PT99265B

PT99265B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo interferon humano e metodo de tratamento de doencas proliferativas celulares

Info

Publication number: PT99265B
Application number: PT99265A
Authority: PT
Inventors: Lawrence M Blatt; Milton W Taylor
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 1999-04-30
Also published as: ES2128348T3; ATE174798T1; DE69130679T2; DE69130679D1; IL99778A; DK0553294T3; IE913656A1; NO931413L; CA2094275A1; EP0553294A4; IL99778A0; NO931413D0; PT99265A; JP3496937B2; EP0553294B1; SG52537A1; NZ240264A; CN1053117C; CN1064018A; HK1010340A1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES .FARMACÊUTICAS CONTENDO INTERFERON HUMANO E MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇAS PROLIFEPATIVAS CELULARES

A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de distúrbios da proliferação celular utilizando o interferão de consenso dos leucócitos humanos, A presente invenção refere-se, ainda, a composições farmacêuticas contendo o interferão de con senso dos leucócitos humanos, adequadas para o tratamento de dis turbios da proliferação celular.

Antecedentes da Presente invenção

Os interferãos constituem uma subclasse de citoquinas que apresentam actividades anti-viral e antiproliferativa. Tendo como base as suas propriedades bioquímicas e imunológicas, agruparam-se os interfèrãos humanos em três classes: interferão alfa (leucócito), interferão beta (fibroblasto) e interferão gama (imu nológico). Por isolamento e secuenciação do ADN que codifica estes polipêptidos, identificaram-se catorze interferãos alfa (que se agruparam em subtipos de A a H) que têm sequências de aminoãci dos distintas. Os interferãos alfa foram objecto de uma atenção considerável como potenciais agentes terapêuticos, devido às suas actividades anti-viral e de inibição do crescimento tumoral.

Na patente de invenção norte-americana n9 4 503 035, en contra-se descrita a purificação do interferão dos leucócitos humanos isolados da fracção constituída pela película formada a par tir do sangue total. Os interferãos dos leucócitos humanos prepa-2¢rados de acordo com este procedimento contem uma mistura de dife- * rentes sequências de aminoacidos de interferãos dos leucócitos humanos» 0 material purificado possui uma actividade específica de 0,9 x 10 - 4 x 10 unidades/mg de proteína, quando ensaiado na linha de células de bovino MDBK e de 2 x 10 - 7,6 x 10 unidades/mg de proteína quando ensaiado na linha de células humanas Ag 1732, O ensaio de inibição do efeito citopãtico utilizado para se determinar a actividade antiviral do interferão esta descrito na patente de invenção norte-americana nÇ 4 241 17. Calibrou-se a actividade medida do interferão utilizando um padrão de referência para os interferãos dos leucócitos humanos proporcionado pelos National Institutes of Health,

Na patente de invenção norte-americana n9 4 530 901 encontra-se descrita a construção de plasmídeos de ADN recombinante contendo sequências que codificam, pelo menos em parte, o interferão dos leucócitos humanos e a expressão na E, coli de um polipêptido que possui a actividade imunológica ou biológica do interferão dos leucócitos humanos.

As patentes de invenção norte-americanas n9s 4 414 150,

456 748 e 4 678 751, descrevem a construção de genes híbridos de interferão alfa contendo combinações de sequências de diferentes subtipos (por exemplo, A e D, A eBeAe F).

Nas patentes de invenção norte-americanas n9s 4 695 623 e 4 897 471, descrevem-se novos polipêptidos de interferãos leucocitãrios humanos que possuem sequências de aminoacidos que incluem aminoacidos comuns ou predominantes que se encontram em ca da uma das posições nos polipêptidos dos subtipos do interferão alfa, natural, e que são designados por interferão de consenso dos leucócitos humanos (IFN-con). As sequências de aminoacidos

-3X do IFN-con descobertas foram designadas por IFN-conl, IFN-con2 % e IFN-con3, Descreve-se também a preparaçao dos genes fabricados que codficam IFN-con e a expressão dos referidos genes na B. coli.

Klein e outros J» CRromatog,, 454 (1988) 205-215_7 descreveram a purificação do IFN-conl produzido na E- coli. Segundo se refere, a actividade especifica do IFN—conl purificado g

de acordo com este procedimento ê de 3 x 10 unidades/mg de pro teina, conforme o cálculo efectuado no ensaio de inibição do efeito citopãtico, utilizando a linha de células humanas T98G /*Fish e outros, J. Interferon Res., 9/1989) 97-114/7, 0 IFN-conl purificado ê constituído por três isoformas, de acordo com o determinado por focalização isoelêctrica, as quais foram identificadas como metionil-IFN-conl, desmetionil-IFN-conl e desmetionil-IFN-conl com o seu N-terminal bloqueado por um grupo ace tilo. zTKlein e outros, Arch. Biochem. Biophys., 276 (1990) 531-537/7.

Nos Estados Unidos e noutros países, o interferão alfa é actualménté aceite no tratamento de leucemia das células filamentosas, doenças venéreas, Sarcoma de Kaposi (um cancro que afli ge normalmente os pacientes que sofrem do Sindroma da Imunodeficiência Adquirida (SIDA)) e de hepatite crõnica, que não sejam as do tipo A e B, Foram aprovadas duas variantes de interferão alfa para uso terapêutico: interferão alfa-2a, comercializado com a designação de ROFERON—A e o Interferão alfa-2b, comercializado sob a designação de INTRON-A, As sequências de aminoâcidos do RO FERON-A e do INTRON-A diferem numa única posição mas no restante são idênticas ã sequência de aminoâcidos do interferão alfa, sub -tipo 2 (sub-tipo A) .

ζ

Para alem, das indicações fornecidas no rótulo, utilizasse ou ensaia-se q interferão alfa isoladamente ou em associação com agentes quimioterapêuticos, em diversos outros distúrbios de proliferação celular, em que se incluem a leucemia mielo genica crónica, o mieloma múltiplo, cancro superficial da bexiga, cancros da pele (carcinoma das células basais e melanoma maligno) , carcinoma das células renais, cancro do ovário, linfoma linfocítico de baixo grau, linfoma cutâneo das células T e glioma, 0 interferão alfa pode ser eficaz quando associado a outros agentes quimioterapêuticos no tratamento de tumores sólidos que procedam de cancros de pulmão, colo-rectal e da mama /7ver Rosenberg e outros Principies and Applications of Biologic Therapy em Câncer Principies and Practices of Oncology, (Devita e outros, eds.) 3^ edição, 1989, pp. 301-547; Balmer, DICP, Ann. Pharmacother, 24 (1990) 761-768 J7.

Sabe-se que os interferãos alfa afectam diversas funções celulares, incluindo a replicação do ADN e a síntese do ARN e das proteínas, tanto nas células normais como nas anormais. Deste modo, os efeitos citotoxicos do interferão não se limitam às células tumorígenas ou infectadas por virus, mas manifestam-se também nas células normais e saudáveis. Como resultado, surgem efeitos secundários indesejáveis durante a terapia com interferãos especialmente quando são necessárias dose elevadas. A administração de interferão pode levar â mielossupressão originando níveis reduzidos de heraãcias, leucócitos e plaquetas., Doses mais elevadas de interferão originam, habitualmente, sintomas semelhantes a gripe (por exemplo, febre, fadiga, cefaleias e calafrios), distúrbios gastrointestinais (por exemplo, anorexia, náuseas e diarreia) vertigens e tosse,. Será útil reduzir ou

-5eliminar terferão.

pia.

os indesejáveis efeitos secundários da terapia com insem diminuir o efeito terapêutico benéfico desta tera-

Deste modo, constitui um dos objectivos da presente invenção o tratamento de distúrbios da proliferação celular, tais como leucemia das células filamentosas ou Sarcoma de Kaposi, com IFN-con, em que se encontram diminuídos os indesejáveis efeitos secundários associados, por comparação com os regimes de tratamen to habitualmente utilizados ou se encontram mesmo completamente abolidos. Como alternativa, um dos objectivos da presente invenção consiste na obtenção de maiores benefícios terapêuticos no tratamento de distúrbios da proliferação celular com IFN-con, em comparação com os regimes de tratamento actualmente praticados, sem que haja um correspondente aumento na frequência ou gravidade de efeitos secundários indesejáveis.

Sumário da Presente Invenção

A presente invenção engloba métodos de tratamento de um distúrbio da proliferação celular que consistem em administrar a um mamífero uma dose terapeuticamente eficaz do interferão de consenso dos leucócitos humanos (IFN-con), Demonstra-se que o IFN -con tem uma actividade anti-proliferativa superior ã do INTRON-A« Deste modo, o tratamento de um distúrbio da proliferação celular utilizando IFN-con apresenta maior eficácia e segurança em comparação com outros tratamentos com interferão actualmente praticados. Em particular, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IFN-con dá origem, a um tratamento mais rápido e de maior alcance de um distúrbio da proliferação celular, em comparação com os métodos actualmente utilizados, não ha-6vendo um aumento correspondente na frequência ou gravidade dos indesejáveis efeitos secundários associados. Para alem disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IFN-con pode ser inferior â referida quantidade de um interferão utilizado nos regimes usual mente praticados. Como resultado, uma menor dose de IFN-con proporciona o mesmo efeito terapêutico que doses superiores de outros interferãos, havendo um decréscimo ou mesmo a eliminação dos efeitos secundários indesejáveis e habitualmente associados â terapia com interferãos,

IFN-con ê eficaz no tratamento de distúrbios da proliferação celular frequentemente associadas ao cancro. Estes di£5 turbios abrangem, mas não exclusivamente, a leucemia das células filamentosas e o Sarcoma de Kaposi, Pode utilizar-se o IFN-con isoladamente ou em associação com outros agentes terapêuticos pa ra o tratamento do cancro e de outros distúrbios proliferativos.

De acordo com um aspecto preferencial, utiliza-se IFN-con em asso ciação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais factores que estimulem a proliferação ou diferenciação das células mieloides, tais como o factor de estimulação da colónia de granulõcitos (G-CSF), factor de estimulação da colõnia de granulo citos/macrõfagos (GM-CSF), interleucina-1 (IL—1), interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), eritropoietina e factor das células progenitoras (SCF).

IFN-con não é um polipêptido de ocorrência natural e possui actividade antiproliferativa, 0 IFN-con ê, preferencialmen te, um polipêptido que tem a sequência de aminoácidos de IFN-conl, IFN-con2 ou iFN-con3, Mais preferencialmente o IFN-con tem a sequência de aminoácidos do IFN-conl,

A presente invenção refere-se ainda a composiçoes farma

cêuticas que contêm uma quantidade .terapeuticamente eficaz de IFN-con, juntamente com diluentes, adjuvantes, veículos, conservantes e/ou solubilizantes adequados»

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1 a 7 mostram a actividade antiproliferativa de iFN-conl e de INTRON-A, um produto de comparação, em Eskol, uma linha de células leucemicas filamentosas, quando se adicionam interferãos a uma suspensão celular de células Eskol, respectivamente a 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng/ml,

A Figura 8 mostra a primeira DMT e a DMT média usualmente atingida em pacientes com Sarcoma de Kaposi tratados com INTRON-A, IFN-conl e r-metGCSF.

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção

Tal como ê utilizada na presente invenção a designação ”interferão leucocitãrio humano de consenso (IFN-con) refere-se a um polipéptido não natural que é constituído predominantemente pelos resíduos aminoácidos que são comuns a todas as sequências naturais dos subtipos de interferãos dos leucócitos humanos e, que contêm numa ou mais das posiçóes em que não existe um aminoãcido comum a todos os subtipos um aminoãcido que surge predominantemente nessa posição e que em ciscunstância alguma engloba um resíduo aminoãcido que não exista nessa posição pelo menos num subtipo natural».0 IFN-con abrange, mas não exclusivamente, as sequências de aminoácidos designadas por IFN-conl, lFN-con2 e IFN-con3 nas patentes de invenção norte-americanas n9s 4 695 623 e 4 897 471, cujas descrições se consideram aqui totalmente incorporadas a titulo de referência» As sequências de ADN que codifi-8-

invenção anteriormente referidas.

Os polipêptidos de IFN-con são os produtos da expressão das sequências de ADN construídas, transformadas ou transfec tadas em hospedeiros bacterianos, especialmente na E.coli. Isto ê, o IFN-con ê o IFN-con recombinante. 0 IFN-con produzido na E. coli ê purificado mediante procedimentos que são do conhecimento do especialista e que foram descritos, dum modo geral, por Klein e outros, supra (1988) para o IFN-conl. 0 IFN-con purificado pode ser constituído por uma mistura de isoformas por exemplo, o IFN-conl purificado, ê constituído por uma mistura de metionil-IFN-conl, desmetionil-IFN-conl e desmetionil-IFN-conl com um terminal N bloqueado £Klein e outros, supra, (1990) £. Como alternativa, o IFN-conl pode ser constituído por uma isoforma isolada, específica. As isofromas de IFN-con separam-se umas das ou tras de acordo com técnicas tais como a focalização isoeléctrica, procedimento este que ê do conhecimento do especialista.

A presente invenção proporciona um método para o tratamento de distúrbios da proliferação celular que consiste em administrar uma dose terapeuticamente eficaz de IFN-con. Um aspecto preferencial da presente invenção consiste num método de tratamen to que implica a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IFN-conl, IFN-con2 ou IFN-con3. Mais preferivelmente, administra-se uma dose terapeuticamente eficaz de IFN-conl.

IFN-con ê utilizável no tratamento de diversos distúr bior da proliferação celular, especialmente de diversos cancros. Estes distúrbios abrangem, mas não exclusivamente, leucemia das células filamentosas, Sarcoma de Kaposi, leucemia mielogênica cro nica, mieloma múltiplo, cancro superficial da bexiga, cancro da

pele (carcinoma das células basais e melanoma maligno), carcinoma das células renais, cancro do ovário, linfoma linfocitico de baixo grau, linfoma cutâneo das células T e glioma.

Utiliza-se IFN-con isoladamente ou em associação com outros agentes terapêuticos no tratamento de cancro e de outros distúrbios proliferativos, Administrasse IFN-con juntamente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes qui mioterapêuticos, tais como o busulfan, 5—fluoro—uracilo (5-FU), zidovudine (AZT), leucoverin, melphalan, prednisone, ciclofosfamida, dacarbazine, cisplatina e dipyridamole. Pode também administrar-se IFN-con juntamente com citoquinas, tais como a interleucinas2 (IL-2).

Pode administrar-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de IFN-con em associação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais factores que estimulem a diferenciação mielôide, de modo a evitar os efeitos da mielossupressão ob servados durante os tratamentos com interferão. Estes agentes incluem, mas não exclusivamente, os G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-6, eritropoietina e SCF, 0 factor das células progenitoras (SCF) estimula a proliferação das células progenitoras hematopoiéticas precoces e encontra-se descrito na patente de invenção norte-americana com o n? de série 573616, cuja descrição ê aqui incorporada, por referência.

Nos exemplos práticos que se apresentam demonstra-se que o IFN-conl ê um agente antiproliferativo eficaz contra a leu cernia das células filamentosas e Sarcoma de Kaposi associado â SIDA,

A actividade antiproliferativa do IFN-conl e do INTRON-A ensaiada em células Eskol, uma linha de células leucémicas fi-10 lamentosas, pode ver-se no Exemplo 1, Demonstra-se gue o IFN-conF' tem uma actividade antiproliferativa superior â do INTRQN-A num grande intervalo de concentrações» Obtiveram-se resultados semelhantes quando se comparou o IFN-conl com o ROFERON-A, Estes resultados indicam que o IFN-conl tem uma eficácia terapêutica superior quando administrado nas mesmas concentrações do INTRQN-A. Alternativamente, são necessárias concentrações inferiores de IFN-conl para se obter a eficácia terapêutica equivalente â do INTRQN-A.

Nq Exemplo 2 faz-se a descrição de um estudo comparati vo do IFN-conl e do INTRON-A no tratamento do Sarcoma de Kaposi associado ã SIDA, Demonstra-se que pacientes aos quais se administrou IFN-conl atingiram doses unitárias superiores às dos pa cientes aos quais se administrou INTRQN-A. Para alem disso, os pacientes aos,quais foi administrado IFN-conl e FECG atingiram doses superiores âs dos pacientes aos quais se administrou apenas IFN-conl (ver Figura 8), Neste estudo, foi administrado a to dos os pacientes AZT, como parte do tratamento na infecção por HIV, O AZT administrado isoladamente não se mostrou eficaz no Sar coma de Kaposi,

Demonstrou-se que o IFN-conl ê mais seguro do que o INTRON-A, de acordo com a reduzida frequência de toxicidade de grau 3 observada quando se administrou IFN-conl, O tratamento com IFN-conl indicou uma incidência reduzida de neutropenia e de disfunção hepática em comparação com o tratamento com intrqn-a, ao passo que o tratamento com IFN-conl e com r-metGCSF eliminou completamente a toxicidade de grau 3 (ver Quadro 2),

Também se proporcionam composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de iFN-con juntamen

Ç te com veículos, adjuvantes, diluentes_r conservantes e/ou solubi lizantes, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico» As compo sições farmacêuticas de IFN-con englobam diluentes de diversos tampões (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) que apresentam um intervalo de pH e de força iõnica, veículos (por exemplo, albumina do soro humano), solubilizantes (por exemplo, Tween, polis sorbato) e conservantes (por exemplo, timerossol, ãlcool benzílico). Regra geral, os componentes das composições farmacêuticas po dem ser seleccionados entre aqueles que habitualmente se utilizam com interferãos e outros agentes antiproliferativos e que são do conhecimento do especialista. As composições farmacêuticas de IFN -con sao fornecidas sob a forma de uma solução injectãvel ou sob a forma de um põ liofilizado que ê reconstituído num diluente adequado antes de ser injectado, especialista poderá determinar a dose terapeuticamente eficaz de IFN-con, tomando em consideração variáveis tais como o tempo de semi-vida das preparações de IFN-con, a via de admini.s tração e o distúrbio de proliferação celular ensaiado. Regra geral, uma dose terapeuticamente eficaz de IFN-con para o tratamento de um distúrbio de proliferação celular está compreendida en6 6 tre 2 x 10 e 60 x 10 unidades por paciente, administradas diver sas vezes por semana. As doses correspondentes aos valores inferiores deste intervalo são eficazes no tratamento da leucemia das células filamentosas, ao passo que as doses situadas nos valores mais elevados do intervalo são eficazes no tratamento do Sarcoma de Kaposi, As doses terapeuticamente eficazes de IFN-con originarão, preferencialmente, a remissão do tumor numa proporção de 20 a 80%, dependendo do tipo específico de tumor, durante um período de pelo menos seis meses.

-12A via de administreçao preferencial consistira na in-^^³jecção no sangue de um mamífero, podendo a referida injecção ser intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intralesional., Será evi dente, para o especialista na matéria, se uma determinada composição farmacêutica ê ou não adequada para uma determinada via de administração.

Os exemplos que se seguem são apresentados com o intui to de ilustrar de um modo mais completo a presente invenção, não limitando de modo algum o âmbito da mesma.

EXEMPLO 1

Actividade Antlproliferativa de IFN-conl e de INTRQN-A

Ensaiou-se a actividade antlproliferativa de IFN-conl e de INTRON-A numa linha de células Eskol, uma linha de células leucêmicas filamentosas isolada pelo Dr, E. Srour na Indiana Uni versity Medicai School. Incubou-se 3 ml de culturas de células Eskol em meio RPMI (Gibco) â temperatura de 37°C em atmosfera de 5% de C0₂, contendo 10% de soro de feto de vitela, durante 12 ho ras, a 1 x 10 células/ml. Adicionou-se IFN-conl ou INTRON-A (In terferão alfa 2b; Schering Corp.) atê uma concentração final de proteínas compreendida entre 0,1 e 100 ng/ml, em 100yil de meio. Determinou-se a concentração de proteínas de IFN-conl, de acordo com um ensaio de proteínas de Bradford Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976) 248-254J/r gendo a concentração de INTRON-A calculada g

a partir da actividade específica (.2 x 10 unidades Internacionais/mg de proteína) e da concentração unitária fornecida pelo fa bricante. Determinou—se o numero de células viáveis, com intervalos de 24 horas por exclusão com azul de tripano (Sigma). Adicio-13nou-se 100 jal de IFN-conl ou de INTRON-A atê â concentração fi nal indicada, com intervalos de 24 horas. Q número de células viáveis foi calculado como uma média de quatro ensaios independen tes, havendo em cada um dos ensaios amostras duplas. A variação na contagem das células variou entre cerca de 5%, no intervalo de 24 a 48 horas, e cerca de 2%, para períodos mais longos. Os resultados indicados nas Figuras 1-7 são as relações entre as con tagens de células viáveis, na presença e na ausência de interferão, em tempos diferentes e expressas em percentagem,'

Confirmou-se a contagem de células viáveis medindo a incorporação de H-timidina nas células Eskol incubadas na presença de IFN-conl ou de INTRON-A. Decorrido um período de incuba ção de 120 horas, retirou-se 200jul de uma suspensão de células e incubou-se â temperatura de 37°C durante 3 horas, na presença 3 de 5 JtiCi/ml de H-timidina (Amersham) . Recolheram-se as células utilizando um dispositivo de recolha de células Cambridge (Cambridge Technology), lavou-se sete vezes com ãgua destilada e duas 3 com etanol a 95% e determinou-se a quantidade de H-timidina incorporada por contagem de cintilação em líquido. A incorporação de H-timidina pelas células Eskol incubadas durante 120 horas na presença de IFN-conl ou de INTRON-A foi proporcional â contagem de viabilidade celular.

EXEMPLQ 2

Segurança, Tolerância, e Eficácia de IFN-conl Administrado a Pacientes com Sarcoma de Kaposi CSK)

Efectuou-se um estudo aleatório de rótulo em branco pa ra se determinar o grau de segurança e a tolerância e para se de

finir a dose máxima tolerada (DMT) de IFN-conl e de INTRQN-A,

A pacientes com SK associado â SIDA, administraram-se IFN-conl e 1NTR0N-A em associaçao com zidovudine (AZT), Para alem disso, determinou-se o grau de segurança, a tolerância e a DMT de IFN-conl, guando administrado em associaçao com AZT e com o factor de estimulação da colónia de granulócitos recombinantes produzido por E. coli, com um resíduo metionina na extremidade amino-termi nal do polipeptido (r-metGCSF), Os três grupos de tratamento nes te estudo consistiram em:

1. INTRQN-A e AZT

2. IFN-conl e AZT

3. IFN-conl, AZT e r-metGCSF

Em cada grupo de tratamento incluiram-se pelo menos 12 pacientes para os quais era possível fazer-se uma estimativa.

A. Descrição do Produto

Produziu-se o IFN-conl na E. coli, utilizando os métodos descritos nas patentes de invenção norte-americanas nÇ 4 695 623 e 4 897 471. Purificou-se o IFN-conl de acordo com procedimentos geralmente descritos por Klein e outros, Supra (1988). No presen te estudo e para administração subcutânea, utilizou-se IFN-conl sob a forma de uma solução esterilizada de proteína em tampão de fosfato de sódio. Sempre que necessário, efectuou-se a diluição em solução salina esterilizada.

Adquiriu-se a zidovudine (AZT) à Burroughs-Wellcome Co. e utilizou-se de acordo com as indicações da embalagem.

Adguiriu-se o 1NTRQN—A na Schering Corp como uma formulação liofilizada esterilizada, com a qual se efectuou uma suspen são em diluente de acordo com as indicações da embalagem.

r-metGCSF foi produzido na E, coli utilizando os métodos descritos, dum modo geral, na patente de invenção norte-ame ricana n? 4 810 643, cujo conteúdo se incorpora aqui a titulo de referência. Preparou-se o r-metGCSF sob a forma de uma solução es terilizada de proteínas em acetato de sódio lOmM, manitol a 5% e Tween 80 a 0,004%, a pH 4,0, numa concentração de 0,3 mg/ml. Sempre que necessário, efectuou-se a diluição em solução aquosa de glicose a 5% (D^W),

B. Dosagem e Escalonamento

AZT. Administrou-se AZT a todos os pacientes em uma dose fixa de 100 mg, por via oral, de quatro em quatro horas, estan do o paciente preparado para um total de cinco doses ou 500 mg, por dia.

r-metGCSF. Para os pacientes escolhidos aleatoriamente para o grupo de tratamento que incluia o r-metGCSF, as doses de r-metGCSF foram de 1 yig/kg da massa corporal por dia, administrado por via subcutânea como uma única ampola injectada. Quando necessário aumentou-se esta dosagem, com incrementos de ljag/kg/dia (não excedendo os 6 ^ig/kg/dia) ou diminuiu-se a referida dosagem com decréscimos de 0,5 jag/kg/dia ou menores, conforme apropriado, no sentido de atingir um intervalo do número absoluto de neutrõfi^ los compreendido entre 5 000 e 15 000/mm .

Interferao. Administrou-se aos pacientes o IFN-conl ou o INTRQN-A de acordo com um esquema de escalonamento de dosagem.

A dosagem baseou-se em unidades iguais de qualquer dos interferãos. No entanto, devido ao facto de as actividades espe-168 cificas dos dois interferãos serem diferentes C2 x 10 Ul/mg pa-, ra o XNTRQN-A e pelo menos 1 x 10 Ul/mg para, IFN-conl, de acordo com o determinado no ensaio citopatico antiviral descrito na patente de invenção norte-americana n9 4 695 623) , a quantidade de proteina em massa (em mg) de uma dada dose serâ diferente para o INTRQN—A e para o IFN-conl. 0 esquema de escalonamento de dosagem utilizado encontra—se indicado a seguir no Quadro 1. No Quadro 1, também se indica a dose para cada interferão, em mg de proteína, correspondente a cada um dos níveis de dose, em UI.

QUADRO 1

Escalonamento de Doses Para INTRON-A e IFN-conl

Nível da Dose	Dose	X10⁶ UI	Dose em mg de Proteína
INTRON-A	IFN-conl
1		3	0,015	0,003
2		9	0,045	0,009
3		12	0,060	0,012
4		15	0,075	0,015
5		18	0,090	0,018
6		21	0,105	0,021
7		24	0,120	0,024
8		27	0,135	0,027
9		30	0,150	0,030
	Aos pacientes	de cada um dos	três grupos	de tratamento
anteriormente indicados	administrou-se	IFN-conl ou	INTRON-A par-

tindo de um nível de dose 1, diariamente, durante uma semana an- * tes de se passar para os níveis de dose mais elevados, 0 aumento da dose efectuou-se aos 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50 e 57 dias, Con tinuou a aumentar-se a dose atê cada um dos pacientes atingir uma DMT ou a dose diária máxima de 30 x 10 UI de interferão, Definiu ''-se a DMT para um determinado paciente como o nível de dose a se·? guir ao qual surge a toxicidade limitativa do fármaco, Escalonou^se a toxicidade numa escala de 0 (ausência de toxicidade) a 4 (toxicidade aguda) utilizando critérios instituídos pela Organiza ção Mundial de Saúde e também descritos por Miller e outros 2 Câncer, 47 (1981) 210-211.7. A toxicidade limitativa da dose foi definida como um fenômeno de Grau 3 ou de Grau 4 que se admite estar pelo menos possivelmente associado ao interferão. Febre e calafrios com uma duração inferior a 24 horas, fadiga, cefaleias ou toxicidade de grau 2 ou inferior não são utilizados para definir a DMT, salvo quando considerados intoleráveis para determinado paciente.

Quando se completa a fase de escalonamento, mantêm-se os pacientes com uma terapia que consiste em administrar diariamente uma dosagem que se situe ao nível da DMT do paciente ou na g

dose máxima de 30 x 10 UI, se tal se conseguir. Continua a manter-rse esta terapia atê â progressão da doença ou outros critérios exigirem a remoção do paciente do grupo do estudo.

Durante a manutenção da terapia são permitidas duas reduções da dose de interferão, originadas pela toxicidade. Após duas reduções da dose não são permitidas outras modificações no doseamento dos interferãos e retiram-se do programa os pacientes que necessitem de mais reduções. Considera-se excepção a este pro cedimento O caso em que a toxicidade limitativa da dose consiste

183 em neutropenia (ANC ^lOQQ/mm ) em deis dias de um período aproximado de uma semana, Nesta circunstância, permite-se que o paciente permaneça no estudo sem mais reduções da dose de interfe rão, mas inicia—se uma terapia com r-metGCSE a 1 jag/Kg de massa corporal, por dia, administrada por via subcutânea, aos pacientes aos quais não foi administrado r-metGCSE, Aos pacientes que jâ se encontravam no grupo de tratamento ao qual ê administrado r-metGCSF, eleva-se a dose de r-metGCSF administrada para o nível superior imediato (um acréscimo de l^g/kg/dia),

C, Selecçâo dos Pacientes

Neste estudo encontraram-se envolvidos um total de 49 pacientes. Cada um dos pacientes foi seleccionado para este estu do depois de se satisfazerem todos os critérios de exclusão e de inclusão. Os critérios significativos para a inclusão consistiram em infecção por HIV serologicamente documentados, Sarcoma de Kaposi confirmado por histopatologia com lesões cutâneas ou orais mensuráveis, função imunolõgica aceitável (determinada pelos níveis de linfõcitos CD4) e sob tratamento com AZT, hã menos de um ano.

Entre as razões para a remoção de um paciente do estudo, contam-se uma segunda ocorrência de toxicidade de Grau 3 ou superior durante a fase de aumento da dose, uma terceira ocorrência de toxicidade limitativa da dose apos ter-se determinado a DMT do paciente, estando o paciente em terapia de manutenção, ou uma progressão no SK,

D, Determinação de DMT para IFN-conl e INTRON-A

Utilizando o esquema de escalonamento da dose anterior

mente descrito, durante 1-9 semanas de estudo, seguido de uma te rapia de manutenção ou de redução da dose, conforme adequado, de terminou—se a primeira e normal DMT médias de INTRON-A e de IFN-conl para três grupos de tratamento, as quais se encontram indi cadas na Figura 8» Cada um dos grupos era constituído por 15 pacientes, 0 Grupo 1 (INTRON-A e AZT) atingiu uma primeira DMT durante o aumento da dose de 9 x 10⁶ ui e uma DMT normal de 6 x 10⁶

UI. 0 grupo 2 (IFN-conl e AZT) atingiu os valores de uma primei6 ra DMT e de uma DMT normal de 15 x 10 UI; e o Grupo 3 (IFN-conl, r-metGCSF e AZT) atingiu os valores de uma primeira DMT e de uma c c

DMT normal de 24 x 10 UI e 21 x 10 UI, respectivamente.

Avaliação do Grau de segurança do tratamento com INTRQN-A e com

IFN-conl

Determinou-se o grau de segurança do tratamento com INTRON-A e IFN-conl de acordo com a gravidade de efeitos adversos que necessitam da redução da dose de interferão. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro 2.

QUADRO 2

Toxicidade que Determinaram Reduções das Doses em Três

Grupos de Tratamento

Frequência da Ocorrência (%)

INTRQN-A IFN-conl* IFN-conl e . r-metGCSF*

Grau 2 Intolerância (Sindroma semelhante a Gripe)	2Q	70	65
Grau 3 Neutropenia	40	10	0
Grau 3 Testes da função hepática	30	10	0

* As percentagens para os grupos de tratamento com IFN-conl e IFN-conl e r-metGCSF não perfazem os 100% devido ao facto de, nestes grupos, alguns pacientes atingirem doses máximas de g

x 10 UI sem a presença de efeitos adversos.

Uma vez iniciado o estudo, não foram retirados pacientes devido a toxicidade claramente resultante da administração de INTRON-A ou de IFN-conl.

F, Pcterminação da- Eficácia do Tratamento com IFN-conl e com

INTRON-A

Re spos ta Ant itumora1. Apôs três meses de tratamento determinaram-se as respostas antitumorais ao tratamento utilizando os critérios de resposta /*Krown e outros, J. CTin. Oncol,

7. (1989) 1201-1207J7 normalizados pelo AIDS Clinicai Trials Group (ACTG) Oncology Committee.

Funções Imunolcgicas, Durante seis meses, no decurso do estudo, efectuou-se mensalmente a contagem dos linfocitos CD4 para se determinar a resposta imunolõgica dos pacientes à infecção por HIV.

Em todo os grupos de tratamento, a reacção das lesões do Sarcoma de Kaposi e os níveis de linfocitos CD4 foram equiva lentes.

Embora se tenha feito a descrição da presente invenção apenas no que se refere aos seus aspectos preferenciais, é evidente para o especialista que poderão ser feitas variações e mo dificações» Deste modo, considerasse que as reivindicações abran gem todas as variações equivalentes que possam ser incluídas no âmbito da presente invenção.

Claims

1.- Método para o tratamento de doenças proliferativas celulares em um mamífero, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade com eficácia terapêutica compreendida entre 2x10^ e 60χ10θ unidades por paciente várias vezes por semana de interferon leucocitãrio humano de consenso, podendo a doença proliferativa celular ser leucemia de células pilosas ou o sarcoma de Kaposi, e sendo a referida administração feita por via endovenosa, intramuscular, subcutânea ou intra-lesões e podendo o mamífero em questão ser um ser humano.

2.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se seleccionar o interferon de leucócitos huma nos de consenso no grupo que consiste em IFN-con_lz IFN-con₂ e

IFN-con₃.

3. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o interferon de leucócitos humanos de consenso ser IFN-con^.

4, - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o interferon de leucócitos humanos de consenso ser um produto da expressão procariótica de uma sequência de ADN exógena.

5, - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se administrar também uma quantidade com eficácia terapêutica de um agente quimio-terapêutico.

6. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda a administração de uma quantidade com eficãc.ia terapêutica de G-CSF, GM-CSF, IL-1,

IL-3 ou SCF.

7.- Processo para a preparação de composições farma

3/

Λ» cêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade com eficácia terapêutica de interferon de leucócitos humanos de 6 6 consenso, compreendida entre 2x10 e 60x10 unidades, como componente activo, com um veículo ou dissolvente, agente adjuvante, agente conservante e/ou agente solubilizante, aceitável em farmá cia, sendo a composição obtida apropriada para administração por via endovenosa, subcutânea, intramuscular ou intra-lesões e podendo apresentar-se sob a forma de solução injectável ou de pó liofilizado.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se seleccionar o interferon de leucócitos humanos de consenso no grupo constituído por IFN-con^, XFN-con₂e IFN-con^.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o interferon de leucócitos humanos de con senso ser IFN-con^.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o interferon de leucócitos humanos de con senso ser o produto da expressão procariótica de uma sequência de ADN exógena.

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11.- Processo de acordo com a reivindicação 7, carac terizado pelo facto de se misturar também uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-3 ou SCF.

O Agsnt!

Qíícia! da Propriedade Industrial