RO116164B1

RO116164B1 - Metoda de inhibare a infectiei retrovirale

Info

Publication number: RO116164B1
Application number: RO95-00493A
Authority: RO
Inventors: Stephen Eisenberg; Sharon M Wahl; Robert C Thompson
Original assignee: Synergen Inc; Us Health
Priority date: 1992-09-09
Filing date: 1993-09-09
Publication date: 2000-11-30
Also published as: NO950897D0; ES2197153T3; WO1994006454A3; EP0666755A1; NO315546B1; EP0666755B1; KR950703357A; HUT75126A; RU2126266C1; WO1994006454A2; SK29795A3; ATE238062T1; CZ55995A3; SG48115A1; RU95109909A; DE69332904D1; KR100273620B1; FI951078A0; AU4853093A; JPH08505042A

Abstract

Inventia prezinta o metoda de inhibare a infectiei retrovirale, bazata pe administrarea inhibitorului semiproteazei leucocitare, SLPI, a unui analog sau derivat al acestuia-inhibitorul cisteinproteazei leucocitare, CLPI-, sub forma orala sau parenterala, prin injectare intravenoasa, subcutanata sau intramusculara, intr-o doza unitara, selectata din domeniul cuprins intre 10 si 1000 mg/zi, preferabil intre 10 si 200 mg/zi si optim intre 20 si 200 mg/zi.

Description

Invenția se referă la o metodă de inhibare a infecției retrovirale, metodă destinată aplicării ei în terapia medicală, în cazul infecțiilor cu virusul imunodeficienței umane (HIV) și tulburărilor asociate acestora, inclusiv al sindromului imunodeficienței dobândite (SIDA).

Se cunoaște că agenții retrovirali au fost implicați în numeroase boli, inclusiv în cancer, boala autoimună și SIDA. Infecția virală a imunodeficienței umane (HIV) produce epuizarea cronică progresivă a limfocitelor T CD4⁺ (celule CD4⁺) și infecția macrofagelor, având ca rezultat sindromul imunodeficienței dobândite. De obicei, zidovudina (AZT), un analog al timidinei este principalul medicament antiviral folosit în tratamentul infecției HIV, deși sunt folosiți, de asemenea, alți doi agenți cu un mecanism de acțiune similar, dideoxiinozina (ddl) și dideoxicitozina (ddC) (Colley, T.P. et al., New Engl.J.Med. (1990), 322, 134045; Fischl, M.A. etal., New Engl, J. /Vfed(1987), 317, 185-91). Acești agenți sunt eficienți pentru inhibarea replicării virale 4 și pot stabiliza nivelurile de celule CD4⁺, dar ei sunt incapabili să elimine unul din rezervoarele importante de virus, macrofagele infectate cu HIV.( Gartner S. Et al., Science (1986), 233, 215-19). Toxicitatea severă care implică, în special, măduva osoasă, gazdă HIV, este asociată, de asemenea, cu doze mai mari ale tratamentului AZT și efectele benefice ale medicamentului la pacienți având SIDA se diminuează după o terapie prelungită. De asemenea,la pacienți tratați, s-au observat tulpini HIV rezistente la AZT.

Aceste constatări au determinat căutarea de medicamente alternative pentru tratamentul infecției HIV, în special agenți cu un mecanism diferit de acțiune.

Este cunoscut că virusul imunodeficienței umane de tipul 1 (HIV-1), un retrovirus, este cauza etiologică a SIDA. Glicoproteină de înveliș HIV-1, gp120, se leagă specific la receptorul CD4 pe limfocitele T, monocite și macrofage. Deși infecția limfocitelor T necesită proliferare celulară și sinteza DNA, infecția produsă monocitelor se poate întâlni independent de sinteza DNA celular (Weinberg J.B.,at al.,(1991), J.Exp.Med. 174, 1477-82). Când HIV-1 infectează limfocite activate CD4⁺, aceasta este letal, dar monocitele infectate sunt relativ rezistente față de distrugerea de către virus. Ca urmare, aceste celule, odată infectate cu HIV-1, servesc ca rezervoare de virus viu, de lungă durată. Aceste celule nu sunt numai o sursă de replicare a virusului, dar disfuncția lor mediată viral poate contribui la creșterea susceptibilității la infecții oportuniste care sunt caracteristice SIDA.

Deoarece monocitele-macrofagele servesc drept rezervoare pentru HIV-1, țintirea selectivă a acestei populații pe lângă limfocitele T îndreptățește considerația ulterioară (Finberg R.W. etal., Science 252 (1991), 1703-05). Rapoarte recente de la grupul lui Fox (JADA 118,(1989), 709-711) au indicat faptul că un component al salivei umane blochează replicarea HIV. Mai recent, Hattori (FEBS Lett. 248,(1989), 48-52) a arătat că un inhibitor al triptazei (o enzimă asemănătoare tripsinei) poate inhiba formarea sincițiului de celule T indus de către HIV.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a identifica o sursă endogenă de activitate inhibitorie, care retardează infecția și/sau replicarea HIV-1 prin explorarea diverșilor modulatori potențiali ai infecției HIV-1.

Factorul responsabil pentru activitatea antivirală este inhibitorul serinproteazei leucocitare (SLPI). Acesta este un inhibitor potențial al elastazei leucocitare umane, catepsinei G și tripsinei umane, și s-a purificat din secreții de la parotidă (Thomson,

R.C. și Ohlsson, K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1986),83, 6692-96 și US

4760130).

RO 116164 Bl

SLPI este acum accesibilă pentru producție prin tehnici DNA recombinant ( cerere de brevet US 07/712354, depusă pe 7.07.1991, WO 86/03519 din 4.12.1985 și cererea de brevet european EP-A -905953.7 din 4.12.1985). so

Capacitatea SLPI și/sau derivaților săi și a analogilor săi de a bloca infecția HIV1 și/sau replicarea pot asigura baza pentru intervenția terapeutică în infecția HIV-1.

Metoda conform invenției, de inhibare a infecției retrovirale, constă în administrarea inhibitorului serinproteazei leucocitare, SLPI, a unui analog al acestuia sau a unui derivat al lui, inhibitorul cisteinproteazei leucocitare, CLPI, pe cale orală sau 55 parenterală, prin injectare intravenoasă, subcutanată sau intramusculară, într-o doză unitară cuprinsă în domeniul 10... 1000 mg/zi, de preferință 10...200mg/zi, optim

20...200 mg/zi.

Avantajele care se obțin prin aplicarea invenției constau în asigurarea unor metode noi pentru prevenirea sau tratarea infecțiilor retrovirale ale celulelor de 6o mamifere, în special prevenirea infectării celulelor umane cu virusul imunodeficienței umane (HIV) și a tulburărilor asociate, inclusiv sindromul imunodeficienței dobândite.

Se prezintă în continuare invenția în detaliu, cu referire la fig. 1 și 2,după cum urmează:

- fig. 1 reprezintă blocarea de către SLPI a replicării HIV în monocite într-un 65 mod dependent de doză. Monocite umane selectate prin eluție s-au etalat și expus la

HIV+ SLPI timp de 1 h la 37°C, s-au spălat și s-au incubat la 37°C, îndepărtând supernatantele și adăugând mediu proaspăt la fiecare 4 zile. EC₅₀ pentru acest experiment a fost mai mic decât 0,1 pg/ml (8,5 nM) cu inhibarea completă la 10 pg/ml (850nM); 70

- fig.2 prezintă efectul inhibitor al SLPI, care este de lungă durată, astfel că la zile de la momentul inițierii HIV este încă inhibat în proporție de 90%.

Conform invenției, infecțiile retrovirale se tratează prin administrarea agenților anti-retrovirali în doze suficiente pentru diminuarea efectelor acestora. Infecțiile retrovirale sunt implicate în numeroase tulburări incluzând, dar fără să se limiteze la 75 acestea, cancerul, boala autoimună și sindromul imunodeficienței dobândite. Tot conform invenției, infecția virală a imunodeficienței umane este de interes deosebit.

Ca agenți anti-retrovirali se cunosc numeroși produși, dintre care majoritatea inhibă activitatea revers transcriptazei retrovirale inverse și includ zidovudina (AZT), un analog al timidinei, dideoxiinozina (ddl) și dideoxicitozina (ddC). Zidovudina este prin- 8o cipalul medicament anti-viral folosit în tratamentul infecției HIV. Agenții anti-retrovirali sunt eficienți în general, într-o doză cuprinsă în domeniul de circa 50 mg/zi până la circa 1000 mg/zi, mai ales de la circa 100 mg/zi până la circa 500 mg/zi și în cazul zidovudinei în mod specific circa 300 mg/zi până la circa 500 mg/zi. Acești agenți sunt administrați, în general, sub formă de formulări orale. 85

Inhibitorii proteazici folosiți în această invenție pot fi preparați prin mijloace binecunoscute specialiștilor în domeniu (US 4760130; EP 85905953.7, WO 86/03519; cerere US 07/712354)

Inhibitorii proteazici izolați, descriși de invenție, sunt într-o formă purificată. De preferință, inhibitorii serinproteazei, conform invenției, sunt proteine polipeptidice 90 monocatenare, care sunt substanțial omoloage și în mod deosebit, echivalente din punct de vedere biologic cu inhibitorul serinproteazei native, izolată din secreții ale glandelor parotide umane.

RO 116164 Bl

Inhibitorul serinproteazei native este cunoscut, de asemenea, ca inhibitor parotidic nativ. Prin “echivalent biologic”, așa cum s-a folosit în descriere și revendicări, se înțelege că aceste compoziții sunt capabile să inhibe proteaza derivată de la monocite, care este inhibată prin SLPI dar nu în mod necesar până la același grad. Prin “derivați”, așa cum s-a folosit termenul în descriere și revendicări, se înțelege un grad de omologie referitoare la aminoacizii inhibitorului parotidic nativ, de preferință mai mare de 40%, în mod deosebit, mai mare de 50%, cu un grup preferat de proteine, cu peste 60% omoloage cu inhibitorul parotidic nativ. Procentul de omologie, cum s-a descris mai sus este calculat ca procentul componenților găsiți în cele două secvențe mai mici, ce poate fi, de asemenea găsit în cele două secvențe mai mari, un component fiind înțeles ca o secvență de 4 aminoacizi învecinați.

Un derivat SLPI util este CLPI, o moleculă SLPI trunchiată, care are doar ultimii 60 aminoacizi ai inhibitorului parotidic nativ. Acești 60 aminoacizi sunt: Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala

Pentru codificarea moleculei de 60 de aminoacizi de mai sus s-a folosit următoarea secvență de nucleotide:

CTG GAT CCT GTT GAC ACC CCA ACA CCA ACA AGG AGG AAG CCT GGG AAG TGC CCA GTG ACT TAT GGC CAA TGT TTG ATG CCT AAC CCC CCC AAT TTC TGT GAG ATG GAT GGC CAG TGC AAG CGT GAC TTG AAG TGT TGC ATG GGC ATG TGT GGG AAA TCC TGC GTT TCC CCT GTG AAA GCT

CLPI s-a construit prin deleția de la gena SLPI a secvenței semnal și a nucleotidelor corespunzătoare primilor 47 de aminoacizi ai proteinei mature SLPI, așa cum s-a descris în US 07/712 354. CLPI se poate produce, de asemenea, prin metoda din exemplul 8, prezentată atât în WO 86/03519, cât și în EP-A 85905953.7. Această metodă se poate folosi și pentru CLPI, care, la rândul său, se utilizează pentru generarea de anticorpi utili în purificarea SLPI. Anticorpii se pot produce, de exemplu, prin metodele descrise de Harlow E.& Lane D. în Antibodies: A Laboratory Manual, pag. 92-114 (Cold Springs Harbor Laboratory, 1988).

Prin analogi”, așa cum s-a folosit în descriere, se înțelege orice compus, inclusiv, de exemplu, compuși organici mici, care sunt echivalenți biologici funcționali ai SLPI pentru inhibarea infecției HIV. Astfel de derivați și analogi se pot izola prin mijloace binecunoscute specialiștilor din domeniu, inclusiv folosind monocite pentru crearea de compuși care previn SLPI de la legarea acesteia. Analogii pot include, de asemenea, mutante specifice SLPI care au cel puțin activitate echivalentă și, în unele cazuri mai mare decât proteina nativă. In mod special, mutantele SLPI utile includ substituția următorilor aminoacizi la restul din poziția enumerată: Gly 20, Gly 72, Val 72 și Phe 72.

Invenția mai cuprinde și mutante CLPI. Mutantele CLPI care corespund mutantelor SLPI Gly 72, Val 72 și Phe 72 sunt denumiți aici Gly 25, Val 25 și Phe 25.

Unele mutante CLPI luate în considerare prezintă următoarea secvență de aminoacizi:

RO 116164 Bl

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys R₈ R₃R9 Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu R4 Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys R₅ Gly R₆ Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys R₇ unde R₇ este alanină și R₃, R₄, 1%. 1%, și FȚ sunt aminoacizi de același fel sau diferiți, și unul sau mai mulți dintre R₃, R₄, R₅, R₆ și R₈ poate fi metionină, valină, alanină fenilalanină, tirozină, triptofan, lizina, glicină sau arginină. De asemenea, analogii pot include, de exemplu, forme ale SLPI sau CLPI PEG-ilate care pot avea caracteristici terapeutice îmbunătățite, ce depășesc proteina SLPI nativă. Mutantele care pot fi corespunzătoare pentru PEG-ilare le includ pe cele care au un rest cisteinic la pozițiile 13, 23, 52, 58, 68 și/sau 75 ale SLPI și la siturile corespunzătoare 5, 11, 21, și 28 în CLPI. Prepararea mutantelor cisteinic pentru PEG-ilare este descrisă în WO 92/16221, care este inclusă aici în mod specific ca referință. O etapă utilă în producerea mutantei poate include o etapă de repliere, în care se adaugă cisteină la soluția care conține proteina. Cisteină poate ajuta la repliere și se poate lega la cisteină liberă, substituită din mutantă. De asemenea, o mutantă poate fi izolată de la proteina ce poate fi inhibată SLPI (SIP] din monocite, folosind tehnici biochimice standard, binecunoscute specialiștilor, și proteine purificate având activitate proteolitică, care este inhibată prin SLPI. După purificarea proteinei (și dacă este necesar, secvențarea ei, clonarea genei sale și exprimarea ei în celule gazdă, adică producerea de SIP recombinant), o mutantă se poate căuta pentru inhibitorii SIP prin mijloace binecunoscute specialiștilor din domeniu. Alternativ, se poate determina structura sa și se pot desemna inhibitori pentru aceasta, de asemenea prin mijloace binecunoscute specialiștilor. Când se folosește SLPI, un analog sau un derivat al acestuia pentru combaterea infecțiilor HIV la om, compusul poate fi administrat oral sau parenteral, într-un vehicul cuprinzând unul sau mai mulți purtători acceptabili farmaceutic, a căror proporție se determină prin solubilitatea și natura chimică a compusului, prin calea de administrare aleasă și prin practica biologică standard.

Pentru administrare orală, analogul SLPI sau derivatul acestuia poate fi formulat în forme dozate unitare, precum capsule sau tablete, fiecare conținând o cantitate predeterminată de ingredient activ, cuprinsă între circa 10 până la 1D0D mg, mai bine 10 până la 200 mg pe zi/pacient, chiar mai bine, 20 până la 200 mg/zi/pacient într-un purtător farmaceutic acceptabil.

Pentru administrare parenterală, SLPI sau analogul, sau derivatul acestuia, se administrează prin injectare intravenoasă subcutanată sau intramusculară, în compoziții cu vehicule sau purtători acceptabili farmaceutic.

Pentru administrare prin injectare, este preferată utilizarea compusului în soluție, într-un vehicul apos steril, care, de asemenea, poate să conțină alte substanțe dizolvate, cum ar fi tampoane sau conservanți, precum și cantități suficiente de săruri acceptabile farmaceutic sau de glucoză, pentru obținerea izotoniei soluției. Este preferată calea de administrare prin injectare subcutanată. Dozajele sunt, în principal, aceleași cu cele menționate mai sus pentru administrare orală. Vehicule sau purtători corespunzători pentru formulările notate mai sus pot fi găsite în lucrări farmaceutice standard (de exemplu în Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980), incluse ca referințe.

140

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 116164 Bl

Dozajul compusului va fi în funcție de forma de administrare și de agentul activ anume ales. Mai mult decât atât, el va fi în funcție de pacientul sau gazda particulară aflată sub tratament (incluzând mamifere și oameni). în general, tratamentul se începe cu doze mici, substanțial mai mici față de doza optimă a compusului. După aceea, doza se mărește prin suplimentări mici, până se atinge efectul optim, în funcție de împrejurări. în general, cel mai de dorit, compusul se administrează la un nivel al concentrației ce va permite, în general, rezultate antivirale eficiente, fără să producă orice alte efecte secundare primejdioase sau dăunătoare. Este de dorit să se mențină un nivel sanguin al compusului, suficient pentru inhibarea infecției retro-virale a celulei gazdă. Aceasta se poate estima prin testarea cantității de compus care este eficientă în prevenirea infecției retrovirale a celulelor gazdă, de exemplu, HIV în monocite in vitro și apoi folosind tehnici farmacocinetice standard, prin determinarea cantității compusului, necesară pentru menținerea nivelului plasmatic la același nivel inhibitor sau până la 10 până la 1OO ori mai mare.

Deși formulările descrise mai sus sunt eficiente și relativ sigure, medicațiile pentru tratarea infecțiilor HIV, posibila administrare concurentă a acestor formulări cu alte medicații sau agenți antivirali nu este exclusă pentru obținerea rezultatelor benefice. Asemenea agenți sau medicații antivirale includ CD4 solubil, zidovudină, dideoxicitidina, fosfonoformatul, ribavarina, interferoni antivirali (de exemplu, alfainterferon sau interleukina-2) sau aerosoli de pentamidină.

Se dau în continuare 11 exemple de realizare a invenției.

Exemplul 1. S-au izolat monocite sanguine periferice (peripheral blood monocytes - PBM) de la donori sănătoși, prin elutriere, s-au etalat în vase de cultură și s-au incubat pentru câteva zile. S-a amestecat SLPI cu HIV (Bal) și s-au aplicat la PBM timp de 1h la 31 °C. Celulele s-au spălat și s-au incubat un timp suplimentar, cu determinări ale reverstranscriptazei și schimbarea mediului pe supernatante la fiecare 3 zile. S-a găsit că SLPI blochează efectiv replicarea HIV la o concentrație de 1 pg/ml (fig. 1). La concentrații mai mici de 20 pg/l/ml, inhibiția prin SLPI este diminuată. Efectul de inhibare este de lungă durată cu inhibiție semnificativă observată până la 18 zile (fig. 2).

Exemplul 2. S-au etalat PBM și s-au incubat ca în exemplul 1. SLPI s-a aplicat celulelor timp de aproximativ 1 h, apoi celulele s-au spălat și s-au tratat cu HIV. S-a schimbat mediul și s-au făcut testări, așa cum s-a arătat în exemplul 1. S-a găsit că SLPI a fost mai eficientă pentru blocarea HIV, când celulele au fost pre-tratate cu SLPI decât atunci când celulele s-au tratat cu un amestec de SLPI și HIV.

Exemplul 3. S-a demonstrat, de asemenea, folosind în principal același protocol ca în exemplul 1, înlocuind monocitele prin celule T, că SLPI este eficient pentru inhibarea replicării HIV în celule T.

Exemplul 4. S-a menținut într-o cultură în suspensie, o linie celulară limfocitară T umană (H-9) în RPMI 1640 cu 10% ser de vițel fetal (FCS) și 200 pg gentamicină /litru. S-a adăugat SLPI la mediul de cultură, până la o concentrație finală de 100pg/ml. După 24 h, celulele s-au spălat, s-au inoculat timp de 4 h cu HIV tulpina III B, s-au spălat din nou și s-au resuspendat la o densitate de 500 000 celule/ml. S-a suplimentat mediul și s-a menținut cu SLPI la o concentrație finală de 100 pg/ml imediat după resuspendare (T=O) sau 2 zile după resuspendare (T=2). S-a colectat supernatantul și culturile s-au alimentat la fiecare 2 zile.

RO 116164 Bl

Supernatantul colectat 8 zile după infecție s-a testat pentru activitatea reverstranscriptazei prin măsurarea absorbției de timidina tritiată pe o matriță poli(rA)-oligo(dT). Așa cum se arată în tabelul 1, în celulele pretratate SLPI, aceasta a inhibat replicarea virală prin aproximativ 62% și 54%, când s-a adăugat imediat după infecție, și respectiv, la 2 zile după infecție.

Celule pretratate SLPI

235

Tabelul 1

	Control negativ	Control pozitiv	T=0	T=2
Activitate RT (medie cpm)	955	86,205	32,594	39,554
Deviație standard	±330	±9,676	±7,220	±8,737

240

Exemplul 5. Experimentul s-a realizat cum s-a descris în exemplul 4, cu deosebire că HIV tulpina III B concentrat de 1OOO de ori s-a incubat cu 100 pg/ml SLPI, timp de 6 h pe gheață, înaintea inoculării. Acest amestec HIV/SLPI s-a diluat de 1000 de ori înainte cu 4 h de inoculare. Așa cum se arată în tabelul 2, folosind celule și virus pretratate SLPI, acesta a inhibat replicarea virală prin aproximativ 64% și 26%, când s-a adăugat imediat după inoculare și, respectiv, la 2 zile după infectare.

Virus și celule pretratate SLPI

245

250

Tabelul 2

	Control negativ	Control pozitiv	T = 0	T = 2
Activitate RT (medie cpm]	2,889	59,004	20,76	43,432
Deviație standard	±565	±10,988	±4,111	±14,982

255

Exemplul 6. Experimentul s-a realizat ca în exemplul 5, cu excepția faptului că celulele au fost netratate, adică nu s-au cultivat cu SLPI înaintea inoculării. Folosind celule netratate și virus pretratat SLPI, SLPI a inhibat replicarea virală prin aproximativ 59% și 32%, când s-a adăugat imediat după infecție și respectiv, la 2 zile după infecție (tabel 3).

260

265

Virus pretratat SLPI

Tabelul 3

	Control negativ	Control pozitiv	T = 0	T= 2
Activitate RT (medie cpm]	4,763	70,076	28,383	47,436
Deviație standard	±1,698	±15,803	±5,520	±11,679

RO 116164 Bl

Exemplul 7. Experimentul s-a realizat ca în exemplele 4-6, cu excepția faptului că nici celulele și nici virusul nu s-au expus la SLPI înainte de inoculare. Folosind celule netratate și virus netratat, SLPI a inhibat inhibarea virală prin aproximativ 50% și 42%, când s-a adăugat imediat după infecție și, respectiv, după 2 zile de la infecție (tabelul 4). Tabelul 5 prezintă activitatea reverstranscriptazei care a fost prezentă în supernatantul culturii, testat la 4,6 și 8 zile după infecție.

Celule și virus netratate

Tabelul 4

	Control negativ	Control negativ	T = O	T = 2
Activitate RT (medie cpm)	531	79,356	38,969	46,004
Deviație standard	±186	±17,497	±7,700	±8,492

Celule și virus netratate

Tabelul 5

	Negative	Pozitive	T = O	T= 2
Ziua 4(medie cpm]	435	1,556	797	1,287
Deviație standard	±85	±300	±222	±204
Ziua 6(medie cpm]	952	72,085	15,846	41,24
Deviație standard	±715	±12,219	±5,644	±1,542
Ziua 8(medie cpm]	1,519	13,853	7,617	11,946
Deviație standard	±475	±3,458	±3,031	±2,889

Exemplul 8. A fost investigat, de asemenea, efectul a diferiți mutanți SLPI asupra replicării virale. S-au incubat celule H-9 netratate cu virus netratat, timp de 4 h, ca în exemplul 7. După spălare, celulele s-au resuspendat la o densitate de 500.000 celule/ml în mediu care conține 30 pg/ml SLPI sau mutantele SLPI prezentate în tabelul 6. Supernatantul de cultură s-a testat, pentru activitate reverstranscriptazică, 8 zile mai târziu.

Tabelul 6

Activitate	Control negativ	Contai pozitiv	Tip sălbatic	Gly 20	Gly 72	Val 72	Lys 72	Phe 72
Activitate RT (medie cpm)	4,815	55,13	39,323	39,387	40,549	36,077	52,239	8,384
Deviație standard	±2,849	±6,637	±10,933	±11,143	±3,537	±7,859	±5,863	±1,925

RO 116164 Bl

Exemplul 9. Experimentul s-a realizat ca în exemplul 8, cu excepția faptului că, după inoculare, celulele s-au resuspendat într-un mediu conținând 100 pg/ml SLPI sau mutantă Phe 72. Supernatantul culturii s-a cercetat pentru activitate reverstranscriptazică 2, 4, 6, 8 și 10 zile post-infecție (tabelul 7). Tabelele 6 și 7 arată că efectul mutantei Phe 72 a fost deosebit de pronunțat

310

315

Tabelul 7

	Negativ	Pozitiv	SLPI	PHE- 72
Ziua 2 (medie cpm]		1,386	995	897
Deviație standard		± 914	±246	±472
Ziua 4 (medie cpm)		1,356	1,087	1,38
Deviație standard		±370	±414	± 442
Ziua 6 (medie cpm)	1,142	2,103	1,526	748
Deviație standard	± 389	±498	±508	±243
Ziua 8 (medie cpm)		77,931	25,241	3,491
Deviație standard		±9,779	±8,399	±1,086
Ziua 10 (medie cpm)		21,431	12,499	2,239
Deviație standard		±1,890	±3,495	±444

320

325

Exemplul 10. Pentru determinarea doar a efectului SLPI s-a evaluat proliferarea celulelor H-9 prin teste de încorporare a timidinei, folosind 200.000 celule H-9 cultivate cu 100 pg/ml SLPI și fără SLPI. Culturile s-au suplimentat cu mediul conținând 2,5 microcurie de timidină tritiată la ziua O, 1 și 2. Cantitățile încorporate s-au măsurat în ziua 1, 2 și 3. Așa cum arată tabelul 8, SLPI nu este toxic pentru aceste celule.

330

335

Activitate FIT (medie cpm). Proliferare H-9

Tabelul 8

	Ziua 1	Ziua 2	Ziua 3
Control (-SLPI)	20,86	67,401	53,326
Deviație standard	±581	±2,529	±3,326
+SPLI 100 pg/ml	20,437	61,892	54,592
Deviație standard	±1,503	±216	±2,781

340

345

Exemplul 11. S-a investigat, de asemenea, inhibarea producției virale din celule infectate cronic, folosind linia celulară promonocite U1. S-au menținut culturi în suspensie de U1 în RPMI cu 10% FCS și 200 pg/l gentamicină. Celulele s-au recoltat, s-au spălat și s-au suspendat la o densitate de 2,5 milioane celule/ml. Celulele suspendate s-au cultivat peste noapte în mediu conținând 100 sau 200 pg/ml SLPI sau

RO 116164 Bl doar mediu. Virusul s-a inclus prin adăugare de acetat de 13-forbol-12-miristat (PMA) până la o concertrație finală de 1 micromolar. După 48 h, supernatantul culturii de celule s-a cercetat pentru activitate reverstranscriptazică, ca în exemplele 4...9. Așa cum se arată în tabelul 9, SLPI a inhibat semnificativ producția virală de la aceste celule infectate cronic.

Claims

Revendicări

1. Metodă de inhibare a infecției retrovirale, caracterizată prin aceea că inhibitorul serinproteazei leucocitare, SLPI, un analog sau un derivat al acestuia, se administrează sub formă orală sau parenterală, prin injectare intravenuasc, subcutanată sau intramusculară, într-o doză unitară, selectată din domeniul cuprins între 10 și 1000 mg/zi, preferabil între 10 și 200 mg/zi, optim între 20 și 200 mg/zi.
2. Metodă de inhibare a infecției retrovirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că infecția retrovirală este infecția celulară cu virusul imunodeficienței umane,HIV.
3. Metodă de inhibare a infecției retrovirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că derivatul inhibitorului serinproteazei leucocitare SLPI este inhibitorul cisteinproteazei leucocitare, CLPI, care are următoarea secvență de aminoacizi:

Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gin Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala
4. Metodă de inhibare a infecției retrovirale, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că analogii sunt selectați dintre mutante SLPI, cum ar fi mutanta SLPI Gly20, mutanta SLPI Phe72, mutanta SLPI Gly72, mutanta SLPI Val72, mutanta SLPI Gly20, și dintre mutante CLPI, cum ar fi mutanta CLPI Phe25, mutanta CLPI Gly25, mutanta CLPI Val25.

Președintele comisiei de examinare: chim. Gruia Amelia

Examinator: ing. Petrea Dana-Maria

RO 116164 Bl (511 Int.CI.⁷ A 61 K 38/00;

C 12 N 15/15;