RU2086247C1

RU2086247C1 - Method of wound-healing preparation preparing

Info

Publication number: RU2086247C1
Application number: RU94035252A
Authority: RU
Inventors: Е.П. Феофилова; В.М. Терешина; А.А. Алексеев; И.А. Гришина
Original assignee: Институт микробиологии РАН
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1994-09-22
Publication date: 1997-08-10

Abstract

FIELD: medicine, biotechnology. SUBSTANCE: the grown fungus mycelium is homogenized, treated with hot water and alkali with detergent. After repeated homogenization biomass is heated with spirituous alkali, dialyzed against water and subjected for lyophilic drying. Method can be used for preparing wound-healing preparations from mycelial fungi. EFFECT: improved method of preparing. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения из мицелия грибов препаратов, обладающих ранозаживляющим действием. The invention relates to biotechnology and medicine and can be used to obtain preparations from the mycelium of fungi that have a wound healing effect.

Известно, что в качестве лечебных средств при лечении ожоговых травм используют поливиниловый спирт, полиоксипропилен, коллаген, ферментсодержащие средства и природные стимуляторы типа облепихового масла, подсолнечного масла и др. Имеются также данные о применении для этих же целей полиаминосахаридов (хитина, хитозана), их мономеров и производных, а также композиций, состоящих из солей органических кислот и хитина. It is known that polyvinyl alcohol, polyoxypropylene, collagen, enzyme-containing agents and natural stimulants such as sea buckthorn oil, sunflower oil, etc. are used as therapeutic agents in the treatment of burn injuries. There is also evidence of the use of polyaminosaccharides (chitin, chitosan) for these purposes, their monomers and derivatives, as well as compositions consisting of salts of organic acids and chitin.

Лечебно-заживляющий эффект производных хитина предложено даже использовать для лечения волос, причем не только при ранениях, но и как репарирующее средство, применяемое в специальных пастах, содержащих, например, хитозан с 90 свободных аминогрупп. It has even been proposed to use the healing and healing effect of chitin derivatives for treating hair, not only for wounds, but also as a repair agent used in special pastes containing, for example, chitosan with 90 free amino groups.

Для составления противоожоговых композиций используют обычно производные хитина, полученные из крабов или омаров. Так, в последние годы противоожоговые повязки на основе хитина крабов выпускает Япония (название повязки Beschitin W). Коммерцией этого хитинового изделия занимается японская фирма Unitika. Однако в настоящее время более доступным и дешевым сырьем является хитит и его производные, получаемые из клеточных стенок грибов. Это объясняется сокращением популяции ракообразных (Crustaceae) из-за загрязнения окружающей среды, нарушением природных пищевых цепочек в результате массового отлова рыб и ракообразных и уничтожением водорослей и зоопланктона. Кроме того, высокая стоимость и дефицитность крабов связаны также с сезонностью их отлова. Chitin derivatives derived from crabs or lobsters are usually used to formulate anti-burn compositions. So, in recent years, Japan produces anti-burn dressings based on crab chitin (the name is Beschitin W dressing). Commerce of this chitin product is carried out by the Japanese company Unitika. However, at present, more affordable and cheaper raw materials are chitite and its derivatives, obtained from the cell walls of fungi. This is due to a reduction in the population of crustaceans (Crustaceae) due to environmental pollution, disruption of natural food chains as a result of the mass capture of fish and crustaceans, and the destruction of algae and zooplankton. In addition, the high cost and scarcity of crabs are also associated with the seasonality of their capture.

Указанных выше недостатков, свойственных этой сырьевой базе, лишены мицелиальные грибы, получаемые биотехнологическим способом в ферментах. Такой способ получения сырья не зависит от сезонности, процесс занимает всего 3-4 дня, может быть использовано дешевое сырье для получения питательных сред, например, мука, древесные отходы. Очень существенно, что полученные при этом полиаминосахариды не содержат тяжелые металлы, производные фенола, т.е. те примеси, которые обнаруживаются в хитине ракообразных и делают непригодными получаемые на базе этих полиаминосахаридов лечебные препараты. The above disadvantages inherent in this raw material base are deprived of mycelial fungi obtained by the biotechnological method in enzymes. This method of obtaining raw materials does not depend on seasonality, the process takes only 3-4 days, cheap raw materials can be used to obtain nutrient media, for example, flour, wood waste. It is very important that the resulting polyaminosaccharides do not contain heavy metals, phenol derivatives, i.e. those impurities that are found in crustacean chitin and make the medications obtained on the basis of these polyaminosaccharides unsuitable.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ использования хитина для заживления ран, согласно которому грибы (Mucor spinosus, Aspergillus niger, Penicillium, Cryptococcus) выращиваются на твердых средах поверхностным способом. В состав сред выращивания входят: бычье сердце (или коровье), мозги теленка, пептон, сахароза, бактопептон и др. Выращенный мицелий грибов вместе с субстратом стерилизуют кипячением, далее отделяют грибную биомассу, отмывают ее и высушивают, затем удаляют хлороформом жирорастворимый материал при комнатной температуре. Обезжиренный материал обрабатывают далее 1 н щелочью в течение 18 ч и подкисляют соляной кислотой, отмывают водой и диализируют против дистиллированной воды. Описанные процедуры по очистке мицелия повторяют, далее материал сушат в вакууме при температуре не выше 50 ^oC и получают серую, рыхлую массу. При испытаниях на животных этот продукт увеличивал на 20 заживление ран по сравнению с контрольными животными.Closest to the technical nature of the present invention is a method of using chitin for wound healing, according to which fungi (Mucor spinosus, Aspergillus niger, Penicillium, Cryptococcus) are grown on solid media by a surface method. The composition of the growth media includes: bovine heart (or cow), calf brains, peptone, sucrose, bactopeptone, etc. The mushroom mycelium grown together with the substrate is sterilized by boiling, then the mushroom biomass is separated, washed and dried, then the fat-soluble material is removed with chloroform at room temperature temperature. The defatted material is treated further with 1 N alkali for 18 hours and acidified with hydrochloric acid, washed with water and dialyzed against distilled water. The described procedures for cleaning the mycelium are repeated, then the material is dried in vacuum at a temperature not exceeding 50 ^o C and get a gray, loose mass. When tested in animals, this product increased wound healing by 20 compared to control animals.

Недостатком данного способа является использование: дорогостоящих и дефицитных сред, поверхностного способа выращивания, что ограничивает масштабы производства, применение хлороформа, который является дорогостоящим и канцерогенным растворителем, запрещенным к применению во всех биотехнологических производствах. Кроме того, в качестве грибов предлагается использовать аскомицетные грибы, например, аспергиллы, которые содержат афлатоксины, а при поверхностном способе выращивания, так же как и Penicillium, образуют споры, распространяющиеся воздушным путем и вызывающие аллергенные и легочные заболевания. The disadvantage of this method is the use of: expensive and scarce media, a surface method of growing, which limits the scale of production, the use of chloroform, which is an expensive and carcinogenic solvent, banned for use in all biotechnological industries. In addition, it is proposed to use ascomycetic fungi, for example, aspergillus, which contain aflatoxins, as fungi, and with the surface method of growth, like Penicillium, they form spores that spread by air and cause allergenic and pulmonary diseases.

Целью данного изобретения является разработка нового способа получения из мицелия грибов хитинсодержащих препаратов, оказывающих заживляющее действие на раны, полученные в результате ожоговых травм, а также расширение числа используемых продуцентов. The aim of the present invention is to develop a new method for producing chitin-containing preparations from mycelium of fungi that have a healing effect on wounds resulting from burn injuries, as well as expanding the number of producers used.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мицелиальные грибы, относящиеся к порядкам Phycomycetes и Basidiomycetes (Cunninghamella japonica BRMF-1204(-), Pleurotus ostreatus BRMF721, Blakeslea trispora A-732-3(+) и A-732-3(-) выращивают в погруженной культуре. Выращенную биомассу отделяют от среды культивирования и прогревают на водяной бане при температуре 98 ^oC в течение ч. Отфильтрованную биомассу гомогенезируют и обрабатывают 1 н щелочью с добавлением детергента в течение 12 ч при интенсивном перемешивании при температуре 28 ^oC. Следующая стадия очистки включает повторную гомогенизацию целевого продукта и его обработку 1 этанолом в 0,3 н щелочи при температуре 96 ^oC в течение 1 ч. Далее целевой продукт диализируют в течение 12 ч против дистиллированной воды с последующей лиофильной сушкой.The essence of the invention lies in the fact that mycelial fungi belonging to the orders Phycomycetes and Basidiomycetes (Cunninghamella japonica BRMF-1204 (-), Pleurotus ostreatus BRMF721, Blakeslea trispora A-732-3 (+) and A-732-3 (-) The grown biomass is separated from the culture medium and heated in a water bath at a temperature of 98 ^o C for one hour. The filtered biomass is homogenized and treated with 1 N alkali with detergent added for 12 hours with vigorous stirring at a temperature of 28 ^o C. Next purification step involves repeated homogenization the desired product and its treatment with 1 ethanol in 0.3 N alkali at a temperature of 96 ^° C. for 1 hour. Next, the target product is dialyzed for 12 hours against distilled water, followed by freeze drying.

Кипячение с водой способствует удалению водорастворимых, несвязанных ковалентно или ионными связями соединений: белков, углеводов, органических кислот и др. Обработка 1 н щелочью с детергентом дает возможность удалить часть прочносвязанных щелочерастворимых белков, липидов и углеводов. Разрыву межмолекулярных связей в биополимерах значительно способствует введение детергента. Обработка щелочью с этанолом приводит к дальнейшему удалению цитоплазматического содержимого мицелия грибов, включая белки, углеводы и особенно жирорастворимые соединения. Boiling with water helps to remove water-soluble, unbound covalent or ionic compounds: proteins, carbohydrates, organic acids, etc. Treatment with 1 N alkali with a detergent makes it possible to remove part of the strongly bound alkali-soluble proteins, lipids and carbohydrates. The breakdown of intermolecular bonds in biopolymers is significantly facilitated by the introduction of a detergent. Treatment with alkali with ethanol leads to further removal of the cytoplasmic contents of fungal mycelium, including proteins, carbohydrates and especially fat-soluble compounds.

Полученный таким способом препарат, названный "Микораном", представляет собой порошок бежевого цвета. Этот препарат испытывали на крысах-самцах весом 200-220 г на экспериментальных моделях ожога кожи (термические ожоги) в сравнении с активностью заживления ран у контрольных животных. Лечение препаратами из мицелиальных грибов начинали сразу после нанесения ожога, площадь которого составляла 30-40 от поверхности тела, т.е. наносили 250 мг препарата на см² раны. Проводились гистологические, микробиологические и цитологические исследования ожоговых ран, на которые наносили препараты. В качестве второго контроля использовали также животных, которых лечили препаратом "Гелевин", широко используемым в настоящее время как противоожоговое средство.The preparation thus obtained, called "Mikoran", is a beige powder. This drug was tested on male rats weighing 200-220 g in experimental models of skin burns (thermal burns) in comparison with the activity of wound healing in control animals. Treatment with preparations of mycelial fungi began immediately after applying a burn, the area of which was 30-40 from the surface of the body, i.e. inflicted 250 mg of the drug per cm ² wounds. Histological, microbiological and cytological studies of burn wounds were carried out on which the preparations were applied. As a second control, animals were also used that were treated with Gelevin, which is now widely used as an anti-burn agent.

Пример 1. Мицелиальный гриб Cunninghamella japonica BKMF-1204(-) выращивают на среде следующего состава: соевая мука 4 кукурузная мука - 1,73 KH₂PO₄ 0,05 pH среды 5,8, стерилизация ведется при 1 атмосфере 30 мин. Полученную биомассу отделяют от среды выращивания и в количестве 20 г (влажность биомассы 70-80) подвергают гомогенизации 3 раза в течение 3 мин для удаления цитоплазматического содержимого. Далее гомогенизированную биомассу, содержащую фрагменты мицелия, помещают в колбу, добавляют 4-х кратный объем воды и прогревают 1 ч при 98 ^oC, не допуская кипения. Биомассу отфильтровывают, делят на 4 равные части и помещают в колбы на 2,5 л, куда добавляют 0,5 л 0,2 раствора детергента в 1 н растворе NaOH. В качестве детергента используют стиральный порошок "Лотос". Колбы с биомассой выдерживают при интенсивном перемешивании в течение 12 ч при температуре 28 ^oC. Далее для нейтрализации добавляют 0,5 л 1 н HCl. Осадок отмывают горячей водой (с температурой 98 ^oC), затем холодной водой до pH 7,0. Осуществляют микроскопический контроль за удалением цитоплазматического содержимого мицелия. Следующая стадия обработки включает повторную гомогенизацию целевого продукта, его обработку 1 этанолом в 0,3 н щелочи при температуре 96 ^oC в течение 1 ч при интенсивном перемешивании. Затем осадок нейтрализуют 0,3 н соляной кислотой и отмывают горячей и холодной водой до нейтральной реакции. На этой стадии обработки микроскопический контроль должен показать значительную потерю цитоплазматического содержимого гиф и преобладание фракции клеточных стенок, в противном случае щелочные обработки необходимо повторить. Последующий этап обработки проведение диализа против дистиллированной воды (целевой продукт помещают в целлофановый мешочек) в течение 12 ч для удаления (целевой продукт помещают в целлофановый мешочек) в течение 12 ч для удаления солей тяжелых металлов и соединений с низким молекулярным весом. Далее продукт сушат лиофильно и подвергают размельчению до стадии мелкодисперсного порошка. Выход целевого продукта составляет до 20 от веса исходной сухой биомассы. При испытании на животных, по данным цитологических и гистологических исследований, препарат оказывает лечебный эффект: гнойное воспаление и некроз тканей носят поверхностный характер, идет почти полное созревание грануляций, а также образование молодой и даже зрелой соединительной ткани, обнаружены регенераторные явления со стороны мышечной и жировой ткани.Example 1. The mycelial fungus Cunninghamella japonica BKMF-1204 (-) is grown on a medium of the following composition: soy flour 4 corn flour - 1.73 KH ₂ PO ₄ 0.05 pH 5.8, sterilization is carried out at 1 atmosphere for 30 minutes. The resulting biomass is separated from the growing medium and in an amount of 20 g (biomass humidity 70-80) is subjected to homogenization 3 times for 3 minutes to remove cytoplasmic contents. Next, a homogenized biomass containing fragments of mycelium is placed in a flask, a 4-fold volume of water is added and heated for 1 h at 98 ^° C, without boiling. The biomass is filtered off, divided into 4 equal parts and placed in 2.5 L flasks where 0.5 L of a 0.2 solution of detergent in a 1 N NaOH solution is added. As a detergent, lotus laundry detergent is used. Flasks with biomass are kept under vigorous stirring for 12 h at a temperature of 28 ^o C. Next, to neutralize add 0.5 l of 1 n HCl. The precipitate is washed with hot water (with a temperature of 98 ^o C), then with cold water to a pH of 7.0. Microscopic control of the removal of the cytoplasmic contents of the mycelium is carried out. The next stage of processing involves re-homogenization of the target product, its treatment with 1 ethanol in 0.3 N alkali at a temperature of 96 ^o C for 1 h with vigorous stirring. Then the precipitate is neutralized with 0.3 N hydrochloric acid and washed with hot and cold water until neutral. At this stage of processing, the microscopic control should show a significant loss of the cytoplasmic contents of the hyphae and the predominance of the fraction of cell walls, otherwise alkaline treatments must be repeated. The subsequent processing step is dialysis against distilled water (the target product is placed in a plastic bag) for 12 hours to remove (the target product is placed in a plastic bag) for 12 hours to remove heavy metal salts and compounds with a low molecular weight. Next, the product is freeze-dried and subjected to grinding to the stage of fine powder. The yield of the target product is up to 20 of the weight of the original dry biomass. When tested on animals, according to cytological and histological studies, the drug has a therapeutic effect: purulent inflammation and tissue necrosis are superficial, granulation almost completely ripens, as well as the formation of young and even mature connective tissue, regenerative effects from muscle and fat are found tissue.

Пример 2. То же, что пример 1, но в качестве мицелиального гриба используют штамм Pleurotus ostreatus BRMF-721. Гриб выращивают на среде того же состава, что и в примере 1, но с добавлением 1 растительного масла, pH среды 6,9, ферметация продолжается пять суток. Выход целевого продукта 15 Результаты испытаний на животных аналогичны данным, приведенным в примере 1. Example 2. The same as example 1, but as a mycelial fungus using the strain Pleurotus ostreatus BRMF-721. The fungus is grown on a medium of the same composition as in example 1, but with the addition of 1 vegetable oil, pH 6.9, fermentation lasts five days. The yield of the target product 15. The results of animal tests are similar to the data given in example 1.

Пример 3. То же, что пример 1, но в качестве мицелиального гриба используют Blakeslea trispora A-732-3 (+) и A-732-3 (-), полученные из промышленной коллекции A/O "Уралбиофарм" (бывший завод "Медпрепаратов", г. Екатеринбург). В этом случае препарат, названный "Микораном", при испытаниях на животных показал ярковыраженный стимулирующий эффект, превосходящий таковой в примерах 1 и 2, а также в препарате "Гелевин", на процессы регенерации тканей при ожоговых травмах. Препарат "Микоран" обеспечивает эпителизацию ожоговой раны статически достоверно быстрее, чем при лечении ожоговой раны "Гелевином" и по сравнению с контрольными животными. Кроме того, применение препарата "Микоран" обеспечивает уменьшение обсемененности ран инфицирующими микроорганизмами на всех сроках наблюдения. Результаты испытаний суммированы в таблице 1. Испытания проводились в Ожоговом Центре Института хирургии им. Вишневского РАМН. Отчет прилагается. Example 3. The same as example 1, but as a mycelial fungus using Blakeslea trispora A-732-3 (+) and A-732-3 (-), obtained from the industrial collection A / O "Uralbiopharm" (former factory " Medications ", Ekaterinburg). In this case, the drug, called "Mikoran", when tested on animals showed a pronounced stimulating effect, superior to that in examples 1 and 2, as well as in the preparation "Gelevin", on the processes of tissue regeneration in burn injuries. The drug "Mikoran" provides epithelization of a burn wound statically significantly faster than in the treatment of a burn wound "Gelevin" and compared with control animals. In addition, the use of the drug "Mikoran" provides a reduction of contamination of wounds by infectious microorganisms at all periods of observation. The test results are summarized in table 1. The tests were carried out at the Burn Center of the Institute of Surgery. Vishnevsky RAMS. The report is attached.

Пример 4. То же, что и пример 3, но биомассу B. trispora выращивали на среде с добавлением 5 подсолнечного масла. Полученный описанным выше способом препарат содержал на 30-40 больше липидов, чем препарат "Микоран". Лечение этим препаратом оказывает положительный эффект на заживление ран при ранних стадиях лечения: отмечается наименьшая обсемененность ран и отсутствие гнойного воспаления на дне раны. В дальнейшем заживляющее действие выражено слабее, чем у "Микорана". Example 4. Same as example 3, but B. trispora biomass was grown on medium supplemented with 5 sunflower oil. The preparation obtained by the method described above contained 30–40 more lipids than the Mikoran preparation. Treatment with this drug has a positive effect on wound healing in the early stages of treatment: there is the least contamination of wounds and the absence of purulent inflammation at the bottom of the wound. In the future, the healing effect is less pronounced than that of "Mikoran".

Пример 5. То же, что пример 3, но обработку препарата 0,3 н щелочью со спиртом повторяют два раза. Полученный таким путем препарат содержит на 30-40 меньше липидов, чем препарат "Микоран". Медико-биологические испытания показали, что заживляющая способность сохраняется, и препарат обеспечивает быструю эпителизацию ожоговой раны и оказывает ярко выраженный эффект на процессы регенерации, однако несколько более слабый, чем у препарата "Микоран". Example 5. The same as example 3, but the treatment of the drug with 0.3 n alkali with alcohol is repeated twice. The preparation obtained in this way contains 30-40 less lipids than the Mikoran preparation. Biomedical tests showed that the healing ability is preserved, and the drug provides rapid epithelization of the burn wound and has a pronounced effect on the regeneration processes, but slightly weaker than the Mikoran drug.

Предлагаемый способ позволяет значительно упростить, обезопасить и удешевить технологию получения противоожоговых препаратов за счет более дешевой и доступной среды выращивания грибов-продуцентов, удаления дорогостоящего и канцерогенного растворителя-хлороформа, а также расширить число продуцентов. Кроме того, выращивание грибов-продуцентов в глубинной культуре позволяет масштабировать процесс и обезопасить его. Это достигается тем, что при выращивании биомассы гриба отсутствует стадия спороношения, вызывающая у обслуживающего биотехнологический процесс персонала аллергические и легочные заболевания. По сравнению с аналогом "Микоран" исследован с медико-биологических позиций значительно подробнее (проведены цитологические, гистологические и бактериологические исследования), что позволяет говорить о высоком ранозаживляющем эффекте препарата. The proposed method allows to significantly simplify, protect and reduce the cost of the technology for obtaining anti-burn drugs due to the cheaper and more affordable environment for growing mushroom-producers, removing expensive and carcinogenic solvent-chloroform, as well as expand the number of producers. In addition, the cultivation of producer mushrooms in deep culture allows you to scale the process and protect it. This is achieved by the fact that when growing the biomass of the fungus there is no stage of sporulation, which causes allergic and pulmonary diseases in the personnel serving the biotechnological process. Compared with the analogue, Mikoran has been studied from a biomedical point of view in much more detail (cytological, histological and bacteriological studies have been conducted), which suggests a high wound healing effect of the drug.

Claims

A method of producing a wound healing preparation, including growing a mycelial producer fungus on a nutrient medium, separating biomass and obtaining the target product, characterized in that the culture using Cunningamella japonica VKMF-1203 (-), or Plurotus ostreatus VKMF-721, or Blekeslea trispora is used as a producer A-732-3 (+) and (-), and the cultivation is carried out on a liquid nutrient medium containing 4% soy flour, 1.75% corn flour, 0.05% KH ₂ PO ₄ , 94.5% water, separated the biomass is homogenized, heated in flasks with water at 96 ^o C for 1 h, after which 0.2% N th solution of detergent in 1 N. alkali solution and incubated for 12 h at 28 ^o With vigorous stirring, re-homogenization is carried out and the target product is obtained by treating the homogenate with a 1% alcohol solution in a solution of 0.3 N. alkali, followed by heating at 95 ^o for 1 hour and further dialysis for 12 hours against distilled water, followed by freeze drying.