[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2056055C1 - Method of separation of blood serum albumins - Google Patents

Method of separation of blood serum albumins Download PDF

Info

Publication number
RU2056055C1
RU2056055C1 SU5054059A RU2056055C1 RU 2056055 C1 RU2056055 C1 RU 2056055C1 SU 5054059 A SU5054059 A SU 5054059A RU 2056055 C1 RU2056055 C1 RU 2056055C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
albumin
gel
separation
peak
parameter
Prior art date
Application number
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Людмила Николаевна Цуканова
Михаил Михайлович Шавловский
Ирина Михайловна Кузнецова
Константин Константинович Туроверов
Татьяна Анатольевна Хрущева
Татьяна Васильевна Пархоменко
Original Assignee
Людмила Николаевна Цуканова
Михаил Михайлович Шавловский
Ирина Михайловна Кузнецова
Константин Константинович Туроверов
Татьяна Анатольевна Хрущева
Татьяна Васильевна Пархоменко
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Людмила Николаевна Цуканова, Михаил Михайлович Шавловский, Ирина Михайловна Кузнецова, Константин Константинович Туроверов, Татьяна Анатольевна Хрущева, Татьяна Васильевна Пархоменко filed Critical Людмила Николаевна Цуканова
Priority to SU5054059 priority Critical patent/RU2056055C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2056055C1 publication Critical patent/RU2056055C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: sample is applied onto chromatography column with gel showing hydrophobic sorption at -Eo= 0,9-1,1 = 0.9-1.1 followed by elution of the end product. EFFECT: improved method of albumin separation. 3 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для разделения альбуминов при диагностике патологий, связанных с наличием в крови больных людей модифицированных альбуминов при оценке состава коммерческих препаратов альбумина, а также для изучения природы сорбированных на альбумине лигандов. The invention relates to medicine, namely to medical biochemistry, and can be used to separate albumin in the diagnosis of pathologies associated with the presence of modified albumin in the blood of sick people in assessing the composition of commercial albumin preparations, as well as to study the nature of ligands adsorbed on albumin.

Известен способ разделения мономерной и агрегированной форм альбумина из сыворотки крови человека на ТSK-HW-55-геле, основанный на различии в молекулярных m массах этих белков. Однако свойства геля TSK-HW-55 таковы, что он разделяет белки только по их молекулярным массам и не позволяет разделить альбумины по их гидрофобности, что необходимо для оценки нагруженности альбумина, отражающей тяжесть патологии. A known method of separating monomeric and aggregated forms of albumin from human serum on a TSK-HW-55 gel, based on the difference in molecular m masses of these proteins. However, the properties of TSK-HW-55 gel are such that it separates proteins only by their molecular weights and does not allow separation of albumin by their hydrophobicity, which is necessary for assessing albumin loading reflecting the severity of the pathology.

Техническим результатом изобретения является разработка способа разделения альбуминов по степени их гидрофобности. Технический результат достигается тем, что в способе разделения альбуминов путем гель-проникающей хроматографии (ГПХ), согласно изобретению разделение осуществляют на геле, обладающем гидрофобной сорбцией с-Ео от 09 до 1,1. Ео эффективная свободная энергия взаимодействия с сорбентом стандартного гидрофобного радикала, в качестве которого принята метиленовая группа СН2.The technical result of the invention is the development of a method for the separation of albumin according to their degree of hydrophobicity. The technical result is achieved by the fact that in the method for the separation of albumin by gel permeation chromatography (GPC), according to the invention, the separation is carried out on a gel having a hydrophobic sorption c-E about from 09 to 1.1. E о is the effective free energy of interaction with the sorbent of a standard hydrophobic radical, which is taken as the methylene group CH 2 .

Сывороточный альбумин основной белок плазмы крови, выполняющий многочисленные функции. Альбумин может осуществлять транспорт жирных кислот (Ж.К. ), билирубина, углеводов, холестерина, липидов, триптофана, пептидных гормонов, лекарственных препаратов, регулировать содержание свободного кальция. Вклад альбумина в величину осмолярности плазмы крови составляет 75-80% определяя собой величину онкотического давления. Связывание с альбумином сыворотки крови человека (ЧСА) многих веществ приводит к увеличению растворимости в плазме гидрофобных лигандов (например, Ж.К.), а также к снижению токсичности некоторых метаболитов (билирубин). Способность альбуминов к модификации и связыванию лигандов позволила Фостеру сформулировать представление о микрогетерогенности препаратов альбумина. Взаимодействие с различными соединениями сопровождается конформационными перестройками белковой молекулы, что регистрируется по изменению физико-химических свойств ЧСА. В ряде работ приводятся данные о существовании модифицированных форм альбумина в крови людей при различных патологиях, причем у больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) обнаружен параллелизм нарастания минорных (модифицированных) форм ЧСА и длительности заболевания. Возможность использования модифицированных форм альбумина для выработки дифференциально-диагностических критериев и прогноза течения заболевания приводит к необходимости количественной оценки доли модифицированных форм ЧСА, в связи с чем появилась задача разделения разных форм альбумина. Serum albumin is the main plasma protein that performs numerous functions. Albumin can transport fatty acids (JK), bilirubin, carbohydrates, cholesterol, lipids, tryptophan, peptide hormones, drugs, and regulate the content of free calcium. The contribution of albumin to the osmolarity of blood plasma is 75-80%, determining the magnitude of the oncotic pressure. The binding of many substances to human serum albumin (HSA) leads to an increase in plasma solubility of hydrophobic ligands (e.g., J.K.), as well as to a decrease in the toxicity of certain metabolites (bilirubin). The ability of albumin to modify and bind ligands allowed Foster to formulate an idea of the microheterogeneity of albumin preparations. Interaction with various compounds is accompanied by conformational rearrangements of the protein molecule, which is recorded by a change in the physicochemical properties of HSA. A number of works cite data on the existence of modified forms of albumin in the blood of people with various pathologies, and in patients with chronic glomerulonephritis (CGN), a parallelism in the increase in minor (modified) forms of HSA and the duration of the disease was found. The possibility of using modified forms of albumin for the development of differential diagnostic criteria and predicting the course of the disease necessitates a quantitative assessment of the proportion of modified forms of HSA, and therefore the task of separating different forms of albumin has arisen.

Предлагается, что для разделения смеси альбуминов необходимо использовать гель, реагирующий на различную степень гидрофобности молекул ЧСА, обладающий гидрофобной сорбцией. Степень гидрофобных взаимодействий увеличивается в интервале нарастания параметра гидрофобности сорбента Ео от 0,9 до 1,1 и выше. Гель TSK-HW-55 практически не проявляет гидрофобного взаимодействия с альбумином (Ео 0,6-0,7), ГПХ на TSK-HW-55-геле при данных условиях элюции имеет вид чистого фракционирования по молекулярным массам. При использовании геля, обладающего гидрофобной сорбцией с -Ео более 1,1, белки настолько прочно связываются с матрицей, что для их элюции необходимо использовать специальные приемы, что вызывает изменение вторичной структуры белка. В данном изобретении использованы матрицы, обладающие гидрофобной сорбцией с параметром Ео от 0,9 до 1,1. Таким образом, сочетание эффекта ситования (фракционирования по молекулярным массам) и эффекта гидрофобных взаимодействий на данных гелях дает хорошее разрешение, что позволяет выделить различные по свойствам, нагруженные разными лигандами альбумины.It is proposed that to separate a mixture of albumin, it is necessary to use a gel that responds to a varying degree of hydrophobicity of HSA molecules, which has hydrophobic sorption. The degree of hydrophobic interactions increases in the range of increase in the hydrophobicity parameter of the sorbent E о from 0.9 to 1.1 and higher. The TSK-HW-55 gel shows almost no hydrophobic interaction with albumin (Е о 0.6-0.7), and the GPC on the TSK-HW-55 gel under these elution conditions has the form of a pure molecular weight fractionation. When using a gel with hydrophobic sorption with -E o more than 1.1, the proteins are so firmly bound to the matrix that it is necessary to use special techniques for their elution, which causes a change in the secondary structure of the protein. In this invention, matrices having hydrophobic sorption with a parameter E о from 0.9 to 1.1 are used. Thus, the combination of the siting effect (fractionation by molecular masses) and the effect of hydrophobic interactions on these gels gives a good resolution, which makes it possible to isolate albumin of various properties loaded with different ligands.

Способ может быть осуществлен следующим образом. Из сыворотки крови человека осаждают глобулины методом высаливания при 33% насыщения сульфата аммония в условиях при постоянном перемешивании в течение двух часов при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют при 700 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость наносят на колонку фирмы "Фармация" длиной 70 см, диаметром 1,6 см, заполненную гидрофобным гелем с Ео 0,9-1,1. Объем наносимой пробы 2,6 мл, концентрация белка 35-45 мг/мл. Элюцию проводят 0,01 М фосфатным буфером рН 6,8 с 0,15 М хлоридом натрия. Скорость элюции 0,22 мл/мин. Регистрацию оптической плотности проводят на Увикорде S-2 фирмы "Фармация". Пробы объемом в 1 мл собирают в пробирки и далее используют для флуоресцетного анализа и иммунопреципитации (иммунохимический метод) с применением поликлональных антител к альбумину производства Behring Institut (Германия). Концентрацию белка в пробах определяют по методу. Bradforda (Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.// Anal. Biochem. 1976.-V.72-p. 248-254). В качестве критерия, позволяющего судить о негомогенности или гомогенности препарата белка в каждом пике профиля элюции используют регистрацию величины спектрального параметра А (А J320/J365, где J320 и J365 интенсивности в спектрах флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно). В тех случаях, когда на протяжении всего пика не обнаруживается постоянство параметра А, нельзя делать вывод о гомогенности белка в этом пике. В качестве контрольного препарата используют раствор альбумина фирмы "Reanal" в 33% насыщения сульфата аммония.The method can be carried out as follows. Globulins are precipitated from human blood serum by salting out at 33% saturation of ammonium sulfate under conditions with constant stirring for two hours at room temperature. The suspension is centrifuged at 700 g for 10 min at room temperature. The supernatant is applied to a Pharmacy column 70 cm long, 1.6 cm in diameter, filled with a hydrophobic gel with E about 0.9-1.1. The volume of the applied sample is 2.6 ml, the protein concentration is 35-45 mg / ml. The elution is carried out with 0.01 M phosphate buffer pH 6.8 with 0.15 M sodium chloride. Elution rate 0.22 ml / min. Registration of optical density is carried out on Uvikord S-2 company "Pharmacy". Samples of 1 ml are collected in test tubes and then used for fluorescence analysis and immunoprecipitation (immunochemical method) using polyclonal antibodies to albumin manufactured by Behring Institut (Germany). The protein concentration in the samples is determined by the method. Bradforda (Bradford MM A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.// Anal. Biochem. 1976.-V.72-p. 248-254). As a criterion, it is possible to judge the inhomogeneity or homogeneity of the protein preparation at each peak of the elution profile using the registration of the value of the spectral parameter A (A J 320 / J 365 , where J 320 and J 365 are the intensities in the fluorescence spectra at wavelengths of 320 and 365 nm, respectively ) In those cases when the constancy of parameter A is not found throughout the peak, it is impossible to conclude that the protein is homogeneous in this peak. As a control preparation, a Reanal albumin solution in 33% saturation of ammonium sulfate is used.

На фиг. 1-3 представлены профили элюции альбуминов сыворотки крови больного (б) и здорового донора (а) и изменение параметра А. Разделение альбуминов проводили на гелях, обладающих гидрофобной сорбцией Ео 0,9-1,1.In FIG. 1-3, elution profiles of blood serum albumin from a patient (b) and a healthy donor (a) and a change in parameter A are presented. Albumin was separated on gels with hydrophobic sorption Е о 0.9-1.1.

П р и м е р 1. На фиг. 1 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови здорового донора (а) и больного (диагноз: гломерулонефрит с минимальными изменениями) (б), полученные после разделения на геле с Ео= 0,9. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину фирмы "Reanal" составляет 68-86 мл (Аср. 0,92); процент содержания альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора (а) получено 2 пика, причем во втором пике в объеме 76-84 обнаружено постоянство параметра А (Аср. 1.09) и 77% альбумина, что дает возможность говорить о наличии в этом пике гомогенного белка. По объему выхода и коэффициенту распределения сделан вывод о том, что этим гомогенным белком является мономер альбумина. На профиле элюции альбуминов сыворотки крови больного (б) получено также 2 пика, однако незначительные изменения параметра А зарегистрированы лишь во втором пике в объекте 77-86 мл, доля альбумина составляет 75% Следовательно, фракционирование на этом сорбенте не позволяет получить достаточно обогащенную фракцию мономерного альбумина.PRI me R 1. In FIG. Figure 1 shows the elution profiles and the change in the parameter A of serum albumin from a healthy donor (a) and a patient (diagnosis: glomerulonephritis with minimal changes) (b) obtained after separation on a gel with E o = 0.9. The output volume of the monomer fraction for this gel according to the albumin of the company "Reanal" is 68-86 ml (A cf. 0.92); the percentage of albumin is 100% On the elution profile of serum albumin of the donor blood (a), 2 peaks were obtained, and in the second peak in the volume of 76-84, the constancy of parameter A (A cf. 1.09) and 77% of albumin was found, which makes it possible to talk about the presence of this peak of homogeneous protein. In terms of yield and distribution coefficient, it was concluded that albumin monomer is this homogeneous protein. 2 peaks were also obtained on the elution profile of the patient’s blood serum albumin (b), however, insignificant changes in parameter A were registered only in the second peak in the object of 77-86 ml, the albumin fraction was 75%. Therefore, fractionation on this sorbent does not allow to obtain a sufficiently enriched monomer fraction albumin.

П р и м е р 2. На фиг. 2 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови того же здорового донора (а) и того же больного (б), что и в первом примере, полученные после разделения на геле с Ео 1,1. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину "Reanal" составляет 74-94 мл (Аср.0,94). Содержание альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора (а) получено 3 пика; постоянство параметра А обнаружено на всем протяжении 2-го пика, вплоть до середины 3-го пика (объем 77-88 мл, А ср. 1,12). Во втором пике иммунохимическим методом зарегистрировано 90% альбумина. Следовательно, мономерная фракция альбумина донора выходит на этом геле в объеме 77-88 мл. Профиль элюции альбуминов сыворотки крови больного дает также 3 пика; постоянство параметра А обнаружено на протяжении 2-го пика (Аср. 1,08) и на другом уровне в 3-м пике (Аср. 1,15), что дает возможность предположить наличие в каждом из этих пиков гомогенного белка; однако по проценту содержания альбумина, обнаруженному во 2-м пике (90%), можно делать вывод о том, что фракция мономерного альбумина на этом геле выходит в объеме 86-92 мл (2-й пик). Следовательно, гель с Ео 1,1, обладая как эффектом ситования, так и эффектом гидрофобной сорбции, дает возможность разделять альбумины как по их молекулярным массам, так и по степени гидрофобности.PRI me R 2. In FIG. 2 shows elution profiles and a change in the parameter A of serum albumin of the same healthy donor (a) and the same patient (b) as in the first example, obtained after separation on a gel with E about 1.1. The output volume of the monomer fraction for this gel on Reanal albumin is 74-94 ml (A cf. 0.94). Albumin content 100%. On the elution profile of serum albumin of the blood donor (a) received 3 peaks; the constancy of parameter A was found throughout the entire 2nd peak, up to the middle of the 3rd peak (volume 77-88 ml, A cf. 1.12). In the second peak, 90% of albumin was detected by the immunochemical method. Therefore, the monomeric fraction of the donor albumin leaves on this gel in a volume of 77-88 ml. The patient elution profile of serum albumin also gives 3 peaks; the constancy of parameter A was found during the 2nd peak (A cf. 1.08) and at a different level in the 3rd peak (A cf. 1.15), which suggests the presence of a homogeneous protein in each of these peaks; however, according to the percentage of albumin found in the 2nd peak (90%), we can conclude that the fraction of monomeric albumin on this gel leaves a volume of 86-92 ml (2nd peak). Therefore, a gel with E about 1.1, having both a screening effect and a hydrophobic sorption effect, makes it possible to separate albumin both in their molecular weights and in the degree of hydrophobicity.

П р и м е р 3. На фиг. 3 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови того же здорового донора (а) и того же больного (б), что и в первом примере, полученные после разделения на ТSK-Hw-55-геле. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину "Reanal" составляет 72-86 мл (Аср.0,91). Содержание альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора получен 1 пик, на протяжении которого зарегистрировано изменение параметра А, но доля альбумина довольно высока: 74% Профиль элюции альбуминов сыворотки крови больного демонстрирует 2 пика, причем доля альбумина во 2-м пике составляет 76% параметр А изменяется на протяжении обоих пиков. Следовательно, на ТSK-Hw-55-геле, не обладающем эффектом гидрофобной сорбции, невозможно выделить гомогенную по параметру А фракцию альбумина как из сыворотки крови донора, так и из сыворотки крови больного.PRI me R 3. In FIG. Figure 3 shows the elution profiles and the change in the parameter A of serum albumin of the same healthy donor (a) and the same patient (b) as in the first example, obtained after separation on TSK-Hw-55 gel. The output volume of the monomer fraction for this gel on Reanal albumin is 72-86 ml (A cf. 0.91). Albumin content 100% .1 peak was obtained on the donor serum albumin elution profile, during which the change in parameter A was recorded, but the albumin fraction was rather high: 74% of the patient's serum albumin elution profile showed 2 peaks, with the albumin fraction in the 2nd peak 76% parameter A changes during both peaks. Therefore, on a TSK-Hw-55 gel that does not have a hydrophobic sorption effect, it is impossible to isolate the albumin fraction homogeneous in parameter A from both the blood serum of the donor and the blood serum of the patient.

Использование предлагаемого способа позволяет разделять альбумины по степени их гидрофобности. Using the proposed method allows to separate albumin according to their degree of hydrophobicity.

Claims (1)

СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ АЛЬБУМИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий нанесение образца на колонку с гелем, хроматографию и элюцию белковых фракций, отличающийся тем, что используют гель, обладающий гидрофобной сорбцией Е0 от 0,9 - 1,1.METHOD FOR SEPARATION OF BLOOD SERUM ALBUMINS, including applying a sample to a gel column, chromatography and elution of protein fractions, characterized in that they use a gel having a hydrophobic sorption of E 0 from 0.9 - 1.1.
SU5054059 1992-07-06 1992-07-06 Method of separation of blood serum albumins RU2056055C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU5054059 RU2056055C1 (en) 1992-07-06 1992-07-06 Method of separation of blood serum albumins

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU5054059 RU2056055C1 (en) 1992-07-06 1992-07-06 Method of separation of blood serum albumins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2056055C1 true RU2056055C1 (en) 1996-03-10

Family

ID=21609211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU5054059 RU2056055C1 (en) 1992-07-06 1992-07-06 Method of separation of blood serum albumins

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2056055C1 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Молекулярная биология, 1988, т.22, выпуск 2, с.466-472. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dodge et al. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes
Greenlee et al. Antibodies to cerebellar Purkinje cells in patients with paraneoplastic cerebellar degeneration and ovarian carcinoma
Kunitake et al. Apolipoprotein AI-containing lipoproteins with pre-beta electrophoretic mobility.
Masket et al. The use of polyacrylamide gel electrophoresis in differentiating type III hyperlipoproteinemia
Rasheed et al. Reactive oxygen species damaged human serum albumin in patients with type 1 diabetes mellitus: biochemical and immunological studies
Marcon et al. Soluble Tac peptide is present in the urine of normal individuals and at elevated levels in patients with adult T cell leukaemia (ATL).
JPH0284193A (en) Removal of protein a from antibody preparation
EP1163004B1 (en) Immunoadsorber for use in sepsis therapy
Lundström Serum immunoglobulins and autoantibodies in patients with oral lichen planus
Nigra et al. Alterations of hemorheological parameters and tubulin content in erythrocytes from diabetic subjects
Seishima et al. Highly sensitive ELISA for soluble Fas in serum: increased soluble Fas in the elderly
KR102109921B1 (en) Method for the analysis of extracellular vesicles using size exclusion chromatography and use thereof
Datta et al. HDL mimetic peptide administration improves left ventricular filling and cardiac output in lipopolysaccharide-treated rats
Rouillon et al. High urinary ferritin reflects myoglobin iron evacuation in DMD patients
RU2056055C1 (en) Method of separation of blood serum albumins
DE60222149T2 (en) REFERENCE CONTROL FOR HIGH-SENSITIVE TESTS OF THE C-REACTIVE PROTEIN
EP1003787B1 (en) Agent for the treatment and/or prophylaxis of microcirculation disorders
Trieshmann Jr et al. The characterization of human anti-IgG autoantibodies by liquid isoelectric focussing
US20030080056A1 (en) Extraction of biological components from body fluids
Alkner et al. Factors affecting IgA related hyperviscosity.
Braun et al. Proteomic profiling of urinary protein excretion in the factor H-deficient mouse
Fink et al. The polyethylene glycol precipitation technique and the particle-counting immunoassay for detection of circulating immune complex-like material in liver cirrhosis and septicemia
US10088487B2 (en) Method for the quantitative characterization of amyloid and/or aggregating peptides and/or proteins in a sample
Dawidowicz et al. Application of adsorption method to the chromatographic analysis of free drug concentration
Alaia et al. A pair of naturally occurring antibodies may dampen complement‐dependent phagocytosis of red cells with a positive antiglobulin test in healthy blood donors