 2005-12-10 |
Family
ID=35868636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004114504/15A RU2265445C1 (en) | 2004-05-14 | 2004-05-14 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2265445C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2462256C2 (en) * | 2007-02-28 | 2012-09-27 | Оган Текнолоджис Инк. | Method for making tooth and tooth made by such method |
| RU2465325C2 (en) * | 2007-01-22 | 2012-10-27 | Оган Текнолоджис Инк. | Method for producing mesenchymal cell, method for making tooth and mesenchymal cell for tooth formation |
| RU2523559C2 (en) * | 2009-01-28 | 2014-07-20 | Орган Текнолоджиз, Инк. | Method for tooth creation |
-
2004
- 2004-05-14 RU RU2004114504/15A patent/RU2265445C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2465325C2 (en) * | 2007-01-22 | 2012-10-27 | Оган Текнолоджис Инк. | Method for producing mesenchymal cell, method for making tooth and mesenchymal cell for tooth formation |
| RU2462256C2 (en) * | 2007-02-28 | 2012-09-27 | Оган Текнолоджис Инк. | Method for making tooth and tooth made by such method |
| RU2523559C2 (en) * | 2009-01-28 | 2014-07-20 | Орган Текнолоджиз, Инк. | Method for tooth creation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2423898T3 (en) | Dental pulp cytoblasts of adult humans in vitro and in vivo | |
| Robey et al. | The use of adult stem cells in rebuilding the human face | |
| Graziano et al. | Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up | |
| US20190167846A1 (en) | Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration | |
| CN102292435B (en) | New uses of tooth related stem cells | |
| CN103585177A (en) | Applications of mesenchymal stem cell and genetically modified mesenchymal stem cell | |
| CN103966158A (en) | Preparation method of specific extracellular matrix ECM of periodontium and application thereof | |
| Meshram et al. | Buccal fat pad-derived stem cells for repair of maxillofacial bony defects | |
| KR20080056280A (en) | Methods for differentiating stem cells and use thereofin the treatment of dental conditions | |
| JP5660896B2 (en) | Root / periodontal tissue unit formation method and regenerated tooth | |
| Lee et al. | Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates | |
| US20190015551A1 (en) | Construct for preventing immunological rejection generated when used in transplants, and method for using collagen in a gel state, in the form of dry lyophilised spongy mouldings and 3d matrices | |
| Khojasteh et al. | Mesenchymal stem cell therapy for treatment of craniofacial bone defects: 10 years of experience | |
| Sándor et al. | Combining adipose-derived stem cells, resorbable scaffolds and growth factors: An overview of tissue engineering | |
| JP2003052365A (en) | Separation of mesenchymal stem cell from mammalian animal and method for using the same | |
| Bodner et al. | Autologous cultured mucosal graft to cover large intraoral mucosal defects: a clinical study | |
| CN105861429A (en) | Resuscitation culture medium and resuscitation culture method for dental pulp mesenchymal stem cells | |
| RU2265445C1 (en) | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating parodontium diseases | |
| RU2418571C1 (en) | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases | |
| Alamoudi et al. | Adipose Tissue and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Role in Regeneration of Cleft Alveolus in Dogs. | |
| RU2320285C2 (en) | Method for restoring alveolar jaw bone crest and periodontium tissues having reduced recovery potential | |
| George et al. | Attachment and differentiation of human umbilical cord stem cells on to the tooth root surface with and without the use of fibroblast growth factor-an in vitro study | |
| EP3695803B1 (en) | Kit and method for improved bone regeneration | |
| RU2692452C1 (en) | Method of jaw bone defects replacement | |
| CN117384835A (en) | Tooth pulp stem cell enrichment gel for deciduous teeth and preparation method and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150515 |