RU2146289C1 - Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, используемый для выращивания вируса - Google Patents
Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, используемый для выращивания вируса Download PDFInfo
- Publication number
- RU2146289C1 RU2146289C1 RU97118662A RU97118662A RU2146289C1 RU 2146289 C1 RU2146289 C1 RU 2146289C1 RU 97118662 A RU97118662 A RU 97118662A RU 97118662 A RU97118662 A RU 97118662A RU 2146289 C1 RU2146289 C1 RU 2146289C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- lbhel
- strain
- vzv
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 38
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 14
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 abstract description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 abstract description 2
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 204
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 241001534530 Okavirus Species 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 3
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 3
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 3
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 3
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 208000032982 Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- RLMJJMISUNCQGK-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogen carbonate phosphoric acid Chemical compound [K+].OC([O-])=O.OP(O)(O)=O RLMJJMISUNCQGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
- A61K39/25—Varicella-zoster virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к вирусологии и медицине и может быть использовано для получения вирусных вакцин. Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека LBHEL получен из ткани легких 20-недельного эмбриона. Штамм депонирован под номером КСТС 0127 ВР. Штамм отличается быстрым ростом, высокой восприимчивостью к вирусам, особенно к вирусу Varicella zoster (VZV). Штамм хорошо растет по среде, содержащей сыворотку плода коровы в концентрации 5%. Изобретение позволяет уменьшить побочные эффекты вируссодержащих вакцин. 7 ил., 5 табл.
Description
Изобретение относится к новому штамму диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, пригодных для получения вируса, и к способу получения вируса Varicella zoster с помощью упомянутого штамма в качестве клетки-хозяина.
Описание предшествующего уровня техники.
Вирусы вызывают различные заболевания, такие как корь, краснуха, эпидемический паротит, ветряная оспа, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, японский энцефалит B, детский полиомиелит, гепатит A, гепатит B, гепатит C и натуральная оспа. Эти вирусные заболевания можно предотвратить путем инокуляции вакцин, полученных из инактивированных или ослабленных патогенных вирусов.
Обычно в качестве клеток-хозяев для получения таких вирусных вакцин используют куриные эмбрионы, клетки мозга крысят и диплоидные клетки млекопитающих. Несмотря на то что куриные эмбрионы или клетки мозга крысят могут использоваться в качестве клеток-хозяев для снижения стоимости производства, их использование невыгодно из-за низкой восприимчивости к вирусам, сложных способов очистки и побочных эффектов, возникающих вследствие наличия контаминантов в виде чужеродных белков. Напротив, использование нормальных диплоидных клеток человека может уменьшить побочные эффекты, вызываемые чужеродными балками, и, следовательно, они являются более предпочтительными для получения вирусных вакцин.
Типичные диплоидные клетки человека включают клеточный штамм MRC-5 (АТСС, CCL 171), клеточный штамм WI-38 (АТСС, CCL 75) и клеточный штамм HEL 299 (АТСС, CCL 137): особенно, клеточный штамм MRC-5, получаемый из легочной ткани 14-недельных эмбрионов мужского пола (Proc. Symp. Human Diploid Cells, Yugoslavia. Acad. Sci. Arts. Zagreb., стр. 43-45 (1970); и Nature (London), 227, стр. 168-170 (1970)); WI-38, получаемый из легочной ткани 3-месячных эмбрионов женского пола (Exp.Cell Res., 25, стр. 585 (1961) и Am.J.Hyg., 75, стр. 240 (1962)) и клеточный штамм HEL 299, получаемый из легочной ткани эмбрионов мужского пола (W. D.Peterson, Jr. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 128, стр. 772 (1968)).
Ветряная оспа является высококонтагиозным заболеванием, которое поражает детей, пожилых людей и пациентов со сниженным иммунитетом вследствие инфицирования вирусом Varicella zoster (VZV). Сообщалось, что VZV можно культивировать на различных клетках, таких как клетки амниона человека, клетки щитовидной железы человека, клетки легких человека, клетки шейки матки человека Hela и клетки почки обезьяны (см. E.V. Meurisse et al., J .Microbiol., 2, 317 (1969)). Далее, патент США N 3985615 раскрывает получение вакцины VZV путем многократной аттенуации вируса Oka на клетках первичной эмбриональной ткани морских свинок (GPEC); патент США N 4000256 описывает получение вакцины VZV путем субкультивирования от 10 до 80 раз клеточного штамма эмбриональных фибробластов человека WI-38, содержащего вирус VZV; патент США N 4000317 описывает получение чувствительного к температуре мутанта VZV на клеточном штамме WI-38 и патент США N 5360736 раскрывает усовершенствованный способ получения вакцины VZV на клеточном штамме MRC-5.
Однако выход VZV при использовании клеток GPEC очень мал. Далее, клеточные штаммы WI-38 и MRC-5 многократно пассируются, снижая таким образом свою способность вырабатывать VZV. Таким образом, вышеупомянутый способ не может применяться для широкомасштабного производства вакцины VZV. Далее, VZV имеет тенденцию инактивироваться в среде, лишенной клеток, вследствие своих клеточно-зависимых свойств.
Краткое изложение сущности изобретения.
Соответственно, целью настоящего изобретения является создание нового штамма диплоидных клеток человека, обладающего высокой восприимчивостью к различным вирусам, особенно к VZV, и обеспечение высокого выхода VZV.
Другой целью настоящего изобретения является создание усовершенствованного способа для получения VZV.
В соответствии с одной особенностью настоящего изобретения создан штамм диплоидных клеток фибробластов LBHEL (KCTC 0127BP), полученный из клеток эмбриональных легких человека. В соответствии с другой особенностью настоящего изобретения создан также способ получения вируса Varicella zoster (VZV), не содержащего клеток, который включает этапы:
(а) культивирования диплоидного клеточного штамма фибробластов эмбриональных легких человека LBHEL (KCTC 0127BP) в сосуде для культивирования с целью получения культивируемых клеток LBHEL;
(b) инфицирования культивируемых клеток LBHEL с помощью VZV с целью получения VZV-инфицированных клеток;
(с) культивирования и сбора VZV-инфицированных клеток;
(d) разрушения собранных клеток с целью получения клеточного гомогената и
(е) центрифугирования клеточного гомогената с целью получения супернатанта, содержащего VZV, лишенного клеток.
(а) культивирования диплоидного клеточного штамма фибробластов эмбриональных легких человека LBHEL (KCTC 0127BP) в сосуде для культивирования с целью получения культивируемых клеток LBHEL;
(b) инфицирования культивируемых клеток LBHEL с помощью VZV с целью получения VZV-инфицированных клеток;
(с) культивирования и сбора VZV-инфицированных клеток;
(d) разрушения собранных клеток с целью получения клеточного гомогената и
(е) центрифугирования клеточного гомогената с целью получения супернатанта, содержащего VZV, лишенного клеток.
Краткое описание чертежей.
Вышеперечисленные и прочие цели и признаки настоящего изобретения будут понятны из следующего их описания в сочетании с прилагаемыми чертежами, в которых:
фиг. 1-1 и 1-2 показывают кариотип клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 2 представляет кривые роста: клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения
клеточного штамма MRC-5 (■) и клеточного штамма HEL299 
фиг. 3 изображает количество клеток, подсчитанное после культивирования клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения, клеточного штамма MRC-5 и клеточного штамма HEL299 на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% или 10% сыворотки плода коровы;
фиг. 4 представляет изменение количества бляшкообразующих единиц (БОЕ) VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в зависимости от множественности инфицирования;
фиг. 5 показывает зависимость цитопатогенного эффекта от количества БОЕ VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 6 показывает изменение БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от содержания неинфицированных клеток штамма LBHEL и
фиг. 7 иллюстрирует как изменяется количество БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от степени покрывания клетками поверхности сосуда для культивирования клеток.
фиг. 1-1 и 1-2 показывают кариотип клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 2 представляет кривые роста: клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения
фиг. 3 изображает количество клеток, подсчитанное после культивирования клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения, клеточного штамма MRC-5 и клеточного штамма HEL299 на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% или 10% сыворотки плода коровы;
фиг. 4 представляет изменение количества бляшкообразующих единиц (БОЕ) VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в зависимости от множественности инфицирования;
фиг. 5 показывает зависимость цитопатогенного эффекта от количества БОЕ VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 6 показывает изменение БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от содержания неинфицированных клеток штамма LBHEL и
фиг. 7 иллюстрирует как изменяется количество БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от степени покрывания клетками поверхности сосуда для культивирования клеток.
Подробное описание изобретения.
Используемый в настоящем документе термин "вирус, не содержащий клеток," означает вирус, который не связан с его клеткой-хозяином.
Новый клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения, полученный из диплоидных клеток фибробластов эмбриональных легких человека, можно получить следующим образом.
Сначала берут малую порцию ткани эмбриональных легких человека у 20-недельного эмбриона женского пола, имеющего кариотип, показанный на фиг. 1-1 и 1-2. Эту ткань измельчают на маленькие кусочки и отмывают фосфатным буфером (pH от 7,1 до 7,3). Ткань затем культивируют в фосфатном буфере, содержащем коллагеназу и диспазу ("ферментный раствор") при температуре от 36 до 37oC в атмосфере, содержащей 5% CO2, в течение 5-10 минут. Полученную культуру центрифугируют при 30-50g и осажденную легочную ткань культивируют в вышеупомянутом ферментном растворе при температуре от 36 до 37oC в течение 20-40 минут. Супернатант полученной культуры затем нейтрализуют 5%-ной (по объему) сывороткой плода коровы (СПК). Эту ферментативную обработку повторяют 3-4 раза до тех пор, пока не останется только соединительная ткань.
Затем объединенный тканевый экстракт оставляют стоять при температуре от 4 до 5oC в течение приблизительно 1 часа для выпадения клеточных агрегатов, а полученный супернатант, содержащий отдельные клетки, отделяют и центрифугируют на 800-100 об./мин в течение 1-2 минут. Осажденные клетки собирают, диспергируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 5-10% (о./о.) СПК до концентрации 5-10•106 клеток в мл, а затем культивируют во флаконе Т80 при 36-37oC до тех пор, пока поверхность сосуда для культивирования не покроется клетками. После обработки трипсином культивируемые клетки подвергаются серийному субкультивированию.
Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения, полученный как описано выше, депонирован 9 ноября 1994 г. в Корейской коллекции типовых культур (KCTC) (адрес: GERI, KIST, P.O. Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, Republic of Korea) под номером KCTC 0127 BP в соответствии с условиями Будапештского договора по международному признанию депозита микроорганизма для целей процедуры выдачи патента.
Тестом на хромосомные аномалии подтверждено, что клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения является обычным диплоидным клеточным штаммом и не вызывает образования опухолей в экспериментах на животных. Далее, он растет гораздо быстрее, чем традиционные клеточные штаммы, такие как MRC-5 и HEL299, и имеет повышенную восприимчивость к различным вирусам. Более того, он сохраняет ту же скорость роста даже после 30 поколений субкультур.
Новый клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения имеет следующие характеристики:
(1) Скорость роста клеток.
(1) Скорость роста клеток.
По сравнению со стандартным клеточным штаммом MRC-5 клеточный штамм LBHEL растет быстрее приблизительно в 2 раза, а количество клеток, получающихся из него на фиксированной площади поверхности, превышает таковое у MRC-5 в 1,7 и более раз.
(2) Идентификация бляшек.
Когда клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения используется в качестве клетки-хозяина для определения титра вируса, образующиеся бляшки можно легко идентифицировать, а его воспроизводимость лучше, чем у MRC-5.
(3) Содержание СПК.
Стандартные штаммы диплоидных нормальных клеток человека, включая MRC-5, WI-38 и HEL299, обычно культивируют на среде, содержащей 10% (о./о.) СПК, в то время как клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения хорошо растет на среде, содержание СПК в которой составляет только 5%. Поскольку СПК стоит дорого, клеточный штамм LBHEL предлагает значительную выгоду в сокращении стоимости производства.
(4) Восприимчивость к VZV.
Как показано в таблице 1, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения имеет гораздо более высокую восприимчивость к VZV по сравнению со стандартными штаммами диплоидных нормальных клеток человека, включая MRC-5, HEL299 и Lu18. Это предполагает, что VZV лучше растет на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения, чем на стандартных штаммах диплоидных нормальных клеток человека, упомянутых выше.
Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения может использоваться как клетка-хозяин для получения различных вирусов, таких как вирусы кори, краснухи, гепатита A и вакцины натуральной оспы.
VZV, не содержащий клеток, может быть получен с помощью клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения следующим образом:
(1) Клеточная культура.
(1) Клеточная культура.
Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения можно культивировать на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 5-10% (о. /о.) СПК при температуре от 36 до 37oC в атмосфере, содержащей 5% CO2 для формирования монослоя.
Коэффициент разведения клеток в монослойной культуре может варьировать от 1:5 до 1:10. Клеточную культуру предпочтительно поддерживают до тех пор, пока 70-80% поверхности сосуда для культивирования не покроется клетками, а затем культивируемые клетки подвергаются серийному субкультивированию.
(2) Размножение VZV.
VZV можно инокулировать в культивируемый клеточный штамм LBHEL, полученный как описано выше, при множественности инфицирования от 1:15 до 1:20. Через 1-1,5 часа после инокуляции инфицированные клетки можно культивировать на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 2-5% СПК, при температуре от 36 до 37oC в атмосфере, содержащей 5% CO2, в течение 40-48 часов. Инфицированные клетки можно собирать, когда цитопатогенный эффект, наблюдаемый под микроскопом (100х), достигает 50% или менее, предпочтительно от 30 до 45%. Конкретно, клеточную культуру отмывают фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывают 0,01-0,03% ЭДТК. Затем ее культивируют в течение 5 минут, после чего центрифугируют для сбора VZV-инфицированных клеток.
(3) Разрушение клеток и выделение VZV, не содержащего клеток.
VZV-инфицированные клетки, собранные как описано выше, можно разрушить любым известным способом, таким как обработка ультразвуком и стеклянными бусами. Затем продукты распада клеток можно удалить любым известным способом, таким как центрифугирование и фильтрование, для получения супернатанта, содержащего лишенный клеток VZV.
Когда VZV находится вне клетки-хозяина, в силу клеточно-зависимого свойства его жизнеспособность практически нулевая. Соответственно, этот вирус легко инактивируется, когда инфицированная вирусом клетка разрушается. Упомянутый выше патент США N 4000256 описывает попытку защитить VZV во время этапа разрушения клеток путем добавления приблизительно 7,5 вес.% сахарозы в фосфатном буфере. Когда VZV-инфицированные клетки разрушаются ультразвуковой волной, сам вирус часто разрушается и инактивируется, снижая таким образом выход вируса, не содержащего клеток. Однако использование сахарозной "подушки" не может предотвратить это разрушение и инактивацию вируса.
Снижение выхода вируса, не содержащего клеток, во время обработки ультразвуком можно эффективно предотвратить путем смешивания перед этапом ультразвуковой обработки неинфицированных клеток LBHEL с инфицированными. В осуществлении на практике настоящего изобретения неинфицированные клетки LBHEL смешивают с инфицированными клетками LBHEL в соотношении от 1:4 до 3: 2.
Тем не менее, описанный выше способ часто вызывает образование большого количества продуктов распада клеток, приводя, таким образом, к некоторой потере вируса, не содержащего клеток, во время этапа очистки, такого как фильтрование и центрифугирование. С целью решения этой проблемы настоящее изобретение во время этапа очистки, такого как центрифугирование, применяет раствор сахарозы. Концентрация сахарозы может составлять 15 вес.% или более, предпочтительно от 15 до 45 вес.%.
Полученный описанным выше способом VZV можно использовать для изготовления вакцин обычными способами, такими как аттенуация вируса или добавление вирусных антигенов.
Настоящее изобретение далее описывается и иллюстрируется примерами и тест-примерами, которые, однако, не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения.
В примерах использовали коммерчески доступный VZV, вирус Varicella Biken Oka (АТСС VR-795, N 6w). В настоящем документе, выше и ниже, MRC-5, HEL299 и Lu18, полученные из АТСС, нумеруются как пассаж N1.
Термины и аббревиатуры в настоящем документе используются в их общепринятом значении, если не указывается иное, например: "oC" относится к градусам по Цельсию; "M" относится к молярности; "о./о." относится к объему на объем и "в./о." относится к весу на объем.
Пример 1. Получение клеточного штамма LBHEL.
Малую порцию ткани эмбриональных легких человека брали у 20-недельного эмбриона женского пола, имеющего кариотип, показанный на фиг 1. Эту ткань измельчали на маленькие кусочки (2 х 2 мм) и трижды отмывали фосфатным буфером (pH от 7,2). Полученные кусочки ткани культивировали" при температуре 36oC в течение 5 минут в фосфатном буфере (pH от 7,2), содержащем 130 единиц/мл коллагеназы и 1 мг/мл диспазы ("ферментный раствор"). Культуру центрифугировали при 200g в течение 2 минут для осаждения легочной ткани. Ткань собирали и культивировали в вышеупомянутом ферментном растворе при температуре 37oC в течение 30 минут. Культуру центрифугировали при 50g в течение 2 минут, а супернатант нейтрализовали добавлением 5%-ной сыворотки плода коровы (СПК). Эту ферментативную обработку повторяли 4 раза до тех пор, пока не осталась только соединительная ткань.
Объединенный супернатант нейтрализовали 5% СПК, оставляли стоять при температуре 4oC в течение 1 часа для выпадения клеточных агрегатов, а полученный супернатант, содержащий отдельные клетки, центрифугировали на 1000 об. /мин в течение 2 минут. Осажденные клетки собирали, диспергировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 10% (о./о.) СПК до концентрации 3•106 клеток в мл, а затем культивировали в T-флаконе при 37oC до тех пор, пока поверхность сосуда для культивирования не покрывалась клетками. После обработки 0,25%-ным раствором трипсина клетки подвергали серийному субкультивированию.
Пример 2. Получение вируса VZV на клеточном штамме LBHEL.
Стадия 1. Клеточная культура.
Клеточный штамм LBHEL, приготовленный в примере 1, культивировали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 5% СПК при 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2, для формирования монослоя.
Коэффициент разведения клеток в монослойной культуре был доведен до 1:4. Культуру поддерживали до тех пор, пока 85-95% поверхности сосуда для культивирования не покрылись клетками, а затем культивируемые клетки подвергали серийному субкультивированию.
Стадия 2. Размножение VZV.
Вирус Varicella Biken Oka (ATCC VR-795, N 6w) инокулировали в культивируемый клеточный штамм LBHEL при множественности инфицирования 1:20. Активность вируса составляла от 100000 до 200000 бляшкообразующих клеток (БОК) на флакон Т80 (2 мл). VZV-инфициpoвaнныe клетки культивировали при 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2. Когда цитопатогенный эффект, наблюдавшийся под микроскопом, достигал 25-45%, культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2), а затем обрабатывали 0,02% ЭДТК. Затем ее культивировали в течение 5 минут, после чего инфицированные клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин для сбора инфицированных клеток.
Стадия 3. Разрушение клеток.
Инфицированные клетки LBHEL суспендировали в разрушающем растворе SPGE (pH 7,2, 7,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двухосновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК) до концентрации 5-10•106 клеток/1 мл. Клетки разрушали с помощью игольчатого наконечника (флакон Т80) или "рога" (многопланшетная установка, CF-10) с помощью ультразвукового дезинтегратора (Sonifier, Branson 450) в ледяной бане, до тех пор, пока не оставалось больше протоплазмы.
Стадия 4. Выделение VZV, не содержащего клеток.
Полученное центрифугировали на 1000 об./мин в течение 10 минут для получения супернатанта, содержащего VZV.
Тест-пример 1: Нормальность клеточного штамма LBHEL.
1). Тест на хромосомные аномалии.
Клеточный штамм LBHEL, полученный в примере 1, подвергали тестам на хромосомные аномалии, включавшие хромосомный полиплоидный тест, тест на диплоидность, тест на аномалии формы, тест на расщепленные хромосомы и тест по анализу кариотипа. Все тесты выполняли, используя клеточный штамм MRC-5 в качестве отрицательного контроля в соответствии с положениями "Biological formulation standard and test method therefor (1992)", опубликованного Министерством здравоохранения Кореи. Фиг. 1-1 и 1-2 показывают кариотип клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения.
2). Тест на онкогенность.
Приблизительно по 2•106 клеток клеточного штамма LBHEL, полученного в примере 1, и клеточного штамма Hela, полученного из АТСС, инъецировали подкожно 5 или более голых мышей, имевших дефицит клеточного иммунитета. Спустя 28 дней после инъекции у мышей, которым инъецировали LBHEL, опухолей не наблюдалось, в то время как у всех мышей, получивших инъекцию клеточного штамма Hela, развились опухоли.
Эти экспериментальные результаты подтверждают, что клеточный штамм фибробластов эмбриональных легких человека LBHEL настоящего изобретения представляет из себя нормальную диплоидную клетку.
Тест-пример 2: Сравнение кривых роста клеток штаммов.
Кривую роста клеток штамма LBHEL настоящего изобретения (KCTC 0127BP) строили путем определения количества клеток как функции от времени роста следующим образом, а затем сравнивали с таковыми клеточных штаммов MRC-5 (АТСС CCL 171) и HEL299 (АТСС CCL 137).
Каждый из испытуемых клеточных штаммов культивировали во флаконах Т80 для получения монослоя в соответствии с процедурой этапа 1 примера 2. Клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывали 0,25%-ным трипсином. Спустя 2 минуты клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут.
Осажденные клетки суспендировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% СПК для LBHEL и 10% СПК - для MRC-5 и HEL299, а затем добавляли во флаконы Т80 в количестве 2•106 клеток на флакон. Клетки культивировали при 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2.
Через каждые 24 часа количество клеток определяли следующим образом: сначала культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывали 0,25% трипсином. Спустя 2 минуты клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут. Осажденные клетки суспендировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла и каплю этой суспензии помещали в гемоцитометр (Hausser Scientific). Количество клеток подсчитывали под микроскопом (100х).
Фиг. 2 иллюстрирует количество клеток, подсчитанных как функция от времени культивирования, для клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения 
клеточного штамма MRC-5 (■) и клеточного штамма HEL299 
Как показано на фиг. 2, клеточный штамм LBHEL демонстрировал лог-фазу на один день раньше по сравнению с клеточными штаммами MRC-5 и HEL299, а количество клеток клеточного штамма LBHEL было больше, чем MRC-5 и HEL299, приблизительно в 1,5 раза.
Фиг. 3 изображает количество клеток клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения, клеточного штамма MRC-5 и клеточного штамма HEL299 после культивирования на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% или 10% СПК, в течение 10 дней. Как показано на фиг. 3, количество клеток LBHEL, культивированных на среде, содержавшей 5% СПК, было приблизительно таким же, как и при культивировании на среде, содержавшей 10% СПК. Напротив, клеточный штамм MRC-5 или HEL299 не показывал хорошего роста на среде, содержавшей 5% СПК. Это позволяет предполагать, что LBHEL настоящего изобретения более выгоден экономически, чем другие общеизвестные клеточные штаммы.
Далее, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения хорошо рос после 20 пассажей. Он также хорошо рос на многопланшетной установке (Nunc 164327, 6000 см2), что позволяет использовать клеточный штамм LBHEL для широкомасштабного получения вируса.
Тест-пример 3: Восприимчивость к VZV.
Каждый из клеточных штаммов, представленных в таблице II, культивировали на чашках Петри диаметром 60 мм для получения монослоя, в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2).
Вирус Varicella Biken Oka серийно разводили модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 3% СПК. Разведенную вакцину инокулировали в клетки в количестве 0,1 мл на чашку. Туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивировали при 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2, в течение 7 дней.
Количество образовавшихся бляшек подсчитывали под микроскопом (40х) и определяли БОЕ для оценки чувствительности каждого клеточного штамма к вирусу. Результаты представлены в таблице II.
Как показано в таблице II, восприимчивость клеточного штамма LBHEL по сравнению с таковой клеточных штаммов MRC-5, HEL299 и Lul8 больше приблизительно в 10 раз. Следовательно, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения пригоден для производства вакцины VZV.
Тест-пример 4: Размножение VZV на клеточных штаммах.
Стадия 1. Инокуляция VZV и сбор инфицированных клеток.
Каждый из клеточных штаммов, представленных в таблице III, культивировали на флаконах Т80 для получения монослоя в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2).
Клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varicella Biken Oka, инокулировали в клетки при активности вируса 100000 - 200000 БОЕ на флакон (2 мл).
Спустя 1 час туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивировали при 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2, в течение приблизительно 48 часов. Когда цитопатический эффект достигал 25-45%, культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2), а затем обрабатывали 0,02% ЭДТК. Полученное культивировали в течение 5 минут, и инфицированные клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут для сбора инфицированных клеток.
Стадия 2. Выделение вируса.
Инфицированные клетки, полученные как описано выше, добавляли к разрушающему раствору SPGE (pH 7,2, 7,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двуохсновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК) до концентрации 5-10•106 клеток/1 мл.
Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (Sonifier, Branson 450), используя игольчатый наконечник для флакона Т80 или "рога" - для многопланшетной установки (CF-10) в ледяной бане, до тех пор, пока не оставалось больше интактных клеток. Полученное центрифугировали при 4oC и 1000 об./мин в течение 10 мин для получения супернатанта, содержащего вирус.
Стадия 3. Активность вируса.
Клеточный штамм LBHEL культивировали на чашках Петри диаметром 60 мм для получения монослоя в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2). Инфицированные клетки, собранные на этапе 1, добавляли к монослою культивируемых клеток в количестве 0,3 мл на чашку для определения активности инфицированных клеток. Далее, супернатант, содержавший вирус, который получили на стадии 2, последовательно разводили 4-кратным объемом модифицированной по способу Дульбекко среды Игла и добавляли к монослою культивированных клеток в количестве 0,1 мл на чашку для определения активности вируса, не содержавшего клеток. Вирусу позволяли адсорбироваться на клетках, поддерживая температуру культуры 37oC в атмосфере, содержавшей 5% CO2, в течение 60 минут. Затем туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивирование продолжали при указанных выше условиях.
Спустя 6 дней количество образовавшихся бляшек подсчитывали под микроскопом (40х) и определяли количество БОК и БОЕ для оценки активности инфицированных клеток и вируса, не содержавшего клеток, соответственно. Результаты представлены в таблице III.
Как показано в таблице III, активность VZV в LBHEL настоящего изобретения была выше, чем у других общеизвестных клеточных штаммов. В частности, количество БОК у других общеизвестных клеточных штаммов составляло приблизительно 50% от такового для клеток LBHEL, в то время как количество БОЕ у них достигало самое большее 30% от такового для клеток LBHEL.
Тест-пример 5: Влияние множественности инфицирования (МИ).
В соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4 получали монослойную культуру клеток-хозяев LBHEL и инокулировали в нее клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varicella Biken Oka, при МИ 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 и 1:50 соответственно. Количество БОЕ определяли в соответствии с процедурами этапов 2 и 3 тест-примера 4.
Фиг. 4 представляет изменение в активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в зависимости от МИ. Как показано на фиг. 4, выход вируса, не содержащего клеток, был наиболее высоким при МИ 1:20.
Тест-пример 6: Влияние цитопатогенного эффекта на БОЕ.
В соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4 получали монослойную культуру клеток LBHEL и инокулировали в нее клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varic lla Biken Oka, при МИ 1:20. Инфицированные клетки собирали, когда цитопатогенный эффект достигал 12,5, 25, 37,5, 50, 62,5, 75 и 87,5%. Собранные клетки разрушали ультразвуком и определяли БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.
Фиг. 5 показывает активность VZV, не содержащего клеток (БОЕ), на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в различных цитопатогенных эффектах. Выход вируса, не содержащего клеток, был высоким, если цитопатогенный эффект составлял менее 50%.
Тест-пример 7: Эффект стабилизации неинфицированных клеток.
Клетки LBHEL, инфицированные VZV, получали в соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4, и к инфицированным клеткам LBHEL добавляли неинфицированные клетки LBHEL в количестве 0, 20, 40, 60 и 80%, от общего количества клеток LBHEL. Эту смесь обрабатывали ультразвуком и определяли количество БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.
Фиг. 6 показывает изменение активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), в зависимости от содержания неинфицированных клеток LBHEL. Как показано на фиг. 6, активность вируса, не содержащего клеток, возрастала в присутствии неинфицированных клеток и была самой высокой при содержании неинфицированных клеток от 20 до 60% от общего количества клеток LBHEL.
Далее, эффект смешивания с неинфицированными клетками оценивали с помощью многопланшетной установки (CF-10); результаты представлены в таблице IV.
Как показано в таблице IV, неинфицированные клетки можно эффективно использовать для стабилизации VZV, не содержащего клеток, при широкомасштабном производстве вируса.
Тест-пример 8: Эффект сахарозы.
Инфицированные клетки LBHEL получали и разрушали ультразвуком в соответствии со стадиями 1 и 2 тест-примера 4.
Полученное центрифугировали на 1000 об./мин в течение 10 минут в отсутствие или в присутствии раствора сахарозы (pH 7,2, 15-37,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двухосновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК), как показано в таблице V, и собирали супернатант, содержавший вирус. Затем определяли количество БОЕ в соответствии с процедурой стадии 3 тест-примера 4. Результаты представлены в таблице V.
Как показано в таблице V, добавление раствора сахарозы в концентрации от 15 до 37,5% (в./о.) стабилизирует VZV.
Тест-пример 9: Эффект насыщения клетками поверхности сосуда для культивирования.
Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения культивировали на флаконе Т80 в соответствии со стадией 1 примера 2 для получения монослоя, покрывающего 50, 75 или 100% общей площади поверхности сосуда для культивирования. Штамм Varicella Biken Oka, инфицированный VZV, инокулировали в клетки и культивировали при 37oС в атмосфере, содержавшей 5% CO2, в течение 48 часов. Затем определяли количество БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.
Фиг. 7 показывает изменение активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), в зависимости от степени покрывания клетками поверхности сосуда для культивирования клеток; причем клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения демонстрировал более высокую восприимчивость к VZV при 75% покрывания монослоем, чем при 100%-ном покрывании монослоем поверхности сосуда.
Приведенные выше результаты показывают, что клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения пригоден для производства различных вирусных вакцин против ветряной оспы, кори, краснухи, эпидемического паротита, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, японского энцефалита B, детского полиомиелита, гепатита A, гепатита B, гепатита C и натуральной оспы.
Поскольку варианты практического осуществления настоящего изобретения описаны и проиллюстрированы, понятно, что в них могут вноситься изменения и модификации без выхода за пределы существа настоящего изобретения, которое следует ограничивать только объемом прилагаемой формулы изобретения.
Claims (1)
- Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека LBHEL (КСТС 0127 ВР), используемый для выращивания вируса.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1996/3876 | 1996-02-16 | ||
| KR1019960003876A KR0177323B1 (ko) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | 바이러스 백신 생산에 유용한 사람 이배체 폐세포 및 이를 이용한 수두 백신의 제조방법 |
| PCT/KR1997/000028 WO1997030147A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-02-15 | Human embryonic lung fibroblast diploid cell strain suitable for the production of virus and process for the production of varicella zoster virus using same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97118662A RU97118662A (ru) | 1999-10-10 |
| RU2146289C1 true RU2146289C1 (ru) | 2000-03-10 |
Family
ID=19451399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97118662A RU2146289C1 (ru) | 1996-02-16 | 1997-02-15 | Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, используемый для выращивания вируса |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5952227A (ru) |
| EP (1) | EP0822979A1 (ru) |
| JP (1) | JP2944223B2 (ru) |
| KR (1) | KR0177323B1 (ru) |
| CN (1) | CN1087777C (ru) |
| AR (1) | AR005823A1 (ru) |
| AU (1) | AU688712B2 (ru) |
| BR (1) | BR9702052A (ru) |
| CA (1) | CA2218358C (ru) |
| ID (1) | ID15944A (ru) |
| RU (1) | RU2146289C1 (ru) |
| TW (1) | TW577923B (ru) |
| WO (1) | WO1997030147A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA971238B (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0206309D0 (en) * | 2002-03-16 | 2002-05-01 | Axordia Ltd | Isolated cells |
| GB0504436D0 (en) * | 2005-03-03 | 2005-04-06 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| EP1950285B1 (en) * | 2005-10-05 | 2013-08-07 | GenomIdea Inc. | Isolated human cell, method for obtaining the same and their use |
| CN102911910A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-06 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法 |
| WO2014062060A1 (en) * | 2012-10-18 | 2014-04-24 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | New method for producing high titer cell-free vzv vaccine virus |
| CN103387958B (zh) * | 2013-08-16 | 2016-04-06 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 人胚肺成纤维细胞sv-7在病毒培养中的应用 |
| CN103387957B (zh) * | 2013-08-16 | 2016-06-08 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 人胚肺成纤维细胞sv-4的应用 |
| RU2637093C1 (ru) * | 2016-12-20 | 2017-11-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова) | Способ получения живой культуральной аттенуированной вакцины для профилактики ветряной оспы |
| CN111004772A (zh) * | 2019-09-10 | 2020-04-14 | 安徽智飞龙科马生物制药有限公司 | 一种人二倍体细胞zfb细胞及其构建方法、规模化培养方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5341202B2 (ru) * | 1974-03-12 | 1978-11-01 | ||
| US4338335A (en) * | 1980-02-05 | 1982-07-06 | Merck & Co., Inc. | Vaccine stabilizer containing L-glutamic acid and L-arginine |
| US5310668A (en) * | 1986-06-20 | 1994-05-10 | Merck & Co., Inc. | Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine |
| US4814268A (en) * | 1986-10-06 | 1989-03-21 | Kreider John W | Methods for propagating fastidious human viruses and for producing purified suspensions thereof |
| US5756281A (en) * | 1991-05-23 | 1998-05-26 | Martin; William John | Stealth virus detection in the chronic fatigue syndrome |
| CZ289574B6 (cs) * | 1992-06-04 | 2002-02-13 | Merck And Co., Inc. | Způsob výroby ľivé, atenuované vakcíny viru varicella zoster |
-
1996
- 1996-02-16 KR KR1019960003876A patent/KR0177323B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-02-11 TW TW086101483A patent/TW577923B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-02-13 ZA ZA971238A patent/ZA971238B/xx unknown
- 1997-02-14 ID IDP970435A patent/ID15944A/id unknown
- 1997-02-14 AR ARP970100589A patent/AR005823A1/es active IP Right Grant
- 1997-02-15 AU AU17358/97A patent/AU688712B2/en not_active Ceased
- 1997-02-15 BR BR9702052A patent/BR9702052A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-15 WO PCT/KR1997/000028 patent/WO1997030147A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-02-15 RU RU97118662A patent/RU2146289C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-15 JP JP9529211A patent/JP2944223B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-15 EP EP97904646A patent/EP0822979A1/en not_active Withdrawn
- 1997-02-15 CN CN97190080A patent/CN1087777C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-15 US US08/945,136 patent/US5952227A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-15 CA CA002218358A patent/CA2218358C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997030147A1 (en) | 1997-08-21 |
| CA2218358C (en) | 2004-05-11 |
| CN1087777C (zh) | 2002-07-17 |
| US5952227A (en) | 1999-09-14 |
| KR970062028A (ko) | 1997-09-12 |
| AR005823A1 (es) | 1999-07-14 |
| JPH10509882A (ja) | 1998-09-29 |
| ID15944A (id) | 1997-08-21 |
| CA2218358A1 (en) | 1997-08-21 |
| AU688712B2 (en) | 1998-03-12 |
| KR0177323B1 (ko) | 1999-04-01 |
| AU1735897A (en) | 1997-09-02 |
| ZA971238B (en) | 1998-07-14 |
| JP2944223B2 (ja) | 1999-08-30 |
| TW577923B (en) | 2004-03-01 |
| BR9702052A (pt) | 1998-06-09 |
| EP0822979A1 (en) | 1998-02-11 |
| CN1180377A (zh) | 1998-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4447054B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| KR0156732B1 (ko) | 연속 셀 라인에서의 ibdv 생성 | |
| CA1174599A (en) | Herpes simplex type i subunit vaccine | |
| US3959466A (en) | Highly attenuated cytomegalovirus vaccine and production thereof | |
| RU2146289C1 (ru) | Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, используемый для выращивания вируса | |
| ES2224422T3 (es) | Recuperacion de un virus procedente de un cultivo celular utilizando una disolucion salina hipertonica. | |
| JP3026029B2 (ja) | 組換え水痘ウイルスとその作製法 | |
| KR102320272B1 (ko) | 부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물 | |
| US4112068A (en) | Canine lung cell strain culture systems and processes for the cultivation of viruses and vaccines therefrom | |
| Sinitsyna et al. | Further-attenuated measles vaccine: virus passages affect viral surface protein expression, immunogenicity and histopathology pattern in vivo | |
| Della-Porta et al. | An experimental inactivated virus vaccine against bovine ephemeral fever 1. Studies of the virus | |
| US7344839B2 (en) | Virus preparations and methods | |
| KR0135614B1 (ko) | 약독화 수두 생바이러스 백신 및 그의 제조방법 | |
| RU2637093C1 (ru) | Способ получения живой культуральной аттенуированной вакцины для профилактики ветряной оспы | |
| US20090042273A1 (en) | Recovery of virus from cell culture using hypertonic salt solution | |
| US5514376A (en) | Cell culture of hepatitis A virus | |
| KR100242878B1 (ko) | 수크로즈를 이용한 수두 바이러스의 안정화 방법 | |
| Duh et al. | In vitro transformation of canine embryo cells by murine sarcoma virus (Kirsten) | |
| JPH0622758A (ja) | 新規な新症候出血熱ワクチンおよびその製造方法 | |
| MXPA06000056A (en) | Virus preparations and methods | |
| AU2129202A (en) | Recovery of virus from cell culture using a hypertonic salt solution | |
| JPH1175833A (ja) | トリレオウイルスの調製法 | |
| MXPA00001260A (en) | Recovery of virus from cell culture using a hypertonic salt solution |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080216 |