Claims (40)
1. Универсальный интеграционный и экспрессионный вектор, компетентный для устойчивой трансформации хлоропластового генома различных видов растений, включающий экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую пептид, представляющий интерес, функционально связанную на 5' - и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропластовом геноме растения-мишени, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной в хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающие устойчивую интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластовый геном путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени.1. A universal integration and expression vector competent for the stable transformation of the chloroplast genome of various plant species, including an expression cassette that includes a heterologous sequence encoding a peptide of interest, functionally linked at the 5 'and 3' end with regulatory sequences that allow expression the coding sequence in the chloroplast genome of the target plant, and flanking sequences located on each side of the expression cassette telnosti homologous to a spacer sequence of the target genome hloroplastovogo conservative hloroplastovom in the genome of different plant species, ensuring a stable integration of the heterologous coding sequence into hloroplastovy genome by homologous recombination of the flanking sequences with the homologous sequences in the target genome hloroplastovom.
2. Вектор по п. 1, включающий гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует селектируемый фенотип. 2. The vector according to claim 1, comprising a heterologous nucleotide sequence that encodes a selectable phenotype.
3. Вектор по п. 2, где каждая фланкирующая последовательность включает часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, что облегчает двойную гомологичную рекомбинацию с консервативной спейсерной областью 2 в хлоропластовом геноме мишени.3. The vector according to claim 2, where each flanking sequence includes a portion of the intergenic spacer region 2 between the tRNA Ile and tRNA Ala genes of the chloroplast genome, which facilitates double homologous recombination with the conserved spacer region 2 in the target chloroplast genome.
4. Вектор по п. 3, где каждая фланкирующая последовательность включает кроме части спейсерной области, части или полные гены tRNAIle и tRNAAla, соответственно.4. The vector according to claim 3, where each flanking sequence includes, in addition to part of the spacer region, parts or complete genes of tRNA Ile and tRNA Ala , respectively.
5. Вектор по п. 4, где каждая фланкирующая последовательность включает кроме части спейсерной области, части или полные последовательности генов 16S и/или 23S rRNA. 5. The vector according to claim 4, where each flanking sequence includes, in addition to part of the spacer region, parts or complete sequences of 16S and / or 23S rRNA genes.
6. Вектор по п. 3, где спейсерная область локализована в инвертированном повторе хлоропластового генома. 6. The vector according to claim 3, where the spacer region is localized in an inverted repeat of the chloroplast genome.
7. Вектор по п. 3, где ДНК фланкирующих последовательностей происходит от иного вида растения, чем растение-мишень. 7. The vector according to claim 3, where the DNA of the flanking sequences comes from a different plant species than the target plant.
8. Клетка устойчиво трансформированного растения, содержащая хлоропласт, устойчиво трансформированный вектором по п. 3, или ее потомство. 8. A cell of a stably transformed plant containing chloroplast stably transformed with a vector according to claim 3, or its progeny.
9. Клетка устойчиво трансформированного растения по п. 8, представляющего собой однодольное растение. 9. A cell of a stably transformed plant according to claim 8, which is a monocotyledonous plant.
10. Клетка устойчиво трансформированного растения по п. 8, представляющего собой двудольное растение. 10. A cell of a stably transformed plant according to claim 8, which is a dicotyledonous plant.
11. Клетка устойчиво трансформированного растения по п. 9, представляющего собой маис, рис, траву, рожь, ячмень, овес или пшеницу. 11. A cell of a stably transformed plant according to claim 9, which is maize, rice, grass, rye, barley, oats or wheat.
12. Клетка устойчиво трансформированного растения по п. 10, представляющего собой сою, арахис, виноград, картофель, сладкий картофель, горох, канолу (canola), табак, томат или хлопчатник. 12. The cell of a stably transformed plant according to claim 10, which is soy, peanuts, grapes, potatoes, sweet potatoes, peas, canola (canola), tobacco, tomato or cotton.
13. Способ устойчивой трансформации вида растения-мишени, включающий введение интеграционного и экспрессионного универсального вектора в хлоропластовый геном растения-мишени и выращивание трансформированного растения, причем вектор является компетентным для устойчивой трансформации хлоропласта различных видов растений и включает экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую пептид, представляющий интерес, функционально связанную на 5' - и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропласте растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной в хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающий устойчивую интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластовый геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени.13. A method for the stable transformation of a target plant species, comprising introducing an integration and expression universal vector into the chloroplast genome of a target plant and growing a transformed plant, the vector being competent for stable transformation of the chloroplast of various plant species and includes an expression cassette that includes a heterologous sequence encoding a peptide of interest functionally linked at the 5 ′ and 3 ′ end to regulatory sequences, providing denoting the expression of the coding sequence in the chloroplast of the target plant, a heterologous nucleotide sequence encoding a selectable phenotype, and flanking sequences located on each side of the expression cassette, including, each, part of the intergenic spacer region 2 between the tRNA Ile and tRNA Ala genes of the chloroplast genome homologous to the spacer sequence chloroplast genome of the target, conservative in the chloroplast genome of various plant species, providing a stable integra the heterologous coding sequence into the chloroplast genome of the target plant by homologous recombination of flanking sequences with homologous sequences in the chloroplast target genome.
14. Способ по п. 13, где трансформируемое растение является однодольным растением. 14. The method of claim 13, wherein the transformable plant is a monocotyledonous plant.
15. Способ по п. 13, где трансформируемое растение является двудольным растением. 15. The method of claim 13, wherein the transformable plant is a dicotyledonous plant.
16. Способ по п. 14, где трансформируемое растение представляет собой одно из следующих однодольных растений: маис, рис, траву, рожь, ячмень, овес или пшеницу. 16. The method according to p. 14, where the transformable plant is one of the following monocotyledonous plants: maize, rice, grass, rye, barley, oats or wheat.
17. Способ по п. 15, где трансформируемое растение представляет собой одно из следующих двудольных растений: сою, арахис, виноград, сладкий картофель, горох, канолу, табак, томат или хлопчатник. 17. The method according to p. 15, where the transformed plant is one of the following dicotyledonous plants: soy, peanuts, grapes, sweet potatoes, peas, canola, tobacco, tomato or cotton.
18. Способ по п. 13, включающий выделение пептида, представляющего интерес. 18. The method of claim 13, comprising isolating the peptide of interest.
19. Способ по п. 13, где полипептид, представляющий интерес, является синтетическим полимером на основе белка (РВР). 19. The method of claim 13, wherein the polypeptide of interest is a protein-based synthetic polymer (PBP).
20. Способ по п. 19, где РВР содержит повторяющиеся пентамерные последовательности (GVGVP)n, где n - целое число от 1 до 250, G означает глицин, V означает валин, и Р означает пролин.20. The method of claim 19, wherein the PBP comprises repeating pentameric sequences (GVGVP) n , where n is an integer from 1 to 250, G is glycine, V is valine, and P is proline.
21. Способ по п. 19, где экспрессированным полипептидом, представляющим интерес, является инсулин. 21. The method of claim 19, wherein the expressed polypeptide of interest is insulin.
22. Способ по п. 21, включающий выделение инсулина. 22. The method according to p. 21, including the selection of insulin.
23. Способ по п. 21, где инсулин находится в форме проинсулина. 23. The method of claim 21, wherein the insulin is in the form of proinsulin.
24. Способ по п. 23, где проинсулин слит с РВР. 24. The method of claim 23, wherein the proinsulin is fused to a PBP.
25. Способ по п. 21, где трансформируемое растение представляет собой табак. 25. The method of claim 21, wherein the transformable plant is tobacco.
26. Способ по п. 19, где полипептид, представляющий интерес, является сывороточным альбумином человека (HSA). 26. The method of claim 19, wherein the polypeptide of interest is human serum albumin (HSA).
27. Способ по п. 26, где трансформируемое растение представляет собой табак. 27. The method of claim 26, wherein the transformable plant is tobacco.
28. Вектор по п. 3, где пептид, представляющий интерес, является биологически активной молекулой. 28. The vector of claim 3, wherein the peptide of interest is a biologically active molecule.
29. Клетка устойчиво трансформированного растения, содержащая хлоропластовый геном, устойчиво трансформированный вектором по п. 28, содержащая биологически активную молекулу. 29. A cell of a stably transformed plant containing a chloroplast genome stably transformed by a vector according to claim 28, containing a biologically active molecule.
30. Клетка устойчиво трансформированного устойчивого к гербициду растения-мишени или ее потомство, содержащие хлоропласт, устойчиво трансформированный универсальным интеграционным и экспрессионным вектором, компетентным для устойчивой трансформации хлоропласта различных видов растений, включающим экспрессионную кассету, которая включает гетерологичный белок, представляющий интерес, экспрессированный гетерологичной последовательностью в хлоропластовом геноме вида растения-мишени, селектируемый фенотип, иной чем толерантность к указанному гербициду, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной в хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающие устойчивую интеграцию гетерологичного белка в хлоропластовый геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени.30. A cell of a stably transformed herbicide-resistant target plant or its progeny containing chloroplast stably transformed with a universal integration and expression vector competent for stable transformation of the chloroplast of various plant species, including an expression cassette that includes a heterologous protein of interest expressed by a heterologous sequence in the chloroplast genome of a target plant species, a selectable phenotype other than tolerance to what was proved herbicide, and disposed on each side of the expression cassette flanking sequences comprising each a portion of the intergenic spacer region 2 between genes tRNA Ile and the tRNA Ala hloroplastovogo genome homologous to a spacer sequence hloroplastovogo genome target conservative in hloroplastovom genome of different plant species, providing stable integration heterologous protein into the chloroplast genome of the target plant by homologous recombination of flanking sequences with homologous E hloroplastovom sequences in the target genome.
31. Клетка устойчивого к гербициду растения-мишени по п. 30, где гербицидом является глифозат. 31. A cell of a herbicide resistant target plant according to claim 30, wherein the herbicide is glyphosate.
32. Клетка устойчивого к гербициду растения-мишени по п. 30, представляющего собой маис, рис, траву, рожь, ячмень, овес, пшеницу, сою, арахис, виноград, картофель, сладкий картофель, горох, канолу, табак, томат или хлопчатник. 32. A cell of the herbicide resistant target plant of claim 30, comprising maize, rice, grass, rye, barley, oats, wheat, soy, peanuts, grapes, potatoes, sweet potatoes, peas, canola, tobacco, tomato or cotton .
33. Способ придания устойчивости к гербициду виду растения-мишени, включающий введение в растение универсального интеграционного и экспрессионного вектора, компетентного для (устойчиво трансформированного универсальным интеграционным и экспрессионным вектором для) устойчивой трансформации хлоропласта различных видов растений, включающего экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую белок, представляющий интерес, придающий устойчивость к гербициду, функционально связанную на 5' - и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропласте растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, иной чем толерантность к указанному гербициду, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной в хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающие устойчивую интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластовый геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени, и выращивание трансформированного растения.33. A method of imparting herbicide resistance to a target plant species, comprising introducing into the plant a universal integration and expression vector competent for (stably transformed by a universal integration and expression vector for) stable transformation of chloroplast of various plant species, including an expression cassette that includes a heterologous sequence, coding protein of interest, giving herbicide resistance, functionally linked at the 5 'and 3' end regulatory sequences ensuring expression of the coding sequence in the chloroplast of the target plant, a heterologous nucleotide sequence coding for a selectable phenotype other than tolerance to said herbicide, and disposed on each side of the expression cassette flanking sequences comprising each a portion of the intergenic spacer region 2 between genes tRNA Ile and tRNA Ala of the chloroplast genome, homologous to the spacer sequence of the target chloroplast genome, active in the chloroplast genome of various plant species, ensuring stable integration of the heterologous coding sequence into the chloroplast genome of the target plant by homologous recombination of flanking sequences with homologous sequences in the chloroplast target genome, and growing the transformed plant.
34. Способ по п. 33, где последовательность ДНК кодирует мутантную форму фермента, имеющую меньшую аффинность к гербициду, чем у фермента, встречающегося в природе. 34. The method according to p. 33, where the DNA sequence encodes a mutant form of the enzyme having a lower affinity for the herbicide than the enzyme found in nature.
35. Способ по п. 33, где фермент представляет собой EPSP-синтазу, а гербицидом является глифозат. 35. The method of claim 33, wherein the enzyme is EPSP synthase and the herbicide is glyphosate.
36. Способ по п. 33 для устойчивой трансформации фенотипа вида растения-мишени, в выращенном трансформированном растении экспрессируется селектируемый фенотип и другой признак в дополнение к экспрессии указанного фенотипа. 36. The method according to p. 33 for the stable transformation of the phenotype of the target plant species, a selectable phenotype and another trait is expressed in the grown transformed plant in addition to expressing the phenotype.
37. Способ по п. 36, где выбранный фенотип обеспечивается посредством экспрессии гена гидромицин-β-фосфотрансферазы, а дополнительным признаком, является устойчивость к гербициду глифозату. 37. The method according to p. 36, where the selected phenotype is provided by expression of the hydromycin-β-phosphotransferase gene, and an additional feature is the herbicide glyphosate resistance.
38. Способ определения трансформации хлоропласта и экспрессии намеченного признака на основании приобретения видом растения-мишени устойчивости к выбранному гербициду вследствие трансформации вида растения, включающий введение в растение универсального интеграционного и экспрессионного вектора, компетентного для устойчивой трансформации хлоропласта различных видов растений, включающего экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, кодирующую нужный намеченный признак, функционально связанную на 5' - и 3'-конце с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующей последовательности в хлоропласте растения-мишени, гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый фенотип, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающие устойчивую интеграцию гетерологичной кодирующей последовательности в хлоропластовый геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени, воздействие на растения, в которые введен вектор, летальной концентрации гербицида, и отбор растений, которые не погибают при таком воздействии, причем посредством этого отбирают трансформированные растения, экспрессирующие нужный намеченный признак.38. A method for determining chloroplast transformation and expression of an intended trait based on the acquisition by a target plant species of resistance to a selected herbicide due to transformation of a plant species, comprising introducing into the plant a universal integration and expression vector competent for stable chloroplast transformation of various plant species, including an expression cassette, which includes a heterologous sequence encoding the desired intended sign, functionally linked to 5 ' - and the 3'-end with regulatory sequences providing expression of the coding sequence in the chloroplast of the target plant, a heterologous nucleotide sequence encoding a selectable phenotype, and flanking sequences located on each side of the expression cassette, including, each, part of the intergenic spacer region 2 between tRNA genes Ile and tRNA Ala of the chloroplast genome, homologous to the spacer sequence of the chloroplast target genome, conservative chloroplast genome different plant species that ensure stable integration of the heterologous coding sequence into the chloroplast genome of the target plant by homologous recombination of flanking sequences with homologous sequences in the chloroplast target genome, the effect on the plants into which the vector is introduced, the lethal concentration of the herbicide, and the selection of plants that do not die when such an effect, whereby transformed plants expressing the desired intended trait are selected.
39. Устойчиво трансформированный устойчивый к насекомым вид растения-мишени или его потомство, содержащие хлоропластовый геном, устойчиво трансформированный универсальным интеграционным и экспрессионным вектором, компетентным для устойчивой трансформации хлоропласта различных видов растений, включающим экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную последовательность, экспрессирующую намеченный белок, придающий устойчивость к намеченному насекомому, в хлоропластовом геноме вида растения-мишени, селектируемый фенотип иной, чем толерантность к намеченному насекомому, и расположенные с каждой стороны экспрессионной кассеты фланкирующие последовательности, включающие, каждая, часть межгенной спейсерной области 2 между генами tRNAIle и tRNAAla хлоропластового генома, гомологичные спейсерной последовательности хлоропластового генома мишени, консервативной в хлоропластовом геноме различных видов растений, обеспечивающие устойчивую интеграцию гетерологичного белка в хлоропластовый геном растения-мишени путем гомологичной рекомбинации фланкирующих последовательностей с гомологичными последовательностями в хлоропластовом геноме мишени, где гетерологичным белком является белок-токсин CryII, экспрессируемый геном CryIIA, придающий устойчивость к насекомым.39. A stably transformed insect-resistant species of a target plant or its progeny containing a chloroplast genome stably transformed by a universal integration and expression vector competent for stable transformation of the chloroplast of various plant species, including an expression cassette that includes a heterologous sequence expressing the intended protein, which gives resistance to the target insect in the chloroplast genome of the target plant species, breeding phenotype and oh than tolerance by the target insect, and disposed on each side of the expression cassette flanking sequences comprising each a portion of the intergenic spacer region 2 between genes tRNA Ile and the tRNA Ala hloroplastovogo genome homologous to a spacer sequence hloroplastovogo genome target conservative in hloroplastovom genome different species plants ensuring stable integration of the heterologous protein into the chloroplast genome of the target plant by homologous recombination of flanking sequences sequences with homologous sequences in the chloroplast target genome, where the heterologous protein is the CryII toxin protein expressed by the CryIIA gene, which confers insect resistance.
40. Устойчиво трансформированный транскрипционно/трансляционно активный хлоропластовый геном растения-мишени, компетентный для устойчивой интеграции гетерологичной последовательности, включающий экспрессионную кассету, которая включает гетерологичную молекулу, представляющую интерес, кодированную гетерологичной последовательностью ДНК, и экспрессирующуюся под контролем регуляторных последовательностей в хлоропластовом геноме растения-мишени, и ДНК растения, фланкирующая каждую сторону экспрессионной кассеты, обеспечивающая устойчивую интеграцию ДНК в хлоропластовый геном мишени путем гомологичной рекомбинации, причем указанная ДНК наследуется через репликацию органеллы в дочерних клетках. 40. A stably transformed transcriptionally / translationally active chloroplast genome of a target plant competent for the stable integration of a heterologous sequence, including an expression cassette that includes a heterologous molecule of interest encoded by a heterologous DNA sequence and expressed under the control of regulatory sequences in the chloroplast genome of the target plant , and plant DNA flanking each side of the expression cassette, providing tainable integration of DNA into the target genome hloroplastovy by homologous recombination, said DNA is inherited through organelle replication in daughter cells.