RU2072853C1

RU2072853C1 - Method of preparing the artificial oxygen carrier

Info

Publication number: RU2072853C1
Authority: RU
Inventors: М.А. Ажигирова; М.Г. Вашкевич; Е.П. Вязова; Ю.А. Литвиненко
Original assignee: Ажигирова Мария Алексеевна
Priority date: 1990-01-02
Filing date: 1990-01-02
Publication date: 1997-02-10

Abstract

FIELD: medicine, hematology. SUBSTANCE: invention relates to making donor blood erythrocyte substituent based on chemically modified extraerythrocyte hemoglobin. Method involves deoxygenation of 8-10% hemoglobin solution containing 4-5-fold molar excess of pyridoxal-5-phosphate followed by its polymerization with glutaric aldehyde and hydrogenation. The obtained product is dialyzed against saline solution and subjected for sterile filtration. The obtained polyhemoglobin does not show by-side negative action on animal organism. EFFECT: improved method of oxygen carrier preparing, high effectiveness of preparation. 2 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к созданию заменителя эритроцитов на основе химически модифицированного гемоглобина. The invention relates to medicine, in particular to the creation of a erythrocyte substitute based on chemically modified hemoglobin.

Известны периодические способы получения искусственного кровезаменителя на основе внеэритроцитарного гемоглобина человека, модифицированного пиридоксаль-5'-фосфатом и глутаровым альдегидом (1). Недостатком указанных способов является получение продуктов, содержащих тяжелые (с молекулярной массой 1 млн.дальтон) фракции, которые оказывают отрицательное воздействие на организм животных. Periodic methods for producing artificial blood substitute based on human extraerythrocyte hemoglobin modified with pyridoxal-5'-phosphate and glutaraldehyde are known (1). The disadvantage of these methods is to obtain products containing heavy (with a molecular weight of 1 million daltons) fractions that have a negative effect on the animal organism.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ химической модификации гемоглобина с помощью пиридоксаль-5'-фосфата и глутарового альдегида методом непрерывной полимеризации. Способ заключается в том, что 16% -18% раствор дезоксигенированного гемоглобина, содержащего 4-5-кратный молярный избыток пиридоксаль-5-фосфата вводят во взаимодействие с раствором глутарового альдегида в молярном соотношении 1:6-1:8. Полученный этим способом продукт характеризуется сродством к кислороду, выражаемым парциальным давлением кислорода, соответствующим половинному насыщению гемоглобина кислородом (р₅₀), равным 26-28 мм рт.ст. что практически идентично характеристикам донорской крови, а также временем удерживания в кровеносном русле половины введенного вещества (Т_1/2) (определенным в эксперименте на крысах при введении плеторически в дозе 1 г/кг массы тела животных), составляющем 4,8 ч (3).Closest to the proposed invention is a method of chemical modification of hemoglobin using pyridoxal-5'-phosphate and glutaraldehyde by continuous polymerization. The method consists in the fact that a 16% -18% solution of deoxygenated hemoglobin containing a 4-5-fold molar excess of pyridoxal-5-phosphate is introduced into the interaction with a solution of glutaraldehyde in a molar ratio of 1: 6-1: 8. The product obtained by this method is characterized by an affinity for oxygen, expressed by the partial pressure of oxygen, corresponding to half saturation of hemoglobin with oxygen (p ₅₀ ), equal to 26-28 mm Hg which is almost identical to the characteristics of donated blood, as well as the retention time in the bloodstream of half of the injected substance (T _1/2 ) (determined in the experiment on rats when plethorically introduced at a dose of 1 g / kg of animal body weight), which is 4.8 hours (3 )

Недостатком указанного способа получения искусственного переносчика кислорода на основе гемоглобина является образование гетерогенного по молекулярной массе продукта, содержащего тяжелые фракции (с молекулярной массой 600 тыс. дальтон). The disadvantage of this method of obtaining an artificial oxygen carrier based on hemoglobin is the formation of a heterogeneous molecular weight product containing heavy fractions (with a molecular weight of 600 thousand daltons).

Однако известно, что тяжелые фракции полигемоглобина обладают рядом отрицательных воздействий на организм животных, в том числе вызывают агрегацию форменных элементов крови. However, it is known that heavy fractions of polyhemoglobin have a number of negative effects on the animal organism, including the aggregation of blood cells.

Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет увеличения его биосовместимости. Указанная цель достигается тем, что в реакцию полимеризации вводят раствор гемоглобина с концентрацией 8% 10% Указанный диапазон концентраций гемоглобина был выбран авторами по результатам проведенных экспериментов по полимеризации гемоглобина с различной исходной концентрацией растворов и по хроматографическому анализу фракционного состава полученных продуктов реакций. В таблице 1 представлены результаты, полученные авторами в серии опытов. The aim of the invention is to improve the quality of the final product by increasing its biocompatibility. This goal is achieved by the fact that a hemoglobin solution with a concentration of 8% 10% is introduced into the polymerization reaction. The authors specified the indicated range of hemoglobin concentrations according to the results of experiments on the polymerization of hemoglobin with different initial concentration of solutions and on the chromatographic analysis of the fractional composition of the obtained reaction products. Table 1 presents the results obtained by the authors in a series of experiments.

Снижение концентрации ниже 8% 10% нецелесообразно, так как приводит к увеличению содержания в продукте немодифицированного гемоглобина, что повлечет за собой его быстрое выведение из кровеносного русла. При увеличении концентрации исходного раствора (до 16% 18%) аналогично способу прототипа продукт содержит до 50% тяжелых фракций. A decrease in concentration below 8% 10% is impractical, since it leads to an increase in the content of unmodified hemoglobin in the product, which will entail its rapid elimination from the bloodstream. With an increase in the concentration of the initial solution (up to 16% 18%), similarly to the prototype method, the product contains up to 50% of heavy fractions.

Способ осуществляется следующим образом. 8% 10% раствор дезоксигенированного гемоглобина, содержащего 4 5-кратный молярный избыток пиридоксаль-5'-фосфата в физиологическом 0,15 М растворе NaCl с рН 7,2 вводят во взаимодействие с равным объемом раствора также в 0,15 М NaCl глутарового альдегида в молярном соотношении 1:6 1:8. Получаемый таким способом продукт содержит фракции с молекулярной массой, не превышающей 130 тыс.дальтон. The method is as follows. An 8% 10% solution of deoxygenated hemoglobin containing 4 5-fold molar excess of pyridoxal-5'-phosphate in a physiological 0.15 M NaCl solution with a pH of 7.2 is introduced into interaction with an equal volume of the solution also in 0.15 M NaCl of glutaraldehyde in a molar ratio of 1: 6 1: 8. The product obtained in this way contains fractions with a molecular weight not exceeding 130 thousand daltons.

Качественные показатели биосовместимости полученного по предлагаемому способу искусственного переносчика кислорода в сравнительном с прототипом аспекте исследовали в экспериментах на животных. В образцах крови, взятых у 24 крыс, установлено, что содержание свободных, неагрегированных форменных элементов крови при введении в кровеносное русло продукта, полученного по заявляемому способу, составило 63% тогда как при введении вещества, полученного по способу прототипа, свободные клетки практически отсутствуют (таблица 2). При этом полностью сохранены как функциональная активность (р₅₀), так и время циркуляции (T_1/2)
Пример конкретного выполнения.Qualitative indicators of biocompatibility obtained by the proposed method, an artificial oxygen carrier in the comparative aspect of the prototype aspect was investigated in animal experiments. In blood samples taken from 24 rats, it was found that the content of free, non-aggregated shaped blood elements when introduced into the bloodstream of the product obtained by the present method was 63%, while when the substance obtained by the prototype method was introduced, free cells were practically absent ( table 2). At the same time, both functional activity (p ₅₀ ) and circulation time (T _1/2 ) are completely preserved
An example of a specific implementation.

8,9% раствор гемоглобина в физиологическом растворе NaCl, содержащий 0,18% (4,67-кратный молярный избыток) натриевой соли пиридоксаль-5-фосфата, дезоксигенируют и вводят во взаимодействие с 0,9% раствором глутарового альдегида (6,52-кратный молярный избыток по отношению к гемоглобину). После завершения полимеризации реакционную смесь гидрировали 5-кратным молярным избытком NaBH₄ при рН 7,4, который поддерживали с помощью 1 М раствора NaH₂PO₄. После этого полученный раствор химически модифицированного гемоглобина концентрировали и диализовали против физиологического раствора (0,15М NaCl). Конечный продукт с концентрацией 10,9% при содержании метгемоглобина 6,3% имел р₅₀ 27,0 мм рт.ст. Доля полимерной фракции составила 30% Полученный продукт испытывался на собаках в модели частичной кровопотери при введении в дозе 4 г/кг массы тела животных, при этом не наблюдалось существенной агрегации эритроцитов, в соответствии с чем скорость кровотока не снижалась, диаметр сосудов оставался неизменным.An 8.9% solution of hemoglobin in physiological NaCl solution containing 0.18% (4.67-fold molar excess) of pyridoxal-5-phosphate sodium salt is deoxygenated and reacted with a 0.9% solution of glutaraldehyde (6.52 multiple molar excess in relation to hemoglobin). After polymerization was completed, the reaction mixture was hydrogenated with a 5-fold molar excess of NaBH ₄ at pH 7.4, which was maintained with a 1 M NaH ₂ PO ₄ solution. After that, the resulting chemically modified hemoglobin solution was concentrated and dialyzed against physiological saline (0.15 M NaCl). The final product with a concentration of 10.9% with a methemoglobin content of 6.3% had a p _{50 of} 27.0 mm Hg. The proportion of the polymer fraction was 30%. The resulting product was tested on dogs in a partial blood loss model with a dose of 4 g / kg of animal body weight, while there was no significant aggregation of red blood cells, according to which the blood flow rate did not decrease, and the diameter of the vessels remained unchanged.

Таким образом заявляемый способ позволяет получить искусственный переносчик кислорода, который по своим биологическим свойствам (биосовместимость) превосходит продукт, получаемый по прототипу, и его агрегирующее воздействие на форменные элементы крови значительно снижено. Thus, the inventive method allows to obtain an artificial oxygen carrier, which in its biological properties (biocompatibility) exceeds the product obtained by the prototype, and its aggregating effect on blood cells is significantly reduced.

Claims

A method of producing an artificial oxygen carrier based on chemically modified hemoglobin using a cross-linking agent glutaraldehyde and a regulator of reversible hemoglobin pyridoxal-5-phosphate oxygenation by continuous polymerization, characterized in that, in order to improve the quality of the final product by increasing its biocompatibility, a hemoglobin solution is used with a concentration of 8 to 10% subjected to its directed polymerization.