RU2181379C2 - Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства - Google Patents
Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства Download PDFInfo
- Publication number
- RU2181379C2 RU2181379C2 RU96108781/13A RU96108781A RU2181379C2 RU 2181379 C2 RU2181379 C2 RU 2181379C2 RU 96108781/13 A RU96108781/13 A RU 96108781/13A RU 96108781 A RU96108781 A RU 96108781A RU 2181379 C2 RU2181379 C2 RU 2181379C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- peptide
- hiv
- group
- carrier
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 49
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 41
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 7
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 40
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 34
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 18
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 18
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 18
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 14
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 12
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 9
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 8
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 claims 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N Lys-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N 0.000 description 7
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 7
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 6
- ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N Asp-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N Trp-Ala-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N Asn-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- IPPFAOCLQSGHJV-WFBYXXMGSA-N Asn-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPPFAOCLQSGHJV-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- ICTXFVKYAGQURS-UBHSHLNASA-N Asp-Asn-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ICTXFVKYAGQURS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091002531 OF-1 protein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения нейтрализующих антител к различным штаммам и клиническим изолятам ВИЧ-1. Пептид имеет аминокислотную последовательность ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS или LELNKWAS и способствует образованию антител. Пептид может быть связан с носителем, представляющим собой вирус или вирусный белок. Пептид, связанный с носителем, получают рекомбинантным путем. Антитело, имеющее ВИЧ-1 нейтрализующую активность и секретируемое поверхностью слизистой оболочки, получают путем иммунизации человека или животного. Изобретение позволяет разработать фармацевтическое средство, способствующее образованию антител к штаммам ВИЧ-1 и/или клиническим изолятам. 6 с. и 11 з.п.ф-лы, 9 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к пептидам, способствующим образованию нейтрализующих антител к различным штаммам и клиническим изолятам ВИЧ-1, а также к создаваемым пептидами антителам и, кроме того, к комбинациям пептид - носитель, эффективно переносящим эти пептиды в иммунную систему. Более конкретно, данное изобретение относится к созданию вакцины против ВИЧ-1.
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является последней стадией клинического проявления долговременной устойчивой инфекции вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Направленные на вирус и на инфицированные вирусом клетки иммунные реакции в ходе устойчивой инфекции обычно не способны прекратить инфекцию. Вакцины могут создать такие иммунные реакции, которые способны предотвратить возникновение устойчивой инфекции или даже предотвратить ее развитие в СПИД. Большинство стратегий вакцинации против ВИЧ-1 направлены на его поверхностный гликопротеин gp160, состоящий из gp120 и gp41 и ответственный за связывание вируса с клеточным рецептором СD 4 и за последующий запуск направленной на слияние активности.
Однако, что касается gp160, то некоторые наблюдаемые явления свидетельствуют о неприемлемости в качестве иммуногена полного gp160 или gp120. Опыты in vitro показывают, что синергизм между gp120 и gp120-специфичными антителами блокирует активность Т-клеток человека (Mittler и др., Science (1989) 245, 1380). Кроме того, известно, что ряд антигенных доменов в gp160 индуцируют антитела, усиливающие инфекцию ВИЧ-1 (Jiang и др., J, Exp. Med. (1991) 174, 1557).
Применение в качестве иммуногенов синтетических пептидов имеет целый ряд преимуществ. Создаваемые синтетическими пептидами антитела обладают заданной специфичностью и в случае вирусов могут быть подобраны пептиды, образующие на поверхности вирионов целые структуры. Синтетические полипептиды интересны также с точки зрения их способности индуцировать реакцию антитела, не наблюдаемую в обычных условиях. К примеру, можно индуцировать нейтрализующие антитела с более широкой, чем у целостных белков, реакционной способностью (Green др., Cell (1982) 28, 477).
Кроме того, пептид, содержащий часть V3 петли gp120 из ВИЧ-1 изолята (ВИЧ-1 IIIb), как показано, индуцирует антитела, защищающие шимпанзе от вируса при искусственном заражении животного тем же ВИЧ-1 изолятом (Emini и др. , Nature (1992) 355, 728).
Поскольку синтетические пептиды сами по себе обладают слабой иммуногенностью, их необходимо соединить с молекулами, создающими синергическое действие, например столбнячным токсоидом или гемоцианином лимфы улитки (Bittle и др. , Nature (1982) 298, 30). Другая возможность заключается в клонировании небольших пептидов в виде слитых белков с глютатион-S-трансферазой из Schitosoma japonicum (Fikrig и др., Science (1990) 250, 553).
В качестве векторов для иммуногенов могут быть использованы также и вирусы, например: коровьей оспы, полиомиелита или гриппа. Кролики, зараженные рекомбинантным вирусом коровьей оспы, содержащим последовательности из поверхностного антигена вируса гепатита В (HBSAg), гликопротеина вируса простого герпеса и гемагглютинина вируса гриппа, продуцируют антитела ко всем трем чужеродным антигенам (Perkus и др., Science (1985) 229, 981). Более того, химерный вирус полиомиелита, экспессирующий эпитоп из gp41 ВИЧ-1, успешно индуцирует у кроликов нейтрализующие антитела к ВИЧ-1 (Evans и др., Nature (1989) 339, 385).
Совсем недавно стало возможным изменять in vitro мутагенезом геном вируса гриппа (Enami и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1990) 87, 3802). С помощью подобной технологии методами генной инженерии удалось создать устойчивый ослабленный вирус гриппа A (Muster и др., Proc. Natl. Асаd. Sci. США (1991) 88, 5177).
Преимущества вируса гриппа в данном контексте заключаются в доступности многих вариантов, что позволяет проводить повторные вакцинации. Кроме того, вирус гриппа индуцирует сильные секреторные и клеточные иммунные реакции, которые могут иметь успех при создании анти-ВИЧ-1 вакцины.
Цель настоящего изобретения состоит в создании пептидных последовательностей, которые всего лишь минимально иммуногенны в сравнении с целостным gp160. Такие пептидные последовательности могут быть использованы для создания антител, проявляющих нейтрализующую активность относительно различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние клеток млекопитающего, пораженных ВИЧ-1.
Еще одна цель изобретения заключается в создании стратегии индуцирования секреторных антител, секретируемых из слизистой поверхности и направленных на вирус ВИЧ-1 и на инфицированные вирусом клетки. Согласно изобретению предполагается, что созданные в ткани слизистой анти-ВИЧ-1 IgА антитела станут оружием, особенно мощным для профилактики и предотвращения инфицирования ВИЧ-1 индивидуумов из группы риска, поскольку многие вирусные инфекции, включая ВИЧ-1, передаются через поверхность слизистой дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и половых путей.
Указанные цели достигаются получением небольших пептидов из семи или восьми аминокислот, полученных либо химическим синтезом, либо микробиологическими методами. Рекомендуется, чтобы пептиды происходили из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих Glu Leu Аsр Liys Trp Ala Ser (=ELDKWAS в однобуквенном коде), Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser (LELDKWAS), Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (ELNKWAS), Leu Glu Leu Asn Lys Trp Ala Ser (LELNKWAS), Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (ELDNWAS) или Leu Glu Leu Asp Asn Trp Ala Ser (LELDNWAS).
По меньшей мере одна, но предпочтительно все шесть вышеупомянутых аминокислотных последовательностей (далее называются "указанными шестью АКП") могут быть успешно введены в иммунную систему, чтобы индуцировать образование и выделение антител, проявляющих нейтрализующую активность относительно ВИЧ-1 штаммов и/или подавляющих клеточное слияние, вызываемое этими штаммами.
Основная цель изобретения заключается в создании многообещающей анти-ВИЧ-1 вакцины, основанной на препарате, включающем по меньшей мере один, предпочтительно смесь всех шести вышеупомянутых пептидов. Характерные признаки и преимущества изобретения приводятся ниже.
В рекомендуемом воплощении изобретения аминокислотную последовательность Glu Leu Asp Lys Trp Ala (ELDKWA), определяющую последовательность эпитопа из моноклонального антитела человека 2F5 (получено из гибридомной клеточной линии 2F5, PHLS депонент 90091704; депонирован 09/17/90), соединяют с Ser или с Leu и Ser одновременно, расположенными рядом с ELDKWA последовательностью в gp41, определяющей 2F5 эпитоп, с образованием пептидных последовательностей Glu Leu Аsр Lys Trp Ala Ser (ELDKWAS) и Leu Glu Lеu Аsр Lys Тrр Ala Ser (LELDКWAS) соответственно и введение в молекулу носителя, а именно область детерминанты В из НА вируса гриппа.
Модифицированный "химерный" НА слитый белок, несущий чужеродную аминокислотную последовательность ELDKWAS или LELDKWAS, очень эффективно индуцирует антитела, направленные на указанную ELDКWAS или LELDKWAS последовательность, при введении белка, предпочтительно в виде инъекции в иммунную систему млекопитающего, в частности человека. Полученные таким путем антитела проявляют нейтрализующую активность относительно различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1.
Тем не менее оказалось, что вследствие известного полиморфизма ВИЧ-1 мутации вируса могут происходить даже в пределах высококонсервативной (L)ELDKWAS аминокислотной последовательности gp41, соответствующей аминокислотам 661-668 (LELDКWAS) или 662-668 (ELDKWAS) из ВИЧ-1 изолята ВН10. Нумерация нуклеотидов и аминокислот, применяемая в данном описании, соответствует нумерации gp160 из ВИЧ-1 изолята ВН10, применяемой согласно базы данных Лос Алмоса (Myers и др. , Data Ваsе Нuman Retrovirus and Aids). Особенно подвержены мутации Аsр (D) и/или Lys (К) аминокислоты, находящиеся в центре указанной последовательности, с уменьшением вероятности нейтрализации вируса антителами, несущими 2F5 эпитоп. Такой нежелательный вариант механизма "побега вируса" можно успешно избежать применением тех пептидов настоящего изобретения, в которых либо Аsр (D), либо соседний Lys (К) заменены аспарагином (N).
Для приготовления фармацевтического средства, предназначенного для индуцирования антител, проявляющих нейтрализующую активность относительно различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние пораженных ВИЧ-1 клеток, может быть использован хотя бы один, предпочтительно смесь всех шести пептидов.
В другом варианте для изготовления фармацевтического средства, предназначенного для индуцирования анти-ВИЧ-1 IgА антител, секретируемых поверхностью слизистой оболочки, предпочтительно при введении млекопитающему через нос, могут быть использованы те же пептиды либо в виде каждого пептида по отдельности, либо в смеси с хотя бы с одним другим пептидом.
В еще одном варианте изобретения по меньшей мере один из шести указанных пептидов соединяют с носителем. Подобным носителем может служить, к примеру, вирус в его ослабленной и/или рекомбинантной форме. С успехом могут быть использованы вирус гриппа, бакуловирус или вирус коровьей оспы. Присоединение небольших пептидов к носителю, такому как, например, вирусный белок или вирус целиком повышает эффективность индуцирования антитела после введения в иммунную систему таких химерных комбинаций пептид - носитель или химерных слитых белков.
Особенно успешным является применение каждого из вышеприведенных пептидов в виде слитого белка с вирусным белком в качестве носителя, причем по меньшей мере одна аминокислотная последовательность по изобретению замещает по меньшей мере одну часть вирусного белка-носителя или встроена в по меньшей мере одну из областей детерминанты вирусного белка. Данный признак, таким образом, представляет важное воплощение изобретения. В рекомендуемом варианте указанный вирусный белок является гемагглютинином (НА) вируса гриппа, нейраминидазой (NA) вируса гриппа или поверхностным антигеном вируса гепатита В. В другом варианте источником белка может служить бакуловирус (предпочтительно рекомбинантный) или вирус коровьей оспы.
Настоящее изобретение относится также к применению любого из вышеохарактеризованных пептидов, состоящих из семи или восьми аминокислот, и/или комбинаций пептид - носитель, или слитых белков для приготовления фармацевтического средства, предназначенного для создания или индуцирования антител, проявляющих нейтрализующую активность относительно различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние пораженных ВИЧ-1 клеток. Если более конкретно, то поставлена задача создания эффективной вакцины, основанной на по меньшей мере одном, предпочтительно смеси всех шести указанных пептидов и/или шести указанных пептидов, соединенных с носителем, для профилактической обработки индивидуумов, которым угрожает заражение ВИЧ-1, и/или для лечения инфицированных ВИЧ-1 больных, особенно для предотвращения развития инфекции в СПИД.
В еще одном рекомендуемом варианте указанные шесть пептидов и/или указанные шесть пептидов, соединенные с носителем, применяют для изготовления фармацевтических препаратов, которые после введения в иммунную систему млекопитающего приводят к индуцированию анти-ВИЧ-1 IgА антител, секретируемых с поверхности слизистой больного животного или человека. В этом случае рекомендуется введение через нос.
Соответственно, указанные шесть пептидов и/или комбинации пептид - носитель настоящего изобретения могут быть также использованы для приготовления фармацевтического средства, предназначенного для профилактики или предотвращения инфекции ВИЧ-1 в группах риска инфицирования ВИЧ-1.
По всей видимости, именно данный характерный признак настоящего изобретения позволяет надеяться на то, что путем индуцирования анти-ВИЧ-1 специфичных секреторных IgА антител на поверхности слизистой оболочки согласно настоящему изобретению дается мединский инструмент, с помощью которого эффективно атакуется вирусная агрессия уже на первых этапах проникновения вируса в организм млекопитающего. Полагают, что способы-прототипы лечения ВИЧ-1 инфицированных больных по меньшей мере частично не способны защитить больного потому, что охота за вирусом происходит в кровеносной системе, т.е. после широкого распространения вируса в гуморальной системе.
В рекомендуемом варианте указанное антитело является секреторным антителом, предпочтительно анти-ВИЧ-1 IgА антителом, которое с успехом секретирируется поверхностью слизистой оболочки.
Кроме того, настоящее изобретение относится также к способу получения любого из шести указанных пептидов либо микробиологическими, либо химическими методами.
В одном из вариантов указанные шесть пептидов синтезируют химически по стандартным биохимическим методикам, предпочтительно с помощью синтезатора пептидов модели 431А фирмы Эпплайд Биосистемс.
В другом варианте указанные аминокислотные последовательности получают микробиологическим способом, включающим стадии встраивания нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности, соответствующей одному из шести указанных пептидов,
b) нуклеотидной последовательности, гибридизованной с одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а),
с) нуклеотидной последовательности, полученной из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
в геном микроорганизма-хозяина, ведущего экспрессию генома, применением стандартной технологии микробиологического культивирования и выделением по меньшей мере одного, предпочтительно нескольких указанных пептидов.
a) нуклеотидной последовательности, соответствующей одному из шести указанных пептидов,
b) нуклеотидной последовательности, гибридизованной с одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а),
с) нуклеотидной последовательности, полученной из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
в геном микроорганизма-хозяина, ведущего экспрессию генома, применением стандартной технологии микробиологического культивирования и выделением по меньшей мере одного, предпочтительно нескольких указанных пептидов.
Химерные слитые белки или комбинации пептид - носитель могут быть получены способом, включающем соединение аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из шести указанных пептидов, с носителем, предпочтительно вирусом или вирусным белком химическими или микробиологическими методами.
В рекомендуемом варианте способ получения шести указанных пептидов, связанных с носителем, предпочтительно вирусом или вирусным белком, является микробиологическим способом и состоит из стадий присоединения нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей:
а) нуклеотидную последовательность, соответствующую одной из аминокислотных последовательностей указанных шести пептидов,
b) нуклеотидную последовательность, гибридизованную с одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а),
с) нуклеотидную последовательность, полученную из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
к нуклеотидной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности носителя, переноса соединенной нуклеотидной последовательности в микроорганизм-хозяин, проведения экспрессии соединенной последовательности применением стандартной микробиологической технологии и выделения по меньшей мере одного, предпочтительно нескольких указанных пептидов, связанных с носителем.
а) нуклеотидную последовательность, соответствующую одной из аминокислотных последовательностей указанных шести пептидов,
b) нуклеотидную последовательность, гибридизованную с одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а),
с) нуклеотидную последовательность, полученную из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
к нуклеотидной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности носителя, переноса соединенной нуклеотидной последовательности в микроорганизм-хозяин, проведения экспрессии соединенной последовательности применением стандартной микробиологической технологии и выделения по меньшей мере одного, предпочтительно нескольких указанных пептидов, связанных с носителем.
В еще одном варианте способ получения указанных шести пептидов, связанных с носителем, предпочтительно вирусом или вирусным белком, отличается тем, что по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей:
a) нуклеотидную последовательность, соответствующую одной из аминокислотных последовательностей указанных шести пептидов,
b) нуклеотидную последовательность, гибридизованную с одной из нуклеотидных последовательностей по п. а),
с) нуклеотидную последовательность, полученную из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
соединяют с нуклеотидной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности вирусного белка в качестве носителя, с замещением в результате по меньшей мере части нуклеотидной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности вирусного белка или встраиванием в по меньшей мере один участок указанной последовательности, соответствующий области детерминанты вирусного белка.
a) нуклеотидную последовательность, соответствующую одной из аминокислотных последовательностей указанных шести пептидов,
b) нуклеотидную последовательность, гибридизованную с одной из нуклеотидных последовательностей по п. а),
с) нуклеотидную последовательность, полученную из одной из нуклеотидных последовательностей по пункту а) путем вырождения
соединяют с нуклеотидной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности вирусного белка в качестве носителя, с замещением в результате по меньшей мере части нуклеотидной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности вирусного белка или встраиванием в по меньшей мере один участок указанной последовательности, соответствующий области детерминанты вирусного белка.
В характерном воплощении изобретения применяемый вирусный белок выбирают из группы, включающей: гемагглютинин вируса гриппа, нейраминидазу вируса гриппа и поверхностный антиген вируса гепатита В, а в другом характерном варианте в качестве микроорганизма-хозяина применяют вирус гриппа, бакуловирус или вирус коровьей оспы, предпочтительно каждый из них в рекомбинантной форме.
Встраивание последовательностей шести указанных пептидов в область детерминанты B в НА штаммов вируса гриппа, отличных от WSN, на который в основном и происходит ссылка в нижеследующих примерах, приводит в равной степени к слитым белкам и/или химерным вирусам, создающим нейтрализующие анти-ВИЧ-1 антитела и предотвращающим направляемое ВИЧ-1 клеточное слияние.
Введение этих же последовательностей в другие участки НА вируса гриппа или нейраминидазу (NA) вируса гриппа также приводит к слитым белкам пептид-носитель и/или химерным вирусам, создающим нейтрализующие анти-ВИЧ антитела и предотвращающим направляемое ВИЧ-1 клеточное слияние.
Настоящее изобретение далее дополнительно разъясняется и иллюстрируется следующими примерами, которые ни в коей мере не ограничивают объема настоящего изобретения.
Пример 1. Картирование эпитопа
Эпитоп моноклонального антитела 2F5 идентифицируют иммуноблоттингом по методике, приведенной в работе Towbin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1979) 76, 4850. Пептиды перекрывающихся фрагментов из gp41 ВИЧ-1 изолята ВН10 клонируют в виде пептидов, слитых с глютатионтрансферазой. Различные слитые пептиды получены путем гибридизации соответствующих gp41 олигонуклеотидов, клонированных между Bam H1 и EСО R1 сайтами плазмиды pGEX-2T (Фармация). Рекомбинантными плазмидами трансформируют Е. coli штамм DН5, и экспрессию слитых белков индуцируют изопропилтиогалактозидом (ИПТГ). Экстракт Е. соli затем очищают на колонках глютатион-сефарозы 4В, переносят на натрийдодецилсульфат-полиакриламидные гели, разделяют электрофорезом, и экспрессию белка анализируют окрашиванием серебром и иммуноблотингом (фиг. 1). Полученные иммуноблотингом данные показывают, что эпитоп моноклонального антитела 2F5 человека включает аминокислотную последовательность ELDKWA, соответствующую в gp160 аминокислотам 662-667.
Эпитоп моноклонального антитела 2F5 идентифицируют иммуноблоттингом по методике, приведенной в работе Towbin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1979) 76, 4850. Пептиды перекрывающихся фрагментов из gp41 ВИЧ-1 изолята ВН10 клонируют в виде пептидов, слитых с глютатионтрансферазой. Различные слитые пептиды получены путем гибридизации соответствующих gp41 олигонуклеотидов, клонированных между Bam H1 и EСО R1 сайтами плазмиды pGEX-2T (Фармация). Рекомбинантными плазмидами трансформируют Е. coli штамм DН5, и экспрессию слитых белков индуцируют изопропилтиогалактозидом (ИПТГ). Экстракт Е. соli затем очищают на колонках глютатион-сефарозы 4В, переносят на натрийдодецилсульфат-полиакриламидные гели, разделяют электрофорезом, и экспрессию белка анализируют окрашиванием серебром и иммуноблотингом (фиг. 1). Полученные иммуноблотингом данные показывают, что эпитоп моноклонального антитела 2F5 человека включает аминокислотную последовательность ELDKWA, соответствующую в gp160 аминокислотам 662-667.
Фиг. 1 иллюстрирует специфичность моноклонального антитела 2F5 человека (см. пример 1).
Фиг. 2 иллюстрирует конструкцию химерных гемагглютининов, несущих последовательность 2F5-эпитопа (см. пример 2).
На фиг. 3 показаны титры в ферментном иммуносорбентном тесте (ELISA) для антисыворотки мыши, иммунизированной химерным вирусом гриппа (см. пример 3).
На фиг. 4 показаны титры в ELISA мыши, иммунизированной клетками, инфицированными рекомбинантным бакуловирусом (см. пример 5).
На фиг. 1 приведены результаты иммуноблоттинга пептидов, слитых с перекрывающимися фрагментами из gp160 ВИЧ-1 (изолят ВН10). В отличие от конструкций, содержащих аминокислоты 597-677 (полоса 2), 634-677 (полоса 3) и 648-677 (полоса 4) и реагирующих с антителом 2F5, слитый белок, содержащий аминокислоты 667-677 (полоса 5), не дает положительной реакции. Это является прямым указанием на то, что эпитоп моноклонального антитела 2F5 образован аминокислотами в пределах последовательности в положении 648-667 в gp160. На основании этих результатов перекрывающиеся 6-мерные пептиды из этой области сливают с глютатион-S-трансферазой.
Как видно из фиг. 1b, пептид, содержащий аминокислотную последовательность GLU LEU ASP LYS TRP ALA (аминокислоты 662-667, полоса 2), отличается высокой реакционоспособностью относительно антитела 2F5, в то время как у пептидов, содержащих аминокислотную последовательность LEU АSР LYS TRP ALA SER (LDKWAS, аминокислоты 663-668, полоса 3) или АSР LYS TRP ALA SER LEU (DKWASL, аминокислоты 664-669, полоса 4), реакционоспособность относительно моноклонального антитела понижена. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность LEU GLU LEU АSР LYS TRP (LELDKW, аминокислоты 661-666, полоса 1), не проявляет значительной реакционоспособности. Приведенные данные показывают, что эпитоп моноклонального антитела включает аминокислотную последовательность GLU LEU ASP LYS TRP ALA (ELDKWA), соответствующую аминокислотам 662-667 в gp160 из ВИЧ-1 (изолят ВН10). В данном контексте как синтетический пептид, соответствующий последовательности данного эпитопа, так и слитый белок, содержащий эту последовательность, оказались способными подавлять нейтрализацию, происходящую при участии 2F5 антитела.
Пример 2. Конструирование плазмид и химерных вирусов гриппа.
Все приемы генной инженерии осуществлены согласно стандартным методикам, приведенным в издании: Sambrook и др. (1989) "Molecular, Cloning", Laboratory Manual, Коулд Спринг Харбор Лэборетори Пресс, Нью-Йорк. Как показано, на фиг. 2, gp41-последовательности Leu Glu Leu Аsр Lys Тrр Аlа Ser (LELDKWAS) или Glu Lеu Аsр Lys Тrр Аlа Ser (ELDKWAS) вводят в область детерминанты В в НА вируса WSN гриппа. Плазмиды pHA-ELDKWAS и рНА-1 ELDKWAS конструируют заменой Рst I-Hind III фрагмента плазмиды рТЗ/WSN-HAml, описанной Li и др. (Proc. Natl. Acad. Sci. США 90, 5214-5218 (1993)), ПЦР продуктом, полученным применением рТ3/WSN-HAml в качестве матрицы и смыслового и антисмыслового праймеров, происходящих из вируса WSN HAml гриппа, причем антисмысловой праймер дополнительно содержит 21 или 24 нуклеотидную вставку, соответствующую положению 1981 или 1984-2004 в gp160. Аналогичным путем получены плазмиды pHA-ELNKWAS, pHA-LELNKWAS, pHA-ELDNWAS и рНА-1 ELDNWAS.
Последовательность WSN НА приводится в работе Hiti и др. (J. Virol. 41 730-734 (1982)), а последовательность gp160 содержится в базе данных Суисспорт, поступление ENVSHTV10. Трансфекцию РНК, происходящую из этой плазмиды, в МDВК клетки, отбор и получение химерных вирусов осуществляют согласно Еnаmi и др. (Рrос. Natl. Acad. Sci. США 87, 3802-3805 (1990)) с модификациями, приведенными Еnаmi и Palese (J. Virol. 65. 2711-2713 (1991)).
Пример 3. Иммунизация и реакция антител у мышей, иммунизированных химерными вирусами гриппа.
Мышей линии ОF-1 иммунизируют химерным вирусом ELDKWAS-гриппа (мыши M1, М2, М3, М4) или вирусом LELDKWAS-гриппа (мышь М5). Вначале мышей иммунизируют 102 TCID50 через нос (IN) с последующей бустер-иммунизацией ч.н. 5•105 TCID50 спустя 6 недель, иммунизацией внутрибрюшинно (IP) 20 мкг очищенного на сахарозе живого вируса через 3 недели и наконец бустер-инъекцией 20 мкг НДС-денатурированного вируса в неполном адъюванте Фрейнда с интервалом в еще 3 недели. При иммунизации через нос мыши находятся под эфирной анестезией. Для WSN контрольного вируса дикого типа (WT1, WT2) применяют ту же методику. Через 12 дней после конечной бустер-инъекции у мышей отбирают образцы крови, антисыворотку дезактивируют 1 ч при 56oС и определяют титры в ELISA и нейтрализующую активность антисыворотки.
На фиг. 3a показано связывание антисыворотки ELDKWAS-гриппа с пептидом, слитым с глютатион-трансферазой (GST) и содержащим у своего С-окончания последовательность ELDKWA. Последовательность определена с помощью ELISA. Титрационные микропланшеты на 96 лунок покрывают GST-ELDKWA слитым пептидом в количестве 4 мкг/мл (100 мкл/лунку) в карбонатном буфере (рН 9,6) и выдерживают 4 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывают ФБСР-0,05% Твина. Антисыворотку разбавляют ФБСР-1% БСА-0,05% Твина, вносят в планшеты и выдерживают 1 час при комнатной температуре. После промывания антитела обнаруживают инкубированием с козьим антимышиным IgG (γ-цепь) антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. Планшеты окрашивают применением в качестве субстрата дигидрохлорида о-фенилендиамина. Реакцию прекращают добавлением 2,5 М Н2SO4, и проводят измерение планшеты (длина волны 492 нм, ссылочная длина волны 620 нм).
На фиг. 3b воспроизведена методика, приведенная для фиг. 3а, за тем исключением, что для обнаружения антител применяют козье антимышиное IgА антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена. Нейтрализующую активность антисыворотки определяют анализом с подавлением сицинтий. Эквивалентные разведения антисыворотки, при которых происходит подавление образования сицинтий на 50% (ЭД50), приведены в таблице. Антисыворотка от мышей М1-М3 нейтрализует испытуемую панель полностью при различных разбавлениях антисыворотки. Антисыворотка мышей М4 и М5 нейтрализует ВИЧ-1 изоляты МN и RF, но не IIIВ. Антисыворотка, индуцированная WSN вирусом дикого типа, не нейтрализует никаких испытанных ВИЧ-1 изолятов даже при самых низких разбавлениях сыворотки (1:20).
Для анализа с подавлением сицинтий применяют индикаторную клеточную линию АА-2, описанную в работе: Chaffee и др., J. Exp. Med. (1988) 168, 605, и исходные замороженные образцы вирусного инокудума ВИЧ-1 штаммов МN, RF и IIВ. Все образцы вируса разбавляют до концентрации 9•10-5•102 TCID50 на мл. Мышиную антисыворотку разбавляют в 2 раза средой и вносят в традиционные микропланшеты на 96 лунок (4 повтора на каждое разбавление). К 50 мкл разбавленной антисыворотки добавляют 50 мкл вируса и смесь вирус - антитело выдерживают 2 ч при 4oC. Для инфицирования в каждую лунку вносят 100 мкл АА-2 клеток (5•106 клеток/мл); присутствие сицинтий регистрируют через 5 дней как указание на ВИЧ-1 инфекцию. Определение 50%-ой ингибирующей дозы (ЭД50) проводят по методике Reed и Muench, приведенной в Am. J. Hyg. (1938) 27, 493. Приведены эквивалентные разведения сыворотки, при которых происходит 50%-ое подавление образования сицинтий (ЭД50).
Пример 4. Экспрессии рекомбинантными бакуловирусами химерных гемагглютининов, несущих удлиненные 2F5-эпитопы.
Химерные гемагглютинины, содержащие шесть указанных пептидов, получают по методике примера 1. Последовательность, кодирующая эти химерные гемагглютинины, фланкирована сайтом фермента рестрикции BamHI и встроена в BamHI сайт плазмиды Bluebac III (Инвитроген, Сан-Диего, КА). Эксперименты с трансфекцией с целью получения рекомбинантных бакуловирусов, содержащих химерные гемагглютинины, проведены по методикам, приведенным в работах: Groebe и др., Nucleic. Асids Res. (1990) 18, 4033 и Felgner и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1987) 84, 7413. Полученные рекомбинантные химерные бакуловирусы могут быть использованы для создания нейтрализующих ВИЧ-1 антител.
Пример 5. Иммунизация и реакции антител у мышей, иммунизированных клетками, инфицированными рекомбинантными бакуловирусами.
Применяемые для иммунизации Sf9 клетки инфицируют рекомбинантными бакуловирусами при множественности заражения (МОТ) 1-5 и собирают через 3 дня после заражения. Клетки дважды промывают ФБСР и вновь суспендируют в ФБСР в концентрации 5•106 клеток/мл. Данные клетки специфично реагируют с моноклональным антителом 2F5 в анализе вестерн блоттингом, что можно считать указанием на содержание в этих клетках гемагглютинина, несущего ELDKWAS или LELDKWAS последовательность. Мышей линии Balb/cA иммунизируют четырьмя инъекциями внутрибрюшинно по 1•106 инфицированных Sf9 клеток с интервалом в 2 недели (Van Wyyke Coelingh и др. Virology (1987) 160, 4465). Через семь дней после четвертой иммунизации у мышей отбирают образцы крови и определяют ELISA титры антисыворотки. На фиг. 4 показано связывание созданной рекомбинантным бакуловирусом антисыворотки с синтетическим пептидом, состоящим из последовательности Gly Gly Gly Glu Leu Аsр Lys Trp Ala (GGGELDKWA) методом ELISA, осуществленным по методике примера 2.
Индуцирование секреторных антител.
Иммунизация, проведенная введением по меньшей мере одного, предпочтительно смеси шести указанных пептидов, привела к значительному улучшению IgG ELDKWA-специфичных ELISA титров. Более того, в отличие от иммунизации с применением ELDKWA последовательности иммунизация шестью указанными пептидами приводит также к значительной IgА реакции. Оказалось неожиданностью то, что такая IgА иммунная реакция запускается также и на уровне слизистой.
Пример 6. IgА антитела в секреции дыхательных путей Ваlb/с мышей, иммунизированных вирусом гриппа-ELDKWAS.
Мышей иммунизируют введением через нос 102 РFU и спустя 4 недели повторно иммунизируют введением тем же путем 105 PFU. Третью иммунизацию проводят спустя еще 4 недели введением через нос (IN) или внутрибрюшинно (IP) 107 PFU. Через 8 недель после третьей иммунизации собирают и объединяют продукты промывания носа и методом ELISA определяют реакционность этих образцов с пептидом ELDKWA. В качестве контроля (образец WT) анализируют объединенные продукты промывания носов мышей, иммунизированных вирусом гриппа дикого типа (WT). Применена та же схема иммунизации, что и для IN группы (см. фиг. 5). Индуцированные антитела продуцируются преимущественно слизистой носа, и можно считать, что титр антитела необычайно высок. Из фиг. 5 видно также, что введение через нос вируса гриппа-ЕLDKWAS приводит к более высокой концентрации ВИЧ-1 нейтрализующих антител по сравнению с внутрибрюшинным введением.
Пример 7. ТgА антитела в секреции кишечника Ваlb/с мышей, иммунизированных вирусом гриппа-ELDKWAS.
Мышей иммунизируют введением через нос 102 PFU и спустя 4 недели повторно иммунизируют введением тем же путем 106 РFU. Третью иммунизацию проводят спустя еще 4 недели введением через нос (см. фиг. 6а) или внутрибрюшинно (см. фиг. 6b) 107 PFU. Через 8 недель после третьей иммунизации собирают и экстрагируют фекалии, содержащие антитела, выделенные из слизистой кишечника и методом ELISA определяют реакционоспособность этих образцов относительно пептида ELDKWA. INO, INR, INВ и INS - это образцы от мышей, которым третья иммунизация проводилась через нос, а образцы IPО, IPR, IPRS и IРS отобраны у мышей, которым третья иммунизация проводилась внутрибрюшинно.
WT1 и WТ2 - это образцы контрольных мышей, иммунизированных вирусом гриппа дикого типа (WТ).
Claims (17)
1. Пептид, способствующий образованию антител, проявляющих нейтрализующую активность в отношении различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние клеток ВИЧ-1, отличающийся тем, что пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS и LELNKWAS.
2. Пептид, связанный с носителем, содействующий формированию антител, проявляющих нейтрализующую активность по отношению к различным штаммам и/или клиническим изолятам ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние ВИЧ-1 клеток, отличающийся тем, что пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, LELDNWAS, ELNKWAS, LELNKWAS, и связан с носителем, которым является вирус или вирусный белок.
3. Пептид по п. 2, отличающийся тем, что носителем является предпочтительно рекомбинантный вирус, выбранный из группы, состоящей из вируса гриппа, бакуловируса и вируса коровьей оспы или вирусного белка, выбранного из группы, состоящей из гемагглютинина (НА) вируса гриппа, нейраминидазы (NA) вируса гриппа и поверхностного антигена вируса гепатита В.
4. Пептид по п. 2 или 3, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из аминокислотных последовательностей, описанных в п. 1, заменяет, по крайней мере, часть аминокислотной последовательности вирусного белка или встроена, по крайней мере, в один антигенный участок вирусного белка.
5. Пептид по п. 2, отличающийся тем, что пептид связан с вирусным белком, подвергаемым воздействию клетки, необязательно Sf9 клетки, предварительно инфицированной вирусом, содержащим упомянутый пептид, связанный с упомянутым вирусным белком.
6. Фармацевтическое средство, способствующее образованию антител, которые проявляют нейтрализующую активность в отношении различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляют слияние ВИЧ-1 клеток, отличающееся тем, что включает, по меньшей мере, один пептид, выбранный из группы, состоящей из ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS и LELNKWAS, и/или, по крайней мере, один из упомянутых пептидов, связанных с носителем, который является вирусом, предпочтительно выбранным из группы, состоящей из вируса гриппа, бакуловируса и вируса коровьей оспы, или же является частью вируса, предпочтительно вирусного протеина, выбранного из группы, состоящей из гемагглютинина (НА) вируса гриппа, нейраминидазы (NA) вируса гриппа и поверхностного антигена вируса гепатита В.
7. Фармацевтическое средство по п. 6, отличающееся тем, что индуцирует секрецию анти-ВИЧ-1 IgA антител, предпочтительно поверхностью слизистой оболочки млекопитающего.
8. Фармацевтическое средство по п. 6 или 7 для профилактики ВИЧ-1 инфекции у индивидуумов из группы риска.
9. Способ для производства пептида, связанного с носителем, способствующего формированию антител, проявляющих нейтрализующую активность в отношении различных штаммов и/или клинических изолятов ВИЧ-1 и/или подавляющих слияние ВИЧ-1 клеток, который включает приготовление нуклеотидной последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности пептида, связанного с вирусным белком, где пептид выбирается из группы, состоящей из ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS и LELNKWAS, с переносом упомянутой нуклеотидной последовательности в организм хозяина для получения химерного вируса, осуществляя экспрессию в подходящих условиях и выделяя пептиды, связанные с носителем в виде упомянутого химерного вируса.
10. Способ по п. 9, где упомянутый пептид заменяет, по меньшей мере, часть аминокислотной последовательности вирусного белка или встраивается в антигенный участок вирусного белка.
11. Способ по п. 9 или 10, где вирусный белок выбирают из группы, состоящей из гемагглютинина вируса гриппа, нейраминидазы вируса гриппа и поверхностного антигена вируса гепатита В.
12. Способ по пп. 9, 10 или 11, где вирус группы, состоящей из предпочтительно рекомбинантного вируса гриппа, бакуловируса и вируса коровьей оспы, используется в качестве организма-хозяина.
13. Способ для производства антитела, проявляющего ВИЧ-1 нейтрализующую активность и способного предотвращать слияние ВИЧ-1 клеток, отличающийся тем, что пептид, выбранный из группы, состоящей из ELDKWAS, LELDKWAS, ELDNWAS, ELNKWAS, LELDNWAS и LELNKWAS, вводят в иммунную систему человека или животного, причем пептид предпочтительно связан с носителем, который является вирусом, предпочтительно выбираемым из группы, состоящей из вируса гриппа, бакуловируса и вируса коровьей оспы, или же частью вируса, предпочтительно вирусного белка, выбранного из группы, состоящей из гемагглютинина (НА) вируса гриппа, нейтраминидазы (NA) вируса гриппа и поверхностного антигена вируса гепатита В, с продуцированием в результате названного антитела.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что упомянутый пептид вводят в иммунную систему через поверхность слизистой оболочки, предпочтительно через нос.
15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что антитело получают путем секреции поверхностью слизистой оболочки.
16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что для пептидов, связанных с носителем, применяют вирус, предпочтительно вирус гриппа, или часть вируса, предпочтительно гемагглютинин вируса гриппа, в качестве носителя.
17. Антитело, проявляющее ВИЧ-1 нейтрализующую активность и способное предотвратить слияние ВИЧ-1 клеток, характеризующееся следующими свойствами: относится к типу IgA; направлено на эпитоп ELDKWA; получают способом согласно п. 13; секретируется преимущественно поверхностью слизистой оболочки.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93114631 | 1993-09-11 | ||
| EP93114631.0 | 1993-09-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96108781A RU96108781A (ru) | 1999-04-20 |
| RU2181379C2 true RU2181379C2 (ru) | 2002-04-20 |
Family
ID=8213253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96108781/13A RU2181379C2 (ru) | 1993-09-11 | 1994-09-12 | Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0725825B1 (ru) |
| JP (1) | JPH09502348A (ru) |
| CN (1) | CN1135237A (ru) |
| AT (1) | ATE199260T1 (ru) |
| AU (1) | AU682893B2 (ru) |
| BR (1) | BR9407531A (ru) |
| CA (1) | CA2171544C (ru) |
| CZ (1) | CZ287808B6 (ru) |
| DE (1) | DE69426725T2 (ru) |
| ES (1) | ES2156902T3 (ru) |
| HU (1) | HU219507B (ru) |
| PT (1) | PT725825E (ru) |
| RU (1) | RU2181379C2 (ru) |
| UA (1) | UA43350C2 (ru) |
| WO (1) | WO1995007354A1 (ru) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2308595A (en) * | 1995-04-19 | 1996-11-07 | Polymun Scientific Immunobiologische Forschung Gmbh | Monoclonal antibodies against hiv-1 and vaccines made thereo f |
| US6319890B1 (en) | 1996-12-30 | 2001-11-20 | Manfred P. Dierich | Inhibition of binding of complement Factor H |
| DK1071442T3 (da) * | 1998-03-23 | 2005-10-24 | Trimeris Inc | Fremgangsmåder og præparater til peptidsyntese (T-20) |
| US6482928B1 (en) | 1999-04-13 | 2002-11-19 | Aventis Pasteur Limited And University Of Toronto | Fab′-epitope complex from HIV-1 cross-neutralizing monoclonal antibody 2F5 |
| CN1172717C (zh) * | 2000-08-18 | 2004-10-27 | 清华大学 | 一种治疗艾滋病的药物及其制备方法 |
| FR2851165A1 (fr) * | 2003-02-19 | 2004-08-20 | Aventis Pasteur | Antigene derivant de l'helice c de la proteine gp41 |
| TW200726479A (en) | 2005-04-12 | 2007-07-16 | Univ Duke | Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus |
| EP1754715A1 (de) | 2005-08-19 | 2007-02-21 | Bundesrepublik Deutschland vertreten durch das Bundesminsterium für Gesundheit, dieses vertr. durch das Robert-Koch-Institut | Impfstoff auf Basis virusneutralisierender Antikörper |
| CA2683752A1 (en) | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Duke University | Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus |
| US8652459B2 (en) * | 2009-02-06 | 2014-02-18 | Mymetics Corporation | Splitting GP41 |
| WO2015048635A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Duke University | Mper-liposome conjugates and uses thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0570357B1 (en) * | 1992-05-14 | 1997-06-25 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Peptides that induce antibodies which neutralize genetically divergent HIV-1 isolates |
| US5817767A (en) * | 1993-02-24 | 1998-10-06 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Synergistic composition of CD4-based protein and anti-HIV-1 antibody, and methods of using same |
-
1994
- 1994-09-12 AU AU76965/94A patent/AU682893B2/en not_active Ceased
- 1994-09-12 JP JP7508473A patent/JPH09502348A/ja not_active Ceased
- 1994-09-12 CN CN94194035A patent/CN1135237A/zh active Pending
- 1994-09-12 DE DE69426725T patent/DE69426725T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-12 UA UA96030897A patent/UA43350C2/ru unknown
- 1994-09-12 RU RU96108781/13A patent/RU2181379C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 HU HU9600587A patent/HU219507B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 BR BR9407531A patent/BR9407531A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-09-12 ES ES94927602T patent/ES2156902T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-12 WO PCT/EP1994/003039 patent/WO1995007354A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-12 CZ CZ1996741A patent/CZ287808B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 PT PT94927602T patent/PT725825E/pt unknown
- 1994-09-12 AT AT94927602T patent/ATE199260T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 EP EP94927602A patent/EP0725825B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-12 CA CA002171544A patent/CA2171544C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALLAWAY et al. Aids Presearch and Human Retroviruses, 1993, v.9, n.7, p.581-587. JAVAHERIAN et al. Science, 1990, v.250, n.4987, p.1590-1593. * |
| HAUROWITZ F. Immunochemistry and the biosynthesis of antibodies. Inter science publishers, a division of John Wiley Sons, New York - London - Sydney. 1968, p.8-34. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1995007354A1 (en) | 1995-03-16 |
| BR9407531A (pt) | 1997-08-26 |
| UA43350C2 (ru) | 2001-12-17 |
| AU7696594A (en) | 1995-03-27 |
| CZ287808B6 (en) | 2001-02-14 |
| AU682893B2 (en) | 1997-10-23 |
| CA2171544A1 (en) | 1995-03-16 |
| HU219507B (hu) | 2001-04-28 |
| ATE199260T1 (de) | 2001-03-15 |
| DE69426725T2 (de) | 2001-09-06 |
| CZ74196A3 (en) | 1996-07-17 |
| HU9600587D0 (en) | 1996-05-28 |
| CA2171544C (en) | 2003-06-24 |
| JPH09502348A (ja) | 1997-03-11 |
| HUT76102A (en) | 1997-06-30 |
| EP0725825B1 (en) | 2001-02-21 |
| EP0725825A1 (en) | 1996-08-14 |
| DE69426725D1 (de) | 2001-03-29 |
| ES2156902T3 (es) | 2001-08-01 |
| PT725825E (pt) | 2001-08-30 |
| CN1135237A (zh) | 1996-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5591823A (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| EA027069B1 (ru) | Моноклональные антитела, способные взаимодействовать с множеством подтипов вируса гриппа а | |
| JP2003529319A (ja) | ＨＩＶ−１ｇｐ４１を標的化する広範に中和する抗体を誘発する方法 | |
| JP2006020635A (ja) | 抗原的に標識した非感染性レトロウィルス様粒子 | |
| RU2181379C2 (ru) | Пептид (варианты) и способ его производства, фармацевтическое средство, антитело и способ его производства | |
| Frangione-Beebe et al. | Enhanced immunogenicity of a conformational epitope of human T-lymphotropic virus type 1 using a novel chimeric peptide | |
| NZ539606A (en) | Antigenic peptides | |
| CN105085672B (zh) | 3d蛋白特异性单克隆免疫球蛋白a抗体及其组合物 | |
| Weijer et al. | Induction of feline leukaemia virus-neutralizing antibodies by immunization with synthetic peptides derived from the FeLV env gene | |
| CN114057850B (zh) | 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN105085671B (zh) | 抗肠道病毒3d蛋白的单克隆免疫球蛋白g抗体及其免疫原性组合物 | |
| CN114057852B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽及其用途 | |
| CN114057843B (zh) | 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057846B (zh) | 一种预防新型冠状病毒感染covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057848B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057851B (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057847B (zh) | 一种预防新型冠状病毒covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| JPH07170982A (ja) | ワクチンおよびその製造方法 | |
| CN114057853A (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114057844A (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN116903754A (zh) | 一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗及其构建方法与应用 | |
| CN114057842A (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的多肽、免疫原性偶联物及其用途 | |
| CN114053400A (zh) | 一种预防新型冠状病毒肺炎covid-19的疫苗及其制备方法 | |
| WO1995007099A1 (fr) | Vaccin et procede pour sa production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120913 |